EA011168B1 - Способ очистки конъюгатов альбумина - Google Patents

Abstract

Способ разделения конъюгатов альбумина и неконъюгированного альбумина в растворе, содержащем конъюгаты альбумина и неконъюгированный альбумин, методом хроматографии гидрофобных взаимодействий (HIC). Раствор загружают на гидрофобную колонку, уравновешенную водным буфером с высоким содержанием соли; применяют в отношении указанного носителя градиент понижения содержания соли; собирают элюированный конъюгат альбумина.

Description

Предпосылки создания изобретения (а) Область, к которой относится изобретение.

Настоящее изобретение относится к способу очистки при выделении конъюгатов альбумина из раствора, содержащего как конъюгаты альбумина, так и неконъюгированный альбумин.

(б) Уровень техники.

В международных заявках \¥О 95/10302 и \УО 99/24074 описано образование конъюгатов альбумина, в которых представляющая интерес молекула имеет связанную с ней реакционноспособную (реактивную) функциональность, которая способна ковалентно связываться с альбумином, образуя при этом конъюгат. Эти конъюгаты могут образовываться ίη νίνο, но они могут также образовываться ίη νίίτο. Образование конъюгатов ίη νίίτο включает присоединение молекулы, связанной с реактивной функциональностью, к альбумину в растворе. Основные конечные продукты этой реакции представляют собой неконъюгированный альбумин, конъюгат альбумина и непрореагировавшую молекулу, связанную с реактивной функциональностью.

Было бы в высшей степени желательно иметь способ очистки конъюгата альбумина из раствора, содержащего конъюгат альбумина и неконъюгированный альбумин.

Сущность изобретенеия

Согласно настоящему изобретению предлагается способ отделения конъюгата альбумина от неконъюгированного альбумина в растворе, содержащем конъюгат альбумина и неконъюгированный альбумин, включающий:

а) нанесение раствора на гидрофобный твёрдый носитель, уравновешенный водным буфером с высоким содержанием соли;

б) подачу на носитель водного буфера с понижающимся с градиентом содержанием соли и

в) сбор элюированного конъюгата альбумина.

В предпочтительном варианте настоящего изобретения конъюгат альбумина состоит из молекулы, содержащей акцептор Михаэля, ковалентно связанный с ней, который связывается с альбумином, и более предпочтительно имеется связь между акцептором Михаэля и цистеином 34 альбумина.

В более предпочтительном варианте настоящего изобретения акцептором Михаэля является малеинимидная группа, и более предпочтительно малеинимидная группа представляет собой малеинимидпропионовую кислоту (МРА). Акцептор Михаэля необязательно связан с молекулой с помощью линкера. Линкер предпочтительно выбирают в группе, состоящей из гидроксиэтильных мотивов, таких как (2амино)этоксиуксусная кислота (АЕА), этилендиамин (ΕΌΑ), 2-[2-(2-амино)этокси]этоксиуксусная кислота (АЕЕА), аминоэтоксиэтиламиноянтарная кислота (ΑΕΕΑ8); один или более мотивов с алкильной цепью (С1-С10), таких как глицин, 3-аминопропионовая кислота (АРА), 8-аминооктановая кислота (АОА), октановая кислота (ОА), 4-аминобензойная кислота (ΑΡΠΑ). Предпочтительными линкерами являются ОА, ΑΌΕ, АЕА, АЕЕА и ΑΕΕΑ8. Можно также применять комбинацию двух линкеров, например, такую как ΑΕΕΑ-ΕΌΑ, ΑΕΕΑ-ΑΕΕΑ, ΑΕΕΑδ-ΑΕΕΑδ и АЕА-АЕЕА.

В предпочтительном варианте настоящего изобретения альбумин выбирают из группы, состоящей из сывороточного альбумина, рекомбинантного альбумина и альбумина из геномного источника.

В предпочтительном варианте настоящего изобретения альбумин выбирают из группы, состоящей из человеческого альбумина, альбумина крысы, альбумина мыши, альбумина свиньи, бычьего альбумина, альбумина собаки и кроличьего альбумина, более предпочтителен бычий сывороточный альбумин.

В предпочтительном варианте изобретения альбумин модифицирован с помощью по меньшей мере одного реагента, выбранного из группы, состоящей из жирных кислот, ионов металла, малых молекул с высоким сродством к альбумину, и сахаров, таких, но без ограничения, как глюкоза, лактоза и манноза.

В предпочтительном варианте настоящего изобретения молекулу выбирают из группы, состоящей из пептида, ДНК, РНК, малой органической молекулы и их комбинации. Молекулярная масса пептида составляет предпочтительно по меньшей мере 57 Да. Предполагается, что пептид включает, но без ограничения, СЬР-1, СЬР-2, ΑΝΡ, К5, динорфин, ОКЕ, инсулин, натрийуретический пептид, Т-20, Т-1249, С34 и ΡΥΥ. Предполагается, что малая молекула включает, но без ограничения, винорелбин, гемцитабин и паклитаксел. В более предпочтительном варианте настоящего изобретения, когда молекула представляет собой ДНК, РНК или малую органическую молекулу, она ковалентно связана с альбумином за счёт чувствительной к кислоте ковалентной связи или за счёт пептидной последовательности, чувствительной к протеолитическому расщеплению, тем самым обеспечивается отделение (отщепление) молекулы от альбумина и вход молекулы в клетку.

В предпочтительном варианте настоящего изобретения гидрофобная твёрдая подложка (носитель) представляет собой колонку, содержащую гидрофобный полимер, такой как, но без ограничения, октилсефароза, фенилсефароза и бутилсефароза, причём более предпочтительной является бутилсефароза.

В другом варианте настоящего изобретения гидрофобный твёрдый носитель содержит гидрофобный лиганд, такой как ОЬасгоп В1ие Ε3Ο-Α, либо изопропильные группы, ассоциированные с носителем, таким как матрица полистирол/изопропилбензол.

Вещества разделяют за счёт их различной интенсивности гидрофобного взаимодействия с гидрофобными лигандами, иммобилизованными на незаряженной матрице. Этот способ обычно осуществляют

- 1 011168 при умеренно высоких концентрациях солей (1М) в начальном буфере (адсорбция, промотируемая солью). Элюцию проводят при линейном или постадийном снижении концентрации соли.

Тип лиганда, степень замещения, значение рН и тип и концентрация соли, применяемой на стадии адсорбции, оказывают значительное влияние на общую эффективность (например, селективность и (адсорбционную) способность) Н1С матрицы (носителя (матрицы) для хроматографии гидрофобных взаимодействий).

Растворимость является одной из наиболее важных характеристик, которая влияет на производительность и селективность Н1С (хроматографии гидрофобных взаимодействий). В целом, процесс адсорбции является более селективным, чем процесс десорбции. Следовательно, важно оптимизировать начальный буфер по рН, типу растворителя, типу соли и концентрации соли. Добавление к образцу различных высаливающих солей вызывает взаимодействия лиганд-белок в процессе Н1С. По мере повышения концентрации соли количество связанного белка повышается до точки преципитации белка. Каждый тип соли отличается по своей способности промотировать гидрофобные взаимодействия. Влияние различных солей на гидрофобное взаимодействие подчиняется общеизвестному ряду Гофмейстера, представленному ниже:

Ряд Гофмейстера

Эффект высаливания

Анионы:

Хаотропный эффект

Катионы:

ΝΗ₄ ⁺ < КЪ⁺ < К⁺ < Ха⁺ < Сз⁺ < Εί⁺ < М§²⁺ < Ва²⁺

Возрастание эффекта высаливания усиливает гидрофобные взаимодействия, тогда как возрастание хаотропного эффекта ослабляет их. Следовательно, сульфат аммония вызывает более сильный эффект высаливания, чем хлорид натрия. Наиболее часто для Н1С применяют соли: сульфат аммония ((ΝΉ₄)₂8Ο₄), сульфат натрия (ЯагЗОд), сульфат магния (Мд8О₄), хлорид натрия (ЫаС1), хлорид калия (КС1) и ацетат аммония (^^ΟΟΝ^).

Связывание белка с Н1С адсорбентами промотируется концентрациями высаливающих солей от умеренных до высоких, большинство из этих солей также оказывают стабилизирующее действие на структуру белка благодаря предпочтительному исключению их из нативных глобулярных белков, т.е. взаимодействие между солью и поверхностью белка термодинамически невыгодно. Концентрация соли должна быть достаточно высокой (например, 500-1000 мМ) для того, чтобы вызывать взаимодействие лиганд-белок, но ниже концентрации, которая вызывает преципитации белка в образце. В случае альбумина концентрацию соли следует выдерживать ниже 3М (молей на литр). Основной механизм высаливания заключается в вызываемом солью повышении поверхностного натяжения воды (Ме1аийег апй НогуаШ, 1977). Таким образом, компактная структура становится энергетически более выгодной, так как она соответствует меньшей площади пограничной (межфазной) поверхности белок - раствор.

Авторы обнаружили, что в одних и тех же условиях (т.е. буфер, содержащий 8О₄ ^2-, РО₄ ^3- или СН3СОО^- с любым противоионом) то, как эти соли проявляют эффект высаливания в отношении практически всего конъюгированного альбумина по данному описанию, отличается от их поведения в отношении неконъюгированного альбумина (т.е. меркаптальбумина и альбумина, кэпированного цистеином), что делает возможным непрерывное хроматографическое разделение конъюгированного альбумина и неконъюгированного альбумина. То есть, для того, чтобы инициировать взаимодействие между лигандом и конъюгированным альбумином, требуются более низкие концентрации соли, чем для инициирования взаимодействия между лигандом и неконъюгированным альбумином. Это хроматографическое разделение практически не зависит от (а) последовательности альбумина (например, человеческого, мыши, крысы и т.д.), (б) источника альбумина (т.е. из плазмы или рекомбинантного), (в) молекулярной массы конъюгированной молекулы, (г) положения акцептора Михаэля (или малеинимидной группы) в структуре молекулы, (д) пептидной последовательности или химической структуры молекулы и (е) трёхмерной структуры конъюгированной молекулы, например линейной структуры по сравнению с петлевой структурой.

В предпочтительном варианте настоящего изобретения соль в водном буфере проявляет достаточный эффект высаливания. Для того, чтобы обеспечить достаточный эффект высаливания, соль, предпочтительно, но без ограничения, представляет собой фосфат, сульфат и ацетат. Более предпочтительно, соль является фосфатом или сульфатом. Выбор катиона в буфере менее важен и, следовательно, такой катион можно выбирать, без ограничения, из группы, состоящей из ΝΉ₄ ⁺, РЬ'. К⁺, №Г. С§⁺, Ь1⁺, Мд²⁺ и Ва²⁺.

Водный буфер предпочтительно представляет собой фосфат аммония, сульфат аммония и фосфат магния и более предпочтительно сульфат аммония.

В предпочтительном варианте настоящего изобретения рН буфера имеет значение 3,0-9,0; более предпочтительно 6,0-8,0 и ещё более предпочтительно рН 7,0.

- 2 011168

В предпочтительном варианте настоящего изобретения температура буфера и гидрофобного твёрдого носителя является комнатной (около 25°С), или равна 4°С, или её значение является промежуточным между двумя этими значениями.

В табл. 1 показан пример влияния различных солей на очистку предварительно полученного конъюгата Н8А: первый аналог СЬР-1 из раствора Н8А с применением бутилсефарозы (структура первого аналога СЬР-1 описана ниже, в примере 1).

Таблица 1

Тип соли	Начальная концентрация соли 750 мМ	Начальная концентрация соли 1750 мМ
Фосфат аммония	Да	да
Сульфат аммония	Да	да
Хлорид аммония	Да	нет
Йодид аммония	Нет	нет
Тиоцианат аммония	Нет	нет
Сульфат магния	Нет	Да
Фосфат магния	-	-
Сульфат бария*	-	-

* означает, что соль нерастворима в концентрациях 1750 мМ или 750 мМ в растворе 20 мМ фосфата натрия (рН 7), 5 мМ каприлата.

«Да» означает, что достигается успешное разделение между конъюгатом Н8Л: первый аналог СЬР1 и неконъюгированным НЛ8.

«Нет» означает, что не достигается успешное разделение между конъюгатом Н8Л: первый аналог СЬР-1 и неконъюгированным НЛ8.

Предполагается, что термин пептид означает аминокислотную последовательность с молекулярной массой по меньшей мере 57 Да. Пептидная последовательность может быть кольцевой (петлевая структура), такой как ΆΝΈ, может содержать более одной аминокислотной цепи, такой как инсулин, или может быть линейной, такой как К5, динорфин А, С-34 и СЬР-1.

Краткое описание фигур

Каждая фигура иллюстрирует ЖК/ЭМС анализ содержания в элюированных фракциях хроматографии, осуществленной в соответствии с настоящим изобретением для сепарации/очистки соединений, описанных в примерах. Каждая фракция была обессолена и концентрирована ранее ЖК/ЭМС анализа, как описано ниже.

На фиг. 1 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: первый аналог СЬР-1 (8ЕО ΙΌ N0:1) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 1;

на фиг. 2 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: первый аналог СВР (8Е0 Ш N0:2) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 2;

на фиг. 3 иллюстрируется очистка неконъюгированного Н8А по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 3;

на фиг. 4 иллюстрируется очистка конъюгата гН8А: первый аналог СЬР-1 (8Е0 ΙΌ N0:1) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 4;

на фиг. 5 иллюстрируется очистка Н8А сойех по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 5;

на фиг. 6 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: аналог К5 (8Е0 ΙΌ N0:3) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 6;

на фиг. 7 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: первое производное инсулина (8Е0 ΙΌ N0:4) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 7;

на фиг. 8 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: второе производное инсулина (8Е0 ΙΌ N0:5) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 8;

на фиг. 9 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: первый аналог С34 (8Е0 ΙΌ N0:6) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 9;

на фиг. 10 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: второй аналог С34 (8Е0 ΙΌ N0:7) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 10;

на фиг. 11 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: третий аналог С34 1 (8Е0 ΙΌ N0:8) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 11;

на фиг. 12 иллюстрируется очистка Ь-цистеина по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 12;

на фиг. 13 иллюстрируется очистка конъюгата Ь-цистеин: первый аналог СЬР-1 (8Е0 ΙΌ N0:1) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 13;

на фиг. 14 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: второй аналог СЬР-1 (8Е0 ΙΌ N0:9) по пред- 3 011168 почтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 14;

на фиг. 15 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: третий аналог СЬР-1 (8ЕО ГО N0:10) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 15;

на фиг. 16 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: четвёртый аналог СЕР-1 (8Е0 ГО N0:11) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 16;

на фиг. 17 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: пятый аналог СЬР-1 (8Е0 ГО N0:12) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 17;

на фиг. 18 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: первый аналог эксендина-4 (8Е0 ГО N0:13) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 18;

на фиг. 19 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: второй аналог эксендина-4 (8Е0 ГО N0:14) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 19;

на фиг. 20 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: МРА по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 20;

на фиг. 21 иллюстрируется очистка Н8А по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 21;

на фиг. 22 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: второй аналог с34 (8Е0 ГО N0:3) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 22;

на фиг. 23 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: первый аналог динорфина-А (8Е0 ГО N0:15) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 23;

на фиг. 24 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: первый аналог АЯР (8Е0 ГО N0:16) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 24;

на фиг. 25 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: второй аналог динорфина А (8Е0 ГО N0:17) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 25;

на фиг. 26 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: ингибитор АСЕ (8Е0 ГО N0:18) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 26;

на фиг. 27 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: шестой аналог СЬР-1 (8Е0 ГО N0:19) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 27;

на фиг. 28 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: седьмой аналог СЬР-1 (8Е0 ГО N0:20) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 28;

на фиг. 29 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: восьмой аналог СЬР-1 (8Е0 ГО N0:21) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 29;

на фиг. 30 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: девятый аналог СЬР-1 (8Е0 ГО N0:22) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 30;

на фиг. 31 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: десятый аналог СЬР-1 (8Е(3 ГО N0:23) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 31;

на фиг. 32 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: одиннадцатый аналог СЬР-1 (8Е0 ГО N0:24) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 32;

на фиг. 33 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: третий аналог эксендина-4 (8Е0 ГО N0:25) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 33;

на фиг. 34 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: двенадцатый аналог СЬР-1 (8Е0 ГО N0:26) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 34;

на фиг. 35 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: первое производное инсулина с модификацией в цепи В (8Е0 ГО N0:4) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 35;

на фиг. 36 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: третье производное инсулина с модификацией в цепи В (8Е0 ГО N0:27) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 36;

на фиг. 37 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: второе производное инсулина с модификацией в цепи А (8Е0 ГО N0:5) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 37;

на фиг. 38 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: четвёртое производное инсулина с модификацией в цепи В (8Е0 ГО N0:28) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 38;

на фиг. 39 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: первый аналог СНГ (8Е0 ГО N0:2) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 39;

на фиг. 40 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: второй аналог СВР (8Е0 ГО N0:29) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 40;

на фиг. 41 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: третий аналог СНГ (8Е0 ГО N0:30) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 41;

на фиг. 42 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: четвёртый аналог СНГ (8Е0 ГО N0:31) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 42;

на фиг. 43 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: тринадцатый аналог СЬР-1 С1С 1365 (8Е0 ГО

- 4 011168

N0:32) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 43; на фиг. 44 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л лактоза: первый аналог ОЬР-1 (8Е0 ГО N0:1) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 44;

на фиг. 45 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: первый аналог Т20 (8Е0 ГО N0:33) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 45;

на фиг. 46 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: первый аналог Т1249 (8Е0 ГО N0:34) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 46;

на фиг. 47 иллюстрируется очистка соединения Н8Л: первый аналог ОЬР-1 (8Е0 ГО N0:1) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 47;

на фиг. 48 иллюстрируется очистка соединения Н8Л: первый аналог С34 (8Е0 ГО N0:6) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 48;

на фиг. 49 иллюстрируется очистка соединения Н8Л: второй аналог ОКЕ (8Е0 ГО N0:29) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 49;

на фиг. 50 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: аналог винорельбина (8Е0 ГО N0:35) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 50;

на фиг. 51 иллюстрируется очистка Ь-цистеина по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 51;

на фиг. 52 иллюстрируется очистка конъюгата Ь- цистеин: аналог винорельбина (8Е0 ГО N0:35) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 52;

на фиг. 53 иллюстрируется очистка конъюгата К.8Л: третий аналог эксендина-4 (8Е0 ГО N0:25) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 53;

на фиг. 54 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: четвёртый аналог С34 (8Е0 ГО N0:36) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 54;

на фиг. 55 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: пятый аналог С34 (8Е0 ГО N0:37) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 55;

на фиг. 56 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: шестой аналог С34 (8Е0 ГО N0:38) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 56;

на фиг. 57 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: седьмой аналог С34 (8Е0 ГО N0:39) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 57;

на фиг. 58 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: восьмой аналог С34 (8Е0 ГО N0:40) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 58;

на фиг. 59 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: первый аналог ΡΥΥ (8Е0 ГО N0:41) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 59;

на фиг. 60 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: второй аналог ΡΥΥ (8Е0 ГО N0:42) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 60;

на фиг. 61 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: пятое производное инсулина с модификацией в цепи В (8Е0 ГО N0:43) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 61;

на фиг. 62 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: шестое производное инсулина с модификацией в цепи В (8Е0 ГО N0:44) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 62;

на фиг. 63 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: седьмое производное инсулина с модификацией в цепи В (8Е0 ГО N0:45) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 63;

на фиг. 64 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: третий аналог ΡΥΥ (8Е0 ГО N0:46) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 64;

на фиг. 65 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: четвёртый аналог ΡΥΥ (8Е0 ГО N0:47) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 65;

на фиг. 66 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: пятый аналог ΡΥΥ (8Е0 ГО N0:48) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 66;

на фиг. 67 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: шестой аналог ΡΥΥ (8Е0 ГО N0:49) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 67;

на фиг. 68 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: второй аналог Л№ (8Е0 ГО N0:50) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 68;

на фиг. 69А-В иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: третий аналог Л№ С1С 1681 (8Е0 ГО N0:51) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 69;

на фиг. 70 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: первый аналог 0ΒΡ-1 (8Е0 ГО N0:1) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 70;

на фиг. 71 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: первый аналог 0ΒΡ-1 (8Е0 ГО N0:1) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 71;

на фиг. 72 иллюстрируется очистка конъюгата Н8Л: первый аналог 0ΒΡ-1 (8Е0 ГО N0:1) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 72;

- 5 011168 на фиг. 73 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: первый аналог СЬР-1 (8ЕЦ ΙΌ N0:1) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 73;

на фиг. 74 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: первый аналог СЬР-1 (8ЕЦ ΙΌ N0:1) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 74;

на фиг. 75 иллюстрируется очистка конъюгата Н8А: первый аналог СЬР-2 (8ЕЦ ΙΌ N0:52) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 75; и на фиг. 76 иллюстрируется очистка конъюгата В8А: первый аналог СЬР-2 (8Е0 ΙΌ N0:52) по предпочтительному варианту способа по настоящему изобретению, как описано в примере 76.

Подробное описание предпочтительного варианта настоящего изобретения

Согласно настоящему изобретению охватывается способ очистки конъюгатов альбумина из раствора, содержащего конъюгаты альбумина и неконъюгированный альбумин.

Способы

Получение контрольного (неконъюгированного) человеческого сывороточного альбумина (НЛ8) и преформированных конъюгатов альбумина.

Каждое соединение с акцетором Михаэля солюбилизируют в наночистой воде (или, если соединение трудно солюбилизируется, в ДМСО) с концентрацией 10 мМ, затем разводят до концентрации 1 мМ в растворе НЛ8 (25%, 250 мг/мл, Сойех-Вюсйет, 8аи Ьеаибго, СА). Затем образцы инкубируют при 37°С в течение 30 мин. Перед очисткой каждый конъюгат разводят до концентрации 5% 50 мг/мл Н8А в 20 мМ натрий-фосфатном буфере (рН 7), содержащем 5 мМ октаноата натрия. Начальную концентрацию соли, применяемой в градиентной элюции, можно добавить к буферу для разведения раствора смеси. Предпочтительно начальная концентрация соли составляет около 750-1700 мМ (ЛН₄)₂80₄.

Методика очистки по предпочтительному варианту изобретения

Применяя хроматографическую систему очистки АКТА (Атегайат Вюэаеисеэ, Ирр8а1а, 8\гебеп). каждый конъюгат при скорости потока 2,5 мл/мин наносят на колонку 50 мл с бутилсефарозой 4 Рай Р1о\т (ЕР) (Атегайат ВюЛепсей Ирр8а1а, 8^ебеп), уравновешенной с 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7), содержащим 5 мМ октаноата натрия и 750 мМ-1,7 М (ХН₄)₂80₄. В этих условиях увеличение молекулярной массы конъюгатов НА8 составляет более 2 кДа относительно неконъюгированного НА8, нанесённого на гидрофобный полимер, тогда как практически весь неконъюгированный НА8 элюируется из свободного объёма колонки. Для увеличения молекулярной массы менее 2 кДа можно использовать более высокое начальное содержание соли с последующим постадийным градиентом уменьшения содержания соли. Каждый конъюгат можно очищать далее от любого свободного неконъюгированного соединения с применением постоянного или постадийного (непостоянного) градиента понижения концентрации соли (от 750 до 0 мМ (НН₄)₂80₄) в объёме, равном 4 объёмам колонки. В предпочтительном варианте изобретения каждый очищенный конъюгат затем обессоливают и концентрируют диафильтрацией, например, используя ультрафильтры (30 кДа) Аписом® (М1Шроге Согрогайоп, ВебГогб, МА). Наконец, для продолжительного хранения каждый раствор конъюгата предпочтительно помещают в жидкий азот и лиофилизируют, используя систему для лиофилизации Ьайсопсо (Ргее2опе®4.5), и хранят при 20°С.

Примеры ЖХ/ЭМС (ЬС/ЕМ8) анализа

После очистки 1 мкл каждого образца конъюгата предпочтительно инъецируют в систему ЬС/ЕМ8. Конъюгат Н8А: первый аналог СЬР-1 (8ЕЦ ΙΌ N0:1) подтверждают, обнаруживая наиболее распространённую частицу с общей молекулярной массой 70160 Да, что соответствует массе меркаптальбумина (66448 Да), в котором цистеин 34 находится в виде свободного тиола, плюс масса только одной молекулы аналога СЬР-1 (3719.9 Да). Структура первого аналога СЬР-1 (8ЕЦ ΙΌ N0:1) описана ниже, в примере 1. Она иллюстрируется табл. 2.

Таблица 2

Компонент	Молекулярная масса	Абсолютное содержание	Относительное содержание
А	70160.58.	321970	100.00
В	65862.95	70008	21.74
С	64545.45	62888	19.53
ϋ	70320.04	41167	12.79
Е	61287.67	16842	5.23
Р	60623ю81	16522	5.13
С	58090.04	12473	3.87

Структуру конъюгата Н8А: первый аналог СВР (8ЕЦ Ш N0:2) подтверждают, обнаруживая наиболее распространённую частицу с общей молекулярной массой 70086 Да, что соответствует массе меркаптальбумина (66448 Да), в котором цистеин 34 находится в виде свободного тиола, плюс масса только

- 6 011168 одной молекулы первого аналога СКР (3648.2 Да). Структура первого аналога СКР (8ЕО ΙΌ N0:2) описана ниже в примере 2. Она иллюстрируется табл. 3.

Таблица 3

Компонент	Молекулярная масса	Абсолютное содержание	Относительное содержание
А	70086.06	279413	100.00
В	63214.84	53333	19.09
С	62148.17	38582	13.81
ϋ	70247.98	34870	12.48
Е	56795.96	10523	3.77
Р	62695.49	9813	3.51

Нижеприведённые примеры иллюстрируют некоторые соединения, содержащие малеинимидную группу в качестве акцептора Михаэля, которые были конъюгированы с альбумином и очищены в соответствии со способом по настоящему изобретению.

Нижеприведённые примеры даются с целью иллюстрации настоящего изобретения, но не с целью ограничения его объёма.

В нижеприведённых примерах номера градиента относятся к следующим особенностям (характеристикам) градиента, где СУ означает объём колонки 50 мл.

Градиент №1. Линейный 750-0 мМ (ΝΗ₄)₂80₄, 4СУ, скорость потока 2,5 мл/мин.

Градиент №2. Ступенчатый градиент 1,75 М-1,2 М (ΝΗ₄)₂80₄, 0,5СУ, затем 1,2 М-875 мМ (ΝΗ₄)₂80₄, 5СУ, и наконец, 875 мМ-0 мМ (ΝΗ₄)₂80₄, 0,5СУ, скорость потока 2,5 мл/мин.

Градиент №3. Линейный 900-0 мМ (ΝΗ₄)₂80₄, 4СУ, скорость потока 2.5 мл/мин.

Градиент №4. Ступенчатый градиент 1,5 М-1,1 М (ΝΗ₄)₂80₄, 0,5СУ, затем 1.1 М-375 мМ (ΝΗ₄)₂80₄, 6СУ, и наконец, 375 мМ-0 мМ (ΝΗ₄)₂80₄, 0,5СУ, скорость потока 2.5 мл/мин.

Градиент №5. Линейный 750-0 мМ (ΝΗ₄)₂80₄, 2СУ, скорость потока 2,5 мл/мин.

Градиент №6. Ступенчатый градиент 1,75 М-0 М (ΝΗ₄)₂80₄, 6СУ, скорость потока 2.5 мл/мин.

Градиент №7. Линейный 750-0 мМ ^Н-|)280₄.6СУ. скорость потока 2,5 мл/мин.

Пример 1. Очистка конъюгата Н8А: первый аналог СЬР-1 (8Е0 ΙΌ N0:1).

Первый аналог СЬР-1 представляет собой СЬР-1 (7-36) бА1а⁸ Ьу8³⁷ Ο:-ΑΕΕΑ-ΜΡΑ)-ίΌΝΗ_; и имеет следующую последовательность:

Н(ЙА)ЕΟΤΡΤδϋУ88УЬЕС(?ААКЕГ1А1¥ЬУКСКК(АЕЕА- М РАУСОМ! з

Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл Н8А (Сойех-Вюсйет, 8ап Ьеапбго, СА) с 1 мМ первого аналога СЬР-1, разведённым в 9 мл буфера, полученного из 20 мМ натрийфосфатного буфера рН 7,0, 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΝΗ₄)₂80₄, проводят на колонке с бутилсефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 1 фракцию очищенного конъюгата элюирует в градиенте понижения концентрации (ΝΗ4)₂80₄ как фракцию В (Р8-Р9), тогда как неконъюгированный альбумин элюируется из свободного объёма колонки (фракция А). Фракцию конъюгата концентрируют на фильтре иНгаГгее™ 30 кДа и анализируют с помощью ЬС-ЕМ8.

Пример 2. Очистка конъюгата Н8А: первый аналог СКР (8Е0 ΙΌ N0:2).

Первый аналог СКР представляет собой СКР (1-29) бА1а² С1п⁸ А1а¹⁵ Ьеи²⁷ Ьу5^3,0(з-МРА)С0НН_; и имеет следующую последовательность:

УаВА1ЕТр8¥ВКУ1.АрЬ8АККЬЬ(^О1[,8КК(МРА)- ΟΟΝΗ->

Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл Н8А (Сойех-Вюсйет, 8ап Ьеапйго, СА) с 1 мМ первого аналога СКР, разведённым в 9 мл буфера 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΝΗ₄)₂80₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 2 фракция очищенного конъюгата наблюдается во фракции В (Р6-Р7), тогда как неконъюгированный альбумин элюируется из свободного объёма колонки (фракция А). Фракцию конъюгата концентрируют на фильтре ИИтаГгее™ 30 кДа и анализируют с помощью ЬС- ЕМ8.

Пример 3. Очистка 1 мл неконъюгированного НА8.

Очистку 1 мл 25% 250 мг/мл неконъюгированного Н8А (Сойех- Вюсйет, 8ап Ьеапбго, СА), разведённого в 9 мл буфера (рН 7,0), полученного из 20 мМ натрий-фосфатного буфера, 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (МН₄)₂804, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. Практически все молекулы альбумина элюируются из свободного объёма и никаких частиц белка не наблюдается при 280 нм в градиенте (МН₄)₂80₄. На фиг. 3 даётся кривая разделения.

Пример 4. Очистка конъюгата гН8А: первый аналог СЬР-1 (8Е0 ΙΌ N0:1).

Первый аналог СЬР-1 представляет собой СЬР-1 (7-36) бА1а Ьу§ (е-АЕЕА-МРА)-С0КН₂ и его последовательность представлена в примере 1.

Очистку конъюгата, полученного по реакции 5 мл 5% гН8А (культура рекомбинантного НА8 сте

- 7 011168 пени чистоты, доступной самыми современными методами), с 200 мкМ первого аналога СЬР-1, разведёнными в 5 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрий-фосфатного буфера, 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΝΗ₄)₂8Θ₄, проводят на колонке с бутилсефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 4 фракция очищенного конъюгата наблюдается во фракции В (Р7-Р8-Р9).

Пример 5. Очистка 10 мл ΗΑ8.

Очистку 10 мл 25% 250 мг/мл Η8Ά (Сойех-Вюсйет, 8ап Ьеапбго, СА), разведённого в 40 мл буфера, полученного из 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΝΗ₄)₂8Θ₄, проводят на колонке с бутилсефарозой в градиенте №1, описанном выше. Практически все молекулы альбумина элюируются из свободного объёма и никаких частиц белка не наблюдается при 280 нм в градиенте (ΝΗ₄)₂8Θ₄. На фиг. 5 даётся полученная кривая разделения.

Пример 6. Очистка конъюгата Η8Α: аналог К-5 (8Е0 Ш N0:3).

Аналог К5 представляет собой Ас-К5 Ьу§⁸ (ε- ΜΡΑ)-ΝΗ₂ и имеет следующую последовательность:

Очистку конъюгата, полученного по реакции 4 мл 25% 250 мг/мл Η8Α (Сойех-Вюсйет, 8ап Ьеапбго, СА) с 1 мМ аналога К-5, разведённым в 16 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрийфосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΝΗ₄)₂80₄, проводят на колонке с бутилсефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 6 фракция очищенного конъюгата наблюдается во фракции А с альбумином и во фракции В (Р6-Р7-Р8).

Пример 7. Очистка конъюгата Η8Α: первое производное инсулина (8Е0 Ш N0:4).

Первое производное инсулина представляет собой человеческий инсулин с МРА в положении В1 В цепи (8Е0 Ш N0:4) и нативной А цепью (8Е0 Ш N0: 35). Формула 1 представляет первое производное инсулина, описанное в настоящем примере, а также другие производные инсулина, описанные в последующих примерах. Формула 1 дает представление о дисульфидном мостике в цепи А и двух дисульфидных мостиках между цепями А и В для всех производных инсулина.

Формула 1

Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл Η8Α (Сойех-Вюсйет, 8ап Ьеапбго, СΑ) с 1 мМ первого производного инсулина, разведённым в 9 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (N4,1)280^1, проводят на колонке с бутилсефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 7 фракция очищенного конъюгата наблюдается во фракции В (Р6-Р7-Р8).

Пример 8. Очистка конъюгата Η8Α: второе производное инсулина (8Е0 Ш N0:5).

Второе производное инсулина представляет собой человеческий инсулин с МРА в положении Α1 цепи Α (8Е0 Ш N0:5) и нативной цепью В (8Е0 Ш N0: 53) и изображено как формула 1, пример 7.

Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл Η8Α (Сойех-Вюсйет, 8ап Ьеап

- 8 011168 бго. СА) с 1 мМ второго производного инсулина, разведённым в 9 мл 20 мМ натрийфосфатного буфера (рН 7.0). 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΝΗ.₁)₂8Θ.₁. проводят на колонке с бутилсефарозой в градиенте №1. описанном выше. На фиг. 8 фракция очищенного конъюгата наблюдается во фракции В (Р6-Р7-Р8).

Пример 9. Очистка конъюгата Н8А: первый аналог С34 (8Е0 ГО N0:6).

Первый аналог С34 представляет собой ΜΡА-АΕΕА-С34-СΟNН₂ и имеет следующую последовательность:

Ν-Ν-¥“Τ-5-ί—ί—Η-Ε-Ε-β-Ο-Ν-Ο-α-Ε-Κ-Μ-Ε-Ο-Ε-ί-ί-ΟΟΝ^

АЕЕА

МРА

Очистку конъюгата. полученного по реакции 5 мл 25% 250 мг/мл Н8А (Сойех-Вюейеш. 8ап Ьеапбто. СА) с 1 мМ первого аналога С34. разведённым в 20 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.0). 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΝΗ₄)₂80₄. проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1. описанном выше. На фиг. 9 фракция очищенного конъюгата наблюдается во фракции Р2.

Пример 10. Очистка конъюгата Н8А: второй аналог С34 (8Е0 ГО N0:7).

Второй аналог С34 представляет собой С34 (1-34) Ьу§³⁵ (ε- АЕЕА- МРА)-С0NН₂ и имеет следующую структуру:

«-Μ-Ε-νν-Ο-Β-Ε-Ι-Ν-Ν-Υ-Τ-3-ί—НН-8-ί—ΚΕ-Ε-δ-Ο-Ν-Ο-Ο-^Κ-Ν-^Ο-Ε-^ί-ρ-ΟΟΝΗί ^£ЕА МРА

Очистку конъюгата. полученного по реакции 5 мл 25% 250 мг/мл Н8А (Сойех-Вюейеш. 8ап Ьеапбто. СА) с 1 мМ второго аналога С34. разведённым в 20 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера. 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΝΠ₄)₂§0₄. проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1. описанном выше. На фиг. 10 фракция очищенного конъюгата наблюдается во фракции Р2.

Пример 11. Очистка конъюгата Н8А: третий аналог С34 (8Е0 ГО N0:8).

Второй аналог С34 представляет собой С34 (1-34) Ьу§¹³^- АЕЕА- МРА)-С0NΠ₂ и имеет следующую структуру:

νν-Μ-Ε-νν-ο-н-е—Η-Ν-Ν-γ-τ-κ-ι—нн-з-ι.— ι-ε-Ε-ε-ο-Ν-ο-α-Ε-κ-Ν-Ε-α-Ε-ι.-ν-οοΝ^

АЕЕА

МРА

Очистку конъюгата. полученного по реакции 5 мл 25% 250 мг/мл Н8А (Сойех-Вюейеш. 8ап Ьеапбто. СА) с 1 мМ третьего аналога С34. разведённым в 20 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.0). 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (N^^80/1. проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1. описанном выше. На фиг. 11 фракция очищенного конъюгата наблюдается во фракции Р2.

Пример 12. Очистка Ь-цистеина.

Очистку 121 мг Ь-цистеина в 2 мл буфера. полученного из 20 мМ фосфата натрия. 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (N^^80^ проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №5. описанном выше. На фиг. 12 показана полученная кривая разделения. на которой Ь-цистеин элюируется из свободного объёма колонки (Р3).

Пример 13. Очистка конъюгата Ь-цистеин: первый аналог ОЬР-1 (8Е0 ГО N0:1).

Первый аналог ОЬР-1 представляет собой ОЬР-1 (7-36) бА1а⁸ Ьу§ (ε-АЕЕА-МРА)-С0NΠ₂ и его последовательность представлена в примере 1.

Очистку конъюгата. полученного по реакции 121 мг Ь-цистеина с 36.36 мг первого аналога ОЬР-1. разведёнными в 2 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.0). 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (N^^80^ проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №5. описанном выше. На фиг. 13 показана полученная кривая разделения. на которой избыток Ь-цистеина элюируется во фракции Р3 (свободный объём колонки). а конъюгат Ь-цистеин: первый аналог ОЬР-1 элюируется при 0 мМ (N^2804.

Пример 14. Очистка конъюгата Н8А: второй аналог ОЬР-1 (8Е0 ГО N0:9).

Второй аналог ОЬР-1 представляет собой ОЬР-1 (7-36) ЬуЧО- МРА)-NΠ₂ и имеет следующую последовательность :

НАЕСТГТ8ОУ88УЬЕСрААКЕПА\¥ЕУКСКК(£- МРА)

Очистку конъюгата. полученного по реакции 2.5 мл 25% 250 мг/мл Н8А (Сойех-Вюейеш. 8ап Ьеапбто. СА) с 1 мМ второго аналога ОЬР-1. разведённым в 10 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.0). 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (N^^80^ проводят на колонке с бутилсефарозой в градиенте №5. описанном выше. На фиг. 14 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2.

Пример 15. Очистка конъюгата Н8А: третий аналог ОЬР-1 (8Е0 ГО N0:10).

Третий аналог ОЬР-1 представляет собой ОЬР-1 (7-36) б А 1а⁸ Ьу§³⁷ (ε-ΜРА)-NΠ₂ и имеет следующую последовательность:

Н(0А)ЕСТГТ80У88¥ЕЕС9ААКЕГ1АУ¥ЕУКСКК(МРА)-СОКН_г

Очистку конъюгата. полученного по реакции 2.5 мл 25% 250 мг/мл Н8А (Сойех-Вюейеш. 8ап Ьеапбто. СА) с 1 мМ второго аналога ОЬР-1. разведённым в 10 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.0).

- 9 011168 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ЛВ₄)₂80₄, проводят на колонке с бутилсефарозой в градиенте №5, описанном выше. На фиг. 15 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2.

Пример 16. Очистка конъюгата Η8Α: четвёртый аналог СЬР-1 (8Е0 ГО N0:11).

Четвёртый аналог СЬР-1 представляет собой СЬР-1 (7-36) Ьу5²⁶(8-АЕЕА- АЕЕА-МРА) и имеет следующую последовательность:

ПАЕСТГТ8ОУ88¥ЕЕСЦААК(е- АЕЕА- АЕЕА- МРА)ЕЕ1А\УЬУКСК

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2,5 мл 25% 250 мг/мл Η8Α (Сойех-Вюсйет, 8аи Ьеаибго, СА) с 1 мМ четвёртого аналога СЬР-1, разведённым в 10 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΝΗ₄)₂80₄, проводят на колонке с бутилсефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 16 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2.

Пример 17. Очистка конъюгата Η8Α: пятый аналог СЬР-1 (8Е0 ГО N0:12).

Пятый аналог СЬР-1 представляет собой СЬР-1 (7-36) Еу8³⁴(е-АЕЕА-АЕЕА-МРА) и имеет следующую последовательность:

НАЕСТГТЗОУЗБУЕЕСОААКЕПАХУЫ КСв- АЕЕА- АЕЕА- МРА)СК

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2,5 мл 25% 250 мг/мл Η8Α (Сойех-Вюсйет, 8аи Ьеаибго, СА) с 1 мМ пятого аналога СЬР-1, разведённым в 10 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΝΗ₄)₂80₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 17 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2.

Пример 18. Очистка конъюгата Η8Α: первый аналог эксендина-4 (8Е0 ГО N0:13).

Первый аналог эксендина-4 представляет собой эксендин-4 (1-39) ^у8⁴⁰(ε-МРА)-NΗ₂ и имеет следующую последовательность:

НСЕСТГТ8ВЬ8К0МЕЕЕАУКЕГ1ЕМЫС^ССР88САРРР8К(£~ МРА)- МП

Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл Η8Α (Сойех-Вюсйет, 8аи Ьеаибго, СΑ) с 1 мМ первого аналога эксендина-4, разведённым в 9 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΝΗ₄)₂80₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 18 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2.

Пример 19. Очистка конъюгата Η8Α: второй аналог эксендина-4 (8Е0 ГО N0:14).

Второй аналог эксендина-4 представляет собой эксендин-4 (9-39) Еу8⁴⁰(е-АЕЕА-МРА)-С0КП₂ и имеет следующую последовательность:

ОЕ8К(ЖЕЕЕАУКЕГ1ЕЛ¥ЬКМ;СР88САРРР8К(е- АЕЕА- МРА)- ПОМП

Очистку конъюгата, полученного по реакции 3,5 мл 25% Η8Α (Сойех-Вюсйет, 8аи Ьеаибго, СΑ) с 1 мМ второго аналога эксендина-4, разведённым в 21,5 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (№4)2804, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 19 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2.

Пример 20. Очистка Η8Α: МРА.

Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл Η8Α (Сойех-Вюсйет, 8ап Ьеаибго, СΑ) с 2 мМ МРА, разведёнными в 9 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 1750 мМ (№^^80^ проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №2, описанном выше. На фиг. 20 меркаптальбумин элюируется с фракцией Α (Р5), а кэпированный альбумин выходит с фракцией В (Р7-Р8). Фракцию конъюгата концентрируют с помощью фильтра Αт^соη 30 кДа.

Пример 21. Очистка ΗΑ8.

Очистку 1 мл 25% 250 мг/мл Η8Α (Сойех-Вюсйет, 8ап Ьеапбго, СА), разведённого в 9 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 1750 мМ (№₄)₂80₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №2, описанном выше. При использовании градиента № 2, в отличие от градиентов №1 и №5, как конъюгированный альбумин, так и неконъюгированный альбумин адсорбируются на гидрофобном полимере в процессе нанесения образца. На фиг. 21 показана полученная кривая разделения, на которой видно, что Р4 и Р5 обогащены меркаптальбумином, а Р6, Р7 и Р8 обогащены кэпированным альбумином.

Пример 22. Очистка конъюгата Η8Α: второй аналог С34 (8Е0 ГО N0:3).

Второй аналог С34 представляет собой С34 (1-34) Ρ·ν5³Έ:-ΑΕΕΑ- МРА)-С0^№₂ и его структура изображена в примере 10.

Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл Η8Α (Сойех-Вюсйет, 8ап Ьеапбго, СΑ) с 1 мМ второго аналога С34, разведённым в 9 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 1750 мМ (№4^80^ проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №2, описанном выше. На фиг. 22 меркаптальбумин элюируется с фракцией Α (Р5), а кэпированный альбумин и очищенный конъюгат выходит с фракцией В (Р7- Р8).

Пример 23. Очистка конъюгата Η8Α: первый аналог динорфина Α (8Е0 ГО N0: 15).

Первый аналог динорфина А представляет собой Эуп Α (1-13) (МРА)-№₂ и имеет следующую структуру: +661^1/141/1441.14(411/+)-(7)411:.

Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл Η8Α (Сойех-Вюсйет, 8ап Ьеап

- 10 011168 бго, СА) с 1 мМ первого аналога динорфина А, разведённым в 9 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 1750 мМ (ΝΗ₄)₂8Θ₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №2, описанном выше. На фиг. 23 фракция очищенного конъюгата выходит с фракцией А (Е11-Е12).

Пример 24. Очистка конъюгата Н8А: первый аналог ΑΝΡ (8Е0 ГО N0:16).

Первый аналог А№ представляет собой МРА-АЕЕА-ΑNΡ(99-126)-С0NΗ₂ и имеет следующую структуру:

МРА-АЕЕА-5ег-Ьси-Агд-Ат8-8ег-8ег-<рг5-Р11е-в1у-С1у-Аг§-Ме1-АзрАте-11е-С1у-А1а-О1п-8ег-О}у-1<еиЧ51у-Су5-А5п-8ег-РЬе-Аг8-Туг-СОМН₂

Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл Н8А (Сойех-Вюсйет, 8аи Ьеапбго. СА) с 1 мМ первого аналога А№, разведённым в 9 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 1750 мМ (ΝΗ₄)₂80₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №2, описанном выше. На фиг. 24 фракция очищенного конъюгата выходит с фракцией А (Е14).

Пример 25. Очистка конъюгата Н8А: второй аналог динорфина А (8Е0 ГО N0:17).

Второй аналог динорфина А представляет собой Ωνη А (7-13) Ьу8¹³(МРА)-С.ГОН₂ и имеет следующую последовательность: Κ.IΚРΚ^Κ(МРΑ)-СΟNΗ₂.

Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл Н8А (Сойех-Вюскет, 8аи Ьеапбго, СА) с 1 мМ второго аналога динорфина А, разведённым в 9 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 1750 мМ (ΝΗ₄)₂80₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №2, описанном выше. На фиг. 25 фракция очищенного конъюгата выходит с фракцией А (Е9).

Пример 26. Очистка конъюгата Н8А: ингибитор АСЕ (8Е0 ГО N0:18).

В данном примере ингибитор АСЕ представляет собой ацетил-Рйе-Н18-циклогексилстатил- Те-ЬуЦе-

Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл Н8А (Сойех-Вюскет, 8аи Ьеапбго, СА) с 1 мМ ингибитора АСЕ, разведённым в 9 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 1750 мМ (ΝΗ₄)₂80₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №2, описанном выше. На фиг. 26 фракция очищенного конъюгата выходит с фракцией А (Е11-Е12).

Пример 27. Очистка конъюгата ΗΥ: шестой аналог СЬР-1 (8Е0 ГО N0:19).

Шестой аналог СЬР-1 представляет собой СЬР-1 (7-36) ^у8²³(ε-АЕЕА-МРА)-С0NΗ₂ и имеет следующую последовательность:

НАЕСТЕТ8ВУ88УЬЕСК(АЕЕА- ΜΡΑ)ΑΑΚΕΠΑ\λΤΛ Κ6Κ- СОА’Ш

Очистку конъюгата, полученного по реакции 3 мл 25% 250 мг/мл №А (Сойех-Вюскет, 8аи Ьеаибго, СА) с 1 мМ шестого аналога СЬР-1, разведённым в 22 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 1750 мМ (N^^80^ проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 27 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 28. Очистка конъюгата №А: седьмой аналог СЬР-1 (8Е0 ГО N0:20).

Седьмой аналог СЬР-1 представляет собой СЬР-1 (7-36) Ьу§ (ε-АЕЕА-МРА)-С0NΗ₂ и имеет следующую последовательность:

НАЕСТЕТ8ВУ8К(АЕЕА- МРА)УЬЕСОААКЕПАЧАТА'КСШ- СО\Н_;

Очистку конъюгата, полученного по реакции 3 мл 25% 250 мг/мл №А (Сойех-Вюскет, 8ап Ьеаибго, СА) с 1 мМ седьмого аналога СЬР-1, разведённым в 22 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (N^2804, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 28 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 29. Очистка конъюгата №А: восьмой аналог СЬР-1 (8Е0 ГО N0:21).

Восьмой аналог СЬР-1 представляет собой СЬР-1 (7-36) Ьу5^:60:-АЕЕА- МРА^ТОМ^ и имеет следующую последовательность:

ΗΑΕΟΤΕΤ8Βν88ΥΕΕΟ(?ΑΑΚ(ΑΕΕΑ- МРА)ЕГ1А\МЛ КСШ- СО\Н.

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2,5 мл 25% 250 мг/мл №А (Сойех-Вюскет, 8ап Ьеапбго, СА) с 1 мМ восьмого аналога СЬР-1, разведённым в 22,5 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΚΗ₄)₂80₄, проводят на колонке с бутилсефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 29 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 30. Очистка конъюгата №А: девятый аналог СЬР-1 (8Е0 ГО N0:22).

Девятый аналог СЬР-1 представляет собой СЬР-1 (7-36) ^у8²⁷(ε-АЕЕА-МРА)-С0NΗ₂ и имеет следующую последовательность:

- 11 011168

НАЕСТБТ8ВУ85¥ЬЕС<2ААКК(АЕЕА- .МРА)Е1АЧ1ЛКСК- ΟΟΝΗ₃

Очистку конъюгата, полученного по реакции 3 мл 25% 250 мг/мл Η8Α (Сойех-ВюсЬет, Бап Ьеапбго. СΑ) с 1 мМ девятого аналога ОЬР-1, разведённым в 22 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΝΗ₄)₂8Ο₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 30 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 31. Очистка конъюгата НБЛ: десятый аналог ОЬР-1 (ББО ΙΌ N0:23).

Десятый аналог ОЬР-1 представляет собой ОЬР-1 (7-36) ^у8³⁷(ε-АЕЕА-АЕЕА-МРА)-СΟNΗ₂ и имеет следующую последовательность:

НДЕСгТГТБОУ'ББУЬЕСОААКЕПАЧ'ЬАКСКК- АЕЕА- АЕЕА- МРА- СОМЕ

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2,5 мл 25% 250 мг/мл №Α (Сойех-ВюсЬет, Бап Ьеапбго, СΑ) с 1 мМ десятого аналога ОЬР-1, разведённым в 22,5 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (№Н₄)₂БО₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 31 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 32. Очистка конъюгата №Α: одиннадцатый аналог ОЬР-1 (ББО ΙΌ N0:24).

Одиннадцатый аналог ОЬР-1 представляет собой ОЬР-1 (7-36) Ьу8³⁷(е-АЕЕА-МРА)-СОМН₂ и имеет следующую последовательность:

ΗΑΕΟΤΕΤ8Βν88ΥΕΕΟΟΑΑΚΕΓΙΑΗΈνΚΟΚΚ(ΑΕΕΑ- МРА)- < ΟΝΗ_;

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2,5 мл 25% 250 мг/мл №Α (Сойех-ВюсЬет, Бап Ьеапбго, СΑ) с 1 мМ одиннадцатого аналога ОЬР-1, разведённым в 22,5 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ЯН₄)₂БО₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 32 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 33. Очистка конъюгата №Α: третий аналог эксендина-4 (ББО ΙΌ NΟ:25).

Третий аналог эксендина-4 представляет собой эксендин-4-(1-39) Ьу8⁴⁰(е-АЕЕА-МРА)-СОМН₂ и имеет следующую последовательность:

НСЕСТГТ8ПЬ8К9МЕЕЕАУКЬЕ1ЕЛУЫ<ПССР88ОАРРР8К(;> АЕЕА- МРА)ΟΟΝΗ₂

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2,5 мл 25% №Α (Сойех-ВюсЬет, Бап Ьеапбго, СΑ) с 1 мМ третьего аналога эксендина- 4, разведённым в 22.5 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (№Н₄)₂БО₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 33 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 34. Очистка конъюгата №Α: двенадцатый аналог ОЬР-1 (БЬО ΙΌ NΟ:26).

Двенадцатый аналог ОЬР-1 представляет собой ОЬР-1 (7-36) Ьу8³⁴(е-АЕЕА-МРА)-СОМН₂ и имеет следующую последовательность:

НАЕСТГТ8ВУ88УЬЕСОААКЕГ1А\¥ЬУК(АЕЕА- МРА)СК- СОМЕ

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2,5 мл 25% 250 мг/мл №Α (Сойех-ВюсЬет, Бап Ьеапбго, СΑ) с 1 мМ двенадцатого аналога ОЬР-1, разведённым в 22,5 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ЯН₄)₂БО₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 34 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 35. Очистка конъюгата №Α: первое производное инсулина (БЬО ΙΌ NΟ:4).

Первое производное инсулина представляет собой человеческий инсулин с МРА в положении В1 цепи В (БЬО ΙΌ NΟ: 4) и нативной А цепью (БЬО ΙΌ NΟ: 35), и его структура подробно представлена в примере 7.

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2,5 мл 25% 250 мг/мл №Α (Сойех-ВюсЬет, Бап Ьеапбго, СΑ) с 1 мМ первого производного инсулина, разведённым в 22,5 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ЯН₄)₂БО₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 35 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 36. Очистка конъюгата №Α: третье производное инсулина (БЬО ΙΌ NΟ:27).

Первое производное инсулина представляет собой человеческий инсулин с ОА-МРА в положении В1 цепи В (БЬО ΙΌ NΟ: 27) и нативной А цепью (БЬО ΙΌ NΟ: 35), и его структура показана на формуле 1 в примере 7.

Очистку конъюгата, полученного по реакции 4 мл 25% 250 мг/мл №Α (Сойех-ВюсЬет, Бап Ьеапбго, СА) с 1 мМ третьего производного инсулина, разведённым в 21 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ЯН₄)₂БО₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 36 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 37. Очистка конъюгата №Α: второе производное инсулина (БЬО ΙΌ NΟ:5).

Второе производное инсулина представляет собой человеческий инсулин с МРА в положении А1 цепи Α (БЬО ΙΌ NΟ: 5) и нативной цепью В (БЬО ΙΌ NΟ: 53), и его структура представлена на формуле 1 в примере 7.

Очистку конъюгата, полученного по реакции 3 мл 25% 250 мг/мл №Α (Сойех-ВюсЬет, Бап Ьеап

- 12 011168 йго, СА) с 1 мМ второго производного инсулина, разведённым в 22 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΝΉ₄)₂8Ο₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 37 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 38. Очистка конъюгата Н8А: четвёртое производное инсулина (8Еф ΙΌ N0:28).

Четвёртое производное инсулина представляет собой человеческий инсулин с МРА в положении В29 цепи В (8Еф ΙΌ N0: 28) и нативной цепью А (8Еф ΙΌ N0: 35), и его структура представлена на формуле 1 в примере 7.

Очистку конъюгата, полученного по реакции 3 мл 25% 250 мг/мл Н8А (Сойех-Вюсйет, 8ап Ьеапйго, СА) с 1 мМ четвёртого производного инсулина, разведённым в 22 мл 20 мМ натрийфосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΝΉ₄)₂8Ο₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 38 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 39. Очистка конъюгата Н8А: первый аналог ОКЕ (8Еф ΙΌ ΝΟ:2).

Первый аналог ОКЕ представляет собой ОКЕ (1-29) йА1а² С1п⁸ А1а¹⁵ Ьеи²⁷ Ьу§³⁰ (ε-МРА)СΟNН₂, и его последовательность представлена в примере 2.

Очистку конъюгата, полученного по реакции 3,7 мл 25% 250 мг/мл Н8А (Сойех-Вюсйет, 8ап Ьеапйго, СА) с 1 мМ первого аналога ОКЕ, разведённым в 22 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΝΉ₄)₂8Ο₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 39 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 40. Очистка конъюгата Н8А: второй аналог ОКЕ (8Еф ΙΌ ΝΟ:29).

Второй аналог ОКЕ представляет собой ОКЕ (1-29) ^у8³⁰(ε-МРА)СΟNН₂ и имеет следующую последовательность :

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2,5 мл 25% 250 мг/мл Н8А (Сойех-Вюсйет, 8ап Ьеапйго, СА) с 1 мМ второго аналога ОКЕ, разведённым в 22,5 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 900 мМ (ΝΉ₄)₂8Ο₄, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №3, описанном выше. На фиг. 40 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 41. Очистка конъюгата Н8А: третий аналог ОКЕ (8Еф ΙΌ ΝΟ:30).

Третий аналог ОКЕ представляет собой ОКЕ (1-29) йА1а² О1п⁸ йАгд¹¹ А1а¹⁵ Ьеи²⁷ Гу5³⁰(з-МРЛ)СΟNН₂, и имеет следующую последовательность:

Υа^ΑIΕΤ^8Υ^ΚV^Α^^8ΑΚΚ^^^^I^8ΒΚ(^ίΡΑ)- СОМЕ

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2,5 мл 25% 250 мг/мл Н8А (Сойех-Вюсйет, 8ап Ьеапйго, СА) с 1 мМ третьего аналога ОКЕ, разведённым в 22,5 мл 20 мМ натрий- фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΝΉ₄)₂8Ο₄, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №3, описанном выше. На фиг. 41 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 42. Очистка конъюгата Н8А: четвёртый аналог ОКЕ (8Еф ΙΌ ΝΟ:31).

Четвёртый аналог ОКЕ представляет собой ОКЕ (1-29) йА1а Ьу§ (ε-МРА)-СΟNН₂, и имеет следующую последовательность:

УаПА1ГТ№УПКУЬСОЬ8АККЕЬЦП1М8КК(МРА)- СОМЕ

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2,5 мл 25% 250 мг/мл Н8А (Сойех-Вюсйет, 8ап Ьеапйго, СА) с 1 мМ третьего аналога ОКЕ, разведённым в 22,5 мл 20 мМ натрийфосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 900 мМ (ΝΉ₄)₂8Ο₄, проводят на колонке с бутилсефарозой в градиенте №3, описанном выше. На фиг. 42 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 43. Очистка конъюгата Н8А: тринадцатый аналог ОЬР-1 СТС 1365 (8Еф ΙΌ ΝΟ:32).

Тринадцатый аналог ОЬР-1 представляет собой ОЬР-1 (9-36) ^у8³⁷(ε-АЕЕА-МРА)-СΟNН₂ и имеет следующую последовательность:

ЕС1Ы8О\88\Е1:С0ЛАКЕЕ1АА\Е\КСККи- АЕЕА- МРА)- СОМЕ

Очистку конъюгата, полученного по реакции 3,5 мл 25% 250 мг/мл Н8А (Сойех-Вюсйет, 8ап Ьеапйго, СА) с 1 мМ тринадцатого аналога ОЬР- 1, разведённым в 21,5 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΝΉ₄)₂8Ο₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 43 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 44. Очистка конъюгата Н8А лактоза: первый аналог ОЬР-1 (8Еф ΙΌ ΝΟ:1).

Первый аналог ОЬР-1 представляет собой ОЬР-1 (7-36) йА1а⁸ ^у8³⁷(ε-АЕЕА-МРА)-СΟNН₂ и имеет последовательность, показанную выше, в примере 1.

Очистку конъюгата, полученного по реакции 4 мл 25% 250 мг/мл лактозаминированного альбумина (Н8А, преинкубированного с избытком лактозы при 37°С, рН 7,0) с 200 мкМ первого аналога ОЬР- 1 в 4 мл буфера, приготовленного из 20 мМ фосфата натрия, 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΝΉ₄)₂8Ο₄, (рН 7,0), проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 44 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 45. Очистка конъюгата Н8А: первый аналог Т20 (8Еф ΙΌ ΝΟ:33).

Первый аналог Т20 представляет собой Ас-Т20 (1-36) Ьу§³⁷ (ε-АЕЕА- МРА)-СΟNН₂ и имеет сле- 13 011168 дующую последовательность:

Ас- УТЗиНЗиЕЕЗфМффЕКЛЕфЕЬЬЕЬПКЗУАЗЬЗУПАТКСАЕЕА- МРА)- СОМН₂

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2,5 мл 25% 250 мг/мл Н8А (Сойех-Вюсйет, 8ап Ьеапбго, СА) с 1 мМ первого аналога Т20, разведённым в 10 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΝΗ₄)₂8Ο₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 45 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2.

Пример 46. Очистка конъюгата Н8А: первый аналог Т1249 (8Е0 ГО N0:34).

Первый аналог Т1249 представляет собой Ас-Т1249 (1-39) ^у8⁴⁰(ε-АЕЕА-МРА)-СΟNН₂ и имеет следующую последовательность:

Ас- \νφΕ\λΕ0ΚΓΙΑΓΕΙ^+Φ0ΕΙ<\ΕΥΕΙΛ)Ι<ΙΓ)Ι<\νΑ8Ε\νΕν>ΓΚ(ΑΕΕΑ- МРА)€ΟΝΗ₃

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2 мл 25% 250 мг/мл Н8А с 1 мМ первого аналога Т1249 в 10,5 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ΝΗ₄)₂8Ο₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 49 очищенный конъюгат выходит во фракции Р4.

Пример 47. Очистка конъюгата Н8А: первый аналог ОЬР-1 (8Е0 ГО N0:1).

Первый аналог ОЬР-1 представляет собой ОЬР-1 (7-36) бА1а⁸ ^у8³⁷(ε-АЕЕА-МРА)-СΟNН₂ и его последовательность представлена в примере 1.

Очистку 114,45 мг преформированного конъюгата первого аналога ОЬР-1 в 12.5 мл 20 мМ натрийфосфатного буфера (рН 7), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (N4^80^ проводят на колонке с бутилсефарозой в градиенте №5, описанном выше. На фиг. 47 показана кривая разделения, полученная для конъюгата, обнаруженного во фракции Р2.

Пример 48. Очистка конъюгата Н8А: первый аналог С34 (8Е0 ГО N0:6).

Первый аналог С34 представляет собой МРА-АЕЕА-С34-СΟNН₂ и имеет последовательность, представленную выше, в примере 9.

Очистку 114,45 мг преформированного конъюгата первого аналога С-34 в 12.5 мл 20 мМ натрийфосфатного буфера (рН 7), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (N4,1)280,1 проводят на колонке с бутилсефарозой в градиенте №5, описанном выше. На фиг. 48 показана кривая разделения, полученная для конъюгата, обнаруженного во фракции Р2.

Пример 49. Очистка конъюгата Н8А: второй аналог ОКР (8Е0 ГО N0:29).

Второй аналог ОКР представляет собой ОКР (1-29) ^у8³⁰(ε-МРА)-СΟNН₂, и его последовательность показана выше в примере 40.

Очистку 125,53 мг преформированного конъюгата второго аналога ОКР в 12,5 мл 20 мМ натрийфосфатного буфера (рН 7), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (NН₄)₂8Ο₄, рН 7,0, проводят на колонке с бутилсефарозой в градиенте №5, описанном выше. На фиг. 49 показана кривая разделения, полученная для конъюгата, обнаруженного во фракции Р2.

Пример 50. Очистка конъюгата Н8А: аналог винорельбина (8Е0 ГО N0:35).

Первый аналог винорельбина представляет собой молекулу винорельбина с присоединённым к ней фрагментом АЕЕА- МРА и имеет следующую структуру:

Очистку конъюгата, полученного из 2,5 мл 25% Н8А и 1 мМ аналога винорельбина в 22.5 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрий-фосфатного буфера, 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ ^Н₄)₂80₄, рН 7,0, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №4, описанном выше. На фиг. 50 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2. Фракцию конъюгата концентрируют на ультрафильтре Аписон™ 30 кДа.

Пример 51. Очистка Ь-цистеина.

Очистку 2,5 мл 40 мМ Ь-цистеина в 22,5 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7), 5 мМ каприлата натрия и 1500 мМ (N4^80,1, рН 7,0, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №4, описанном выше. На фиг. 51 показана кривая разделения, полученная для Ь-цистеина, элюированного из свободного объёма колонки (фракция Р3).

Пример 52. Очистка конъюгата Ь-цистеин: аналог винорельбина (8Е0 ГО N0:35).

Аналог винорельбина представляет собой молекулу винорельбина с присоединённым к ней фрагментом АЕЕА-МРА, как иллюстрируется в примере 50.

- 14 011168

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2,5 мл 40 мМ Ь-цистеина с 1 мМ аналога винорельбина в 22,5 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (N4^80/1, проводят на колонке с бутилсефарозой в градиенте №4, описанном выше. На фиг. 52 иллюстрируется кривая разделения, полученная для конъюгата Ь-цистеина, элюирующегося с фракциями Р8, Р9 и Р10.

Пример 53. Очистка конъюгата В8А: третий аналог эксендина-4 (8Е0 ΙΌ N0:25).

Третий аналог эксендина-4 представляет собой эксендин-4-(1-39) ^у8⁴⁰(ε-АЕЕА-МРА)-СΟNН₂ и имеет последовательность, показанную в примере 33.

Очистку конъюгата, полученного по реакции 11 мл 5% В8А (сывороточный альбумин крысы) с 200 мкМ третьего аналога эксендина-4 в 11 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (N4^80^ проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 53 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2.

Пример 54. Очистка конъюгата Н8А: четвёртый аналог С34 (8Е0 ΙΌ N0:36).

Четвёртый аналог С34 представляет собой С34 (1-34) ^у8¹³(ε-МРА)-С0NН₂ и имеет следующую последовательность :

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2 мл 25% Н8А с 1 мМ четвёртого аналога С34 в 13 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (N4^80^ проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 54 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2.

Пример 55. Очистка конъюгата Н8А: пятый аналог С34 (8Е0 ΙΌ N0:37). Пятый аналог С34 представляет собой С34 (1-34) ^у8³⁵(ε-МРА)-С0NН₂ и имеет следующую последовательность:

\УМЕ\УВКЕт1\ГУТ8Ь1Н8Ь1ЕЕ80^0ЕКХЕ0ЕЬЬК(МРА)-С<ЖН_:

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2 мл 25% Н8А с 1 мМ пятого аналога С34 в 13 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (N4^80^ проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 55 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2.

Пример 56. Очистка конъюгата Н8А: шестой аналог С34 (8Е0 ΙΌ N0:38).

Шестой аналог С34 представляет собой МРА-С34 (1-34)-С0NН₂ и имеет следующую последовательность:

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2 мл 25% Н8А с 1 мМ шестого аналога С34 в 13 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (N4^80^ проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 56 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2.

Пример 57. Очистка конъюгата Н8А: седьмой аналог С34 (8Е0 ΙΌ N0:39).

Седьмой аналог С34 представляет собой Ас- С34 (1-34) С1и² ЬуУ Ьу§⁷ С1и⁹ С1и¹⁰ Ьу§¹³ Ьу§¹⁴ С1и¹⁶ С1и¹⁷ Ьуз²⁰ Ьуз²¹ С1и²³ С1и²⁴ Ьуз²⁷ С1и³¹ Ьуз³⁴ Ьуз³⁵ Ьуз³⁶ (ε-АЕЕА-ΜРА)-С0NН₂ и имеет следующую последовательность :

Ас- \\ЕЕ\\1)КК11ЕУГКК1 ЕЕГ]КК8ЕЕООКК\ЕЕЕ[.ККК(АЕЕА- ΜΡΑ)-ΌΟΝΗ₂

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2 мл 25% Н8А с 1 мМ седьмого аналога С34 в 13 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и

750 мМ (N4^80/1, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 57 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2.

Пример 58. Очистка конъюгата Н8А: восьмой аналог С34 (8Е0 ΙΌ N0:40).

Восьмой аналог С34 представляет собой МРА-АЕЕА-С34 (1-34) С1и² Ьуз⁶ Ьуз⁷ С1и⁹ С1и¹⁰ Ьуз¹³ Ьуз¹⁴ С1и¹⁶ С1и¹⁷ Ьуз²⁰ Ьуз²¹ С1и²³ С1и²⁴ Ьуз²⁷ С1и³¹ Ьуз³⁴ ^у8³⁵-С0NН₂ и имеет следующую последовательность:

МРА- АЕЕА- λΥΕΕννϋΚΚΙΕΕУТКК1ЕЕЫКК8ЕЕ00КЮЧЕЕЕЬКК- С ОМЬ

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2 мл 25% Н8А с 1 мМ восьмого аналога С34 в 13 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (N4^80^ проводят на колонке с бутилсефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 58 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2.

Пример 59. Очистка конъюгата Н8А: первый аналог РΥΥ (8Е0 ΙΌ N0:41).

Первый аналог РΥΥ представляет собой РΥΥ (3-36) Ьуз⁴ (ε-ОА- МРА)-С0NН₂ и имеет следующую структуру:

- 15 011168

Очистку конъюгата, полученного по реакции 1.5 мл 25% Η8Α с 1 мМ первого аналога ΡΥΥ в 6 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (№4)2804, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 59 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2.

Пример 60. Очистка конъюгата Η8Α: второй аналог ΡΥΥ (8ЕЦ ΙΌ N0:42).

Первый аналог ΡΥΥ представляет собой МРА-0Α-ΡΥΥ (3-36)-С0МИ₂ и имеет следующую последовательность:

Очистку конъюгата, полученного по реакции 1,5 мл 25% Η8Α с 1 мМ второго аналога ΡΥΥ в 6 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (№₄)₂80₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 60 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2.

Пример 61. Очистка конъюгата Η8Α: пятое производное инсулина (8ЕЦ ΙΌ N0:43).

Пятое производное инсулина представляет собой человеческий инсулин с ΑΕΕΑ8-ΑΕΕΑ8-ΜΡΑ в положении В29 цепи В (8ЕЦ ΙΌ N0: 43) и нативной цепью Α (8ЕЦ ΙΌ N0: 35) и изображено на формуле 1, пример 7.

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2 мл 25% Η8Α с 1 мМ пятого производного инсулина в 15 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (№₄)₂80₄, проводят на колонке с бутилсефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 61 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2.

Пример 62. Очистка конъюгата Η8Α: шестое производное инсулина (8ЕЦ ΙΌ N0:44).

Шестое производное инсулина представляет собой человеческий инсулин с ΑΕΕΑ8-ΑΕΕΑ8-ΜΡΑ в положении В1 цепи В (8ЕЦ ΙΌ N0: 44) и нативной цепью Α (8ЕЦ ΙΌ N0: 35) и изображено на формуле 1, пример 7.

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2.5 мл 25% Η8Α с 1 мМ шестого производного инсулина в 15 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (№₄)₂80₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 62 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2.

Пример 63. Очистка конъюгата Η8Α: седьмое производное инсулина (8ЕЦ ΙΌ N0:45).

Седьмое производное инсулина представляет собой человеческий инсулин с ОА-МРА в положении В29 цепи В (8ЕЦ ΙΌ N0: 45) и нативной А цепью (8ЕЦ ΙΌ N0: 35) и изображено на формуле 1, пример 7.

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2 мл 25% Η8Α с 1 мМ седьмого производного инсулина в 15 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (№₄)₂80₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 63 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2.

Пример 64. Очистка конъюгата Η8Α: второй аналог ΡΥΥ (8ЕЦ ΙΌ N0:46).

Третий аналог ΡΥΥ представляет собой ΜΡΑ-ΡΥΥ (3-36)-С0МИ₂ и имеет следующую последовательность:

МРА-NΗ-IКΡЕΑΡ6Е^Α8ΡЕЕ^NΚΥΥΑ8^ΚΗΥ^N^VΤΚ^ΚΥ- С0№₂

Очистку конъюгата, полученного по реакции 3 мл 25% Η8Α с 1 мМ третьего аналога ΡΥΥ в 18 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (№₄)₂80₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 64 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2.

Пример 65. Очистка конъюгата Η8Α: четвёртый аналог ΡΥΥ (8ЕЦ ΙΌ N0:47).

Четвёртый аналог ΡΥΥ представляет собой ΡΥΥ (3-36) ^у8³⁷(ε-МРА)-С0NΗ₂ и имеет следующую последовательность:

IКΡЕΑΡ6Е^Α8ΡЕЕ^NΚΥΥΑ8^ΚΗΥ^N^VΤΚ^ΚΥК(ΜΡΑ)-СΟNΗ₂

Очистку конъюгата, полученного по реакции 3 мл 25% Η8Α с 1 мМ четвёртого аналога ΡΥΥ в 18 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (№₄)₂80₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 65 очищенный конъюгат выходит во фракции Р2.

Пример 66. Очистка конъюгата Η8Α: пятый аналог ΡΥΥ (8ЕЦ ΙΌ N0:48).

Пятый аналог ΡΥΥ представляет собой ΜΡΑ- ΡΥΥ (22-36)-С0МИ₂ и имеет следующую последовательность:

(МРА)- А81КН ΥΙΜΙΥΓΚΟΚΥ-· С()!\ Н₂

Очистку конъюгата, полученного по реакции 6 мл 25% Η8Α с 1 мМ пятого аналога ΡΥΥ в 36 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 900 мМ (ЫИ₄)₂80₄, проводят на ко

- 16 011168 лонке с бутил-сефарозой в градиенте №3, описанном выше. На фиг. 66 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 67. Очистка конъюгата Н8А: шестой аналог ΡΥΥ (8Е0 ГО N0:49).

Шестой аналог ΡΥΥ представляет собой Ацетил-ΡΥΥ (22- 36) Ьу8³⁷(е- МРА)-С0ПН₂ и имеет следующую последовательность:

ΑΜ,ΚΗΥΕΝΙΛ ΓΚΟΚΥΚ (МРА)- СОМЕ

Очистку конъюгата, полученного по реакции 6 мл 25% Н8А с 1 мМ шестого аналога ΡΥΥ в 36 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 900 мМ (ПН₄)₂80₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №3, описанном выше. На фиг. 67 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 68. Очистка конъюгата Н8А: второй аналог АЖ (8Е0 ГО N0:50).

Второй аналог АЖ представляет собой МРА-АЖ (99-126)- С0ПН₂ и имеет следующую структуру^:

МРА-8ег-1^и-Аг£-Аге'5ег-5ег-Су^-РНе-П1у-61у-Аг£-МсГА5р-Аг81!е-С1У’А1а-61п-8ег-О1у-Ьеи-О1у-Су5-А5П-5ег-РЬе-Аг£-Туг-СОГ1Н2

Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% Н8А с 1 мМ шестого аналога АЖ в 14 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.0), 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ПН₄)₂80₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №3, описанном выше. На фиг. 68 очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 69. Очистка конъюгата Н8А: третий аналог АЖ (8Е0 ГО N0:51).

Третий аналог АЖ представляет собой АЖ (99-126), прореагировавший с МЛЬ-άΡΕΟ,ι™ (Онап1а Βίοάοδίβη. Ρο^βΐΐ, 0Н, И8А), связанным с 8ег. Полученный в результате аналог АЖ представляет собой МРА-ЕЕЕЕР-АЖ (99- 126), где ЕЕЕЕР обозначает этокси- этокси- этокси- этоксипропионовую кислоту; и имеет следующую последовательность:

МРА-ЕЕЕЕР-Зег-Ееи-Аг^-Агз-Зег-Зег-Суз-РНе-О^-СЯу'Атв-МеЬАзр-Агй

I Пе-О1у-А1а-О1п-8ег-С1у-Ееи-О1у-Су5-А511-8ег-РЬе-Ат§-Туг-СОНН ₂

Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% Н8А с 1 мМ шестого аналога ОС 1681 в 14 мл 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), 5 мМ каприлата натрия и 900 мМ (ПН₄)₂80₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №3, описанном выше. На фиг. 69 А и 69В очищенный конъюгат выходит во фракции Е2.

Пример 70. Очистка конъюгата Н8А: первый аналог ΟΕΡ-1 (8Е0 ГО N0:1).

Первый аналог 0ΕΡ-1 представляет собой 0ΕΡ-1 (7-36) бА1а⁸ ^у8³⁷(ε-ЛЕЕА-ΜΡА)-С0NН₂ и его последовательность представлена выше, в примере 1.

Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл Н8А (Сойех-ВюсЕет, 8ал Ьеапбго, СА) с 1 мМ первого аналога ΟΕΡ- 1, разведённым в 9 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрийфосфатного буфера рН 7.0, 5 мМ каприлата натрия и 1.75 М (ПН₄)₂80₄, проводят на колонке с бутилсефарозой в градиенте №6, описанном выше. На фиг. 70 фракция очищенного конъюгата выходит во фракции В.

Пример 71. Очистка конъюгата Н8А: первый аналог 0ΕΡ-1 (8Е0 ГО N0:1).

Первый аналог 0ΕΡ-1 представляет собой 0ΕΡ-1 (7-36) бА1а⁸ Ьу§³⁷ (ε-ЛЕЕА-ΜΡА)-С0NН₂ и его последовательность представлена выше, в примере 1.

Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл Н8А (Сопех-ВюсЕет, 8ал Ьеапбго, СА) с 1 мМ первого аналога 0ΕΡ-1, разведённым в 9 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрийфосфатного буфера рН 7,0, 5 мМ каприлата натрия и 1,75 М (сульфата магния, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте № 6, описанном выше. На фиг. 71 фракция очищенного конъюгата выходит во фракции Е2.

Пример 72. Очистка конъюгата Н8А: первый аналог 0ΕΡ-1 (8Е0 ГО N0:1).

Первый аналог 0ΕΡ-1 представляет собой 0ΕΡ-1 (7-36) бА1а⁸ Еу8³⁷^-АЕЕА-МРА)-С0ПН₂, и его последовательность представлена выше, в примере 1.

Пример с 750 мМ сульфата аммония. Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл Н8А (Сопех-ВюсЕет, 8ал Ьеапбго, СА) с 1 мМ первого аналога 0ΕΡ-1, разведённым в 9 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрий-фосфатного буфера рН 7,0, 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ЫН₄)₂80₄, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 72 фракция очищенного конъюгата выходит во фракции Е2.

Пример 73. Очистка конъюгата Н8А: первый аналог 0ΕΡ-1 (8Е0 ГО N0:1).

Первый аналог 0ΕΡ-1 представляет собой 0ΕΡ-1 (7-36) бА1а⁸ ^у8³⁷(ε-АЕЕА-ΜΡА)-С0NН₂ и его последовательность представлена выше, в примере 1.

Пример с 1,75 М фосфата аммония. Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250

- 17 011168 мг/мл НЗА (Сойех- Вюсйет, Зап Ьеапбго, СА) с 1 мМ первого аналога СЬР- 1, разведённым в 9 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрийфосфатного буфера рН 7,0, 5 мМ каприлата натрия и 1,75 М фосфата аммония, проводят на колонке с бутил- сефарозой в градиенте №6, описанном выше. На фиг. 73 фракция очищенного конъюгата выходит во фракции В.

Пример 74. Очистка конъюгата НЗА: первый аналог СЬР-1 (ЗЕО ГО N0:1).

Первый аналог СЬР-1 представляет собой СЬР-1 (7-36) бА1а⁸ Ьу5³⁷(е-АЕЕА-МРА)-С0ПН₂, и его последовательность представлена выше, в примере 1.

Пример с 750 мМ фосфата аммония. Очистку конъюгата, полученного по реакции 1 мл 25% 250 мг/мл НЗА (Сойех-Вюсйет, Зап Ьеапбго, СА) с 1 мМ первого аналога СЬР-1, разведённым в 9 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрий-фосфатного буфера рН 7.0, 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ фосфата аммония, проводят на колонке с бутил-сефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 74 фракция очищенного конъюгата выходит во фракции Г2.

Пример 75. Очистка конъюгата НЗА: первый аналог СЬР-2 (ЗЕО ГО N0:52).

Первый аналог СЬР-2 представляет собой СЬР-2 (1-33) С1у² Ьу5³⁴(е-МРА)-С0ПН₂ и имеет следующую последовательность:

НС11Х₄ЗК1)1А1\ТПП\1.АА1ЮН\\\ЬЮТК1Т1Ж(\1РА)-СС)\1Ь

Очистку конъюгата, полученного по реакции 2 мл 25% 250 мг/мл НЗА (Сойех-Вюсйет, Зап Ьеапбго, СА) с 1 мМ первого аналога СЬР-2, разведённым в 14 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрийфосфатного буфера рН 7,0, 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ИН₄)₂З0₄, проводят на колонке с бутилсефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 75 фракция очищенного конъюгата выходит во фракции Г2.

Пример 76. Очистка конъюгата ВЗА: первый аналог СЬР-2 (ЗЕО ГО N0:52).

Первый аналог СЬР-2 представляет собой СЬР-2 (1-33) С1у² Ьу5³⁴(е-МРА)-С0ПН₂, и его последовательность представлена в примере 75.

Очистку конъюгата, полученного по реакции 9 мл 25% 250 мг/мл НЗА (сывороточный альбумин крысы) с 1 мМ первого аналога СЬР- 2, разведённым в 14 мл буфера, приготовленного из 20 мМ натрийфосфатного буфера рН 7,0, 5 мМ каприлата натрия и 750 мМ (ИН₄)₂З0₄, проводят на колонке с бутилсефарозой в градиенте №1, описанном выше. На фиг. 76 фракция очищенного конъюгата выходит во фракции Г2.

Хотя изобретение описывается на его конкретных вариантах, понятно, что возможны его дальнейшие модификации, и предполагается, что данная заявка охватывает любые варианты, применения или улучшения изобретения, следующие, в целом, принципам изобретения и включающие такие отступления от настоящего описания, которые подпадают под известную или обычную практику в уровне техники, к которой относится изобретение, и которые могут быть применены к основным признакам, представленным выше в данном описании, и которые соответствуют объёму прилагаемой формулы изобретения.

Claims (30)

1. Способ отделения конъюгата альбумина от неконъюгированного альбумина в растворе, содержащем конъюгат альбумина и неконъюгированный альбумин, включающий:

а) нанесение раствора на гидрофобную твердую подложку, уравновешенную водным буфером с высоким содержанием соли;

б) подачу на подложку градиента, понижающего содержание соли и

в) сбор конъюгата альбумина.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что конъюгат альбумина состоит из молекулы, содержащей ковалентно присоединённый к ней акцептор Михаэля.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что присоединение осуществляется между акцептором Михаэля и цистеином 34 альбумина.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что акцептор Михаэля представляет собой малеинимидную группу.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что малеинимидная группа представляет собой малеинимидпропионовую кислоту (МРА).

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что альбумин выбирают из группы, состоящей из сывороточного альбумина и рекомбинантного альбумина.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что альбумин выбирают из группы, состоящей из человеческого альбумина, альбумина крысы, альбумина мыши, альбумина свиньи, бычьего альбумина, альбумина собаки и кроличьего альбумина.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что альбумин модифицирован с помощью по меньшей мере одного агента, выбранного из группы, состоящей из жирных кислот, ионов металлов и сахаров.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что сахара выбирают из группы, состоящей из глюкозы, лак

- 18 011168 тозы и маннозы.

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что молекулу выбирают из группы, состоящей из пептида, ДНК, РНК и их комбинаций, к которым ковалентно присоединён акцептор Михаэля, возможно через линкер.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что молекула представляет собой пептид с молекулярной массой по меньшей мере 57 Да.

13. Способ по п.11, отличающийся тем, что пептид выбран из группы, состоящей из глюкагоноподобного пептида 1 (СЬР-1), эксендин-4, предсердного натрийуретического пептида (АНР), крингл 5 (К5), динорфина, фактора высвобождения гормона роста (СВР), инсулина, натрийуретических пептидов, энфувиртида (Т-20), Т-1249, С-34, растворимого С-35 пептида ЕР (8С-35), пептида ΥΥ (РУУ) и их аналогов.

14. Способ по п.2, отличающийся тем, что молекула выбрана из группы, состоящей из винорельбина, гемцитабина и паклитаксела.

15. Способ по п.11, отличающийся тем, что молекула ковалентно присоединена к альбумину чувствительной к кислоте ковалентной связью или пептидной последовательностью, чувствительной к протеолитическому расщеплению, что способствует отделению молекулы от альбумина и входу молекулы в клетку.

16. Способ по п.1, отличающийся тем, что гидрофобная твердая подложка представляет собой колонку, содержащую гидрофобный полимер.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что гидрофобный полимер выбирают из группы, состоящей из октилсефарозы, фенилсефарозы и бутилсефарозы.

18. Способ по п.16, отличающийся тем, что гидрофобный полимер представляет собой бутилсефарозу.

19. Способ по п.1, отличающийся тем, что соль оказывает эффект высаливания, достаточный для промотирования взаимодействий лиганд-протеин.

20. Способ по п.1, отличающийся тем, что соль выбирают из группы, состоящей из фосфата аммония, сульфата аммония и фосфата магния.

21. Способ по п.1, отличающийся тем, что соль представляет собой фосфат аммония или сульфат аммония.

22. Способ по п.1, отличающийся тем, что соль представляет собой сульфат аммония.

23. Способ по п.1, отличающийся тем, что градиент, понижающий содержание соли, имеет начальную концентрацию соли менее 3000 мМ.

24. Способ по п.1, отличающийся тем, что градиент, понижающий содержание соли, имеет начальную концентрацию соли от 500 до 1000 мМ.

25. Способ по пп.2, 4 или 5, отличающийся тем, что молекула представляет собой пептид, к которому ковалентно присоединён акцептор Михаэля, возможно через линкер.

26. Способ по п.25, отличающийся тем, что пептид выбран из группы, состоящей из глюкагоноподобного пептида 1 (СЬР-1), глюкагоноподобного пептида 2 (СЬР-2), эксендин-4, предсердного натрийуретического пептида (ЛЕР), крингл 5 (К5), динорфина, фактора высвобождения гормона роста (СВР), инсулина, натрийуретических пептидов, энфувиртида (Т-20), Т-1249, С-34, растворимого С-35 пептида ЕР (8С-35), пептида ΥΥ (РУУ).

27. Способ по пп.2, 4 или 5, отличающийся тем, что молекула выбрана из группы, состоящей из СЬР-1 (7-36) бА1а⁸ Ьуз³⁷ (е-АЕЕА-МРА)-С0ЫН2 (8ЕО ΙΌ N0:1), СВР (1-29) бА1а² С1п⁸ А1а¹⁵ Ьеи²⁷ Ьуз³⁰ (е-МРА)-С0ЫН2 (8ЕО ΙΌ N0:2), Ас-К5 ЬузА-МРА)-ПН₂ (8ЕО ΙΌ N0:3), инсулин В1-МРА (8ЕО ΙΌ N0:4), инсулин А1-МРА (8ЕО ΙΌ N0:5), МРА-АЕЕА-С34-С0ЫН₂ (8ЕО ΙΌ N0:6), С34 (1-34) Ьу8³⁵(еАЕЕА-МРА)-С0ЫН2 (8ЕО ΙΌ N0:7), С34 (1-34) Ьуз¹³^-АЕЕА-МРА)-С0ПН2 (8ЕО ΙΌ N0:8), СЬР-1 (736) Ьу8³⁷(8-МРА)-№Н2 (8ЕО ΙΌ N0:9), СЬР-1 (7-36) бА1а⁸ Ьуз³⁷ (е-МРА)-ЫН2 (8ЕО ΙΌ N0: 10), СЬР-1 (736) Ьу<5²⁶(8-АЕЕА-АЕЕА-МРА) (8ЕО ΙΌ N0:11), СЬР-1 (7-36) Ьу8³⁴(8-АЕЕА-АЕЕА-МРА) (8НО ΙΌ N0:12), эксендин-4 (1-39) Ьуз⁴⁰ (е-МРА)-№Н2 (8ЕЦ ΙΌ N0:13), эксендин-4 (9-39) Ьуз⁴⁰ (ε-АЕЕА-МРА)С0ПН2 (8ЕО ΙΌ N0:14), Пуп А (1-13) (МРА)-ЫН₂ (8ЕО ΙΌ N0:15), МРА-АЕЕА-А№ (99-126)-С0ЫН₂ (8ЕЦ ΙΌ N0:16), Ьуп А (7-13) Ьуз¹³(МРА)-С0ПН2 (8ЕЦ ΙΌ N0:17), ацетил-Рйе-Н1з-циклогексилстатилПе-Ьуз (ε-АЕЕА-МРА )-С0\Н; (8ЕО ΙΌ N0:18), СЬР-1 (7-36) Ьуз²³ (е-АЕЕА-МРА)-С0ПН2 (8ЕО ΙΌ N0:19), СЬР-1 (7-36) ^уз¹⁸(ε-АЕЕА-МРА)-С0NН2 (8ЕО ΙΌ N0:20), СЬР-1 (7-36) Ьуз²⁶ (ε-АЕЕА-МРА)С0ЫН2 (8ЕО ΙΌ N0:21), СЬР-1 (7-36) Ьуз²А-АЕЕА-МРА)-С0ЫН2 (8ЕО ΙΌ N0:22), СЬР-1 (7-36) Ьуз³⁷ ^-АЕЕА-АЕЕА-МРА)-С0ПН2 (8ЕО ΙΌ N0:23), СЬР-1 (7-36) Ьуз³А-АЕЕА-МРА)-С0ЫН2 (8ЕО ΙΌ N0:24), эксендин-4 (1-39) Ьуз⁴⁽А-АЕЕА-МРА)-С0МН2 (8ЕО ΙΌ N0:25), СЬР-1 (7-36) Ьуз³А-АЕЕАМРА)-С0ЫН2 (8ЕО ΙΌ N0:26), инсулин В1-0А-МРА (8ЕО ΙΌ N0:27), инсулин В29-МРА (8ЕО ΙΌ N0:28), СВР (1-29) Ьуз³А-МРА)-С01ЧН2 (8ЕО ΙΌ N0:29), СВР (1-29) бА1а² С1п⁸ бАгд¹¹ А1а¹⁵ Ьеи²⁷ Ьуз³⁰ ^-МРА)-С0ПН2 (8ЕО ΙΌ N0:30), СВР (1-29) бА1а² Ьуз³⁰ ^-МРА)-С0ЫН2 (8ЕО ΙΌ N0:31), СЬР-1 (9-36) Ьуз³⁷ ^-АЕЕА-МРА)-С0ПН2 (8ЕО ΙΌ N0:32), Ас-Т20 (1-36) Ьуз³А-АЕЕА-МРА)-С0ЫН2 (8ЕО ΙΌ N0:33), Ас-Т1249 (1-39) Ьуз⁴⁰ ^-АЕЕА-МРА)-С0ЫН₂ (8ЕО ΙΌ N0:34), 3'4'-дидегидро-4'-деокси-С'

- 19 011168 норвинкалеукобластин-АЕЕА-МРА (ΝΕΟ ΙΌ N0:35), С34 (1-34) Ьу8¹³ (ε-ΜΡΑ)-0ΘΝΗ2 (ΝΕΟ ΙΌ N0:36), С34 (1-34) Ьу8³⁵ (ε-ΜΡΑ)Ή0ΝΗ2 (8Ер ΙΌ N0:37), МРА-С34 (1-34)Ή0ΝΗ2 (ΝΕΟ ΙΌ N0:38), Ас-С34 (134) С1и² Ьу8⁶ Ьу8⁷ С1и⁹ С1и¹⁰ Ьу8¹³ Ьу8¹⁴ С1и¹⁶ С1и¹⁷ Ьу8²⁰ Ьу8²¹ С1и²³ С1и²⁴ Ьу8²⁷ С1и³¹ Ьу8³⁴ Ьу8³⁵ Ьу8³⁶ (εАЕЕА-МРА)-С0№2 (8Ер ΙΌ N0:39), МРА-АЕЕА-С34 (1-34) С1и² Ьу8⁶ Ьу8⁷ С1и⁹ С1и¹⁰ Ьу8¹³ Ьу8¹⁴ С1и¹⁶ С1и¹⁷ Ьу8²⁰ Ьу8²¹ С1и²³ С1и²⁴ Ьу8²⁷ С1и³¹ Ьу8³⁴ Е\8^;-С0\1 Е (8Ер ΙΌ N0:40), ΡΥΥ (3-36) Ьу8⁴ ^-0А-МРА)С0№2 (8Ер ΙΌ N0:41), МРАЮА-ΡΥΥ (3-36)-С0\'1 Е (8Ер ΙΌ N0:42), инсулин В29-АЕЕ8-АЕЕ8-МРА (8Ер ΙΌ N0:43), инсулин В1-АЕЕ8-АЕЕ8-МРА (ΝΕΟ ΙΌ N0:44), инсулин В29-ОА-МРА (ΝΕΟ ΙΌ N0:45), МРА-ΡΥΥ (3-36)^0^2 (8Ер ΙΌ N0:46), ΡΥΥ (3-36) Ьу8³⁷ (ε-ΜΡΑ)-С0NΗ2 (ΝΕΟ ΙΌ N0:47), ΜΡΑ-ΡΥΥ (22-36)-С0NΗ2 (ΝΕΟ ΙΌ N0:48), α^τ^^ΥΥ (22-36) Ьу8³⁷ (ε-ΜΡΑ)-С0NΗ₂ (8Ер ΙΌ N0:49), МРА-АОТ (99-126)^0^2 (8Ер ΙΌ N0:50), МРА-ЕЕЕЕР-АЖ (99-126) (ΝΕΟ ΙΌ N0:51), СЬР-2 (1-33) С1у² Ьу8³⁴ (εМРА)-С0№2 (ΝΕΟ ΙΌ N0:52).

28. Способ по п.26, отличающийся тем, что пептид представляет собой СЕР-1 (7-36) ФА1а⁸ Ьу8³⁷.

29. Способ по п.26, отличающийся тем, что пептид представляет собой эксендин-4 (1-39) Ьу8⁴⁰.

30. Способ по пп.2, 4 или 5, отличающийся тем, что молекула представляет собой СЬР-1 (7-36) бА1а⁸ Ьу8³⁷ (ε-ΑΕΕΑ-ΜΡΑ)-С0NΗ2.