TW202313680A - 靶向表皮調節素(epiregulin)之化合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於表皮調節素(epiregulin)抗體、包含該等抗體之組合物及製備及/或使用該等抗體及/或其組合物用於慢性疼痛病症(諸如慢性骨關節炎疼痛、或慢性糖尿病周圍神經病變疼痛或慢性下背疼痛)之方法。

Description

靶向表皮調節素(EPIREGULIN)之化合物及方法
本發明係關於包括針對人類表皮調節素(Epiregulin)之抗體之化合物、醫藥組合物及方法及其在治療慢性疼痛(包括傷害感受性、神經病性及混合性疼痛)且特定地治療骨關節炎(OA)疼痛、或糖尿病周圍神經病變性疼痛(DPNP)或慢性下背疼痛(CLBP)中之用途。
慢性疼痛根據機制分為不同類別：傷害感受性、神經病性及混合性。傷害感受性疼痛係由可能或實際上對非神經元組織造成傷害之刺激引起。此激活周圍感覺系統中之傷害感受器。骨關節炎引起之疼痛係軀體傷害感受性疼痛之典型實例。神經病性疼痛係由中樞或周圍神經系統之損傷或疾病引起，導致感覺神經系統之適應不良性過敏反應。糖尿病周圍神經病變引起之疼痛係周圍神經病性疼痛之典型實例。展現傷害感受性及神經病性疼痛二者之特徵之病況(例如慢性下背疼痛)分類為混合性疼痛。
慢性疼痛係具有巨大社會影響之極普遍病況。在2016年，基於國民健康訪問調查(National Health Interview Survey)之數據，據估計，20.4%之美國成年人經歷過慢性疼痛，慢性疼痛定義為過去6個月之大多數日子或每天疼痛。據估計，8%之群體患有慢性疼痛，在過去6個月之大多數日子或每天限制其生活或工作活動。因此，慢性疼痛係醫療保健支出之主要原因，其中2010年在美國用於管理慢性疼痛之年度費用估計為約6350億美元。儘管慢性疼痛有高疾病負擔及社會影響，但目前對慢性疼痛之管理並不令人滿意。單獨的非藥物療法很少能夠緩解疼痛或改良功能，且可用藥物療法多種多樣且提供適度益處且一些具有顯著安全風險。目前，緩和最常見慢性疼痛類型之最常用藥物係乙醯胺酚、非類固醇消炎藥及類鴉片。類加巴噴丁(Gabapentinoid)、其他抗痙攣劑(例如雙丙戊酸鈉(sodium divalproate)、卡巴馬平(carbamazepine)或樂命達錠(lamotrigine))及一些抗抑鬱藥(例如三環類或度洛西汀(duloxetine))可用於一些特定疼痛病症。當前藥物醫療設備通常提供低效能水準，且具有耐受性問題及/或有害副作用。類鴉片有效針對急性疼痛，但由於高濫用風險及潛在嚴重不良反應，故其係慢性疼痛之受限治療選擇。慢性疼痛對患者及社會之身體、情感及財務影響連同缺乏有效且可耐受治療選擇，使其成為嚴重未滿足之醫療需求。
表皮調節素係表皮生長因子受體(EGFR)配體家族之成員，其包含7種配體：TGF-α (TGFA)、表皮調節素(EREG)、EGF、肝素結合EGF (HB-EGF)、表皮素(EPGN)、雙調蛋白(AREG)及β細胞素(BTC) (Schneider MR、Wolf E. The epidermal growth factor receptor ligands at a glance . J Cell Physiol. 2009；218(3):460-466)。除EGFR (ErbB1)之外，此受體家族內存在3種其他受體(ErbB2、ErbB3及ErbB4)，其中ErbB3及ErbB4可結合神經調節蛋白配體家族以及選擇EGFR配體家族之成員(表皮調節素、β細胞素及HB-EGF)。該等配體係作為跨膜蛋白合成，該等跨膜蛋白以蛋白水解方式裂解以產生可溶性配體，該等可溶性配體可以旁分泌或自分泌方式調節各種生物過程。表皮調節素可結合至EGFR及ErbB4二者以藉助同二聚化或配體誘導之與ErbB2或ErbB3之異二聚化來誘導信號傳導。
表皮調節素信號傳導有助於寬範圍生理條件，例如發炎、傷口癒合及血管生成(Riese等人 Epiregulin: Roles in Normal Physiology and Cancer, Semin Cell Dev Biol. 2014, 0:49-56)。藉助EGFR受體同二聚體或異二聚體對之表皮調節素信號傳導允許潛在地激活許多下游信號傳導路徑，例如ERK、MAPK、AP1、PI3K、JAK/STAT及NFKB。諸如JAK/STAT及NFKB等路徑之激活在驅動發炎方面已充分證明，而AP1信號傳導之激活驅動c-FOS及c-JUN激活，其係神經激活之標幟物。最近發佈之臨床前模型數據表明表皮調節素在調節以神經元發炎及神經元激活為特徵之慢性疼痛中之作用，此暗示表皮調節素信號傳導路徑調節發炎及神經元激活作為慢性疼痛病症中之潛在機制之作用。有報告指示，EGFR路徑涉及神經病性疼痛之發病機制(Kersten等人，Epidermal growth factor receptor-inhibition (EGFR-I) in the treatment of neuropathic pain. Br J Anaesth. 2015；115(5):761-767)。然而，已發現，利用EGFR抗體或EGFR酪胺酸激酶抑制劑靶向受體與胃腸道(GI)及皮膚不良反應之高發生率相關，此限制其在慢性疼痛病症中之潛在應用。
結合TGFα及表皮調節素二者之抗體連同治療糖尿病腎病變之方法揭示於WO 2012/138510中。LY3016859係結合表皮調節素及轉變生長因子α (TGF-α)之單株抗體，其以在1期臨床研究中進行測試並在健康受試者及患有糖尿病腎病變之患者中評估安全性、藥物動力學、藥效學及效能(參見Sloan-Lancaster等人，Evaluation of the Safety, Pharmacokinetics, Pharmacodynamics, and Efficacy After Single and Multiple Dosings of LY3016859 in Healthy Subjects and Patients With Diabetic Nephropathy, Clinical Pharmacology in Drug Development 2018, 7(7) 759-772)。Sloan-Lancaster等人詳述，LY3016859對TGFα之親和力較表皮調節素高，且進一步LY3016859投與對腎病變疾病相關生物標記不會造成任何明顯效應(亦參見Beidler等人，J. Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2014, 349(2):330-343)。非線性動力學表明靶標介導之藥物處置，且高劑量需要高位準之可溶性靶標參與。值得注意地，在兩個所報告之研究中均觀察到高頻率之抗LY3016859抗體，但對藥物動力學或靶標參與無明顯影響，如由在藥物耐受分析中所量測之循環表皮調節素之劑量及時間依賴性增加所指示。對於慢性疼痛適應症之治療，對表皮調節素更具選擇性、具有更高親和力且較不可能引起抗藥物抗體反應之抗體係重要的未滿足之治療需求。業內對慢性疼痛病症(包括傷害感受性、神經病性及混合性疼痛)之替代及/或經改良治療且特定地在骨關節炎、或糖尿病周圍神經病變或慢性下背疼痛之治療及/或在療法抗性疼痛之治療方面仍存在未滿足需求。
本發明之實施例提供新穎抗人類表皮調節素抗體、其醫藥組合物及使用該等抗體及組合物治療疼痛及慢性疼痛病症之方法。根據一些實施例，本發明提供包含輕鏈可變區(LCVR)及重鏈可變區(HCVR)之抗體，其中該LCVR包含互補決定區(CDR) LCDR1、LCDR2及LCDR3且該HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2及HCDR3，且選自表1中所提供CDR組合之群組。本文所用之標識符列示於表1中，且序列提供於本文所提供之胺基酸及核苷酸序列列表中。抗體1係高親和力全人類免疫球蛋白G4 (IgG4)單株抗體，其結合至人類表皮調節素之C-末端區域中之殘基且阻止人類表皮調節素至EGFR之結合及EGFR之激活。抗體1代表用於人類療法之經改良抗表皮調節素抗體，其具有包括以下各項之有利性質之組合：增強之親和力、選擇性、降低之脫靶風險及不期望之活性、降低之免疫原性風險、高功效及長作用持續時間以及其他期望性質，且提供阻斷表皮調節素及治療疼痛及慢性疼痛病症之經改良方式。 表 1 ：抗體 1 之胺基酸及核苷酸序列
抗體 1
SEQ ID HC 1
SEQ ID LC 2
SEQID HCVR 3
SEQID LCVR 4
SEQID HCDR1 5
SEQID HCDR2 6
SEQID HCDR3 7
SEQID LCDR1 8
SEQID LCDR2 9
SEQID LCDR3 10
SEQ ID: DNA HC 11
SEQ ID DNA LC 12
因此，本發明之實施例亦提供包含LCVR及HCVR之抗體，其中LCVR具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列且HCVR具有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列。
根據其他實施例，本揭示內容亦提供包含LCVR及HCVR之抗體，其中LCVR具有SEQ ID NO: 4之胺基酸序列且HCVR具有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列，其中鉸鏈區及Fc區選自SEQ ID NO: 51及SEQ ID NO: 52。
在一些實施例中，本揭示內容亦提供抗體，其包含具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之LC及具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之HC。根據其他實施例，本揭示內容亦提供包含LC及HC之抗體，LC及HC具有與具有SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之LC及具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之HC之胺基酸序列具有至少95%同源性之胺基酸序列。
如本文所用，「抗體1」係指具有SEQ ID NO: 5之HCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO: 6之HCDR2胺基酸序列、SEQ ID NO: 7之HCDR3胺基酸序列、SEQ ID NO: 8之LCDR1胺基酸序列、SEQ ID NO: 9之LCDR2胺基酸序列、SEQ ID NO: 10之LCDR3胺基酸序列、SEQ ID NO: 3之HCVR胺基酸序列、SEQ ID NO: 4之LCVR胺基酸序列、SEQ ID NO: 1之HC胺基酸序列、SEQ ID NO: 2之LC胺基酸序列、或由SEQ ID NO: 11之HC DNA序列編碼或由SEQ ID NO: 12之LC DNA序列編碼之抗體。除非另外規定，否則序列闡釋於本文中之每一抗體的框架及CDR序列係使用與North等人， J. Mol. Biol. 2011: 406: 228-256之方法一致之標註規則進行標註。
每一HC之羧基末端部分界定主要負責效應物功能之恆定區，且在本發明之一些實施例中，抗體在每一HC之恆定區中具有減少效物應功能之一或多個改質。較佳地，本發明之實施例係IgG4抗體，且因此含有IgG4 Fc區或源自人類IgG4之Fc區，例如經改質IgG4 Fc區。
根據一些實施例，將兩個HC之恆定區中減少效應物功能之改質及胺基酸取代引入IgG4鉸鏈及Fc區中。因此，一些實施例具有在兩個HC之恆定區中之改質(其包括在殘基229及230二者處之胺基酸丙胺酸)(EU索引位置234-235) (例示於抗體1之HC中且說明於SEQ ID NO: 52中)及在兩個HC之恆定區中促進穩定性之其他改質(包括在殘基223處之胺基酸脯胺酸(EU索引位置228) (例示於抗體1之HC中且說明於SEQ ID NO: 51中)及在殘基442處之胺基酸離胺酸之缺失(EU索引位置447) (例示於SEQ ID NO: 1之HC))。
據信，本發明之抗體具有優於先前技術抗表皮調節素抗體之特別有利性質之組合，包括(但不限於)以下性質中之一或多者：1) 高結合親和力及期望締合及解離速率，2) 中和人類表皮調節素以達成疼痛減輕反應及活體內效能之功效，3)作為單一療法用於治療及/或預防疼痛病症具有足夠效力；4) 作用之持久持續時間；5) 充分受限之注射位點反應，6) 可接受之低免疫原性(即，在人類中之足夠非免疫原性)；7) 不利的皮疹反應減少，及/或8) 期望的活體內穩定性、物理及化學穩定性，包括(但不限於)熱穩定性、溶解性、低自締合及藥物動力學特徵，該等對於開發及/或用於治療疼痛病症(例如慢性疼痛、包括傷害感受性、神經病性及混合性疼痛)且特定地治療慢性骨關節炎疼痛、或慢性糖尿病周圍神經病變疼痛或慢性下背疼痛中係可接受的。
本發明之實施例藉由提供針對人類表皮調節素之抗體、其組合物及可用於藉助表皮調節素中和使用本文所述實施例中所提供之藥理學有利的抗人類表皮調節素抗體用於治療、下調或改善疼痛病症之方法而提供優於先前技術之顯著進步。本發明之抗人類表皮調節素抗體能夠較佳藉助抑制特定地慢性疼痛病症及疼痛狀態中之疼痛反應減輕疼痛症狀、改良疼痛病理生理學。臨床上使用此類抗體可導致正治療之疼痛相關疾病的延長緩解。
此外，業內需要診斷性抗人類表皮調節素抗體，該等抗體特異性針對人類表皮調節素且具有經改良結合親和力，且在人類表皮調節素測定中展現增強之靈敏性及導致最小干擾及寬稀釋線性之經改良酶聯免疫吸附分析(ELISA)分析條件。根據本揭示內容之一些態樣，提供結合由SEQ ID NO: 21給出之人類表皮調節素之抗人類表皮調節素抗體(包括人類表皮調節素中和抗體)。「表皮調節素」或「人類表皮調節素」係指人類表皮調節素蛋白。如本文所用，表皮調節素係指成熟表皮調節素肽。表皮調節素(亦稱為EREG、EPR)係屬肽激素之表皮生長因子(EGF)家族之46-胺基酸蛋白質。表皮調節素係作為162-胺基酸跨膜表皮調節素前體產生，其裂解以釋放以下序列之46-胺基酸成熟肽：
「VSITKCSSDMNGYCLHGQCIYLVDMSQNYCRCEVGYTGVRCEHFFL」(SEQ ID NO: 21) (例如，參見Toyoda等人，Molecular cloning of mouse epiregulin, a novel epidermal growth factor-related protein, expressed in the early stage of development. FEBS Lett. 1995；377:403-7)。人類表皮調節素(SEQ ID NO: 22)(如實例2中所述及製備)可例如用於本文所述之活體外實驗。提及如本文所述抗體結合及/或中和人類表皮調節素之能力亦係關於其在活體外實驗中結合及中和人類表皮調節素之能力。
本申請案在35 U.S.C. §119(e)下主張於2021年5月21日提出申請之美國臨時申請案第63/191,496號之權益；此臨時申請案之揭示內容以引用的方式併入本文中。
如本文所用，「人類抗表皮調節素抗體」或「抗人類表皮調節素抗體」係指結合至人類表皮調節素且當活體外或活體內投與時導致表皮調節素活性中和及/或阻斷反應(例如，至少一種顯著減輕之活性)之抗體。舉例而言，表皮調節素信號傳導之期望減少係由表皮調節素反應性分子或細胞終點之變化證明。如本文所用，術語「信號傳導」及「信號轉導」及「表皮調節素介導的」當其涉及表皮調節素時係指由表皮調節素之活性引起之細胞及/或細胞間反應。
如本文所用，術語「抗體」係指結合抗原之免疫球蛋白分子。抗體之實例包括單株抗體、多株抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體或偶聯抗體。抗體可為任何類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA)及任何子類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。實例性抗體係包含四條多肽鏈之免疫球蛋白G (IgG)型抗體：兩條重鏈(HC)及兩條輕鏈(LC)，其經由鏈間二硫鍵交聯。LC分類為κ或λ，其各自以特定恆定區為特徵。本發明之實施例可包含IgG1或IgG4抗體，且進一步包含κ輕鏈或λ輕鏈。較佳地，本發明之抗體包含為κ恆定區之輕鏈恆定區。
HC分類為γ、μ、α、δ或ε，且將抗體之同型分別定義為IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。四條多肽鏈之每一者的胺基末端部分包括主要負責抗原識別之約100-125個或更多個胺基酸之可變區。四條多肽鏈之每一者的羧基末端部分含有主要負責效應物功能之恆定區。每一重鏈包含重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區。重鏈之恆定區含有CH1、CH2及CH3結構域。CH1在HCVR之後；CH1及HCVR形成抗原結合(Fab)片段之重鏈部分，該片段係結合抗原之抗體之一部分。CH2在鉸鏈區之後且在CH3之前。CH3在CH2之後且在重鏈之羧基末端處。輕鏈之恆定區含有一個結構域CL，CL在LCVR之後；CL及LCVR形成Fab之輕鏈部分。
本發明之抗體包括IgG HC，其可進一步分為諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4之子類，且本發明之實施例可在每一HC之恆定區中包括例如增強或減小效應物功能之一或多個改質。如本文所用，術語「Fc區」係指抗體之包含抗體重鏈之CH2及CH3結構域之區。視情況，Fc區可包括鉸鏈區之一部分或抗體重鏈之整個鉸鏈區。IgG1已知誘導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)，且本文所述之Fc突變可減少聚集，降低或增強ADCC或CDC活性(或其他功能)，及/或改質抗體之藥物動力學。本文所述之抗人類EREG抗體之實施例具有降低之與FcγR及C1q受體之結合，由此降低或消除可由具有野生型IgG Fc區之抗體誘導之細胞毒性。因此，根據一些實施例，在本文所述之位置處將突變引入Fc區。患者安全性可利用充分降低或消除該等包含經改質Fc區之抗人類EREG抗體之效應物功能來改良，且與本文所述之其他特性組合，提供具有經改良有用活性概況同時避免不期望活性之治療劑。
當表現於某些生物系統中時，抗體在Fc區中經醣基化。通常，醣基化出現於抗體之Fc區中高度保守之N-醣基化位點處。N-聚糖通常連接至天門冬醯胺。抗體亦可在其他位置處發生醣基化。本揭示內容之抗體係單株抗體。單株抗體係衍生自單一拷貝或純系(包括例如任何真核、原核或噬菌體純系)之抗體，且不由產生其之方法定義。單株抗體可藉由(例如)雜交瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術、合成技術(例如CDR移植)或該等技術或此項技術中已知之其他技術之組合產生。在單株抗體之情形中，術語「人類」及「人類化」為熟習此項技術者所熟知(Weiner LJ, J. Immunother. 2006；29: 1-9；Mallbris L等人，J. Clin. Aesthet. Dermatol. 2016；9: 13-15)。本揭示內容之抗體之實例性實施例亦包括抗體片段或抗原結合片段，其包含抗體之保留與抗原特異性相互作用之能力的至少一部分，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、scFv抗體片段、二硫鍵鏈接之Fv (sdFv)、Fd片段及線性抗體。
每一LC及HC之胺基端部分包括約100-120個胺基酸之可變區，其主要負責經由其中所含有之CDR來識別抗原。VH及VL區可進一步細分成超變區(稱為互補決定區(CDR))，其與更保守之區(稱為框架區(FR))散佈排列。CDR暴露於蛋白質表面上且係抗體之用於抗原結合特異性之重要區域。每一VH及VL由3個CDR及4個FR組成，其自胺基末端至羧基末端以以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本文中，重鏈之三個CDR稱為「HCDR1、HCDR2及HCDR3」且輕鏈之三個CDR稱為「LCDR1、LCDR2及LCDR3」。CDR含有與抗原形成特定相互作用之大多數殘基。抗體結合特定抗原之功能性能力主要受6個CDR影響。胺基酸殘基至CDR之分配可根據熟知方案實施，包括Kabat (Kabat等人，「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」 National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)), Chothia (Chothia等人，「Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins」, Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987)；Al-Lazikani等人，「Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins」, Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997))、North (North等人，「A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations」, Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011))或IMGT (the international ImMunoGeneTics database available on at www.imgt.org；參見Lefranc等人，Nucleic Acids Res. 1999；27:209-212)中所闡述之彼等。
出於本揭示內容之目的且除非另有說明，否則North CDR定義用於本文所述之抗表皮調節素抗體及胺基酸至LCVR及HCVR區內之CDR結構域之指派。下表2提供分別基於North、Kabat、Chothia及/或IMGT之慣例、使用SAbPred/ANARCI庫生成之抗體1及/或本揭示內容之抗體之CDR序列(Dunbar及Deane, 「ANARCI: antigen receptor numbering and receptor classification」, Bioinformatics, 32, 298-300 (2016))。 表 2 ：
抗體 1 ( 或本揭示內容之抗體 ) 之實例性 CDR
Ab HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
North TVSGGSISSYYWS (SEQ ID NO: 5) RIYPSGNTN (SEQ ID NO: 6) ARGGLVMDV (SEQ ID NO: 7) RASQSVEFSYLA (SEQ ID NO: 8) YGASSRAT (SEQ ID NO: 9) HQYGTNPFT (SEQ ID NO: 10)
Kabat SYYWS (SEQ ID NO: 31) RIYPSGNTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 32) GGLVMDV (SEQ ID NO: 33) RASQSVEFSYLA (SEQ ID NO: 34) GASSRAT (SEQ ID NO: 35) HQYGTNPFT (SEQ ID NO: 36)
Chothia GGSISSY (SEQ ID NO: 37) YPSGN (SEQ ID NO: 38) GGLVMDV (SEQ ID NO: 39) RASQSVEFSYLA (SEQ ID NO: 40) GASSRAT (SEQ ID NO: 41) HQYGTNPFT (SEQ ID NO: 42)
IMGT GGSISSYY (SEQ ID NO: 43) IYPSGNT (SEQ ID NO: 44) ARGGLVMDV (SEQ ID NO: 45) QSVEFSY (SEQ ID NO: 46) GAS (SEQ ID NO: 47) HQYGTNPFT (SEQ ID NO: 48)
抗體本發明之實施例具有多種藥理學有用且重要活性之組合，且在一個方面能夠以高親和力結合人類表皮調節素，且對人類表皮調節素具有高特異性以及其他有用性質。除非另有說明，否則如本文所用，術語「結合(bind, binds)」意欲指蛋白質或分子與另一蛋白質或分子形成有吸引力之相互作用的能力，此導致兩種蛋白質或分子接近，如藉由此項技術已知之常用方法所測定。如本文所用，片語「特異性結合」係指抗表皮調節素抗體對人類表皮調節素之親和力，且除非另有說明，否則意欲指K D小於約2 × 10 -9M、且較佳小於約2 × 10 -11M且甚至更佳介於約2 × 10 -11M與約2 × 10 -12M之間，如在約pH 7.4下藉由此項技術已知之常用方法所測定，包括使用如本文所述之MSD-SET (溶液平衡滴定)。片語「特異性結合」亦指示抗表皮調節素抗體對人類表皮調節素與其他抗原抗原、且特定地EGFR-配體TGFα相比之相對親和力，其中對人類表皮調節素之親和力導致人類表皮調節素之特定識別且缺少與所測試之其他EGFR配體之結合。
本發明之抗體實施例可藉由此項技術已知之各種技術自包含本實施例之序列之構築體表現及產生。如本文互換使用，術語「核酸」或「多核苷酸」係指核苷酸之聚合物，包括含單鏈及/或雙鏈核苷酸之分子，例如併入天然、經改良及/或核苷酸類似物之DNA、cDNA及RNA分子。本揭示內容之多核苷酸亦可包括例如藉由DNA或RNA聚合酶或合成反應併入其中之受質。本揭示內容之DNA分子係包含非天然多核苷酸序列之DNA分子，該非天然多核苷酸序列編碼具有本發明抗體之多肽中之至少一者之胺基酸序列之多肽(例如重鏈、輕鏈、可變重鏈及可變輕鏈)。
編碼HCVR或LCVR區之經分離DNA可藉由將各別編碼HCVR或LCVR之DNA可操作地鏈接至編碼重鏈或輕鏈恆定區之另一DNA分子一分別形成重鏈或輕鏈來轉化為全長重鏈基因。業內已知人類以及其他哺乳動物重鏈恆定區基因之序列。可(例如)藉由標準PCR擴增獲得涵蓋該等區之DNA片段。
本發明之多核苷酸可在將序列可操作地鏈接至表現控制序列之後表現於宿主細胞中。表現載體通常可在宿主生物體中作為游離基因體或作為宿主染色體DNA之組成部分而複製。通常，表現載體將含有選擇標幟物(例如四環素(tetracycline)、新黴素(neomycin)及二氫葉酸還原酶)以使得可檢測彼等經期望DNA序列轉變之細胞。含有所關注多核苷酸序列(例如，編碼抗體之多肽之多核苷酸及表現控制序列)之載體可藉由熟知方法轉移至宿主細胞中，該等方法端視細胞宿主之類型而變化。
本揭示內容之抗體可易於在哺乳動物細胞中產生，哺乳動物細胞之非限制性實例包括CHO、NS0、HEK293或COS細胞。宿主細胞係使用此項技術熟知之技術培養。抗體之哺乳動物表現通常導致醣基化。抗體之醣基化通常係N-鏈接或O-鏈接。N-鏈接醣基化係指碳水化合物部分連接至天冬醯胺殘基之側鏈。O-鏈接醣基化係指糖(例如N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖)連接至羥基胺基酸。通常，醣基化發生於抗體之Fc區中之高度保守之N-醣基化位點處(例如，IgG1中之位置297，根據IMGT或EU索引編號)。醣基化位點可經改質以改變醣基化(例如阻斷或減少醣基化或改變胺基酸序列以產生額外或不同醣基化)。
來自IgG子類之抗體之哺乳動物表現可導致自一或兩條重鏈剪下C-末端胺基酸；例如，對於IgG1抗體，可去除一或兩個C末端胺基酸。對於IgG1抗體，若存在C-末端離胺酸，則其可在表現期間自重鏈截斷或剪掉。另外，倒數第二個甘胺酸亦可自重鏈截斷或剪掉。
抗體之哺乳動物表現亦可導致N-末端胺基酸之改質。舉例而言，在重鏈或輕鏈之N-末端大多數胺基酸係麩醯胺酸之情形中，其可改質為焦麩胺酸。
本揭示內容之抗體或包含其之醫藥組合物可藉由非經腸途徑投與，非經腸途徑之非限制性實例係皮下投與及靜脈內投與。本揭示內容之抗體可與醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑以單一或多個劑量投與給患者。本揭示內容之醫藥組合物可藉由此項技術熟知之方法製備(例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第22版(2012), A. Loyd等人，Pharmaceutical Press)且包括如本文所揭示之抗體及一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
本揭示內容之抗體實施例的用途：根據一些實施例，本揭示內容之抗表皮調節素抗體可用於治療疼痛病症。如本文所用，術語「疼痛病症(pain disorder, pain disorders)」係指由過度及/或慢性疼痛狀況引起之不期望病況，其中表皮調節素抑制導致更多恆定及更少病理性疼痛狀態。本文所述欲考慮藉由本揭示內容之抗體治療之實例性疼痛病症包括慢性疼痛，包括傷害感受性、神經病性及混合性疼痛，且特別地治療特定地呈慢性疼痛狀態之骨關節炎疼痛、或糖尿病周圍神經病變疼痛或下背疼痛及化學療法引起之周圍神經病變。
根據本發明之其他實施例，抗表皮調節素抗體可用於表皮調節素介導之疼痛病症之診斷應用。在一些實施例中，疼痛病症係骨關節炎(OA)疼痛、或糖尿病周圍神經病變性疼痛(DPNP)或慢性下背疼痛(CLBP)中之至少一者。在一些更特定實施例中，疼痛病症係骨關節炎(OA)。
本發明進一步提供包含本發明之單株抗體及一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之醫藥組合物。此外，本揭示內容提供治療疼痛病症(例如骨關節炎疼痛、或糖尿病周圍神經病變疼痛或慢性下背疼痛)之方法，其包含向需要其之患者投與本揭示內容之醫藥組合物。
另外，本揭示內容提供治療表皮調節素介導之疾病之方法。更具體而言，本發明提供治療慢性疼痛病症(例如骨關節炎疼痛、或糖尿病周圍神經病變疼痛或慢性下背疼痛)之方法，其包含向需要其之患者投與有效量之本揭示內容之抗表皮調節素抗體。
本揭示內容亦提供本揭示內容之抗表皮調節素抗體，其用於療法中。更具體而言，本揭示內容提供本揭示內容之抗表皮調節素抗體，其用於治療慢性疼痛病症，例如骨關節炎疼痛、或糖尿病周圍神經病變疼痛或慢性下背疼痛。
在某些實施例中，本揭示內容提供本揭示內容之抗表皮調節素抗體或其組合物在製造藥劑中之用途，該藥劑用於治療一或多種慢性疼痛病症，例如骨關節炎疼痛、或糖尿病周圍神經病變疼痛或慢性下背疼痛。
本揭示內容之抗體可用於鑑別慢性疼痛病症，其中表皮調節素可促成病症之發病機制。在其他實施例中，本揭示內容提供治療患者之慢性疼痛病症之方法。該等方法包含以下步驟：使患者試樣與抗表皮調節素抗體接觸，及檢測該患者試樣中之人類表皮調節素與抗體間之結合；及當患者試樣中表皮調節素之存在檢測為高於在未患病個體中所觀察之參照值時，將患者診斷為具有表皮調節素介導之病症；處於表皮調節素介導之病症之風險下；需要治療表皮調節素介導之病症；及/或處於表皮調節素介導之病症相關症狀之風險下。根據本文所提供治療方法之一些更特定實施例，該等方法進一步包括測定參照值之步驟，該等步驟包括以下之其他步驟：使對照標準物與第一抗體接觸，該第一抗體結合與接觸患者試樣所用相同之表皮調節素之第一表位區；使對照標準物與第二抗體接觸，該第二抗體具有可檢測標記且結合與接觸患者試樣所用相同之表皮調節素之第二表位區；及檢測由可檢測信號提供之信號。在一些具體實施例中，抗表皮調節素抗體包含表1中所提供LC及HC CDR之組合。在其他實施例中，第二抗體包含表1中所提供LCVR及HCVR之組合。在某些實施例中，慢性疼痛病症係骨關節炎疼痛、或糖尿病周圍神經病變疼痛或慢性下背疼痛中之一者。在一些實施例中，患者試樣係CSF、血液、血清、組織溶解產物或血漿。根據一些實施例，方法進一步包括以下步驟：使患者試樣與第二抗表皮調節素抗體接觸，該第二抗表皮調節素抗體結合表皮調節素之第二表位區且具有可檢測標記；及檢測由可檢測信號提供之信號。在其他實施例中，第二抗體包含表1中所提供LC及HC CDR之組合。在其他實施例中，第二抗體包含表1中所提供LCVR及HCVR之組合。根據某些實施例，第一及第二抗表皮調節素抗體不屬於同一分倉。
根據一些實施例，本揭示內容提供檢測患者試樣中之表皮調節素之方法，其包含以下步驟：使患者試樣與結合表皮調節素之第一表位區之第一抗體接觸；使患者試樣與結合表皮調節素之第二表位區且具有可檢測標記之第二抗體；及檢測由該可檢測標記提供之信號。在一些實施例中，患者試樣係血液、血清、組織溶解產物或血漿中之一者。根據一些更特定實施例，表皮調節素之第一表位區與表皮調節素之第二表位區部分地重疊。此外，在一些實施例中，與第一及第二抗體接觸之該等步驟係同時發生。在一些具體實施例中，第一抗體包含表1中所提供LC及HC CDR之組合。在其他實施例中，第一抗體包含表1中所提供LCVR及HCVR之組合。
根據本揭示內容之一些實施例，提供量化患者試樣中之表皮調節素之方法。該方法包括以下步驟：使患者試樣與結合表皮調節素之第一表位區之第一抗體接觸；使患者試樣與結合表皮調節素之第二表位區且具有可檢測標記之第二抗體接觸；及檢測由該可檢測標記提供之信號；使對照標準物與第一抗體接觸，該第一抗體結合表皮調節素(如接觸患者試樣中所用)之相同第一表位區；使對照標準物與第二抗體接觸，該第二抗體結合表皮調節素(如接觸患者試樣中所用)之相同第二表位區且具有可檢測標記；及檢測由該可檢測信號提供之信號。在一些實施例中，患者試樣係血液、血清或血漿、或組織溶解產物中之一者。根據一些更特定實施例，表皮調節素之第一表位區與表皮調節素之第二表位區部分地重疊。此外，在一些實施例中，與第一及第二抗體接觸之該等步驟係同時發生。在一些具體實施例中，第一抗體包含表1中所提供LC及HC CDR之組合。在其他實施例中，第一抗體包含表1中所提供LCVR及HCVR之組合。在一些具體實施例中，第二抗體包含表1中所提供LC及HC CDR之組合。在其他實施例中，第二抗體包含表1中所提供LCVR及HCVR之組合。
根據一些實施例，提供診斷表皮調節素介導之疾病或病症之方法。該方法包含以下步驟：使患者試樣與抗表皮調節素抗體接觸及檢測患者試樣中之表皮調節素與抗體之間之結合。根據一些特定實施例，診斷方法包括當患者試樣中表皮調節素之存在檢測為高於參照值時，將患者診斷為患有表皮調節素介導之病症；處於表皮調節素介導之病症之風險下；需要治療表皮調節素介導之病症；及/或處於表皮調節素介導之病症相關症狀之風險下。根據一些更特定實施例，該等方法進一步包括測定參照值之步驟，該等步驟包括以下步驟：使對照標準物與第一抗體接觸，該第一抗體結合與接觸患者試樣所用相同之表皮調節素之第一表位區；使對照標準物與第二抗體接觸，該第二抗體具有可檢測標記且結合與接觸患者試樣所用相同之表皮調節素之第二表位區；及檢測由可檢測信號提供之信號。在一些實施例中，第一抗體包含表1中所提供LC及HC CDR之組合。在其他實施例中，抗體包含表1中所提供LCVR及HCVR之組合。本文所提供之診斷表皮調節素介導疾病之方法的一些實施例進一步包括以下步驟：使患者試樣與第二抗表皮調節素抗體接觸，該第二抗表皮調節素抗體結合表皮調節素之第二表位區且具有可檢測標記；及檢測由可檢測標記提供之信號。在一些具體實施例中，抗表皮調節素抗體包含表1中所提供LC及HC CDR之組合。在其他實施例中，抗體包含表1中所提供LCVR及HCVR之組合。根據特定實施例，表皮調節素之第一表位區與表皮調節素之第二表位區部分地重疊。根據某些實施例，第一及第二抗體不屬於同一分倉。根據其他實施例，參照值係自健康志願者血漿、體液或組織溶解產物建立，及/或如由熟習此項技術者針對適當參考組及試樣源所測定。在其他實施例中，疼痛病症係骨關節炎疼痛、或糖尿病周圍神經病變疼痛或慢性下背疼痛中之一者。
在實施例中，本揭示內容提供測定體液試樣中人類表皮調節素含量之方法，其包含：(a) 使體液試樣與抗人類表皮調節素診斷單株抗體或其抗原結合片段接觸，該抗體或其抗原結合片段特異性結合至包含如SEQ ID NO: 21中之胺基酸序列之人類表皮調節素，其中該抗體或其抗原結合片段包含：分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 10之輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2及LCDR3，及分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6及SEQ ID NO: 7之重鏈互補決定區HCDR1、HCDR2及HCDR3；(b) 視情況去除任何非特異性結合單株抗體或其抗原結合片段；及(c) 檢測及/或量化特異性結合至人類表皮調節素之單株抗體或其抗原結合片段之量。較佳地，其中該體液試樣係血液、血清或血漿試樣或腦脊髓液試樣，且該接觸係離體發生。
在本揭示內容之實施例中，患者係已診斷為罹患諸如本文所述疾病或病症之醫學風險、病況或病症而需要利用本文所述抗體治療的人。在這些可藉由本發明方法治療之病症藉由已建立及接受之分類已知之彼等情況中(例如骨關節炎疼痛、或糖尿病周圍神經病變疼痛或慢性下背疼痛)，其分類可在各種熟知的醫學文本中找到。舉例而言，第5版精神疾病診斷與統計手冊(DSM-5)或相似文本提供用於鑑別本文所述之某些病症之診斷工具(亦參見例如Scholz等人，The IASP classification of chronic pain for ICD-11: chronic neuropathic pain. Pain. 2019年1月；160(1): 53-59，及Treede等人，Chronic pain as a symptom or a disease: the IASP Classification of Chronic Pain for the International Classification of Diseases (ICD-11), PAIN: 2019年1月 160:19-27))。而且，國際疾病分類第十次修訂本(International Classification of Diseases, Tenth Revision； ICD-10)提供本文所述某些病症之分類。熟習此項技術者應認識到，對本文所述疾病及病症(包括彼等如DMS-5及ICD-10或ICD-11中所述者)存在替代術語、疾病分類學及分類系統，且術語及分類系統隨著醫學科學進步而演變。
術語「治療(treating, treat, treatment)」意欲指以下所有過程：其中可能減緩、中斷、阻止、控制、緩和、停止、減少或逆轉本文所述之現有症狀、病症、病況或疾病之進展或嚴重性，但不一定係指完全消除所有病症或疾病症狀。治療包括投與蛋白質或核酸或載體組合物用於治療患者、特定地人類中之疾病、病症或病況。治療包括投與本揭示內容之抗體用於治療人類之將受益於表皮調節素活性降低之疾病或病症，且包括其中該治療提供：(a) 抑制疾病之進一步進展，即，阻止其發展；(b) 減輕疾病，即，使疾病或病症消退或緩和其症狀或併發症；及/或(c) 防止疾病症狀之發作。如本文所定義，治療明確地包括降低疼痛之發生率、改善疼痛或疼痛之一或多種症狀、緩解疼痛或疼痛之一或多種症狀、延遲疼痛之發展。在一些情形中，治療亦包括治療疼痛，但不一定改變引起疼痛之潛在疾病或病況。如本文所用，「療法抗性疼痛」定義為兩種或以上先前單一療法及/或雙重療法治療方案之難治性疼痛。
如本文所用，「降低疼痛之發生率」意指減少持續時間及/或疼痛之頻率中之任一者(包括例如延遲或增加個體中出現疼痛症狀之時間)。如熟習此項技術者所瞭解，個體可能在他們對治療反應方面有所不同。疼痛之治療亦包括降低疼痛之嚴重程度以及減少對通常用於此病況之其他藥物及/或療法(包括例如鴉片劑)之需求及/或量(例如對其之暴露)。「改善」疼痛或疼痛之一或多種症狀(例如，骨關節炎疼痛)意指與未投與本揭示內容之抗體或組合物相比，減輕或改進疼痛之一或多種症狀。「改善」亦包括縮短或減少症狀之持續時間。「緩解」疼痛或疼痛之一或多種症狀(例如骨關節炎疼痛)意指減輕利用本揭示內容之抗體或組合物治療之個體或個體群體中疼痛之一或多種不期望臨床表現之程度。如本文所用，「延遲」疼痛之發展意味著推遲、阻礙、減緩、延緩、穩定及/或延後疼痛(例如骨關節炎疼痛)之進展。此一延遲可能具有不同時間長度，此取決於疾病之歷史和/或所治療之個體。如對於熟習此項技術者顯而易見，足夠或顯著延遲可實際上涵蓋預防，此乃因個體不會發展疼痛。與不使用該方法相比，「延遲」症狀發展之方法可為在既定時間框架內降低發展症狀之機率及/或降低在既定時間框架內症狀之程度的方法。該等比較通常係基於臨床研究，使用統計上顯著之受試者數量。
「有效量」意指本揭示內容之抗人類表皮調節素抗體或包含此一抗體之醫藥組合物將引發醫療健康專業人員所尋求之組織、系統或人類之生物或醫療反應或期望治療效應之量。如本文所用，術語患者之「有效反應」或患者對治療之反應性係指在投與本揭示內容之抗體時給予患者之臨床或治療益處。抗體之有效量可根據諸如以下之因素而變：疾病狀態、個體之年齡、性別及體重以及抗體在個體內引起期望反應之能力。該期望反應包括以下中之任一或多者：降低慢性疼痛之位準；或改良疼痛病症之跡象或症狀。有效量可藉由熟習此項技術者使用已知技術且藉由觀察在類似情形下獲得之結構容易地確定。有效量之本揭示內容之抗人類表皮調節素抗體可以單一劑量或多個劑量投與。此外，有效量之本發明抗體可以將小於在不投與多於一次之情形中之有效量之量的多個劑量投與。在測定患者之有效量中，主診醫師考慮多種因素，包括(但不限於)：患者之大小(例如，體重或質量)、體表面積、年齡及總體健康情況；所涉及之特定疾病或病症；疾病或病症之程度或參與程度或嚴重程度；個別患者之反應；所投與之特定化合物；投與模式；所投與製劑之生物利用度特徵；所選劑量方案；伴隨藥物之使用；及開業醫師已知之其他相關情形。劑量(包括但不限於皮下、肌內及/或靜脈內)可為約0.5 mg/kg至約50 mg/kg。然而，亦設想低於或高於本文所提及劑量之劑量，尤其慮及熟習此項技術者已知及/或本文所述之劑量考慮因素。所治療患者之進展可藉由定期評價來監測，並在必要時相應地調整劑量。
本文所揭示方法之潛在優點係在患有慢性疼痛病症之患者中產生顯著及/或延長之緩解之可能性，或具有可接受之安全性概況，包括可接受之耐受性、毒性及/或不良事件(包括抗藥物抗體反應)，以使患者整體上自治療方法受益。更特定地，本揭示內容之抗體將提供有效治療，同時避免臨床不期望之不良事件，例如皮疹(Li T, Perez-Soler R. Skin toxicities associated with epidermal growth factor receptor inhibitors. Target Oncol. 2009 Apr；4(2):107-19)及或抗楊武抗體反應。本揭示內容之治療效能可藉由常用於評估各種疼痛病症之治療的各種終點來量測。可視情況採用測定本揭示內容之任何特定療法之效能的其他方法，包括例如熟習此項技術者已知之評價。
實例提供以下實例以說明而非限制所主張之發明。以下分析之結果展示，本揭示內容之例示性單株抗體及/或其抗原結合片段結合及/或中和人類表皮調節素且因此可用於治療本文所述之表皮調節素介導之病症。
實例 1 ：抗體生成、表現及純化藉由利用重組EREG (人類及食蟹猴)免疫人類化小鼠獲得一組人類抗表皮調節素抗體，以鑑別可有效中和表皮調節素信號傳導之抗體。將突變系統地引入每一抗體之個別互補決定區(CDR)中，且所得庫利用降低之抗原濃度、減少之抗原締合時間及/或增加之解離時間段經歷多輪選擇，以分離具有經改良親和力之純系。確定個別變體之序列並用於構築組合庫，該庫經受更嚴格之額外一輪選擇，以鑑別個別CDR區之間之加性或協同突變對。對個別組合純系進行定序並確定結合特徵。此篩選可針對人類或小鼠表皮調節素實施以增加對一或多種所選物種之親和力(例如針對人類表皮調節素之抗體1)。可針對其他EGFR配體進行反篩選以在工程化後維持選擇性。所選抗體亦可經誘變以固定轉譯後修飾(例如，甲硫胺酸氧化)，同時維持對表皮調節素之結合親和力。另外，可對抗體進行框架(FW)及CDR取代，以將該等序列恢復至其種系狀態，以降低潛在的免疫原性風險。
獲得在本文中稱為抗體1之工程化及/或最佳化抗表皮調節素抗體，該等抗體具有重鏈及輕鏈之可變區的胺基酸序列及完整的重鏈及輕鏈胺基酸序列，以及編碼其之核苷酸序列，如在下文標題為「胺基酸及核苷酸序列之列表」之部分中所列示。對應於該等序列之SEQ ID NO以及輕鏈及重鏈CDR胺基酸序列顯示於表1中。
表現及純化 ：本揭示內容之例示性抗表皮調節素抗體可基本上如下所述表現及純化。抗體1表現於適當宿主細胞(例如HEK293或CHO)中，該宿主細胞利用分泌抗體1之表現系統使用最佳預定HC:LC載體比率或編碼HC及LC二者之單一載體系統瞬時或穩定轉染。表現質體含有抗體1之LC及HC基因的cDNA型式(例如，編碼表1中所示例示性抗體1之HC之SEQ ID NO:11的DNA序列及編碼表1之LC胺基酸序列的DNA序列，例如編碼表1中所示例示性抗體1之LC之SEQ ID NO:12的DNA序列)；且係自用於此目的之常用且適宜構築體表現，例如基於人類巨細胞病毒主要立即早期啟動子之構築體。
本發明之抗體已分泌於其中之培養基可藉由習用技術純化，例如離子交換與疏水相互作用層析之混合模式方法。舉例而言，培養基可使用習用方法施加至蛋白質A或G管柱並自其溶析；亦可使用離子交換與疏水相互作用層析之混合模式方法。可溶性聚集體及多聚體可藉由常用技術有效移除，該等技術包括粒徑篩析、疏水相互作用、離子交換或羥磷灰石層析。產物可立即在(例如) -70℃下冷凍，冷藏，或可將其凍乾。可採用蛋白質純化之各種方法，且該等方法為業內已知且闡述於例如Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990)及Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 第3版, Springer, NY (1994)。抗體1可立即在-70℃下冷凍或在2-8℃下儲存數月，或可以凍乾或保藏在4℃下以供立即使用。本發明之例示性人類抗體之胺基酸SEQ ID NO顯示於表1中。
實例 2 ：抗表皮調節素抗體之表徵表皮調節素試劑係作為融合蛋白製得，裂解並純化。裂解之表皮調節素係成熟可溶形式，其相對於天然形式包括額外胺基酸且用於活體外結合及中和分析(SEQ ID NO: 22-25)。人類表皮調節素(EREG)融合物(SEQ ID NO: 27)亦用於結合分析(捕獲試劑)，且全長表皮調節素序列(SEQ ID NO: 26)用於基於細胞之結合及效應物功能分析，該序列具有單一突變以減少脫落。
成熟、可溶性表皮調節素係在瞬時轉染之CHO細胞培養中在單體人類IgG4 Fc (F405Q/Y407E) (SEQ ID NO: 27)上表現為HRV3C蛋白酶可裂解C-末端融合物。利用蛋白質A親和管柱捕獲融合蛋白並進一步藉由粒徑篩析層析純化。利用HRV3C蛋白酶裂解融合物，流動穿過蛋白質A親和管柱以去除Mono Fc，並進一步藉由粒徑篩析層析純化，獲得成熟、可溶性表皮調節素。
抗原之序列：裂解之人類表皮調節素(SEQ ID NO: 22) GPGVSITKCSSDMNGYCLHGQCIYLVDMSQNYCRCEVGYTGVRCEHFFLG 裂解之食蟹猴表皮調節素(SEQ ID NO: 23) GPGVSITKCNSDMNGYCLHGQCIYLVDMSQNYCRCEVGYTGVRCEHFYLG 裂解之大鼠表皮調節素(SEQ ID NO: 24) GPGVLITKCSSDMDGYCLHGHCIYLVDMSEKYCRCEVGYTGLRCEHFFLG 裂解之兔表皮調節素(SEQ ID NO: 25) GPGVSITKCGSDMNGYCLHGQCIYLVDMSENYCRCEVGYTGVRCEHFFLG 全長人類表皮調節素(膜與T111P突變結合) (SEQ ID NO: 26) MTAGRRMEMLCAGRVPALLLCLGFHLLQAVLSTTVIPSCIPGESSDNCTALVQTEDNPRVAQVSITKCSSDMNGYCLHGQCIYLVDMSQNYCRCEVGYTGVRCEHFFLTVPQPLSKEYVALTVILIILFLITVVGSTYYFCRWYRNRKSKEPKKEYERVTSGDPELPQV Mono Fc人類表皮調節素(SEQ ID NO: 27) APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFQLESRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSLEVLFQGPGVSITKCSSDMNGYCLHGQCIYLVDMSQNYCRCEVGYTGVRCEHFFLG
來自各種物種之成熟表皮調節素之序列通常係此項技術已知的，且參照序列係例如如下：成熟、可溶性人類表皮調節素參照序列(NP_001423.1 63-108)，成熟、可溶性食蟹猴(cynomolgus monkey)(在本文中亦稱為食蟹猴(cyno))表皮調節素參照序列(XP_005555120.1 63-108)，成熟、可溶性大鼠表皮調節素參照序列(NP_067721.1 56-101)，及 成熟、可溶性兔表皮調節素參照序列(XP_008265968.1 57-102)。其他人類EGFR配體參照序列號係：人類TGFa (NP_003227.1)， EREG    (NP_001423.1)、EPGN (NP_001257918.1)、AREG (NP_001648.1)、BTC (NP_001720.1)、EGF (NP_001954.2)、HB-EGF (NP_001936.1)。
對人類表皮調節素之結合親和力抗體1對人類(SEQ ID NO: 22)、食蟹猴(SEQ ID NO: 23)、大鼠(SEQ ID NO: 24)及兔(SEQ ID NO: 25)表皮調節素之溶液相平衡結合親和力係藉由MSD溶液平衡滴定(MSD-SET)分析在37℃下量測。(例如，參見Darling RJ, Brault P-A (2005) Kinetic Exclusion Assay Technology: Characterization of Molecular Interactions. Assay and Drug Development Technologies 2:647-657。)
使用MSD SI6000儀器(Meso Scale Discovery, Rockville, MD)用於讀取MSD板。MSD分析板係如下製備。將多陣列96孔板(Meso Scale Discovery, P/N L15XA-3)在2-8℃下用30 μl之1 μg/ml Mono Fc-人類表皮調節素融合物於PBS中之溶液塗佈過夜。塗佈後，將板在PBST中洗滌3x，然後在室溫下利用在3% Blocker A (自5% Blocker A稀釋於PBS中, Meso Scale Discovery, P/N R93AA-1)中振盪封阻1小時。
SET試樣係於1% Blocker A中在pH 6.0及pH 7.4下製備。將抗體稀釋至20及200 pM (pH 7.4)或200 pM及2 nM (pH 6.0)。以約2x抗體濃度為中心將表皮調節素連續稀釋，總共12次稀釋。此係藉由使用10及100 nM (pH 7.4)或100 nM及1000 nM (pH 6.0)之起始濃度來完成，其然後10x稀釋一次，2x連續稀釋9次且然後10x稀釋用於最終稀釋。將表皮調節素滴定及固定濃度之抗體溶液1:1組合以製備SET溶液。將SET溶液在37℃下培育大約96小時，以允許結合達到平衡。
將100 μl SET溶液轉移至雙列所製備MSD板並在室溫下培育10分鐘以捕獲自由抗體。培育後，將板用PBST洗滌3X，然後將100 μl於1% Blocker A中之1 μg/ml生物素化山羊抗人類κ一級抗體(Southern Biotech, Catalog 2060-08)添加至所有孔。將此在板振盪器上在室溫下培育60分鐘。然後將板用PBST洗滌3x，然後將100 μl於1% Blocker A中之1 μg/ml SULFO鏈黴抗生物素蛋白(Meso Scale Discovery, P/N R32AD-1)添加至所有孔。將此在板振盪器上在室溫下30分鐘。然後將板用PBST洗滌3x，然後添加100 μl之1X讀取緩衝液T (自4X讀取緩衝液T稀釋於水中, Meso Scale Discovery, P/N R93AA-1)，之後讀取板。使用非線性回歸將解離常數(K D)及用於解釋未知活性抗原部分之最小公倍數(LCM)配體校正因子自MSD-SET數據整體擬合至平衡結合方程。此係在既定pH下針對每對固定抗體濃度實施。
在pH 7.4下，抗體1以14.9 pM之親和力(K D)結合至人類表皮調節素，以26.8 pM之K D結合至食蟹猴表皮調節素、以30.2 pM之K D結合至大鼠表皮調節素，及以24.0 pM之K D結合至兔表皮調節素。在pH 6.0下，抗體1以195 pM之K D結合至人類表皮調節素，以328 pM之K D結合至食蟹猴表皮調節素，以286 pM之K D結合至大鼠表皮調節素，及以330 pM之K D結合至兔表皮調節素。抗體1之pH選擇性(pH 6.0 K D/ pH 7.4 K D)對於人類表皮調節素係13.0，對於食蟹猴表皮調節素係12.2，對於大鼠表皮調節素係9.5，且對於兔表皮調節素係13.7。pH依賴性抗原結合可提供在藥物動力學及靶標中和之持續時間二者方面之改良(參見Vincent, K. J.及M. Zurini (2012). 「Current strategies in antibody engineering: Fc engineering and pH-dependent antigen binding, bispecific antibodies and antibody drug conjugates.」 Biotechnol J 7(12): 1444-1450)，且抗體1及/或本揭示內容之抗體對表皮調節素結合展現有利的pH選擇性，該等經設想以提供有用藥物動力學及表皮調節素中和性質。 表3：藉由MSD-SET在37℃下在pH 7.4及6.0下所量測抗體1對表皮調節素之活體外結合親和力。K D值係3個獨立重複之平均值± 標準偏差。
物種 pH 7.4 親和力 (pM) pH 6.0 親和力 (pM) 選擇性 (pH 6.0 K D/ pH 7.4 K D)
人類 14.9 ± 2.9 195 ± 43 13.0
食蟹猴 26.8 ± 10.3 328 ± 110 12.2
大鼠 30.2 ± 15.9 286 ± 47 9.5
兔 24.0 ± 7.3 330 ± 34 13.7
結果係報告為來自3個獨立重複之K D的平均值。誤差估計係計算為該等獨立重複之標準偏差。相對於LY3016859，抗體1在pH 7.4下對人類EREG之親和力代表大約70倍親和力改良，此可導致在活體內達成等效EREG中和所需之抗體1之劑量顯著降低。使用較低劑量抗體1之能力意味著可利用較少抗體完成必需抑制且因此該藥物產品可適於皮下投與，此與需要靜脈內給藥之抗體相比，對於可及性、耐受性、順從性係臨床上重要的。此在諸如本文所述之慢性疼痛適應症所需之長期給藥之情況下係特別有利的。
抗體 1 之配體特異性：抗體與EGF家族配體結合之特異性可藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)及/或熟習此項技術者熟知之其他常用方法進行測試。
ELISA試劑製備可如下實施。所測試配體係人類表皮素(R&D 6629-EP-025/CF)、表皮調節素((SEQ ID NO: 22)，如本文實例2中所述及/或藉由此項技術已知之方法製備及純化)、雙調蛋白(R&D 262-AR-100/CF)、β細胞素(R&D 261-CE-010/CF)、EGF (R&D 236-EG-200)、HB-EGF (R&D 259-HE-050/CF)及TGFα (R&D 239-A-100)。將配體利用10倍過量之生物素使用Thermo Pierce磺基-NHS-LC-生物素(A39257)在冰上生物素化2小時，且然後在-80℃下以小等份試樣冷凍以供個別使用。
ELISA分析可如下運行。Greiner 96孔高結合板(650061)在4℃下利用50µl/孔中性抗生物素蛋白(Thermo-Pierce 31000)以1µg/ml於PBS中塗佈過夜。第二天去除塗佈溶液並添加100μl/孔Pierce Blocker Casein (37528)，並在室溫下培育30分鐘或更長時間以封阻板。封阻後，將板用PBS加0.05% Tween20洗滌3次，以去除殘餘封阻緩衝液。將生物素化配體在單獨PCR板(Eppendorf 951020443)中以20 nM之恆定濃度跨越12孔/配體稀釋於Pierce Casein Blocker中，其中最後一列中係無抗原對照。將配體轉移至經封阻分析板並在室溫下培育1小時。將分析板用PBS加0.05% Tween20洗滌3次。欲測試抗體以5μg/mL (LY3016859)或10μg/ml (抗體1)開始在Pierce Casein Blocker中以1:3稀釋跨越板(12孔)進行連續稀釋，其中最終體積為50µl/孔並在室溫下培育1小時。將分析板用PBS加0.05% Tween20洗滌3次。以50µl/孔以於PBS加0.05% Tween20中之1:2000稀釋添加將抗人類Kappa-AP二級抗體(Southern Biotech 2060-04)並在室溫下培育1小時。將分析板用PBS加0.05% Tween20洗滌3次。最後，添加50μl pNPP受質(Sigma-Aldrich N2765)並使其顯色直至呈現足夠色彩並在405nm下在Spectramax Plus 384讀板儀上藉由Molecular Devices進行讀取。
圖1圖解說明抗體1之配體選擇性ELISA結果。抗體1展示對結合人類表皮調節素之選擇性，但未明顯結合至其他EGF家族配體表皮素、雙調蛋白、β細胞素、EGF、HB-EGF及TGFα，如在以上配體特異性ELISA中所測定。選擇性及特異性結合至表皮調節素而非其他EGF家族配體指示，抗體1可達成阻斷表皮調節素信號傳導之期望效應，同時避免結合至其他EGF家族配體(例如TGFα或其他)之臨床上不期望之效應。缺乏與TGFα之結合可降低有效抑制表皮調節素所需之劑量。此選擇性可避免已針對泛-EGFR抑制劑所觀察到之不期望臨床不良事件，例如皮疹。
物理化學屬性：關於治療性抗體產品屬性，包括化學穩定性、溶解性及黏度，抗體1展現用作人類治療劑之物理化學屬性之期望組合。
穩定性 ：抗體1之穩定性係以高濃度(大約100mg/ml)調配於5mM組胺酸(pH 6.0)加280mM甘露醇加0.05% (w/v)聚山梨醇酯-80中進行評價。將濃縮試樣在5℃及35℃下培育4週之時期。培育後，利用粒徑篩析層析(SEC)分析試樣之高分子量百分比(%HMW)，藉由毛細管電泳(CE-SDS)分析碎片化，且藉由LC-MS肽圖譜分析來分析化學改質(例如去醯胺、異構化或氧化)。在35℃下4週後，抗體1展現0.4%之∆%HMW (高分子量百分比之變化)、0.6%之∆%片段(片段百分比之變化)及大於0.5%之非CDR化學改質。
在相同調配物條件下之光穩定性係藉由40瓦特小時/m 2UV光及240 klux小時可見光之組合總曝光在25℃下進行評估。在培育後，藉由SEC分析試樣之%HMW且藉由LC-MS肽圖譜分析來分析化學改質。相對於未曝光對照，抗體1展現6.1%之藉由SEC量測之∆%HMW及大於0.7%之非CDR化學改質。
在相同調配物條件下之冷凍/解凍穩定性係使用3個重複的緩慢、受控溫度循環進行評估，該循環模擬放置於-70℃下之大體積原料藥的冷凍/解凍條件。在3個冷凍-解凍循環後，抗體1展現1.0%之藉由SEC量測之∆%HMW。
該等結果指示，抗體1具有有利的物理及化學穩定性，足以促進溶液調配物之開發及用作治療劑。
溶解度 ：溶解性係藉由利用30 kDa分子量截止離心過濾器(例如，Amicon U.C. filters, Millipore，目錄號UFC903024)將100 mg抗體1濃縮至約0.5 ml之體積來評價。試樣之最終濃度係藉由使用Solo VPE分光光度計(C Technologies, Inc)在280 nm下之UV吸光度量測。
抗體1展現在5 mM組胺酸pH 6緩衝液中大於或等於175 mg/ml且在PBS pH 7.4中大於或等於168 mg/ml之溶解度。在5℃或-5℃下儲存1週後未觀察到相分離或冷凍沈澱。該等結果指示，抗體1展現足夠溶解度以使能夠高濃度給藥。
黏度 ：抗體1及LY3016859之黏度係在15℃下以125 mg/ml之近似濃度使用VROC Initium (RheoSense)分析。抗體1在133 mg/ml下在5mM組胺酸(pH 6)加280mM甘露醇中展現6.4 cP之黏度，且LY3016859在132 mg/ml下在5mM組胺酸(pH 6)加280mM甘露醇中展現12.2 cP之黏度。該等結果指示，抗體1相對於LY3016859展現降低之黏度，且足夠低之黏度以使能夠高濃度給藥。使用較高濃度抗體1之能力與對較低劑量之需求之組合意味著，所需有效劑量可以較小體積進行遞送來完成且意味著藥物產品可適於皮下投與，此與必須為需要靜脈內給藥之抗體之藥劑相比，對於可及性、耐受性、順從性係臨床上重要的。
實例 3 ：抗人類表皮調節素抗體之活體外功能表徵 表皮調節素活體外中和：表皮調節素活性由本揭示內容之抗體(例如抗體1)之中和可藉由表皮調節素誘導之基於細胞之反應分析中之一或多者來評價，如下文所述。
在兩個獨立功能分析中測試本揭示內容之抗體中和表皮調節素活性之能力。表皮調節素活性由本揭示內容之抗體1之中和可藉由一或多個基於細胞之活性分析利用EGFR受體家族下游信號傳導路徑來評價，如下文所述。中和分析(C166-AP1-Luc及TGW-pERK)之平均半最大抑制濃度(IC 50)之測定係在SigmaPlot或GraphPad Prism中計算。在GraphPad Prism中，IC 50係藉由運行Log 10轉變之抗體濃度之非線性回歸分析來計算。對於僅在1個板上一式兩份或三份運行之分析，IC 50及標準偏差(SD)係藉由計算每一重複之IC 50及來自重複之平均IC 50之SD來確定。對於跨各個板一式兩份或一式三份分析化合物而言，IC 50係針對每一板及跨越各板測定之SD來計算。
表皮調節素誘導之反應在 C166-AP1- 螢光素酶功能分析中之抑制：本揭示內容之抗體中和人類表皮調節素誘導之螢光素酶報導基因活性之能力可在由AP1活化驅動之過表現螢光素酶報導基因之C166細胞(C166-AP1-Luc)中進行評價。C166細胞係內皮源細胞系，其表現所有4種EGFR家族受體，其中EGFR係以最高位準表現。為測試抗體1活性，使C166-AP1-Luc細胞於生長培養基[DMEM (Gibco 12430-047)、10% FBS (Gibco 10082147)、Anti/Anti (Gibco 15240062)及2 μg /ml Puro (1000x 2mg/ml嘌呤黴素二鹽酸鹽(Calbiochem, 目錄號540411)]中生長並在0.05%胰蛋白酶-PBS中分離並以50,000個細胞/1 ml以50μl/孔在無血清培養基(沒有FBS之生長培養基)中鋪在組織培養處理之96孔板中。將細胞利用50μl之100ng/ml (16-18.5nM)最終濃度之表皮調節素(人類(SEQ ID NO: 22)、食蟹猴(SEQ ID NO: 23)、大鼠(SEQ ID NO: 24)及兔(SEQ ID NO: 25)，如本文上文所述)及連續稀釋濃度之抗體1處理6小時。在培育之後，利用100μl Promega TMOne-Glo TM螢光素酶溶液(Promega TM, Cat. # E6120)使細胞溶解3分鐘。在Perkin Elmer Wallace 1420 Victor2 TM微板讀取器上讀取發光。下表4中所示相對螢光單位(RFU)之降低反映抗體1中和所測試各種相關物種(包括人類(SEQ ID NO: 22)、食蟹猴(SEQ ID NO: 23)、大鼠(SEQ ID NO: 24)及兔(SEQ ID NO: 25))之表皮調節素活性之能力。抗體1中和人類表皮調節素之IC 50值係8.7 nM，SD 2.3，n=5個板，2-3個重複/板(表4)。跨相關物種之中和係藉由針對食蟹猴(IC 502.1 nM, SD 0.08, n=3個重複)、大鼠(IC 502.5 nM, SD 0.27, n=3個重複)、兔(IC 503.6 nM, SD 0.14, n=3個重複)進行測試來展示。與LY3016859 (WO 2012/138510之抗體1)相比，抗體1之分析驗證及降低之IC 50已與在此分析中利用LY3016859中和人類表皮調節素進行比較確認(表4)。該等研究中所用之人類、兔、食蟹猴及兔表皮調節素係如本文上文所述生成。LY3016895展示以25.9 nM之IC 50(SD 11.7, n=8個板, 2-3個重複/板)中和人類表皮調節素，食蟹猴(IC 508.6 nM, SD 0.27, n=2個板, 2-3個重複/板)、大鼠(IC 50720 nM, SD 10, n=2個板，2-3個重複/板)及兔(IC 5011.0 nM, SD 1.15, n=2個板, 2-3個重複/板)。表皮調節素誘導之C166-AP1-Luc分析之統計驗證確定MSR為1.24，MSR (MSR = 最小顯著性比率)之95% CI為1.15、1.43，且抗體1之功效分析為8.4 +/-1.3。此分析展示抗體1對表皮調節素誘導之功能性細胞反應之活體外中和、及抑制來自各種物種之表皮調節素之活性的能力及抗體1在活體內對表皮調節素之中和效應之潛力。 表 4 ：抗體 1 中和 C166-AP1- 螢光素酶細胞中表皮調節素誘導螢光素酶報導基因活性 .
抗體1 IC 50± SD (nM) LY3016859 IC 50± SD (nM)
人類表皮調節素 8.7 ± 2.3 25.9 ± 11.4
食蟹猴表皮調節素 2.1 ± 0.1 8.6 ± 0.3
大鼠表皮調節素 2.5 ± 0.3 720 ± 10
兔表皮調節素 3.6 ± 0.1 11.0 ± 1.2
對於人類表皮調節素之中和，平均值及SD係藉由對用於抗體1之5個板及用於LY3016859之8個板之重複的IC 50進行平均來確定。對於大鼠、食蟹猴及兔表皮調節素之中和，將來自每一物種之1個板之一式三份的IC 50進行平均並測定抗體1之SD。對於大鼠、食蟹猴及兔表皮調節素之中和，IC 50係對LY3016859之2個不同板的重複的IC 50進行平均產生。
表4中之數據展示，在上述基於C166-AP1-Luc細胞之分析(IC 50= 8.7 nM)中，抗體1可有效中和人類表皮調節素誘導之螢光素酶報導基因活性，其具有較LY3016895 (IC 50= 25.9 nM)低大約3倍之IC 50。表皮調節素之相關物種的交叉反應性係藉由測試對大鼠(IC 50= 2.5 nM)、食蟹猴(IC 50= 2.1 nM)及兔(IC 50= 3.6 nM)表皮調節素之中和來證實。該等數據支持抗體1中和人類表皮調節素介導之信號傳導及治療其中表皮調節素介導之信號傳導促成發病機制之人類疾病(例如疼痛病症，且特別地OA、DPNP及CLBP)之能力。
在 C166-AP1-Luc 分析中抗體 1 對於表皮調節素中和之選擇性抗體1用於中和表皮調節素之選擇性可藉由在C166-AP1-Luc分析中測試所有7種EGFR配體(表皮素、TGFα、BTC、EGF、HB-EGF、表皮調節素及雙調蛋白)之活性進一步展示(配體可係自例如R&D systems購得：表皮調節素#1195-EP-CF、β細胞素#261-CE-CF、EGF #236-EG-CF、TGFα #239-A-CF、HB-EGF #259-HE-CF、表皮素#6629-EP-CF及雙調蛋白#262-AR-CF)。該等7種EGFR配體展示AP1活化，其中螢光素酶活性增加2-5倍，此取決於配體。EGFR配體之EC 50係藉由在C166-AP1-Luc細胞系中運行每一配體之劑量反應來確定，如本文上文所述。用於刺激之配體濃度係藉由使用每一配體之EC 50-EC 80來確定(β細胞素0.8nM、EGF 1.3nM、TGFα、2.5nM、HB-EGF 0.52nM、表皮調節素16nM、表皮素333nM及雙調蛋白181nM，表皮素及雙調蛋白由於曲線上沒有平臺期而估計為EC50)。抗體1展示以8.7 nM之IC 50中和C166-AP1-Luc細胞中表皮調節素誘導之螢光素酶活性之能力，且與此相比，在C166-AP1-Luc分析未能展示β細胞素、EGF、TGFα、HB-EGF、表皮素或雙調蛋白誘導之螢光素酶活性之抑制(參見下表5)。表5中之數據亦支持抗體1之藥理學選擇性，此乃因其特異性中和表皮調節素之活性，但不中和其他家族成員β細胞素、EGF、TGFα、HB-EGF、表皮素及雙調蛋白。此選擇性係重要的，此乃因預計抗體1選擇性地干預表皮調節素反應，且因此避免將由可能阻斷其他EGFR配體之特異性較低藥劑(例如LY3016859)引起之可能的不良效應。 表5：在C166-AP1-Luc分析中抗體1中和表皮調節素之特異性。在C166-AP-Luc分析中，所有7種EGFR配體均經測試用於EC 50計算。NA (無活性)指示缺乏用於確定IC 50之抑制曲線，且因此在所測試抗體之最高濃度200 nM下缺乏中和作用。對於表皮調節素中和，IC 50係使用表皮調節素試劑(SEQ ID NO. 22)計算。
配體 EC 50nM 抗體1 IC 50nM
β細胞素 0.8 NA
EGF 1.3 NA
TGFα 2.5 NA
HB-EGF 0.13 NA
表皮調節素 7.8 8.7
表皮素 429 NA
雙調蛋白 42.9 NA
抗體 1 在 TGW 神經胚細胞瘤細胞系中中和表皮調節素誘導之反應的能力：表皮調節素中和藉由在TGW神經胚細胞瘤細胞系中量測表皮調節素誘導之ERK磷酸化進一步評價。TGW細胞表現所有4種EGFR家族受體，其中EGFR表現係最高位準。在此分析中，TGW細胞在膠原1塗佈之板上在生長培養基[高葡萄糖且具有NAPYR之DMEM (Gibco #11995-065)、1X NEAA (Gibco #11140-050)、Glutamax (Gibco #35050-061)及1X Anti-Anti (Gibco #15240-062)]中生長。將細胞在0.05%胰蛋白酶-PBS中分離並以100,000個細胞/100μl在96孔膠原1塗佈之96孔板(Corning #354407)中鋪於無血清培養基(用0.1%BSA代替FBS之生長培養基)中。在TGW細胞中，與未經刺激之細胞相比，表皮調節素處理(80ng/ml達5分鐘)引起ERK (Meso Scale Diagnostics, LLC phospho-ERK1/2 Whole Cell Lysate Kit #K151DWD)磷酸化增加超過5倍。磷酸化ERK活化係藉由化學發光誘導測定且展示為相對螢光單位(RFU)。抗體1之中和係藉由將人類表皮調節素與連續稀釋之抗體1一起培育20分鐘、然後刺激細胞來測定。數據係藉由在Meso Scale Diagnostics SECTOR成像器上讀取板來獲得。利用抗體1處理之表皮調節素誘導之磷光體-ERK1/2信號之降低顯示於表6中且反映抗體1中和人類表皮調節素之能力。抗體1在中和TGW細胞之人類表皮調節素誘導之pERK誘導中之IC 50值為3.4 nM, SD 0.7, (n = 2個重複)，其低於其中IC 50為14.6 nM, SD 0.7, (n = 2個重複)之LY3016859。表6中之數據提供抗體1阻斷TGW細胞中人類表皮調節素誘導之磷光體-ERK1/2活化之能力的證據。此數據利用兩種不同細胞系與獨立讀數展示本揭示內容之抗體且特別地抗體1中和人類表皮調節素之能力，且支持該等抗體在治療表皮調節素介導之病症(例如，慢性疼痛病症)中之治療用途。 表 6 ：抗體 1 在 TGW 細胞中中和人類表皮調節素誘導之磷酸化 ERK 誘導之效應。
抗體1 IC 50± SD (nM) LY3016859 IC 50± SD (nM)
人類表皮調節素 3.4 ± 0.7 14.6 ± 0.7
實例 4 ：表皮調節素在 CD-1 小鼠之誘導觸覺觸摸痛中之活體內功能性表徵生物活性分子表皮調節素及TGFα誘導觸覺觸摸痛之能力可在雄性CD-1小鼠中在足底注射後評價。實驗前，使小鼠在溫度及光照控制之動物設施中自由取水及食物以適應至少7天之時期。在測試當天，使動物進入測試室，在飼養籠中適應20分鐘，然後將其置於高架金屬網地板上之透明塑膠室中並使其適應1小時。機械刺激之縮爪反應係藉由使用穿過金屬網地板中之開口自籠下方施加至後爪之蹠面的校準von Frey細絲來測定。量測係藉由在上-下測試範式中使用von Frey細絲來完成。八級細絲之力值範圍係0.04 g至6 g。量測並計算縮爪臨限值。動物係基於縮爪臨限值之基線值隨機化至各給藥組，即PBS、表皮調節素30 ng、表皮調節素300 ng、TGFα 30 ng或TGFα 300 ng (如本文所述製備之鼠類表皮調節素(SEQ ID NO: 28)及鼠類TGFα (SEQ ID NO: 29)試劑，或對於TGFα，經His標記並藉由標準層析技術(固定化金屬離子親和層析或IMAC，隨後粒徑篩析層析或SEC)純化。然後，動物接受20 µl PBS溶液、或新鮮經稀釋表皮調節素或TGFα之後爪足底注射。縮爪臨限值係在注射後2小時及4小時時間點評價。數據顯示於下表7中。 表 7 ：
   縮爪臨限值(g) 平均值± SEM (n)
基線 2小時 4小時
媒劑 2.55 ± 0.50 (10) 2.34 ± 0.36 (10) 2.27 ± 0.49 (10)
30 ng表皮調節素 2.58 ± 0.46 (10) 1.91 ± 0.32 (10) 1.56 ± 0.34 (10)
300 ng表皮調節素 2.58 ± 0.47 (10) 1.05 ± 0.49 (10) 1.32 ± 0.47 (10)
30 ng TGFα 2.57 ± 0.49 (10) 2.50 ± 0.52 (10) 3.13 ± 0.50 (10)
300 ng TGFα 2.61 ± 0.50 (10) 2.67 ± 0.53 (10) 2.40 ± 0.63 (10)
表皮調節素與TGFα相比之效應顯示於上表7中，且指示在此疼痛模型中，表皮調節素引起疼痛反應，如由縮回臨限值之減小所指示，而TGFα不引起反應。與識別表皮調節素及TGFα二者之LY3016859，據信抗體1體現更具選擇性及特異性疼痛治療，且缺少TGFα與本揭示內容之抗體1的結合認為關於避免脫靶效應、降低免疫原性及改良或降低治療用途可需要之劑量係有利的。
實例 5 ：抗體 1 免疫原性潛力之表徵抗體1在幾個綜合方面是經改良的治療性抗體，包括對人類表皮調節素之親和力增強、相對於其他EGFR配體對表皮調節素具有經改良之特異性，且與LY3016859相比，具有經改良之生物物理性質及全人類序列，後者被認為提高降低之免疫原性潛力，如由以下發現所支持。
樹突細胞 (DC) 內化分析 單核球源 DC 培養 (MDDC)CD14+單核球係自周圍血液單核細胞(PBMC)分離並根據標準方案培養並分化為DC。簡言之，PBMC係使用密度梯度離心利用聚蔗糖(Ficoll)(#17-1440-02, GE Healthcare)及Sepmate 50 (#15450, STEMCELL Technologies)自LRS-WBC分離。CD14+單核球係使用陽性選擇利用CD14+微珠套組(#130-050-201, Miltenyi Biotec)按照製造商手冊進行分離。然後將細胞以1百萬/ml與1000單位/ml GM-CSF及600單位/ml IL-4一起培養6天，以在RPMI培養基中驅動不成熟樹突細胞(MDDC)，該RPMI培養基具有L-麩醯胺酸及25 mM HEPES且補充有10% FBS、1 mM丙酮酸鈉、1× 青黴素-鏈黴素、1× 非必需胺基酸及55 μM 2-巰基乙醇(在下文中稱為完全RPMI培養基或培養基，自Life Technologies購得)。培養基在第2天及第5天更換兩次。在第6天，利用細胞刮刀輕柔地收集細胞並用於實驗。藉由顯微鏡視覺上表徵MDDC之樹突形態，且藉由流式細胞術表徵CD14、CD11c及HLA-DR之表現。其對LPS治療之回應能力係藉由使用流式細胞術量測CD80、CD83及CD86之上調來證實。
Fab-TAMRA-QSY7 之偶聯將F(ab′)2片段山羊抗人類IgG (Jackson ImmunoResearch)利用QSY7-NHS及TAMRA-SE (Molecular Probes)雙重標記以獲得Fab-TAMRA-QSY7，其用作通用探針以追蹤檢品內化。將每一小瓶之F(ab′)2 (約1 ml，1.3 mg/ml)藉由利用Amico Ultra-0.5離心過濾裝置(#UFC501096, Millipore)在14,000 rcf下離心2分鐘濃縮至約2 mg/ml。利用10% (v/v) 1 M碳酸氫鈉將pH調整至鹼性(＞ pH 8)，並添加6.8 μl於DMSO中之10 mM QSY-NHS原液並混合。將反應小瓶在黑暗中在室溫下保持30 min。中間產物Fab-QSY7係利用Zeba Spin脫鹽管柱(#89890, Thermo Scientific)藉由在1000相對離心力(RCF)下離心2 min來純化。濃度及標記程度(DOL)係藉由在NanoDrop (ThermoFisher)上量測在280 nm及560 nm下之吸光度來計算。然後Fab-QSY7藉由再次利用Amico Ultra-0.5離心過濾裝置在14,000 rcf下離心2 min濃縮至約2 mg/ml。利用10% (v/v) 1 M碳酸氫鈉調整pH之後，添加4.3 μl於DMSO中之15 mM TAMRA-SE原液並混合。在室溫下在黑暗中30 min後，使用Zeba Spin脫鹽管柱藉由在1000 rcf下離心2 min純化並收集最終產物Fab-TAMRA-QSY7。再次藉由在NanoDrop分光光度計上讀取在280 nm、555 nm及560 nm下之吸光度定量濃度及DOL。使用此方案，獲得約300 μl之約1.5 mg/ml之每F(ab′)2具有約兩個QSY7及兩個TAMRA之Fab-TAMRA-QSY7。
藉由 FACS 之標準化內化研究將個別測試分子利用PBS正規化至1 mg/ml且然後在完全RPMI培養基中進一步稀釋至8 μg/ml。將Fab-TAMRA-QSY7在完全RPMI培養基中稀釋至5.33 μg/ml。將抗體及Fab-TAMRA-QSY7以等體積混合並在4℃下在黑暗中培育30 min用於複合物形成。將MDDC以4百萬/ml重新懸浮於完全RPMI培養基中並以50 μl/孔接種於96孔圓底板中，向其中添加50 μl抗體/探針複合物。將細胞在37℃下在CO 2培育器中培育24 h。將細胞用2% FBS PBS洗滌並重新懸浮於100 μl具有Cytox Green活/死染料之2% FBS PBS。在BD LSR Fortessa X-20上收集數據並在FlowJo中進行分析。對活的單細胞進行門控，並記錄TAMRA螢光陽性細胞之百分比作為讀數。
數據顯示及統計分析將分子在三個或以上供體上一式兩份或一式三份進行測試。考慮每一供體之TAMRA陽性群體之百分比。為允許將分子與自不同供體產生之數據進行比較，使用正規化內化指數(NII)。使用以下方程式將內化信號正規化至IgG1同型(NII = 0)及內部陽性對照PC (NII  = 100)：
Figure 02_image001
其中X TAMRA、IgG1同型 TAMRA及PC TAMRA分別係測試分子X、IgG1同型及PC之TAMRA陽性群體之百分比。數據係在JMP® 14.1.0或Graphpad Prism 8.1.2中進行分析。計算並報告TAMRA陽性群體百分比之平均值及NII。抗原呈遞細胞(例如DC)中增加之內化與增加之免疫原性風險相關聯。表9中之結果展示抗體1之DC內化相對於LY3016859降低，且因此免疫原性風險降低。 表 9. DC 內化結果
測試抗體 %TAMRA+ NII
LY3016859 10.3 16.9
抗體1 2.3 1.3
(參見例如Wen, Y.、Cahya, S.、Zeng, W.等人，Development of a FRET-Based Assay for Analysis of mAbs Internalization and Processing by Dendritic Cells in Preclinical Immunogenicity Risk Assessment. AAPS J22, 68 (2020))
MAPPS 分析 (MHC 相關肽蛋白質體學 ) 方法： 來自10名正常人類供體之原代人類樹突細胞藉由分離CD-14陽性細胞自膚色血球層製備，並藉由在含有5%血清替代物之完全RPMI培養基(Thermo Fisher Scientific, cat#A2596101)中與20 ng/ml IL-4及40 ng/ml GM-CSF一起在37℃及5% CO 2下培育3天分化成不成熟樹突細胞，如所述(Knierman等人，「The Human Leukocyte Antigen Class II Immunopeptidome of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein」, Cell Reports, 33, 108454 (2020))。在第4天將3微莫耳濃度之測試抗體添加至約5 x 10 6個細胞，並在5小時培育後更換含有5 mg/ml LPS之新鮮培養基以使細胞轉變為成熟樹突細胞。第二天，使成熟細胞在1 ml具有蛋白酶抑制劑及DNAse之RIPA緩衝液中溶解。將溶解產物儲存於-80℃下，直至試樣分析。
使用自動化液體處置系統以使用生物素化抗泛HLA II類抗體(純系Tu39)自解凍之溶解產物分離HLA-II分子。將結合受體-肽複合物利用5%乙酸、0.1% TFA溶析。使經溶析MHC-II肽經過預洗滌之10k MWCO過濾器以去除高分子量蛋白質。經分離之MHC-II肽係藉由nano LC/MS使用具有Thermo LUMOS質譜儀之Thermo easy 1200 nLC-HPLC系統分析。分離使用75 µm x 7 cm YMC-ODS C18柱以250 nL/min流速且0.1%甲酸水溶液作為A溶劑及80%乙腈及0.1%甲酸作為B溶劑進行65分鐘梯度。質譜係在全掃描模式下以240,000解析度運行，隨後係包含離子阱快速掃描以及HCD及EThcD碎片化之3秒數據依賴性MS/MS循環。
肽鑑別係由內部蛋白質體學管道(Higgs等人，「Label-free LC-MS method for the identification of biomarkers」, Methods in Molecular Biology, 428, 209-230 (2008))使用多種搜尋演算法在沒有針對含有測試抗體序列之牛/人類資料庫之酶搜尋參數之情況下生成。使用KNIME工作流程來處理試樣之鑑別檔案。將自測試物品鑑別之肽與母體序列進行比對。為所有供體創建匯總，注釋展示非種系殘基之供體百分比、展示具有非種系殘基之肽之不同區域之數量以及在具有非種系殘基之每一區域處肽展示之深度。非種系肽展示程度之增加與增加之免疫原性風險有關。表8中之結果顯示，與LY3016859相比，抗體1之非種系肽展示減少，且因此抗體1之免疫原性風險降低。 表 8 ： MAPP 結果
測試抗體 供體% 簇數量 來自所有簇之非種系殘基之總數 來自所有簇之非種系肽之總數
LY3016859 60% 3 15 20
抗體1 20% 2 5 5
實例 6. 在大鼠中給藥後活體內結合至膜表皮調節素之證實 . 表皮調節素係以膜結合形式及由ADAM (A去整合素及金屬蛋白酶)蛋白酶裂解膜形式而發生之可溶形式存在。本揭示內容之抗體在周圍給藥(例如藉由皮下注射)後在活體內結合表皮調節素之膜形式的能力可藉由離體分離組織、隨後採用如本文所述及/或熟習此項技術者已知之標準免疫螢光染色方法進行評價。可利用抗體1展示大鼠舌之上皮層的陽性及特異性免疫螢光標記。
大鼠舌可自安樂死之雄性史-道二氏大鼠(Sprague Dawley rat)(體重140-215克)在不同劑量(0.1至100 mg/kg，皮下)欲測試抗體(包括抗體1，或對照或比較抗體)後且在給藥後不同時間後(給藥後3-28天)獲得，並在乾冰上急凍。將冷凍之舌組織冠狀面20微米切片解凍，在PBS中洗滌3分鐘並在4%多聚甲醛中固定10分鐘。將載玻片在超靈敏洗滌緩衝液(Super Sensitive Wash Buffer) (HK583-5K, Biogenex)中洗滌且然後用Power block (HK065-5K, Biogenex)加0.1% Triton x-100封阻10分鐘。然後將載玻片洗滌並在室溫下與Alexa Fluor 488山羊抗人類IgG (A11013, Life Technologies, 13.3 µg/ml)及具有抗體1之可變區(SEQ ID’s 3及4)及鼠類恆定區(經DyLight 650標記)之經標記之人類/小鼠IgG1嵌合體(在本文中稱為「抗體1 VR嵌合體」(SEQ ID’s 64及65))一起培育15分鐘。將載玻片洗滌3次並在蓋蓋玻片之前施加Prolong gold抗褪色試劑。利用Keyence BZ800對所有影像使用相同曝光設置來捕獲每一動物在488及650 nm波長下之螢光影像。利用ImageJ-Win64軟體藉由選取感興趣之四個隨機區來量化陽性染色上皮層內之綠色或紅色信號以獲得平均強度。綠色信號來自結合抗體1、對照抗體或參考比較抗體(活體內給藥)，且紅色信號係未結合之表皮調節素，其中檢測抗體與結合藥物競爭，且僅染色游離之表皮調節素而不結合。所得數據藉由利用Alexa Fluor 488山羊抗人類IgG信號(綠色)對剩餘抗體1 VR嵌合體信號(紅色)之比率進行正規化。
圖2顯示在以劑量 ≥ 1 mg/kg之抗體1給藥3天後，在活體內觀察到膜表皮調節素結合之顯著劑量依賴性增加。圖3顯示在10 mg/kg之單一劑量的抗體1後，膜表皮調節素在活體內之持續結合達至少14天。
圖4展示抗體1與效力低＞50x之表皮調節素結合比較抗體相比在活體內具有更高程度之膜表皮調節素結合。圖4顯示抗體1親和力之改良，亦轉化為活體內經改良之膜結合表皮調節素配體結合。
實例 7 ：抗體 1 之表位定位抗體1係人類IgG4抗體，其以高親和力選擇性結合並中和EGFR配體家族成員表皮調節素(EREG)，且對於其他EGFR配體家族成員具有選擇性及有利的表皮調節素中和活性及藥物動力學性質。該等性質連同本文所述之額外穩定性及黏度以及溶解度性質導致抗體具有經改良屬性及用以中和EREG活性之有利治療劑之組合。實施表位定位研究以確定人類EREG中用於抗體1結合及特異性所需之特定胺基酸。關鍵胺基酸係自抗體1 Fab/EREG複合物之晶體結構鑑別，並藉助誘變及結合研究進一步表徵該等胺基酸。該等胺基酸之貢獻為抗體1對EREG與其他EGFR配體家族成員相比之特異性提供結構基礎。該等結果亦說明相關臨床前物種中之交叉反應性及選擇性。
測試材料之序列提供於胺基酸及核苷酸序列之列表中並交叉引用如下：人類EREG (SEQ ID NO: 21)、抗體1 Fab HC (SEQ ID NO: 62)、抗體1 Fab LC (SEQ ID NO: 63)、Mono Fc人類EREG (SEQ ID NO: 27)、Mono Fc人類EREG E95H (SEQ ID NO: 57)、Mono Fc人類EREG E95A (SEQ ID NO: 56)、Mono Fc人類EREG H78N (SEQ ID NO: 55)、Mono Fc人類EREG H78A (SEQ ID NO: 54)、Mono Fc人類EREG F106K (SEQ ID NO: 61)、Mono Fc人類EREG F106A (SEQ ID NO: 60)、Mono Fc人類EREG Y98A (SEQ ID NO: 58)、Mono Fc人類EREG L77F (SEQ ID NO: 53)、Mono Fc人類EREG R102A (SEQ ID NO: 59)。
抗體1 Fab片段及人類EREG二者均以瞬時CHO表現產生並藉由標準技術純化。複合物係藉由將30%莫耳過量之EREG添加至抗體1 Fab中製備，且然後藉由粒徑篩析層析純化以去除過量之游離EREG。首先藉由西方墨點分析探測結合至EREG之抗體1 Fab，且顯示抗體1 Fab在此分析中可識別變性、非還原之EREG，但不能識別變性、還原之EREG。此強烈表明構形表位依賴於EREG二硫鍵。
結合至人類表皮調節素之抗體 1 之 Fab 片段之晶體結構解析結合至人類表皮調節素之抗體1之Fab片段之晶體結構。使複合物結晶且藉由分子置換使用Phaser 2.8.3解析1.8Å結構，且隨後利用Refmac 5.8.0258進行精修。在晶體中，抗體1 Fab結合於表皮調節素二聚體之相對面上。表皮調節素Leu77及His78側鏈處於表位之中心，其中Leu77包埋於疏水袋中且His78側鏈位於氫鍵網路中心。抗體1重鏈Arg50側鏈係重鏈Tyr52側鏈羥基之氫鍵供體，重鏈Tyr52側鏈羥基係去質子化His78側鏈N δ1氫鍵受體之氫鍵供體，去質子化His78側鏈N ε2係作為水分子之氫鍵供體，且此水分子係作為重鏈Leu109及輕鏈Tyr107主鏈羰基之氫供體。抗體1殘基係藉由IMGT慣例編號。額外鑑別之表位接觸包括Glu95、Tyr98、Arg102、及Phe106側鏈及Leu77、Val96以及Glu104主鏈。結構清晰地展示，抗體1表位係構形而非線性的，此證實以上西方結果。
利用抗體 1 Fab 之突變表皮調節素 ELISA藉由點誘變進一步表徵關鍵表位殘基，以瞭解其對結合及選擇性二者之相對貢獻。將Mono Fc EREG融合物(參見上文)於PBS中稀釋至1 μg/mL，並將100 μL添加至每一孔，以在5℃下過夜塗佈ELISA板(Greiner Cat# 655061)。變體在板上按行分組，其中野生型塗佈於3個重複行中且點突變體塗佈於單個重複行中。塗佈後，將板用PBST以3 x 200 μL/孔洗滌，然後在板振盪器上使用酪蛋白封阻緩衝液(Thermo Cat# 37528)在RT下封阻1小時。封阻後，將板如前所述洗滌。將抗體1 Fab片段在酪蛋白封阻緩衝液中稀釋至1 μg/mL，然後在封阻緩衝液中3x連續稀釋達總共7個濃度及封阻緩衝液空白。將Fab稀釋系列以100 μL/孔添加至準備好之ELISA板中，並在板振盪器上在RT下培育1小時。將板如前所述洗滌，然後將100 μL於封阻緩衝液中以1:8,000稀釋之山羊抗人類κ HRP二級抗體(Southern Biotech Cat# 2060-05)添加至每一孔。將板與二級抗體在板振盪器上在RT下培育1小時，然後如前所述洗滌。準備TMB受質(Thermo Cat# 34021)，並將100 μL添加至所有孔。將板在RT下靜置培育3-5分鐘，然後向所有孔中添加100 μL 1N HCl以停止反應。將板在讀板儀上在450nm下讀取。將減去空白之ELISA數據在GraphPad Prism 9中繪製，其中抗體濃度在X軸上且OD450在Y軸上。藉由使用非線性回歸將數據擬合至「Sigmoidal, 4PL, X is concentration」模型來生成曲線。
點突變體係藉由ELISA評估，其中將表皮調節素突變體塗佈於板上，添加抗體1 Fab稀釋系列，並藉由抗κ二級抗體量測信號(參見圖5)。除Y98A以外，所有突變體均顯示減少之結合。H78A幾乎敲除結合，且Y98A在所測試濃度下未展現可檢測結合。
結合至 Mono Fc 人類 EREG 突變體之抗體 1 Fab 片段之 SPR 分析使用Biacore 8K儀器及試劑(Cytiva)用於結合至兩種Mono Fc人類EREG突變體之抗體1 Fab片段之SPR分析。使用胺偶合套組(Cytiva P/N BR100050)及Biacore 8K控制軟體中之「Low Level CM5 Coupling」方法將低含量之Mono Fc人類EREG突變體固定於CM5 S系列感測器晶片(Cytiva P/N BR100530)之試樣流動槽(Fc2)中。運行緩衝液係1X HBS-EP+ pH 7.4 (自20X HBS-EP+製得, Teknova P/N H8022)或1X MBS-EP+ pH 6.0 (10mM MES + 150mM NaCl + 3mM EDTA + 0.05% Tween 20)，且運行溫度為37℃。Biacore實驗係在三個獨立實驗中進行，其中在每一獨立實驗中每一稀釋度重複單次。使用「1:1 binding」動力學模型(EREG變體)或「Steady State Affinity」模型利用Biacore Insight評估版本3.0 (Cytiva)分析減去參考、減去空白之SPR數據以確定KD值。
將抗體1 Fab於運行緩衝液中稀釋至300 nM (pH 7.4)或900nM (pH 6.0)，然後3x連續稀釋達總共7次稀釋。將Fab注入所有流動槽達240秒，隨後係50 μL/min之流速下之1800秒解離。晶片表面利用2 x 30秒以100 μL/min注入7 M胍進行再生。減去參考之數據收集為在8個通道中之每一者中以試樣流動槽減去參考流動槽(Fc2-Fc1)的形式收集，且然後將減去參考之數據減去緩衝空白。
藉由Biacore在37℃下量測突變體子集之結合親和力。結果在表9中報告為3次獨立重複量測之平均值± 標準偏差。「rel」指示相對於野生型(wt)。 表 9 ：在 pH 6.0 及 pH 7.4 下在 37℃ 下，抗體 1 對野生型及突變體 EREG 之結合親和力 .
EREG 變體 SEQ ID NO pH 7.4, 37℃ K D(pM) pH 7.4 K D 倍數變化 ( 相對於 wt) pH 6.0, 37℃ K D(pM) pH 6.0 K D 倍數變化 ( 相對於 wt) K DpH 6.0 / K DpH 7.4
wt (野生型) 27 51.8 ± 5.6 1 508 ± 6 1 9.8
L77F 53 26,500 ± 1,600 511 197,000 ± 6,000 388 7.4
H78N 55 29,300 ± 1,500 565 25,600 ± 2,200 50 0.9
E95A 56 19,600 ± 1,700 379 81,400 ± 500 160 4.2
E95H 57 7,180 ± 420 139 47,300 ± 700 93 6.6
R102A 59 177 ± 43 3 1,930 ± 140 4 10.9
F106A 60 12,500 ± 500 241 77,100 ± 3,600 152 6.2
F106K 61 54,600 ± 3,100 1,050 293,000 ± 16,000 577 5.4
表9中之結果顯示，在pH 7.4下，對R102A之3倍直至對F106K之＞1000倍之突變體的一系列較弱親和力。
人類 EGFR 配體表位對齊在EGFR配體序列對齊之情形中(圖6)，數據顯示E95及F106係EREG選擇性之關鍵表位位置。儘管100%保守之Y98及R102位置對結合甚為重要，但對選擇性沒有貢獻。L77及H78對於結合及影響選擇性亦係關鍵的，但其在EGFR配體中高度保守且因此不具有EREG特異性。該等結果不僅展示抗體1對EREG之結合及精細選擇性之結構基礎，而且亦自表位定位研究說明配體及物種選擇性。
胺基酸及核苷酸序列之列表 抗體 1 之重鏈 (SEQ ID NO: 1)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPAGKGLEWIGRIYPSGNTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGLVMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG 抗體 1 之輕鏈 (SEQ ID NO: 2)EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVEFSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYGTNPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 抗體 1 之 HCVR (SEQ ID NO: 3)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPAGKGLEWIGRIYPSGNTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGLVMDVWGQGTLVTVSS 抗體 1 之 LCVR (SEQ ID NO: 4)EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVEFSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYGTNPFTFGQGTKVEIK 抗體 1 之 HCDR1 (SEQ ID NO: 5)TVSGGSISSYYWS 抗體 1 之 HCDR2 (SEQ ID NO: 6)RIYPSGNTN 抗體 1 之 HCDR3 (SEQ ID NO: 7)ARGGLVMDV 抗體 1 之 LCDR1 (SEQ ID NO: 8)RASQSVEFSYLA 抗體 1 之 LCDR2 (SEQ ID NO: 9)YGASSRAT 抗體 1 之 LCDR3 (SEQ ID NO: 10)HQYGTNPFT 編碼抗體 1 之重鏈之 DNA (SEQ ID NO: 11)CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGTCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGTTCGTACTACTGGAGCTGGATTCGGCAGCCCGCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGAGGATCTATCCGAGTGGGAACACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGGACTGGTGATGGACGTGTGGGGACAGGGAACACTAGTGACCGTGAGTAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCCTGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAAAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGT 編碼抗體 1 之輕鏈之 DNA (SEQ ID NO: 12)GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGTCTGTGGAATTCAGCTACTTAGCCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCACCAGTACGGAACAAACCCGTTCACATTCGGGCAGGGAACCAAGGTTGAAATAAAGCGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGC 人類表皮調節素 (SEQ ID NO: 21)VSITKCSSDMNGYCLHGQCIYLVDMSQNYCRCEVGYTGVRCEHFFL 人類表皮調節素構築體 (SEQ ID NO: 22)GPGVSITKCSSDMNGYCLHGQCIYLVDMSQNYCRCEVGYTGVRCEHFFLG 食蟹猴表皮調節素 (SEQ ID NO: 23)VSITKCNSDMNGYCLHGQCIYLVDMSQNYCRCEVGYTGVRCEHFYL 大鼠表皮調節素 (SEQ ID NO: 24)VLITKCSSDMDGYCLHGHCIYLVDMSEKYCRCEVGYTGLRCEHFFL 兔表皮調節素 (SEQ ID NO: 25)VSITKCGSDMNGYCLHGQCIYLVDMSENYCRCEVGYTGVRCEHFFL 全長人類表皮調節素(膜結合，具有T111P突變) (SEQ ID NO: 26)MTAGRRMEMLCAGRVPALLLCLGFHLLQAVLSTTVIPSCIPGESSDNCTALVQTEDNPRVAQVSITKCSSDMNGYCLHGQCIYLVDMSQNYCRCEVGYTGVRCEHFFLTVPQPLSKEYVALTVILIILFLITVVGSTYYFCRWYRNRKSKEPKKEYERVTSGDPELPQV Mono Fc 人類表皮調節素 (SEQ ID NO: 27)APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFQLESRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSLEVLFQGPGVSITKCSSDMNGYCLHGQCIYLVDMSQNYCRCEVGYTGVRCEHFFLG 裂解之小鼠 EREG (SEQ ID NO: 28)GPGVQITKCSSDMDGYCLHGQCIYLVDMREKFCRCEVGYTGLRCEHFFLG 小鼠 TGFα His (SEQ ID NO: 29)VVSHFNKCPDSHTQYCFHGTCRFLVQEEKPACVCHSGYVGVRCEHADLLAGHHHHHH 抗體 1 之 HCDR1 (Kabat) (SEQ ID NO: 31)SYYWS 抗體 1 之 HCDR2 (Kabat) (SEQ ID NO: 32)RIYPSGNTNYNPSLKS 抗體 1 之 HCDR3 (Kabat) (SEQ ID NO: 33)GGLVMDV 抗體 1 之 LCDR1 (Kabat) (SEQ ID NO: 34)RASQSVEFSYLA 抗體 1 之 LCDR2 (Kabat) (SEQ ID NO: 35)GASSRAT 抗體 1 之 LCDR3 (Kabat) (SEQ ID NO: 36)HQYGTNPFT 抗體 1 之 HCDR1 (Chothia) (SEQ ID NO: 37)GGSISSY 抗體 1 之 HCDR2 (Chothia) (SEQ ID NO: 38)YPSGN 抗體 1 之 HCDR3 (Chothia) (SEQ ID NO: 39)GGLVMDV 抗體 1 之 LCDR1 (Chothia) (SEQ ID NO: 40)RASQSVEFSYLA 抗體 1 之 LCDR2 (Chothia) (SEQ ID NO: 41)GASSRAT 抗體 1 之 LCDR3 (Chothia) (SEQ ID NO: 42)HQYGTNPFT 抗體 1 之 HCDR1 (IMGT) (SEQ ID NO: 43)GGSISSYY 抗體 1 之 HCDR2 (IMGT) (SEQ ID NO: 44)IYPSGNT 抗體 1 之 HCDR3 (IMGT) (SEQ ID NO: 45)ARGGLVMDV 抗體 1 之 LCDR1 (IMGT) (SEQ ID NO: 46)QSVEFSY 抗體 1 之 LCDR2 (IMGT) (SEQ ID NO: 47)GAS 抗體 1 之 LCDR3 (IMGT) (SEQ ID NO: 48)HQYGTNPFT IgG4PAA 鉸鏈區 (SEQ ID NO: 51)ESKYGPPCPPCP IgG4PAA Fc 區 (SEQ ID NO: 52)APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG Mono Fc huEREG L77F (SEQ ID NO: 53)APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFQLESRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSLEVLFQGPGVSITKCSSDMNGYCFHGQCIYLVDMSQNYCRCEVGYTGVRCEHFFLG Mono Fc huEREG H78A (SEQ ID NO: 54)APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFQLESRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSLEVLFQGPGVSITKCSSDMNGYCLAGQCIYLVDMSQNYCRCEVGYTGVRCEHFFLG Mono Fc huEREG H78N (SEQ ID NO: 55)APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFQLESRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSLEVLFQGPGVSITKCSSDMNGYCLNGQCIYLVDMSQNYCRCEVGYTGVRCEHFFLG Mono Fc huEREG E95A (SEQ ID NO: 56)APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFQLESRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSLEVLFQGPGVSITKCSSDMNGYCLHGQCIYLVDMSQNYCRCAVGYTGVRCEHFFLG Mono Fc huEREG E95H (SEQ ID NO: 57)APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFQLESRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSLEVLFQGPGVSITKCSSDMNGYCLHGQCIYLVDMSQNYCRCHVGYTGVRCEHFFLG Mono Fc huEREG Y98A (SEQ ID NO: 58)APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFQLESRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSLEVLFQGPGVSITKCSSDMNGYCLHGQCIYLVDMSQNYCRCEVGATGVRCEHFFLG Mono Fc huEREG R102A (SEQ ID NO: 59)APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFQLESRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSLEVLFQGPGVSITKCSSDMNGYCLHGQCIYLVDMSQNYCRCEVGYTGVACEHFFLG Mono Fc huEREG F106A (SEQ ID NO: 60)APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFQLESRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSLEVLFQGPGVSITKCSSDMNGYCLHGQCIYLVDMSQNYCRCEVGYTGVRCEHAFLG Mono Fc huEREG F106K (SEQ ID NO: 61)APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFQLESRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSGGGGSLEVLFQGPGVSITKCSSDMNGYCLHGQCIYLVDMSQNYCRCEVGYTGVRCEHAKLG 抗體 1 Fab HC (SEQ ID NO: 62)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPAGKGLEWIGRIYPSGNTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGLVMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESK 抗體 1 Fab LC (SEQ ID NO: 63)EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVEFSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYGTNPFTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTQGTTSVTKSFNRGEC 抗體 1 VR 嵌合體 h/mIgG1 HC (SEQ ID NO: 64)QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPAGKGLEWIGRIYPSGNTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGLVMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK 抗體 1 VR 嵌合體 h/mΚLC (SEQ ID NO: 65)EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVEFSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQYGTNPFTFGQGTKVEIKRTVAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC 人類表皮素 /EPGN (SEQ ID NO: 66)KFSHLCLEDHNSYCINGACAFHHELEKAICRCFTGYTGERCEHLTLT 人類雙調蛋白 /AREG (SEQ ID NO: 67)KKKNPCNAEFQNFCIHGECKYIEHLEAVTCKCQQEYFGERCGEKSMK 人類肝素結合表皮生長因子 / HBEGF (SEQ ID NO: 68)KKRDPCLRKYKDFCIHGECKYVKELRAPSCICHPGYHGERCHGLSL 人類 β 細胞素 /BTC (SEQ ID NO: 69)GHFSRCPKQYKHYCIKGRCRFVVAEQTPSCVCDEGYIGARCERVDLFY 人類轉變生長因子 α/TGFa (SEQ ID NO: 70)VVSHFNDCPDSHTQFCFHGTCRFLVQEDKPACVCHSGYVGARCEHADLLA 人類表皮生長因子 /EGF (SEQ ID NO: 71)NSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKW
圖 1.顯示抗體1 (組A)及LY 3016859 (組B)之配體選擇性ELISA結果，且展示抗體1對人類表皮調節素具有選擇性，但未明顯結合至其他EGF家族配體(表皮素、雙調蛋白、β細胞素、EGF、HB-EGF及TGFα(TGFA))，如在實例2中所述之配體特異性ELISA中所測定。與此相比，LY 3016859結合至表皮調節素及TGFα二者。 圖 2.與對照hIgG抗體(實心正方形)相比，在投與抗體1 (實心圓形)後3天活體內之膜表皮調節素之結合。 圖 3.與對照hIgG抗體(空心正方形)相比，在10 mg/kg皮下劑量之抗體1 (實心正方形)後活體內膜表皮調節素之預處理時間依賴性結合。 圖 4.與效力低＞50x之表皮調節素結合比較抗體(空心圓形)相比，投與抗體1 (實心正方形)後3天活體內膜表皮調節素之結合。 圖 5.抗體1 Fab與表皮調節素之指示突變結合之ELISA評價。 圖 6.抗體1之人類EGFR配體表位(EGF樣結構域)比對。配體序列提供於胺基酸及核苷酸序列之列表中。 
<![CDATA[<110>  美商美國禮來大藥廠(Eli Lilly and Company)]]>
          <![CDATA[<120>  靶向表皮調節素(EPIREGULIN)之化合物及方法]]>
          <![CDATA[<130>  X30020]]>
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          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  441]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Ile Tyr Pro Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Gly Gly Leu Val Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 
                  115                 120                 125             
          Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 
              130                 135                 140                 
          Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 
                          165                 170                 175     
          Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 
                      180                 185                 190         
          Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 
                  195                 200                 205             
          Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys 
              210                 215                 220                 
          Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
                          245                 250                 255     
          Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 
                      260                 265                 270         
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
                  275                 280                 285             
          Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
              290                 295                 300                 
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
                          325                 330                 335     
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 
                      340                 345                 350         
          Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                  355                 360                 365             
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
              370                 375                 380                 
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 
                          405                 410                 415     
          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
                      420                 425                 430         
          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 
                  435                 440     
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  215]]>
          <![CDATA[<212>]]>  PRT
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Glu Phe Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Thr Asn Pro 
                          85                  90                  95      
          Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 
                      100                 105                 110         
          Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 
                  115                 120                 125             
          Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 
              130                 135                 140                 
          Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 
                          165                 170                 175     
          Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 
                      180                 185                 190         
          Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 
                  195                 200                 205             
          Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 215 
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  115]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Ile Tyr Pro Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Gly Gly Leu Val Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Ser Ser 
                  115 
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  108]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Glu Phe Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Thr Asn Pro 
                          85                  90                  95      
          Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105             
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  13]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser 
          1               5                   10              
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          Arg Ile Tyr Pro Ser Gly Asn Thr Asn 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          Ala Arg Gly Gly Leu Val Met Asp Val 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Arg Ala Ser Gln Ser Val Glu Phe Ser Tyr Leu Ala 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>]]>  9
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          His Gln Tyr Gly Thr Asn Pro Phe Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  1323]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          caggtgcagc tgcaggagtc gggtccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc       60
          acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt tcgtactact ggagctggat tcggcagccc      120
          gcagggaagg gactggagtg gattgggagg atctatccga gtgggaacac caactacaac      180
          ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg      240
          aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aggaggactg      300
          gtgatggacg tgtggggaca gggaacacta gtgaccgtga gtagcgcctc caccaagggc      360
          ccatcggtct tcccgctagc gccctgctcc aggagcacct ccgagagcac agccgccctg      420
          ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc      480
          ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc      540
          agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcacga agacctacac ctgcaacgta      600
          gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagagagttg agtccaaata tggtccccca      660
          tgcccaccct gcccagcacc tgaggccgcc gggggaccat cagtcttcct gttcccccca      720
          aaacccaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac      780
          gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat      840
          aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc      900
          ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac      960
          aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagag     1020
          ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg     1080
          acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga aagcaatggg     1140
          cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc     1200
          ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc     1260
          tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacacaga agagcctctc cctgtctctg     1320
          ggt                                                                   1323
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  669]]>
          <![CDATA[<212>  DN]]>A
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc       60
          ctctcctgca gggccagtca gtctgtggaa ttcagctact tagcctatgg tgcatccagc      120
          agggccactt ggtaccagca gaaacctggc caggctccca ggctcctcat ctatggtgca      180
          tccagcaggg ccactggcat cccagacagg ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc      240
          actctcacca tcagcagact ggagcctgaa gattttgcag tgtattactg tcaccagtac      300
          ggaacaaacc cgttcacatt cgggcaggga accaaggttg aaataaagcg aactgtggct      360
          gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct      420
          gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat      480
          aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc      540
          acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc      600
          tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg      660
          ggagagtgc                                                              669
          <![CDATA[<210> 13]]>
          <![CDATA[<400> 13]]>
          000
          <![CDATA[<210> 14]]>
          <![CDATA[<400> 14]]>
          000
          <![CDATA[<210> 15]]>
          <![CDATA[<400> 15]]>
          000
          <![CDATA[<210> 16]]>
          <![CDATA[<400> 16]]>
          000
          <![CDATA[<210> 17]]>
          <![CDATA[<400> 17]]>
          000
          <![CDATA[<210> 18]]>
          <![CDATA[<400> 18]]>
          000
          <![CDATA[<210> 19]]>
          <![CDATA[<400> 19]]>
          000
          <![CDATA[<210> 20]]>
          <![CDATA[<400> 20]]>
          000
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  46]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Val Ser Ile Thr Lys Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gln Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys 
                      20                  25                  30          
          Glu Val Gly Tyr Thr Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu 
                  35                  40                  45      
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  50]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Gly Pro Gly Val Ser Ile Thr Lys Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr 
          1               5                   10                  15      
          Cys Leu His Gly Gln Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Cys Arg Cys Glu Val Gly Tyr Thr Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe 
                  35                  40                  45              
          Leu Gly 
              50  
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  46]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  食蟹猴]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Val Ser Ile Thr Lys Cys Asn Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gln Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys 
                      20                  25                  30          
          Glu Val Gly Tyr Thr Gly Val Arg Cys Glu His Phe Tyr Leu 
                  35                  40                  45      
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  46]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  褐鼠]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Val Leu Ile Thr Lys Cys Ser Ser Asp Met Asp Gly Tyr Cys Leu His 
          1               5                   10                  15      
          Gly His Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Ser Glu Lys Tyr Cys Arg Cys 
                      20                  25                  30          
          Glu Val Gly Tyr Thr Gly Leu Arg Cys Glu His Phe Phe Leu 
                  35                  40                  45      
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  46]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  家兔]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          Val Ser Ile Thr Lys Cys Gly Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gln Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Ser Glu Asn Tyr Cys Arg Cys 
                      20                  25                  30          
          Glu Val Gly Tyr Thr Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu 
                  35                  40                  45      
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  169]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Met Thr Ala Gly Arg Arg Met Glu Met Leu Cys Ala Gly Arg Val Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ala Leu Leu Leu Cys Leu Gly Phe His Leu Leu Gln Ala Val Leu Ser 
                      20                  25                  30          
          Thr Thr Val Ile Pro Ser Cys Ile Pro Gly Glu Ser Ser Asp Asn Cys 
                  35                  40                  45              
          Thr Ala Leu Val Gln Thr Glu Asp Asn Pro Arg Val Ala Gln Val Ser 
              50                  55                  60                  
          Ile Thr Lys Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His Gly Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys Glu Val 
                          85                  90                  95      
          Gly Tyr Thr Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu Thr Val Pro Gln 
                      100                 105                 110         
          Pro Leu Ser Lys Glu Tyr Val Ala Leu Thr Val Ile Leu Ile Ile Leu 
                  115                 120                 125             
          Phe Leu Ile Thr Val Val Gly Ser Thr Tyr Tyr Phe Cys Arg Trp Tyr 
              130                 135                 140                 
          Arg Asn Arg Lys Ser Lys Glu Pro Lys Lys Glu Tyr Glu Arg Val Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Gly Asp Pro Glu Leu Pro Gln Val 
                          165                 
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  282]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 
          1               5                   10                  15      
          Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 
                      20                  25                  30          
          Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 
              50                  55                  60                  
          Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 
                          85                  90                  95      
          Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 
                  115                 120                 125             
          Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 
              130                 135                 140                 
          Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Gln Leu 
                          165                 170                 175     
          Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 
                      180                 185                 190         
          Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 
                  195                 200                 205             
          Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
              210                 215                 220                 
          Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Val Ser Ile Thr Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His Gly Gln Cys Ile Tyr 
                          245                 250                 255     
          Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys Glu Val Gly Tyr Thr 
                      260                 265                 270         
          Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu Gly 
                  275                 280         
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  50]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  家鼷鼠]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          Gly Pro Gly Val Gln Ile Thr Lys Cys Ser Ser Asp Met Asp Gly Tyr 
          1               5                   10                  15      
          Cys Leu His Gly Gln Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Arg Glu Lys Phe 
                      20                  25                  30          
          Cys Arg Cys Glu Val Gly Tyr Thr Gly Leu Arg Cys Glu His Phe Phe 
                  35                  40                  45              
          Leu Gly 
              50  
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  57]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          Val Val Ser His Phe Asn Lys Cys Pro Asp Ser His Thr Gln Tyr Cys 
          1               5                   10                  15      
          Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Leu Val Gln Glu Glu Lys Pro Ala Cys 
                      20                  25                  30          
          Val Cys His Ser Gly Tyr Val Gly Val Arg Cys Glu His Ala Asp Leu 
                  35                  40                  45              
          Leu Ala Gly His His His His His His 
              50                  55          
          <![CDATA[<210> 30]]>
          <![CDATA[<400> 30]]>
          000
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>構築體
          <![CDATA[<400>  31]]>
          Ser Tyr Tyr Trp Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          Arg Ile Tyr Pro Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 
          1               5                   10                  15      
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          Gly Gly Leu Val Met Asp Val 
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          <![CDATA[<400>  34]]>
          Arg Ala Ser Gln Ser Val Glu Phe Ser Tyr Leu Ala 
          1               5                   10          
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          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 
          1               5           
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          <![CDATA[<400>  36]]>
          His Gln Tyr Gly Thr Asn Pro Phe Thr 
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          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  37]]>
          Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 
          1               5           
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          <![CDATA[<400>  38]]>
          Tyr Pro Ser Gly Asn 
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  39]]>
          Gly Gly Leu Val Met Asp Val 
          1               5           
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  40]]>
          Arg Ala Ser Gln Ser Val Glu Phe Ser Tyr Leu Ala 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  42]]>
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          <![CDATA[<400>  42]]>
          His Gln Tyr Gly Thr Asn Pro Phe Thr 
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          Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr 
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          Ile Tyr Pro Ser Gly Asn Thr 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  45]]>
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          <![CDATA[<400>  45]]>
          Ala Arg Gly Gly Leu Val Met Asp Val 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  46]]>
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          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  46]]>
          Gln Ser Val Glu Phe Ser Tyr 
          1               5           
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          Gly Ala Ser 
          1           
          <![CDATA[<210>  48]]>
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          His Gln Tyr Gly Thr Asn Pro Phe Thr 
          1               5                   
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          000
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          Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  52]]>
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          Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 
          1               5                   10                  15      
          Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 
                      20                  25                  30          
          Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 
              50                  55                  60                  
          Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 
                          85                  90                  95      
          Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 
                  115                 120                 125             
          Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 
              130                 135                 140                 
          Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 
                          165                 170                 175     
          Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 
                      180                 185                 190         
          Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 
                  195                 200                 205             
          Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 
              210                 215     
          <![CDATA[<210>  53]]>
          <![CDATA[<211>  282]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  53]]>
          Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 
          1               5                   10                  15      
          Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 
                      20                  25                  30          
          Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 
              50                  55                  60                  
          Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 
                          85                  90                  95      
          Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 
                  115                 120                 125             
          Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 
              130                 135                 140                 
          Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Gln Leu 
                          165                 170                 175     
          Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 
                      180                 185                 190         
          Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 
                  195                 200                 205             
          Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
              210                 215                 220                 
          Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Val Ser Ile Thr Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Phe His Gly Gln Cys Ile Tyr 
                          245                 250                 255     
          Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys Glu Val Gly Tyr Thr 
                      260                 265                 270         
          Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu Gly 
                  275                 280         
          <![CDATA[<210>  54]]>
          <![CDATA[<211>  282]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  54]]>
          Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 
          1               5                   10                  15      
          Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 
                      20                  25                  30          
          Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 
              50                  55                  60                  
          Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                  115                 120                 125             
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              130                 135                 140                 
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                          165                 170                 175     
          Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 
                      180                 185                 190         
          Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 
                  195                 200                 205             
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              210                 215                 220                 
          Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Val Ser Ile Thr Lys 
          225                 230                 235                 240 
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                      260                 265                 270         
          Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu Gly 
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          Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 
          1               5                   10                  15      
          Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 
                      20                  25                  30          
          Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 
              50                  55                  60                  
          Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
          Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 
                      100                 105                 110         
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                  115                 120                 125             
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          Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 
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          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
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                  35                  40                  45              
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              50                  55                  60                  
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                          85                  90                  95      
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          145                 150                 155                 160 
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                          165                 170                 175     
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                      180                 185                 190         
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          Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
              210                 215                 220                 
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                      260                 265                 270         
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          Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 
          1               5                   10                  15      
          Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 
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          Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 
              50                  55                  60                  
          Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 
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          145                 150                 155                 160 
          Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Gln Leu 
                          165                 170                 175     
          Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 
                      180                 185                 190         
          Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 
                  195                 200                 205             
          Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
              210                 215                 220                 
          Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Val Ser Ile Thr Lys 
          225                 230                 235                 240 
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                          245                 250                 255     
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          Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 
          1               5                   10                  15      
          Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 
                      20                  25                  30          
          Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 
                  35                  40                  45              
          Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 
              50                  55                  60                  
          Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                  115                 120                 125             
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              130                 135                 140                 
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                          165                 170                 175     
          Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 
                      180                 185                 190         
          Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 
                  195                 200                 205             
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              210                 215                 220                 
          Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Val Ser Ile Thr Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His Gly Gln Cys Ile Tyr 
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          Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys Glu Val Gly Ala Thr 
                      260                 265                 270         
          Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu Gly 
                  275                 280         
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          Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
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                  35                  40                  45              
          Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 
              50                  55                  60                  
          Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
          Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 
                      100                 105                 110         
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          Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 
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          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
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                  35                  40                  45              
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              50                  55                  60                  
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                          85                  90                  95      
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          145                 150                 155                 160 
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                          165                 170                 175     
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                      180                 185                 190         
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                  195                 200                 205             
          Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
              210                 215                 220                 
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          Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 
          1               5                   10                  15      
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                  35                  40                  45              
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              50                  55                  60                  
          Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 
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          Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Gln Leu 
                          165                 170                 175     
          Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 
                      180                 185                 190         
          Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 
                  195                 200                 205             
          Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
              210                 215                 220                 
          Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Val Ser Ile Thr Lys 
          225                 230                 235                 240 
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                          245                 250                 255     
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          Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Ile Tyr Pro Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Gly Gly Leu Val Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 
                  115                 120                 125             
          Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 
              130                 135                 140                 
          Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 
                          165                 170                 175     
          Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 
                      180                 185                 190         
          Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 
                  195                 200                 205             
          Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys 
              210                 215     
          <![CDATA[<210>  63]]>
          <![CDATA[<211>  213]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  63]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Glu Phe Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Thr Asn Pro 
                          85                  90                  95      
          Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 
                      100                 105                 110         
          Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 
                  115                 120                 125             
          Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 
              130                 135                 140                 
          Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 
                          165                 170                 175     
          Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 
                      180                 185                 190         
          Tyr Ala Cys Glu Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Thr Lys Ser Phe 
                  195                 200                 205             
          Asn Arg Gly Glu Cys 
              210             
          <![CDATA[<210>  64]]>
          <![CDATA[<211>  439]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  64]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Ile Tyr Pro Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Gly Gly Leu Val Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 
                  115                 120                 125             
          Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val 
              130                 135                 140                 
          Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu 
                          165                 170                 175     
          Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser 
                      180                 185                 190         
          Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val 
                  195                 200                 205             
          Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys 
              210                 215                 220                 
          Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val 
                          245                 250                 255     
          Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp 
                      260                 265                 270         
          Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe 
                  275                 280                 285             
          Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp 
              290                 295                 300                 
          Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe 
          305                 310                 315                 320 
          Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys 
                          325                 330                 335     
          Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys 
                      340                 345                 350         
          Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp 
                  355                 360                 365             
          Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys 
              370                 375                 380                 
          Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser 
          385                 390                 395                 400 
          Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr 
                          405                 410                 415     
          Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser 
                      420                 425                 430         
          Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 
                  435                 
          <![CDATA[<210>  65]]>
          <![CDATA[<211>  215]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成構築體]]>
          <![CDATA[<400>  65]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Glu Phe Ser 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Thr Asn Pro 
                          85                  90                  95      
          Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 
                      100                 105                 110         
          Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp 
              130                 135                 140                 
          Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met 
                          165                 170                 175     
          Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser 
                      180                 185                 190         
          Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys 
                  195                 200                 205             
          Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 
              210                 215 
          <![CDATA[<210>  66]]>
          <![CDATA[<211>  47]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  66]]>
          Lys Phe Ser His Leu Cys Leu Glu Asp His Asn Ser Tyr Cys Ile Asn 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ala Cys Ala Phe His His Glu Leu Glu Lys Ala Ile Cys Arg Cys 
                      20                  25                  30          
          Phe Thr Gly Tyr Thr Gly Glu Arg Cys Glu His Leu Thr Leu Thr 
                  35                  40                  45          
          <![CDATA[<210>  67]]>
          <![CDATA[<211>  47]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  67]]>
          Lys Lys Lys Asn Pro Cys Asn Ala Glu Phe Gln Asn Phe Cys Ile His 
          1               5                   10                  15      
          Gly Glu Cys Lys Tyr Ile Glu His Leu Glu Ala Val Thr Cys Lys Cys 
                      20                  25                  30          
          Gln Gln Glu Tyr Phe Gly Glu Arg Cys Gly Glu Lys Ser Met Lys 
                  35                  40                  45          
          <![CDATA[<210>  68]]>
          <![CDATA[<211>  46]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  68]]>
          Lys Lys Arg Asp Pro Cys Leu Arg Lys Tyr Lys Asp Phe Cys Ile His 
          1               5                   10                  15      
          Gly Glu Cys Lys Tyr Val Lys Glu Leu Arg Ala Pro Ser Cys Ile Cys 
                      20                  25                  30          
          His Pro Gly Tyr His Gly Glu Arg Cys His Gly Leu Ser Leu 
                  35                  40                  45      
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  69]]>
          Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys 
                      20                  25                  30          
          Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr 
                  35                  40                  45              
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          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  70]]>
          Val Val Ser His Phe Asn Asp Cys Pro Asp Ser His Thr Gln Phe Cys 
          1               5                   10                  15      
          Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Leu Val Gln Glu Asp Lys Pro Ala Cys 
                      20                  25                  30          
          Val Cys His Ser Gly Tyr Val Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp Leu 
                  35                  40                  45              
          Leu Ala 
              50  
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  71]]>
          Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His 
          1               5                   10                  15      
          Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn 
                      20                  25                  30          
          Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys 
                  35                  40                  45              
          Trp
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Claims (20)

  1. 一種結合人類表皮調節素(epiregulin)之抗體，其中該抗體包含重鏈可變區(heavy chain variable region；VH)及輕鏈可變區(light chain variable region；VL)，其中該VH包含重鏈互補決定區(heavy chain complementarity determining region；HCDR) HCDR1、HCDR2及HCDR3，且該VL包含輕鏈互補決定區(light chain complementarity determining region；LCDR) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中 該HCDR1包含SEQ ID NO: 5， 該HCDR2包含SEQ ID NO: 6， 該HCDR3包含SEQ ID NO: 7， 該LCDR1包含SEQ ID NO: 8， 該LCDR2包含SEQ ID NO: 9，且 該LCDR3包含SEQ ID NO: 10。
  2. 如請求項1之抗體，其中該VH包含SEQ ID NO: 3且該VL包含SEQ ID NO: 4。
  3. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO: 1之重鏈(HC)及包含SEQ ID NO: 2之輕鏈(LC)。
  4. 一種核酸，其包含SEQ ID NO: 11或12之序列。
  5. 一種載體，其包含如請求項4之核酸。
  6. 如請求項5之載體，其中該載體包含SEQ ID NO: 11之第一核酸序列及SEQ ID NO: 12之第二核酸序列。
  7. 一種組合物，其包含以下：包含SEQ ID NO: 11之核酸序列之第一載體及包含SEQ ID NO: 12之核酸序列之第二載體。
  8. 一種細胞，其包含如請求項5或6之載體。
  9. 一種細胞，其包含以下：有包含SEQ ID NO: 11之核酸序列之第一載體及包含SEQ ID NO: 12之核酸序列之第二載體。
  10. 如請求項8或9之細胞，其中該細胞係哺乳動物細胞。
  11. 一種產生抗體之方法，其包含將如請求項8至10中任一項之細胞在使得該抗體表現之條件下培養及自培養基回收該經表現抗體。
  12. 一種抗體，其係藉由如請求項11之方法產生。
  13. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至3或12中任一項之抗體及醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
  14. 一種如請求項1至3或12中任一項之抗體之用途，其用於製造用來治療疼痛病症之藥劑。
  15. 如請求項14之用途，其中該疼痛病症選自由以下組成之群：骨關節炎疼痛、糖尿病周圍神經病變疼痛及慢性下背疼痛。
  16. 如請求項15之用途，其中該疼痛病症係骨關節炎疼痛。
  17. 如請求項15之用途，其中該疼痛病症係糖尿病周圍神經病變疼痛。
  18. 如請求項15之用途，其中該疼痛病症係慢性下背疼痛。
  19. 一種測定體液試樣中人類表皮調節素含量之方法，其包含： (a) 使該體液試樣與如請求項1至3中任一項之抗人類表皮調節素診斷性單株抗體或其抗原結合片段接觸； (b) 視情況，去除任何非特異性結合單株抗體或其抗原結合片段；及 (c) 檢測及/或量化特異性結合至人類表皮調節素之單株抗體或其抗原結合片段之量。
  20. 如請求項19之方法，其中該體液試樣係血液、血清或血漿試樣或腦脊髓液試樣，且該接觸係離體發生。
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