JP2007508552A - マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(maldi)質量分析法(ms)を包含する化学分析のための被検体の濃縮および精製のための方法および装置 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の一目的は、MALDI質量分析法による感度の高い分析のための血清、血漿、全血、脳脊髄液、尿などのような粗生物学的サンプルの前処理方法を提供することである。本発明の別の目的は、効率的な様式で実施するのに便宜的であるこうした方法を提供して、それによりサンプル処理量を増大させならびに分析の費用を低下させることである。
本発明のなお別の目的は、これらの方法を実施するための装置を提供することであり、ここで該装置は同様に使用するのに便宜的であり、高品質のデータを提供しかつ製造するのが比較的安価である。最適には、該装置は、使用者による最低数の調製段階を必要としかつ最少の若しくは調製時間を必要とするように予め浄化かつ予め調整されて提供することができる。本発明の付加的な一目的は、経済的な単回使用を可能にしてそれによりこうした装置が臨床研究ならびにヒトおよび家畜の臨床診断応用において過剰な費用を顧みずに自由に使用されることを可能にするのに十分に低い製造費用を有するように、こうした装置を設計することである。こうした予め浄化された装置は、以前の使用条件、浄化手順若しくは分析装置の摩耗状態などに結果が依存しないと思われるため、改良された均一性および信頼性を使用者に提供するとみられる。また、使用者は、使用前に装置で退屈な人的浄化操作をもはや実施する必要がないという便宜性を提供されると思われる。
[発明の詳細な記述]
本発明の一局面は、電場中で集束させることによる荷電した被検体の複数のサンプルの分離濃縮および捕捉のための装置および方法である。該装置および方法は、下述される要素および/若しくは段階の1種以上を包含する。
A.複数のサンプルを保持するためのウェル:
図1、2および3は濃縮器装置のそれぞれ透視図、上面図および側面図を示す。該装置は、質量分析法的分析のための1種以上のサンプルを同時に調製するのに有用であるマルチウェルサンプル保持装置である。該図は該装置の基礎的な機能的構成部品を示す。装置2は該装置の上面層4に配置されたサンプルウェル6を有する。該装置は多様な形状を有し得るとは言え、一般的にはそれは上面層4から見られるとおり長方形であることができ、そして一側で0.5cmと50cmとの間の寸法を有することができる。より通常は、該装置は一側で2cmと15cmとの間の寸法を有することができる。該装置は1と1000個との間のサンプルウェル若しくはそれ以上を有し得るが、しかし、より通常は、サンプルのサンプルウェルへの自動化分注のため、機器のサンプル処理量および利用可能性に依存して10から100ウェルを有することができる。該ウェルはまた、いかなる断面形状、例えば正方形、六角形、五角形などを有する筒状、立方体、長斜方形のような多様な形状のものでもあり得る。ウェルの直径若しくは幅は一般に1mmと1cmとの間であることができる。同様に、ウェルの深さは1mmと2cmとの間であることができる。より通常は、ウェルは深さ2mmと10mmとの間であることができる。
B.妨害種からの被検体の分離のための層
サンプルウェル内若しくは下に、例えば質量分析法による感度の高い分析のための被検体の分離、濃縮、保持および結合のための2個以上の多孔質層8が配置される。図5は2個若しくはそれ以上の多孔質層8の一例の構成の断面の拡大図を示す。ウェルの底面層は、多孔質層8への部分的若しくは競争する(compete)曝露により完全に若しくは部分的に多孔質でありうる。ウェル底の一部分のみが多孔質である場合、一般に、ウェル底は多孔質領域24および非多孔質領域26を有することができる。非多孔質領域は、層8で使用される素材の強度を増大させるため、若しくは、あるいは側壁12と多孔質層8との間での封止の形成において補助するためのような構成を容易にするために選択されるために有利に使用しうる。
C.化学分析のための被検体の濃縮および捕捉のための層
第三の多孔質集束層50は、場合によっては集束層として層40の下に配置しうる。層50は、捕捉層60の下にある捕捉領域68に集束されつつある被検体に高い移動性を提供する素材を含む。集束層50の例の素材は高度に浸透性のアガロース、セルロース(例えばWhatman#1若しくはWhatman#2濾紙など)である。こうした素材の固体部分は大きな孔を有するが、しかしなお集束層50内の対流を有利に予防する。使用される場合、集束層50は、被検体の分離層40から下にある捕捉60への拡散および対流双方の輸送を予防するのに十分厚いことができる。通常、該厚さは200ミクロンからおよび3000ミクロンであることができる。集束層50は多孔質層8に平行な面への被検体の集束(すなわち濃縮)において補助する。目的の被検体が一旦高度に抵抗性の分離層40を通過したがしかし捕捉層60へのそれらの進入前に濃縮が起こる。集束層40は任意であるが、しかし、存在する場合は、捕捉層60の捕捉領域68への被検体の所望の集束の達成において補助する。
v=μE (等式1)
式中、μは被検体分子の電気泳動的移動度でありかつEは電場強度である、
として示される。μの値は、アインシュタインの関係
D=(kT/q)μ (等式2)
から、その拡散係数Dから直接計算される。アミノ酸および類似の大きさにされた分子の拡散係数は、ほぼ室温で約10−5cm2/秒である。一価の分子について室温で(kT/q)≒0.0259ボルトという値から、われわれは、これらの分子のμの値が約4×10−4cm2/(V・秒)であることを見出す。従って、等式1から、約20ボルト/cmの電場中で膜を横断するこうした分子の速度は:(20ボルト/cm)・4×10−4cm2/(V・秒)=8×10−3cm/秒(すなわち約80ミクロン/秒)であることができる。
x2=6Dt (等式3)
を使用して、上で明記された最速の通過時間(すなわち0.1ミリ秒)さえでの(約10−6cm2/秒の拡散係数を有する)小型のタンパク質分子の効率的な捕捉について、われわれは、孔径xが8000オングストロームまで(すなわちほぼ1ミクロン)でありうることを見出す。対照的に、篩過過程による捕捉のために、孔径は、1000〜60,000の分子量をもつ小さい被検体を除去するために何倍もより小さくなければならない(すなわち約15〜40オングストローム)とみられる。従って、アフィニティー捕捉は、多様な孔径が非常に高い電気泳動速度について(若しくは薄い膜を用いて)大まかには10オングストロームから約1ミクロンまでの範囲にわたり利用されることを可能にする。対応して、より遅い電気泳動速度若しくはより厚い膜は、孔径が対応してなおより大きい(例えば10オングストロームから10ミクロンまで若しくはより大きい範囲にわたる)ことを可能にするとみられる。
ゾン(Celazole(R));アセタールコポリマーCelcon若しくはDelrin(R);ポリイミド、例えばDuratron(R)若しくはKapton(R);例えばHalar(R);PETポリエステル、例えばErtalyte(R);ポリエチレン;ポリウラタン、例えばIsoplast(R);ポリケトン、例えばKadel(R);ポリエチレンテレフタレートポリエステル、例えばMylar(R);ポリプロピレンオキシドおよびスチレン、例えばNoryl(R);ポリエーテル−エーテルケトン、例えばPEEKTM;ポリアリールエーテルスルホン、例えばRadel(R);ポリアミド−イミド、例えばTorlon(R);ポリフェニレンスルフィド、例えばTechtron(R);ポリアリーレート、例えばArdel(R);ポリメチルペンテン(TPX(R));ポリケトン、例えばKadel(R);ポリスルホン、例えばUdel(R);ポリフェニレンスルフィド、例えばRyton(R);PBTポリエステル、例えばValox(R);ポリマーアロイから成形される膜、例えばXenoy(R);または2種若しくはそれ以上のポリマー膜のラミネートを包含する。
D.集束電場の適用のための電極:
多孔質層8の底面層に、多孔質層8内でイオン電流を生じさせる電流を供給するための底部電極100がある。層30、40、50、60、70および80を包含する層の全部8は、電解液サンプル中のイオンに対し多孔質であることができ、それにより目的の被検体を電極100に向かって電気泳動的に誘引しつつイオン電流が捕捉膜60の領域68を通って実質的に集束されることを可能にする。
E.MALDI質量分析法による分析のためのMALDI標的プレートへの取り外し可能な付属品を提供する捕捉部位のアレイを有する捕捉スライド
サンプル被検体の分離および捕捉膜60の領域68への濃縮後のマトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)を提供するために、結合層60を他の多孔質層から分離し、そして、結合層60を、図7に示されるとおり質量分析計への導入のため適するMALDI質量分析サンプルプレート300に固定する。適するマトリックス溶媒に溶解した適するMALDIマトリックスを、その後、結合膜の被検体捕捉領域68に小液滴350として添加する。存在する被検体を溶媒に溶解させ、そして、溶媒が蒸発する際に、被検体は、捕捉膜60の上面層61上で生じるMALDIマトリックス結晶内に取り込まれた
ようになる。MALDI質量分析法の当業者に公知であるとおり、マトリックス物質は一般に、UVレーザー(例えばパルス窒素レーザー)により提供される電磁スペクトルの領域(例えば337ナノメートル)でエネルギーを強く吸収する有機酸である。一般に、MALDIマトリックスは、被検体を再溶解するように液体の形態で、しかし、サンプル被検体を実質的に希釈またはそれを被検体捕捉膜60の捕捉領域68の上面層61より大きい面積にわたり広げないように0.5ないし5.0マイクロリットルのような小容量で添加することができる。自動化分注機器の使用で、適用されるマトリックスの容量は実質的により少なく、例えば1ピコリットルないし1ナノリットルでありうる。より通常は、マトリックスの容量は1マイクロリットルと1ナノリットルとの間であることができる。溶媒液体の蒸発およびMALDIマトリックス結晶の形成のための時間を許容した後に、サンプルプレートは、MALDI質量分析計への導入のための準備ができている。質量分析計へのMALDIサンプルプレート300の挿入に際して、MALDIマトリックス結晶を強いUVレーザー光パルスで照射して、従来技術で公知であるとおり被検体分子の画分のイオン化をもたらす。別個の分子量のイオンの存在若しくは非存在を、その後、また従来技術で公知であるとおり決定し得る。
F.高められた電場集束および捕捉スライドからの被検体の化学的抽出のための装置:
本発明の代替の一態様を図11に示す。絞り層510が分離層40と捕捉層60との間に追加されることを除き図10に示されるものに類似の本態様。図12に示されるとおり、絞り層510は不浸透性領域512、および分離層40から不浸透性領域512を通り捕捉層60へのイオン伝導を可能にする小開口部518を有する。開口部518は、捕捉膜60のより小さい断面積の捕捉領域68のみを通過するようにイオン電流を制約するよう機能し、ここで開口部518の中心は捕捉膜60内の捕捉領域68の中心と物理的に整列されている。開口部は通常、直径10ミクロンと2mmとの間であることができる。より通常は、直径は直径50と500ミクロンとの間であることができる。絞り層510はいかなる厚さのものでもありうるが、しかし、通常は耐久性および小型性のために50ミクロンと1000ミクロン厚との間であることができる。とりわけ、絞り膜が200ミクロンより厚い場合は、開口部で気泡を形成する傾向を伴わずに水性緩衝液を保持するように、開口部中に多孔質の吸収性の親水性素材を付着させることが有用である。吸収性の疎水性素材は多様な素材、例えばアガロース、Sephadex、ラテックス、シリカ粒子、ガラス粒子などから選びうる。親水性粒子は絞り層510の厚さより直径がより小さいことのみを必要とする。慎重な注意が、しかしながら、粒子上の表面電荷に対し払われるべきである。例えば、正に荷電した巨大分子被検体を開口部518を通り電気泳動的に集束している場合は、中性若しくは正味の正のいずれかの表面電荷を有するように吸収性の疎水性素材を選ぶべきである。正味の負の表面電荷は、表面電荷間の距離が巨大分子上の正に荷電した部分間の距離より実質的により大きい場合にのみ使用しうる。同様に、負に荷電した巨大分子被検体を開口部518を通り電気泳動的に集束している場合は、逆が真である。すなわち、中性若しくは正味の負のいずれかの表面電荷を有するように吸収性の疎水性素材を選ぶべきである。正味の正の表面電荷は、表面電荷間の距離が巨大分子上の負に荷電した部分間の距離より実質的により大きい場合にのみ使用しうる。
G.検出のさらに高められた感度を提供するための分離段階
本発明の装置および方法は、さらに高められた分離および濃縮を達成してそれによりさらに高められた感度をもたらすために、伝統的な分離および濃縮段階と組合せうる。付加的な段階は付加的な時間をとるであろうが、しかし、付加的な段階は、該段階を実質的に自動化した様式で実施し得るような方法で本発明と組合せ得る。それにより、該段階は、付加的な操作者の介入若しくは操作者が付いている稼働時間をほとんど若しくは全く必要とせず、実施するのが容易かつ簡便である。
i)等電点電気泳動法:
例えば、等電点電気泳動段階を、以前に記述された精製および濃縮段階と一緒に組合せうる。サンプルの等電点電気泳動は図14に示されるところのその改変により該装置で実施しうる。該改変は、集束層50として1個、若しくはそれ以上の等電点電気泳動ストリップ610を使用することを包含する。該等電点電気泳動ストリップは装置の第一の次元620に沿って連続的である。2個、若しくはそれ以上の別個の等電点電気泳動ストリップを、第一の次元に直行する第二の次元630に沿って置くことができる。2個、若しくはそれ以上のストリップが存在する場合、ストリップは実質的に平行であることができる。各等電点電気泳動ストリップ610を、各集束スリットの下に中心があるスリット660を有する絞り層510上に配置する。図14中の点線640は各電気泳動ストリップ610の中心軸を示す。各スリット660は、第一の次元620に沿った開口部518の伸長として単純に見ることができる。各電気泳動ストリップの中心軸640は、それ以外は不浸透性の絞り層600中の下にあるスリット660の上に直接存する。2個、若しくはそれ以上の等電点電気泳動ストリップ610が存在する場合、2個、若しくはそれ以上のスリット660が存在することができ、ここで各スリットは各電気泳動ストリップ610の中心軸640に沿って整列され、そして相互のスリットに実質的に平行である。
来技術で公知であるとおり、安定なpH勾配を提供するように液体の対流を予防する。例えば、P.GlukhovskiyとG.Vigh、Analytical and Preparative Scale Isoelectric Focusing Separation of Enantiomers、Analytical Chemistry 71、(17)、1999、3814−3820(引用することにより本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
2H2O−2e−→2H++O2 (4)
に従って自然に下落することができるためである。逆に、水が陰極で還元される場合、pHは等式(5):
2H2O+2e−→2OH−+H2 (5)
に従って自然に上昇することができる。形成されるpH勾配は、いずれの場合も、電解液へのキャリア両性電解質の添加により直線化かつ安定化し得る。両性電解質は両性分子である。すなわち、それらは置換基の酸性および塩基性基を有する。IEFの間に安定なpH勾配を創製するために、多様なキャリア両性電解質の混合物を使用する。各両性電解質は異なる等電点(pI)、すなわち両性電解質上の正味の電荷がゼロであるpHを有する。両性電解質は、それらがpH勾配中のそれらのpI値に達するまで、外的に適用された電場中を移動する。それらの速度はその後ゼロになり、そして、それらは、例えばそれらが勾配に進入する場合のサンプル被検体によるpHのいかなる外的混乱に対しても緩衝する。正の電位が陰極に関して陽極に適用される場合、多様な電解質は、最低のpIをもつものが陽極に最も近くかつ最高のpIをもつものが陰極に最も近いような直線的な連続した様式で陽極と陰極との間の電場中にそれら自身を配置する。便宜的なpH3.0〜10.0の両性電解質混合物は、例えば製品番号P1647としてSigma Chemical Companyから入手可能である。
実施例
標識タンパク質標準品:
テキサスレッドで標識したユビキチン(TR−ユビキチン)およびマリーナブルーBSA(MB−BSA)は、それぞれテキサスレッド(カタログ番号T−6134、Molecular Probes、オレゴン州ユージーン)およびマリーナブルー(製品番号M−10165;Molecular Probes;オレゴン州ユージーン)のNHS−エステルを利用することにより調製した。Molecular Probesにより推奨される標識手順を使用した。簡潔には、NHS−蛍光標識種を約1□g/mLの濃度でジメチルホルムアミド(DMF)に入れ、そして、タンパク質に対する標識試薬のモル結合比が約10/1となるように、ボルテックス攪拌しながら中性のpHの標準的リン酸緩衝生理的食塩水(PBS)緩衝液中の1mg/mL若しくはそれ以上のタンパク質のサンプルに添加した。タンパク質サンプルとの標識反応を1時間進行させた。反応混合物はその後、250mM L−ヒスチジン(Sigma)緩衝液で事前に平衡化したP6スピンカラム(Bio−Rad)を通過させた。標識タンパク質サンプルを25マイクロリットルのアリコートに分注しかつ凍結保存した。
電解槽、ポリアクリルアミド、アガロースおよび多孔質膜:
光電気ブロッティングによる被検体の分離および濃縮のための基礎的な装置を図6に図解で示す。開放端サンプルウェルは、約2cm長および直径約2cmのポリスチレン管材料の短いシリンダーから形成した。分離層を管の一端に固定してサンプルウェルの底を形成した。分離層はプレキャスト10%ポリアクリルアミド(BioRad、カリフォルニア州から得た)から作成したゲルの2〜3mm厚スラブから形成した。ポリアクリルアミドは、より小さいタンパク質およびペプチド以上の大型タンパク質の電気泳動速度を遅らせる分子量篩としてはたらく。ポリアクリルアミドは、ゲルマトリックス中でのタンパク質の電気泳動分離の当業者に公知であるとおり、より大きなタンパク質のより迅速な移動性を可能にするようにより少なく高度に架橋してもよいか、若しくは、タンパク質およびペプチドの移動性をより良好に遅らせるようにより高度に架橋してもよい。
Lの250mM L−ヒスチジン中の10□Lの10%水性ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)(Sigma Chemical Company)を100mgのアガロースに添加する。(SDSは、それが使用されない場合については単純に省略する。)使用直前に、アガロースを電子レンジで液体状態を形成するのに十分に加熱する。アガロースの薄膜をその後、いかなる液体の漏出も封止するためにポリスチレンシリンダーの側壁12に沿ってプレキャストポリアクリルアミドの上面層に注ぐ。アガロースはその後固化するまで放置して冷却する。次に、サンプルを、1〜10μL容量の10%グリセロールを含有する250mM L−ヒスチジン中で適用する。泳動緩衝液(アガロースを含まないことを除いては上のアガロース溶液に同一)をその後、サンプルの上に慎重に積層する。
半導体および光学機器:
nタイプゲルマニウムウエハー(14ミル厚および直径5cm)はPolishing
Corporation of Americaから購入した。ウエハーのバルク抵抗率は0.4Ω−cm未満であった。抵抗接点を、ガリウム/インジウム共晶および銅線を使用することにより、ウエハーの上面層に作成した。抵抗接点は5分硬化エポキシ接着剤(5−minute epoxy)の上張層で機械的に強化した。該強化ゲルマニウムウエハーを、レーザーおよび集束光学装置と一緒に光学台上に据付けることにより光アノードとして使用した。据付けたゲルマニウムウエハーをクランプにより実験室用支持スタンドに取付けた。1ミリワット出力のヘリウム/ネオンの633nm線を光電気ブロッティングに使用した。レーザーは、直径100ミクロンと1mmとの間の集束ビームでガラスの底面層に衝突させた。
電気泳動分離およびブロッティング:
0.2μLのTR−ユビキチン、MB−BSA(1〜2μg/μL)若しくは双方のいずれかを、25%(v/v)グリセロールを含む250mM水性ヒスチジン緩衝液を含有する2μLのサンプルに取り込んだ。サンプルを混合し、そして約1000×gで2分間遠沈させた。約0.5μLの上清を各分離および電気ブロッティング操作(run)に使用した。タンパク質の混合物からの質量分析法の結果を、精製標準タンパク質若しくはペプチドサンプル(例えばユビキチンおよび1%TFAのみを含有する)の使用と比較した。ユビキチンの純粋な(標準)サンプルを、MALDI質量分析法による分析の前の溶媒の蒸発後に妨害種が存在しないことができるように、0.1%TFAで(800fmol/μL若しくは10fmol/μLのいずれかまで)直接希釈した。
MALDI−MS分析のプロトコル:
分析は、提供されたQGEN_PR2法を使用することにより、ABI/Perceptive Biosystems Voyager DE(MALDI−TOF)機器を用いて実施した。CHCAマトリックス溶液を用いる使用のため、設定は:25kVの加速電圧、89%格子電圧、0.25%ガイドワイヤ電圧、200nsの遅延時間、2800のレーザー設定、64回の走査を平均、3.45e−7torr、100の低質量ゲート、陰イオンオフであった。
結果:
(PVDF膜を伴わない)CEA透析膜の直接上でのTR−ユビキチンの光電気濃縮を上述されたとおり実施した。図16に示されるMALDI質量スペクトルは、オリゴペプチドを膜からCHCAを含有するMALDIマトリックス溶液に抽出し、そしてステンレス鋼製標的プレート上に直接該溶液をスポットし、かつ、溶液を乾固まで蒸発させた後に得た。複数のピークが、各ユビキチンポリペプチドに共有結合した0、1、2、3若しくは4分子のテキサスレッドを表す。
発させ、そしてPVDF透析膜を、二重被覆接着テープ(3M)によりでステンレス鋼製MALDIサンプルプレートに直接固定し、そしてその後MALDI−TOFを使用して分析する。図16および17の比較は2つの主要な差違を示す。第一に、最大強度ピークのイオン電流強度はPVDF膜を使用する場合に最大である。従って、PVDF膜を用いる手順を使用する場合に捕捉の効率が最大であるかのように思われる。第二に、2種の異なる膜による捕捉に際して、0、1、2、3若しくは4分子のテキサスレッドで標識されたユビキチンの明瞭に異なる比が観察される。CEA膜による捕捉は、ユビキチンの1分子あたり0若しくは1個のテキサスレッド標識を伴うより少ない分子をもたらしたようであった。従って、CEA透析膜は、テキサスレッド標識され(かつ従ってより負に荷電した)を伴うより高度に標識されているユビキチン分子を優先的に結合するかのように思われる。対照的に、PVDF膜は、ステンレス鋼製MALDI標的上に標識ユビキチンサンプルを直接分注することにより実施した分析の比較により示されるとおり、標識ユビキチン分子の全部をより均一に捕捉するようである(データは示されない)。
血液、血漿若しくは血清中の少量のペプチドの分析での主要な一問題は、多量のタンパク質が少量のペプチドの出現を遮蔽することである。血液、血漿若しくは血清サンプルからの高度に豊富なアルブミンの除去は、かなり多数の少量のペプチドもまた除去することが報告されている。従って、少量のペプチドをアルブミンから解離させる方法を見出すことは重要な責務である。本研究において、われわれは、解離を促進するために血清サンプルを洗剤で処理した。
ヒト血清サンプル:
洗剤処理した血清サンプルは、エッペンドルフマイクロチューブ(500μL容量)中の10μLのヒト血清(Sigma Chemical Co.から得た)に5mg/mLのオクチル−β−D−グルコピラノシド(OG)を添加することにより作成した。洗剤処理した血清をその後4℃で一夜保存し、そして14時間後に室温にした。サンプルをその後、洗剤処理した血清の3μLのアリコート、1μLの250mMヒスチジン緩衝液、1μLのテキサスレッド標識したLeuエンケファリン(250mMヒスチジン緩衝液中のトレーサーとして)および0.5μLのグリセロールから作成した。生じるサンプル混合物を、一緒に1および3μLの液滴をもたらすために約1000gで約1分間遠心分離した。
サンプルウェルおよび分離層:
サンプルをその後、質量分析法分析のためのMALDI適合性の膜上での分離および濃縮のため、Serum Profiler分析セルのサンプルリザーバに入れた。該濃縮器のリザーバは、サンプルリザーバの側壁を形成するポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリメチラメタクリレート、ポリメチルペンテン、TeflonTMなどのような電気的に非伝導性の素材から作成されるサンプルリングから作成される。
縁を1%アガロースゲルで所定の位置に封止する。アガロースおよびポリアクリルアミド双方を使用前に250mMヒスチジン緩衝液、pH7.8で平衡化した。(あるいは、アクリルアミドゲルを正しい位置で重合することができ、そして封止物質を必要としない。)
捕捉、障壁および緩衝層:
ポリアクリルアミド分離層の下、およびそれとイオン電気的接触に、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質を包含するポリペプチド被検体を捕捉するようはたらく捕捉層がある。捕捉はポリペプチドのポリマー性捕捉膜との疎水性相互作用により進行する。多孔質Teflon若しくはPVDFのような素材から作成される膜が、疎水性相互作用によるポリペプチドの捕捉にとりわけ有用である。本実施例において、捕捉膜は、受領されかつ使用前に4℃で水性緩衝液(250mM L−ヒスチジン)中で保存されるPVDF透析膜(250,000の分子量カットオフ)から構成される。
緩衝領域:
捕捉および障壁膜の組合せの下かつそれとイオン電気的接触に、捕捉膜中で被検体分子の電気泳動的動き、分離および濃縮を引き起こす電場を生じさせるのに使用される電極の表面で形成される生成物を緩衝(若しくは捕捉するための緩衝領域が配置される。本場合において、緩衝領域はImmobilon−P膜(Millipore,Inc.から得られる)の単一層から構成され、かつ、250mM L−ヒスチジン緩衝液、pH7.8で飽和されている。
光応答性電極:
緩衝層のすぐ下かつそれとイオン電気的接触に、nタイプゲルマニウムウエハーから作成した光応答性陽極がある。ゲルマニウムウエハー(14ミル厚および直径5cm)はPolishing Corporation of Americaから購入した。抵抗率は0.4Ω−cm未満であった。5分硬化エポキシ接着剤でガラスプレートに据付けたゲルマニウムウエハーを、作用電極および光アノード双方として使用した。銅リード線への抵抗接点を、ガリウム/インジウム共晶および銅線を使用することによりウエハーの上面層で作成した。抵抗接点は5分硬化エポキシ接着剤の上張層で機械的に強化した。
ヒト血清サンプルの分析方法:
サンプル成分の分離および結合を実施するために、洗剤処理したサンプル混合物のアリコート(0.5〜8μL)をアクリルアミド/アガロース層の上部のサンプルリザーバに添加した。次に、白金から作成されかつリザーバの内壁とゆるく接触する円形対極(陰極)をサンプル中に直接置いた。白金陰極および光応答性陽極を定電位電解装置(Princeton Applied Research、型式273)に接続し、室を暗くし、そして+4Vのバイアス電圧を白金陰極に関して光応答性陽極に適用した。1ミリワット出力のヘリウム/ネオンの633nm線を光応答性陽極の裏面の光励起に使用した(すなわち、電解液と正対する側のウエハーに光を照らした)。レーザー集束装置は、レーザーが直径100ミクロンと1mmとの間の集束ビームでガラス強化の底に衝突するように構築した。4.0ボルトの電気的バイアスおよび同時の照射は約700mAの総電流(約30%の光電流)をもたらした。分離はバイアス電圧をゼロに設定する前に約20分間進行させ、そして、上部および底部電極へのリード線を切断した。
上の実施例1および実施例2と同様、本実施例において、ヒト血清サンプルからのペプチドおよび小型血清タンパク質を、目的のより小さいタンパク質およびポリペプチドからより大きいタンパク質を分離するためにゲルを通過させた後に捕捉膜上で電気泳動的に濃縮する。前の実施例でのとおり、荷電したペプチドおよびタンパク質分子は、外的陽極および陰極により適用される電場中を漂流する。本実施例において、正に荷電した被検体分子は、負に荷電した陰極に向かって漂流しかつ濃縮され、そして捕捉膜60の捕捉領域68内に結合されたようになる。捕捉された正に荷電したタンパク質をその後、前の実施例に記述されたとおり捕捉膜から直接分析し、MALDI分析を実施例2に記述されたとおりVoyager DE質量分析計で実施する。
材料:
・底部電極(500):パラジウム(Pd)箔を、所望されうるとおり底部電極上の伝導性領域を選択的にパターン化するように、Kapton(ポリイミド)接着テープで被覆しうる。例えば、Kaptonテープ中の2mm直径の孔は、底部電極表面として使用されるPdのこの領域を露出させるようはたらく。
・上部電極(140):上部電極は約3mm直径ループに造形した白金(Pt)ワイヤから作成した。3電極定電位電解装置若しくはガルバノスタットでの作動のため、上部電極を、定電位電解装置若しくはガルバノスタットからの制御電極および参照電極双方のリード線に接続する。
・底部電極(599)は、Kaptonテープの1”×3”片に2.4mmの穴を中ぐり
することにより調製する。接着テープをパラジウム(Pd)箔の小片の上に置き、そして双方をガラス製顕微鏡スライドガラスに固定する。定電位電解装置からの作用電極リード線を箔にクリップで直接接続する。
・緩衝層(80):緩衝層はMillipore,Inc.から得られるImmobilon−P膜から構成する。Immobilon−P膜は250mM水性L−ヒスチジン溶液、pH7.8で飽和させる。
・遮断層(70):500の分子量カットオフ、CEA透析膜、Spectrum Laboratories,Inc.から得られる。
・捕捉層(60):500の分子量カットオフ、ポリビニリデンジフルオリド透析膜(PVDF−DM)、Spectrum Laboratories,Inc.から得られる。
・分離層(40):10%ポリアクリルアミド、Bio−Rad Laboratories,Inc.から得られる。
・飽和水性DL−グルタミン酸およびDL−アスパラギン酸中の1%低EEOアガロース(Sigma Chem.Co.から得られる)から構成されるゲルを使用して、サンプルウェル(6)の側壁(12)に分離層(40)を封止する。
・サンプル緩衝液:水性緩衝液を使用して、サンプルを希釈しかつ上部および底部電極間の電気的接触を作成する。水性緩衝液は飽和DL−グルタミン酸およびDL−アスパラギン酸(Sigma Chem.Co.から得られる)である。該緩衝液のpHは約3.0である。
・サンプルウェル(6):開放の上および底部をもつ単一のポリカーボネートシリンダーを使用して、単一ウェルを有する分離および濃縮装置を構築する。該単一ウェルは19.15mm外径×16.95mm内径×17.32mm高である。
・サンプル:1μLグリセロール+1μLのユビキチン(Sigma Chem.Co.から得られる)かつ製造元推奨に従ってテキサスレッド(Molecular Probes,Inc.)で標識される+8μLヒト血清(Sigma Chem.Co.から得られる)+約1μgのオクチル−β−D−グルコピラノシド(Sigma Chem.Co.から得られる)+3μLのサンプル緩衝液。サンプルの全成分を一旦一緒に添加したら、それらを遠心分離かつ(混合するため)ボルテックス攪拌する。サンプルの5μLのアリコートをその後、サンプルウェルにピペットで移す。
・MALDIマトリックス溶液:第一のMALDIマトリックス溶液は、50%アセトニトリルおよび0.1%トリフルオロ酢酸に飽和させたα−シアノ−4−ヒドロキシケイヒ酸(CHCA)である。第二のMALDIマトリックス溶液は、50%アセトニトリル、50% 0.1%トリフルオロ酢酸に10mg/mLで溶解したシナピン酸(SA)である。MALDIマトリックス溶液の全物質はSigma Chem.Co.から得た。
器具類:
・電極バイアス電圧若しくは電流制御装置:EG&G Princeton Applied Researchからの型式273定電位電解装置/ガルバノスタットを、定電位電解装置若しくはガルバノスタットいずれかのモードで使用した。
・データ収集:Powerlab/4SP、AD Instruments、およびDellからのデスクトップPC。
・MALDI質量分析法:Voyager DE生体分光法ワークステーション、(Applied Boosters,Inc.)。
膜の調製:
サンプルの分離、濃縮およびPVDF捕捉膜(60)への結合前に、PVDF膜をメタノールに約1分間浸漬する。PVDF膜は疎水性であるため、メタノールは膜を初期「湿潤化」するようにはたらき、かつ、膜を浄化するようにもまたはたらく。湿らせたPVDF膜はその後、貯蔵のため脱イオン水中に入れる。分離層(60)はBio−Rad Laboratoriesから得たプレキャスト10%ポリアクリルアミドから調製する。ポリアクリルアミドをそのカセットから取り外し、サンプルウェルの側壁(12)に使用
するポリカーボネートシリンダーで円板に切断する。切断した円板を、遮断層(70)として使用するCEA膜と一緒に脱イオン水に一夜浸漬する。プレキャストポリアクリルアミドゲル中の高塩濃度は、許容できる範囲まで伝導性を低下させるために水中での一夜浸漬を必要とする。とは言え、該装置は、分離層およびサンプル緩衝液の広範囲の伝導性、例えば1マイクロジーメンスから100ミリジーメンスまでにわたり作動させうる。該装置の最適な作動は、10マイクロジーメンスから10ミリジーメンスまでのより狭い範囲にある。
装置の構築:
分離および濃縮器(2)は、底部電極の上に多孔質層を以下の順序、すなわち緩衝層、捕捉膜、絞り層、分離層、分離層に側壁を封止するための加熱したアガロースゲル、水性緩衝液および上部電極で置くことにより構築する。加熱したアガロースを、サンプルウェルの側壁中および周囲に1〜2mmの深さまでピペットで移す。アガロースが一旦ゲル化すれば、上部電極として使用するPtループを、それがアガロースを接触するまでセル中で慎重に下げる。十分な水性緩衝液をその後添加してPtループ上部電極を覆う。該装置の図解を図6に具体的に説明する。
装置の作動:
ヒト血清を含有するサンプルは、1μLグリセロール+1μLのテキサスレッド標識ユビキチン+8μLのヒト血清+<1μgのオクチル−β−D−グルコピラノシド+3μLの水性緩衝液を添加することにより調製する。該溶液を短時間遠心分離し、ボルテックス攪拌し、そして5μLのサンプルをその後、Ptループの中心を通しセルに分注する。底部電極を底部電極に関して−5Vでバイアスをかける。電流を連続してモニターする。初期過渡電流後に、電流は、45分の分離および濃縮段階の残りの間、約200μAに落ち着いた。テキサスレッド標識ユビキチンを、被検体の分離および捕捉の進行を視覚的に追跡するための指標被検体として使用する。分離に必要とされる時間および電流を、分離および捕捉を最適化するために過去に遡って調節する。
MALDI質量分析法分析:
Voyager DE質量分析計のパラメータは以下に続くとおりであった:20,000Vの加速電圧、94.1%の格子電圧、0.05%のガイドワイヤ電圧、110nsの遅延時間、2800に設定したレーザー、64回の走査を平均、そして陰イオンモードはオフであった。
結果:
図20、20aおよび21に、正に荷電したペプチドおよびタンパク質の典型的なMALDI質量分析結果を示す。該図から見ることができるとおり、(約8600、9330および10,100質量単位にみられるところの)標識ユビキチン追跡タンパク質からの質量シグナルを包含する多数の低分子量タンパク質の質量ピークが検出される。MALDIマトリックスとしてシナピン酸(20,000より上の分子量の中程度の大きさのタンパク質をより至適にイオン化する傾向がある)を用いた結果を描く図18は、中程度の量のアルブミンのみが(約68,00質量単位に)出現することを示す。また、約34,0
00質量単位に1個の小さな質量ピークが見られる。他のそのこれらの2個の質量ピーク、間違いなくポリアクリルアミドゲル分離層のより小さいポリペプチドからのより大きいタンパク質の実質的分離による、11,000ダルトンより上にほとんど質量ピークは見られない。
本発明の本態様において、固体物質中の開口部の二次元アレイを使用して、荷電した被検体を開口部中に電気泳動的に濃縮する。被検体の捕捉のための多孔質媒体を、濃縮される被検体を捕捉するための開口部に(すなわちそれら内またはそれらの入口若しくは出口に)取付ける。各開口部は、捕捉媒体の予め決められた領域を囲む連合した非多孔質の周囲を有する。該非多孔質の周囲は、予め決められた領域内に置かれる液体溶液をより大きな領域を占有することから保持するようにはたらく。1個若しくはそれ以上の開口部を有する装置を、以下の段階を有する手順で使用することができる:
1.)荷電した被検体を、開口部の一方の側の陽極および開口部の他方の側の陰極の双方と電気的接触にある電解液中に置かれているサンプル保持容量中の液体として付着させる付着段階;
2.)被検体を開口部に電気的に駆動しかつそれ内に集束させる集束および捕捉段階。また、この段階の間に、なお荷電している被検体が、開口部に(すなわち開口部内に、または開口部の入口若しくは出口に)予め付着された多孔質捕捉媒体の予め決められた領域上に捕捉されて、それにより荷電した被検体を予め決められた領域内で濃縮する;
3.)有利には先行する段階で予め決められた領域に濃縮された、捕捉された荷電した被検体を分析する分析段階。
a)液体溶媒および溶解されたマトリックス物質を含んでなる液体分析マトリックス溶液を多孔質捕捉媒体に添加して、被検体を液体溶媒中におよび多孔質媒体の上面層に遊離させる下位段階、
b)多孔質捕捉媒体の予め決められた領域内の非多孔質の周囲により液体溶媒を保持する下位段階、
c)溶媒を蒸発させて、溶解されたマトリックス物質および捕捉された被検体を多孔質媒体の上面層の予め決められた領域内に残す下位段階、ならびに
d)予め決められた領域の上面層に存在する被検体の特性を分析する下位段階
を含むことができる。
oration.マサチューセッツ州ビルリシア(Billricia)から入手可能)であり、また、開口部のアレイは固体PVDFのシート(McMaster Carr Corporation、ジョージア州アトランタから入手可能)中に作成する。非多孔質の周囲は、記述されるとおり、開口部の周りの固体シートに多孔質膜を熱的に溶接することにより作成する。
ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)シートへのImmobilon−PSQ膜の溶接:
本実施例において、Immobilon−PSQのようなPVDFの固体薄膜に多孔質PVDF捕捉膜を永続的に固定するための多様な手段を記述する。該方法は、0.010”厚の固体PVDFから作成されるポリマーシートのような固体物質に多孔質膜を熱的に溶接することを包含する。該方法において、多孔質膜は固体ポリマーシート中の小開口部のアレイ上に置かれる。開口部は、開口部を通り多孔質捕捉膜の上面層への溶媒の流れによるペプチドおよびタンパク質のような吸着された種の溶出を可能にするように機能する。
PVDF固体膜にPVDF多孔質膜を溶接するための手順:
・PVDFの0.01”厚の固体シートの45mm×45mmの片を、3Mの両面テープの接着層によってポリカーボネート製底板の中央に取付ける。
・アルミニウム製ドリルガイドをPVDFシートの上の底板にねじ込む。
・25個の穴のアレイを、ボール盤で使用するように設計された0.024”インチ直径のドリルビットおよびピン万力を使用することにより、固体PVDFシートを通してドリルで開ける;
・ドリルガイドを取り外し;Immobilon−PSQ膜のストリップを孔の上に置き、そして溶接アイロンガイドを基部にねじ込んだ。溶接アイロンガイド中の孔を、PVDFシート中の孔と正確に整列した。
・はんだごてを約850°Fに設定し、そして数分間温まらせた。
・はんだごての先端を、それが膜を接触するまでアルミニウム製プレート中のガイド孔に押し込んだ。はんだごてを、許容できる溶接継目が創製されるまで、1〜10秒間、膜に対して保持した。
・全25個の穴の上で膜を溶接した後に、ガイドを取り外し、そして膜を顕微鏡下で検査した。
・鉗子を使用して、溶接継目を取り囲む膜を除去した。
・溶接したアレイをその後メタノールに浸漬しかつ10分間超音波処理した。
・溶接した膜を含有するシートを乾燥し、そして使用の準備ができるまでビニール袋に入れた。
抽出したサンプルの質量スペクトル分析:PVDF−PSQ膜を、上述されたとおり固体PVDFシート中の開口部の上に溶接した。次に、多孔質膜を1マイクロリットルのメタノールで湿らせ、そして、ACTHのペプチドフラグメントを含んでなる被検体を、およそ0.5マイクロリットルの水性PBS緩衝溶液中で多孔質膜の前側(固体PVDFに正対する側)に適用した。被検体を、シナピン酸(SA)マトリックス(80%アセトニトリル、20% 0.1%トリフルオロ酢酸に10mg/mLで溶解した)を含有する80:20のACN/水混合物から構成されるMALDIマトリックス溶液2×0.3マイクロリットルで反対表面に溶出した。MALDIマトリックス溶液のための全物質はSigma Chem.Co.から得た。膜の裏側をMALDI−TOFにより分析した。結果を質量スペクトルとして図31に示す。
図32に、MALDI質量分析法による分析のためのタンパク質およびポリペプチド被検体の捕捉およびその後の抽出のための基本構造の図解を示す。該構築物は、1個若しくはそれ以上の微小開口部として開口部を含有するプラスチック製枠から構成される。開口部すなわち穿孔は、有利には小直径、通常直径1ミクロンと2ミリメートルとの間のものである。より通常は、穿孔は直径100ミクロンと1ミリメートルとの間である。室の下区分は、PVDF−PSQ(Millipore,Corp.、マサチューセッツ州ビレリシアから入手可能なImmobilon膜)のような多孔質タンパク質捕捉膜で覆われる。捕捉膜は、1個若しくはそれ以上の封止手段を使用することによりプラスチック製枠に封止される。最も単純な封止手段は、プラスチック製保持リングに嵌合するように作成されたナイロンワッシャーのような保持リングよりなる。ガラス製カバーガラスが、サンプルおよび溶媒が適用された後に室を覆う。
本発明の本態様において、一体化多孔質捕捉素材を、固体物質の開口部の二次元アレイに形成する。本態様において、荷電した被検体を、焦点電気泳動開口部のアレイで形成し
た一体化多孔質捕捉素材中に電気泳動的に濃縮する。被検体の捕捉のための多孔質媒体を、ポリビニリデンフルオリド(PVDF)支持層に以前にドリルで開けた一連の200μm直径の孔に注型した。その多孔質重合が一旦完了したら、ポリマー物質をより良好に保持するように孔の内壁を官能性化した。多孔質素材を、ポリマー素材としてメチルメタクリレートを使用してその場で二次加工した。一般に、支持層をUV透過性Tefonで被覆した石英製スライドガラスの上に置き、そしてポリマー素材を孔にピペットで移した。次に、孔の上部を、気泡が存在しないように、別のUV透過性Tefonで被覆した石英製スライドガラスにより覆った。最後に、素材を多孔質「填材」を形成するため適切な時間UV光に曝した。個々のスポットを検討しかつ多孔性が均一であることを見出し、そして上部および底部双方を、支持層の上面層および底面層とともに洗い流した。
Claims (38)
- ウェルを形成する少なくとも1個の開口部を包含する上面層;
捕捉層;および
上面層と捕捉層との間に配置される分離層
を含んでなる濃縮器。 - 捕捉層が多孔質である、請求項1に記載の濃縮器。
- 多孔質捕捉層が膜である、請求項2に記載の濃縮器。
- 膜が疎水性膜である、請求項3に記載の濃縮器。
- 捕捉層がタンパク質結合素材から作製される透析膜である、請求項2に記載の濃縮器。
- 上面層が複数の開口部を包含し、各開口部が1個のウェルを形成する、請求項1に記載の濃縮器。
- 10から100個までのウェルを包含する、請求項6に記載の濃縮器。
- 上面層と分離層との間に配置される多孔質層を包含する、請求項1に記載の濃縮器。
- 捕捉層と分離層との間に配置される多孔質層を包含する、請求項1に記載の濃縮器。
- 捕捉層に隣接して配置される遮断層を包含する、請求項1に記載の濃縮器。
- 緩衝層を包含する請求項10に記載の濃縮器であって、遮断層が捕捉層と緩衝層との間に配置される、上記濃縮器。
- 上面層と分離層との間に配置される多孔質層を包含する、請求項1に記載の濃縮器。
- 上面層と正対する底面層を有する請求項1に記載の濃縮器であって、底面層が電極である、上記濃縮器。
- 底部電極が光導電電極である、請求項13に記載の濃縮器。
- 光導電電極が単一の連続的半導体電極である、請求項14に記載の濃縮器。
- 光導電電極が非連続的半導体電極である、請求項14に記載の濃縮器。
- 分離層と捕捉層との間に配置される絞り層を包含する、請求項1に記載の濃縮器であって、絞り層が不浸透性領域および少なくとも1個の開口部を包含し、該少なくとも1個の開口部が多孔質素材を通じてウェル開口部と液体連絡状態にある、上記濃縮器。
- 多孔質の吸収性の親水性素材が絞り層の少なくとも1個の開口部中に配置される、請求項17に記載の濃縮器。
- 絞り層の不浸透性領域が捕捉層に接着されている、請求項17に記載の濃縮器。
- 絞り層の不浸透性領域が、熱溶接により捕捉層に接着されて少なくとも1個の絞り層開
口部の周囲の周りに環状溶接継目を形成する、請求項19に記載の濃縮器。 - 絞り層が捕捉層の下に配置され、該絞り層は不浸透性領域および少なくとも1個の開口部を包含し、該少なくとも1個の開口部が多孔質素材を通じてウェル開口部と液体連絡状態にある、請求項1に記載の濃縮器。
- 絞り層の不浸透性領域が捕捉層に接着されている、請求項21に記載の濃縮器。
- 絞り層の不浸透性領域が、熱溶接により捕捉層に接着されて少なくとも1個の絞り層開口部の周囲の周りに環状溶接継目を形成する、請求項22に記載の濃縮器。
- 第一の絞り層および第二の絞り層を包含する請求項1に記載の濃縮器であって、捕捉層が第一の絞り層と第二の絞り層との間に配置される、上記濃縮器。
- 第一の絞り層および第二の絞り層の双方がそれぞれ、多孔質素材を通じて同一のウェル開口部と液体連絡状態にある少なくとも1個の開口部を有する、請求項1に記載の濃縮器。
- 捕捉膜が、質量分析計により読み取り可能である少なくとも1個のマーカーを包含する、請求項1に記載の濃縮器。
- 捕捉層が、質量分析計により読み取り可能であるマーカー位置を有し、かつ、予め決められた位置がマーカー位置からある既知の距離にある、請求項1に記載の濃縮器。
- ウェルを形成する少なくとも1個の開口部を包含する上面層;
光導電電極である底面層;
多孔質捕捉層;
上面層と多孔質捕捉層との間に配置される分離層;
分離層と多孔質捕捉層との間に配置される絞り層であって、該絞り層は不浸透性領域および少なくとも1個の上面層開口部に対し同心の少なくとも1個の開口部を包含する;ならびに
絞り層中の環状溶接継目であって、該環状溶接継目は少なくとも1個の絞り層開口部の周囲を取り囲む
を含んでなる濃縮器。 - (a)ウェルを形成する少なくとも1個の開口部を包含する上面層、捕捉層、および上面層と捕捉層との間に配置される少なくとも1個の分離層を含んでなる濃縮器を提供すること;
(b)複数の被検体を包含するサンプルを濃縮器に入れること;
(c)捕捉層中に捕捉領域を形成すること;
(d)被検体の少なくとも1種を捕捉領域中で濃縮すること;
(e)分離層を濃縮器から取り除くこと;
(f)MALDIマトリックスを捕捉層に適用すること;
(g)濃縮器をMALDI質量分析計の分析プレートに取付けること;ならびに
(h)捕捉領域中の被検体を質量分析法により分析すること
を含んでなる、質量分析法による被検体の測定方法。 - 捕捉層が質量分析計により読み取り可能であるマーカー位置を包含し、かつ、捕捉領域がマーカー位置からある既知の距離にある、請求項29に記載の方法。
- 濃縮器が、室と整列させた光還元(photoreduction)領域をもつ電極層を包含し、少なくとも1種の被検体が、対極を濃縮器内でサンプルと電気連絡に置くこと;電極層と対極との間に電流を適用すること;および光還元領域を通して光源を向ける(direct)ことにより集束光源で捕捉領域を照射することにより捕捉領域中で濃縮される、請求項29に記載の方法。
- 濃縮器が磁性部分を包含し、かつ、MALDI質量分析計の分析プレートが磁性部分を包含し、また、濃縮器がプレートに磁気的に取付けられる、請求項29に記載の方法。
- サンプルが、少なくとも1個のウェル中にサンプルを入れることにより濃縮器中に配置される、請求項29に記載の方法。
- 捕捉層が、少なくとも1個の分離層を濃縮器から取り除いた後に乾燥される、請求項29に記載の方法。
- MALDIマトリックスが捕捉層にのみ適用される、請求項29に記載の方法。
- 集束電場により1個以上の予め決められた別個の位置で捕捉される被検体を有する多孔質捕捉膜であって、かつ、多孔質捕捉膜がMALDI質量分析計のサンプルプレートに嵌合するように適合される、上記膜。
- MALDIマトリックス物質が各別個の位置に適用されて、被検体と一緒になって1種、若しくはそれ以上のMALDIマトリックス結晶を形成する、請求項36に記載の膜。
- (a)サンプルが少なくとも1個の分離層と接触するように電解液を含有するサンプルを保持するための1個以上の室;
(b)上記少なくとも1個の分離層の下の多孔質捕捉膜;
(c)室と整列させた光還元領域をもつ電極層;
(d)室内でサンプルと電気連絡にある電極;
(e)光還元領域を照射しかつサンプル中の被検体を捕捉膜上の予め決められた別個の位置に集束させる光源
を含んでなる、請求項36に記載の多孔質捕捉膜の製造のための装置。
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