KR101802541B1 - 생물학적 관련 분자 및 이들의 상호작용 특징을 검출하는 방법 - Google Patents

생물학적 관련 분자 및 이들의 상호작용 특징을 검출하는 방법 Download PDF

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Abstract

화학적으로 불활성인 재료 시트 중의 미세 홀에 생물학적 관련 분자를 농축하고, 개구를 제한하며, 또 관통 홀을 통한 전류 또는 관통홀 개구 부근의 형광을 측정하는 것을 포함하는 생물학적 관련 분자의 검출 방법이 제공된다. 상기 전류 또는 형광은 분자가 홀 밖으로 확산됨에 따라서 변하며, 확산속도의 측도를 제공하므로 상기 분자의 존재와 특징을 검출한다. 상호작용하는 분자의 경우, 확산 속도는 상호작용하지 않는 분자에서보다 더 느릴 것이므로, 분자적 상호작용을 측정할 수 있다. 홀의 집단을 캡핑하고 질량 분석계에 삽입하면 분자의 확인을 허용한다.

Description

생물학적 관련 분자 및 이들의 상호작용 특징을 검출하는 방법{Methods for the detection of biologically relevant molecules and their interaction characteristics}
관련 출원의 교차-참조
본 출원은 2010년 2월 23일 출원된 미국 특허 가출원 번호 61/338676호를 35 U.S.C. 섹션 119(e)하에서 우선권 주장하고 있고, 상기 가출원은 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 분석물질 입자를 검출하고, 또 복합 매체 내에서 이들의 상호작용 특징을 결정하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 확산 면역측정법(diffusion immunoassays) 및 이들의 기능적 등가물에 관한 것이다.
단백질과 핵산과 같은 생물학적 관련 분자는 흔히 생물학적 시스템과 관련되며, 그러한 시스템에서 상기 분자들은 세포 복제, 대사, 자가-조절, 세포간 시그널링(signaling) 및 면역반응과 같은 과제 수행을 위한 복잡한 상호작용 네트워크를 형성한다. 질병들이 이러한 네트워크를 왜곡시키며, 이러한 왜곡의 이해는 질병의 초기 검출과 약물 치료를 통한 상기 왜곡의 화학적 수선을 위해 기본적인 것이다. 상기와 같은 상호작용 네트워크에 대한 이해를 습득하기 위하여 이들 대형 분자를 확인하고 특징화하기 위한 수법이 기존에 다수 존재하지만, 각각은 특정의 제한 문제를 지니고 있다. DNA와 같은 핵산에 대해 사용되는 수법은 이들의 분석적으로 바람직한 특성으로 인하여 대개 성공적이었지만, 단백질은 화학적으로 또 물리적으로 다양하다. 이러한 다양성으로 인하여, 복잡한 단백질 네트워크를 특징화하는데 있어서 광범위한 수법이 훨씬 더 유익할 것으로 보여질 때, 필요에 따라 범위를 좁혀 집중된 분석 수법을 초래한다. 또한, 단백질은 검출할 수 없는 농도에서도 기능적으로 현저하지만, 핵산처럼 용이하게 증폭될 수는 없기 때문에, 고유 감도가 높은 수법을 필요로 한다.
유전자 방법
단백질 상호작용은 전통적인 유전학을 이용하여 조사될 수 있다. 동일 세포 또는 생물에서 상이한 돌연변이들을 조합한 다음, 그로 인하여 생성한 표현형을 관찰한다. 이는 단백질 상호작용이 거의 완전한 천연 환경에서 생기게 한다. 불행히도, 이들 방법은 소 그룹의 단백질에만 적용할 수 있고, 전체 단백질군(proteome) 연구에는 사용될 수 없다. 또한, 표현형 변화는 유전자 돌연변이와 관련된 다수의 이유에 의해 유발될 수 있으므로, 실험 결과에 의해 제시된 단백질 상호작용은 생화학적 수준에서 확인을 필요로 할 것이다.
생물정보 방법
단백질 상호작용은 단백질의 기능적 부가설명(annotation)을 위해 대조적 유전체학(genomics)을 이용하여 연구될 수 있다. 현재, 3개의 주요 수법이 존재한다. 그 첫째 수법은 도메인 융합(또는 로제타 스톤)이라 불리는 것으로, 단백질 도메인(domain)이 별개의 폴리펩티드로서 동작할 수 있는 구조적으로 또 기능적으로 독립적인 단위라 추정하고 있다. 두 번째 수법은 세균 유전자의 오페론 구조를 기본으로 하며, 오페론 구조에서 이러한 유전자는 흔히 이들의 실제 서열이 이질적이더라도 기능적으로 관련된다. 세 번째 수법은 계통적 프로파일링(phylogenic profiling)을 이용하는 것으로, 특정 기능에서 함께 관련되는 유전자의 진화적 보존을 활용한다. 불행히도, 이들 생물정보 방법은 완전한 게놈 서열을 필요로 하고, 또 일반적으로 잘 정의된 오페론(operons)을 갖는 세균 또는 기타 생물에 한정된다. 또한, 그 결과는 특정 단백질 상호작용의 결정적인 증거는 아니며, 또 생화학적 수준에서 확인을 필요로 한다.
친화성을 기본으로 한 방법
단백질 상호작용은 면역측정법에서와 같이 단백질 및 상호작용성 후보 파트너 사이의 친화성을 직접적으로 결정하는 것에 의해 생화학적 수준에서 조사될 수 있다. 단백질은 정지상 또는 평평한 유리 표면 상에 고정화되며, 잠재적 상보적 리간드의 혼합물을 상기 고정화된 단백질 위로 흘려준다. 결합은 리간드에 화학적으로 부착된 다음 영상화되는 형광 또는 방사성활성 프로브에 의해 표시된다. 불행히도, 단백질은 고정화 방법에 의해 기능적으로 심각하게 제한될 수 있다. 관련된 수법은 단백질 자체를 화학적으로 라벨링한 다음 고정화된 리간드에 의해 코팅된 표면 위로 이들을 흘려준다. 그러나, 상기 방법은 단백질이 동일 효율로 균일하게 라벨링되지 않는 문제가 있고, 또 상기 라벨의 화학적 부착은 단백질 상호작용의 범위를 방해할 수 있는 문제가 있다. 더구나, 라벨의 부착은 단백질 용해도에도 나쁜 영향을 줄 수 있고, 또 형광 프로브는 상기 부착에 의해 소거(quenched)될 수 있다. 검출은 또한 전기화학적 암페어측정법(예컨대, 미국 특허 US 7,297,312호)에 의해서도 실시될 수 있지만, 상기 결점들이 그대로 잔류한다.
확산 면역측정법은 미세모세관 채널(예컨대 미국 특허 US 6,541,213호, US 7,271,007호, US 7,306,672호, US 7,060,446호, US 7,704,322호, 및 미국 특허출원 US 2010/0263732호, US 2008/0182273호, US 2003/0096310호, US 2009/0053732호 및 US 2003/0234356호), 또는 기능적 등가물에서 인접하는 한 쌍의 유체 유동을 이용할 수 있으며, 상기 유동 계면에서 2개 유체 중의 성분 사이의 상호작용은 확산 특징에서 변화를 유발하며, 이것이 유체 계면 부근의 농도 프로필에 영향을 준다. 농도 프로필의 검출은 상호작용에 대한 정보를 제공한다. 이것은 정지 상과 관련된 문제를 피하게 하지만, 여전히 라벨의 사용을 선호하며, 또 샘플당 오직 1개 측정만이 실용적이다(즉, 비-순환성). 다가 반응물의 사용(예컨대 US 7,550,267호)은 확산 계수 차이가 큰 성분의 사용을 허용하지만, 라벨링 및 비-순환성의 측정 결점은 잔존한다. 다공성 막을 사용하는 관련 장치(예컨대 US 5,212,065호)는 동일한 결점을 갖는다. 다수의 전기화학적 센서 위에 중합체 박층의 사용(예컨대 US 7,144,553호)은 중합체를 투과하는데 관련된 시간 지연을 통한 확산 특징을 결정할 수 있지만, 협소한 구멍(hole)에서 분석물질을 농축하지 않으며(따라서, 감도 향상), 또 유체역학적 유동을 통하여 센서를 향하여 센서로부터 멀어지게 분석물질을 순환시킬 수 없다. 확산은 분석물질 시스템을 광학적으로 추적하는 것에 의해 측정(예컨대 US 2008/0145856호)될 수 있지만, 라벨링 기술의 이용을 선호하는 결점을 갖는다. 확산은 히드로겔 내로의 침투 깊이를 검출하는 것에 의해 측정(예컨대 US 2006/0115905호)될 수 있지만, 이것은 라벨링 기술의 이용을 선호하는 결점을 갖는다.
단백질 분자가 미세채널을 통과함에 따라서 미세채널 전기전도도 측정은 횡방향 콘덕턴스로 변하며, 이것은 무-라벨 단백질 상호작용 검출(예컨대 US 2005/0109621호)에 유용할 수 있는 것으로 기재되어 있다. 그러나, 상기 방법은 확산 특성을 간접적으로만 측정하므로, 상기 측정을 순환하기 어렵다. 전기전도도는 또한 무-라벨 세포 배양 모니터링(예컨대 US 7,732,127호 및 US 7,192,752호)을 위해서도 사용되어 왔지만, 이들은 단백질 및 이들의 상호작용의 직접적 측정은 아니다. 나노갭의 사용(예컨대 US 2005/0136419호)은 전기화학적 측정의 특정 이중층 문제를 피하지만, 테더링 기술(tethering technology)의 사용을 선호하는 결점을 갖는다.
물리적 방법
단백질 상호작용은 물리적 수준에서 조사될 수 있다. X-선 결정화 및 핵자기 공명(NMR)의 수법은 분자 내의 단백질 원자의 위치를 결정하며, 또 생성한 3차원 지도는 다른 분자가 그의 위상기하학과 전하 분포에 들어맞는 것을 제시하기 위해 이용될 수 있다. 불행히도, X-선 결정화는 조사하려는 각 단백질에 대하여 어렵고 시간 소모적 방법인 단백질 결정의 성장을 필요로 하며, 또 결정 환경은 단백질이 작용하는 수성 환경보다 훨씬 상이하다. NMR은 다량의 정제된 단백질을 필요로 하며, 또 생성한 복합체 데이터의 분석은 결정적이지 않을 수 있다.
표면 플라스몬 공명 수법은 금속 필름에 대한 단백질 접착을 이용하지만, 이것은 단백질 기능에 나쁜 영향을 줄 수 있다.
형광 공명 에너지 전달(FRET) 수법은 1개 형광단의 방출 스펙트럼이 다른 형광단의 여기(excitation)와 중첩할 때 형광단 부근 사이에서 생길 수 있는 에너지 전달을 이용한다. 1개의 상호작용 후보 파트너를 1개 형광단으로 라벨링하고, 또 다른 상호작용 후보 파트너를 다른 형광단으로 라벨링한 다음, 하나를 희생하여 1개 형광단의 형광에서 증가로 상호작용을 나타낼 것이다. 이 작업은 일시적 상호작용에 대해서도 잘 작용한다. 불행히도, 상기 작업은 매 단백질마다 형광단을 화학적으로 부착시키는 것을 필요로 하며, 이는 단백질 기능에 나쁜 영향을 줄 수 있다.
덴드론-단리된 분석물질의 원자력 현미경 수법(예컨대 US 6,645,558호, US 2008/0113353호, US 2009/0048120호 및 US 2010/0261615호)은 개별 분석물질 분자를 검출할 수 있지만, 테터링 결합 및 광범위한 샘플 제조를 필요로 한다.
표준 발현 라이브러리
단백질 상호작용은 라벨링될 수 있고 또 프로브로서 사용될 수 있는 목적 단백질을 생성하는 cDNA의 라이브러리의 사용을 통하여 조사될 수 있었다. 전형적으로, 상기 목적 단백질은 파아지 입자의 사용을 통하여 생성된다. 상기 수법은 목적 단백질과 그의 상응하는 cDNA의 결합을 허용하지만, 처리량이 낮은 주요 결점이 있어; 각 목적 단백질에 대한 스크리닝이 필요하다. 또한, 목적 단백질의 생산은 천연 조건하가 아니므로, 잘못된 폴딩(folding)과 부정오류(false negatives)를 초래한다.
파아지 상호작용 디스플레이
단백질 상호작용은 발현 클로닝 전략의 이용을 통하여 조사될 수 있다. cDNA 서열을 파아지 단백질 피막 유전자(coat gene) 내로 삽입하고, 또 세균 세포에서 배양한다. 이어 파아지는 그의 피막 상에서 신규 단백질을 발현한 다음, 단백질 상호작용 분석을 위해 사용될 수 있다. 이러한 파아지의 혼합물이 웰(well) 중의 고정화되지 않은 라벨링된 단백질과 상호작용하면, 상기 웰은 상호작용성 파아지만을 그로부터 형성된 cDNA 서열과 함께 남기도록 헹구어질 수 있다. 이 cDNA 서열은 세균 감염에 의해 대량으로 증폭될 수 있다. 이러한 수법은 자동화된 평행 스크리닝(parallel screening)에 잘 적응된다. 불행히도, 표준 발현 라이브러리에 의하면, 상기 단백질은 천연 조건하에서 형성되지 않는다. 또한 상기 수법은 파아지 표면 상에서 형성될 수 있는 짧은 펩티드에만 한정된다.
효모 2- 하이브리드 시스템
단백질 상호작용은 시험관 내에서보다 단백질 발현에 대하여 더욱 천연 환경인 효모 세포 내의 전사 인자를 통하여 조사될 수 있다. 조사 중인 단백질은 반수체 효모 세포에서 전사 인자로부터 DNA-결합 도메인과의 융합물로서 발현된다. 다른 단백질은 다른 반수체 효모 세포에서 동일 전사 인자의 트랜스활성화(transactivation) 도메인과의 융합물로서 발현된다. 상기 2개 효모 균주를 배수체 균주로 짝지우면 상기 2개 단백질이 상호작용하게 한다. 이들이 상호작용하면, 상기 전사 인자는 조립되어, 활성화될 시험 유전자를 유발할 것이다. 이 수법은 대규모 스크리닝에 적합하지만, 몇 가지 결점이 있다. 실험 반복성이 아주 낮아서, 환경 조건에 대하여 지나친 감수성을 제시하거나, 또는 스크리닝이 광범위하지 않다. 다른 더 특수한 수법으로부터 잘 확립된 상호작용을 검출하기 위한 상당수의 실패가 존재하였고, 이는 고도의 부정오류를 나타낸다. 마지막으로, 상당 수의 검출된 상호작용은 추가의 분석에 의해 타당하지 않은 것으로 밝혀졌는데, 이는 고도의 긍정 오류(false positives)를 나타낸다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌은 그 내용이 상반되지 않을 정도로 그 전체 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
발명의 요약
본 명세서에 기재된 방법은, 분석물질 입자(예컨대 생물학적 관련 분자)를 검출하여 특징화하고, 분석물질 입자에 대한 구조적 변화를 특징화하며, 또 이들의 상화작용을 확인하기 위하여, 스페로이드(spheroid), 자계, 형광, 광학, 필터 기술, 겔 기술, 화학, 전기화학, 크로마토그래피 및 매트릭스-보조된 레이저 탈착 이온화(MALDI)를 비롯한 기존의 기술의 조합을 이용한다.
본 발명에 따른 일개 방법에서, 분석물질 입자는 용매 유동 또는 전계와 같은 수단에 의해 이온 환경(수성 염수와 같은)의 현미경 저장소(reservoir) 내에 포획된다. 일단 포획되면, 포획 수단이 종료되고, 분석물질 입자가 저장소 밖으로 확산됨에 따라서 저장소의 전기적 도전성을 측정한다. 이러한 전기적 도전성은 이온 유동의 용이성의 측도이다. 이온 유동은 분석물질 입자에 의해 한정되기 때문에, 상기 도전성은 분석물질 입자가 저장소 밖으로 확산됨에 따라 저하질 것이다. 도전성이 저하되는 기간 동안의 시간 프레임은 분석물질 입자 확산 계수의 측도를 제공한다. 이러한 확산계수는 크기 및 형상과 같은 분석물질 입자 특징의 측도를 제공한다. 확산을 보충하거나 억제하기 위하여 전계의 이용은 분석물질 입자의 전하 특징을 연구하기 위해 또한 적용될 수 있다. 또한, 결합 상호작용을 나타내는 2개의 분석물질 입자는 개별 분석물질 입자에 대하여 확산계수 감소를 나타낼 것이다; 이러한 감소는 결합 상호작용의 측도를 제공한다. 상기 분석물질 입자가 저장소 밖으로 확산된 후, 이들은 저장소 내에 다시 포획될 수 있으므로, 상기 측정은 연속 주기로 반복될 수 있다.
상기 제1 방법과 유사한 다른 방법으로, 분석물질 입자 확산계수의 측정을 제공하기 위하여 전기적 도전성 대신 형광이 이용된다. 이러한 형광은 형광의 개시를 지연하기 위한 전계에서 이온 유동의 제한을 유발하는 것에 의해, 또는 형광 입자 자체의 유동 제한을 유발하는 것에 의하여 이용될 수 있다.
다른 방법은 분석물질 입자를 저장소 내에 물리적으로 포획하는 것을 포함할 수 있으므로, 상기 저장소는 수성 환경에 머무르는 동안 질량 분석계의 진공 챔버로 이동될 수 있다. 분석물질 입자의 수성 매트릭스를 증발시키기 위하여 레이저 절삭(laser ablation)을 이용하여 분자 단편화에 대하여 향상된 제어를 갖는 질량 분석계 샘플을 제공할 수 있다.
본 발명의 방법은 크기 차이가 큰 분석물질 입자에 대해, 또 연관된 분석물질 입자의 하나 이상이 지질 환경에 있는 상황의 경우에 대해 이원적, 삼원적, 또는 그 이상의 상호작용을 찾기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 바이오마커 발견, 약물 발견, 및 약물 평가를 위해 광범위하게 적용될 수 있다. 기존의 방법에 비하여 이들 방법의 강력한 이점은 이 방법이 무-라벨(label-free) 및 무-테터(tether-free)이라서, 화학적으로 부착된 라벨 또는 테터 없이 분석물질 입자가 자신의 천연 상태에서의 상호작용을 보장하는 점이다; 라벨 및 테터는 여전히 사용될 수 있지만, 반드시 필요한 것은 아니다. 상기 방법은 또한 pH 또는 다른 용액 특징과 대개 독립적이고, 불투명한 복합 수성 혼합물과 함께 사용될 수 있으며, 극히 적은 샘플 부피를 사용할 수 있고, 또 향상된 감도를 위해 상기 측정이 순환되게(즉, 반복) 한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 실질적으로 유사한 직경의 복수의 관통홀을 갖는 재료 시트(sheet of material)를 제공하는 단계; 상기 재료의 적어도 일개 면(face)의 관통홀 개구를 제한하는 단계; 상기 관통홀의 부분집단(sub-population)에 분석물질 입자를 삽입하는 단계; 분석물질 입자를 함유하는 상기 관통홀을 통하여 전계를 인가하는 단계; 상기 분석물질 입자의 확산 속도를 나타내는 시간에 따른 전류 흐름의 변화를 측정하는 단계를 포함하며; 상기 분석물질 입자의 확산속도가 분석물질 입자의 존재, 특징, 및 상호작용의 정도를 제공하는, 분석물질 입자 존재, 특징, 및 상호작용을 검출하는 방법이 제공된다.
상기 재료 시트는 폴리카보네이트; 트랙-에칭된 폴리카보네이트; 복수의 홀에 의해 드릴링된 중합체; 복수의 홀에 의해 화학적으로 에칭된 중합체; 복수의 홀에 의해 드릴링된 유리; 복수의 홀에 의해 화학적으로 에칭된 유리; 천공된 중합체 필름; 천공된 단층 필름 또는 천공된 다층 필름을 포함할 수 있다. 전형적으로, 상기 재료는 전기적 절연성이고 또 실질적으로 화학적으로 불활성이다. 상기 재료 시트는 두께가 500 nm 내지 1000000 nm 범위일 수 있다. 다르게는, 1 nm 내지 10 cm 범위의 두께일 수 있다. 상기 관통홀은 10 nm 내지 5000nm 직경일 수 있다. 다르게는, 상기 관통홀은 1 nm 내지 1 cm 직경일 수 있다. 일개 배열에서, 관통홀의 내면(inner surface)은 화학적으로 유도체화(derivatized)될 수 있다. 다르게는, 관통홀의 외면(outer surface)은 화학적으로 유도체화될 수 있다. 관통홀은 겔에 의해 충전될 수 있다.
일 실시양태에서 관통홀은 상기 재료 시트의 표면과 접촉하는 겔 층을 도포하는 것에 의해 제한된다. 상기 겔은 젤라틴; 아가로오스; 폴리아크릴아미드; 폴리아크릴레이트; 투과성 중합체; 투과성 공중합체; 녹말; 에어로겔; 콜로디온; 투석 막; 분석물질 입자 매트릭스와 비혼화성 유체; 화학적으로 변형된 형태의 상기 수록된 재료; 입자가 매립된 상기 수록된 재료 및 그의 조합을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서 관통홀 개구는 상기 홀을 통한 유체 유동에 실제적 제한을 유발하도록 형성된 직경을 갖는 스페로이드를 사용하여 제한된다. 스페로이드는 중력; 구심력; 원심분리력; 유체역학적 압력; 정수압(hydrostatic pressure); 화학결합에 의해 또는 겔 매트릭스를 사용하여 제 위치에서 유지될 수 있다. 스페로이드의 조성에 따라서 스페로이드는 전계를 인가하는 것에 의해 또는 자계 구배를 인가하는 것에 의해 위치에서 유지될 수 있다.
스페로이드가 겔 매트릭스를 사용하여 위치에서 유지되면, 상기 방법은 겔 매트릭스로부터 스페로이드를 제거하는 추가의 단계를 더 포함할 수 있다.
유리하게는 상기 전류 흐름은 확산 속도를 측정하기에 충분한 속도로 시트의 선택된 영역을 통하는 전류를 측정하도록 형성된 전류계(amperometer)를 이용하여 측정한다.
상기 선택된 영역은 재료 시트와 물리적으로 접촉하는 일개 단부를 갖는 절연 튜브, 재료 시트의 표면에 도포된, 홀을 갖는 절연 시트, 또는 재료 시트의 표면에 도포된 절연성 수-비혼화성 유체를 사용하여 선택할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 실질적으로 유사한 직경의 복수의 관통홀을 갖는 재료 시트를 제공하는 단계; 상기 재료의 적어도 일개 면(face)의 관통홀 개구를 제한하는 단계; 상기 관통홀의 부분집단(sub-population)에 분석물질 입자를 삽입하는 단계; 분석물질 입자를 함유하는 상기 관통홀을 통하여 축방향으로 이동력을 통과시키는 단계; 전계를 인가하는 단계; 상기 분석물질 입자의 확산 속도를 나타내는 시간에 따라 형광의 변화를 측정하는 단계를 포함하며; 또 상기 분석물질 입자의 확산속도가 분석물질 입자 존재, 특징, 및 상호작용의 측정을 제공하는, 분석물질 입자 존재, 특징, 및 상호작용을 검출하는 방법이 제공된다.
바람직하게는 형광은 확산 속도가 측정되기에 충분한 속도로 시트의 선택 영역의 형광을 측정할 수 있는 광도 시스템(photometric system)에 의해 측정한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 실질적으로 유사한 직경의 복수의 관통홀을 갖는 재료 시트를 제공하는 단계; 상기 재료의 적어도 일개 면의 관통홀 개구를 제한하는 단계; 상기 관통홀의 부분집단에 분석물질 입자를 삽입하는 단계; 상기 관통홀 개구를 실질적으로 닫는 단계; 상기 재료 시트를 질량 분석계에 삽입하는 단계; 상기 재료 시트의 선택 영역을 절삭하는 단계; 생성한 절삭 생성물을 이온화하는 단계; 생성한 이온의 질량/전하 비율을 측정하는 단계를 포함하고; 또 상기 질량/전하 비율은 분석물질 입자를 확인하는 수단을 제공하는, 분석물질 입자를 확인하는 방법이 제공된다.
상기 방법은 스페로이드를 상기 관통홀 개구의 입구에 압착시켜 넣어 상기 개구가 실질적으로 닫아지게 하는 것에 의해 관통홀 개구를 제한하는 단계를 더 포함한다.
본 발명을 더욱 잘 이해하기 위하여, 본 발명에 따른 방법은 예시적으로 첨부 도면을 참조하여 설명될 것이다.
도 1A는 본 발명의 방법에 사용된 천공된 재료의 개략도이다;
도 1B는 도 1A의 x-x선을 통한 천공된 재료의 횡단면도이다;
도 2는 도 1의 천공된 재료에서 단일 홀의 확대도이다;
도 3은 제어된 두께의 이층 재료의 제조를 예시한다;
도 4는 폴리아크릴아미드 겔을 형성하기 위한 공지 화학을 예시한다;
도 5는 도 3으로부터 이층 재료의 확대도이다;
도 6은 펩티드 결합 합성의 공지 화학을 예시한다;
도 7은 서로 근접하고 있는 도 1의 천공된 재료 및 도 3의 이층 재료의 개략도이다;
도 8은 도 1의 천공된 재료 및 도 3의 이층 재료가 펩티드 결합에 의해 함께 결합되어 생성된 구조의 개략도이다;
도 9는 이층의 외부층이 제거되어 천공된 재료에 부착된 겔 층을 남기는 도 8의 구조의 개략도이다;
도 10은 겔의 외면에 화학적으로 결합된 형광단 또는 계면활성제를 갖는 도 9에서의 변화의 개략도이다;
도 11은 구조의 조립 이전에 천공된 재료에서 홀의 일개 단부를 막는 스페로이드를 작은 갭과 함께 갖는 도 9에서의 변화의 개략도이다;
도 12는 도 11의 스페로이드의 위치를 제거하는 것에 의해 자계 구배와 같은 것으로부터 힘의 장애제거(unclogging) 효과의 개략도이다;
도 13은 구조의 조립 이전에 천공된 재료에서 홀의 일개 단부를 막는 스페로이드를 갭 없이 갖는 도 9에서의 변화의 개략도이다;
도 14는 천공된 재료에서 홀의 양 단부를 막게 하는 스페로이드를 갖는 도 9의 변화의 개략도이다;
도 15는 도 14의 스페로이드 중의 하나를 제거하여 생긴 겔에서의 인열부(tear)의 개략도이다;
도 16은 천공된 재료에서 홀의 한쪽 단부를 막게 하는 스페로이드를 겔 없이 갖고, 자계 구배와 같은 힘에 의해 자리에서 유지되는 도 9의 변화의 개략도이다;
도 17은 도 9의 구조의 홀을 통한 유체 유동의 개략도이다;
도 18은 도 9의 구조의 홀에서 분석물질 입자의 축적의 개략도이다;
도 19는 전계 E에 의해 유도된 형광단 이동의 개략도이다;
도 20은 자계 구배 nabla B에 의해 유도된 형광단 이동의 개략도이다;
도 21은 중력계 G에 의해 유도된 형광단 이동의 개략도이다;
도 22는 전계 E에 의해 유도된 전해재료 이동의 개략도이다;
도 23은 전계 E에 의해 유도된 전해재료 이동을 초래하는 커패시터 형성의 개략도이다;
도 24는 도 23의 커패시터와 결합된 전계를 도시한다;
도 25는 도 23의 형광단으로 전기적 전하를 전달하는 것을 도시한다;
도 26은 a) 장애 없음, b) 작은 장애 및 c) 실질적 장애에 대한 분자 장애물 부근의 형광단 이동의 개략도이다;
도 27은 a) 장애 없음, b) 작은 장애 및 c) 실질적 장애에 대한 분자 장애물 부근의 전해질 이동의 개략도이다;
도 28은 a) 장애 없음, b) 작은 장애 및 c) 실질적 장애에 대한 하전된 분자 장애물 부근의 전해질 이동의 개략도이다;
도 29는 이동된 형광단의 자외선에 의한 여기 및 가시광선의 방출의 개략도이다;
도 30은 하전된 형광단의 자외선에 의한 여기 및 가시광선의 방출의 개략도이다;
도 31은 전극으로의 전류 흐름의 개략도이다;
도 32는 도 9의 구조의 홀에 분석물질 입자가 로딩되는 방법의 개략도이다;
도 33A는 분석학적으로 유용한 방식으로 전류가 검출되는 방식의 개략도이다;
도 33B는 도 33A 중의 분석물질 입자를 전달하는 튜브의 선단(tip)의 확대도이다;
도 33C는 도 33A로부터 생성한 콘덕턴스 맵을 도시한다;
도 34A는 분석학적으로 유용한 방식으로 형광이 검출되는 방식의 개략도이다;
도 34B는 도 34A로부터 얻은 사진을 도시한다;
도 35는 전계가 인가될 때 시간 경과에 따라 발생하는 콘덕턴스 맵(map)을 도시한다;
도 36은 이동력이 인가될 때 시간 경과에 따라 발생하는 사진 영상을 도시한다;
도 37은 단백질 분자 부재시 대 단백질 분자 존재할 때 홀의 작은 집단에 대한 전류에서 수직(증가) 변동을 도시한다;
도 38은 단백질 분자 부재시 대 단백질 분자 존재할 때 홀의 작은 집단에 대한 형광 굴절점(inflection point)에서 수평적(일시적) 변동을 도시한다;
도 39는 홀의 작은 집단에서 단백질 분자의 존재시 및 홀의 다른 작은 집단에서 단백질 분자의 부재시 반복된 델타 전류 측정을 도시한다;
도 40은 홀의 작은 집단에서 단백질 분자의 존재시 및 홀의 다른 작은 집단에서 단백질 분자의 부재시 반복된 델타 시간 측정을 도시한다;
도 41은 홀의 작은 집단에서 단백질 이원적 상호작용 및 홀의 다른 작은 집단에서 단백질 이원적 비-상호작용의 반복된 델타 전류 측정을 도시한다;
도 42는 홀의 작은 집단에서 단백질 이원적 상호작용 및 홀의 다른 작은 집단에서 단백질 이원적 비-상호작용의 반복된 델타 시간 측정을 도시한다;
도 43은 도 9의 천공된 재료의 홀의 큰 집단의 개략도이다;
도 44는 천공된 재료의 분자종의 영구 포획의 제1 단계의 개략도이다;
도 45는 천공된 재료의 분자종의 영구 포획의 제2 단계의 개략도이다;
도 46은 천공된 재료에서 영구적으로 포획된 분자종의 개략도이다;
도 47은 천공된 재료의 홀에서 포획된 분자종의 레이저에 의한 조명의 개략도이다; 또
도 48은 도 43의 포획된 분자종의 증발을 도시하는 개략도이다.
발명의 상세한 설명
발명의 실시양태는 독특한 방식으로 기존 기술의 조합을 이용한다. 이들 기존의 기술은 스페로이드, 자계, 형광, 광학, 필터 기술, 겔 기술, 화학, 전기화학, 크로마토그래피, 및 매트릭스-보조된 레이저 탈착 이온화(MALDI)를 포함한다. 이들은 개별적으로 그 개요를 살펴본 다음, 본 발명의 다양한 실시양태에 따른 방법을 설명할 것이다. 본 특허 명세서를 통하여 동일 부품을 나타내기 위하여 동일 참조 번호를 이용한다.
스페로이드
스페로이드는 http://www.microspheres-nanospheres.com/과 같은 다양한 제조자로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
이들은 50 nm 내지 5000 nm 범위의 고정밀도 직경을 가지며, 또 폴리스티렌 또는 폴리스티렌/멜라민 공중합체와 같은 다양한 물질로 제조될 수 있다. 부가적으로, 이들은 자기 활성 물질에 의해 함침될 수 있고, 또 형광 물질에 의해 함침될 수 있다. 또한, 이들 입자는 잘 확립된 화학에 의해 다수의 리간드가 부착될 수 있는 아민(NH2) 또는 카복실(COOH)과 같은 유도체화된 표면을 갖도록 제조될 수 있다. 이들은 단백질 정제 과정을 위해 흔히 사용되며, 이때 특정 단백질이 표면 리간드에 결합된 다음 벌크 용액(bulk solution)으로부터 자기적으로 추출될 수 있다.
자계
자계 구배에서, 산화제일철 입자와 같은 자성 모멘트를 갖는 입자는 자계의 수렴을 향하여 자성 모멘트 M과 구배 nabla B의 세기의 단순한 곱의 크기를 갖는 힘을 경험할 것이다.
자계 구배는 전류를 운반하는 단순 솔레노이드에 의해 생성될 수 있다. 전형적인 솔레노이드는 언제나 솔레노이드의 중심을 향하도록 지시된 솔레노이드의 단부의 외측에 최대 자계 구배점을 갖는다. 각각 전류의 옵셋 사인파를 운반하는 한쌍의 대향하는 솔레노이드를 사용하여 임의 세기와 극성의 자계 구배를 생성할 수 있다.
형광
형광 물질은 짧은 파장의 광을 흡수한 다음, 긴 파장의 광으로 에너지를 방출한다. 바이오기술 분야에서 널리 사용되는 상업적으로 입수가능한 다수의 형광 염료가 존재한다. 그 일례는 나트륨 플루오레세이네이트이며, 이것은 자외선을 흡수하고 녹황색 광을 방출한다. 중성 형태인 플루오레세인은 비-형광성이다. 형광 분자 이외에, 퀀텀 도트(양자점)로 불리는 새로운 유형의 물질도 또한 형광이다. 이들은 황화 카드뮴(CdS) 또는 카드뮴 텔루라이드(CdTe)와 같은 반도체 입자로 구성된다. 이들은 매우 소형이고, 직경이 수 나노미터 정도이고 또 극도로 형광이다. 입자의 표면은 잘 확립된 화학에 의해 다수의 리간드가 부착될 수 있는 아민(NH2) 또는 카복실(COOH)과 같은 다양한 물질에 의해 유도될 수 있다. 이들은 흔히 현미경 염색을 위해 흔히 사용된다.
광학
형광은 짧은 파장의 광(자외선과 같은)에 의해 형광을 여기시키고, 또 방출된 긴 파장의 광(가시광선과 같은)을 광센서에 의해 수집하는 것에 의해 검출될 수 있다. 자외선 공급원의 예는 수은-증기 전구(bulb) 및 LED 레이저이다. 근자외선의 경우, 블루-레이(Blu-Ray) 디스크에 흔히 사용되는 405 nm LED 레이저가 특히 편리하다. 방출된 형광은 광학 렌즈 또는 광 파이프에 의해 수집될 수 있고 또 광센서로 보내진다. 광센서의 예는 광전자증배관 튜브 및 디지털 카메라이다. 광전자증배관 튜브는 높은 감도와 속도를 가지며, 또 디지털 카메라는 광범위한 영역을 측정할 수 있다.
필터 기술
트랙-에칭된 폴리카보네이트(TEPC)를 포함하는 독특한 유형의 천공된 재료(10)는 필터링에 사용하기 위해, 밀리포어 코포레이션 또는 홧트만 코포레이션으로부터 시중에서 입수가능하다.
TEPC는 매끈한 유리상 표면을 갖고, 매우 균일한 크기의 관통홀(14)을 통하여 무작위로 구멍이 난 폴리카보네이트 재료 시트(12)를 포함한다. 도 1A 및 도 1B는 이러한 천공된 재료(10)의 개략적 대표이다. 이들 홀(14)은 10 nm 내지 5000 nm 크기로 입수가능하고, 또 6000 내지 11000 nm 두께의 재료이다. 이들은 등록상표 폴리카보네이트 재료 시트를 조사(irradiating)하는 것에 의해 생성된다. 상기 홀(14)은 상당히 평행하다. 상기 재료는 적은 정도의 형광을 나타내지만, 흑색으로 염색될 수 있다. 상기 재료는 자외선을 강하게 흡수한다. 상기 표면은 폴리비닐 피롤리돈에 의해 특수하게 처리되어 소수성으로 되며, 알코올에서 침지하는 것에 의해 제거될 수 있다. 홀의 밀도에 따라서, 경우에 따라 홀의 일부 중첩이 존재한다.
겔 기술
기술적으로, 겔은 액체에 의해 충전된 개방된 가교 구조로 구성된다. 그러나, 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "겔"은 그의 엄격한 기술적 정의에 제한을 받지 않지만, 일반적으로 분석물질의 확산을 제한하는 것에 관련된 임의 물질을 지칭한다. 일반적 겔은 젤라틴, 아가로오스, 또는 아크릴아미드로부터 제조된다. 이들의 개방된 가교 구조의 밀도는 겔을 형성하기 위해 사용된 물질의 농도를 조절하는 것에 의해 용이하게 제어된다. 젤라틴 또는 아가로오스로부터 제조되는 일부 겔은 융점을 가지며, 그 아래 온도에서 겔 구조가 형성된다. 아크릴아미드로부터 제조되는 다른 겔은 화학적으로 유도된 중합체화 또는 자외선 유도된 중합체화에 의해 형성될 수 있다. 이들 겔은 겔 전기영동으로 불리는 인기있는 수법으로 단백질의 복잡한 혼합물을 분리하기 위하여 바이오기술 분야에서 자주 사용된다. 이 수법에서, 단백질 혼합물의 농축된 등분량(aliquot)을 겔의 시트 중앙에 주입한 다음 시트의 각 단부에 있는 겔에 전계를 인가한다. 겔의 개방 가교 구조는 기본적으로 단백질 분자가 통과할 수 있는 기공의 집합이다. 단백질 분자는 전형적으로 특징적 전하 및 직경을 갖기 때문에, 겔의 기공을 통한 특정 속도에서 전계에서 이동하려는 경향이 있다. 각 단백질 유형은 독특한 전하와 직경을 갖기 때문에, 상기 단백질 혼합물은 그의 성분으로 물리적으로 분리될 것이다.
겔의 교차 구조가 충분히 조밀하면, 작은 분자만이 기공을 통과할 수 있을 것이고, 또 큰 분자는 주입 지점으로부터 전혀 이동하지 않을 것이다. 그 이상에서는 이동이 생기지 않는 분자 크기를 겔의 제한 한계(Exclusion Limit)라 흔히 칭한다. 폴리아크릴아미드의 경우, 상기 제한 한계는 대부분의 전형적인 단백질보다 작게 될 수 있다.
화학
아크릴아미드 공중합체화는 잘 공지된 반응이며, 겔 전기영동을 위해 사용된 겔을 생성하기 위해 보통 사용된다. 아크릴아미드 단량체를 N.N'-메틸렌비스아크릴아미드(bis)와 같은 가교제와 혼합하고, 또 퍼설페이트 음이온과 같은 자유 라디칼 및 삼급 지방족 아민 N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)과 같은 개시제를 사용하여 촉매화하는 것에 의해 제조된다. 또한 리보플라빈 및 장파장 자외선에 의해 중합체화될 수 있다. 우레아와 같은 부가적인 시약을 사용하여 겔의 기공성을 감소시킬 수 있다. 부가적으로, 적층 화학에서 도움을 주기 위하여 폴리아크릴레이트와 같은 다른 중합체도 포함될 수 있다.
카복실레이트 유도체화 및 아민 유도체화는 분자 또는 표면과 같은 기질이 수성 시약과 화학적으로 반응하도록 유도되어, 카복실레이트 또는 아민 잔기를 기질에 부착하도록 하는 과정이다. 예를 들어, 폴리카보네이트 표면은 적절한 유기 아지드와의 처리에 의해 유도체화되어 일급 아민 잔기를 얻거나, 또는 그의 폴리비닐 피롤리돈 표면이 강한 염기에 의해 개방되어 카복실레이트 잔기를 형성할 수 있다. 일반적으로, 이들 잔기는 실질적으로 벌크 용액에 노출되며, 이 용액에서 이들은 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 부착에 이용된 화학은 기질 화학에 크게 의존한다.
펩티드 결합 합성은 잘 공지된 반응이며, 흔히 펩티드 합성을 위해 사용된다. 카복실레이트 잔기는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC)에 의해 처리되어 불안정한 반응성 o-아실이소우레아 에스테르를 생성한다. 이 에스테르는 일급 아민 잔기와 반응하여 안정한 아미드 결합을 형성한다. 그러나, 이 에스테르는 굉장히 반응성이기 때문에, 용매(물)와도 반응하여 카복실 잔기를 재생할 것이다. 이는 상기 반응의 효율을 감소시킨다. 상기 에스테르를 N-히드록시설포숙신이미드(Sulfo-NHS)와 반응시켜 반-안정한 아민-반응성 NHS 에스테르를 형성하는 것에 의해 향상시킬 수 있다. 후자 에스테르는 물과 반응하지 않지만, 오직 일급 아민 잔기와 반응하여 안정한 아미드 결합을 형성한다.
전기화학
2개 전극이 수용액 중에 위치하고, 또 전위가 전극 사이에 인가되면, 상기 수용액 중에 전계가 생성할 것이다. 물은 자연적으로 H30+ 및 OH- 이온으로 약간 해리된다. 이들 해리 산물은 전하를 갖기 때문에, 이들은 전극 표면으로 이동할 것이고, 거기에서 금속이 전자를 제공하거나 전자를 추출하여, 전류 회로를 완성할 것이다. 염화나트륨과 같이 물에 부가된 이온 염은 훨씬 더 높은 농도의 이온을 도입하여, 상당히 더 큰 전류 흐름을 허용한다. 각종 이온 염이 수용액(전자 전달 과정의 용이성을 정의하는 화학을 각각 가짐)중에 존재하면, 전류를 모니터링하면서 전극 전위를 스캔(scanning)하면 수용액 중에서 이온 염의 특징을 제공한다. 흔히, 매우 어려운 전자 전달 과정에 의해 이온 염을 부가하는 것은 전기화학 분야에서 유용하다; 이러한 이온 염은 흔히 "지지 전해질"이라 칭한다. 금속 전극의 표면에서 전계의 구조는, 다양한 이온이 금속 표면 부근에서 층을 형성하기 때문에 매우 복잡하다.
크로마토그래피
크로마토그래피는 적절한 검출 방법에 따라서 유체 매질 중의 성분을 물리적으로 분리하는 것이다. 전형적으로, 복잡한 혼합물의 농축된 플러그는 혼합물의 성분에 약하게 결합하는 물질에 의해 코팅된 입자에 의해 팩킹된("정지상") 좁은 튜브("컬럼")를 통하여 캐리어 스트림("이동상")에 의해 씻겨진다. 성분들이 정지상을 거쳐 흐르면, 일부 성분들은 다른 것에 비하여 더 강하게 결합하며, 또 컬럼 밖으로 더 느리게 용출할 것이다. 따라서, 컬럼으로부터의 용리액은 먼저 비-결합 성분으로 구성된 다음, 계속 증가하는 결합 강도의 일련의 성분으로 구성될 것이다. 자외선 흡수와 같은 성분들의 일부 공통되는 특징을 모니터링하는 검출기는 재료가 컬럼 밖으로 용출됨에 따라 물질의 존재를 나타낸다. 상기 용리액은 밸브에 의해 방향을 바꾸어서 각 성분을 수집한다.
바이오기술 분야에서, 겔 전기영동은 단백질의 복잡한 혼합물을 분리하고 검출하기 위하여 널리 사용되어 왔다. 그러나, 상기 수법은 다소 불편하여서 꽤 다량의 단백질을 필요로 한다. 최근, 상기 수법은 다르게는 MudPIT로도 공지된 "다차원의 단백질 확인 기술"에 의해 교체되기 시작한다. 이 수법은 유체 밸브 세트와 함께 상이한 특성을 갖는 컬럼의 조합을 이용하여 단백질 분리를 얻으며, 이는 겔 전기영동보다 더 우수하다. 모세관 대역 전기영동의 이용은 사용된 단백질의 부피를 역시 감소시킬 수 있다.
매트릭스- 보조된 레이저 탈착 이온화( MALDI )
통상의 용도에서, MALDI는 현미경적 양의 생물학적 샘플을 유리 또는 실리콘 웨이퍼 상에 스포팅(spotting)하고, 또 이것을 증발성 화합물과 혼합하는 것을 포함한다. 상기 웨이퍼를 건조시킨 다음 질량 분석계 챔버에 위치시킨다. 집중된 레이저 펄스는 각 샘플을 증발시키며, 또 생성한 증기는 이온화되고 또 질량 분석계의 주요 챔버를 통하여 가속된다. 증발하는 동안, 생물학적 샘플은 심각하게 단편화되며, 또 단편화 패턴은 질량 분석계 데이터로부터 추출된다. 이러한 과정은 산업에서 널리 이용되며, 그 장치는 Sequenom 및 기타 제조자에 의해 제조된다.
제1 실시양태 요약
특이하게 작성된, 층상 재료는 다양한 공간적으로-분리된 분석물질 입자가 로딩된 저장소 세트를 형성하며, 또 상기 층상 재료는 전기화학적 프로브에 의해 스캔된다. 이에 의해 다양한 분석물질 입자의 특징의 맵을 얻으며, 이것은 생물학적 샘플에 관한 유용한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 제1 실시양태에 따른 방법
본 발명의 제1 실시양태에 따른 방법에서, TEPC 필터와 같은 천공된 재료는 제한된 개구를 구비한 홀을 갖는다. 제어된 매트릭스 내의 분석물질 입자의 동질 또는 이질적 집단을 TEPC 필터 홀에 로딩하며, 또 전류를 사용하여 바깥쪽으로의 확산을 측정하며, 이는 분석물질 입자를 포함하는 존재, 구조 변화 및 결합 상호작용의 측도(정도)이다.
본 발명의 방법은 도 1 내지 도 43을 참조하여 설명할 것이다.
도 1A, 도 1B, 및 도 2를 참조하면, TEPC 필터(1)는 무작위로 분포된 균일한 크기의 홀을 갖는다. 도 1A는 상면도를 도시하고, 도 1B는 횡단면도이다. TEPC 필터(1)는 카복실레이트 잔기(3)에 의해 화학적으로 유도체화된 외면을 가질 수 있다. 유사한 특징을 갖는 다른 재료가 대체될 수 있다.
도 3, 도 4, 및 도 5를 참조하면, 다음 과정에 의해 이층 재료가 형성될 수 있다. 먼저, 겔 전구체(아크릴아미드 또는 용융된 아가로오스와 같은)의 매트릭스에서 균일한 크기의 스페로이드(4)의 희석 현탁액을 형성한다. 이 현탁액을 얇은 플라스틱 시트(5)에 도포하고 또 소수성 표면을 갖는 매끈한 실린더(6) 부근을 포장한다. 겔(7)은 화학적, 열적 또는 광 중합체화에 의해 형성된다. 화학적 중합체화의 일례는 도 4에 도시되어 있다. 스페이서 입자(4)는 균일하고 공지된 두께를 겔(7)에 제공한다. 중합체화 후, 상기 얇은 플라스틱 시트(5)는 매끈한 실린더(6)로부터 박리되어, 겔(7) 층 및 플라스틱(5) 층으로 구성된 이층 재료(8)를 생성한다. 이러한 이층 재료의 확대도는 도 5에 도시되어 있다; 상기 스페로이드(4)는 이 확대도에는 도시되어 있지 않은데, 이는 이들이 충분히 희석되어 있기 때문이다. 이층 재료(8) 계면(9)의 화학은 물리적 또는 화학적 수단에 의해 상기 얇은 플라스틱 시트(5) 층이 장래에 용이하게 제거될 수 있도록 선택한다. 겔(7)의 외면은 아미노 잔기(10)에 의해 화학적으로 유도체화될 수 있지만, 이들은 폴리아크릴아미드에 고유하다.
상기 이층 재료와 다르게, 겔 전구체는 2개의 소수성의 매끈한 플레이트 사이에 샌드위치될 수 있고, 또 중합되고 건조된다. 이것은 강인하고 건조된 겔 필름을 형성하며, 용이하게 취급될 수 있으며, 필요할 때 재수화될 수 있다.
상기 이층 재료와 다르게, 투석 막이 사용될 수 있으며, 이들은 밀리포어 또는 홧트만과 같은 다수의 제조자로부터 상업적으로 입수될 수 있다.
도 6, 도 7, 및 도 8을 참조하여, 상기 이층 재료(8)는 TEPC 필터(1)에 화학적으로 결합될 수 있다. 화학적 결합 메카니즘의 일례는 도 6에 도시되어 있으며, 여기서 카복실레이트 잔기 및 아미노 잔기는 화학적으로 결합하여 펩티드 결합(11)을 형성한다. 다른 화학이 치환될 수 있다. 도 7은 인접하여 있는 TEPC 필터(1)와 이층 재료(8)를 도시하며, 카복실레이트 유도체화된 표면(3) 및 아미노 유도체화된 표면(10)은 서로 대향한다. 도 8은 TEPC 필터(1)와 이층 재료(8)가 펩티드 결합(11)에 의해 화학적으로 결합되는 것을 도시한다.
도 8 및 도 9를 참조하면, 상기 얇은 플라스틱 시트(5)는 물리적 또는 화학적 수단에 의해 제거되어, TEPC 필터(1)에 부착된 겔(7) 층만을 남긴다.
상기 화학 결합과는 다르게, 겔(7) 층 및 TEPC 필터(1)는 실린더 부근을 포장하고 또 외부 TEPC 필터(1) 층에 인장을 가하는(tensioning) 것과 같이 화학 결합 없이 물리적 힘에 의해 함께 단순히 압축될 수 있다.
상기 화학 결합과 다르게, 상기 TEPC 필터(1)는 분석물질 입자 매트릭스를 포함하는 유체와 비혼화성인 도전성 유체의 표면 상에 위치될 수 있다.
도 9에 개략적으로 도시된 것에 대한 다수의 변형이 존재하며, 이들의 예는 도 10, 도 11, 도 12, 도 13, 도 14, 도 15, 및 도 16에 도시되어 있다. 이 방법의 나머지는 도 9의 간단한 경우에 대해 집중되어 있지만, 이들 변형도 또한 적용가능함을 잘 알 것이다.
도 10을 참조하면, 겔(7)의 상기 외면은 형광단(12), 계면활성제(13), 다른 물질 또는 물질의 임의 조합에 의해 화학적으로 유도체화될 수 있다. 마찬가지로, 겔(7)의 내면(홀(2)과 대향하는) 또는 홀(2)의 내면은 또한 화학적으로 유도체화될 수 있다.
도 11, 도 12, 및 도 13을 참조하면, 스페로이드(14)는 펩티드 결합(11)을 형성하기 전에 홀(2)의 개구에 제공될 수 있다. 이 스페로이드(14)는 홀(2)의 직경보다 약간 더 큰 직경을 가질 것이다. 겔(7) 층은 스페로이드(14)의 존재에 의해 움푹해질 수 있어, 스페로이드(14) 주변에 빈 용적(15)을 생성한다. 자계 구배, 전계, 중력계, 또는 유체역학적 흐름과 같은 힘(16)은 홀(2)의 개구에서 그의 위치로부터 스페로이드(14)를 들어올리기 위해 사용될 수 있어, 스페로이드(14)의 표면과 홀(2)의 개구 사이에 작은 갭(17)을 생성한다. 빈 용적(15)은 스페로이드(14)를 잠시 가열하여 주변 겔(7)을 용융시키는 것에 의해, 또는 겔 전구체에 의해 포화시킨 다음 화학적 중합화에 의해 제거될 수 있다. 생성한 구조는 도 13에 도시된다.
도 14 및 도 15를 참조하면, 홀(2)의 양쪽 단부는 스페로이드(14)에 의해 캡화(capped)될 수 있다. 겔(7)이 충분히 유연하면, 스페로이드(14)의 하나는 자계 구배와 같은 힘에 의해 제거될 수 있다. 이것은 계(7) 내에 작은 인열부(18)를 남길 것이다. 이러한 특정 배치구조(configuration)는 활성 체류 메카니즘 없이도 홀(2) 내에 재료를 체류하는데 특히 유용할 수 있다.
도 16을 참조하면, 겔은 사용되지 않을 수 있고, 또 스페로이드(14)는 자계 구배(16)와 같은 힘에 의해 자리에서 유지된다.
도 9의 단순한 예에 집중하면, 상기 구조는 홀(2) 내에 분석물질 입자를 수집하여 농축시키기 위하여 사용될 수 있다. 도 17은 홀(2)의 개방 단부로부터 홀(2)을 통하여 통과하는 유체 유동(19)의 개략도이다. 유체 유동(19) 내에서 현탁된 분석물질 입자는, 겔(7)이 통과를 방해할 만큼 충분히 긴밀한 가교 구조를 가지면, 겔(7)에 의해 여과되게 된다. 이러한 분석물질 입자의 예는 단백질(20), 핵산, 바이러스, 원형질 구조, 양자점, 대형 형광단(21), 대형 전해질 양이온, 대형 전해질 음이온, 및 대형 산화환원 시약이다. 겔(7)의 투과성은, 형성하는 동안 겔(7) 내에 입자의 혼입에 의해 감소될 수 있다. 겔(7)을 통과할 수 있는 입자의 예는 물 분자, 작은 전해질 양이온(22), 작은 전해질 음이온(23), 및 작은 산화환원 시약이다. 도 18은 홀(2) 내에 축적된 분석물질 입자의 네트 결과의 개략도이다.
홀(2) 내에 축적된 분석물질 입자가 일단 존재하면, 유체 유동(19)이 중지될 수 있다. 이 지점에서, 축적된 분석물질 입자는 바깥쪽으로 확산하기 시작하여, 결국 홀(2)을 비우게 된다. 상기 유체 유동(19)은 부활할 수 있고, 또 상기 축적/확산 주기가 반복될 수 있다. 확산을 약하게 제한하는 겔은 홀(2) 출구에 위치하여, 순환성을 향상시킬 수 있다. 확산을 약하게 제한하는 겔은 홀 내에 위치하여, 확산 시간을 연장시킬 수 있다.
확산하는 동안, 홀(2) 내의 분석물질 입자는 이온 입자와 상호작용할 수 있는 이동 경로를 가질 수 있다. 상기 입자는 서로를 통과할 수 없기 때문에, 이들은 서로의 주변을 돌고, 이온 입자의 이동 경로를 지연시킨다. 이러한 지연은 분석물질 입자의 존재 및 이들의 결합 과정에 의존적이기 때문에 상기 방법의 기초를 형성한다.
확산하는 동안, 홀(2) 내의 분석물질 입자는 확산 이외에 이동력(예컨대 전계로부터 생긴 힘)에 의해 축방향으로 구동될 수 있다.
상기 과정은 주기의 축적 부분에 적용될 수 있지만, 분석은 유체 유동(19) 힘의 부가에 의해 복잡해진다.
확산 또는 주기의 축적 부분 동안, 상기 유체 유동(19)은 입자 이동을 변형하기 위한 소정의 고주파수 축방향 진동일 수 있다. 예를 들어, 도 15의 상기 스페로이드(14)는 자성 모멘트를 가질 수 있고 또 인열부(18)를 통하여 분석물질 입자를 펌핑하도록 자기적으로 진동된다. 다른 예로서, 도 9의 겔(7)의 외면(또는 내면)은 압력 맥동(pressure pulsation)에 처리될 수 있어, 홀(2) 내에서 분석물질 입자가 진동하는 것처럼 만든다.
확산 이외에 홀(2) 내의 입자가 힘에 의해 축방향으로 구동되는 다수의 메카니즘이 있다. 이들 메카니즘의 하나의 일례는 도 22에 도시되어 있다.
도 22를 참조하면, 겔(7)을 가로지를 수 있는 전해질 또는 산화환원 시약은 작업전극(-W), 대향전극(C+) 및 기준(R) 전극에 의해 생성된 전계에 의해 겔(7)을 통하여 이동된다.
홀(2) 내의 입자가 확산 이외의 힘에 의해 축방향으로 구동되는 메카니즘에 대한 이들 예의 각각에서, 이동 경로 자체는 몇 개의 상이한 메카니즘에 의해 지연될 수 있다. 이들 메카니즘의 일부의 예는 도 27 및 도 28에 도시되어 있다.
도 27을 참조하면, 작은 전해질 양이온(22) 및 작은 전해질 음이온(23)은 그의 경로에 장애가 없으면 전계에 의해 직선으로 이동될 수 있다. 그러나, 분석물질 입자(20) 및 분석물질 입자(27)와 같은 장애물이 존재하면, 상기 양이온(22) 및 음이온(23)은 분석물질 입자 주변을 돌아갈 필요가 있어, 이온 축방향 이동을 지연시킨다. 상기 분석물질 입자가 결합 상호작용을 가지면, 이들은 대형 복합물(28)을 형성할 것이므로, 이온 축방향 이동을 더 더욱 지연되게 유도한다. 예를 들어, 소 혈청 알부민(BSA)과 같은 전형적인 단백질은 약 4 nm x 4 nm x 14 nm의 크기를 갖는다. 50 nm의 TEPC 필터(1) 홀(2) 직경으로 인하여, 단일 BSA 단백질 분자는 홀(2)의 단면적의 상당 부분(0.8% 내지 2.9%)을 차단할 것이므로, 이온 입자 유동을 현저히 감소시킨다.
도 28을 참조하면, 장애물(29, 30, 및 31) 자체는 전하를 가질 수 있다. 전계 인가시, 이들은 전해질 또는 산화환원 시약의 이동으로 인하여 복잡한 방식으로 상호작용할 수 있다.
홀(2) 내의 장애물 특징에 의존하는, 겔(7)을 통한 전해질 분자 또는 산화환원 시약의 전달은 장애물 특징을 측정하기 위한 민감한 방식을 제공한다. 도 31은 작업전극, 대향전극 및 기준전극의 적용을 도시한다. 이온 입자는 장애물에 의해 및 겔(7)에 의해 저항된 전극에서 전류를 생성할 것이지만, 겔(7)의 저항은 비교적 일정하기 때문에, 이러한 저항은 상기 측정을 반복하는 것에 의해 차감될 수 있다.
샘플 로딩 상태인 전체 장치는 도 32에 도시되어 있다. 크로마토그래피 컬럼(32)으로부터 용출된 단백질의 복잡한 서열과 같은 분석물질 입자의 유체 유동은 TEPC 필터(1)의 특정 영역으로 흐르도록 지시된다. 대향 측 상의 더 낮은 압력은 용매 및 기타 작은 분자들이 TEPC 필터(1)와 겔(7)을 통과하도록 하여, TEPC 필터(1) 홀(2) 내에 분석물질 입자를 축적한다. 분석물질 입자가 크로마토그래피 컬럼(32)으로부터 용출됨에 따라서, 상기 TEPC 필터(1) 표면은 스캔 동작으로 이동된다. 용출되는 상이한 분석물질 입자는 TEPC 필터(1) 내의 공간적으로 분명한 위치에 포획된다. 이 작업을 따라서, 크로마토그래피 컬럼(32)으로부터 용출되는 상이한 분석물질 입자를 사용하여 제2 스캔을 실시하여, TEPC 필터(1)의 영역을 가로지르는 다수의 독특한 이원 화합물(제어가능한 부분의)을 생성한다. 홀(2) 내의 집단에 더욱 복잡성을 부가하기 위하여 추가의 스캔을 이용할 수 있다. 이것은 단백질 교차반응성 문제를 감소하기 위한 "샌드위치 어레이(Sandwich Array)" 기술과 기능적으로 상응할 것이다. 홀(2) 내에 지질 미셀, 콜로이드, 고정화된 재료, 또는 파아지 항체 디스플레이 기술을 포함할 수 있고, 지지된 분석물질 입자가 환경과 상호작용하도록 허용한다. 또한, 1개 세트의 홀(2)로부터 분석물질 입자를 추출하고 이것을 홀(2)의 다른 세트에 부가할 수 있다.
측정 상태의 전체 장치는 도 33에 도시된다. 전극(33), 또는 복수의 전극은 TEPC 필터(1) 표면과 같은 표면을 가로질러 스캔되며, 또 전류가 측정된다. 전극 및 전류의 위치에 관한 정보는 콘덕턴스 맵(34) 내에 편집된다. 전극 구조의 예는 절연체에 의해 둘러싸인 노출된 금속 표면, 및 도전성 유체에 의해 충전된 튜브를 포함한다.
도 35를 참조하여, 측정 결과는 대개 균일한 콘덕턴스 맵(34) 세트이다. 이 영역의 대부분은 상당한 이동 장애물(예컨대 분석물질 입자)을 갖는 몇 개의 저-콘덕턴스 영역을 제외하고는 균일한 도전성이다. 균일한 도전성 영역과 비교한 이들 저-콘덕턴스 영역의 특징은, 분석 신호의 기본이다.
도 33을 참조하여, 측정하려는 영역의 제한은 전기적 도전성 유체에 의해 충전되고, 일개 단부가 상기 재료 시트, 상기 재료 시트에 적용된 홀을 갖는 절연 시트, 또는 상기 재료 시트의 표면에 적용된 절연성 수-비혼화성 유체와 물리적으로 접촉하는 절연 튜브에 의해 달성될 수 있다. 후자의 경우, TEPC 필터(1)의 겔 측의 가압시, 홀 내의 물의 표면 장력은 TEPC 필터(1)의 다른 표면을 따라 단리된 수성 돌기를 형성하며, 이것은 전기적 도전성 유체에 의해 충전된 절연 튜브를 이용하여 스캔될 수 있다.
도 37을 참조하여, 전기적 콘덕턴스는 단백질이 존재하는 영역 및 단백질이 존재하지 않는 다른 영역에 대한 관계로서 그래프로 표시된다. 전계 E가 작동한 후, 단백질의 존재는 전류(i) 수준에서 수직(증가된) 변동을 유발하며, 이는 델타 전류(i) 측정에 의해 정량될 수 있다.
도 39를 참조하여, 단백질이 존재하는 경우 대 단백질이 존재하지 않는 경우에 대한 이론적 결과를 비교한다. 전계 E는 주기에서 반복적으로 작동되어, 반복된 델타 전류(i) 측정을 얻는다. 장시간 규모일 때, 유체역학적 압력 P는 또한 주기에서 반복적으로 동작된다. 압력 증가로 단백질 축적이 유발되면, 델타 전류는 증가한다. 상기 압력이 감소되면, 단백질은 외측으로 확산되고, 또 델타 전류는 감소한다. 따라서 유체역학적 압력을 반복하는 것은 연속되는 일련의 델타 전류 피크를 제공하며, 이는 단백질 존재의 민감 검출을 얻기 위해 평균될 수 있다.
도 41을 참조하여, 단백질 결합 존재 대 단백질 비-결합에 대한 이론적 결과를 비교한다. 다른 단백질에 결합하는 단백질은 더 큰 입체장애 효과를 가져, 큰 장애물로 되고 또 더 느린 확산속도를 가질 것이다; 이는 큰 진폭의 일련의 연속적인 델타 전류(i) 피크를 초래한다. 다른 단백질에 결합하지 않는 단백질은 더 적은 입체장애 효과를 가질 것이고, 큰 장애물로 되지 않고 또 더 느린 확산 속도를 가지지 않을 것이다; 이는 작은 진폭의 일련의 연속적인 델타 전류 피크를 초래한다. 다수의 단백질이 존재하기 때문에, 이 작은 진폭은 다수의 피크를 가질 수 있음에 유념한다.
측정 결과의 요약은 도 43에 도시한다. 상기 측정은 TEPC 필터(1)의 영역을 통한 분석물질 입자 특징의 맵을 제공한다. 특정 영역(38)은 이 방법을 실시하는 과학자에게 흥미있는 측정 특징을 가질 것이다. 이들 영역의 내용물의 확인은 질량 분석계와 같은 다양한 수법에 의해, 또는 최초로 내용물을 전달한 크로마토그래피 시스템의 지식에 의해 실시될 수 있다.
실질적으로, TEPC/겔 구조 대신 천공된 단층 필름과 같은 유사한 구조를 사용하는 것에 의해 동일한 작용을 얻을 수 있으며, 이때 확산은 축상 대신 방사상이다.
제2 실시양태 요약
특이하게 작성된, 층상 재료는 다양한 공간적으로-분리된 분석물질 입자가 로딩된 저장소 세트를 형성하며, 또 상기 층상 재료는 형광 방출에 대해 영상화된다. 이에 의해 다양한 분석물질 입자의 특징의 맵을 얻으며, 이것은 생물학적 샘플에 관한 유용한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 제2 실시양태에 따른 방법
본 발명의 제2 실시양태에 따른 방법에서, TEPC 필터와 같은 천공된 재료는 제한된 개구를 구비한 홀을 갖는다. 제어된 매트릭스 내의 분석물질 입자의 동질 또는 이질적 집단을 TEPC 필터 홀에 로딩하고, 또 형광을 이용하여 외부로의 확산을 측정하며, 이는 분석물질 입자를 포함하는 상호작용의 존재, 구조적 변화 및 결합의 측도이다.
본 발명의 방법은 도 1 내지 도 43을 참조하여 설명할 것이다.
도 1A, 도 1B, 및 도 2를 참조하면, TEPC 필터(1)는 무작위로 분포된 균일한 크기의 홀을 갖는다. 도 1A는 상면도를 도시하고, 도 1B는 횡단면도이다. TEPC 필터(1)는 카복실레이트 잔기(3)에 의해 화학적으로 유도체화된 외면을 가질 수 있다. 유사한 특징을 갖는 다른 재료가 대체될 수 있다.
도 3, 도 4, 및 도 5를 참조하면, 다음 과정에 의해 이층 재료가 형성될 수 있다. 먼저, 겔 전구체(아크릴아미드 또는 용융된 아가로오스와 같은)의 매트릭스에서 균일한 크기의 스페로이드(4)의 희석 현탁액을 형성한다. 이 현탁액을 얇은 플라스틱 시트(5)에 도포하고 또 소수성 표면을 갖는 매끈한 실린더(6) 부근을 포장한다. 겔(7)은 화학적, 열적 또는 광 중합체화에 의해 형성된다. 화학적 중합체화의 일례는 도 4에 도시되어 있다. 스페이서 입자(4)는 균일하고 공지된 두께를 겔(7)에 제공한다. 중합체화 후, 상기 얇은 플라스틱 시트(5)는 매끈한 실린더(6)로부터 박리되어, 겔(7) 층 및 플라스틱(5) 층으로 구성된 이층 재료(8)를 생성한다. 이러한 이층 재료의 확대도는 도 5에 도시되어 있다; 상기 스페로이드(4)는 이 확대도에는 도시되어 있지 않는데, 이는 이들이 충분히 희석되어 있기 때문이다. 이층 재료(8) 계면(9)의 화학은 물리적 또는 화학적 수단에 의해 상기 얇은 플라스틱 시트(5) 층이 장래에 용이하게 제거될 수 있도록 선택한다. 겔(7)의 외면은 아미노 잔기(10)에 의해 화학적으로 유도체화될 수 있지만, 이들은 폴리아크릴아미드에 고유하다.
상기 이층 재료와 다르게, 겔 전구체는 2개의 소수성의 매끈한 플레이트 사이에 샌드위치될 수 있고, 또 중합되고 건조된다. 이것은 강인하고 건조된 겔 필름을 형성하며, 용이하게 취급될 수 있으며, 필요할 때 재수화될 수 있다.
상기 이층 재료와 다르게, 투석 막이 사용될 수 있으며, 이들은 밀리포어 또는 홧트만과 같은 다수의 제조자로부터 상업적으로 입수될 수 있다.
도 6, 도 7, 및 도 8을 참조하여, 상기 이층 재료(8)는 TEPC 필터(1)에 화학적으로 결합될 수 있다. 화학적 결합 메카니즘의 일례는 도 6에 도시되어 있으며, 여기서 카복실레이트 잔기 및 아미노 잔기는 화학적으로 결합하여 펩티드 결합(11)을 형성한다. 다른 화학이 치환될 수 있다. 도 7은 인접하여 있는 TEPC 필터(1)와 이층 재료(8)를 도시하며, 카복실레이트 유도체화된 표면(3) 및 아미노 유도체화된 표면(10)은 서로 대향한다. 도 8은 TEPC 필터(1)와 이층 재료(8)가 펩티드 결합(11)에 의해 화학적으로 결합되는 것을 도시한다.
도 8 및 도 9를 참조하면, 상기 얇은 플라스틱 시트(5)는 물리적 또는 화학적 수단에 의해 제거되어, TEPC 필터(1)에 부착된 겔(7) 층만을 남긴다.
상기 화학 결합과는 다르게, 겔(7) 층 및 TEPC 필터(1)는, 실린더 부근을 포장하고 또 외부 TEPC 필터(1) 층에 인장을 가하는(tensioning) 것과 같은 화학 결합 없이, 물리적 힘에 의해 함께 단순히 압축될 수 있다.
상기 화학 결합과 다르게, 상기 TEPC 필터(1)는 분석물질 입자 매트릭스를 포함하는 유체와 비혼화성인 도전성 유체의 표면 상에 위치될 수 있다.
도 9에 개략적으로 도시된 것에 대한 다수의 변형이 존재하며, 이들의 예는 도 10, 도 11, 도 12, 도 13, 도 14, 도 15, 및 도 16에 도시되어 있다. 이 방법의 나머지는 도 9의 간다한 경우에 대해 집중되어 있지만, 이들 변형도 또한 적용가능함을 잘 알 것이다.
도 10을 참조하면, 겔(7)의 상기 외면은 형광단(12), 계면활성제(13), 다른 재료, 또는 재료의 임의 조합에 의해 화학적으로 유도체화될 수 있다. 마찬가지로, 겔(7)의 내면(홀(2)과 대향하는) 또는 홀(2)의 내면은 또한 화학적으로 유도체화될 수 있다.
도 11, 도 12, 및 도 13을 참조하면, 스페로이드(14)는 펩티드 결합(11)을 형성하기 전에 홀(2)의 개구에 제공될 수 있다. 이 스페로이드(14)는 홀(2)의 직경보다 약간 더 큰 직경을 가질 것이다. 겔(7) 층은 스페로이드(14)의 위치에 의해 움푹해질 수 있어, 스페로이드(14) 주변에 빈 용적(15)을 생성한다. 자계 구배, 전계, 중력계, 또는 유체역학적 흐름과 같은 힘(16)은 홀(2)의 개구에서 그의 존재로부터 스페로이드(14)를 들어올리기 위해 사용될 수 있어, 스페로이드(14)의 표면과 홀(2)의 개구 사이에 작은 갭(17)을 생성한다. 빈 용적(15)은 스페로이드(14)를 잠시 가열하여 주변 겔(7)을 용융시키는 것에 의해, 또는 겔 전구체에 의해 포화시킨 다음 화학적 중합에 의해 제거될 수 있다. 생성한 구조는 도 13에 도시된다.
도 14 및 도 15를 참조하면, 홀(2)의 양쪽 단부는 스페로이드(14)에 의해 캡화(capped)될 수 있다. 겔(7)이 충분히 유연하면, 스페로이드(14)의 하나는 자계 구배와 같은 힘에 의해 제거될 수 있다. 이것은 계(7) 내에 작은 인열부(18)를 남길 것이다. 이러한 특정 배치구조(configuration)는 활성 체류 메카니즘없이도 홀(2) 내에 재료를 체류하는데 특히 유용할 수 있다.
도 16을 참조하면, 겔은 사용되지 않을 수 있고, 또 스페로이드(14)는 자계 구배(16)와 같은 힘에 의해 자리에서 유지된다.
도 9의 단순한 예에 집중하면, 상기 구조는 홀(2) 내에 분석물질 입자를 수집하여 농축시키기 위하여 사용될 수 있다. 도 17은 홀(2)의 개방 단부로부터 홀(2)을 통하여 통과하는 유체 유동(19)의 개략도이다. 유체 유동(19) 내에서 현탁된 분석물질 입자는, 겔(7)이 통과를 방해할 만큼 충분히 긴밀한 가교 구조를 가지면, 겔(7)에 의해 여과되게 된다. 이러한 분석물질 입자의 예는 단백질(20), 핵산, 바이러스, 원형질 구조, 양자점, 대형 형광단(21), 대형 전해질 양이온, 대형 전해질 음이온, 및 대형 산화환원 시약이다. 겔(7)의 투과성은, 형성하는 동안 겔(7) 내에 입자의 혼입에 의해 감소될 수 있다. 겔(7)을 통과할 수 있는 입자의 예는 물 분자, 작은 전해질 양이온(22), 작은 전해질 음이온(23), 및 작은 산화환원 시약이다. 도 18은 홀(2) 내에 축적된 분석물질 입자의 네트 결과의 개략도이다.
홀(2) 내에 축적된 분석물질 입자가 일단 존재하면, 유체 유동(19)이 중지될 수 있다. 이 지점에서, 축적된 분석물질 입자는 바깥쪽으로 확산하기 시작하여, 결국 홀(2)을 비우게 된다. 상기 유체 유동(19)은 부활할 수 있고, 또 상기 축적/확산 주기가 반복될 수 있다. 확산을 약하게 제한하는 겔은 홀(2) 출구에 위치하여, 순환성을 향상시킬 수 있다. 확산을 약하게 제한하는 겔은 홀 내에 위치하여, 확산 시간을 연장시킬 수 있다.
확산하는 동안, 홀(2) 내의 분석물질 입자는 이온 입자와 상호작용할 수 있는 이동 경로를 가질 수 있다. 상기 입자는 서로를 통과할 수 없기 때문에, 이들은 서로의 주변을 돌고, 이온 입자의 이동 경로를 지연시킨다. 이러한 지연은 분석물질 입자의 존재 및 이들의 결합 과정에 의존적이기 때문에 상기 방법의 기초를 형성한다.
확산하는 동안, 홀(2) 내의 분석물질 입자는 확산 이외에 이동력(예컨대 전계로부터 생긴 힘)에 의해 축방향으로 구동될 수 있다.
상기 과정은 주기의 축적 부분에 적용될 수 있지만, 분석은 유체 유동(19) 힘의 부가에 의해 복잡해진다.
확산 또는 주기의 축적 부분 동안, 상기 유체 유동(19)은 입자 이동을 변형하기 위한 소정의 고주파수 축방향 진동일 수 있다. 예를 들어, 도 15의 상기 스페로이드(14)는 자성 모멘트를 가질 수 있고 또 인열부(18)를 통하여 분석물질 입자를 펌핑하도록 자기적으로 진동된다. 다른 예로서, 도 9의 겔(7)의 외면(또는 내면)은 압력 맥동에 처리될 수 있어, 홀(2) 내의 분석물질 입자가 진동하는 것처럼 유도한다.
확산 이외에 홀(2) 내의 입자가 힘에 의해 축방향으로 구동되는 다수의 메카니즘이 있다. 이들 메카니즘의 일부의 예는 도 19, 도 20, 도 21 및 도 23에 도시되어 있다.
도 19를 참조하면, 겔(7)을 가로지를 수 없는 형광단은 작업전극(-W), 대향전극(C+) 및 기준(R) 전극에 의해 생성된 전계에 의해 내부 겔(7) 표면을 향하여(또는 멀어지게) 이동된다.
도 20을 참조하면, 겔(7)을 가로지를 수 없는 형광단은 자계 구배에 의해 내부 겔(7) 표면을 향하여(또는 멀어지게) 이동된다.
도 21을 참조하면, 겔(7)을 가로지를 수 없는 형광단은 중력계에 의해 내부 겔(7) 표면을 향하여(또는 멀어지게) 이동된다.
도 23을 참조하면, 대형 전해질 양이온(24), 대형 전해질 음이온(25) 또는 겔(7)을 가로지를 수 없는 산화환원 시약은 전계에 의해 내부 겔(7) 표면 및 외부 겔(7) 표면을 향하여(또는 멀어지게) 이동되어, 커패시터를 생성한다.
상기 커패시터는 도 24, 도 25 및 도 26에 부가적으로 기재된 거동 특징을 갖는다.
도 24를 참조하여, 홀(2)에 대하여 축방향인 상기 전계는 복잡한 구조를 갖는다. 이러한 복잡한 구조는 통상의 전기화학적 연구에서 금속 전극 부근에 존재하는 전계와 유사하다. 벌크 용액에서 겔(7)의 외면으로부터 떨어진 간격에서 전계는 작고 또 간격에 따라 현저히 변하지 않는다. 겔(7)의 외면에 접근하면, 전해질은 증가된 농도를 나타내어, 전계의 지수적 증가를 초래한다; 이것은 흔히 고우이-채프만(Gouy-Chapman) 층으로 불린다. 겔(7)의 외면에 아주 근접하면, 전해질은 교대되는 전하의 이중층을 형성한다; 이것은 흔히 헬름홀츠(Helmholtz) 층으로 불린다. 계면활성제 분자(13)의 존재는 헬름홀츠 층 내에서 전계의 형성을 보조할 수 있다. 겔(7) 쪽으로 계속 진행하면, 전계가 줄어든다. 내면 상의 겔(7)을 벗어나면, 전계는 외면에 대한 구조를 반영하는 구조를 갖는다.
도 25를 참조하면, 외부 겔(7) 표면의 헬름홀츠 층 중의 강한 전계는 전자와 같은 전기적 전하가 전해질(또는 적합한 산화환원 시약) 음이온(25)(또는 양이온)으로부터 표면에 결합된 형광단(12)으로 전달되게 한다. 상기 분자(25)가 그의 전하를 전달한 후, 이것은 다른 분자(26)로 된다. 형광단(12)은 상기 전하 전달에 의해 변경된 형광 특징을 가질 것이다. 예를 들어, 하전되지 않은 상태의 플루오레세인은 비-형광이지만, 음으로 하전되면 강한 형광으로 된다.
홀(2) 내의 입자가 확산 이외의 힘에 의해 축방향으로 구동될 수 있는 메카니즘에 대한 이들 실시예 각각에서, 이동 경로 자체는 몇 개의 상이한 메카니즘에 의해 지연될 수 있다. 이들 메카니즘의 일부 예는 도 26, 도 27, 및 도 28에 도시되어 있다.
도 26을 참조하여, 형광단(21)은, 그 경로에서 장애물이 없다면, 이동력(전계, 자계 구배, 또는 중력계와 같은)에 의해 직선으로 이동될 수 있다. 그러나, 분석물질 입자(20) 및 분석물질 입자(27)와 같은 장애물이 존재하면, 형광단(21)은 분석물질 입자 주변을 돌아갈 필요가 없고, 형광단이 축방향으로 지연된다. 상기 분석물질 입자가 결합 상호작용을 가지면, 이들은 대형 복합체(28)를 형성할 것이므로, 형광단 축방향 이동은 더욱 더 지연될 것이다. 예를 들어, 소 혈청 알부민(BSA)과 같은 전형적인 단백질은 4 nm x 4 nm x 14 nm의 크기를 갖는다. 50 nm 직경의 TEPC 필터(1) 홀(2)을 사용하면, 단일 BSA 단백질 분자는 홀(2)의 횡단면의 상당 부분(0.8% 내지 2.9%)을 차단할 것이므로, 형광단 유동을 상당히 감소시킬 것이다.
도 27을 참조하여, 대형 전해질 양이온(24) 및 대형 전해질 음이온(25)은 그 통로에 장애물이 없다면 전계에 의해 직선으로 이동될 수 있다. 그러나, 분석물질 입자(20) 및 분석물질 입자(27)와 같은 장애물이 존재하면, 양이온(24) 및 음이온(25)은 분석물질 입자 주변을 돌아갈 필요가 있어, 이온 축방향 이동을 지연시킬 것이다. 상기 분석물질 입자가 결합 상호작용을 가지면, 이들은 대형 복합체(28)를 형성할 것이므로, 이온 축방향 이동을 더욱 더 지연시킬 것이다.
도 28을 참조하여, 장애물(29, 30, 및 31) 자체는 전하를 가질 수 있다. 전계 인가시, 이들은 전해질 또는 산화환원 시약의 이동에 따라 복잡한 방식으로 상호작용할 수 있다.
홀(2) 내의 장애 특징에 의존하는, 겔(7)의 주변에서 형광단의 축적 또는 활성화는 장애물 특징을 측정하기 위한 민감한 방식을 제공한다. 도 29 및 도 30은 자외선을 형광단에 적용하는 것과 그로 인하여 방출된 가시광선을 도시한다. 방출된 가시광선의 세기는 겔(7)의 부근에 있는 활성 형광단의 농도에 따라 다르다. 홀(2) 아래의 간격을 두고 위치한 형광단은 형광을 내지 않을 것인데, 이는 TEPC 필터(1)의 폴리카보네이트 재료가 자외선을 강하게 흡수하기 때문이다. 상기 방법의 주요 이점은 분석물질 입자를 형광단으로 라벨링할 필요를 없애는 데 존재하지만, 본 발명의 범위에는 형광단으로 라벨링된 분석물질 입자도 포함됨에 유념한다.
샘플 로딩 상태에 있는 전체 장치는 도 32에 도시한다. 크로마토그래피 컬럼(32)으로부터 용출하는 단백질의 복잡한 서열과 같은 분석물질의 유체 유동은 TEPC 필터(1)의 특정 영역으로의 흐르도록 지시된다. 대향측 상의 낮은 압력은 용매 및 기타 소형 분자들이 TEPC 필터(1) 및 겔(7)을 통하여 통과하도록 하여, TEPC 필터(1) 홀(2) 내에 분석물질 입자의 축적을 초래한다. 분석물질 입자가 크로마토그래피 컬럼(32)으로부터 용출됨에 따라서, TEPC 필터(1) 표면은 스캔 모션으로 이동될 것이다. 용출되는 상이한 분석물질 입자는 TEPC 필터(1) 내의 공간적으로 분명한 위치에서 포획된다. 이 작업을 따라서, 크로마토그래피 컬럼(32)으로부터 용출하는 상이한 분석물질 입자를 사용하여 제2 스캔을 실시할 수 있으며, TEPC 필터(1)의 영역을 가로지르는 다수의 독특한 이원 화합물(제어가능한 특성의)을 생성한다. 홀(2) 내의 집단에 더욱 복잡성을 부가하기 위하여 추가의 스캔을 이용할 수 있다. 이것은 단백질 교차반응성 문제를 감소하기 위한 "샌드위치 어레이" 기술과 기능적으로 상응할 것이다. 홀(2) 내에 지질 미셀, 콜로이드, 고정화된 재료, 또는 파아지 항체 디스플레이 기술을 포함할 수 있고, 지지된 분석물질 입자가 환경과 상호작용하도록 허용한다. 또한, 1개 세트의 홀(2)로부터 분석물질 입자를 추출하고 이것을 홀(2)의 다른 세트에 부가할 수 있다.
측정 상태의 전체 장치는 도 34에 도시된다. 자외선과 같은 형광 여기 광의 빔은 겔(7) 표면과 같은 표면을 향하도록 지시된다. 가시광선과 같은 형광 방출 광이 렌즈(35) 또는 광 파이프, 및 디지털 카메라와 같은 광센서(36)에 의해 수집된다. 카메라로부터 얻은 정보는 사진 영상(37)으로 편집된다.
도 36을 참조하여, 측정 결과는 이동력(전계, 자계 구배, 또는 중력계와 같은)이 인가될 때 일련의 변화하는 사진 영상(37)이다. 처음에는, 상기 사진 영상은 비교적 어둡다. 잠시 시간이 흐른 후, 대부분의 영역은, 충분한 이동 장애(예컨대 분석물질 입자)를 갖는 몇 개의 지연된 영역을 제외하고는 형광을 나타낸다. 그러나, 곧, 이들 지연 영역에서 이동이 완료되면, 영상의 전체 영역은 균일하게 형광을 나타낸다. 지연되지 않은 영역과 비교한 이들 지연된 영역의 일시적 특징은 분석 신호의 기초이다.
도 38을 참조하여, 상기 형광은 단백질이 존재하는 영역 및 단백질이 존재하지 않는 다른 영역에 대한 시간의 관계로서 그래프로 표시된다. 전계 E가 작동한 후, 단백질의 존재는 시그모이달(sigmoidal) 곡선에서 수평적(일시적) 변동을 유발하며, 이는 델타 시간(t) 측정에 의해 정량될 수 있다.
도 40을 참조하여, 단백질이 존재하는 경우 대 단백질이 존재하지 않는 경우에 대한 이론적 결과를 비교한다. 이동력은 주기에서 반복적으로 동작되어, 반복된 델타 시간(t) 측정을 얻는다. 오랜 시간 규모에서, 유체역학적 압력 P는 또한 주기에서 반복적으로 동작된다. 증가된 압력이 단백질로 하여금 축적되게 하면, 델타 시간은 증가한다. 상기 압력이 감소되면, 단백질은 외측으로 확산하며, 또 델타 시간은 감소한다. 따라서 유체역학적 압력의 주기는 연속적인 일련의 델타 시간 피크를 제공하며, 이는 단백질 존재의 민감성 검출을 위해 평균될 수 있다.
도 42를 참조하여, 단백질 결합이 존재하는 경우 대 단백질 비-결합 경우에 대한 이론적 결과를 비교한다. 다른 단백질에 결합하는 단백질은 더 큰 입체장애 효과를 가질 것이고, 큰 장애물로 되어 더 느린 확산 속도를 가질 것이다; 이는 큰 진폭의 일련의 연속적인 델타 시간(t) 피크를 초래한다. 다른 단백질에 결합하지 않는 단백질은 더 작은 입체장애 효과를 가질 것이고, 큰 장애물로 되지 않을 것이고 또 더 느린 확산 속도를 가지지 않을 것이다; 이는 작은 진폭의 일련의 연속적인 델타 시간 피크를 초래한다. 다수 단백질이 존재하기 때문에, 이러한 작은 진폭은 다수의 피크를 가질 수 있음에 유념한다.
측정 결과의 요약은 도 43에 도시한다. 이 측정은 TEPC 필터(1)의 영역을 가로지르는 분석물질 입자 특징의 맵을 제공한다. 특정 영역(38)은 그 방법을 실시하는 과학자에게 흥미로운 측정 특징을 가질 것이다. 이들 영역의 내용물의 확인은 질량 분석계와 같은 각종 수법에 의해, 또는 원래 내용을 전달하였던 크로마토그래피 시스템의 지식에 의해 실시될 수 있다.
TEPC/겔 구조 대신 천공된 단층 필름과 같은 유사한 구조를 사용하는 것에 의해 실질적으로 동일한 작용성을 달성할 수 있으며, 확산은 축방향 대신 방사상이다.
제3 실시양태 요약
특이하게 작성된, 층상 재료는 각종의 공간적으로-분리된 분석물질 입자가 로딩된 저장소 세트를 형성하며, 또 상기 층상 재료는 질량 분석계에 의해 샘플링된다. 이것은 다양한 분석물질 입자의 조성의 맵을 얻으며, 이는 생물학적 샘플에 관한 유용한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 제3 실시양태에 따른 방법
본 발명의 제3 실시양태에 따른 방법에서, TEPC 필터의 홀(또는 기능적 등가 구조)은 개구에서 제한된다. 제어된 매트릭스 내의 분석물질 입자의 동질 또는 이질적 집단은 TEPC 필터 홀에 로딩되며, 또 상기 홀 단부는 홀 단부에 강제적으로 막힌 스페로이드에 의해 긴밀하게 캡핑된다. 이 조립체를 진공 챔버에 로딩하고, 레이저 빔에 의해 표적화되어, 생성한 증기는 질량 분석계 챔버로 향하도록 지시된다. 이온화 및 질량/전하 검출은 분석물질 입자의 확인 수단을 제공한다.
본 발명의 방법은 도 44 내지 도 48을 참조하여 설명할 것이다.
도 44를 참조하여, 분석물질 입자(20, 22 및 23)의 조성은, 홀(2)의 각 단부에 스페로이드(14)를 갖는 것에 의해 TEPC 필터(1)의 홀(2) 내에 둘러싸인다.
도 45 및 도 46을 참조하여, 압축력(39)을 발휘하도록 2개의 매끈한 롤러 사이에서 TEPC 필터(1)를 긴밀하게 압착하면 각 스페로이드(14)가 홀(2)의 양 단부를 막히게 할 것이다. 이어 TEPC 필터(1)를 제조 장치로부터 제거하여, 분석물질 입자를 함유하는 도 46에 도시된 안정한 재료를 얻는다.
도 47을 참조하여, 상기 안정한 재료는 진공 챔버에 들어간다. 홀(2) 내에 분석물질 입자를 함유하는 수성 매트릭스는 홀(2)을 막고 또 수성 매트릭스에서 밀봉하는 스페로이드(14)에 의해 진공으로부터 보호된다. 부가적 밀봉은 얇은 중합체 필름 오버코트(overcoat)에 의해 제공될 수 있다. 강력하고, 집중된 레이저 빔(40)을 홀(2)에 향하게 한다.
도 48을 참조하여, 상기 레이저 빔은 TEPC 필터(1) 홀(2)의 상부 스토퍼를 증발시켜서, 수성 매트릭스가 외부로 폭발되어 진공으로 들어가고, 이것을 가스로 분산시킨다. 이것은 매트릭스-보조된 레이저 탈착 이온화(MALDI) 분석과 유사하다. 그러나, 생물학적 샘플은 훨씬 더 적은 열적 스트레스를 받으므로, 덜 복잡한 단편화 패턴을 초래한다. 이렇게 감소된 복잡성은 분석적으로 유용할 것이다.
요약
이들 방법의 범위는 분석물질 입자의 검출, 특징화 및 확인, 그리고 나노규모 저장소를 사용한 이들을 포함한 상호작용의 특징화를 포함한다.
이들 과제를 실시하는 현재의 방법은 라벨링 수법의 방해 및 교차반응성과 같은 각종의 결점을 갖는다. 이들 결점은 제거된다. 또한, 상기 방법은 극히 저 농도의 분석물질 입자의 분석에 유용하다.
이들 방법이 유용할 수 있는 특정 분야는 단백질 상호작용을 측정하기 위한 바이오기술이다. 각 생물학적 시스템에 사용되는 단백질은 극히 다수가 존재하며, 많은 인자에 의존적인 복잡한 네트워크로 상호작용한다. 질병들이 이러한 네트워크를 왜곡시키며, 성분들과 상호작용 경로를 부가하거나 제거한다. 이러한 왜곡의 이해는 질병의 초기 검출과 약물 치료를 통한 상기 왜곡의 화학적 수선을 위해 기본적인 것이다. 이들 시스템 내에서 가장 인기있고 안정한 단백질은 부분적으로 연구되었지만, 훨씬 더 많은 연구가 요청되고 있다. 본 명세서에 기재된 방법과 같은 신규하고 더욱 강력한 도구를 의학 연구자의 레파토리에 부가한다면 단백질 네트워크의 이해를 심화시키고 또 신규 약물 요법의 개발을 가능하게 할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "입자"는 분자, 세포, 다세포 구조, 서브세포(subcellular) 성분, 바이러스, 프리온, 단백질, 중합체, 이온, 콜로이드, 및 형광단을 포함한다. 이들 입자는 현탁되거나 또는 용해될 수 있다. 상기 입자는 반드시 생물학적으로 관련되어야 하는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "분석물질"은 측정되어야 할 입자를 기재한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "겔"은 엄격한 기술적 정의에 한정되지 않고, 오히려 분석물질 입자의 확산 제한과 관련된 임의의 재료를 일반적으로 포함한다. 용어 "겔"은 비제한적으로 젤라틴, 아가로오스, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴레이트, 투과성 중합체, 투과성 공중합체, 녹말, 에어로겔, 콜로디온, 투석 막, 비혼화성 유체, 화학적으로 변형된 형태의 상기 수록된 재료, 입자가 매립된 상기 수록된 재료, 및 상기 수록된 재료의 조합을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "비혼화성 유체"는 분석물질 입자 매트릭스와 비혼화성인 유체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "대형"은 TEPC 필터 홀의 단부에서 제한을 통하여 겔에 의해 통과할 수 없는 입자를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "작은"은 TEPC 필터 홀의 단부에서 제한을 통하여 겔에 의해 통과할 수 있는 입자를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "힘"은 전계, 자계 구배로부터 생긴 힘, 중력계로부터 생긴 힘, 구심력, 원심분리력, 유체역학적 압력으로부터 생긴 힘, 정수압으로부터 생긴 힘, 또는 이러한 힘의 조합을 포함한다.
전계는 이온 또는 산화환원 종과의 직접적 전극 접촉없이 정전용량적으로 생성될 수 있다. 필요한 전계를 달성하기 위하여 필요에 따라 다수 세트의 전극이 이용될 수 있다. 예를 들어, 강한 이동력을 발휘하기 위하여 1개 세트의 전극이 이용되는 반면에, 분석물질 입자 측정을 위하여 다른 세트의 전극이 사용된다.
전류의 측정은 저항, 콘덕턴스, 임피던스, 커패시턴스 및 인덕턴스 측정 및 그의 조합을 구성하도록 구조화될 수 있다. 예를 들어, 임피던스 경계가 있는 지질 미셀, 전체 세포, 또는 다른 재료의 특징화는 커패시턴스 측정에 의해 보조될 수 있고, 또 키럴 분석물질의 특징화는 인덕턴스 측정에 의해 보조될 수 있다.
분석물질 입자는, 표준 크로마토그래피 수법 이외에, 완전 세포의 부분적 파쇄에 의해, 또는 기타 수법에 의해 장치로 전달될 수 있다.
상기 TEPC 재료에서 홀 또는 천공, 또는 그의 기능적 등가물은 개별 세포에꼭 맞는 크기일 수 있어, 전기적 임피던스 및 커패시턴스는 세포의 벌크를 통하여 대개 측정된다.
본 명세서에 기재된 방법은 흔히 "랩-온-어-칩(lab-on-a-chip)" 기술로 지칭되는 통상의 미세채널 어레이 기술과 조합될 수 있다.
본 발명은 특정의 바람직한 실시양태를 참조하여 기재하였지만, 당업자라면 첨부한 특허청구범위에 의해 정의된 본 발명의 정신과 범위 내에 있는 한 다른 부가, 결실, 치환, 변형 및 개량을 실시할 수 있음을 잘 알고 있을 것이다.

Claims (20)

  1. 분석물질 존재, 특징 및/또는 상호작용을 검출하는 방법에 있어서,
    a. 복수의 관통홀을 갖는 재료 시트를 제공하는 단계;
    b. 상기 재료 시트의 적어도 하나의 면(face)의 홀 개구를 제한하는 단계;
    c. 상기 관통 홀에 분석물질을 삽입하는 단계 - 관통 홀을 통한 분석물질의 통과는 단계 b의 제한 단계에 의해 제함됨 - ;
    d. 분석물질을 함유하는 상기 관통홀을 통해 전계를 인가하는 단계;
    e. 상기 분석물질이 관통 홀의 밖으로 확산되는 것을 허용하는 단계;
    f. 상기 관통 홀의 밖으로 확산되는 상기 분석물질의 확산 속도(diffusion rate)를 나타내는 시간흐름에 따른 전류의 변화를 측정하는 단계를 포함하고,
    상기 분석물질의 확산 속도는 분석물질의 존재, 특징 및/또는 상호작용의 검출을 제공하는
    분석물질의 존재, 특징, 및/또는 상호작용을 검출하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 재료 시트는,
    전기 절연성을 가진 것, 화학적으로 불활성인 것, 재료 시트의 두께가 500nm 내지 1000000nm 범위에 있는 것; 재료 시트의 두께가 1nm 내지 10cm 범위에 있는 것; 관통 홀의 직경이 10nm 내지 5000nm 범위에 있는 것; 관통 홀의 직경이 1nm 내지 1cm 범위에 있는 것; 화학적으로 유도체화된 내면을 가진 것; 화학적으로 유도체화된 외면을 가진 것; 겔에 의해 충전된 관통홀;을 갖는 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 특성을 갖는 재료를 포함하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 재료 시트가 폴리카보네이트; 트랙-에칭된 폴리카보네이트; 복수의 홀에 의해 드릴링된 중합체; 복수의 홀에 의해 화학적으로 에칭된 중합체; 복수의 홀에 의해 드릴링된 유리; 복수의 홀에 의해 화학적으로 에칭된 유리; 천공된 중합체 필름; 천공된 단층 필름; 및 천공된 다층 필름으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 b의 제한하는 단계는 재료 시트의 표면과 접촉하는 겔 층에 의해 상기 관통 홀 개구를 제한하는 단계를 포함하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 겔은,
    젤라틴; 아가로오스; 폴리아크릴아미드; 폴리아크릴레이트; 투과성 중합체; 투과성 공중합체; 녹말; 에어로겔; 콜로디온; 투석 막; 분석물질 입자 매트릭스와 비혼화성 유체; 화학적으로 변형된 형태의 상기 수록된 재료; 입자가 매립된 상기 수록된 재료; 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 재료를 포함하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 b의 제한하는 단계는,
    1) 관통홀을 통한 유체 유동을 제한하는 스페로이드를 사용하여 상기 관통홀 개구를 제한하는 단계, 및
    2) 전계를 인가하는 단계; 자계 구배를 인가하는 단계; 중력계를 인가하는 단계; 구심력을 인가하는 단계; 원심분리력을 인가하는 단계; 유체역학적 압력을 인가하는 단계; 정수압을 인가하는 단계; 화학적 결합(bonding)단계; 및 겔 매트릭스를 사용하는 단계로 이루어진 군으로부터 선택된 단계에 의해 관통홀 개구에 대해 고정된 위치에서 상기 스페로이드를 유지하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 겔 매트릭스로부터 상기 스페로이드를 제거하는 단계를 더 포함하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 f 단계의 측정하는 단계는, 전류계를 이용하여 재료 시트의 선택된 영역을 통과하는 전류 흐름을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 선택된 영역은,
    도전성 유체로 충전된 절연 튜브의 일단부를 상기 재료 시트와 접촉하는 단계 - 여기서 도전성 유체에 대한 재료 시트 상의 접촉 영역은 전류 흐름을 측정하기 위해 선택됨 - ; 상기 재료 시트의 표면에 홀을 갖는 절연 시트를 인가하는 단계 - 여기서 절연 시트 상의 홀에 대응하는 재료 시트 상의 영역은 전류 흐름을 측정하기 위해 선택됨 - ; 상기 재료 시트의 표면에 절연성 수-비혼화성(insulating water-immiscible) 유체를 인가하는 단계; 및 도전성 유체로 충전된 절연 튜브의 일단부와 재료 시트의 표면을 접촉하는 단계 - 여기서 도전성 유체에 대한 재료 시트 상의 접촉 영역은 전류 흐름을 측정하기 위해 선택됨 - 로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단계에 의해 선택되는 방법.
  10. 분석물질 존재, 특성 및/또는 상호작용의 검출을 위한 방법에 있어서,
    a. 복수의 관통홀을 갖는 재료 시트를 제공하는 단계;
    b. 상기 재료 시트의 적어도 하나의 면(face)의 홀 개구를 제한하는 단계;
    c. 상기 관통 홀에 형광 분석물질을 삽입하는 단계 - 여기서 관통 홀을 통한 형광 분석물질의 통과는 단계 b의 제한하는 단계에 의해 제한됨 - ;
    d. 상기 형광 분석물질을 관통 홀 내의 축방향으로 이동시키기 위해 분석물질을 포함하는 관통 홀을 통해 축방향으로 이동력을 인가하는 단계;
    e. 상기 관통 홀의 밖으로 상기 형광 분석물질의 확산을 허용하는 단계;
    f. 상기 관통 홀의 밖으로 확산되는 상기 형광 분석물질의 확산 속도(diffusion rate)를 나타내는 시간에 따른 형광의 변화를 측정하는 단계를 포함하고,
    상기 분석물질의 확산 속도는 분석물질의 존재, 특징 및/또는 상호작용의 검출을 제공하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 재료 시트는,
    전기 절연성을 가진 것, 화학적으로 불활성인 것, 재료 시트의 두께가 500nm 내지 1000000nm 범위에 있는 것; 재료 시트의 두께가 1nm 내지 10cm 범위에 있는 것; 관통 홀의 직경이 10nm 내지 5000nm 범위에 있는 것; 관통 홀의 직경이 1nm 내지 1cm 범위에 있는 것; 화학적으로 유도체화된 내면을 가진 것; 화학적으로 유도체화된 외면을 가진 것; 겔에 의해 충전된 관통홀;을 갖는 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 특성을 갖는 재료를 포함하는 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 재료 시트가 폴리카보네이트; 트랙-에칭된 폴리카보네이트; 복수의 홀에 의해 드릴링된 중합체; 복수의 홀에 의해 화학적으로 에칭된 중합체; 복수의 홀에 의해 드릴링된 유리; 복수의 홀에 의해 화학적으로 에칭된 유리; 천공된 중합체 필름; 천공된 단층 필름; 및 천공된 다층 필름으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  13. 제 10항에 있어서,
    상기 단계 b의 제한하는 단계는 재료 시트의 표면과 접촉하는 겔 층에 의해 상기 관통 홀 개구를 제한하는 단계를 포함하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 겔은,
    젤라틴; 아가로오스; 폴리아크릴아미드; 폴리아크릴레이트; 투과성 중합체; 투과성 공중합체; 녹말; 에어로겔; 콜로디온; 투석 막; 분석물질 입자 매트릭스와 비혼화성 유체; 화학적으로 변형된 형태의 상기 수록된 재료; 입자가 매립된 상기 수록된 재료; 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 재료를 포함하는 방법.
  15. 제 10항에 있어서,
    상기 단계 b의 제한하는 단계는,
    1) 관통홀을 통한 유체 유동을 제한하는 스페로이드를 사용하여 상기 관통홀 개구를 제한하는 단계, 및
    2) 전계를 인가하는 단계; 자계 구배를 인가하는 단계; 중력계를 인가하는 단계; 구심력을 인가하는 단계; 원심분리력을 인가하는 단계; 유체역학적 압력을 인가하는 단계; 정수압을 인가하는 단계; 화학적 결합(bonding)단계; 및 겔 매트릭스를 사용하는 단계로 이루어진 군으로부터 선택된 단계에 의해 관통홀 개구에 대해 고정된 위치에서 상기 스페로이드를 유지하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 겔 매트릭스로부터 상기 스페로이드를 제거하는 단계를 더 포함하는 방법.
  17. 제 10항에 있어서, 상기 이동력은 전계로부터 생긴 힘; 자계 구배로부터 생긴 힘; 중력계로부터 생긴 힘; 구심력; 원심분리력; 유체역학적 압력으로부터 생긴 힘; 정수압으로부터 생긴 힘; 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  18. 제 10항에 있어서,
    상기 형광의 시간에 따른 변화는 상기 재료 시트의 선택된 영역의 형광을 측정할 수 있는 광도 시스템(photometric system)에 의해 측정되는 방법.
  19. 삭제
  20. 삭제
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