JP2007532566A - 疼痛治療のためのＥｒｂＢアンタゴニスト - Google Patents

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Abstract

本出願は、疼痛を治療するためのＥｒｂＢアンタゴニスト、特にｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４などのＥｒｂＢ２抗体の使用を説明する。

Description

（発明の分野）
本発明は、疼痛治療のためのＥｒｂＢアンタゴニストに関する。
（発明の背景）
抗ＥｒｂＢ抗体と癌治療におけるこれらの使用
レセプターチロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーは、細胞成長、分化及び生存の重要な介在物質である。該レセプターファミリーは、上皮細胞成長因子（ＥＧＦＲ又はＥｒｂＢ1）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２又はｐ１８５neu）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ3）、及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ4又はtyro2）を含む４つの明らかなメンバーを含む。
ｅｒｂＢ１遺伝子にコードされるＥＧＦＲは、ヒト悪性腫瘍の原因と示唆されている。特にＥＧＲＦの発現の増加は、***、膀胱、肺、頭部、首部及び胃癌、並びに膠芽細胞腫で観察されている。増大したＥＧＦＲ発現は、自己分泌刺激経路によるレセプターの活性化となる、同じ腫瘍細胞によるＥＧＦＲリガンド、トランスフォーミング成長因子−アルファ(ＴＧＦ-α）の生成の増加にしばしば関連していると報告されている。Baselga及びMendelson Pharmac Ther., 64:127-154 (1994)）。ＥＧＦＲ、又はそのリガンドＴＧＦ-α及びＥＧＦに対するモノクローナル抗体は、そのような悪性腫瘍の治療における治療剤として評価されている。例えば、Baselga及びMendelson 上掲；Masuiら, Cancer Research, 44:1002-1007(1984)；及びWuら, J. Clin. Invest., 95:1897-1905 (1995)参照。
ＥｒｂＢファミリーの第２のメンバーであるｐ１８５neuは、元々は、化学的に処理されたラットの神経芽細胞種由来のトランスフォーミング遺伝子の産物として同定された。neuプロト癌遺伝子の活性化型は、コードされたタンパク質の膜貫通領域の点突然変異（バリンからグルタミン酸へ）から生じる。ｎｅｕのヒト相同体の増幅は、***及び卵巣癌で観察され、乏しい予後と相関している(Slamonら, Science, 235:177-182 (1987)；Slamonら, Science, 244:707-712 (1989)；及び米国特許第4,968,603号)。今日まで、ｎｅｕプロト癌遺伝子におけるものに類似した点突然変異はヒトの腫瘍に対しては報告されていない。ＥｒｂＢ２の過剰発現(増幅のためしばしば見られるが均一にではない)が、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、大腸、甲状腺、膵臓及び膀胱の癌腫を含む他の癌腫においても観察されている。特に、Kingら, Science, 229:974 (1985); Yokotaら, Lancet, 1:765-767 (1986); Fukushigeら, Mol Cell Biol., 6:955-958 (1986); Guerinら, Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohenら, Oncogene., 4:81-88 (1989);Yonemuraら, Cancer Res., 51:1034 (1991); Borstら, Gynecol.Oncol., 38:364 (1990); Weinerら, Cancer Res., 50:421-425 (1990); Kernら, Cancer Res., 50:5184 (1990); Parkら, Cancer Res., 49:6605 (1989); Zhauら, Mol. Carcinog., 3:354-357 (1990); Aaslandら, Br. J. Cancer 57:358-363 (1988); Williamsら, Pathobiology, 59:46-52 (1991);及びMcCannら, Cancer, 65:88-92 (1990)参照。ＥｒｂＢ２は前立腺癌で過剰発現されうる（Guら Cancer Lett. 99:185-9(1996); Rossら Hum. Pathol. 28:827-33(1997); Rossら Cancer 79:2162-70(1997);及びSadasivanら J. Urol. 150:126-31(1993)）。
ラットｐ１８５neu及びヒトＥｒｂＢ２タンパク質産物に対する抗体が記述されている。Drebinとその仲間は、ラットｎｅｕ遺伝子産物であるｐ１８５neuに対する抗体を言及している。例えば、Drebinら, Cell 41:695-706(1985)；Myersら，Meth. Enzym. 198:277-290(1991)；及びWO94/22478参照。Derbinら, Oncogene 2:273-277(1988)は、ｐ１８５neuの２つの異なる領域と反応性のある抗体混合物が、ヌードマウス中に移植されたｎｅｕ形質転換ＮＩＨ-３Ｔ３細胞に相乗的な抗腫瘍効果を生じることを報告している。また1998年10月20日公開の米国特許第5,824,311号参照。
Hudziakら, Mol. Cell. Biol. 9(3):1165-1172(1989)には、ヒトの***腫瘍株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３を使用して特徴付けられた抗-ＥｒｂＢ２抗体パネルの作成が記載されている。抗体への暴露に続いてＳＫ-ＲＢ-３細胞の相対的細胞増殖が、７２時間後の単層のクリスタルバイオレット染色により測定された。このアッセイを使用して、４Ｄ５と呼ばれる抗体により最大の阻害度が得られ、これは細胞増殖を５６％阻害した。パネルの他の抗体は、このアッセイにおいてより少ない度合いで細胞増殖を低減した。さらに、抗体４Ｄ５は、ＴＮＦ-αの細胞障害効果に対し、ＥｒｂＢ２過剰発現***腫瘍株化細胞を感作させることが見出されている。また、1997年10月14日に公開された米国特許第5,677,171号参照。Hudziakら により検討された抗-ＥｒｂＢ２抗体は、Fendlyら Cancer Research 50:1550-1558(1990)；Kottsら In Vitro 26(3):59A(1990)；Sarupら Growth Regulation 1:72-82(1991)；Shepardら J. Clin. Immunol. 11(3):117-127(1991)；Kumarら Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986(1991)；Lewisら Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263(1993)；Pietrasら Oncogene 9:1829-1838(1994)；Vitettaら Cancer Research 54:5301-5309(1994)；Sliwkowskiら J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665(1994)；Scottら J. Biol. Chem. 266:14300-5(1991)；D'souzaら Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206(1994)；Lewisら Cancer Research 56:1457-1465(1996)；及びSchaeferら Oncogene 15:1385-1394(1997)においてもさらに特徴付けられている。
マウス抗-ＥｒｂＢ２抗体４Ｄ５の組換えヒト化体(ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２又はハーセプチン(登録商標)；米国特許第5,821,337号)は、広範な抗癌治療を前に受けたＥｒｂＢ２過剰発現転移性乳癌を持つ患者において臨床的に活性であった(Baselgaら, J. Clin. Oncol. 14:737-744(1996))。ハーセプチン(登録商標)は、腫瘍がＥｒｂＢ２タンパク質を発現する転移性乳癌を有する患者の治療のために、1998年9月25日、食品医薬品局から販売許可を受けた。
様々な特性を有する他の抗-ＥｒｂＢ２抗体は、Tagliabueら Int. J. Cancer 47:933-937(1991)；McKenzieら Oncogene 4:543-548(1989)；Maierら Cancer Res. 51:5361-5369(1991)；Bacusら Molecular Carcinogenesis 3:350-362(1990)；Stancovskiら PNAS(USA)88:8691-8695(1991)；Bacusら Cancer Research 52:2580-2589(1992)；Xuら Int. J. Cancer 53:401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzykら Cancer Research 52:2771-2776(1992)；Hancockら Cancer Res. 51:4575-4580(1991)；Shawverら Cancer Res. 54:1367-1373(1994)；Arteagaら Cancer Res. 54:3758-3765(1994)；Harwerthら J. Biol. Chem. 267:15160-15167(1992)；米国特許第5,783,186号；及びKlapperら Oncogene 14:2099-2109(1997)に記載されている。
相同性スクリーニングは、結果的に他の２つのＥｒｂＢレセプターファミリーメンバーを同定した；ＥｒｂＢ３（米国特許第5,183,884号及び第5,480,968号、並びにKrausら PNAS(USA) 86: 9193-9197(1989))、及びＥｒｂＢ４(欧州特許出願第599,274号、Plowmanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750(1993)、及びPlowmanら, Nature 366: 473-475(1993))。これらのレセプターはどちらも、少なくともいくつかの乳癌株での増加した発現を示す。
ＥｒｂＢレセプターが一般に、細胞内の様々な組み合わせで発見され、ヘテロ二量化は様々なＥｒｂＢリガンドに対する細胞応答の相違を増加すると考えられる(Earpら Breast Cancer Research and Treatment 35:115-132(1995))。ＥＧＦＲは６つの異なるリガンド；上皮成長因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ-α）、アンフィレグリン、ヘパリン結合上皮細胞成長因子（ＨＢ-ＥＧＦ）、ベーターセルリン及びエピレグリンにより結合される(Groenenら Growth Factors 11:235-257(1994))。単一の遺伝子の選択的スプライシングから生じるヘレグリンタンパク質のファミリーはＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４のリガンドである。ヘレグリンファミリーは、α、β及びγヘレグリン（Holmesら, Science, 256:1205-1210(1992)；米国特許第5,641,869号；及びSchaeferら Oncogene 15:1385-1394(1997))；ｎｅｕ分化因子(ＮＤＦ)、グリア成長因子（ＣＧＦ）；アセチルコリンレセプター促進活性（ＡＲＩＡ）；及び感覚、運動神経由来因子（ＳＭＤＦ）を含む。概説については、Groenenら Growth Factors 11:235-257(1994)；Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7:247-262(1996)及びLeeら Pharm. Rev. 47:51-85(1995)参照。最近になって更に３つのＥｒｂＢリガンドが同定された；ＥｒｂＢ３又はＥｒｂＢ４のどちらかに結合すると報告されたニューレグリン-２（ＮＲＧ-２）（Changら Nature 387 509-512(1997);及びCarrawayら Nature 387:512-516(1997))；ＥｒｂＢ４に結合するニューレグリン-３（Zhangら PNAS(USA)94(18):9562-7(1997)）；及びＥｒｂＢ４に結合するニューレグリン-４（Harariら Oncogene 18:2681-89(1999)）ＨＢ-ＥＧＦ、ベータセルリン及びエピレグリンもまたＥｒｂＢ４に結合する。
ＥＧＦ及びＴＧＦαはＥｒｂＢ２に結合しないが、ＥＧＦはヘテロ二量体を形成するようにＥＧＦＲ及びＥｒｂＢ２を促進し、ＥＧＦＲを活性化し、その結果ヘテロ二量体でＥｒｂＢ２のトランスリン酸化を生じる。ヘテロ二量体及び／又はトランスリン酸化はＥｒｂＢ２チロシンキナーゼを活性化するように見える。上掲のEarpら, 参照。同様に、ＥｒｂＢ３がＥｒｂＢ２と共に発現しているとき、活性シグナル伝達複合体が形成され、ＥｒｂＢ２に対する抗体はこの複合体を***させる能力がある（Sliwkowskiら, J. Biol. Chem., 269(20）:14661-14665(1994))。更に、ヘレグリン(ＨＲＧ)に対するＥｒｂＢ３の親和性はＥｒｂＢ２と共に発現するときの高い親和性にまで増加される。また、ＥｒｂＢ２-ＥｒｂＢ３タンパク質複合体に関しては、Leviら, Journal of Neuroscience 15:1329-1340(1995)；Morrisseyら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1431-1435(1995)；及びLewisら, Cancer Res., 56:1457-1564(1996)参照。ＥｒｂＢ３と同様にＥｒｂＢ４はＥｒｂＢ２と活性シグナル伝達複合体を形成する(Carraway and Cantley, Cell 78:5-8(1994))。
疼痛管理
慢性疼痛は様々な疾患及び病理学的状態の一般的な症状であって、侵害受容性疼痛（体組織の損傷によって生じる疼痛）、神経障害疼痛（神経、脊髄又は脳の異常によって生じる疼痛）及び心因性疼痛（完全に又は主に心因性疾患に関したもの）が含まれる。侵害受容性疼痛は体性痛（骨、関節、筋肉、皮膚又は結合組織に起因するもの）及び内臓痛を含み、内臓器官、例えば胃腸管および膵臓に起因する。
軽度から中程度の疼痛は、一般的に非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えばアセトアミノフェン、イブプロフェン、アスピリン、ケトロラック、エトドラクなど）によって治療される。より重度の慢性疼痛の治療は、オピエイトとＮＳＡＩＤの組合せ、例えばアスピリンとオキシコドン（(Percodan)、アセトアミノフェンとヒドロコドン(Vicodin and Lortab)が含まれる。
また、疼痛は進行癌のよくある症状である。例えば、約６０％のホルモン抵抗性前立腺癌患者は著しい疼痛で苦しむ。一般的に、疼痛は直接、癌（癌転移を含む）から生じるが、癌治療そのものと関連していることもある。例えば、癌の外科的除去の間に神経損傷があった場合、慢性疼痛が生じうる。また、化学療法が疼痛の原因になることもありうる。発疱薬と称される化学療法剤が、静脈から漏れると組織に害がありうるものもある。場合によっては、化学療法によって、口（口内炎）又は腸（粘膜炎）の内壁に疱疹が生じる。末梢性神経障害は特定の化学療法剤が高用量に長期間投与される場合に起こりうる。また、放射線治療は、治療される癌性腫瘍を囲む正常な細胞に影響するので、疼痛が生じうる。
現在一般に、１０段階の視覚アナログスケール(visual analog scale)でスコア３以下に疼痛を維持するためのオピエイト用量を投与することによって患者の疼痛を軽減するために、モルヒネやヒロインなどのオピエイト鎮痛剤によって癌関連の疼痛が管理されている。しかしながらこの治療は最適でない。一般的な副作用には睡魔及び便秘がある。加えて、患者は耐性になるものが多く、オピエイト鎮痛剤に身体的に依存するようになり、疼痛治療の有効性が低くなり、薬剤依存の深刻な問題が生じる。オピオイドを中断する場合、禁断症状が現れるかもしれない、その特徴や重症度は、中断される特定のオピオイド、中断されるオピオイドの一日量、オピオイド治療の継続期間及び薬剤に依存する個々の症状などの因子に依存する。禁断症状自体は重度の疼痛を含む症状と関連している。癌性疼痛の唯一の効果的な治療は、成功裏に行われる腫瘍の根絶であろう。
重症の、持続疼痛は、患者及びその介護者を衰弱させ、患者及び医学専門家のオピオイド投与に対する恐れのために、治療されていないことが多い。現在の治療が不満足であるので、より効果的で、現在の治療に関連するリスクと望ましくない副作用がない、癌関連の疼痛を含む慢性疼痛の管理のための更なる治療様式を開発することが重要である。
（発明の概要）
この発明は、少なくともある程度、ｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４と称するＥｒｂＢアンタゴニストで治療される前立腺癌患者が、腫瘍が進行しているときでさえ痛覚消失の必要性が低くなるか疼痛が軽減されたという驚くべき所見に基づく。これはｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４が痛覚消失性性質を有することを示す。
一態様では、本発明は、患者にＥｒｂＢアンタゴニストの有効量を投与されることを含んでなる患者の疼痛を治療する方法に関する。
他の態様では、本発明は、患者の疼痛あるいは痛覚消失の必要性が軽減されるか又は取り除かれる用量のＥｒｂＢアンタゴニストを患者に投与されることを含んでなる、患者の疼痛を治療する方法に関する。
一実施態様では、疼痛は疼痛を反映する疼痛スコア又は生活の質スコアで測定される。例えば、疼痛は０から５の６段階スケールのマッギール疼痛評価(McGill Pain Index)により測定してもよい。あるいは、疼痛は、患者の疼痛の主観的感覚で表す０−１００の視覚アナログスケール(visual analog scale)を用いて測定してもよい。痛覚消失の必要性は鎮痛スコアを用いて測定してもよい。特定の実施態様では、非ステロイド性鎮痛薬の１用量は鎮痛スコア１に対応し、モルヒネの１回１０ｍｇ用量又は、他のオピエイト鎮痛薬の等価用量は鎮痛スコア２に対応する。
他の実施態様では、疼痛は毎日モニターされる。
さらに他の実施態様では、痛覚消失の必要性も毎日モニターされる。
他の態様では、本発明は、癌と診断された患者の癌関連の疼痛を治療する方法であり、患者にＥｒｂＢアンタゴニストの有効量が投与されることを含む方法に関するものであり、前記の癌は寛解でないか又は当該治療の間、成長し続ける。
前記方法の特定の実施態様では、癌は、前記治療の間寛解の状態にないか、又は治療の間に成長し続ける。
癌は何れの癌でもよく、例として、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌、扁平上皮細胞癌、肺癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮上皮癌、唾液腺上皮癌、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門の上皮癌、陰茎上皮癌ないし頭頸部癌が挙げられるが、これに限定されるものではない。
特定の実施態様では、癌は転移性癌である。
他の実施態様では、転移は軟組織転移である。
さらに他の実施態様では、転移は骨転移を含む。
好ましい実施態様では、癌は前立腺癌、特にアンドロゲン非依存性前立腺癌を含むものである。
他の実施態様では、癌は前立腺癌であり、患者のＰＳＡは治療の間に低減あるいは亢進を示す。
更なる態様では、本発明は、患者にＥｒｂＢアンタゴニストの有効量が投与されることを含んでなり、患者の非癌関連の疼痛を治療する方法に関する。
なお更なる態様では、本発明は、有効量のＥｒｂＢアンタゴニスト、及び疼痛の治療のために該アンタゴニストを投与するようにという指示書を含んでなるキットに関する。
すべての態様では、ＥｒｂＢアンタゴニストは抗体であることが好ましい。抗体は、例えば、ＥｒｂＢを結合するモノクローナル抗体でもよい。他の実施態様では、抗体はＥｒｂＢのリガンドの活性化をブロックする。さらに他の実施態様では、抗体はＥｒｂＢヘテロ二量体の形成をブロックする。好ましい実施態様では、抗体はＥｒｂＢ２に対するモノクローナル抗体２Ｃ４の結合をブロックする。他の好ましい実施態様では、抗体はモノクローナル抗体２Ｃ４の生物学的特徴を有する。更なる好ましい実施態様では、抗体はモノクローナル抗体２Ｃ４又はヒト化２Ｃ４を含んでなる。
抗体は抗体断片、例としてＦａｂ断片などであってもよく、細胞障害性薬剤とコンジュゲートしていてもしていなくてもよい。
本発明に従って治療される疼痛は、限定するものではないが侵害受容性疼痛、神経障害疼痛及び心因性疼痛などの急性の疼痛又は慢性の疼痛であってもよく、癌関連又は癌に関連しないものでもよい。疼痛が癌関連のものである場合、癌は場合によって、ＥｒｂＢ２及び／又はＥＧＦＲなどのＥｒｂＢレセプターを発現する。特定の実施態様では、癌は転移性癌であり、この転移は軟組織及び／又は骨転移でありえる。
他の実施態様では、癌は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌、扁平上皮細胞癌、肺癌、腹膜癌、肝細胞性癌、胃癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮上皮癌、唾液腺上皮癌、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門の上皮癌、陰茎上皮癌及び頭頸部癌からなる群から選択される。
特定の実施態様では、癌は前立腺癌、例えばアンドロゲン非依存性前立腺癌である。
（好ましい実施態様の詳細な説明）
特に提言しない限り、本明細書中で使用した技術用語及び化学用語は本発明が属する分野の通常の技術者によって一般的に理解される意味と同じである。Singleton等., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 第２版, J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)により当分野の技術者は本開示内容に使用した多くの用語の一般的な理解が得られる。
Ｉ．定義
「疼痛」なる用語は、本明細書中で最も広義の意味で用いられ、侵害受容性疼痛、例えば体性痛覚及び内臓痛；神経障害疼痛、例えば中枢神経性疼痛及び末梢神経性疼痛；及び心因性疼痛などの急性疼痛及び慢性疼痛を含む全種類の疼痛を指す。前記用語は好ましくは慢性疼痛、最も好ましくは体性痛及び内臓痛を含む侵害受容性疼痛を指すものであり、それは癌に関連するもの、癌に関連しないもの、又は部分的に癌に関連するものでありうる。
「侵害受容性疼痛」なる用語は、限定するものではないが切断、挫傷、骨骨折、粉砕損傷、熱傷などを含む身体組織の損傷に起因するすべての疼痛を含むために用いられる。このタイプの疼痛は一般的に、うずいたり、刺すようなものだったり、ズキズキするようなものである。組織損傷（侵害受容器）の疼痛レセプターが、主に皮膚又は、内部臓器に位置する。
「体性痛」なる用語は、骨、関節、筋肉、皮膚又は結合組織に起因する疼痛を指すために用いられる。このタイプの疼痛は一般的にうずいたりズキズキする質のものであり、局部的なものである。
「内臓痛」なる用語は、内臓器官、例えば胃腸管及び膵臓に起因する疼痛を指すために、本願明細書において用いられる。内臓痛はうずくものを含み、臓器莢膜の腫瘍併発に起因する非常に局部的なものである。一般的に凹窩内臓の閉塞に起因する他のタイプの内臓痛は間欠的で締めつけるような特徴があり、あまり局部的な疼痛ではない。
「神経障害疼痛」なる用語は、末梢神経系又は中枢神経系による感覚入力過程の異常から生じる疼痛を指すために、本願明細書において用いられる。
「痛覚消失」は、通常痛みを伴う刺激や鎮痛薬での治療に応答して疼痛が消失することを指すために用いられる。「鎮痛薬」なる用語及びその文語的に同義の用語は、痛覚消失を引き起こすことが可能である薬剤を指す。
患者の「痛覚消失の必要性」なる用語は、患者の疼痛を管理するために患者に鎮痛薬（ＥｒｂＢアンタゴニスト以外）の投与が必要であることを意味するために、本願明細書において用いられる。
「処置」は治療的処置及び予防又は予防的処置を意味する。処置を必要とするものには、既に疼痛を持つもの並びに疼痛が予防されるべきものが含まれる。
「有効量」なる用語は、ＥｒｂＢアンタゴニストの投与前に、痛覚消失の下で経験されるような主観的な疼痛を感知するか又は疼痛スコアを同じに維持するか低くしつつ、少なくともある程度疼痛を軽減するために、又は痛覚消失の必要性を少なくするか除去するために有効なＥｒｂＢアンタゴニストの量を意味する。疼痛及び疼痛の低減は、疼痛管理の分野で公知の任意の疼痛スコア系及び／又は疼痛の生活の質スコア系を用いて評価することができる。好ましくは、疼痛は６段階スケール（０−５）のマックギール疼痛評価(McGill Pain Index)に基づいて測定される。この評価では、０＝疼痛なし、１＝軽度の疼痛、２＝不快にさせるような疼痛、３＝苦しむような疼痛、４＝ひどい疼痛、５＝耐えがたい疼痛である。疼痛の生活の質スコアは、０−１００の視覚アナログスケールを用いて測定することができる。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長により特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態に相当するか、または表すものである。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより特定な例には、扁平上皮癌(squamous cell cancer)(例えば、上皮性扁平上皮癌（epithelial squamous cell cancer）)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃(gastric又はstomach)癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓(kidney又はrenal)癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌及び頭部及び頸部の癌が含まれる。
「ＰＳＡ」なる用語は、前立腺特異的抗原試験によって測定されるような前立腺によって産生される血液中の前立腺特異的抗原のレベルを意味するために、本明細書中で用いられる。前立腺が癌の場合、この抗原の量が増加し、一般的に癌の進行につれて増加し続ける。
「ＥｒｂＢ」は、ＥｒｂＢレセプターファミリーに属するレセプタープロテインキナーゼであり、ＥＧＲＦ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４レセプター及び今後同定されるこのファミリーの他のメンバーを含む。ＥｒｂＢは一般に、ＥｒｂＢリガンドと結合する細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；及びリン酸化されうるいくつかのチロシンキナーゼ残基を抱合するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含んでなりうる。ＥｒｂＢは「天然配列」ＥｒｂＢ又はその「アミノ酸配列変異体」であってもよい。好ましくは、ＥｒｂＢは天然配列ヒトＥｒｂＢである。
「ＥｒｂＢ１」、「上皮成長因子レセプター」、「ＨＥＲ１」及び「ＥＧＦＲ」という用語は、ここで、互換的に使用され、Carpenterら, Ann. Rev. Biochem. 56:881-914(1987)に開示されているようなＥＧＦＲに相当し、その自然発生突然変異体（例えば、Humphreyら, PNAS(USA) 87:4207-4211(1990)に記載されているような欠失変異体ＥＧＦＲ；ＩＩ型ＥＧＦＲ突然変異体（米国特許第６，４５５，４９８）等）を含む。ｅｒｂＢ１は、ＥＧＦＲタンパク質産物をコードする遺伝子に相当する。
表記「ＥｒｂＢ２」、「ＨＥＲ２」は、ここで互換的に使用され、例えばSembaら, PNAS(USA)82:6497-6501(1985)及びYamamotoら, Nature 319:230-234(1986)(Genebank受託番号 X03363)に記載されているヒトＨＥＲ２タンパク質に相当する。「ｅｒｂＢ２」という用語は、ヒトＥｒｂＢ２をコードする遺伝子に相当し、「ｎｅｕ」はラットｐ１８５ｎｅｕをコードする遺伝子に相当する。好ましくは、ＥｒｂＢ２は天然配列ヒトＥｒｂＢ２である。
「ＥｒｂＢ３」及び「ＨＥＲ３」は、例えば、米国特許第5,183,884号及び第5,480,968号、並びにKrausら, PNAS(USA) 86: 9193-9197(1989)に開示されたレセプターポリペプチドに相当する。
ここでの用語「ＥｒｂＢ４」及び「ＨＥＲ４」は、例えば、欧州特許出願599,274；Plowmanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750(1993)；及びPlowmanら, Nature 366: 473-475(1993)に開示されたレセプターポリペプチドに相当し、例えば1999年4月22日公開の国際公報９９／１９４８８に開示されているような、そのアイソフォームを含む。
「ＥｒｂＢリガンド」とは、ＥｒｂＢレセプターに結合する及び／又は活性化するポリペプチドを意味する。この用語はＥｒｂＢリガンドの膜結合性前駆体型だけでなくＥｒｂＢリガンドのタンパク分解過程の可溶性型も含む。ここで特に対象とするＥｒｂＢリガンドは、例えば上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）（Savageら, J. Biol. Chem. 247: 7612-76721(1972)）；トランスフォーミング成長因子-α（ＴＧＦ-α）（Marquardtら, Science 223: 1079-1082 (1984)）；シュワン細胞腫由来成長因子又はケラチノサイト自己分泌成長因子としても知られているアンフィレグリン(Shoyabら, Science 243:1074-1076(1989)；Kimuraら, Nature 348:257-260(1990)；及びCookら, Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557(1991)）；ベーターセルリン（Shingら, Science 259:1604-1607(1993)；及びSasadaら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173(1993)）；ヘパリン結合上皮細胞成長因子(ＨＢ-ＥＧＦ)(Higashiyamaら, Science 251:936-939(1991))；エピレグリン（Toyodaら, J. Biol. Chem. 270: 7495-7500(1995)；及びKomurasakiら, Oncogene 15:2841-2848(1997)）；ヘレグリン(以下参照)；ニューレグリン-２(ＮＲＧ-２)（Carrawayら, Nature 387: 512-516(1997)）；ニューレグリン-３(ＮＲＧ-３)（Zhangら, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 9562-9567(1997)）；及びニューレグリン-４(ＮＲＧ-４)(Harariら Oncogene 18:2681-89(1999))又はクリプト(ＣＲ-１)(Kannanら J. Biol. Chem. 272(6):3330-3335(1997))のような天然配列ヒトＥｒｂＢリガンドである。ＥＧＦＲに結合するＥｒｂＢリガンドは、ＥＧＦ、ＴＧＦ-α、アンフィレグリン、ベータセルリン、ＨＢ-ＥＧＦ及びエピレグリンを含む。ＥｒｂＢ３に結合するＥｒｂＢリガンドは、ヘレグリンを含む。ＥｒｂＢ４に結合する能力のあるＥｒｂＢリガンドはベータセルリン、エピレグリン、ＨＢ-ＥＧＦ、ＮＲＧ-２、ＮＲＧ-３、ＮＲＧ-４及びヘレグリンを含む。
ここで使用される「ヘレグリン」(ＨＲＧ)は、米国特許第5,641,869号又はMarchionniら, Nature, 362:312-318(1993)に開示されているようなヘレグリン遺伝子産物にコードされるポリペプチドに相当する。ヘレグリンの例は、ヘレグリン-α、ヘレグリン-β１、ヘレグリン-β２、及びヘレグリン-β３（Holmesら, Science, 256:1205-1210(1992)；米国特許第5,641,869号）；ｎｅｕ分化因子(ＮＤＦ)（Pelesら, Cell 69:205-216(1992)）；アセチルコリンレセプター誘発活性(ＡＲＩＡ)（Fallsら, Cell, 72:801-815(1993)）；グリア成長因子(ＧＧＦ)（Marchionniら, Nature, 362:312-318(1993)）；感覚及び運動神経由来因子(ＳＭＤＦ)（Hoら, J. Biol. Chem. 270:14523-14532(1995)）；及びγ-ヘレグリン（Schaeferら, Oncogene 15:1385-1394(1997)）含む。該用語は、天然配列ＨＲＧポリペプチドの生物学的活性断片及び／又はアミノ酸配列変異体、例えばそれらのＥＧＦ様ドメイン断片(例えばＨＲＧβ１177-244)が含まれる。
ここでの「ＥｒｂＢヘテロ-オリゴマー」は、少なくとも２つの異なるＥｒｂＢを含んでなる非共有的に関連したオリゴマーである。このような複合体は、２以上のＥｒｂＢを発現する細胞がＥｒｂリガンドに暴露すると形成される（Sliwkowskiら, J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665(1994)）。このようなＥｒｂＢヘテロ-オリゴマーの例はＥＧＦＲ-ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ２-ＥｒｂＢ３及びＥｒｂ３-ＥｒｂＢ４複合体を含む。更にＥｒｂＢヘテロ-オリゴマーは、異なるＥｒｂＢレセプター、例えばＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４又はＥＧＦＲと組み合わせられた２以上のＥｒｂＢ２を含んでいてもよい。他のタンパク質、例えばサイトカインレセプターサブユニット(例えばｇｐ１３０)はヘテロ-オリゴマーに含まれうる。ここで言う患者はＥｒｂＢヘテロダイマー、特にＥＧＦＲ-ＥｒｂＢ２および／またはＥｒｂＢ２-ＥｒｂＢ３ヘテロダイマーが患者細胞、例えば患者の患部組織内に存在するかどうかを決定するために分析する対象となりうる。
「ＥｒｂＢのリガンド活性化」とは、対象とするＥｒｂＢを含んでなるＥｒｂＢヘテロ-オリゴマーに結合するＥｒｂＢリガンドに媒介されるシグナル伝達(例えば、ＥｒｂＢ又は基質ポリペプチドのチロシン残基をリン酸化するＥｒｂＢの細胞内キナーゼドメインにより引き起こされる)を意味する。一般に、これはヘテロ-オリゴマーの一又は複数のＥｒｂＢのキナーゼドメインを活性化するＥｒｂＢヘテロ-オリゴマーへのＥｒｂＢリガンドの結合を含むことがあり、よってその結果、ＥｒｂＢの一又は複数のチロシン残基のリン酸化及び／又は更なる基質ポリペプチドのチロシン残基のリン酸化を生じる。ＥｒｂＢ活性は、様々なチロシンリン酸化アッセイを用いて定量化できる。
「ＥｒｂＢアンタゴニスト」は、一又は複数のＥｒｂＢの生物学的活性をブロックする（低減する又は予防する）分子である。好ましくは、前記アンタゴニストはＥｒｂＢのリガンド活性をブロックする（低減する又は予防する）。一般的に、前記アンタゴニストは、抗体、小ペプチド又は非ペプチド（有機）分子、アンチセンス分子、オリゴヌクレオチドおとり分子などであり、ＥｒｂＢレセプターの生物学的活性を阻害する。ゆえに、例えばアンタゴニストはＥｒｂＢに結合するか別の方法で会合するかして、そのチロシンキナーゼ活性を減弱しうる。また、ＥｒｂＢアンタゴニストは、ＥｒｂＢリガンド又はＥｒｂＢシグナル伝達経路の他のメンバーに結合ないしは会合することによってＥｒｂＢの生物学的活性を阻害する分子が含まれる。好適なＥｒｂＢアンタゴニストは、ＥｒｂＢ２又は、ＥＧＦＲ又は、ＥｒｂＢ２及び／又はＥＧＦＲを含んでなるヘテロオリゴマー（例えばヘテロ二量体）に結合する抗体及びＥｒｂＢのリガンド活性をブロックする抗体である。最も好適なアンタゴニストは、ｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４又はｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４の生物学的特性を有する分子である。例として、アンタゴニストは、ＥＧＦＲ標的薬剤及び／又はチロシンキナーゼインヒビターであってもよい。
ここで使用されるように、「ＥＧＦＲ標的薬」という用語は、ＥＧＦＲに結合し、場合によってはＥＧＦＲ活性化を抑制する治療薬に相当する。このような薬剤の例は、ＥＧＦＲに結合する抗体及び小分子を含む。ＥＧＦＲに結合する抗体の例は、ＭＡｂ５７９(ATCC CRL HB8506)、ＭＡｂ４５５(ATCC CRL HB8507)、Ｍａｂ２２５(ATCC CRL 8509)、ＭＡｂ５２８(ATCC CRL HB8509)(米国特許第4,943,533号、Mendelsohnら参照)及びその変異体、例えばキメラ２２５(Ｃ２２５またはセツキシマブ(Cetuximab)；ＥＲＢＵＴＩＸ（登録商標）)及び再構成ヒト２２５(Ｈ２２５)(国際公報96/40210、Imclone Systems社参照)；タイプIIマウスEGFRに結合する抗体(米国特許第5,212,290号)；米国特許第5,891,996号に記載のＥＧＦＲに結合するヒト化及びキメラ抗体；及びＡＢＸ−ＥＧＦのようなＥＧＦＲに結合するヒト抗体(国際公報98/50433、Abgenix参照)を含む。抗ＥＧＦＲ抗体は、細胞障害剤とコンジュゲートされ、よって免疫コンジュゲートを作る(例えば、欧州特許第659,439号A2、Merck Patent GmbH)。ＥＧＦＲに結合する小分子の例は、ＺＤ１８３９またはゲフィチニブ(Gefitinib)(ＩＲＥＳＳＡＴＭ；Astra Zeneca)、ＣＰ-３５８７７４(ＴＡＲＣＥＶＡＴＭ；Genentech/OSI)及びＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Sugen）を含む。
「チロシンキナーゼ阻害剤」は、ＥｒｂＢなどのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性をある程度阻害する分子である。そのような阻害剤の例として、PD 153035、4-(3-クロロアニリン)キナゾリン等のキナゾリン、CGP 59326、CGP 60261、およびCGP 62706等のピリドピリミジン、ピリミドピリミジン、ピルロロピリミジン(pyrrolopyrimidines)、およびピラゾロピリミジン(pyrazolopyrimidines)、4-(フェニルアミノ)-7Ｈ-ピルロロ[2,3-d]ピリミジン、カルシウム(ディフェルロイルメタン、4,5-bis (4-フルオロアニリノ)フタルイミド)、ニトロチオフェン成分を含むトリホスチン(tyrphostines)；PD-0183805 (Warner-Lamber)；アンチセンス分子(例えば、ＥｒｂＢコード化核酸に結合するもの)；キノキサリン(quinoxalines) (米国特許第5,804,396号)；トリホスチン(米国特許第5,804,396号)；ZD6474 (Astra Zeneca)；PTK-787 (Novartis/Schering AG)；CI-1033 (Pfizer)等のpan-ErbB阻害剤 ；Affmitac (ISIS 3521; Isis/Lilly)；メシル酸イマチニブ (Gleevac; Novartis)；PKI 166 (Novartis)；GW2016 (Glaxo SmithKline)；CI-1033 (Pfizer)；EKB-569 (Wyeth)；セマキシニブ(Semaxanib) (Sugen)；ZD6474 (AstraZeneca)；PTK-787 (Novartis/Schering AG)；1NC-1C11 (Imclone)；または以下に挙げるいずれかの特許文献に記載されているもの：米国特許第5,804,396号；国際公報99/09016 (American Cyanimid)；国際公報98/43960 (American Cyanamid)；国際公報97/38983 (Warner Lambert)；国際公報99/06378 (Warner Lambert)；国際公報99/06396 (Warner Lambert)；国際公報96/30347 (Pfizer, Inc)；国際公報96/33978 (Zeneca)；国際公報96/3397 (Zeneca)；及び国際公報96/33980 (Zeneca)だけでなく、前段落に記載したＥＧＦＲ標的薬剤を含む。
「天然配列」ポリペプチドは、天然由来の対応するポリペプチド(例えば、ＥｒｂＢ又はＥｒｂＢリガンド)と同一のアミノ酸配列を有するものである。このような天然配列ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。従って、天然配列ポリペプチドは、自然発生ヒトポリペプチド、マウスポリペプチド、又は特定の他の哺乳動物種のアミノ酸配列を有しうる。
「アミノ酸配列変異体」という用語は、天然配列ポリペプチド由来と或る程度異なっているアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。通常、アミノ酸配列変異体は天然のＥｂｒＢリガンドの少なくとも１つのレセプター結合ドメインと又は天然のＥｂｒＢの少なくとも１つのリガンド結合ドメインと少なくとも約７０％の相同性を有しており、好ましくは該レセプター又はリガンド結合ドメインと少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％の相同性を有している。アミノ酸配列変異体は、天然アミノ酸配列のアミノ酸配列内の或る位置での置換、欠失及び／又は挿入を有している。
「相同性」は、配列を整列させ、必要な場合には最大パーセントの相同性を達成するために間隙を導入した後に、同一であるアミノ酸配列変異体中の残基のパーセントとして定義される。整列の方法およびコンピュータープログラムは当該分野で良く知られている。一つのこのようなコンピュータープログラムはジェネンテック（Genentech）Inc．の著作の「Align 2」であり、これは1991年12月10日に20559ワシントンＤＣの米国著作権庁に使用者用説明書と共に提出された。
ここでの「抗体」という用語は最も広義に使用され、特に完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗体から形成された多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片も含む。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、抗体産生の際に増加する突然変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む通常のポリクローナル抗体と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されないで合成される点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、第１にKohlerら, Nature 256, 495 (1975)により開示されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは例えば組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例えば、米国特許第4,816,567号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClacksonら, Nature 352:624-628(1991)、及びMarksほか, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を特に含む(米国特許第4,816,567号；Morrisonほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。ここで対象とするキメラ抗体は、非ヒト(例えばオナガザル、サルなど)及びヒト定常領域配列から誘導される可変ドメイン抗原結合配列を含んでなる「霊長類化」抗体を含む。
「抗体断片」は、完全な抗体の一部、好ましくはその抗原結合又は可変領域が含んでなる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディー(diabodies)；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
「完全な」抗体は、抗原結合可変領域、並びに軽鎖定常ドメイン(ＣＬ)及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含んでなるものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)又はそのアミノ酸配列変異体でありうる。好ましくは、完全な抗体は一又は複数のエフェクター機能を有する。
抗体「エフェクター機能」は抗体のFc領域(天然配列Fc領域又はアミノ酸配列変異体Fc領域)に帰因するこれらの生物学的活性に関する。抗体エフェクター機能の例は、Ｃｌｑ結合；補体依存性細胞障害活性；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介細胞障害活性(ＡＤＣＣ)；食作用；細胞表面レセプターのダウンレギュレーション(Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ)、等を含む。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、完全な抗体は異なる「クラス」に分類できる。完全な抗体の五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更に「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３，ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ及びμと称される。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られている。
「抗体依存性細胞媒介細胞障害活性」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ)を発現する非特異性細胞障害性細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介反応に関する。ＡＤＣＣを媒介する第１の細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲIIIのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＩ、ＦｃγII及びＦｃγIIIを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現はRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991)の４６４ページの表３に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、例えば米国特許第5,500,362号又は5,821,337号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。このアッセイで使用できるエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を含む。他に、又はさらに対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)に記載されている様な哺乳動物のモデルでインビボの評価がされうる。
「ヒトエフェクター細胞」は、一つ以上のＦｃＲを発現する白血球であり、エフェクター機能を果たす。好ましくは、細胞は、少なくともＦＣγＲIIIを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー(ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球を含む；ＰＢＭＣ類及びＮＫ細胞が好まれる。エフェクター細胞は、その天然ソースより単離されてもよい；例えばここにおいて記載の血液又はＰＢＭＣ類である。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記述するために使用される。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(γレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲIIレセプターは、ＦｃγＲIIＡ(「活性化レセプター」）及びＦｃγＲIIＢ(「阻害レセプター」）を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化ＦｃγＲIIＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ）を有する。阻害レセプターＦｃγＲIIＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＩＭ）を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)に概説されている）。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capelら, Immunomethods 4:25-34 (1994);及びde Hasら, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲが、ここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。この用語は胎児への母性ＩｇＧｓの移動の原因である新生児レセプター、ＦｃＲｎもまた含む(Guyerら, J. Immumol. 117:587 (1976)及びKimら, J. Immunol. 24:249 (1994))。
「補体依存性細胞障害活性」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下で目的物を溶解させる分子の能力に関する。補体活性化経路は、同系の抗原と複合体形成する分子(例えば、抗体)への補体系の第１の成分(Ｃｌｑ)の結合により開始される。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro等, J.Immunol. Methods 202:163(1996)に記載されているようなＣＤＣアッセイが実施されうる。
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)への抗体の関与を示す。
ここで使用される場合、「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合性を生じる抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)）又は「高頻度可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３);Chothia及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))を含んでなる。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここに定義した高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つの高頻度可変領域は相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つの高頻度可変領域のみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。抗-ＥｒｂＢ２抗体ｓｃＦｖ断片は国際公報93/16185；米国特許第5,571,894号；及び米国特許第5,587,458号に記載されている。
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成を可能にするリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、欧州特許第404,097号；国際公報93/11161；及びHollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
非ヒト(例えば齧歯動物)抗体の「ヒト化」形とは、非非と免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分においてヒト化抗体はレシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域残基（ＦＲ）は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体に、又はドナー抗体に見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全ての高頻度可変領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体はまた、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒトの免疫グロブリンのものを含んでなる。さらなる詳細は、Jonesら, Nature 321, 522-525(1986)；Reichmanら, Nature 332, 323-329(1988)及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596(1992)を参照。
ヒト化抗-ＥｒｂＢ２抗体は、出展明示によりここに取り込まれる米国特許第5,821,337号の表３に記載されているようなｈｕＭＡｂ４Ｄ５-１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-７及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８(ハーセプチン(登録商標))；ヒト化５２０Ｃ９(国際公報93/21319)及び以下に記載されるようなヒト化２Ｃ４抗体を含む。
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及びタンパク質様又は他の非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法によって決定した場合９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％の抗体まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
対象とする抗原、例えばＥｒｂＢ２抗原に「結合する」抗体は、抗体が抗原発現細胞を標的にしての治療剤として利用できる程、十分な親和性で抗原に結合することができるものである。抗体がＥｒｂＢ２に結合するものである場合、通常他のＥｒｂＢに対してＥｒｂＢ２と特異的に結合し、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３又はＥｒｂＢ４などの他のタンパク質と有意には交差反応しないようなものである。このような実施態様では、これらの非ＥｒｂＢ２タンパク質に対する抗体の結合度合い(例えば内在性レセプターに対する細胞表面結合性)は、蛍光活性化細胞選別(ＦＡＣＳ)分析又は放射性免疫沈降(ＲＩＡ)による測定では約１０％未満であろう。時として、抗-ＥｒｂＢ２抗体は、例えばSchecterら, Nature 312:513(1984)及びDrebinら, Nature 312:545-548(1984)に記載されているように、ラットｎｅｕタンパク質と有意には交差反応しない。
ＥｒｂＢのリガンド活性化を「阻害する（ブロックする）」抗体は、上で定義したような活性化を減少又は防止するもので、ここで抗体は、実質的にモノクローナル抗体４Ｄ５よりも効果的に、例えばモノクローナル抗体７Ｆ３又は２Ｃ４又はそのＦａｂ断片と同じくらい効果的に、好ましくはモノクローナル抗体２Ｃ４又はそのＦａｂ断片と同じくらい効果的にＥｒｂＢのリガンド活性化を阻害することができる。例えば、ＥｒｂＢのリガンド活性化を阻害する抗体は、ＥｒｂＢヘテロ-オリゴマーの阻害型で４Ｄ５よりも約５０−１００％効果的であるものでありうる。ＥｒｂＢのリガンド活性化の阻害は、任意の方法により、例えばＥｒｂＢに結合するリガンド、ＥｒｂＢ複合型、ＥｒｂＢ複合体のＥｒｂＢのチロシンキナーゼ活性化及び／又はＥｒｂＢでの又はによるチロシンキナーゼ残基のリン酸化を妨げることにより生じうる。ＥｒｂＢのリガンド活性化を阻害する抗体の例は、モノクローナル抗体２Ｃ４及び７Ｆ３(ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ４ヘテロオリゴマーのＨＲＧ活性化；ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ２ヘテロオリゴマーのＥＧＦ，ＴＧＦ-α、アンフィレグリン、ＨＢ-ＥＧＦ及び／又はエピレグリン活性化)；ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４を発現するＴ４７Ｄ細胞に結合するＥＧＦ及びＮＤＦを阻害する及びＬ２６、Ｌ９６及びＬ２８８抗体(Klapperら, Oncogene 14:2099-2109(1997))を含む。
命名された抗体の、例えば２Ｃ４と命名されたモノクローナル抗体の「生物学的特性」を有する抗体は、同じ抗体(例えばＥｒｂＢ２)に結合する他の抗体から識別する、抗体の一又は複数の生物学的特性を有するものである。例えば、２Ｃ４の生物学的特性を有する抗体は、ＥｒｂＢ２とＥｒｂＢ３又はＥｒｂＢ４を含むＥｒｂＢヘテロ-オリゴマーのＨＲＧ活性化を阻害しても；ＥＧＦＲ及びＥｒｂＢ２を含むＥｒｂＢのＥＧＦ、ＴＧＦ-α、ＨＢ-ＥＧＦ、エピレグリン及び／又はアンフィレグリン活性化を阻害しても；ＭＡＰＫのＥＧＦ、ＴＧＦ-α及び／又はＨＲＧ媒介活性化を阻害しても；及び／又は２Ｃ４により結合するようなＥｒｂＢ２の細胞外ドメインの同じエピトープに結合(例えば、モノクローナル抗体２Ｃ４のＥｒｂＢ２への結合を阻害する)してもよい。
特に示されなければ、表記「モノクローナル抗体２Ｃ４」は以下の実施例のマウス２Ｃ４抗体の、又は該抗体由来の抗原結合残基を有する抗体に相当する。例えば、モノクローナル抗体２Ｃ４は、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４又はその変異体、例えばマウスモノクローナル抗体２Ｃ４の抗原結合アミノ酸残基を有するヒト化抗体２Ｃ４でありうる。ヒト化２Ｃ４抗体の例は、以下の実施例３で提供される。他に示されなければ、ここで使用される場合の発現「ｒｈｕＭＡｂ２Ｃ４」はそれぞれ配列番号．３及び４の可変軽鎖(ＶＬ)及び可変重鎖(ＶＨ)配列を含み、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞により通常発現されるヒト軽鎖及び重鎖ＩｇＧ１(非-Ａアロタイプ)定常領域配列に融合する抗体を意味する。
特に示されなければ、「モノクローナル抗体４Ｄ５」という用語は、マウス４Ｄ５抗体(ATCC CRL10463)の、又は該抗体由来の抗原結合残基を有する抗体の相当する。例えば、モノクローナル抗体４Ｄ５はマウスモノクローナル抗体４Ｄ５又はその変異体、たとえばマウスモノクローナル抗体４Ｄ５の抗原結合残基を有するヒト化４Ｄ５であってもよい。ヒト化４Ｄ５抗体は、米国特許第5,821,337号に記載されているようなｈｕＭＡｂ４Ｄ５-１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-７及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８(ハーセプチン(商品名))を含み、ここで、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８(ハーセプチン(登録商標))はヒト化４Ｄ５抗体であることが好ましい。
ここで使用される場合の「成長阻害剤」とは、インビトロ又はインビボのいずれかにおいて、細胞、特にＥｒｂＢ発現癌細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を指すものである。よって、成長阻害剤とは、Ｓ期におけるＥｒｂＢ発現細胞のパーセンテージを有意に低減させるものである。成長阻害剤の例には、細胞周期の進行を阻害する薬剤(Ｓ期以外のところで)、例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘発する薬剤が含まれる。伝統的なＭ期ブロッカーには、ビンカ(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン、及びトポＩＩインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。またＧ１を停止させるこれらの薬剤、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-ＣがＳ期停止に溢流する。更なる情報は、Murakamiらにより「細胞***周期の調節、癌遺伝子、及び抗新生物薬(Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs)」と題された、癌の分子的基礎(The Molecular Basis of Cancer)、Mendelsohn及びIsrael編、第１章(WB Saunders；Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
「成長阻害」抗体の例は、ＥｒｂＢ２に結合して、ＥｒｂＢ２を過剰発現する癌細胞の成長を抑制するものである。好ましい成長阻害抗-ＥｒｂＢ２抗体は、成長阻害がＳＫ-ＢＲ-３細胞の抗体への暴露から６日後に決定される場合に、抗体濃度約０．５から３０μg/mlで２０％よりも大きく、好ましくは５０％よりも大きく(例えば約５０％から１００％)細胞培養物のＳＫ-ＢＲ-３乳癌細胞の成長を阻害する(1997年10月14日公開の米国特許第5,677,171号参照)。ＳＫ-ＢＲ-３細胞成長阻害アッセイは、該特許及び以下に更に詳しく記載される。好ましい成長阻害抗体は、モノクローナル抗体４Ｄ５、例えばヒト化４Ｄ５である。
「細胞死を誘発」する抗体は、生存している細胞を生存不能とさせるものである。該細胞は一般に、ＥｒｂＢ２レセプターを発現するもので、特に該細胞はＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する。好ましくは細胞は癌細胞、例えば***、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、大腸、甲状腺、膵臓又は膀胱細胞である。インビトロでは、細胞はＳＫ-ＢＲ-３、ＢＴ４７４、Ｃａｌｕ３、ＭＤＡ-ＭＢ-４５３、ＭＤＡ-ＭＢ-３６１又はＳＫＯＶ３細胞でありうる。インビトロでの細胞死は、補体と免疫エフェクター細胞の非存在下で決定され、抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)又は補体依存性細胞障害活性(ＣＤＣ)により誘発される細胞死と区別される。よって、細胞死に対するアッセイは、熱不活性化血清(すなわち補体の不在下)を使用し、免疫エフェクター細胞の不在下で行うことができる。抗体が細胞死を誘発可能であるか否かを測定するために、ヨウ化プロピジウム(ＰＩ)、トリパンブルー(Mooreら, Cytotechnology 17:1-11(1995)を参照)又は７ＡＡＤの取込みにより評価される膜インテグリティの損失度合いが未処理細胞と比較して評価される。好ましい細胞死誘発抗体は、ＢＴ４７４細胞におけるＰＩ取込みアッセイにおいて、ＰＩの取込みを誘発するものである(下記参照)。
「アポトーシスを誘発」する抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞の形成(アポトーシス体と呼ばれる)により決定されるようなプログラム細胞死を誘発するものである。細胞は、通常ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現するものである。好ましくは細胞は、腫瘍細胞、例えば***、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、大腸、甲状腺、膵臓又は膀胱細胞である。インビトロでは、細胞はＳＫ-ＢＲ-３、ＢＴ４７４、Ｃａｌｕ３細胞、ＭＤＡ-ＭＢ-４５３、ＭＤＡ-ＭＢ-３６１又はＳＫＯＶ３細胞でありうる。アポトーシスに伴う細胞のイベントを評価するために種々の方法が利用できる。例えば、ホスファチジルセリン(ＰＳ)転位置をアネキシン結合により測定することができ；ＤＮＡ断片化はＤＮＡラダーリングにより評価することができ；ＤＮＡ断片化に伴う細胞核／染色質凝結は低二倍体細胞の何らかの増加により評価することができる。好ましくは、ＢＴ４７４細胞を使用するアネキシン結合アッセイにおいて、アポトーシスを誘発する抗体は、未処理細胞の約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合を誘発するという結果を生じるものである(下記参照)。時として、プロアポトーシス抗体は、ＥｒｂＢのＥｒｂＢリガンド活性化を更に阻害するであろう(例えば７Ｆ３抗体)；つまり抗体はモノクローナル抗体２Ｃ４と生物学的特性を共有する。場合によっては、抗体は、ＥｒｂＢのＥｒｂＢリガンド活性化を有意に阻害しないものであろう(例えば７Ｃ２)。さらに、抗体は、アポトーシスを誘発しながら、Ｓ期中の細胞のパーセントの大きな低減を誘発しない７Ｃ２のようなものでありうる(例えば、コントロールと比較してこれらの細胞を約０−１０％の割合だけ低減するもの)。
「エピトープ２Ｃ４」は抗体２Ｃ４が結合するＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン中の領域である。２Ｃ４エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載の通常の交差ブロッキングアッセイを行うことができる。あるいは、抗体がＥｒｂＢ２の２Ｃ４エピトープに結合するか否かを評価するために、エピトープマッピングを行うこともできる(例えば、ＥｒｂＢ２の約残基２２から約残基５８４までを含む領域における任意の一又は複数の残基；図１Ａ−Ｂ参照)。
「エピトープ４Ｄ５」は、抗体４Ｄ５(ATCC CRL 10463)が結合するＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン中の領域である。このエピトープはＥｒｂＢ２の膜貫通領域に近接している。４Ｄ５エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載の通常の交差ブロッキングアッセイを行うことができる。あるいは、抗体がＥｒｂＢ２の４Ｄ５エピトープに結合するか否かを評価するために、エピトープマッピングを行うこともできる(例えば、約残基５２９から約残基６２５までを含む領域における任意の一又は複数の残基；図１Ａ−Ｂ参照)。
「エピトープ３Ｈ４」は抗体３Ｈ４が結合するＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン中の領域である。このエピトープは、ＥｒｂＢ２の細胞外ドメインのアミノ酸配列のうち、約５４１〜約５９９の残基を含む；図１Ａ−Ｂ参照。
「エピトープ７Ｃ２／７Ｆ３」は７Ｃ２及び／又は７Ｆ３抗体(各々以下のATCCで寄託)が結合するＥｒｂＢ２の細胞外ドメインのＮ末端領域である。７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載の通常の交差ブロッキングアッセイを行うことができる。あるいは、抗体がＥｒｂＢ２の７Ｃ２／７Ｆ３エピトープに結合するか否かを確認するために、エピトープマッピングを行うこともできる(例えば、ＥｒｂＢ２の約残基２２から約残基５３までの領域における任意の一又は複数の残基；図１Ａ−Ｂ参照)。
「ＥｒｂＢ発現癌」という用語は、抗ＥｒｂＢ２抗体が結合できるようにその細胞表面にＥｒｂＢタンパク質の存在を有するものである。
ＥｒｂＢの「過剰活性化により特徴づけられる」細胞は、その細胞のＥｒｂＢ活性化の範囲が、同じ組織型の正常細胞で該レセプターの活性化のレベルを十分に超えるものである。このような過剰な活性化は、ＥｒｂＢの過剰発現あるいは過剰増幅及び／又は細胞のＥｒｂＢを活性化する通常レベルよりも大きいＥｒｂＢリガンド活性化により生じうる。このような過剰活性化は、細胞の悪性状態を引き起こす、及び／又はそれにより引き起こされうる。いくつかの実施態様としては、ＥｒｂＢのこのような過剰活性化を生じるＥｒｂＢの増幅及び／又は過剰発現が引き起こされるかどうかを決定するために、患者からの試料は診断又は予後予測のための対象となる。あるいは、又は加えて、レセプターの過剰活性化によるものである、患者におけるＥｒｂＢリガンドの増幅、過剰発現及び／又はタンパク分解過程の増加が起こっていいるかどうかを決定するために、患者からの試料は診断又は予後予測のための対象となる。たびたび、レセプターの過剰活性化が自己分泌刺激性経路に起因する。
「自己分泌」促進経路において、ＥｒｂＢリガンド及びその同族のＥｒＢの両方を産生する癌細胞の効力によって自己促進が引き起こされる。例えば、癌は、ＥＧＦＲを発現又は過剰発現しても、又はＥＧＦＲリガンド(例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ-α、又はＨＢ-ＥＧＦ)を発現又は過剰発現してもよい。他の実施態様では、癌はＥｒｂＢ２を発現又は過剰発現しても、又はヘレグリン(例えば、γ-ＨＲＧ)を発現又は過剰発現してもよい。
ＥｒｂＢを「過剰発現する」細胞は、同じ組織型の正常細胞と比較して、細胞表面のＥｒｂＢ、例えばＥｒｂＢ２の有意に高いレベルを有している。このような過剰発現は、遺伝子増幅により、又は転写又は翻訳を増加させることにより引き起こされてもよい。ＥｒｂＢ過剰発現は、細胞表面のＥｒｂＢタンパク質存在の増加レベルを評価することにより、診断又は予後アッセイで決定されうる(例えば、免疫組織化学アッセイ；ＩＨＣ、酵素抗体法、ウェスタンブロット法、リガンド結合、キナーゼ活性による)。あるいは、又は加えて、細胞のＥｒｂＢコード化核酸のレベルを測定してもよい、例えば、蛍光インサイトハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ；1998年10月公開の国際公報98/45479参照)、サザンブロット法、又はポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)法、例えばリアルタイム定量ＰＣＲ(ＲＴ−ＰＣＲ)。また、血清のような生体液中の脱落抗原(例えば、ＥｒｂＢ細胞外ドメイン)を測定することにより(例えば、1990年6月12日に公開の米国特許第4,933,294号；1991年4月18日公開の国際公報91/05264；1995年3月28日公開の米国特許第5,401,638号；及びSiasら, J. Immunol. Methods 132: 73-80(1990))ＥｒｂＢ過剰発現を研究してもよい。前記アッセイのみならず、様々なインビボアッセイが技術熟練者において利用できる。例えば、検知できるラベル、例えば放射性同位体で任意に標識された抗体に患者の体にある細胞を暴露してもよく、患者の細胞への抗体の結合は、例えば放射活性の外側スキャンニングにより、又は抗体に先に暴露された患者から得られたバイオプシーを分析することにより評価される。
逆に、「ＥｒｂＢの過剰発現により特徴付されない」細胞は、診断アッセイにおいて、同組織型の正常細胞と比較して、ＥｒｂＢの通常のレベルよりも高く発現しないものである。
ＥｒｂＢリガンドを「過剰発現する」細胞は、同組織型の正常細胞に比較して十分に高いレベルのリガンドを産生するものである。このような過剰発現は、遺伝子増幅により、又は転写又は翻訳を増加することにより引き起こされうる。ＥｒｂＢリガンドの過剰発現は、患者のリガンド(又はそれをコードする核酸)のレベルを評価することにより、例えば、バイオプシーで、又はＩＨＣ、酵素抗体法、ウェスタンブロット法、リガンド結合、ＦＩＳＨ、サザンブロット法、ＰＣＲ又は前記のインビボアッセイのような様々な診断アッセイにより診断的に決定してもよい。
ここで使用される「細胞障害性剤」という用語は、細胞機能を阻害又は抑制するか、及び／又は細胞の崩壊を引き起こす物質を意味する。その用語は放射性アイソトープ(例えばＡｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32及びＬｕの放射性同位体)、化学療法剤、及び毒素、例えば細菌、真菌、植物又は動物由来の小分子毒又は酵素活性毒のような毒を含み、それらの断片及び／又は変異体を含むことを意図している。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル類、；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)などのアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カリケアマイシン(calicheamicin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、キラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)などの抗生物質；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ）などの抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)などの葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)、５-ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)などのアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)などの葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；オキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)：ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＫＳ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えばパクリタキセル（タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、及びドキセタキセル（タキソテレ(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンなどのプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン(navelbine)；ノバントロン(novantron)；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＴＰ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。また、この定義には、細胞に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)、４(５)-イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、トレミフェン(Fareston)を含む抗エストロゲン；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)及びニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド(bicalutamide)、リュープロリド(leuprolide)及びゴセレリン(goserelin)；並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
「抗-血管形成剤」は、血管の発達を阻害する、又はある程度妨げる化合物に相当する。抗-血管形成因子は、例えば、血管形成の促進に関与する成長因子又は成長因子レセプターに結合する小分子又は抗体でありうる。ここでの好ましい抗-血管形成因子は、組み換えヒト化抗ＶＥＧＦ抗体であるＡＶＡＳＴＩＮＴＭ(Genentech)のような、血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)に結合する抗体である。
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。このようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンを挙げることができる。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)のような糖タンパク質ホルモン、副甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)；肝臓成長因子；繊維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミュラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；ＮＧＦ−β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-αあるいはＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子I及びII；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロンα、β、γのようなインターフェロン；マクロファージＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)のようなコロニー刺激因子(ＣＳＦ)；顆粒球マクロファージＣＳＦ(ＧＭ−ＣＳＦ)及び顆粒球ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１０、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２等のインターロイキン(ＩＬ)；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α又はＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
「パッケージ挿入物」という用語は効能、用法、用量、投与方法、禁忌及び／又はかかる治療製品の使用に関する警告についての情報を含む、治療製品の市販用パッケージに通常含まれるインストラクションを意味するために使用される。
「心臓保護剤(cardioprotectant）」は、患者へのアントラサイクリン抗生物質及び／又は抗-ＥｒｂＢ２抗体のような薬剤の投与に関連する心筋機能障害(すなわち心筋症及び／又はうっ血性心不全）を予防する又は減じる化合物或いは組成物である。心臓保護剤は、例えば、フリーラジカル媒介心毒性効果を妨害又は減じ及び／又は酸化的ストレス障害を防止或いは減じる。現定義で包含される心臓保護剤の例は、イオンキレート剤dexrazoxane(ICRF-187)(Seifertら，The Annals of Phamacotherapy 28:1063-1072(1994)）；脂肪低減剤及び／又はプロブコール(Singalら, J. Mol. Cell Cardiol. 27:1055-1063(1995)のような抗酸化剤；アミフォスチン(amifostine）(アミノチオール２-［(３-アミノプロピル)アミノ］エタンチオール-二水素リン酸塩エステル、またWR-2721と呼ばれている、及びWR-1065と呼ばれる、その脱リン酸化細胞取り込み型）及びS-3-(3-メチルアミノプロピルアミノ)プロピルホスホチオ酸(WR-151327)、Greenら，Cancer Research 54:738-741(1994)を参照のこと；ジゴキシン(Bristow, M.R. In : Bristow MR, ed. Drug-Induced Heart Disease. New York : Elsevier 191-215[1980]）；メトプロロール(Hjalmarsonら，Drugs 47: Suppl 4:31-9[1994]; 及びShaddy ら，Am. Heart J. 129:197-9[1995]）のようなベーターブロッカー；ビタミンＥ；アスコルビン酸(ビタミンＣ）；オレアノール酸、ウルソル酸及びＮ-アセチルシステイン(ＮＡＣ）のようなラジカルスカベンジャー；アルファ-フェニル-ブチルニトロン(ＰＢＮ）のようなスピントラップ化合物(Paracchiniら，Anticancer Res. 13:1607-1612(1993)）；Ｐ２５１(Elbesen）のようなセレン有機化合物；類似物を含む。
II．詳細な説明
膜貫通型チロシンキナーゼレセプターのＥｒｂＢ（ＨＥＲ）ファミリは４つのメンバー、ＥｒｂＢ１（ＨＥＲ１、ＥＧＦＲ）；ＥｒｂＢ2（ＨＥＲ2又はｐ１８５ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ3（ＨＥＲ3）及びＥｒｂＢ4（ＨＥＲ4又はｔｙｒｏ2）から成る。
ＥｒｂＢ2／ＨＥＲ2／ｐ１８５ｎｅｕ及びＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲは、ほとんどの上皮性悪性腫瘍、例として乳癌、頭頸部癌、胃癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌、肺癌、膀胱、並びに膠芽腫において、有意に過剰発現する。ＨＥＲ２は、ヘテロ二量体を形成することによってＨＥＲファミリの他のレセプターによって生じるシグナルを増幅する。ＨＥＲシグナル伝達ネットワークのＨＥＲ２の重要な役割によって癌治療のための抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体（ＭＡｂ）が開発された。特に、ヒト化抗ＥｒｂＢ２ ＭＡｂ（trastuzumab、ハーセプチン、Genentech, Inc.）は、ＨＥＲ２を過剰発現する乳癌の女性の治療に広く使われている。TrastuzumabはＨＥＲ２レセプターの下方制御を誘発し、その結果、重要なシグナル伝達経路（すなわちｒａｓ-Ｒａｆ-ＭＡＰＫ及びＰＩ3Ｋ／Ａｋｔ）が阻害され、ｐ２７／Ｃｄｋ２複合体の形成を誘導することによる細胞周期の進行を阻害する。また、Trastuzumabは抗体誘導性レセプター下方制御に先行するＨＥＲ２切断を阻害する。この効果はいくつかの癌における抗腫瘍活性に寄与しうる。生体内で、trastuzumabは血管新生を阻害して、抗体依存性細胞障害を引き起こす。ＨＥＲ２は、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４とヘテロ二量体を形成することが知られている。２Ｃ４と称するヒト化モノクローナル抗体は癌治療のための臨床研究の段階にある。２Ｃ４は、trastuzumabよりＨＥＲ２外部ドメインの異なるエピトープと結合して、立体配置的に他のＨＥＲレセプターとのヘテロ二量体のＨＥＲ２漸増を妨げる。この結果、ＨＥＲ２発現が低い細胞においてもＨＥＲ２発現が高い細胞においてもHER２-ベースのヘテロ二量体によるシグナル伝達が阻害される。インビトロ及びインビボでの抗腫瘍活性は、胸部腫瘍及び前立腺腫瘍のモデルの分野において報告された。また、小分子抗ＨＥＲ２／新規のペプチド模倣（anti-HER2/neu peptidomimetics、ＡＨＮＰ）が開発され、癌治療における有効性について試験された(Zhang等, Drug News Perspect. 13(6)325-9 (2000))。
本発明は、少なくとも一部は、ＥｒｂＢアンタゴニストが痛覚消失効果を表すので、癌関連の疼痛などの慢性疼痛を含む疼痛管理に有用であるという予想外の発見に基づく。特に、本発明は、ヒト化抗ＥｒｂＢ２抗体２Ｃ４で治療される前立腺癌患者はより少ない疼痛を記録し、ＰＳＡ値が減少しない場合にさえも痛覚消失が軽減された。同様に、ヒト化２Ｃ４抗体の痛覚消失効果は脂肪肉腫の治療の間に観察された。
したがって、その最も広義の態様では、本発明はＥｒｂＢアンタゴニストを用いた疼痛管理に関する。特に、本発明は、癌関連又は癌に伴う急性及び慢性の疼痛を含む疼痛のＥｒｂＢアンタゴニストを用いた管理に関する。本発明は、限定するものではないが、侵害受容性疼痛、体性痛覚、内臓痛、神経障害疼痛、中枢神経に起因する疼痛（求心路遮断性疼痛及び交感神経性に維持された疼痛を含む）、及び末梢神経に起因する疼痛（痛みを伴う多発性神経炎及び痛みを伴う単神経障害を含む）を含む任意の種類の疼痛の治療に関する。
ＥｒｂＢアンタゴニスト
本発明のＥｒｂＢアンタゴニストは、一以上のＥｒｂＢの生物学的活性をブロックする分子である。好ましくは、アンタゴニストはＥｒｂＢのリガンド活性をブロック（低減又は予防）する。特定の実施態様では、本発明のＥｒｂＢアンタゴニストは、ＥｒｂＢ2（ＨＥＲ２）及び／又はＥｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）レセプター又はそれらレセプターを含んでなるレセプター複合体によって媒介される生物学的活性を阻害する。
本願明細書中のＥｒｂＢアンタゴニストとして、ポリペプチド（抗体及び抗体断片を含む）、ペプチド、ペプチド擬晶、非ペプチド小有機分子、アンチセンス分子及びオリゴヌクレオチドおとり分子が挙げられるが、これに限定されるものではない。
ＥＧＦＲのキナーゼポケットへのＡＴＰ結合と競合する小有機分子は、例えば、Arteaga CL., Exp. Cell. Res. 284(1): 122-30 (2003)に検討されている。小分子ＥＧＦＲインヒビター、ＩｒｅｓｓａＴＭ (ZD1839, gefinitib, Aztra-Zeneca)は、例えば、Kris M 等 JAMA, 290(16): 2149-2158 (2003)に記述される。更なる小分子ＥＧＦＲアンタゴニストにはＣＰ358,774（ＴＡＲＣＥＶＡ(登録商標)；Genentech/OSI）及び、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Sugen）が含まれる。
また、抗ＥＧＦＲ抗体は従来技術において周知であり、例えば、Ｅｒｂｉｔｕｘ(登録商標)（ＩＭＣＣ２２５、セツキシマブ、ＩｍＣｌｏｎｅ）、キメラ抗ＥＧＦＲ ＭＡｂ、及び、再構築されたヒト２２５（Ｈ２２５）（国際公報９６／４０２１０（ImClone Systems Inc.）が含まれる。ＥＧＦＲと結合する抗体の更なる例には、ＭＡｂ５７９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ ８５０６）、ＭＡｂ４５５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ８５０７）、ＭＡｂ２２５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０８）、ＭＡｂ５２８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０９）（米国特許第４,９４３,５３３号、Mendelsohn等）及びその変異形、米国特許第５,８９１,９９６号に記載のようなＥＧＦＲを結合するヒト化抗体及びキメラ抗体、ＡＢＸ-ＥＧＦなどのＥＧＦＲを結合するヒト抗体（国際公報98／50433、Abgeruxを参照）を含む。抗ＥＧＦＲ抗体は、細胞障害性薬剤とコンジュゲートされてもよく、したがって免疫コンジュゲートを生成する（ＥＰ659,439Ａ2、Merck Patent GmbHを参照）。
ＥＧＦＲチロシンキナーゼと関連するＥｒｂＢ２の選択的阻害剤であるＣＰ-６５４５７７(Pfizer)は、例えば、Barbacci 等, Cancer Res. 63(15): 4450-9 (2003)に開示される。抗ＥｒｂＢ２ペプチド擬態の小分子型は、Zhang 等, Drug Nes Perspect 13(6): 325-9 (2000)に記述される。
ＥｒｂＢアンタゴニストの同定
ＥＧＦＲ及び／又はＥｒｂＢ２などのＥｒｂＢレセプターの生物学的活性を標的として阻害する新規の薬剤を従来技術において周知の方法によって同定することができる。
一般に、新しいＥｒｂＢアンタゴニストを同定する際の第一段階はインビトロスクリーニングであり、その後、適当な動物モデルでのインビボアッセイ、最終的にヒトの臨床試験である。
ＥｒｂＢレセプター又はレセプター複合体と結合する化合物を同定するために、それぞれ天然の供給源から単離するか組み換えＤＮＡ技術及び／又は化学合成法によって産生したＥｒｂＢレセプター又はレセプター複合体を用いてレセプター結合試験を行うことができる。候補化合物の結合能は、直接結合又は、間接的な、例えば競合的結合によって試験することができる。競合的結合実験において、レセプター結合する他の化合物の５０％を置換するのに必要な化合物の濃度（ＩＣ５０）は通常、結合親和性の測定値として用いられる。
他の方法では、新規のＥｒｂＢアンタゴニストを同定するために、標的ＥｒｂＢレセプタ（例えばＥｒｂＢ２又はＥＧＦＲ）をコードする配列をコードするＤＮＡを、選択可能なマーカーを含有している発現ベクターにクローニングする。ベクターを用いて組換え宿主細胞の形質転換を行う。数回の選別後、ＥｒｂＢレセプターを発現する安定株が同定される。次いで、新規なＥｒｂＢアンタゴニストは、標的ＥｒｂＢレセプターの公知のインヒビターと効果的に競合する能力によって同定されうる。公知の方法、例えばスキャッチャード分析によって、結合係数が測定されうる。
また、標的ＥｒｂＢレセプターを発現することが公知の細胞又は細胞株を用いて結合実験を行いうる。
ＥｒｂＢのリガンド活性をブロックする候補分子を同定するために、ＥｒｂＢを発現する細胞へのＥｒｂＢリガンド結合をブロックする分子（例えば、対象のＥｒｂＢがＥｒｂＢヘテロオリゴマーを形成する他のＥｒｂＢとのコンジュゲート型）の能力が測定されてもよい。例えば、ＥｒｂＢヘテロオリゴマーのＥｒｂＢを天然に発現する細胞、又は発現するように形質転換された細胞は、候補分子と共にインキュベートし、次いで、標識したＥｒｂＢリガンドにさらされてもよい。次いで、ＥｒｂＢヘテロオリゴマーのＥｒｂＢへのリガンド結合を遮断する候補分子の能力を評価してもよい。
あるいは、又はさらに、ＥｒｂＢヘテロオリゴマに存在するＥｒｂＢのＥｒｂＢリガンド刺激性チロシンリン酸化をブロックする候補分子の能力を評価してもよい。例えば、ＥｒｂＢを内生的に発現する細胞又はそれらを発現するように形質転換した細胞を候補分子と共にインキュベートし、次いで抗ホスホチロシンモノクローナル（場合によっては検出可能な標識とコンジュゲートしたもの）を用いてＥｒｂＢリガンド依存性チロシンリン酸化活性について検定してもよい。また、米国特許第５,７６６,８６３号に記載のキナーゼレセプター活性化アッセイは、ＥｒｂＢ活性化の測定及びアンタゴニストによるその活性のブロックに利用できる。
また、基本的に例えばSchaefer等 Oncogene 15:1385-1394 (1997)に記述されるように、ＭＤＡ-ＭＢ-175細胞に対する候補分子の成長阻害効果を評価してもよい。このアッセイに記載のように、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞は、候補アンタゴニストで処置して、クリスタルバイオレットで染色してもよい。候補アンタゴニストとのインキュベーションにより、モノクローナル抗体２Ｃ４によってディスプレイされるものと類似の細胞株に対する成長阻害効果が示されうる。さらなる態様では、外因性ＨＲＧはこの阻害を有意に逆転させない。好ましくは、外因的ＨＲＧの存在下及び欠如下において、アンタゴニストは、モノクローナル抗体４Ｄ５より大きな程度に（及び場合によっては、モノクローナル抗体７Ｆ３より大きな程度に）ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の細胞増殖を阻害することが可能でありうる。
一実施形態では、アンタゴニストは、モノクローナル抗体４Ｄ５より実質的に効果的に、そして、好ましくはモノクローナル抗体７Ｆ３より実質的に効果的に、実施例２に記述されるような共同免疫沈降実験で測定されるような、ＭＣＦ７及びＳＫ-ＢＲ-３細胞におけるＥｒｂＢ３とＥｒｂＢ２とのヘレグリン依存性対合をブロックしうる。
増殖阻害性性質を有するアンタゴニストを同定するために、ＥｒｂＢ２を過剰発現させる癌細胞の成長を阻害する抗体についてスクリーニングしてもよい。
細胞死を誘発するアンタゴニストについて選択するために、例えばＰＩ、トリパンブルー又は７ＡＡＤ取り込みによって示される膜完全性の損失を対照との相対比で評価してもよい。好適なアッセイは、ＢＴ４７４細胞を用いたＰＩ取り込みアッセイである。このアッセイの詳細、特に抗体に関連しては、以下に示す。
アポトーシスを引き起こすアンタゴニストを選択するために、例えばＢＴ４７４細胞を用いたアネキシン結合実験又はＢＴ４７４細胞を用いたＤＮＡ染色アッセイを使うことが可能であり、これらアッセイは、アポトーシス特性を有した抗体と共に以下に詳述する。
更なる方法によると、ＥｒｂＢ２及びＥＧＦＲアンタゴニストは、ＥＧＦＲ、ＴＧＦ-α（ＥＧＦＲのリガンド）及びＥｒｂＢ２ ｍＲＮＡ発現レベルを国立癌研究所（NCI）薬剤スクリーンデータベース(Wosikowski等, J. )Vatl. Cancer Inst. 89(20): 1505-15 (1997))の４９０００の化合物の細胞障害性アッセイの結果と相関させることによって同定される。
インビトロアッセイにおける標的生物活性の阻害を測定した後に、対照の疼痛に対する候補アンタゴニストの能力を、疼痛のインビボモデルで試験することができる。
好ましい実施態様では、候補ＥｒｂＢアンタゴニストの痛覚消失性活性は、疼痛研究において用いられる動物モデルで試験する。
疼痛の動物モデル
(i)有害疼痛
有害疼痛に好適な動物モデルは、「テールフリック」試験(Bass及びWanderbrook, J. Ain. Pharm. Assoc. Sci. Ed. 41: 569-70 (1952))である。この方法は、マウス又はラットが候補ＥｒｂＢアンタゴニストの投与の有無にかかわらずそれらの尾部の小さい領域への加熱に反応するように、マウス又はラットの痛覚感受性の測定に基づく。前記試験は、放射熱の適用後の尾部の離脱症状時間の測定に基づくものであり、市販の道具、例えばTail Flick Analgesia Meter (SDI, San Diego, CA)）を用いて行うことができる。
有害疼痛の他の動物モデルは、「ホットプレート足-なめること(hot plate paw-licking)」試験である。この試験では、動物（ラット又はマウス）を、ホットプレート上に別々に配置する後足舐めの第一徴候に対する刺激潜伏性、又は、ジャンプ応答が、侵害受容閾値の指標とされる。この閾値に対する薬剤投与の効果は、痛覚消失性応答の指標と考えられる。(O'Callaghan及びHolzman, J. Pharmaceol. Exp. Ther. 192:497-505 (1975))。投与経路は違ってもよいが、一般的に皮下である。
足-圧(paw-pressure)、又は物理的な痛覚過敏試験は、後足上の又は一般的ではないが尾部上の点状領域に強さを増した圧を与える。実際には、足又は尾部は平面と平滑末端との間に置き、自動読み取りのために目盛りを付けた放射(Green等, Br. J. Pharmacol. 6:572-85 (1957)に従って置換したカーソルと共に、プラスチックコート部分を歯車のシステムの上に配置する。動物の尾部を除去するときに圧力の増加を中断して、応答の閾値のグラム力として動作を読み出した。
また、化学刺激を用いて動物の有害疼痛をモデル化することができる。一般的に、化合物は皮内又は腹腔内に投与される。例えば、ホルマリン（足）では、通常、０．５〜１５％（一般的に約３．５％）のホルマリン溶液をラット前足又は後足の背面又は足底表面へ注入すると、約６０分間、疼痛反応の増強強度及び減弱強度が生じる。代表的な応答は足のリフティング、舐める、かじる又は震えがあり、それは検体の欠如下及び存在下でモニターすることができる(Lariviere及びMelzack, Pain 66:271-7 (1996))。
(ii) 内臓痛
内臓痛は、一般的に刺激物（Writhing Test）、例えば酢酸性／エタクリン酸又はフェニルベンゾキノンの腹腔内投与によって試験される。薬剤は齧歯動物において型どおりの応答を引き起こし、これらは腹部収縮、全身運動、腹筋のひきつり、減弱した運動活動性及び不調整に特徴がある。これらの応答は、内臓化学レセプターと関連する内臓痛の表れと思われる。曲げ試験を成功裏に用いて、ヒトの治療のための効果的な痛覚消失性用量を予測した(Dubinsky等, Agents Actions 20.50-60 (1987))。
(iii) 炎症性疼痛
炎症性疼痛は、一般的に、ｐ-ベンゾキノン誘導性もがき試験又はカラゲナン誘導性後足浮腫モデル(DiRosa 等, J. Pathol. 101:15-29 (1971))を用いてモデル化する。
炎症性疼痛の他の動物モデルにおいて、カプサイシンの皮内注射を、神経原性炎症及び痛覚過敏に用いられる。本来、応答を観察し、視覚散布により定量化するが、サーモグラフィ及びレーザードプラフローメトリーの最近の発達により、神経原性炎症反応及び炎症反応を数量化する有用な手段であることが証明された。詳しくは、例えばSumikura 等, Pain 105(285-291 (2003)参照。
(iv) 舐める、ひっかき及びかみつき応答
このような応答は、例えば、気管内に注入される（i.t.）、特に高用量（３ｇ／ｋｇ）のＴＮＦ-α（一般的に１００ｐｇ）、ＩＦＮ-γ（一般的に１００ｐｇ）又はＩＬ-１β（一般的に１００ｐｇ）によって誘発されうる。加えて、同様の応答は、グルタミン酸塩（２０μｇ）、Ｎメチル-Ｄアスパラギン酸（５０ｎｇ）、α-アミノ-３-ヒドロシ-５-メチルイソキサゾール-４-プロピオン酸（１３ｎｇ）又はカイニン酸の気管内注入、又はｆｏ物質Ｐ(fo substrance P)あるいはカプサイシンの投与によって誘発されうる。
(v) 神経障害疼痛
ラットの座骨神経の慢性収縮損傷（ＣＣＩ）は、持続的で物理的な痛覚過敏及び異痛を誘発し、神経障害疼痛のモデルに広く使われている(Bennett及びXie, Pain 33:87-107 (1988))。
(vi) 癌疼痛
癌疼痛の治療のための候補薬剤は、急性及び慢性の疼痛又は炎症性疼痛の上記した動物モデルで試験されうる。加えて、特に癌疼痛を試験するようにデザインされた有用な動物モデルが多くある。
例えば、Menendez 等, Brain Res. 969(102): 102-9 (2003)に記載されるように、候補ＥｒｂＢアンタゴニストは、骨癌疼痛のマウスモデルで試験されうる。この試験は、ＮＣＴＣ２４７２細胞を頸骨内投与された（i.t.）Ｃ3Ｇ／ＨｅＪマウスの有害な熱に対する反応性を調査した。ＮＣＴＣ２４７２細胞は骨肉腫を誘発することが可能で、接種の数週間後に軟組織約２に骨を突破する。そして、４週めから肢サイズの肉眼で見える増加を生産する。熱反応性は細胞移植後の初めの２週間に減少する。この痛覚過敏はナロキソン（１０ｍｇ／ｋｇ）の投与によって逆転される。著者によると、ＮＣＴＣ２４７２細胞移植後第４週と第５週の間に、痛覚鈍麻の代わりに侵害受容の熱反応性の増加が観察された。この痛覚過敏は、モルヒネ（１５ｍｇ／ｋｇ）の全身投与によって予防された。骨癌疼痛のこの動物モデルを用いて、骨癌疼痛、及び一般的に存在しうる癌疼痛の管理のためのＥｒｂＢアンタゴニストなどの新規の薬剤を同定して研究することができる。
同様に、Wacnik 等, Pain 101(1-2): 175-86 (2003)によって記述されるように、癌疼痛に対する候補ＥｒｂＢアンタゴニストの効果は腫瘍を移植したマウスで研究することができる。
神経障害癌疼痛のマウスモデルは、Shimoyama 等, Pain 99(1-2): 167-74 (2002)によって開発された。このモデルでは、Ｍｅｔｈ Ａ肉腫細胞が、ＢＡＬＢ／ｃマウスの坐骨神経の隣接部に接種されていた。成長する腫瘍は徐々に神経を圧縮し、それによって神経損傷を引き起こす。熱痛覚過敏の時間経過及びvon Frey hairに対する物理的な感受性を測定し、自然痛の徴候を評価する。
痛覚閾値研究のための突然変異体マウスを用いる例は、Guiiherme 等, Nature Neurosci. 6:221-222 (2003)に記載される。
一般的な疼痛の動物モデルの概要のために、例えばEaton, M., J. of Rehabilitation Research and Development 40(4) Suppl. 1:41-54 (2003)）を参照のこと。
ヒト臨床試験
疼痛測定値は痛覚欠如を評価するために必須である。ヒト臨床試験において、個々の患者によって経験される疼痛は、視覚的アナログスケール（Visual Analog Scale、ＶＡＳ）、図形描写スケール、数のスケール、機能障害評価アンケート（Health Assessment Questionare、ＨＡＱ）疼痛指標などを含む一以上の公知の疼痛測定によって評価される。Initiative on Methods, Measurement, and Pain Assessment in Clinical Trials（IMMPACT）が後援するワークショップは、すべての慢性疼痛実験に伴うと思われる６のコンセンサスドメインを示した(Turk 等, Pain, 106(3): 337-45 (2003))。
疼痛は様々なスケール、例えば０〜１００又は０〜１０のスケールで記録されるＶＡＳを用いて評価されることが最も多い。そのスケールは、最も低いスケールが痛みなし、最も高いスケールが最も悪いと思われる痛みを表す。患者が１００のレベルの疼痛を識別するのが困難であると報告されたので、最も頻繁に使われるＶＡＳ系は０〜１０のスケールである(Miller, GA, Psychological Review 63:81-97 (1956)。
図形スケールは一般的に以下の描写を含む：疼痛なし、軽度の疼痛、中程度の疼痛、重度の疼痛、非常に重度の疼痛及び最悪の疼痛。
好ましい実施態様では、本発明のＥｒｂＢアンタゴニストは、抗ＥｒｂＢ２抗体である。
抗ＥｒｂＢ２抗体の製造
本発明で使用される抗体を製造するための例示的な技術を以下に説明する。抗体の製造に使用されるＥｒｂＢ２抗原は、例えば所望のエピトープを含むＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン又はそれらの一部の可溶形態のものであってよい。あるいは、抗体を産生するために、その細胞表面にＥｒｂＢ２を発現する細胞(例えばＥｒｂＢ２を過剰発現するように形質転換されたＮＩＨ-３Ｔ３細胞；又は癌腫株化細胞、例えばＳＫ-ＢＲ-３細胞、Stancovskiら, PNAS(USA)88:8691-8695(1991)を参照)を使用することもできる。抗体の産生に有用な他の形態のＥｒｂＢ２は当業者には明らかであろう。
(i) ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより動物に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに関連抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基による抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲにより抱合させることが有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
(ii) モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、抗体産生の際に増加する突然変異体を除いて同一である。よって、「モノクローナル」との修飾詞は、別個の抗体の混合物ではなく、抗体の特性を示すものである。
例えば、モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonほか, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウスの重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerraら, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPlueckthum, Immunol. Revs., 130:151-188(1992)がある。
更なる実施態様では、モノクローナル抗体又は抗体断片は、McCaffertyら, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clacksonら, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marksら, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖混合による高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marksら, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouseら, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第4,816,567号；Morrisonら, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることで修飾できる。
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
(iii) ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は従来からよく知られている。好ましくは、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
以下の実施例３には、ＥｒｂＢ２に結合し、ＥｒｂＢのリガンド活性化を阻害する例示的なヒト化抗-ＥｒｂＢ２抗体の作成が記載される。ここで特に対象とするヒト化抗体は、マウスモノクローナル抗体２Ｃ４(又はそのＦａｂ断片)と実質的に同じくらいの効果でＥＧＦ、ＴＧＦ-α及び／又はＨＲＧ媒介活性化を阻害し、及び／又はマウスモノクローナル抗体２Ｃ４(又はそのＦａｂ断片)と実質的に同じくらいの効果でＥｒｂＢに結合する。ここでのヒト化抗体は、例えば、ヒト可変重鎖ドメインに取り込まれた非ヒト高頻度可変領域を含んでいても良く、Kabatら, Sequences of Protains of Immunol Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)に示す可変ドメインの番号付けに従って、６９Ｈ、７１Ｈ及び７３Ｈからなる群から選択される位置で置換されたフレームワーク領域(ＦＲ)をさらに含んでいてもよい。ある実施態様では、ヒト化抗体は位置６９Ｈ、７１Ｈ及び７３Ｈの内の２つ又は全てでＦＲ置換を含む。
ここで対象とする例示的なヒト化抗体は、可変重鎖ドメイン相補性決定残基ＧＦＴＦＴＤＹＴＭＸ（配列番号：１４）、ここでＸは好ましくはＤ又はＳ(配列番号：７)；ＤＶＮＰＮＳＧＧＳＩＹＮＱＲＦＫＧ(配列番号：８)；及び／又はＮＬＧＰＳＦＹＦＤＹ(配列番号：９)を含んでなり、場合によっては、これらのＣＤＲ残基のアミノ酸修飾を含んでなり、例えば、実質的に修飾は抗体の親和性を維持又は向上させる。例えば、対象とする抗体変異体は、前記の可変重鎖ＣＤＲ配列で約１から約７又は約５のアミノ酸置換を有していてもよい。このような抗体変異体は、例えば以下に記載されるような親和性成熟により調製されうる。もっとも好ましいヒト化抗体は、配列番号：４の可変重鎖ドメインアミノ酸配列を含む。
ヒト化抗体は、可変軽鎖ドメイン相補性決定残基ＫＡＳＱＤＶＳＩＧＶＡ(配列番号：１０)；ＳＡＳＹＸ１Ｘ２Ｘ３、ここでＸ１は好ましくはＲ又はＬ、Ｘ２は好ましくはＹ又はＥ、及びＸ３は好ましくはＴ又はＳ(配列番号：１１)；及び／又はＱＱＹＹＩＹＰＹＴ(配列番号：１２)、例えば更に前段落の可変重鎖ドメインＣＤＲ残基を含んでなりうる。このようなヒト化抗体は、場合によっては、例えば、抗体の親和性を実質的に維持又は向上させるような前記ＣＤＲ残基のアミノ酸修飾を含む。例えば、対象とする抗体変異体は、前記可変軽鎖ＣＤＲ配列で約１から約７又は約５のアミノ酸置換を有していてもよい。このような抗体変異体は、例えば以下に記載されるような親和性成熟により調製されうる。もっとも好ましいヒト化抗体は、配列番号：３の可変軽鎖ドメインアミノ酸配列を含む。
本出願ではまた、ＥｒｂＢ２に結合し、ＥｒｂＢのリガンド活性化を阻害する親和性成熟抗体が考えられる。親抗体はヒト抗体又はヒト化抗体、例えば、それぞれ配列番号．３及び４の軽鎖及び／又は重鎖配列を含むもの(つまり、変異体５７４)であってもよい。親和性成熟抗体は、好ましくはＥｒｂＢ２レセプターにマウス２Ｃ４又は変異体５７４のものより優れた親和性(例えば、ＥｒｂＢ２細胞外ドメイン(ＥＣＤ)ＥＬＩＳＡを用いて検討して、例えば約２又は約４倍から１００倍又は約１０００倍の向上した親和性)で結合する。置換ための例示的な可変重鎖ＣＤＲ残基は、Ｈ２８、Ｈ３０、Ｈ３４、Ｈ３５、Ｈ６４、Ｈ９６、Ｈ９９又は２以上(例えば、これらの残基の２、３、４、５、６、又は７)の組み合わせを含む。変化のための可変軽鎖ＣＤＲ残基の例は、Ｌ２８、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ５６、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４、Ｌ９６、Ｌ９７、又は２以上(例えば、これらの残基の２から３、４、５又は約１０まで)の組み合わせを含む。
ヒト化抗体又は親和性成熟抗体の様々な形態が、考えられる。例えば、ヒト化抗体又は親和性成熟抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ、場合によっては免疫コンジュゲートを作成するために１又は複数の細胞障害剤でコンジュゲートされたものであってもよい。あるいは、ヒト化抗体又は、親和性成熟抗体は、完全な抗体、例えば完全なＩｇＧ１であってもよい。
（iv）ヒト抗体
ヒト化のための別法により、ヒト抗体を生産することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovitsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993); Bruggermanら, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5,591,669号、同第5,589,369号及び同第5,545,807号を参照されたい。
あるいは、ファージディスプレイ技術(McCaffertyら, Nature 348：552-553(1990))を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３の大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のいずれかにおいてイン-フレームをクローンする。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖のＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clacksonら, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリーからの抗オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成可能で、抗原(自己抗原を含む)とは異なる配列の抗体を、Marksら, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffithら, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第5,565,332号及び同5,573,905号を参照のこと。
前記したように、またヒト抗体は、活性化Ｂ細胞によりインビトロで生産してもよい(例えば米国特許第5,567,610号及び同第5,229,275号を参照)。
ヒト抗-ＥｒｂＢ２抗体は1998年6月30日発行の米国特許第5,772,997号；1997年1月3日公開の国際公報97/00271；及び2001年2月8日公開の国際公報01/09187(Medarex)に記載されている。
(v) 抗体断片
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開93/16185；米国特許第5,571,894号；及び米国特許第5,587,458号を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第5,641,870号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってよい。ＥｒｂＢ２に結合する単鎖細胞内抗体（ｓＦｖ）は国際公報01/56604及び米国特許第6,028,059号に記載されている。
(vi) 二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２タンパク質の２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体ではＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３及び／又はＥｒｂＢ４に対する結合部位と、ＥｒｂＢ２結合部位とが結合しうる。あるいは、抗ＥｒｂＢ２アームは、ＥｒｂＢ２発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２又はＣＤ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はＥｒｂＢ２を発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＥｒｂＢ２結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
国際公報96/16673には、抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＦｃγＲＩＩＩ抗体が記載され、米国特許第5,837,234号には、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＦｃγＲＩ抗体が開示されている。二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／Ｆｃａ抗体は国際公報98/02463、二重特異性抗-ＥｒｂＢ２／抗-ＣＤ３抗体を教示する米国特許第5,821,337号に示されている。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Milsteinら, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公報93/8829及びTrauneckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公報94/04690に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
米国特許第5,731,168号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること（米国特許第4,676,980号）及びＨＩＶ感染の治療（国際公報91/00360、国際公報92/200373及び欧州特許第03089号）等の用途が提案されてる。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方法によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第4,676,980号に記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
最近の進歩により、大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは科学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役させて二重特異性抗体を形成する。従って、形成された二重特異性抗体は、ヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発すると同時に、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常ヒトＴ細胞へ結合することが可能であった。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelnyら, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、およびＦｃＲに結合する三重特異性抗体については2001年8月7日公開の米国特許第6,270,765号B1に記載されている。
（vii）他のアミノ酸配列の修飾
ここで記載の抗-ＥｒｂＢ２抗体のアミノ酸配列の修飾を考察する。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性が改善されることが望ましい。抗-ＥｒｂＢ２抗体のアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化を抗-ＥｒｂＢ２抗体核酸に導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗-ＥｒｂＢ２抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終構造物に達するまでなされるが、その最終構造物は所望の特徴を有する。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数の変化などの変異抗体の翻訳後過程を変更しうる。
突然変異のための好ましい位置にある抗-ＥｒｂＢ２抗体の残基又は領域の同定のために有用な方法は、Cunningham及びWells , Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され（例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基）、中性又は負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリペプチドアニリン）に置換され、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更に又は他の置換を導入することにより精密にされる。即ち、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における性能を分析するために、ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された抗-ＥｒｂＢ２抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例は、Ｎ-末端メチオニル残基を持つ抗-ＥｒｂＢ２抗体又は細胞障害ポリペプチドに融合した抗体を含む。抗-ＥｒｂＢ２抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を向上させる酵素(ＡＤＥＰＴ)又はポリペプチドの抗-ＥｒｂＢ２抗体のＮ-又はＣ-末端への融合物を含む。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗-ＥｒｂＢ２抗体分子において少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基が挿入されている。置換突然変異について最も関心ある部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ交互変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。これらの置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に「例示的置換」と名前を付けた又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてよい。
表１
Figure 2007532566
抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又はへリックス構造、（ｂ）標的部位もしくは（ｃ）側鎖全体における分子の電荷又は疎水性、を維持する効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けできる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類のものに交換することが必要であろう。
抗-ＥｒｂＢ２抗体の適切な配置の維持に含まれない任意のシステイン残基は、一般的にセリンで置換し、分子の酸化的安定性を向上させて異常な架橋を防止する。逆に、抗体にシステイン結合を付加して、その安定性を向上させてもよい（特に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）。
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体の一又は複数の高度可変領域残基の置換を含む(例えばヒト化又はヒト抗体)。一般的に、さらなる発展のために選択されて得られた変異体は、それらが生成された親抗体に比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を生成する簡便な方法はファージディスプレイを使用する親和性突然変異である。簡単に述べれば、高度可変領域部位（例えば、６−７部位）を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された抗体変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として一価形式で表示される。ファージディスプレイ変異体は、次いで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾の候補となる高度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高度可変領域残基を同定することができる。あるいは、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体とヒトＥｒｂＢ２との接点を同定するのが有利である。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されたら、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
抗体のアミノ酸変異の他の型は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する。変更とは、抗体に見られる一又は複数の炭水化物部分の欠失、及び／又は抗体に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ-結合又はＯ-結合の何れかである。Ｎ-結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)というトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ-結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ-結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。この変化は、元の抗体配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
抗-ＥｒｂＢ２抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、これらに限られないが、天然源からの単離（自然に生じるアミノ酸配列変異体の場合）又はオリゴヌクレオチド媒介（又は部位指向性）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による初期調製された変異体又は抗-ＥｒｂＢ２抗体の非変異体の調製を含む。
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)及び／又は補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)を増強することが望ましい。このことは、抗体のＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸置換基を導入することにより達成される。別に、又は付加的にシステイン残基(類)をＦｃ領域に導入して、この領域における鎖間ジスルイド結合を形成させる。このようにして産生されたホモダイマー抗体は改善された内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)を有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照されたい。抗腫瘍活性が高められたホモダイマー抗体は、Wolff等, Cancer Research 53:2560-2565(1993)に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。あるいは二重Ｆｃ領域を有し、よって増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能を有しうる抗体を設計することができる。Stevensonら, Anti-cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
Ｆｃ領域配列を変異させ、Ｃ１ｑ結合を減少または改良した変異型抗体は国際公報99/51642に記載されている。Ｆｃ領域配列を変異させ、ＦｃＲ結合機能を変異させた変異型抗体は国際公報00/42072に記載されている。
抗体の血清半減期を増加させるために、例えば米国特許第5,739,277号に記載されているようにして、抗体(特に抗体断片)にサルベージレセプター結合エピトープを導入してもよい。ここで用いられる場合、用語「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を向上させる原因となるＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを意味する。
(viii) 所望の特性を有する抗体のスクリーニング
抗体を生産するための技術は上述した。所望する、任意の生物学的特徴を有する抗体がさらに選択される。
ＥｒｂＢのリガンド活性化を阻害する抗体を同定するために、ＥｒｂＢを発現する細胞に結合するＥｒｂＢリガンドを阻害する抗体の能力(例えば、対象とするＥｒｂＢがＥｒｂＢヘテロ-オリゴマーを形成するための他のＥｒｂＢとのコンジュゲーションで)が決定されうる。例えば、ＥｒｂＢヘテロ-オリゴマーのＥｒｂＢを自然に発現する、又は発現するように形質移入された細胞を、抗体とインキュベートし、ついで標識したＥｒｂＢリガンドに暴露してもよい。次いで、抗-ＥｒｂＢ２抗体の、ＥｒｂＢヘテロ-オリゴマーのＥｒｂＢに結合するリガンドを阻害する能力が評価されうる。
例えば、抗-ＥｒｂＢ２抗体によりＭＣＦ７乳癌細胞株へのＨＲＧ結合の阻害は、以下の実施例１に記載のような２４穴プレートフォーマットでの氷上単層ＭＣＦ７培地を用いて実施されてもよい。抗-ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体をそれぞれの穴に加え、３０分間インキュベートししてもよい。125Ｉ標識化ｒＨＲＧβ１177-224(２５ｐｍ)を、次に加え、インキュベーションを４から１６時間続けてもよい。用量反応曲線が作成され、対象とする抗体のためにＩＣ５０値を算出する。一実施態様では、ＥｒｂＢのリガンド活性化を阻害する抗体は、このアッセイで約５０ｎＭ以下の、より好ましくは約１０ｎＭ以下のＭＣＦ７細胞へのＨＲＧ結合抑制のＩＣ５０を有しうる。抗体が、Ｆａｂ断片のような抗体断片である場合、このアッセイにおけるＭＣＦ７細胞へのＨＲＧ結合抑制のＩＣ５０は、例えば約１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下である。抗体以外の他の候補ＥｒｂＢアンタゴニストは同様の方法で試験されうる。
あるいは、又は更に加えて、ＥｒｂＢヘテロ-オリゴマーに存在するＥｒｂＢのＥｒｂＢリガンド刺激性チロシンリン酸化を阻害する抗-ＥｒｂＢ２抗体の能力が評価されうる。例えば、ＥｒｂＢを内性的に発現する又はそれらを発現するように形質移入された細胞は、抗体と共にインキュベートされ、次いでＥｒｂＢリガンド依存性チロシンリン酸化活性を抗-ホスホチロシンモノクローナル(場合によっては、検出可能なラベルとコンジュゲートされたもの)を用いてアッセイされる。米国特許第5,766,863号に記載されるキナーゼレセプター活性アッセイもまた、ＥｒｂＢ活性化及び抗体による該活性の阻害を測定するのに利用できる。
一実施態様では、以下の実施例１に記載されるような本来ＭＣＦ７細胞のｐ１８０チロシンリン酸化のＨＲＧ促進を阻害する抗体をスクリーニングしてもよい。例えば、ＭＣＦ７細胞を２４穴プレートに蒔き、ＥｒｂＢ２に対するモノクローナル抗体をそれぞれの穴に加え、室温で３０分間インキュベートし；次いで最終濃度が０．２ｎＭになるようにｒＨＲＧβ１177-224をそれぞれの穴に加え、インキュベーションを８分間続けてもよい。培地をそれぞれの穴から吸引し、１００μlのＳＤＳサンプル緩衝液(５％ＳＤＳ、２５ｍＭＤＴＴ、及び２５ｍＭトリス-ＨＣｌ、ｐＨ６．８)を加えることで、反応を終了させる。それぞれのサンプル(２５μｌ)を、４−１２％勾配ゲル(Novex)で電気泳動し、二フッ化ビニリデン膜に電気泳動的に形質移入してもよい。抗リン酸化チロシン(１μg/ml)免疫ブロットが進み、Ｍｒ〜１８０，０００の顕著な活性バンドの強度が反射率濃度測定により定量されうる。選択された抗体は、好ましくはこのアッセイのコントロールの約０−３５％まで、ｐ１８０チロシンリン酸化のＨＲＧ刺激を有意に抑制する。反射率濃度測定により決定されたｐ１８０チロシンリン酸化のＨＲＧ刺激抑制の用量反応曲線が作成され、対象とする抗体のためにＩＣ５０値を算出してもよい。一実施態様では、ＥｒｂＢのリガンド活性化を阻害する抗体は、このアッセイで約５０ｎＭ以下の、より好ましくは約１０ｎＭ以下のｐ１８０チロシンリン酸化のＨＲＧ刺激抑制のＩＣ５０を有しうる。抗体が、Ｆａｂ断片のような抗体断片である場合、このアッセイにおけるｐ１８０チロシンリン酸化のＨＲＧ刺激抑制のＩＣ５０は、例えば約１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下である。
例えば、基本的にSchaeferら, Oncogene 15:1385-1394(1997)に記載されているように、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞での抗体の成長抑制効果を調べてもよい。このアッセイによると、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞は抗-ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体(１０μg/mL)で４日間処理され、クリスタルバイオレットで染色した。抗-ＥｒｂＢ２抗体とのインキュベーションにより、この細胞株での成長抑制効果はモノクローナル抗体２Ｃ４により示されたものと同じように示されうる。更なる実施態様においては、外因性ＨＲＧはこの抑制を有意に反転させない。好ましくは、抗体は、外因性ＨＲＧのある又は無い両方の状態で、モノクローナル抗体４Ｄ５よりも広範囲に(及び場合によってはモノクローナル抗体７Ｆ３よりも広範囲に)ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の細胞増殖を抑制することができるであろう。
一実施態様において、対象とする抗-ＥｒｂＢ２抗体は、実質的にモノクローナル抗体４Ｄ５よりも効果的な、更に好ましくは実質的にモノクローナル抗体７Ｆ３よりも効果的な実施例２に記載されたような共免疫沈降実験で決定されているような、ＭＣＦ７とＳＫ-ＢＲ-３細胞両方のＥｒｂＢ３を用いたＥｒｂＢ２のヘレグリン依存性結合を阻害してもよい。
成長抑制性抗-ＥｒｂＢ２抗体を同定するために、ＥｒｂＢ２を過剰発現する癌細胞の成長を抑制する抗体をスクリーニングしてもよい。一実施態様において、選別した成長抑制性抗体は、約０．５から３０μg/mlの抗体濃度で約２０−１００％、好ましくは約５０−１００％まで細胞培養物中のＳＫ-ＢＲ-３細胞の成長を阻害することができる。このような抗体を同定するために、米国特許第5,677,171号に記載のＳＫ-ＢＲ-３アッセイを実施することができる。このアッセイに従って、ＳＫ-ＢＲ-３細胞を１０％のウシ胎児血清、グルタミン及びペニシリンストレプトマイシンを補ったＤＭＥＭ及びＦ１２培地の１：１混合物で生育させる。ＳＫ-ＢＲ-３細胞を３５ｍｍの細胞培養皿で２０，０００細胞を蒔く(２ｍｌ／３５ｍｍ皿)。１皿当り０．５から３０μｇ／ｍｌの抗ＥｒｂＢ２抗体を追加する。６日後、未処理細胞と比べた細胞数を電子ＣＯＵＬＴＥＲ(商品名）細胞カウンタを使用してカウントする。ＳＫ-ＢＲ-３細胞の成長を約２０−１００％、又は約５０-１００％阻害する抗体が、上述したアポトーシス抗体と組合せるために選択される。
細胞死を誘発する抗体を選択するために、例えばＰＩ、トリパンブルー又は７ＡＡＤの取込みにより示される膜インテグリティの損失度合いをコントロールと比較して求める。好ましいアッセイは「ＢＴ４７４細胞を使用するＰＩ取込みアッセイ」である。このアッセイでは、ＢＴ４７４細胞(アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション[Rockville, MD])が、ダルベッコの変性イーグル培地(D-MEM)；１０％の熱不活性化ＦＢＳ(Hyclone)と２ｍＭのＬ-グルタミンを補ったハムのＦ-１２(５０：５０)で培養される。(従って、アッセイは補体及び免疫エフェクター細胞の不在下で行われる)。ＢＴ４７４細胞を１００ｘ２０ｍｍ皿に、皿当たり３ｘ１０６の密度で播種し、一晩付着させたままにする。ついで培地を除去し、新しい培地を単独で、又は１０μｇ／ｍｌの適切なＭＡｂを含む培地と取り替える。細胞を３日間インキュベートする。各処理に続いて、単層をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理により分離する。ついで、１２００ｒｐｍ、５分間、４℃で細胞を遠心分離し、ペレットを３ｍｌのＣａ２＋結合氷冷バッファー(１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２)に再懸濁させ、細胞凝塊除去のために３５ｍｍのストレーナキャップ付き１２×７５チューブ(チューブ当たり１ｍｌ、処理グループ当り３チューブ)に等分する。サンプルをＦＡＣＳＣＡＮ(登録商標）フローサイトメータとＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ(登録商標）セルクエスト(CellQuest)ソフトウエア(Becton Dickinson)を使用して分析する。ＰＩ取込みにより測定されるような、統計的に有意なレベルの細胞死を誘発する抗体が選択される。
アポトーシスを誘発する抗体を選択するためには、ＢＴ４７４細胞を使用するアネキシン結合アッセイが利用できる。ＢＴ４７４細胞を培養し、先の段落において記載したように皿に播種する。ついで培地を回収し、新しい培地を単独で、又は１０μｇ／ｍｌの適切なＭＡｂを含む培地と取り替える。３日間インキュベートした後、単層をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理により分離する。ついで細胞を遠心分離し、Ｃａ２＋結合氷冷バッファーに再懸濁させ、細胞死アッセイに対して上述したようにチューブに等分する。ついでチューブに標識化アネキシン(例えばアネキシンＶ-ＦＴＩＣ)(１μｇ／ｍｌ)を入れる。サンプルをＦＡＣＳＣＡＮ(登録商標）フローサイトメータとＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ(登録商標）セルクエスト(CellQuest)ソフトウエア(Becton Dickinson)を使用して分析する。対照に対して、統計的に有意なレベルのアネキシン結合を誘発する抗体がアポトーシス誘発抗体として選択される。
アネキシン結合アッセイに加えて、ＢＴ４７４細胞を使用するＤＮＡ染色アッセイが利用できる。このアッセイを行うために、先の２段落に記載したように関心のある抗体で処理されたＢＴ４７４細胞を、３７℃で２時間、９μｇ／ｍｌのＨＯＥＣＨＳＴ３３３４２(登録商標）と共にインキュベートし、ついでＭＯＤＦＩＴＬＴ(登録商標）ソフトウエア(Verity Software House)を使用し、ＥＰＩＣＳ ＥＬＩＴＥ(登録商標）フローサイトメータ(Coulter Corporation)で分析する。このアッセイを使用し、未処理細胞(最大１００％のアポトーシス細胞)よりも２倍又はそれ以上(好ましくは３倍以上)のアポトーシス細胞のパーセンテージの変化を誘発する抗体が、プロアポトーシス抗体として選択される。
関心のある抗体により結合したＥｒｂＢ２上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするため、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow及びDavid Lane編(1988)に記載されているような通常の交差ブロッキングアッセイを実施することができる。別法として、従来から公知の方法により、エピトープマッピングを実施することもできる（例えば、ここで図１Ａ及び１Ｂ参照）。
次いで、アンタゴニストとして同定した抗体は上記の何れかの疼痛の動物モデルで試験することができる。
(ix) 免疫コンジュゲート
また本発明のＥｒｂＢアンタゴニスト抗体は、細胞障害剤、例えば化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒又は小分子毒素、それらの断片及び／又は変異形を含む)、又は放射性アイソトープ(すなわち、放射性コンジュゲート)に抱合した抗体を含有する免疫コンジュゲートの形態でありうる。
このような免疫コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は上述している。抗体のコンジュゲート及び一つ以上の小分子毒素、例えばカリケアミシン(calicheamicin)、マイタンシン(maytansine)(米国特許第5,208,020号）、トリコテン(trichothene）及びＣＣ１０６５もここにおいて考慮される。
本発明のひとつの好ましい実施態様では、抗体は、一つ以上のマイタンシン(maytansine)分子(例えば、抗体分子当たり約１から約１０のマイタンシン分子）と共役している。マイタンシンは、例えばＭａｙ-ＳＨ３へ還元されるＭａｙ-ＳＳ-Ｍｅへ変換され、修飾抗体(Chariら，Cancer Research 52:127-131(1992))と反応してマイタンシノイド(maytansinoids)−抗体免疫コンジュゲートを生じる。
その他の対象免疫コンジュゲートは、一つ以上のカリケアマイシン(calicheamicin)分子と共役している抗ＥｒｂＢ２抗体を包含する。抗体のカリケアマイシンファミリーは、サブピコモル濃度で、二重鎖ＤＮＡの割れ目を作ることができる。使用されるであろうカリケアマイシンの構造類似体は、限定されるものではないが、γ１ Ｉ、α２ Ｉ、α３ Ｉ、Ｎ−アセチルγ１ Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ １（Hinmanら, Cancer Research 53:3336-3342(1993)及びLodeら，Cancer Research 58:2925-2928(1998)）を含む。また、米国特許第5,714,586号；5,712,374号；5,264,586号；及び5,773,001号参照、文献明示によりここに取り込む。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、1993年10月28日に公開の国際公開第93/21232を参照のこと。
本発明は、更に、抗体と核酸分解性活性(例えば、リボムクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；DNA分解酵素）をともなう化合物との間に形成される免疫コンジュゲートについて考慮する。
種々の放射性核種が放射性コンジュゲート抗ＥｒｂＢ２抗体の生成に利用できる。具体例にはＡｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32及びＬｕの放射線各種が含まれる。
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、スクシインミジル１-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６号を参照されたい。
リンカーは、細胞内で細胞毒性薬剤を放出を容易にする「切断可能なリンカー」でもよい。例えば、酸に弱いリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー(Chariら，Cancer Research 52:127-131[1992]）を使用してもよい。
あるいは、抗ＥｒｂＢ２抗体及び細胞毒性剤を含んでなる融合タンパク質を、例えば組み換え技術又はペプチド合成で製造してもよい。ケモカイン（例えば、RANTES）と融合した抗ＥｒｂＢ２抗体の免疫コンジュゲートは国際公報98/33914に記載されている。
他の実施態様では、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体がコンジュゲートされ得、ここで、抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄化(clearing)剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
(x) 抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法(ＡＤＥＰＴ)
また、本発明の抗体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公報81/01145を参照)を活性な抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素に抗体をコンジュゲートさせることにより、ＡＤＥＰＴにおいて使用することができる。例えば国際公報88/07378及び米国特許第4,975,278号を参照されたい。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。
限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)を参照)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗ＥｒｂＢ２抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(例えばNeubergerら, Nature 312:604-608(1984)参照。
（xi）他の抗体修飾
抗体の他の修飾がここで検討される。例えば、抗体は、様々な非タンパク質性(nonproteinaceous)のポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーの1つに結合されてもよい。また抗体は、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol編(1980)に開示されている。
ここで開示されている抗ＥｒｂＢ２抗体は、免疫リポソームとして処方することもできる。抗体を含有するリポソームは、例えばEpsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；及び米国特許第4,485,045号及び同4,544,545号に記載されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martinら,J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤はリポソーム内に包含される。Gabizonら, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照されたい。
医薬製剤
本発明のＥｒｂＢアンタゴニストの治療用製剤は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed., (1980)に記載のような技術及び標準的な材料を用いて、医薬製剤として調整することができる。したがって、抗ＥｒｂＢ抗体は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、好適な製薬上受容可能な担体、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有するアンタゴニストとを混合することにより、保存用に調整される。受容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はＴＷＥＥＮ(登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ(登録商標）又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。好ましい凍結乾燥抗-ＥｒｂＢ２抗体の形態は、国際公報97/04801に記載され、文献明示によりここに取り込む。
ここで、製剤は、治療される特定の効能に必要な一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。例えば、ある製剤に、血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)、又はＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２(例えばＥｒｂＢ２の異なるエピトープに結合する抗体)、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４に結合する抗体をさらに提供することが望ましい。あるいは、又は加えて、組成物は、化学療法剤、細胞障害性剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、ＥＧＦＲ標的薬剤、チロシンキナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、抗血管形成剤、及び／又は心臓保護剤を含有してもよい。このような分子は、好適には、意図した目的に有効な量で組合せて存在する。
また活性成分は、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術は上掲のRemington's Pharmaceutical Sciencesに開示されている。
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含む固体疎水性重合体の半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスはフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えばポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT(商品名）(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
インビボ投与に使用される製剤は、無菌にしなければならない。これは無菌濾過膜を通して濾過することにより容易に成される。
ＥｒｂＢアンタゴニストが小有機分子の場合、経口投与に好適な形態で調整するのが好ましいが、注射又は注入投与用に液体製剤として調整してもよい。
ＥｒｂＢアンタゴニストと用いた治療
ＥｒｂＢアンタゴニストは周知の方法によってヒト患者に投与されうる。したがって、例えば、抗-ＥｒｂＢ（例えば抗-ＥｒｂＢ２）抗体を、例えばボーラスないしはある期間の連続注入による静脈注射で、又は筋肉内、腹膜内、脳髄内、皮下、関節内、滑膜内、クモ膜下腔内、経口、局所、又は吸入によって投与される。抗体の静脈投与又は皮下投与が好ましい。
最適用量は、適切な動物モデルの用量実験とヒト臨床試験での最終調整に基づいて決定されうる。一般的に、有効量は、患者の疼痛を、少なくとも１、好ましくは少なくとも２、より好ましくは少なくとも３段階軽減するものであり、その結果、疼痛スコア（０から１０段階）を少なくとも５以下、より好ましくは４以下、さらにより好ましくは３以下、最も好ましくは２以下にするのが好ましい。また、有効量は初めの疼痛の性質及び重症度に依存するであろう。
候補ＥｒｂＢアンタゴニストの痛覚消失活性は、通常、二重盲検、無作為化、プラセボ対照臨床試験で試験される。無作為対照化試験の設定の概要については、例としてJadad AR, Haynes RB. Med Decis Making 1998;18.2-9を参照のこと。
他の治療法を、抗-ＥｒｂＢ２抗体などのＥｒｂＢアンタゴニストの投与と組み合わせてもよい。組み合わせ投与は、別々の形態又は単一の製薬形態を用いた同時投与、及び好ましくは両方の(又は全てが)それらの生物学的活性を同時に発揮するような期間をもったそれぞれの順序での連続投与を含む。
一つの好ましい実施態様では、患者は２つの異なる抗-ＥｒｂＢ２抗体で治療される。例えば、患者は、ＥｒｂＢのリガンド活性化を阻害する第１の抗-ＥｒｂＢ抗体、又はモノクローナル抗体２Ｃ４、並びに成長抑制のある第２の抗-ＥｒｂＢ２抗体(例えば、ハーセプチン(登録商標))又はＥｒｂＢ２過剰発現細胞のアポトーシスを促進する抗-ＥｒｂＢ２抗体(例えば７Ｃ２、７Ｆ３又はそのヒト化変異体)の生物学的活性を有する抗体で治療されてもよい。好ましくはこのような組み合わせ治療は、相乗的な治療効果を生じる。例えば、ハーセプチン治療に応答しない患者を、ハーセプチン(登録商標)で治療した後、ｒｈｕＭＡｂ２Ｃ４で治療する。他の実施態様では、患者をまずｒｈｕＭＡｂ２Ｃ４で処置してからハーセプチン(登録商標)治療を行う。また更に好ましい実施態様では、患者はｒｈｕＭＡｂ２Ｃ４とハーセプチン(登録商標)の両方で同時に治療されうる。
また、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)に対する抗体の投与とともに、抗-ＥｒｂＢ２抗体または複数の抗体を組み合わせることが望まれる。
一実施態様では、本発明の治療は、抗-ＥｒｂＢ２抗体（または複数の抗体）、および一又は複数の化学療法剤、細胞障害性剤、又は成長阻害剤の組み合わせ投与を含んでなるものであり、異なる化学療法剤のカクテル同時投与含む。このような化学療法剤の調製及び投与スケジュールは製造者の指示に従って使用されるか、又は熟練した実務者により経験的に決定される。このような化学療法の調製及び投与スケジュールは、Chemotherapy Service M.C.Perry編, Williams ＆Wilkins, Baltimore, MD(1992)に記載されている。
抗体は、抗-エストロゲン化合物、例えばタモキシフェン；抗プロゲステロン、例えばオナプリストン(onapristone)(欧州特許第616,812号を参照)；又は抗-アンドロゲン、例えばフルタミドの抗ホルモン化合物を、このような分子に対して既知の投薬量で組合せてもよい。
ときに、心臓保護剤(治療に関する心筋機能障害を防止する又は減少するために)又は一又は複数のサイトカインを患者にを同時投与することも適している。また抗-血管形成剤を同時投与してもよい。前記の治療法に加えて、患者は、外科手術、放射線療法又は光線療法を受けてもよい。
ここでの抗-ＥｒｂＢ２抗体はまた、相補的な、及び潜在的に相乗的な治療効果を生じるように、定義の章で前記したようなＥＧＦＲ-標的薬、チロシンキナーゼ阻害剤及び／又は免疫抑制剤と組み合わせてもよい。
前記の同時投与される任意の薬剤の適した投与量は、現在使用されている投与量で、薬剤と抗-ＥｒｂＢ２抗体の組み合わせ作用(相乗効果)に応じて少なくしてもよい。
前述のように、疼痛の予防又は治療のための抗体の適切な投与量は、治療される疼痛の重症度及び種類、抗体を防止目的で投与するのか治療目的で投与するのか、過去の治療、患者の臨床歴及び抗体の応答性、手当てをする医師の裁量に依存するであろう。抗体は一度に又は一連の処置にわたって患者に適切に投与される。病気の種類及び重症度に応じて、疾患のタイプや重症度に応じて、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入のいずれであれ、約１μｇ／ｋｇないし１５ｍｇ／ｋｇ(例えば、好ましくは約０．１、又は０．５−約２０又は３０ｍｇ／ｋｇ)の抗体が患者への最初の投与量の候補である。上述した因子に応じて、典型的な一日の投与量は約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上の範囲である。数日間又はそれ以上の繰り返し投与の場合、症状に応じて、病気の徴候の望ましい抑制が生じるまで処置を維持する。抗体の好ましい投与量は、約０．５ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、又は１５ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量(又はその任意の組み合わせ)で、患者に投与されてもよい。これらの用量は、断続的に、例えば、毎週又は３週間毎、毎月又は３又は４か月毎に投与されうる(例えば、患者は、ＥｒｂＢ２抗体の約２から約２０、例えば約６用量を受ける)。高い初負荷用量は、一又hあ複数の低用量の後に投与されうる。例示的な用法は、約４mg/kgの初負荷用量を、毎週約２mg/kgの抗-ＥｒｂＢ２抗体を維持した後に投与することを含む。しかしながら、他の投薬計画も有効であろう。この治療の進行状態は通常の技術やアッセイで容易にモニターされる。
一方、ある実施態様では、投与される抗体は、好ましくは、「そのままの(naked)」または「細胞障害性剤とコンジュゲートさせない」ものであるが、細胞障害性剤とコンジュゲートさせた抗ＥｒｂＢ（例えば、抗ＥｒｂＢ２）抗体を含む免疫コンジュゲートを患者に投与する。好ましくは、結合された免疫コンジュゲート及び／又はＥｒｂＢ２タンパク質は細胞内に取りこまれ、免疫コンジュゲートの治療的効果が上がる。好ましい実施態様では、細胞障害性剤は細胞内の核酸を標的とする又は干渉する。このような細胞障害性剤の例として、メイタンシノイド、カリチェアマイシン、リボヌクレアーゼ、及びＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。
患者への抗体タンパク質の投与のみならず、本出願は、遺伝子療法による抗体の投与についても検討する。抗体をコードする核酸のこのような投与は、「治療的効果量の抗体の投与」という表現に包含される。例えば、1996年3月14日に公開の国際公報96/07321、および遺伝子治療により投与されるＨＥＲ２に対する抗体に関する2001年8月9日公開の国際公報01/56604参照。
核酸（場合によってはベクター内に含まれたもの）を患者の細胞に入れるために：インビボ及びエキソビボという２つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は、通常はアンタゴニストが必要とされている部位に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与する（米国特許第4,892,538号及び第5,283,187号参照）。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかに依る。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。
現在インビボ核酸移入技術で好ましいのは、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルス）、及び脂質ベースの系（例えば、遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ-Ｃｈｏｌである）での形質移入を含む。幾つかの状況では、核酸供給源を標的細胞をターゲティングする薬剤、例えば細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体又は標的細胞、標的細胞上のレセプターのリガンドなどとともに提供するのが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、ターゲティング及び／又は取り込みの促進のために用いられ、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクリングにおいて内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティングし細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987)及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。現在知られている遺伝子標識化及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、国際公報 93/25673及びそこに引用された参考文献も参照。
材料の寄託
以下のハイブリドーマ株化細胞を、アメリカ合衆国、バージニア２０１１０−２２０９、マナッサス、ブールバード大学 １０８０１、アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション(ＡＴＣＣ)に寄託した。
抗体名 ATCC 番号 寄託日
７Ｃ２ ATCC HB-12215 1996年10月17日
７Ｆ３ ATCC HB-12216 1996年10月17日
４Ｄ５ ATCC CRL 10463 1990年5月24日
２Ｃ４ ATCC HB-12697 1999年4月8日
本発明のさらなる詳細を、以下の非限定的な実施例により例証する。本明細書中で開示された全ての引用例は、出典明示によりここに特に取り入れている。
実施例１
モノクローナル抗体２Ｃ４の作成と特徴付け
ＥｒｂＢ２の細胞外ドメインに特異的に結合するマウスモノクローナル抗体２Ｃ４、７Ｆ３及び４Ｄ５を、Fendlyら,Cancer Research 50:1550-1558(1990)に記載されているようにして作成した。簡単には、Hudziakら, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA)84:7158-7163(1987)に記載されているようにして作成されたＮＩＨ３Ｔ３／ＨＥＲ２-３４００細胞(約１×１０５ＥｒｂＢ２分子/細胞を発現)を２５ｍＭのＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)で収集し、ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化するために使用した。マウスに、０、２、５及び７週に、０．５ｍｌのＰＢＳに１０７細胞が入ったものを腹腔内注射した。３２Ｐ標識化ＥｒｂＢ２を免疫沈降させた抗血清を有するマウスに、９及び１３週に、小麦麦芽凝集素-セファロース(ＷＧＡ)精製ＥｒｂＢ２膜抽出物を腹腔内注射した。続いて０．１ｍｌのＥｒｂＢ２調製物を静脈内注射し、脾細胞をマウス骨髄腫株Ｘ６３-Ａｇ８.６５３と融合させた。
ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡ及び放射性免疫沈降により、ＥｒｂＢ２結合性についてスクリーニングした。
モノクローナル抗体２Ｃ４、７Ｆ３及び４Ｄ５に結合されるＥｒｂＢ２エピトープを、競合結合分析により決定した(Fendlyら Cancer Reseach 50:1550-1558(1990))。交差阻害研究は、量的蛍光のためのＰＡＮＤＥＸ(商品名)スクリーン機を用いて完全な細胞上で蛍光検定することにより、抗体で実施された。それぞれのモノクローナル抗体は、確立した方法(Wofsyら Selected Methods in Cellular Immunology, p. 287, Mishel and Schiigi(eds.)San Francisco: W.J.Freeman Co. (1980))を用いて、フルオレセインイソチオシアネート(ＦＩＴＣ)とコンジュゲートした。ＮＩＨ３Ｔ３／ＨＥＲ２−３４００細胞の集密的な単層をトリプシン処理し、１回洗浄し、更に０．５％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)及び０．１％ＮａＮ３を含有する冷たいＰＢＳ中に、１．７５ｘ１０６細胞/mlで再懸濁した。最終濃度１％のラテックス粒子(ＩＤＣ、ポートランド、ＯＲ)をＰＡＮＤＥＸ(商品名)プレート膜の目詰まりを減少させるために追加した。懸濁液中の細胞、２０μl、及び２０μlの精製モノクローナル抗体(１００μg/mlから０．１μg/ml)をＰＡＮＤＥＸ(登録商標)プレートの穴に加え、３０分間氷上でインキュベートした。所定希釈のＦＩＴＣ標識されたモノクローナル抗体２０μＬをそれぞれの穴に加え、３０分間インキュベートし、洗浄し、更に蛍光がＰＡＮＤＥＸ(登録商標)で定量された。モノクローナル抗体は、無関係なモノクローナル抗体コントロールに比較して５０％又はそれ以上で他の結合をそれぞれ阻害した場合に、エピトープを共有するとみなされた。この実験において、モノクローナル抗体４Ｄ５、７Ｆ３及び２Ｃ４はそれぞれ、エピトープＩ、Ｇ／Ｆ及びＦを指定した。
モノクローナル抗体２Ｃ４、７Ｆ３及び４Ｄ５の成長抑制特性は、乳癌細胞株、ＳＫ-ＢＲ-３(Hudziakら Molec. Cell. Biol. 9(3):1165-1172(1989)参照)を用いて評価された。簡単には、ＳＫ-ＢＲ-３細胞を０．２５％(vol/vol)トリプシンで検定し、４×１０５細胞/mlの密度で培地体に完全に懸濁した。１００μl(４×１０４細胞)に等分したものを９６穴微量希釈プレートに入れ、細胞を付着させ、ついで培地のみ又はモノクローナル抗体を含有する培地(最終濃度５μg/ml)１００μlを加えた。７２時間後、プレートをＰＢＳ(ｐＨ７．５)で２回洗浄し、クリスタルバイオレット(メタノール中０．５％)で染色し、Sugarmanら Science 230:943-945(1985)に記載されたようにして関連のある細胞増殖を分析した。モノクローナル抗体２Ｃ４及び７Ｆ３はＳＫ-ＢＲ-３関連細胞増殖をそれぞれ約２０％及び約３８％阻害したのに比べて、モノクローナル抗体４Ｄ５は５６％阻害した。
モノクローナル抗体２Ｃ４、４Ｄ５及び７Ｆ３を、ＭＣＦ７細胞の全細胞溶解物からのＭｒ180,000の範囲のタンパク質のＨＲＧ促進性チロシンリン酸化を阻害する能力について評価した(Lewisら Cancer Research 56:1457-1465(1996))。ＭＣＦ７細胞は既知のＥｒｂＢをすべて発現するが、比較的低いレベルであることが報告されている。ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、及びＥｒｂＢ４はほとんど同一の分子サイズを有し、全細胞溶解物をウエスタンブロット分析で評価する場合、タンパク質がリン酸化チロシンであると識別することはできない。
しかしながら、これらの細胞は、外因性付加ＨＲＧが無い状態で使用されるアッセイ条件下で、それらがＭｒ180,000の範囲でチロシンリン酸化タンパク質の検出不可能な程低いレベルを示すために、ＨＲＧチロシンリン酸化アッセイに理想的である。
ＭＣＦ７細胞を２４穴プレートに蒔き、ＥｒｂＢ２に対するモノクローナル抗体をそれぞれの穴に加え、室温で３０分間インキュベートした；次いでｒＨＲＧβ１177-244を０．２ｎＭの最終濃度になるまでそれぞれの穴に加え、インキュベーションを８分続けた。培地をそれぞれの穴から注意深く取り除き、１００μlのＳＤＳサンプル緩衝液(５％ＳＤＳ、２５ｍＭＤＴＴ、及び２５ｍＭトリス-ＨＣｌ、ｐＨ６．８)の付加により反応を停止した。それぞれのサンプル(２５μl)を４−１２％勾配ゲル(Novex)で電気泳動し、次いで二フッ化ポリビニリデン膜に電気泳動的に移動した。前記したように(Holmesら Science 256:1205-1210(1992)；Sliwkowskiら J. Biol. Chem. 269:14661-14665(1994))、抗リン酸化チロシン(４Ｇ１０、ＵＢＩ由来、１μg/mlで使用)イムノブロットを進め、Ｍｒ〜180,000で顕著な反応バンドの強度を反射率濃度で定量した。
モノクローナル抗体２Ｃ４、７Ｆ３及び４Ｄ５は、Ｍｒ180,000でＨＲＧ促進チロシンリン酸化シグナルの生成を有意に抑制した。ＨＲＧの無い場合、これらの抗体はＭｒ180,000の範囲のタンパク質のチロシンリン酸化を促進することができない。また、これらの抗体は、ＥＧＦＲ(Fendlyら Cancer Research 50:1550-1558(1990))、ＥｒｂＢ３、又はＥｒｂＢ４と交差反応しない。抗体２Ｃ４及び７Ｆ３はコントロールの＜２５％でｐ１８０チロシンリン酸化のＨＲＧ促進を有意に阻害した。モノクローナル抗体４Ｄ５は、〜５０％までチロシンリン酸化のＨＲＧ促進を阻害することができた。図２Ａは反射率濃度に決定されるｐ１８０チロシンリン酸化のＨＲＧ促進の２Ｃ４又は７Ｆ３阻害曲線を示す。４パラメーターフィットを用いたこれらの抑制曲線の評価から、それぞれ２Ｃ４及び７Ｆ３の２．８±０．７ｎＭ及び２９．０±４．１ｎＭのＩＣ５０を得た。
抗-ＥｒｂＢ２抗体によるＭＣＦ７乳癌細胞株へのＨＲＧ結合の抑制は、２４穴プレート形態の氷上単層培地で実施された(Lewisら Cancer Research 56:1457-1465(1996))。抗-ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体をそれぞれの穴に加え、３０分間インキュベートした。125Ｉ-標識ｒＨＲＧβ１177-224(２５ｐｍ)が加えられ、インキュベーションを４から１６時間続けた。図２Ｂには、ＭＣＦ７細胞に対するＨＲＧ結合の２Ｃ４又は７Ｆ３抑制の用量・反応曲線が示される。様々な濃度の２Ｃ４又は７Ｆ３を125Ｉ-標識ｒＨＧβ１の存在した状態でＭＣＦ７細胞とインキュベートし、抑制曲線を図２Ｂに示した。これらのデータの分析から、それぞれ２Ｃ４及び７Ｆ３の２．４±０．３ｎＭ及び１９．０±７．３ｎＭのＩＣ５０を得た。２Ｃ４及び７Ｆ３の最大抑制〜７４％は、チロシンリン酸化のデータと一致していた。
ＭＣＦ７細胞で見られる抗-ＥｒｂＢ２抗体の効果が一般的な減少であるかどうかを決定するために、ヒト腫瘍細胞株を２Ｃ４又は７Ｆ３と共にインキュベートし、特定の125Ｉ-標識ｒＨＲＧβ１結合の程度が決定された(Lewisら Cancer Research 56:1457 1465(1996))。この研究の結果は、図３に示される。ＥｒｂＢ２をほとんど又は全く発現しないと報告されている乳癌細胞株ＭＤＡ-ＭＢ-４６８を除いて、すべての細胞株で２Ｃ４又は７Ｆ３のどちらかにより125Ｉ-標識ｒＨＲＧβ１の結合を有意に抑制することができた。残りの細胞株においては、これらの細胞株にわたって広く変化するＥｒｂＢ２発現のレベルで、ＥｒｂＢ２を発現することが報告される。実際に、試験された細胞株中のＥｒｂＢ２発現の程度は、２桁以上にまで変化する。例えば、ＢＴ-４７４及びＳＫ-ＢＲ-３が〜１０６ＥｒｂＢ２レセプター/細胞を発現するのに対して、ＢＴ-２０、ＭＣＦ７、及びＣａｏｖ３は、〜１０４ＥｒｂＢ２レセプター/細胞を発現する。これらの細胞の広範囲のＥｒｂＢ２発現及び前記のデータから、ＥｒｂＢ２とＥｒｂＢ３又はＥｒｂＢ４の間の相互作用はそれ自体、原形質膜の表面にある高親和性相互作用であることが推論される。
外因性ｒＨＲＧβ１がある場合とない場合とで、ＭＤＡ-ＭＢ-１７５及びＳＫ-ＢＲ-３細胞上でのモノクローナル抗体２Ｃ４及び４Ｄ５の成長抑制効果を測定した(Schaeferら Oncogene 15:1385-1394(1997))。ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞のＥｒｂＢ２レベルは、通常の***上皮細胞で見られるレベルよりも４−６倍高く、ＥｒｂＢ２-ＥｒｂＢ４レセプターは構成的にＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞のリン酸化チロシンである。ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞は抗-ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体２Ｃ４及び４Ｄ５(１０μg/ml)と４日間処理された。クリスタルバイオレット染色アッセイにおいて、２Ｃ４でのインキュベーションはこの細胞株での強い成長抑制効果を示した(図４Ａ)。外因性ＨＲＧはこの抑制を有意には反転しない。言い換えると、２Ｃ４はＥｒｂＢ２過剰発現細胞株ＳＫ-ＢＲ-３での抑制効果を示さない(図４Ｂ)。モノクローナル抗体２Ｃ４は外因性ＨＲＧのある場合と無い場合の両方で、モノクローナル抗体４Ｄ５よりもより広くＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の増殖を抑制することができる。４Ｄ５による細胞増殖の抑制は、ＥｒｂＢ２発現のレベルに依存する(Lewisら Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263(1993))。ＳＫ-ＢＲ-３細胞で６６％の最大抑制が示された(図４Ｂ)。しかしながらこの効果は外因性ＨＲＧによって得ることはできない。
実施例２
モノクローナル抗体２Ｃ４に阻害されるＥｒｂＢ２のＥｒｂＢ３とのＨＲＧ依存性結合
ＥｒｂＢ２に結合するＥｒｂＢ３の能力を共免疫沈降実験で試験した。１．０ｘ１０６のＭＣＲ７又はＳＫ-ＢＲ-３細胞を、１０％ウシ血清(ＦＢＳ)と１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２(成長培地)を含有する５０：５０のＤＭＥＭ／Ｈａｍ'ｓＦ１２培地の６穴細胞培養プレートに蒔き、一晩接触させた。細胞を実験開始前に血清なしの成長培地に２時間おいて枯渇させた。
細胞をリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)で簡単に洗浄し、次いで１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２(結合緩衝液)、又は結合緩衝液のみ(コントロール)のどちらかを含有する０．２％w/vウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、ＲＰＭＩ培地で希釈された１００ｎＭの指示抗体のそれぞれとともにインキュベートする。室温で１時間おいた後、ＨＲＧを半分の穴に５ｎＭの最終濃度まで加える(＋)。同量の結合緩衝液を他の穴に加える(−)。インキュベーションはおよそ１０分間続けられた。
上澄みを吸引により取り除き、細胞を０．２ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μg/mlロイペプチン、及び１０ＴＵ/mlアプロチニンを含有するＲＰＭＩ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１．０％v/vトリトンＸ-１００(登録商標)、１．０％w/vＣＨＡＰＳ(溶解緩衝液)に溶解した。
ＥｒｂＢ２を親和性ゲル(Affi-Prep10、Bio-Rad)に共有結合したモノクローナル抗体を用いて免疫沈降した。この抗体(Ab-3、Oncogene Science)は細胞質ドメインエピトープを認識する。免疫沈降は、それぞれの溶解物に固定された抗体、約８．５μgを含有する１０μlのゲル懸濁液を加えることにより実施され、サンプルを室温で２時間混合させた。次いでゲルを遠心分離により集めた。結合していない物質を取り除くために、ゲルを溶解緩衝液を用いてバッチ式に３回洗浄した。次いでＳＤＳサンプル緩衝液を加え、サンプルを沸騰したウォーターバスの中で、軽く温めた。
上澄みを４−１２％のポリアクリラミドゲル上に流し、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。ＥｒｂＢ３の存在は、その細胞質ドメインエピトープ(c-17、Santa Cruz Biotech)に対するポリクローナル抗体でのブロットをプローブすることにより調べられる。ブロットは、化学ルミネセント基質(ＥＣＬ、Amersham)を用いて可視化した。
図５Ａ及び５Ｂのコントロールのレーンに示されるように、それぞれＭＣＦ７及びＳＫ-ＢＲ-３細胞におて、ＥｒｂＢ３は、細胞がＨＲＧで促進される場合にのみＥｒｂＢ２免疫沈殿物中に存在した。細胞が最初にモノクローナル抗体２Ｃ４とインキュベートされる場合、ＥｒｂＢ３シグナルはＭＣＦ７細胞で消滅する(図５Ａ、レーン２Ｃ４＋)かあるいはＳＫ-ＢＲ-３細胞で減少する(図５Ｂ、レーン２Ｃ４＋)。図５Ａ−Ｂに示されるように、ハーセプチン(登録商標)よりも実質的に効果的に、モノクローナル抗体２Ｃ４はＭＣＦ７及びＳＫ-ＢＲ-３の両方の細胞でＥｒｂＢ３のＥｒｂＢ２とのヘレグリン依存性結合を阻害する。ハーセプチン(登録商標)と予めインキュベーションすると、ＭＣＦ７溶解物でＥｒｂＢ３シグナルを減少させるが、ＳＫ-ＢＲ-３溶解物由来のＥｒｂＢ３共沈の量にはほとんど又は全く効果を有しない。ＥＧＦレセプターに対する抗体(Ab-1、Oncogene Science)とのプレインキュベーションは、どちらの細胞株においてもＥｒｂＢ２との共免疫沈降のＥｒｂＢ３の能力に全く効果が無い。
実施例３
ヒト化２Ｃ４抗体
最初にマウスモノクローナル抗体２Ｃ４の様々なドメインをマウス／ヒトキメラＦａｂ断片を生成させるベクターにクローン化した。全ＲＮＡを市販のプロトコールに続いてストラタジーンＲＮＡ抽出キットを用いてハイブリドーマ細胞から単離した。様々なドメインをＲＴ-ＰＣＲにより増幅し、ゲルを精製し、前記されるように(Caterら PNAS(USA)89:4285(1992)；及び米国特許第5,821,337号)、ヒトκ定常ドメイン及びヒトＣＨ１ドメインを含有するｐＵＣ１１９をもとにしたプラスミドの誘導体に挿入した。その結果に生じたプラスミドをＦａｂ断片の発現のために大腸菌株１６Ｃ９に移した。培養物の成長、タンパク質発現の誘発、及びＦａｂ断片の増幅については前に記載した(Wetherら J. Immunol. 157:4986-4995(1996)；Prestaら Cancer Research 57:4593-4599(1997))。
精製したキメラ２Ｃ４Ｆａｂ断片を、ＭＣＦ７細胞への125Ｉ-ＨＲＧ結合の抑制及びＭＣＦ７細胞のｐ１８０チロシンリン酸化のｒＨＲＧ活性化の抑制の能力に関してマウス親抗体２Ｃ４と比較した。図６Ａに示されるように、キメラ２Ｃ４Ｆａｂ断片はヒト乳癌細胞株、ＭＣＦ７の高親和性ＥｒｂＢ２-ＥｒｂＢ３結合部位の形成を妨害するのに非常に効果的である。無傷のマウス２Ｃ４から算出された関連するＩＣ５０の値は、４．０±０．４ｎＭであるのに対して、Ｆａｂ断片からの値は７．７±１．１ｎＭである。図６Ｂに示されるように、一価のキメラ２Ｃ４Ｆａｂ断片は、ＨＲＧ依存性ｒｂＢ２-ＥｒｂＢ３活性化を妨害するのに非常に効果的である。完全なマウスモノクローナル抗体２Ｃ４から算出されるＩＣ５０の値は６．０±２ｎＭであるが、Ｆａｂ断片からの値は１５．０±２ｎＭである。
キメラクローンのＤＮＡ配列により、ＣＤＲ残基を同定することができる(Kabatら, Sequences of Protein of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))(図７Ａ及びＢ)。オリゴヌクレオチド部位指定突然変異を用いて、これら６つのＣＤＲ領域の全てを、前記したようなプラスミドＶＸ４(Prestaら, Cancer research 57:4593-4599(1997))に含まれた完全なヒトフレームワーク(ＶＬκサブグループＩ及びＶＨサブグループIII)に導入した。結果物「ＣＤＲ-スワップ」由来のタンパク質を発現し、前記のようにして精製した。結合研究は２つのバージョンを比較して実施した。簡単には、NUNC MAXISORP(商品名)プレートを１μg/mlのＥｒｂＢ２細胞外ドメイン(ＥＣＤ；国際公報90/14357に記載されたようにして作成)の５０ｍＭ炭酸緩衝液、ｐH９．６、４℃で一晩覆い、次いで、室温で１時間ＥＬＩＳＡ希釈液(０．５％ＢＳＡ、０．０５％ポリソルベート２０、ＰＢＳ)で阻害した。ＥＬＩＳＡ希釈液の連続希釈サンプルをプレート上で２時間インキュベートした。洗浄の後、結合したＦａｂ断片をストレプトアビジンコンジュゲートホースラディシュ・ペルオキシダーゼ(Sigma)に続いてビオチン化マウス抗-ヒトκ抗体(ＩＣＮ６３４７７１)を用いて検出し、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersdish, MD)を基質として使用した。吸高度は４５０ｎｍで読取った。図８Ａに示されるように、全ての結合は、ＣＤＲ-スワップヒトＦａｂ断片の構築に効果はなかった。
ヒト化Ｆａｂの結合を修復するために、ＣＤＲ-スワップ由来のＤＮＡを鋳型として用いて突然変異体を構築した。コンピューター作成モデル(図９)を用いて、これらの突然変異体は、変化がＣＤＲ構造又は抗体-抗原相互作用を変化させる位置にそれらのマウスの複製物のために、ヒトフレームワーク領域残基を変化させて生成した。突然変異体は表２に示す。
表２ ヒト化２Ｃ４ＦＲ変異形の設定
Figure 2007532566
様々な突然変異体の結合曲線が、図８Ａ−Ｃに示される。変化ＡｒｇＨ７１Ｖａｌ、ＡｓｐＨ７３Ａｒｇ及びＩｌｅＨ６９Ｌｅｕを持つヒト化Ｆａｂバージョン５７４は、元のキメラ２Ｃ４Ｆａｂ断片のものに戻す結合を有するように見える。更なるＦＲ及び／又はＣＤＲ残基は、例えば、Ｌ２、Ｌ５４、Ｌ５５、Ｌ５６、Ｈ３５及び／又はＨ４８で、ヒト化抗体の結合を更に精錬する又は向上させるために修飾されていてもよい(例えば次の置換−IleL2Thr; ArgL54Leu; TyrL55Glu; ThrL56Ser; AspH35Ser; 及びValH48Ile)。あるいは、又は更に加えて、ヒト化抗体をその親和性及び／又は他の生物学的活性を更に改善又は向上させるために親和性成熟(前記参照)させてもよい。
ヒト化２Ｃ４バージョン５７４をファージディスプレイ方法を用いて親和性成熟してもよい。簡単には、ヒト化２Ｃ４．５７４Ｆａｂを遺伝子III融合としてファージディスプレイベクター中に複製する。ファージ粒子をＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージの感染で誘発する場合、この融合がＦａｂをファージテールファイバータンパク質、遺伝子IIIのＮ-末端に置かれるようにする(Bacaら J Biol Chem. 272:10678(1997))。
個々のライブラリを上で定義した６つのＣＤＲのそれぞれで構築した。これらのライブラリにおいて、ＥｒｂＢ２に結合で潜在的に有意であるような、コンピューター作成モデル(図９)を用いて同定されるＣＤＲのアミノ酸は、「ＮＮＳ」を含有する糖をそれらのコドンとして用いてランダム化される。次いでライブラリを、全ての阻害溶液に代わって使用される０．２％のＴＷＥＥＮ２０(登録商標)含有の３％乾燥ミルクのＰＢＳを用いて、ＮＵＮＣＭＡＸＩＳＯＲＰＴＭに覆われるＥｒｂＢ２ＥＣＤに対してパニングした。２Ｃ４．５７４のものよりも高い親和性でファージを選択するために、パニングの回３、４、及び５において、可溶性ＥｒｂＢ２ＥＣＤ又は可溶性Ｆａｂ２Ｃ４．５７４を競合として洗浄段階の間に加えた。洗浄時間は室温で１時間まで延長した。
５回のパニングの後、個々のクローンを再びファージＥＬＩＳＡで分析した。個々のクローンをコスター９６穴Ｕ-型組織培養プレートで生育し、ファージをヘルパーファージの添加により促進した。一晩の生育の後、大腸菌細胞をペレット化し、ファージ含有上澄みを９６穴プレートに移し、室温で１時間ファージをＭＰＢＳＴで阻害した。ＥｒｂＢ２ＥＣＤでコートされたＮＵＮＣ ＭＡＸＩＳＯＲＰＴＭプレートもまた、前記のようにしてＭＰＢＳＴで阻害した。阻害されたファージを２時間プレート上でインキュベートした。洗浄の後、結合したファージを、3,3',5,5',-テトラメチルベンジジンを基質として用いた後にＭＰＢＳＴで１：５０００に希釈したフォースラディッシュ・ペルオキシダーゼ-コンジュゲート抗-Ｍ１３モノクローナル抗体(Amersham Pharmacia Biotech, Inc. 27-9421-01)を用いて検出した。吸光度は４５０ｎｍで読取られた。
最も高いシグナルを持つ、それぞれのライブラリ由来の４８クローンをＤＮＡ配列決定した。最も頻繁に生じる配列を持つこれらのクローンは、前記したような可溶性Ｆａｂの発現をするベクターにサブクローン化される。これらのＦａｂを促進し、精製されたタンパク質及び精製されたＦａｂを前記したようにしてＥＬＩＳＡにより結合を分析し、結合をスターティングヒト化２Ｃ４．５７４バージョンのものと比較する。
個々のＣＤＲの所望の突然変異の後、それらの様々な組み合わせである更なる突然変異を構築し、前記のようにして試験した。５７４に対して改善した結合を与える突然変異体は、表３に記載した。
表３ ２Ｃ４.５７４の親和性成熟からの変異形の設定
Figure 2007532566
*Ｅｒｂ２-ＥＣＤ ＥＬＩＳＡにおいて、標準曲線の中間ＯＤを与えるのに必要な突然変異量の、標準曲線の中間ＯＤを与えるのに必要な５７４の量に対する割合。１．０よりも低い数字は、ＥｒｂＢ２に５７４よりもよく結合することを示す。
次の突然変異体もまた構築し、評価している：
Figure 2007532566
相同性スキャンにより次の突然変異体が構築されている：
Figure 2007532566
Ｈ３４での好ましいアミノ酸配列はメチオニンである。この位置で酸化が見つかった場合にはロイシンに変化する。
ＡｓｎＨ５２及びａｓｎＨ５３は、結合に非常に好ましいことが分かった。これらの残基のアラニン又はアスパラギン酸への変化は結合を劇的に減少させる。
ヒトＩｇＧ重鎖定常領域を有するヒト化バージョン５７４の可変軽鎖及び可変重鎖ドメインを含む完全な抗体が作成されている(米国特許第5,821,337号参照)。完全な抗体は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞で作成された。該分子はここでｒｈｕＭＡｂ２Ｃ４と称される。
実施例４
モノクローナル抗体２Ｃ４によるＭＡＰＫのＥＧＦ、ＴＧＦ-α又はＨＲＧ媒介活性化の阻害
多くの成長因子レセプターが、***促進因子活性化プロテインキナーゼ(ＭＡＰＫ)経路を通して伝達される。これらの二重特異性キナーゼは、最終的に癌細胞を***するように誘発するシグナル伝達経路の鍵となる指標の一つである。ＭＡＰＫのＥＧＦ、ＴＧＦ-α又はＨＲＧ活性化を抑制する、モノクローナル抗体２Ｃ４又はＨＥＲＣＥＰＴＩＮ(商品名)の能力を次の方法で調べた。
ＭＣＦ７細胞(１０５細胞/穴)を１２穴細胞培養プレートの血清含有培地に入れた。次の日、細胞培地を取り出し、０．１％の血清を含有する新しい細胞培地をそれぞれの穴に加えた。次いでこの方法をこの後の日も繰り返し、培地をアッセイする前に無血清結合緩衝液に再び入れた(Jonesら J. Biol.Chem.273:11667-74(1998)；及びSchaeferら J. Biol. Chem. 274:859-66(1999))。細胞を室温に平衡化させ、次いで０．５ｍＬの２００ｎＭのハーセプチン(商品名)又はモノクローナル抗体２Ｃ４と３０分間インキュベートした。次いで、細胞を１５分間、１ｎＭ ＥＧＦ、１ｎＭ ＴＧＦ-α、又は０，２ｎＭ ＨＲＧで処理した。細胞培地を吸引して反応を止め、次いで１％ＤＴＴを含有する０．２ｍＬのＳＤＳ-ＰＡＧＥサンプル緩衝液を加えた。ＭＡＰＫ活性化を前記したようにして(Jonesら J. Biol. Chem. 273:11667-74(1998))抗-活性ＭＡＰＫ抗体(Promega)を用いたウエスタンブロット法により調べた。
図１０に示されるように、モノクローナル抗体は、ハーセプチン(商品名)よりも大きな程度でＭＡＰＫのＥＧＦ、ＴＧＦ-α及びＨＲＧ媒介活性化を有意に阻害した。これらのデータは、モノクローナル抗体２Ｃ４がＥＲＦＧ又はＥｒｂＢ３のどちらかとの結合に使用されるＥｒｂＢ２の表面に結合し、従ってシグナル伝達レセプター複合体の生成を妨げることを示唆した。
モノクローナル抗体２Ｃ４もまた、ヘレグリン(ＨＲＧ)依存性Ａｋｔ活性化を阻害することが示された。ＰＩ３キナーゼシグナル伝達経路の活性化は細胞生存にとって重要である(Carrawayら J. Biol. Chem. 270:7111-6(1995))。腫瘍細胞において、ＰＩ３キナーゼ活性化は浸潤性表現型の役割を担う(Tanら Cancer Research. 59:1620-1625,(1999))。生存経路はセリン/チロシンキナーゼＡＫＴに主に媒介される(Bosら Trends Biochem Sci. 20: 441-442(1995)。ＥｒｂＢ２とＥｒｂＢ３又はＥＧＦＲのどちらかの間で形成される複合体は、それぞれヘレグリン又はＥＧＦに関するこれらの経路を開始させることができる(Olayioyeら Mol. & Cell. Biol. 18:5042-51(1998); Karunagaranら, EMBO Journal. 15:254-264(1996); 及びKrymskayaら Am. J. Physiol. 276: L246-55(1999))。２Ｃ４を有するＭＣＦ７乳癌細胞のインキュベーションはヘレグリン媒介ＡＫＴ活性化を抑制する。更に、ヘレグリン添加の無い場合に存在するＡＫＴ活性化の基本的なレベルは、２Ｃ４の添加により更に減少する。これらのデータは、２Ｃ４がＰＩ３キナーゼのＥｒｂＢリガンド活性化を阻害し、これがアポトーシスを招きうることを示唆する。増加したアポトーシスに対する感受性は化学療法の毒性影響に対する腫瘍細胞のより高い感受性において顕著である。
したがって、モノクローナル抗体２Ｃ４は２つの主なシグナル伝達経路ＭＡＰキナーゼ(主な増殖経路)及びＰＩ３キナーゼ(主な生存/抗アポトーシス経路)を通してＥｒｂＢシグナル伝達を開始するリガンドを阻害する。
実施例５
癌関連疼痛の治療のためのｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４
脂肪肉腫と診断されて２年間化学療法を受けている４３歳男性患者が左足の深い創傷のために入院し、パックする前にオピエイト鎮痛の必要があった。腫瘍病変のサイズは６．６ｃｍであった。モノクローナル抗体２Ｃ４（１０ｍｇ／ｋｇ）で２サイクル治療した後、更に鎮痛薬を投与することなく患者の創傷をパックすることができた。腫瘍そのものは２Ｃ４抗体治療に応じなかったが、２Ｃ４は痛覚消失活性を表した。
実施例６
アンドロゲン依存性前立腺癌に関連する疼痛の治療のためのｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４
タキサンベースの化学療法の後に進行した骨転移を有するホルモン耐性（アンドロゲン非依存性）前立腺癌と診断された患者をｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４で治療した。ｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４の投与を開始する前にすべての患者は現疼痛強度スコア(Present Pain Intensity Score)の６段階のうち１又はそれ以上を示した。
０＝疼痛なし
１＝軽度の疼痛
２＝不快にさせるような疼痛
３＝苦しむような疼痛
４＝ひどい疼痛
５＝耐えがたい疼痛
患者の鎮痛効果は毎日日記を付けることで測定した。非ステロイド性鎮痛薬の１用量ではスコア１であり、モルヒネの１０ｍｇの１用量又は他のオピエイト鎮痛薬の等用量ではスコア２であった。
ｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４は８４０ｍｇ充填ボーラス用量で初めて、その後３週間毎に４２０ｍｇ静脈内用量を投与した。
ある患者は痛覚消失の必要性が最も緩やかに減少し、疼痛スコアが３から１となった。この効果は２４週間続いた。この患者はＰＳＡの上昇率の減少を示したが、絶対値は低下しなかった。
ある患者は安定して疼痛スコア２を示したが、痛覚消失は全く停止した。ＰＳＡの進行にもかかわらずこの効果は２４週目にも継続した。
ある患者は初期には痛覚消失の必要性が５０％以上低下する（スコア２から１への低下）という疼痛の改善を示した。この治療は患者のＰＳＡに対して効果がなかった。疼痛に値する効果は６週間持続し、疾患は進行し、疼痛は増加した。
このデータは、前立腺癌が寛解になく、進行し続けている場合でさえも、ｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４が患者の疼痛を低減させ安定させることができたことを示す。
トランケーション突然変異分析及び部位特異的突然変異誘発(Nakamuraら J. of Virology 67(10):6179-6191(1993); 及びRenzら J. Cell Biol. 125(6):1395-1406(1994))により決定されたＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)(シグナル配列を含み、図１Ａに示される、アミノ酸配列)内の残基２２−６４５のエピトープマッピングを示した。種々のＥｒｂＢ２-ＥＣＤ切断又は点変異を、ポリメラーゼ連鎖反応法を使用してｃＤＮＡから調製した。ＥｒｂＢ２変異体は、哺乳類発現プラスミドにおけるｇＤ融合タンパク質として発現された。この発現プラスミドとして、挿入ｃＤＮＡの下流に位置するポリアデニル化シグナルとＳＶ４０末端を有するサイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサーが使用される。プラスミドＤＮＡを２９３Ｓ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション１日後、細胞を、35Ｓメチオニン及び35Ｓシステインを各々２５μＣｉと、透析されたウシ胎児血清を１％含むメチオニン及びシステインフリーの低グルコースＤＭＥＭ中で、一晩かけて代謝標識した。上清を回収し、ＥｒｂＢ２ ＭＡｂ又は対照抗体のいずれかを上清に添加し、４℃で２−４時間インキュベートした。複合体を沈殿させ、１０−２０％のトリシンＳＤＳ勾配ゲルに塗布し、１００Ｖで電気泳動にかけた。ゲルは膜上にエレクトロブロットされ、これをオートラジオグラフィーで分析した。 トランケーション突然変異分析及び部位特異的突然変異誘発(Nakamuraら J. of Virology 67(10):6179-6191(1993); 及びRenzら J. Cell Biol. 125(6):1395-1406(1994))により決定されたＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)(シグナル配列を含み、図１Ａに示される、アミノ酸配列)内の残基２２−６４５のエピトープマッピングを示した。種々のＥｒｂＢ２-ＥＣＤ切断又は点変異を、ポリメラーゼ連鎖反応法を使用してｃＤＮＡから調製した。ＥｒｂＢ２変異体は、哺乳類発現プラスミドにおけるｇＤ融合タンパク質として発現された。この発現プラスミドとして、挿入ｃＤＮＡの下流に位置するポリアデニル化シグナルとＳＶ４０末端を有するサイトメガロウイルスのプロモーター／エンハンサーが使用される。プラスミドＤＮＡを２９３Ｓ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション１日後、細胞を、35Ｓメチオニン及び35Ｓシステインを各々２５μＣｉと、透析されたウシ胎児血清を１％含むメチオニン及びシステインフリーの低グルコースＤＭＥＭ中で、一晩かけて代謝標識した。上清を回収し、ＥｒｂＢ２ ＭＡｂ又は対照抗体のいずれかを上清に添加し、４℃で２−４時間インキュベートした。複合体を沈殿させ、１０−２０％のトリシンＳＤＳ勾配ゲルに塗布し、１００Ｖで電気泳動にかけた。ゲルは膜上にエレクトロブロットされ、これをオートラジオグラフィーで分析した。図１Ｂに示されるように抗-ＥｒｂＢ２抗体７Ｃ２、７Ｆ３、２Ｃ４、７Ｄ３、３Ｅ８、４Ｄ５、２Ｈ１１及び３Ｈ４は様々なＥｒｂＢ２ＥＣＤエピトープに結合する。 ＭＣＦ７細胞のｒＨＲＧβ１活性化での抗-ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体２Ｃ４及び７Ｆ３を示す。図２Ａはチロシンリン酸化のＨＲＧ刺激の２Ｃ４又は７Ｆ３抑制の反応曲線を示す。 ＭＣＦ７細胞のｒＨＲＧβ１活性化での抗-ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体２Ｃ４及び７Ｆ３を示す。図２Ｂは２Ｃ４又は７Ｆ３によりＭＣＦ７細胞に結合される125Ｉ-標識ｒＨＲＧβ177-244の抑制の反応曲線を示す。 抗-ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体２Ｃ４及び７Ｆ３によりヒト癌細胞株のパネルに結合した特異的125Ｉ-標識ｒＨＲＧβ177-244の抑制を示す。モノクローナル抗体コントロールは、ｒＨＲＧ結合を阻害しないアイソタイプ適合マウスモノクローナル抗体である。非特異的125Ｉ-標識ｒＨＲＧβ177-244結合は、１００ｎＭのｒＨＲＧβ１の存在下で実施された並行したインキュベーションから決定された。非特異的125Ｉ-標識ｒＨＲＧβ177-244結合の値は、試験された全ての細胞株全体の１％よりも小さかった。 ＭＤＡ-ＭＢ-１７５細胞の増殖でのモノクローナル抗体２Ｃ４及び４Ｄ５の効果を示す。実験は１％の血清を含む培地で実施された。抗-ＥｒｂＢ２抗体又は培地のみを加え、細胞を３７℃で２時間インキュベートした。置換ｒＨＲＧβ１(１ｎＭ)又は培地のみを加え、細胞を４日間インキュベートした。単層を洗浄し、０．５％クリスタルバイオレットで染色／固定した。細胞増殖を決定するために吸高度を５４０ｎＭで測定した。 ＳＫ-ＢＲ-３細胞の増殖でのモノクローナル抗体２Ｃ４及び４Ｄ５の効果を示す。実験は１％の血清を含む培地で実施された。抗-ＥｒｂＢ２抗体又は培地のみを加え、細胞を３７℃で２時間インキュベートした。置換ｒＨＲＧβ１(１ｎＭ)又は培地のみを加え、細胞を４日間インキュベートした。単層を洗浄し、０．５％クリスタルバイオレットで染色／固定した。細胞増殖を決定するために吸高度を５４０ｎＭで測定した。 低／標準レベルにＥｒｂＢ２を発現するＭＣＦ７細胞のＥｒｂＢ２のＥｒｂＢ３とのヘレグリン(ＨＲＧ)依存性関連のモノクローナル抗体２Ｃ４、ハーセプチン(商品名)抗体又は抗ＥＧＦＲ抗体の効果を示す；前記実施例２を参照。 高レベルにＥｒｂＢ２発現するＳＫ-ＢＲ-３細胞のＥｒｂＢ２のＥｒｂＢ３とのヘレグリン(ＨＲＧ)依存性関連のモノクローナル抗体２Ｃ４、ハーセプチン(商品名)抗体又は抗ＥＧＦＲ抗体の効果を示す；前記実施例２を参照。 完全なマウスモノクローナル抗体２Ｃ４(ｍｕ２Ｃ４)及びキメラ２Ｃ４Ｆａｂ断片の活性を比較する。図６Ａは、キメラ２Ｃ４Ｆａｂ又は完全なマウスモノクローナル抗体２Ｃ４によるＭＡＣＦ７細胞に結合する125Ｉ-ＨＲＧの抑制を示す。ＭＣＦ７細胞を２４穴プレート(１ｘ１０５細胞／穴)に蒔き、約８５％集密性まで２日間、生育した。結合実験は、Lewsら Cancer Research 56:1457-1465(1996)に記載されるようにして実施された。 完全なマウスモノクローナル抗体２Ｃ４(ｍｕ２Ｃ４)及びキメラ２Ｃ４Ｆａｂ断片の活性を比較する。図６Ｂは、Lewsら Cancer Research 56:1457-1465(1996)に記載されるようにして実施されたＭＣＦ７細胞のｐ１８０チロシンリン酸化のｒＨＲＧβ１活性化の抑制を示す。 マウスモノクローナル抗体２Ｃ４可変軽鎖(ＶＬ)(配列番号．１)；ヒト化２Ｃ４バージョン５７４のＶＬドメイン(それぞれ配列番号．３)、及びヒトＶＬコンセンサスフレームワーク(ｈｕｍ κ１、軽κサブグループＩ)(配列番号．５)のアミノ酸配列の配置を示す。相補正決定領域(ＣＤＲ)はブラケットにある。 マウスモノクローナル抗体２Ｃ４可変重鎖(ＶＨ)ドメイン(配列番号．２)；ヒト化２Ｃ４バージョン５７４のＶＨドメイン(配列番号．４)、及びヒトＶＨコンセンサスフレームワーク(ｈｕｍIII、重鎖サブグループIII)(配列番号．６)のアミノ酸配列の配置を示す。相補正決定領域(ＣＤＲ)はブラケットにある。 実施例３のＥＬＩＳＡにより決定されるキメラＦａｂ２Ｃ４(Ｆａｂ．ｖ１)及びＥｒｂＢ２細胞外ドメインに対するいくつかのヒト化２Ｃ４変異体の結合を示す。 実施例３のＥＬＩＳＡにより決定されるキメラＦａｂ２Ｃ４(Ｆａｂ．ｖ１)及びＥｒｂＢ２細胞外ドメインに対するいくつかのヒト化２Ｃ４変異体の結合を示す。 実施例３のＥＬＩＳＡにより決定されるキメラＦａｂ２Ｃ４(Ｆａｂ．ｖ１)及びＥｒｂＢ２細胞外ドメインに対するいくつかのヒト化２Ｃ４変異体の結合を示す。 標識された白のＣＤＲ主鎖(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)を有するモノクローナル抗体２Ｃ４のＶＬ及びＶＨドメインのリボン・ダイアグラムである。ヒト化する間に突然変異誘発により評価されたＶＨ側鎖(実施例３、表２参照)も、示された。 モノクローナル抗体２Ｃ４又はＥＧＦ、ＴＧＦ-α上のハーセプチン(商品名)、又は***促進活性化プロテインキナーゼ(ＭＡＰＫ)のＨＲＧ-媒介活性化の効果を示す。

Claims (80)

  1. 患者の疼痛ないしは痛覚消失の必要性が低減するか除去する用量のＥｒｂＢアンタゴニストが患者に投与されることを含む患者の疼痛を治療する方法。
  2. 疼痛が疼痛を反映する疼痛スコア又は生活の質スコアによって測定されるものである、請求項１に記載の方法。
  3. 疼痛が０〜５の６段階スケールのマギルマックギール疼痛評価で測定される、請求項２に記載の方法。
  4. 疼痛が、患者の疼痛の主観的な感覚を反映する０−１００の視覚アナログスケールを用いて測定される、請求項２に記載の方法。
  5. 痛覚消失の必要性が痛覚消失スコアを用いて測定される、請求項１に記載の方法。
  6. 非ステロイド性鎮痛薬の１用量が痛覚消失スコアの１に対応し、モルヒネの１０ｍｇの１用量又は、他のオピエイト鎮痛薬の等価用量が痛覚消失スコアの２に対応する、請求項５に記載の方法。
  7. 疼痛が毎日モニターされる、請求項１に記載の方法。
  8. 痛覚消失の必要性が毎日モニターされる、請求項１に記載の方法。
  9. アンタゴニストがＥｒｂＢを結合する抗体である、請求項１に記載の方法。
  10. 抗体がＥｒｂＢのリガンド活性化をブロックする、請求項９に記載の方法。
  11. 抗体がＥｒｂＦ３ヘテロ二量体の形成をブロックする、請求項９に記載の方法。
  12. 抗体がＥｒｂＢ２に対するモノクローナル抗体２Ｃ４の結合をブロックする、請求項９に記載の方法。
  13. 抗体がモノクローナル抗体２Ｃ４の生物学的特性を有する、請求項９に記載の方法。
  14. 抗体がモノクローナル抗体２Ｃ４又はヒト化２Ｃ４を含んでなる、請求項９に記載の方法。
  15. 抗体が抗体断片である、請求項９に記載の方法。
  16. 抗体断片がＦａｂ断片である、請求項１５に記載の方法。
  17. 抗体が細胞障害性剤と接合されていない、請求項９の方法。
  18. 抗体が細胞障害性剤と接合されている、請求項９に記載の方法。
  19. 抗体断片が細胞障害性剤と接合されていない、請求項１５に記載の方法。
  20. 抗体断片が細胞障害性剤と接合されている、請求項１５に記載の方法。
  21. 疼痛が慢性疼痛である、請求項１に記載の方法。
  22. 慢性疼痛が侵害受容性疼痛、神経障害疼痛及び心因性疼痛からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
  23. 疼痛が侵害受容性疼痛である、請求項２２に記載の方法。
  24. 疼痛が癌関連疼痛である、請求項１に記載の方法。
  25. 癌がＥｒｂＢレセプターを発現する、請求項２４に記載の方法。
  26. ＥｒｂＢレセプターがＥｒｂＢ２又はＥＧＦＲである、請求項２５に記載の方法。
  27. 癌が転移性癌である、請求項２４に記載の方法。
  28. 疼痛が癌転移と関係している、請求項２７に記載の方法。
  29. 癌が前立腺癌である、請求項２６に記載の方法。
  30. 転移が骨転移である、請求項２９に記載の方法。
  31. 癌が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌、扁平上皮細胞癌、肺癌、腹膜癌、肝細胞性癌、胃癌、膠芽細胞腫、子宮頸癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮上皮癌、唾液腺上皮癌、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門の上皮癌、陰茎上皮癌及び頭頸部癌からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
  32. 癌が前立腺癌である、請求項３１に記載の方法。
  33. 癌がアンドロゲン非依存性前立腺癌である、請求項３２に記載の方法。
  34. 癌が寛解にないか又は治療の間に成長し続ける、請求項２４に記載の方法。
  35. 疼痛が非癌性である、請求項１に記載の方法。
  36. 患者が悪性腫瘍に罹患していない、請求項１に記載の方法。
  37. 有効量のＥｒｂＢアンタゴニストが患者に投与されることを含む、癌と診断された患者の癌関連疼痛を治療する方法であって、該癌が寛解にないか又は治療の間に成長し続けるものである方法。
  38. 前記治療の間、癌が寛解にない、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記治療の間、癌が成長し続ける、請求項３７に記載の方法。
  40. 癌が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌、扁平上皮細胞癌、肺癌、腹膜癌、肝細胞性癌、胃癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌又は子宮上皮癌、唾液腺上皮癌、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門の上皮癌、陰茎上皮癌及び頭頸部癌からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
  41. 癌が転移性癌である、請求項３７に記載の方法。
  42. 転移が軟組織転移である、請求項４１に記載の方法。
  43. 転移が骨転移を含む、請求項４１に記載の方法。
  44. 癌が前立腺癌である、請求項４０に記載の方法。
  45. 癌がアンドロゲン非依存性前立腺癌である、請求項４４に記載の方法。
  46. 治療の間、患者のＰＳＡが低下を示さない、請求項４４に記載の方法。
  47. 治療の間、患者のＰＳＡが上昇する、請求項４４に記載の方法。
  48. アンタゴニストがＥｒｂＢを結合する抗体である、請求項３７に記載の方法。
  49. 抗体がＥｒｂＢのリガンド活性化をブロックする、請求項４８に記載の方法。
  50. 抗体がＥｒｂＢヘテロ二量体の形成をブロックする、請求項４８に記載の方法。
  51. 抗体がＥｒｂＢ２に対するモノクローナル抗体２Ｃ４の結合をブロックする、請求項４８に記載の方法。
  52. 抗体がモノクローナル抗体２Ｃ４の生物学的特性を有する、請求項４８に記載の方法。
  53. 抗体がモノクローナル抗体２Ｃ４又はヒト化２Ｃ４を含んでなる、請求項４８に記載の方法。
  54. 抗体が抗体断片である、請求項４８に記載の方法。
  55. 抗体断片がＦａｂ断片である、請求項５４に記載の方法。
  56. 抗体が細胞障害性剤と接合していない、請求項４８に記載の方法。
  57. 抗体が細胞障害性剤と接合している、請求項４８に記載の方法。
  58. 抗体断片が細胞障害性剤と接合していない、請求項５４に記載の方法。
  59. 抗体断片が細胞障害性剤と接合している、請求項５４に記載の方法。
  60. 有効量のＥｒｂＢアンタゴニストが患者に投与されることを含む、患者の非癌性疼痛を治療する方法。
  61. アンタゴニストが抗ＥｒｂＢ抗体である、請求項６０に記載の方法。
  62. 抗体がＥｒｂＢのリガンド活性化をブロックする、請求項６１に記載の方法。
  63. 抗体がＥｒｂＢヘテロ二量体の形成をブロックする、請求項６１に記載の方法。
  64. 抗体がＥｒｂＢ２に対するモノクローナル抗体２Ｃ４の結合をブロックする、請求項６１に記載の方法。
  65. 抗体がモノクローナル抗体２Ｃ４の生物学的特性を有する、請求項６１に記載の方法。
  66. 抗体がモノクローナル抗体２Ｃ４又はヒト化２Ｃ４を含んでなる、請求項６１に記載の方法。
  67. 抗体が抗体断片である、請求項６１に記載の方法。
  68. 抗体断片がＦａｂ断片である、請求項６７に記載の方法。
  69. 有効量のＥｒｂＢアンタゴニストと、疼痛治療のために該アンタゴニストを投与する指示書を含んでなるキット。
  70. アンタゴニストがＥｒｂＢを結合する抗体である、請求項６９に記載のキット。
  71. 抗体がＥｒｂＢのリガンド活性化をブロックする、請求項７０に記載のキット。
  72. 抗体がＥｒｂＢヘテロ二量体の形成をブロックする、請求項７０に記載のキット。
  73. 抗体がＥｒｂＢ２に対するモノクローナル抗体２Ｃ４の結合をブロックする、請求項７０に記載のキット。
  74. 抗体がモノクローナル抗体２Ｃ４の生物学的特性を有する、請求項７０に記載のキット。
  75. 抗体がモノクローナル抗体２Ｃ４又はヒト化２Ｃ４を含んでなる、請求項７０に記載のキット。
  76. 抗体が抗体断片である、請求項７０に記載のキット。
  77. 抗体断片がＦａｂ断片である、請求項７６に記載の方法。
  78. 疼痛が癌関連のものである、請求項６９に記載のキット。
  79. 疼痛が非癌性のものである、請求項６９に記載のキット。
  80. 疼痛が慢性疼痛である、請求項６９に記載のキット。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014520792A (ja) * 2011-07-06 2014-08-25 スィーケフス ソールラン ホーエフ Ｅｇｆｒ標的治療
JP2019023227A (ja) * 2012-12-21 2019-02-14 スィーケフス ソールラン ホーエフ 神経障害及び疼痛のｅｇｆｒ標的治療

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA9811162B (en) * 1997-12-12 2000-06-07 Genentech Inc Treatment with anti-ERBB2 antibodies.
EP2248899B8 (en) 2003-03-19 2015-07-15 Biogen MA Inc. NOGO receptor binding protein
SV2006002143A (es) * 2004-06-16 2006-01-26 Genentech Inc Uso de un anticuerpo para el tratamiento del cancer resistente al platino
WO2006002437A2 (en) 2004-06-24 2006-01-05 Biogen Idec Ma Inc. Treatment of conditions involving demyelination
US7560111B2 (en) 2004-07-22 2009-07-14 Genentech, Inc. HER2 antibody composition
JO3000B1 (ar) * 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
AU2005314127A1 (en) * 2004-12-07 2006-06-15 Genentech, Inc. Selecting patients for therapy with a HER inhibitor
CA2592177A1 (en) * 2005-01-21 2006-07-27 Genentech, Inc. Fixed dosing of her antibodies
MX2007009889A (es) 2005-02-23 2007-09-07 Genentech Inc Alargar el tiempo hasta la progresion de la enfermedad o la supervivencia de los pacientes de cancer.
AU2006269458B2 (en) 2005-07-08 2012-11-08 Biogen Ma Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
PE20070207A1 (es) * 2005-07-22 2007-03-09 Genentech Inc Tratamiento combinado de los tumores que expresan el her
US20090175872A1 (en) 2005-12-02 2009-07-09 Biogen Idec Ma Inc. Treatment of Conditions Involving Demyelination
US8128926B2 (en) 2007-01-09 2012-03-06 Biogen Idec Ma Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
EP2132573B1 (en) 2007-03-02 2014-04-23 Genentech, Inc. Predicting response to a her dimerisation inhbitor based on low her3 expression
WO2009048605A1 (en) * 2007-10-11 2009-04-16 Biogen Idec Ma Inc. Methods for treating pressure induced optic neuropathy, preventing neuronal degeneration and promoting neuronal cell, survival via administration of lingo-1 antagonists and trkb agonists
EP2217697B1 (en) * 2007-11-08 2015-06-10 Biogen MA Inc. Use of lingo-4 antagonists in the treatment of conditions involving demyelination
TWI472339B (zh) 2008-01-30 2015-02-11 Genentech Inc 包含結合至ｈｅｒ２結構域ii之抗體及其酸性變異體的組合物
BRPI0812682A2 (pt) 2008-06-16 2010-06-22 Genentech Inc tratamento de cáncer de mama metastático
JP2011527572A (ja) * 2008-07-09 2011-11-04 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｌｉｎｇｏ抗体または断片を含む組成物
CA2779436A1 (en) 2008-10-31 2010-05-06 Biogen Idec Ma Inc. Light targeting molecules and uses thereof
US9155802B2 (en) 2010-11-01 2015-10-13 Symphogen A/S Pan-HER antibody composition
SG10202110077QA (en) 2011-10-14 2021-10-28 Genentech Inc Uses for and article of manufacture including her2 dimerization inhibitor pertuzumab
CN104093743B (zh) 2011-11-23 2018-04-24 医学免疫有限责任公司 特异于her3的结合分子及其用途
US9071046B2 (en) 2012-01-10 2015-06-30 Hzo, Inc. Methods, apparatuses and systems for monitoring for exposure of electronic devices to moisture and reacting to exposure of electronic devices to moisture
US9146207B2 (en) 2012-01-10 2015-09-29 Hzo, Inc. Methods, apparatuses and systems for sensing exposure of electronic devices to moisture
EP2844675B1 (en) 2012-05-02 2019-01-02 Symphogen A/S Humanized pan-her antibody compositions
US9796780B2 (en) 2012-05-14 2017-10-24 Biogen Ma Inc. LINGO-2 antagonists for treatment of conditions involving motor neurons
SG10201911353WA (en) 2013-04-16 2020-02-27 Genentech Inc Pertuzumab variants and evaluation thereof
AU2014290044B2 (en) 2013-07-17 2020-10-29 Foundation Medicine, Inc. Methods of treating urothelial carcinomas
WO2015048008A2 (en) 2013-09-24 2015-04-02 Medimmune, Llc Binding molecules specific for her3 and uses thereof
US10745490B2 (en) 2014-04-11 2020-08-18 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-ErbB antibodies and methods of use thereof
AU2015249633B2 (en) 2014-04-25 2020-10-15 Genentech, Inc. Methods of treating early breast cancer with Trastuzumab-MCC-DM1 and Pertuzumab
EP3242893A1 (en) 2015-01-08 2017-11-15 Biogen MA Inc. Lingo-1 antagonists and uses for treatment of demyelinating disorders
CN107614015A (zh) 2015-05-30 2018-01-19 豪夫迈·罗氏有限公司 治疗her2阳性局部晚期或先前未治疗的转移性乳腺癌的方法
WO2017087280A1 (en) 2015-11-16 2017-05-26 Genentech, Inc. Methods of treating her2-positive cancer
WO2018085513A1 (en) 2016-11-04 2018-05-11 Genentech, Inc. Treatment of her2-positive breast cancer
CN110099926A (zh) 2016-12-28 2019-08-06 豪夫迈·罗氏有限公司 晚期her2表达性癌症的治疗
EP3868404A1 (en) 2017-01-17 2021-08-25 F. Hoffmann-La Roche AG Subcutaneous her2 antibody formulations
MX2019010296A (es) 2017-03-02 2019-11-21 Genentech Inc Tratamiento adyuvante de cancer de mama her2 positivo.
AU2018258263A1 (en) 2017-04-24 2019-10-24 Genentech, Inc. ErbB2/Her2 mutations in the transmembrane or juxtamembrane domain
WO2020115108A1 (en) * 2018-12-06 2020-06-11 Sørlandet Sykehus Hf Egfr inhibitors and their use in the treatment of neuroathic pain
TWI807338B (zh) * 2020-06-26 2023-07-01 美商美國禮來大藥廠 結合ＴＧＦ-α及表皮調節素（ＥＰＩＲＥＧＵＬＩＮ）之抗體於治療疼痛之用途
TW202313680A (zh) * 2021-05-21 2023-04-01 美商美國禮來大藥廠 靶向表皮調節素(epiregulin)之化合物及方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020002276A1 (en) * 1997-02-10 2002-01-03 Genentech, Inc. Chimeric heteromultimer adhesins
JP2003503361A (ja) * 1999-06-25 2003-01-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ＥｒｂＢ２抗体を用いる前立腺癌の処置
JP2006516117A (ja) * 2002-11-21 2006-06-22 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ＥｒｂＢ２抗体を用いた非悪性疾病または疾患の治療

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
US4943533A (en) 1984-03-01 1990-07-24 The Regents Of The University Of California Hybrid cell lines that produce monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US4968603A (en) * 1986-12-31 1990-11-06 The Regents Of The University Of California Determination of status in neoplastic disease
US5824311A (en) * 1987-11-30 1998-10-20 Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of tumors with monoclonal antibodies against oncogene antigens
JP3040121B2 (ja) * 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5183884A (en) * 1989-12-01 1993-02-02 United States Of America Dna segment encoding a gene for a receptor related to the epidermal growth factor receptor
IL101943A0 (en) * 1991-05-24 1992-12-30 Genentech Inc Structure,production and use of heregulin
DE69233254T2 (de) * 1991-06-14 2004-09-16 Genentech, Inc., South San Francisco Humanisierter Heregulin Antikörper
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
CA2120745A1 (en) 1992-06-30 1994-01-06 Philip G. Kasprzyk A combination of anti-erbb-2 monoclonal antibodies and method of using
CA2103323A1 (en) 1992-11-24 1994-05-25 Gregory D. Plowman Her4 human receptor tyrosine kinase
PT616812E (pt) 1993-03-24 2000-04-28 Berlex Biosciences Combinacao de compostos anti-hormonais e moleculas de ligacao no tratamento do cancro
AU6527894A (en) 1993-03-30 1994-10-24 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Prevention of tumors with monoclonal antibodies against (neu)
ES2166368T3 (es) 1993-12-24 2002-04-16 Merck Patent Gmbh Inmunoconjugados.
EP0831880A4 (en) 1995-06-07 2004-12-01 Imclone Systems Inc ANTIBODIES AND FRAGMENTS OF ANTIBODIES INHIBITING TUMOR GROWTH
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US7041292B1 (en) * 1999-06-25 2006-05-09 Genentech, Inc. Treating prostate cancer with anti-ErbB2 antibodies

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020002276A1 (en) * 1997-02-10 2002-01-03 Genentech, Inc. Chimeric heteromultimer adhesins
JP2003503361A (ja) * 1999-06-25 2003-01-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ＥｒｂＢ２抗体を用いる前立腺癌の処置
JP2006516117A (ja) * 2002-11-21 2006-06-22 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗ＥｒｂＢ２抗体を用いた非悪性疾病または疾患の治療

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014520792A (ja) * 2011-07-06 2014-08-25 スィーケフス ソールラン ホーエフ Ｅｇｆｒ標的治療
JP2016138152A (ja) * 2011-07-06 2016-08-04 スィーケフス ソールラン ホーエフ 神経障害性疼痛の治療用薬剤
JP2018016659A (ja) * 2011-07-06 2018-02-01 スィーケフス ソールラン ホーエフ 神経障害性疼痛の治療用薬剤
JP2019210295A (ja) * 2011-07-06 2019-12-12 スィーケフス ソールラン ホーエフ 神経障害性疼痛の治療用薬剤
US10980879B2 (en) 2011-07-06 2021-04-20 Sykehuset Sørlandet Hf EGFR targeted therapy
JP2022027977A (ja) * 2011-07-06 2022-02-14 スィーケフス ソールラン ホーエフ 神経障害性疼痛の治療用薬剤
JP2019023227A (ja) * 2012-12-21 2019-02-14 スィーケフス ソールラン ホーエフ 神経障害及び疼痛のｅｇｆｒ標的治療
US10611844B2 (en) 2012-12-21 2020-04-07 Sykehuset Sørlandet Hf EGFR targeted therapy of neurological disorders and pain
JP2022058654A (ja) * 2012-12-21 2022-04-12 スィーケフス ソールラン ホーエフ 神経障害及び疼痛のｅｇｆｒ標的治療
US11396548B2 (en) 2012-12-21 2022-07-26 Sykehuset Sørlandet Hf EGFR targeted therapy of neurological disorders and pain

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