JP2007319127A

JP2007319127A - Method for diagnosing alzheimer's disease

Info

Publication number: JP2007319127A
Application number: JP2006155378A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Yamamoto; 博山本; Hideto Yonekura; 秀人米倉; Takuo Watanabe; 琢夫渡邉; Yasuhiko Yamamoto; 靖彦山本; Koichi Tsuneyama; 幸一常山; Hiroyasu Akatsu; 裕康赤津; Makoto Kawaguchi; 誠川口; Yutaka Miura; 裕三浦
Original assignee: Kanazawa University NUC; Nagoya City University
Current assignee: Kanazawa University NUC; Nagoya City University
Priority date: 2006-06-02
Filing date: 2006-06-02
Publication date: 2007-12-13
Anticipated expiration: 2026-06-02
Also published as: JP4933159B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a means for accurately and simply diagnosing Alzheimer's disease in high reproducibility. <P>SOLUTION: The method for diagnosing Alzheimer's disease comprises diagnosing Alzheimer's disease by using the amount of endogenous secretory receptor for advanced glycation end products (esRAGE) in a sample containing nerve cells isolated from a specimen as an index. The diagnostic or diagnostic kit for Alzheimer's disease comprises an antibody to be specifically combined with esRAGE. <P>COPYRIGHT: (C)2008,JPO&INPIT

Description

本発明は、アルツハイマー病の診断方法、診断薬、又は診断用キットに関する。 The present invention relates to a diagnostic method, diagnostic agent, or diagnostic kit for Alzheimer's disease.

国、地域の境をこえて、全世界で考えていかなくてはならない問題の一つにアルツハイマー病を含む痴呆性疾患の問題がある。各国の高齢化に伴いアルツハイマー病を含む痴呆性疾患の方は年々増え続けており、現在その数は、世界でおよそ１８００万人、日本でもおよそ１６０万人にのぼる。以前は脳の循環障害（脳梗塞、脳出血などの血管性痴呆）が代表的な痴呆の原因であったが、最近の疫学調査ではアルツハイマー病の割合が増加する傾向にある。現在、はっきり認定されているアルツハイマー病の危険因子の中で、唯一確実な危険因子が加齢である以上、高齢化社会になるにつれ、痴呆性疾患のなかでのアルツハマー病の占める割合は年々増加の一途をたどる事は間違いのないことと思われる。 One of the issues that must be considered worldwide across national and regional borders is the problem of dementia, including Alzheimer's disease. With the aging of each country, the number of dementia diseases including Alzheimer's disease continues to increase year by year. Currently, the number is about 18 million in the world and 1.6 million in Japan. Previously, cerebral circulatory disturbance (vascular dementia such as cerebral infarction and cerebral hemorrhage) was a typical cause of dementia, but recent epidemiological surveys tend to increase the proportion of Alzheimer's disease. Among the currently recognized risk factors for Alzheimer's disease, as the only certain risk factor is aging, the proportion of Alzheimer's disease in dementia is increasing year by year as it becomes an aging society. It seems that there is no mistake in following this path.

日本は歴史上例のない高齢化社会を迎えており、高齢者の２〜３％はアルツハイマー病になると推定されている。２０００年で患者数は４５万〜５５万となり、２０２０年にはその倍近い７０〜８０万人にのぼり、さらに増加するものと推測されている。今後このような問題が日本だけでなく、世界に広がることから我々は逃れることは出来ない状況にある。 Japan is facing an unprecedented aging society, and it is estimated that 2-3% of the elderly will have Alzheimer's disease. In 2000, the number of patients reached 450,000 to 550,000, and in 2020, it is estimated that the number will increase to 700,000 to 800,000, which is almost double that number. In the future, we cannot escape from the spread of such problems not only in Japan but around the world.

現在、アルツハイマー病の確定診断は神経病理学的検索をおいて他にはない。従って、在命中に真の意味で確定診断をつける事は現実的には非常に難しいのが現状である。しかし、臨床の現場においては、臨床症状と病歴経過によって診断がなされ、補助的検査として、CT、MRIさらにはPET/SPECTといった画像診断、また脳波、血液・髄液生化学的検査等が行われる。 At present, there is no other definitive diagnosis of Alzheimer's disease based on neuropathological search. Therefore, in reality, it is very difficult to make a definitive diagnosis in a true sense while alive. However, in clinical settings, diagnosis is made based on clinical symptoms and history, and as an auxiliary test, CT, MRI, PET / SPECT, image diagnosis, electroencephalogram, blood and cerebrospinal fluid biochemical tests, etc. are performed. .

数年前まではアルツハイマー病の病理学的な確定診断は治療法がなかったゆえに重要視されていなかった。しかし最近の研究、すなわち家族性アルツハイマー病における原因遺伝子の解明によって、老人斑の根幹をなすアミロイドβ蛋白の形成過程やタウ蛋白質のリン酸化の機序などが明らかにされるとともに、アポリポ蛋白E4が危険因子である点からコレステロール代謝等がアルツハイマー病の病態に大きく関与していること、などが判明してきている。これらの知見に基づき、新しい治療法の開発がすすみつつあり、アルツハイマー病の病態解析、ケアは大きく進歩しつつある。特に今日ではコリンエステラーゼ阻害薬が実際に臨床の場で使用されそれなりの成果をあげ、発病初期であれば症状の進行をある程度抑えることも可能になっている。またワクチン療法の開発は、現在は臨床治験段階でストップしているが、近い将来必ずや再開されアルツハイマー病の予防や治療に大きく貢献できるものと思われる。さらに、昨今の目覚ましい技術の進歩に伴うCT、MRI、PET/SPECTなどの画像診断はアルツハイマー病の早期診断、予後予測診断に重点がおかれるようになりつつある。特にPET プローブの開発により老人斑の描出までをも可能にしつつある状況である。 Until a few years ago, the pathological definitive diagnosis of Alzheimer's disease was not emphasized due to the lack of treatment. However, recent research, elucidation of the causative gene in familial Alzheimer's disease, revealed the formation process of amyloid β protein that forms the basis of senile plaques, the mechanism of phosphorylation of tau protein, and apolipoprotein E4 From the point of being a risk factor, it has been revealed that cholesterol metabolism and the like are greatly involved in the pathology of Alzheimer's disease. Based on these findings, the development of new therapies is progressing, and the pathological analysis and care of Alzheimer's disease are making great progress. In particular, cholinesterase inhibitors are actually used in clinical settings and have achieved some results, and it is also possible to suppress the progression of symptoms to some extent in the early stages of onset. The development of vaccine therapy has been stopped at the clinical trial stage, but it will surely be resumed in the near future and it will be able to make a significant contribution to the prevention and treatment of Alzheimer's disease. In addition, CT, MRI, PET / SPECT, and other diagnostic imaging techniques have become increasingly important for early diagnosis and prognosis of Alzheimer's disease. In particular, the development of PET probes has made it possible to depict senile plaques.

病気の治療の第一歩は、病態と原因疾患の正確な診断から始まる。アルツハイマー病においても例外ではない。日本ではそれほど一般的とは言えないが、欧米ではアルツハイマー病、種々の変性疾患、脳腫瘍、脳炎、脳の感染症を含めて、原因疾患の検索、治療方針の決定の際に、脳組織生検による病理診断の果たす重要性が増している。脳組織生検の技術もCT、MRIをガイドとして使用、定位装置を使用したステレオバイオプシー（定位生検術）が一般的となり極小箇所を正確に生検する事が可能となっている。アルツハイマー病の場合、Braakのstagingによれば、海馬領域（海馬、海馬支脚、海馬傍回）の中で、海馬傍回（側頭葉内側面）が最もはじめに病変が出るとされるが、海馬（アンモン角、Cornu Ammonis、CA1-CA4を含む部分）に病変が及んではじめて病理学的な確定診断が可能となる。 The first step in disease treatment begins with an accurate diagnosis of the condition and the causative disease. Alzheimer's disease is no exception. Although not so common in Japan, in Europe and the United States, brain tissue biopsy is used to search for causative diseases and determine treatment strategies, including Alzheimer's disease, various degenerative diseases, brain tumors, encephalitis, and brain infections. The importance of pathological diagnosis by the use of is increasing. Brain tissue biopsy technology uses CT and MRI as a guide, and stereo biopsy (stereoscopic biopsy) using a stereotaxic device is common, and it is possible to accurately biopsy a minimal part. In the case of Alzheimer's disease, according to Braak's staging, in the hippocampal region (hippocampus, hippocampal pedestal, parahippocampal gyrus), the parahippocampal gyrus (side of the temporal lobe) appears to be the first lesion. A pathological definitive diagnosis is possible only after lesions (ammon horn, cornu ammonis, CA1-CA4).

日本においては、アルツハイマー病で在命中の確定診断に生検による病理診断法が用いられる事は現在のところ無い。倫理面での問題、安全性の問題、など種々の理由から、海馬あるいはその近傍が実際に生検の標的とされることは無い。しかしながら、海馬がてんかん発作の原因部位である場合を含め、実際に海馬を標的とした電極挿入、あるいは片側海馬の切離術、などの実施例は多数ある。従って同部位のピンポイントで正確な生検は、現在技術的には殆ど問題はない。欧米における生検によるアルツハイマー病の診断状況を考えると、将来的にその必要性が徐々に増してくる事に疑いは無いと思われる。 In Japan, pathological diagnosis by biopsy is not currently used for definitive diagnosis in Alzheimer's disease. For various reasons, such as ethical issues and safety issues, the hippocampus or its vicinity is not actually targeted for biopsy. However, there are many examples such as electrode insertion that actually targets the hippocampus, or unilateral hippocampal dissection, including cases where the hippocampus is the cause of epileptic seizures. Therefore, pinpoint accurate biopsy at the same site has little technical problem at present. Given the diagnosis of Alzheimer's disease by biopsy in the West, there is no doubt that the need will gradually increase in the future.

アルツハイマー病を1906年に最初の報告したのは、ドイツの精神科医で神経病理学者のアルツハイマーである。健忘と見当識障害を初発症状として、やがて抑うつ、幻覚を示し４年半の経過で著しい痴呆を呈して死亡した51歳女性における、特異的な神経病理学的変化が報告された。特徴の一つは、神経細胞の周囲間質に鍍銀染色で染まる多数の斑状構造物（老人斑、senile plaque; SP）が認められること、第２には神経細胞内に鍍銀染色で染まる線維状の構造物（神経原線維変化、neurofibrillary tangle; NFT）が多数出現することである。現在までの研究で、SPは神経細胞外組織へのアミロイドβ蛋白の凝集、蓄積とこれに伴う組織反応（変性した神経突起や反応性グリア細胞）からなり、アルツハイマー病での疾患特異性が比較的高いとされる。またNFTは神経細胞内に形成され、細胞骨格蛋白であるtau（タウ）が異常にリン酸化を受け凝集、蓄積したもので、他の疾患での出現も知られ疾患特異性はさほど高くないとされている。そのような背景のもと、現在、確定診断の際に使用されている、主要病理所見は３つある。すなわち、（A）アミロイドβ蛋白沈着によるSP、（B）tauの異常凝集によるNFT形成、（C）単純萎縮による神経細胞死、である。その３つの所見がどのように出現し、進展していくかを総合的にみて判断していくかにより確定診断がなされる。上記所見中の細胞死に関して補足すると、神経細胞死には形態学的に２つのタイプがある。一つはNFT形成に伴う細胞死で、もう一つは細胞が萎縮して消滅してゆく死に方であり、この過程は「単純萎縮」と呼ばれている。アルツハイマー病では神経細胞が変性して脱落、すなわち、神経細胞死が起こることが病態の基本となる。特に海馬領域（海馬、海馬支脚、海馬傍回）はアルツハイマー病の脳で最も高度に侵される部位で、最初期少量の記憶障害に対応していることはよく知られた事実である。 Alzheimer's disease was first reported in 1906 by a German psychiatrist and neuropathologist Alzheimer. A specific neuropathological change was reported in a 51-year-old woman who died of dementia and hallucinations, with marked dementia after 4 and a half years, with amnesia and disorientation as initial symptoms. One of the features is the presence of numerous plaque-like structures (senile plaques; SP) that stain with the silver stain in the interstitium around the nerve cells, and second, the nerve cells with the silver stain The appearance of many fibrous structures (neurofibrillary tangle; NFT). In the research to date, SP consists of aggregation and accumulation of amyloid β protein in the extracellular tissue and the accompanying tissue reaction (degenerated neurites and reactive glial cells), and the disease specificity in Alzheimer's disease is compared. It is said that it is expensive. NFT is formed in nerve cells, and tau (tau), a cytoskeletal protein, is abnormally phosphorylated, aggregated and accumulated, and its appearance in other diseases is known and its disease specificity is not so high. Has been. Against this background, there are three main pathological findings that are currently used for definitive diagnosis. (A) SP due to amyloid β protein deposition, (B) NFT formation due to abnormal tau aggregation, and (C) neuronal cell death due to simple atrophy. A definitive diagnosis is made depending on how these three findings appear and make a comprehensive decision. Complementing cell death during the above findings, there are two types of neuronal cell death morphologically. One is cell death that accompanies NFT formation, and the other is death by cell atrophy and annihilation. This process is called “simple atrophy”. In Alzheimer's disease, neuronal cells degenerate and fall out, that is, neuronal cell death is the basis of the disease state. It is well known that the hippocampus region (hippocampus, hippocampal pedestal, parahippocampal gyrus) is the most highly affected area in the brain of Alzheimer's disease and corresponds to the initial small amount of memory impairment.

さて、実際の神経病理学的診断の際に、上記（A）アミロイドβ蛋白沈着によるSP、（B）tauの異常凝集によるNFT形成、は鍍銀、Galyas Braak 染色を施した後の顕微鏡観察で決定する事が出来る。また（C）単純萎縮による神経細胞死も、剖検例の脳のごとく、脳全体のサイズ縮小の検討が可能な場合は、顕微鏡観察を加え判断することができる。しかしながら、海馬の脳組織が少量生検された場合を想定すると、萎縮を明確に出来ないだけに「単純萎縮による神経細胞死」の決定は難しく、診断に難渋する事が予測される。上記（A）（B）の病理所見が同時に存在すればほぼアルツハイマー病の診断を下すことができる。しかし、それぞれはアルツハイマー病特異的な所見ではなく、個別には他の痴呆性疾患にも存在する。このため、他疾患との誤診を避け、少量の脳組織で（C）単純萎縮による神経細胞死を決定して確定診断を確実に行うための簡便な「細胞死判定法」が望まれているところである。 At the time of actual neuropathological diagnosis, (A) SP due to amyloid β protein deposition, (B) NFT formation due to abnormal tau aggregation, and microscopic observation after staining with silver and Galyas Braak. Can be determined. In addition, (C) neuronal cell death due to simple atrophy can be judged by microscopic observation if it is possible to examine the size reduction of the entire brain, as in the case of the brain of an autopsy case. However, assuming that the brain tissue of the hippocampus is biopsied in a small amount, it is difficult to determine “nerve cell death due to simple atrophy” because the atrophy cannot be clearly determined, and it is predicted that it will be difficult to diagnose. If the pathological findings (A) and (B) above exist at the same time, Alzheimer's disease can be diagnosed. However, each is not a specific finding of Alzheimer's disease, but is also present individually in other dementia diseases. Therefore, there is a need for a simple “cell death determination method” that avoids misdiagnosis with other diseases and determines neuronal cell death due to simple atrophy (C) in a small amount of brain tissue to ensure definitive diagnosis. By the way.

少量生検された海馬の脳神経組織において「単純萎縮による神経細胞死」を正確に判定出来ることは、将来的にアルツハイマー病の確定診断、治療方針の決定上、極めて重要である。一方、その判定は、正確であることは勿論のこと、迅速性、簡便性も要求される。海馬領域が記憶に関係する大切な部位であることを考慮すれば、生検により多量の脳神経組織を得ることは不可能である。従って、正確で且つ簡便、再現性のある「神経細胞死」の決定が行えてはじめて正確な診断、さらには出来るだけ早期の治療開始による治療効果を期待できる。従って、正確であることに加えて、過度の負担を患者にかけることなく「神経細胞死」を判定できる手法が開発されれば、アルツハイマー病診断に対する貢献は計り知れない。 The ability to accurately determine “neuronal cell death due to simple atrophy” in hippocampal cranial nerve tissue biopsied in a small amount is extremely important in the future for the definitive diagnosis of Alzheimer's disease and the determination of treatment strategy. On the other hand, the determination is required not only to be accurate, but also to be quick and simple. Considering that the hippocampal region is an important part related to memory, it is impossible to obtain a large amount of cranial nerve tissue by biopsy. Therefore, an accurate diagnosis, and a therapeutic effect by starting treatment as early as possible can be expected only after accurate, simple and reproducible determination of “neuronal cell death”. Therefore, in addition to being accurate, if a method capable of determining “neural cell death” without imposing an excessive burden on the patient is developed, the contribution to the diagnosis of Alzheimer's disease is immeasurable.

これまでにアルツハイマー病の診断手法に関して種々の発明がなされている。例えば特許文献1及び2には、βアミロイドの生成及び代謝に関与すると考えられている酵素の活性を検出することによりアルツハイマー病を診断する手法が開示されている。しかしながら、これらはいずれも、脳組織の神経細胞の状態を間接的に評価する手法であることから、神経組織の状態を正確に評価する目的には適していないと考えられる。 So far, various inventions have been made regarding diagnostic techniques for Alzheimer's disease. For example, Patent Documents 1 and 2 disclose a technique for diagnosing Alzheimer's disease by detecting the activity of an enzyme that is considered to be involved in the production and metabolism of β-amyloid. However, since these are methods for indirectly evaluating the state of nerve cells in brain tissue, they are not suitable for the purpose of accurately evaluating the state of nerve tissue.

一方、膜結合型の後期糖化反応生成物受容体 (Receptor for advanced glycation endproducts, 本明細書において「RAGE」と略記することがある)は、Sternらのグループにより、AGE (advanced glycation endproducts, 後期糖化反応生成物)の細胞表面特異受容体として分離されその一次構造が決定された（非特許文献１）。膜結合型RAGEは，イムノグロブリンスーパーファミリーに属する１回膜貫通型の受容体で、V,C1,C2の３つのイムノグロブリン様ドメインからなる細胞外領域と短い細胞内領域とを有する。そして最もN末端にある免疫グロブリン可変領域様ドメイン部分の内部にAGEリガンド結合部位がある。AGEとはグルコースなどの還元糖とタンパク質のアミノ基との非酵素的な反応、グリケーションによって生ずる構造体の総称であり、糖尿病合併症、動脈硬化、神経変性疾患さらには老化にも関与すると注目されているものである。さらに近年、RAGEはマルチリガンドレセプターとして認識されるに至り、RAGEが様々な病態に関与している可能性が考えられている。膜結合型RAGEにAGEをはじめとするリガンドが結合すると、活性酸素種の産生を経て転写因子NFκBの活性化を引き起こし、様々な遺伝子群の発現誘導を引き起こすと考えられている。 On the other hand, membrane-bound late glycation end product receptor (Receptor for advanced glycation endproducts, which may be abbreviated as “RAGE” in this specification) is a group of Stern et al. The reaction product was isolated as a cell surface specific receptor and its primary structure was determined (Non-patent Document 1). Membrane-bound RAGE is a single-transmembrane receptor belonging to the immunoglobulin superfamily, and has an extracellular region composed of three immunoglobulin-like domains of V, C1, and C2, and a short intracellular region. And, there is an AGE ligand binding site inside the immunoglobulin variable region-like domain part at the most N-terminal. AGE is a general term for structures resulting from non-enzymatic reactions and glycation of reducing sugars such as glucose and amino groups of proteins, and it is noted that it is also involved in diabetic complications, arteriosclerosis, neurodegenerative diseases and aging It is what has been. In recent years, RAGE has been recognized as a multi-ligand receptor, and it is considered that RAGE may be involved in various pathological conditions. When ligands such as AGE bind to membrane-bound RAGE, it is considered that the activation of transcription factor NFκB is caused through the production of reactive oxygen species and the induction of expression of various gene groups is caused.

本発明者らは、RAGEには一つの遺伝子から選択的スプライシングによって作り出される新しい分子種が存在することを見出した。以前から知られている完全長膜結合型RAGEに比べ、新たに見出されたアイソフォームの一つはC端側の膜貫通領域を欠き分泌型となるRAGEである。この分泌型RAGEタンパクは血管内皮培養細胞から実際に分泌され、ヒトの血中や様々な組織にも存在することより、内在性分泌型RAGE（endogenous secretory RAGE, 本明細書において「esRAGE」と略記する）と命名した（特許文献3）。esRAGEはリガンド結合部位を持つため、細胞外でリガンドを捕捉することによりリガンドと細胞表面の膜型RAGEとの結合を阻害する働きを持つと考えられる。 The present inventors have found that RAGE has a new molecular species created by alternative splicing from one gene. One of the newly discovered isoforms is a secreted RAGE that lacks the transmembrane region on the C-terminal side, compared to the previously known full-length membrane-bound RAGE. This secreted RAGE protein is actually secreted from cultured vascular endothelial cells and is also present in human blood and various tissues. Therefore, endogenous secretory RAGE (endogenous secretory RAGE, abbreviated as “esRAGE” in this specification). (Patent Document 3). Since esRAGE has a ligand binding site, it is considered that it has a function of inhibiting the binding between the ligand and the membrane-type RAGE on the cell surface by capturing the ligand outside the cell.

これまでにRAGEポリペプチドの機能に関しては種々の報告がある（非特許文献2および3）。しかしながら、esRAGEポリペプチドとアルツハイマー病との関係については、これまで具体的な検討はなされていない。特許文献4には、体液中の可溶型RAGE (esRAGEと同じ) の発現量の変化に起因した疾患の診断に使用することができる、可溶型RAGEに対する抗体を含有していることを特徴とする免疫学的測定試薬又は疾患診断剤が記載されている。そして特許文献4では、診断されうる疾患としてアルツハイマー病が挙げられている。しかしながら特許文献4では、アルツハイマー病患者においてesRAGEの発現量が健常者と比較して相違するか否か、相違するとすればどのように相違するのか、という点について具体的な開示がされていない。 There have been various reports on the functions of RAGE polypeptides so far (Non-patent Documents 2 and 3). However, no specific study has been made regarding the relationship between esRAGE polypeptide and Alzheimer's disease. Patent Document 4 contains an antibody against soluble RAGE that can be used for diagnosis of diseases caused by changes in the expression level of soluble RAGE (same as esRAGE) in body fluids. And an immunological measurement reagent or disease diagnostic agent. In Patent Document 4, Alzheimer's disease is cited as a disease that can be diagnosed. However, Patent Document 4 does not specifically disclose whether or not the expression level of esRAGE is different from that in healthy subjects in Alzheimer's disease patients, and how it is different.

特開2005-145837号公報JP 2005-145837 A 特開平9-196912号公報JP-A-99-196912 特開2003-12586号公報JP 2003-12586 特開2003-128700号公報JP 2003-128700 A J. Biol. Chem. 267: 14998-15004 (1992)J. Biol. Chem. 267: 14998-15004 (1992) J. Clin. Invest. 113: 1641-1650 (2004)J. Clin. Invest. 113: 1641-1650 (2004) J. Clin. Invest. 115: 1267-1274 (2005)J. Clin. Invest. 115: 1267-1274 (2005)

本発明は正確で、簡便で、再現性の高いアルツハイマー病の診断手段を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide an accurate, simple and highly reproducible diagnostic means for Alzheimer's disease.

本発明は以下の発明を包含する。
(1) 被検体から単離された神経細胞を含有する試料中の、内在性分泌型後期糖化反応生成物受容体 (esRAGE) の量を指標としてアルツハイマー病を診断することを特徴とする、アルツハイマー病の診断方法。
(2) 前記試料が海馬に由来する試料である、(1) 記載の方法。
(3) 指標として用いられるesRAGEの量が、神経細胞の細胞質におけるesRAGEの量である、(1)又は(2)記載の方法。
(4) 被検体から単離された前記試料中のesRAGEの量と、対照検体から単離された神経細胞を含有する試料中のesRAGEの量とを対比する工程と、
被検体から単離された前記試料中のesRAGEの量が、対照検体から単離された神経細胞を含有する試料中のesRAGEの量と対比して少ないときに、被検体がアルツハイマー病に罹患している、あるいは対照検体と比較してより重度のアルツハイマー病患者であると判断する工程とを含む、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。 The present invention includes the following inventions.
(1) Alzheimer's disease characterized by diagnosing Alzheimer's disease using the amount of endogenous secretory late glycation reaction product receptor (esRAGE) in a sample containing neurons isolated from a subject as an indicator How to diagnose the disease.
(2) The method according to (1), wherein the sample is a sample derived from the hippocampus.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the amount of esRAGE used as an indicator is the amount of esRAGE in the cytoplasm of nerve cells.
(4) comparing the amount of esRAGE in the sample isolated from a subject with the amount of esRAGE in a sample containing nerve cells isolated from a control sample;
A subject suffers from Alzheimer's disease when the amount of esRAGE in the sample isolated from the subject is small compared to the amount of esRAGE in the sample containing neurons isolated from the control sample. Or a step of determining that the patient is a more severe Alzheimer's disease patient as compared to a control sample, or the method according to any one of (1) to (3).

(5) 被検体から単離された前記試料が神経細胞とグリア細胞とを含有するものであり、
前記試料中の神経細胞におけるesRAGEの量と、グリア細胞におけるesRAGEの量とを対比する工程と、
神経細胞におけるesRAGEの量が、グリア細胞におけるesRAGEの量と対比して少ないときに、被検体がアルツハイマー病に罹患していると判断する工程とを含む、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。 (5) the sample isolated from the subject contains nerve cells and glial cells,
Comparing the amount of esRAGE in nerve cells in the sample with the amount of esRAGE in glial cells;
Any one of (1) to (3), comprising the step of determining that the subject is suffering from Alzheimer's disease when the amount of esRAGE in nerve cells is small compared to the amount of esRAGE in glial cells The method described in 1.

(6) esRAGEの量の評価が、esRAGEに特異的に結合し得る抗体を用いて行われる、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(7) esRAGEに特異的に結合し得る抗体を用いた免疫染色法により、被検体から単離された前記試料中のesRAGEを染色する工程と、
esRAGEに特異的に結合し得る抗体を用いた免疫染色法により、対照検体から単離された神経細胞を含有する試料中のesRAGEを染色する工程と、
被検体から単離された前記試料中の神経細胞の染色強度と、対照検体から単離された前記試料中の神経細胞の染色強度とを対比する工程と、
被検体から単離された前記試料中の神経細胞の染色強度が、対照検体から単離された前記試料中の神経細胞の染色強度と対比して弱いときに、被検体がアルツハイマー病に罹患している、あるいは対照検体と比較してより重度のアルツハイマー病患者であると判断する工程とを含む、(6)記載の方法。 (6) The method according to any one of (1) to (3), wherein the amount of esRAGE is evaluated using an antibody that can specifically bind to esRAGE.
(7) a step of staining esRAGE in the sample isolated from the subject by an immunostaining method using an antibody that can specifically bind to esRAGE;
a step of staining esRAGE in a sample containing nerve cells isolated from a control specimen by an immunostaining method using an antibody capable of specifically binding to esRAGE;
Comparing the staining intensity of neurons in the sample isolated from a subject with the staining intensity of neurons in the sample isolated from a control specimen;
The subject suffers from Alzheimer's disease when the staining intensity of neurons in the sample isolated from the subject is weak compared to the staining intensity of neurons in the sample isolated from the control sample. Or a step of determining that the patient is a more severe Alzheimer's disease patient compared to a control sample.

(8) 被検体から単離された前記試料が神経細胞とグリア細胞とを含有するものであり、
esRAGEに特異的に結合し得る抗体を用いた免疫染色法により、前記試料中のesRAGEを染色する工程と、
前記試料中の神経細胞の染色強度と、グリア細胞の染色強度とを対比する工程と、
神経細胞の染色強度が、グリア細胞の染色強度と対比して弱いときに、被検体がアルツハイマー病に罹患していると判断する工程とを含む、(6)記載の方法。 (8) The sample isolated from the subject contains nerve cells and glial cells,
a step of staining esRAGE in the sample by an immunostaining method using an antibody capable of specifically binding to esRAGE;
Comparing the staining intensity of nerve cells in the sample with the staining intensity of glial cells;
The method according to (6), further comprising the step of determining that the subject is suffering from Alzheimer's disease when the staining intensity of nerve cells is weak as compared with the staining intensity of glial cells.

(9) 前記抗体が、配列表の配列番号1のC末端の16個のアミノ酸の配列からなるポリペプチドを抗原として用いて誘導された抗体である、(6)〜(8)のいずれかに記載の方法。
(10) esRAGEに特異的に結合し得る抗体を含有し、該抗体が(6)〜(8)のいずれかに記載の方法に使用されるものであることを特徴とする、アルツハイマー病の診断薬。
(11) 前記抗体が、配列表の配列番号1のC末端の16個のアミノ酸の配列からなるポリペプチドを抗原として用いて誘導された抗体である、(10)記載の診断薬。 (9) The antibody according to any one of (6) to (8), wherein the antibody is an antibody derived using a polypeptide consisting of a sequence of 16 amino acids at the C-terminus of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing as an antigen. The method described.
(10) A diagnosis of Alzheimer's disease comprising an antibody capable of specifically binding to esRAGE, wherein the antibody is used in the method according to any one of (6) to (8) medicine.
(11) The diagnostic agent according to (10), wherein the antibody is an antibody derived using a polypeptide consisting of a sequence of 16 amino acids at the C-terminus of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing as an antigen.

(12) esRAGEに特異的に結合し得る抗体を含有し、該抗体が(6)〜(8)のいずれかに記載の方法に使用されるものであることを特徴とする、アルツハイマー病の診断用キット。
(13) 前記抗体が、配列表の配列番号1のC末端の16個のアミノ酸の配列からなるポリペプチドを抗原として用いて誘導された抗体である、(12)記載の診断用キット。 (12) A diagnosis of Alzheimer's disease comprising an antibody capable of specifically binding to esRAGE, wherein the antibody is used in the method according to any one of (6) to (8) For kit.
(13) The diagnostic kit according to (12), wherein the antibody is an antibody derived using a polypeptide consisting of a sequence of 16 amino acids at the C-terminus of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing as an antigen.

本発明により、正確で、簡便で、再現性の高いアルツハイマー病の診断手段が提供される。 The present invention provides an accurate, convenient, and highly reproducible diagnostic means for Alzheimer's disease.

1. 被検体
本発明において「被検体」とはアルツハイマー病を発症しうる動物であれば限定されないが、ヒトが特に好ましい。ヒト以外の被検体としては、例えば、サル、チンパンジー等の非ヒト霊長類、マウス、ラット、モルモット等の齧歯類、ニワトリ、ウズラ等の鳥類等が挙げられる。ヒト以外の動物を被検体とした場合に得られる情報（判定結果）は、当該非ヒト動物のアルツハイマー病の診断にも利用され得るが、むしろそれをヒトのアルツハイマー病の診断法の確立に利用できる点で有用である。 1. Subject In the present invention, the “subject” is not limited as long as it is an animal capable of developing Alzheimer's disease, but a human is particularly preferable. Examples of subjects other than humans include non-human primates such as monkeys and chimpanzees, rodents such as mice, rats, and guinea pigs, and birds such as chickens and quails. Information (judgment results) obtained when a non-human animal is used as a subject can be used for diagnosis of Alzheimer's disease in the non-human animal, but rather it is used for establishing a diagnostic method for human Alzheimer's disease. Useful in that it can.

ヒトが被検体である場合は通常、他の診断法によってアルツハイマー病が疑われる者（患者）が被検体となる。ここでの他の診断法としては例えば、臨床症状および病歴、ＣＴ検査、ＭＲＩ検査、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ検査、脳波検査、生化学的検査を用いた診断法などが該当する。通常は、これらの一つ以上によってアルツハイマー病が疑われるヒトから被検試料が採取される。 When a human is a subject, a subject (patient) suspected of having Alzheimer's disease by another diagnostic method is usually the subject. Other diagnostic methods here include, for example, diagnostic methods using clinical symptoms and history, CT examination, MRI examination, PET / SPECT examination, electroencephalogram examination, biochemical examination, and the like. Usually, test samples are collected from humans suspected of having Alzheimer's disease by one or more of these.

2. 試料
本発明の方法で使用される、被検体から単離された試料は、神経細胞を含有する試料である限り特に限定されない。このような試料としては、脳、ガングリオン、実質臓器の神経節などに由来する試料が好ましく、なかでも脳に由来する試料が好ましい。脳のなかでも海馬が特に好ましいが、これには限定されず、海馬以外の部位もまた試料として使用できる。海馬に由来する試料としては、海馬錐体細胞を含有する試料が好ましい。 2. Sample The sample isolated from the subject used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a sample containing nerve cells. As such a sample, a sample derived from the brain, ganglion, a ganglion of a parenchymal organ, or the like is preferable, and a sample derived from the brain is particularly preferable. Among the brains, the hippocampus is particularly preferred, but the invention is not limited to this, and parts other than the hippocampus can also be used as samples. As a sample derived from the hippocampus, a sample containing hippocampal pyramidal cells is preferable.

試料は、摘出臓器から位置を確認して切り離したものを使用することができる。試料が生検であれば、被験者の所望の部位から採取したものを使用することができる。 The sample can be used after confirming the position from the removed organ. If the sample is a biopsy, a sample collected from a desired site of the subject can be used.

試料の形態としては、特に限定されないが、上記の各部位に由来する試料をホルマリン固定した形態や、AMEX法やPFA固定により凍結材料にした形態のものが挙げられる。 The form of the sample is not particularly limited, and examples thereof include a form obtained by fixing a sample derived from each of the above-mentioned parts with formalin, and a form obtained by freezing material by AMEX method or PFA fixation.

以下に、被検試料としてヒトの海馬錐体細胞を含有する試料を用いる場合について詳述する。この場合、被検体であるヒトの生体脳組織から海馬錐体細胞が採取される。海馬錐体細胞は、被検体の脳、海馬領域より採取される。具体的には、生体の場合は被検体の脳海馬組織の一部をバイオプシー（生検）で採取し、採取された組織片を、海馬錐体細胞を含む試料として使用する。剖検例（死体）の場合は、剖検時に採取された海馬領域全体又は一部を、海馬錐体組織を含む試料として使用することができる。このように、生体又は死体より分離された状態の海馬錐体細胞が用意される。ここで「生体（又は死体）より分離された」とは、海馬錐体細胞が存在する生体（又は死体）脳組織の海馬の一部を摘出することによって、その由来の生体（又は死体）と完全に隔離されている状態をいう。海馬錐体細胞は通常、生体（又は死体）で存在していた状態、即ち周囲の各種の細胞や間質結合組織と結合した状態（即ち組織片として）で採取され、本発明の方法に使用される。生体（剖検症例の場合は死体）より採取した組織はホルマリンやパラフォルムアルデヒド等によって固定する。その後パラフィン包埋する。 The case where a sample containing human hippocampal pyramidal cells is used as the test sample is described in detail below. In this case, hippocampal pyramidal cells are collected from human brain tissue, which is the subject. Hippocampal pyramidal cells are collected from the subject's brain and hippocampal region. Specifically, in the case of a living body, a part of the brain hippocampal tissue of the subject is collected by biopsy (biopsy), and the collected tissue piece is used as a sample containing hippocampal pyramidal cells. In the case of an autopsy case (dead body), the whole or part of the hippocampal region collected at the time of necropsy can be used as a sample containing hippocampal cone tissue. In this way, hippocampal pyramidal cells separated from the living body or cadaver are prepared. Here, “isolated from a living body (or cadaver)” means that a part of the hippocampus of a living body (or cadaver) brain tissue in which hippocampal pyramidal cells exist is extracted, A state of complete isolation. Hippocampal pyramidal cells are usually collected in the state of being present in a living body (or corpse), that is, in a state of being bound to various surrounding cells and interstitial connective tissue (that is, as a piece of tissue) and used in the method of the present invention. Is done. Tissue collected from a living body (in the case of an autopsy case) is fixed with formalin, paraformaldehyde, or the like. Then embedded in paraffin.

3. esRAGE
本発明においてアルツハイマー病診断の指標として測定されるesRAGEのアミノ酸配列は被検体により若干異なるが、ヒト由来esRAGEのアミノ酸は配列表の配列番号1記載の通りである。なお参考のために、ヒト由来膜型RAGE (完全長RAGE)のアミノ酸配列を配列表の配列番号2に示す。本発明において指標として用いられるesRAGEは糖鎖修飾などの種々の修飾を受けたものであってもよい。 3. esRAGE
In the present invention, the amino acid sequence of esRAGE measured as an index for diagnosis of Alzheimer's disease varies slightly depending on the subject, but the amino acid of human-derived esRAGE is as described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. For reference, the amino acid sequence of human-derived membrane RAGE (full-length RAGE) is shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. The esRAGE used as an index in the present invention may be subjected to various modifications such as sugar chain modification.

4. 抗esRAGE抗体
esRAGEの測定は、esRAGEに特異的に結合し得る抗体を用いて行われることが好ましい。このような抗体は、esRAGE又はその部分配列を含むポリペプチドを抗原として用い、常法により作成された抗体を好適に使用できる。なかでも、配列番号1のC末端の16個のアミノ酸の配列からなるポリペプチドを抗原として用いて誘導された抗体を好適に使用できる。 4. Anti-esRAGE antibody
The measurement of esRAGE is preferably performed using an antibody that can specifically bind to esRAGE. As such an antibody, an antibody prepared by a conventional method using a polypeptide containing esRAGE or a partial sequence thereof as an antigen can be preferably used. Among them, an antibody derived using a polypeptide consisting of the sequence of 16 amino acids at the C-terminal of SEQ ID NO: 1 as an antigen can be preferably used.

抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。また抗体はesRAGEに特異的に結合し得る限り断片として使用することもできる。抗体の断片としては、例えば、Fab断片、F（ab）’_２断片、単鎖抗体（scFv）等が挙げられる。
モノクローナル抗体は例えば次の手順で作成することができる。 The antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Antibodies can also be used as fragments as long as they can specifically bind to esRAGE. Examples of antibody fragments include Fab fragments, F (ab) ′ ₂ fragments, single-chain antibodies (scFv), and the like.
A monoclonal antibody can be prepared, for example, by the following procedure.

上記の抗原を、動物に対して、抗原の投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。用いられる動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどの哺乳動物が挙げられる。抗血清中の抗体価の測定は常法により行うことができる。 The above-mentioned antigen is administered to animals together with itself, a carrier, or a diluent at a site where antibody production is possible by administration of the antigen. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Examples of animals used include mammals such as monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats and the like. The antibody titer in the antiserum can be measured by a conventional method.

抗原を免疫された動物から抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。融合操作は既知の方法、例えば、Nature 256: 495 (1975)記載の方法に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが挙げられる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられる。 By selecting an individual having an antibody titer from an animal immunized with the antigen, collecting the spleen or lymph node 2 to 5 days after the final immunization, and fusing the antibody-producing cells contained therein with myeloma cells, Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared. The fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method described in Nature 256: 495 (1975). Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG). Examples of myeloma cells include NS-1, P3U1, SP2 / 0, and the like.

モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はHAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。 Selection of the monoclonal antibody can be performed according to a known method or a method similar thereto, but can be usually performed in a medium for animal cells to which HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) is added. As a selection and breeding medium, any medium may be used as long as the hybridoma can grow. The antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the antibody titer in the antiserum.

モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様の、例えば塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどを用いた特異的精製法による免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
一方、ポリクローナル抗体は例えば次の手順で作成することができる。 The separation and purification of the monoclonal antibody is the same as the separation and purification of a normal polyclonal antibody, for example, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, adsorption / desorption method using an ion exchanger (eg, DEAE), It can be carried out according to an ultracentrifugation method, a gel filtration method, an antigen-binding solid phase or a specific purification method using protein A or protein G, and the like, according to a method for separating and purifying immunoglobulin.
On the other hand, a polyclonal antibody can be prepared, for example, by the following procedure.

ポリクローナル抗体は、例えば、抗原とキャリアーとの複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から活性型ハプトグロビン対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。ポリクローナル抗体の作成に使用する抗原はモノクローナル抗体の作成におけるのと同様である。抗原とキャリアーとの複合体を形成する際に、キャリアーの種類および抗原とキャリアーとの混合比は、キャリアーに架橋させた抗原に対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよい。キャリアーとしては、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等が用いられる。また、抗原とキャリアーのカップリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 Polyclonal antibodies are prepared by, for example, producing a complex of an antigen and a carrier, immunizing a mammal in the same manner as the above-described monoclonal antibody production method, collecting an antibody-containing substance against active haptoglobin from the immunized animal, It can manufacture by performing isolation | separation purification. The antigen used for the production of the polyclonal antibody is the same as that for the production of the monoclonal antibody. When forming a complex of an antigen and a carrier, the type of carrier and the mixing ratio of the antigen and the carrier can be any ratio and any ratio as long as the antibody can be efficiently produced against the antigen cross-linked to the carrier. It may be crosslinked with Examples of the carrier include bovine serum albumin, bovine thyroglobulin, keyhole limpet hemocyanin, and the like. Various condensing agents can be used for coupling the antigen and the carrier, and active ester reagents containing glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, thiol group, dithiobilidyl group, and the like are used.

抗原とキャリアーとの複合体は、免疫される動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なうことができる。用いられる動物としては、モノクローナル抗体作成の場合と同様の哺乳動物が挙げられる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の手順で行なうことができる。 The complex of an antigen and a carrier is administered to a immunized animal at a site where antibody production is possible, together with the carrier or diluent. Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. The administration can usually be carried out about once every 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total. Examples of animals used include mammals similar to those used in the production of monoclonal antibodies. Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc., preferably blood of animals immunized by the above method. The polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the above-described measurement of the antibody titer in the serum. Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed by the same procedure as the separation and purification of the monoclonal antibody.

5. esRAGEの量の評価方法
本発明の方法は、被検体から単離された神経細胞含有試料中のesRAGEの存在量を評価する工程を含むが、esRAGEの絶対的な量を測定する必要はなく、対照となる試料、あるいは神経細胞の周囲にあるグリア細胞中のesRAGEの存在量との相対的な関係を明らかにできれば評価としては十分である。対比の基準として用いられる、神経細胞の周囲にあるグリア細胞としては、アストロサイト、オリゴデンドログリアなどが挙げられる。 5. Method for evaluating the amount of esRAGE The method of the present invention includes a step of evaluating the abundance of esRAGE in a sample containing nerve cells isolated from a subject, but it is necessary to measure the absolute amount of esRAGE. However, if the relative relationship with the abundance of esRAGE in the control sample or the glial cells surrounding the nerve cells can be clarified, the evaluation is sufficient. Examples of glial cells around nerve cells used as a reference for comparison include astrocytes and oligodendroglia.

esRAGEの量の評価方法としては、上記の抗esRAGE抗体を用いた種々の方法が挙げられる。なかでも免疫染色法が好ましい。免疫染色法ではesRAGEと抗esRAGE抗体との結合量が染色強度として表される。免疫染色法としては、具体的には一般的に行われている酵素抗体法を用いることができるがこれには限定されず、蛍光抗体法、金属標識抗体法等も使用できる。酵素抗体法は例えば次のような手順で行うことができる。まず、ホルマリン固定パラフィン包埋標本から、キシレン、アルコールでパラフィンを取り除き、適正な非特異反応ブロッキングを行う。この作業は５％ヤギ血清、あるいは５％BSAに５分間反応させることにより行われる。抗原賦活液（DAKOの市販薬、あるいはクエン酸バッファー）に標本を浸し、熱処理を加えて抗原賦活化を行う。その後、一次抗体として抗esRAGE抗体と反応後、二次抗体と反応させる。ここでの二次抗体とは、抗esRAGE抗体等に特異的結合性を有する抗体であって例えばウサギ抗体として抗esRAGE抗体等を調製した場合には抗ウサギIgG抗体が使用される。ウサギやヤギ、マウスなど様々な種の抗体に対して使用可能な標識二次抗体が市販されており（例えばDAKO, フナコシ株式会社やコスモ・バイオ株式会社など）、本発明で使用する抗esRAGE抗体に応じて適切なものを適宜選択して使用することができる。標識物質には、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミンイソチオシアネート（RITC）、アルカリホスファターゼ、ビオチン、及び放射性物質の中から任意に選択されるものが好適に用いられる。さらに、ビオチンを標識物質として用いてアビジンペルオキシダーゼを反応させる方法によれば、より高感度の検出が可能である。また、二次抗体としてはペロキシダーゼ、あるいはアルカリフォスファターゼといった酵素を添付したポリマーにしたもの（市販名：Envision, Histofine等）を用いることもできる。最終的に、必要な場合は基質を反応させて、上記標識物質を茶色や赤、青色等に発色し、各種顕微鏡観察に供する。下記実施例においても基本的に上記手順を採用した。 Examples of the method for evaluating the amount of esRAGE include various methods using the above-mentioned anti-esRAGE antibody. Of these, immunostaining is preferred. In the immunostaining method, the amount of binding between esRAGE and anti-esRAGE antibody is expressed as staining intensity. As the immunostaining method, specifically, a generally performed enzyme antibody method can be used, but is not limited thereto, and a fluorescent antibody method, a metal-labeled antibody method, and the like can also be used. The enzyme antibody method can be performed, for example, by the following procedure. First, paraffin is removed from formalin-fixed paraffin-embedded specimens with xylene and alcohol, and appropriate nonspecific reaction blocking is performed. This operation is performed by reacting with 5% goat serum or 5% BSA for 5 minutes. Immerse the specimen in an antigen activation solution (DAKO commercial drug or citrate buffer) and apply heat treatment to activate the antigen. Then, after reacting with an anti-esRAGE antibody as a primary antibody, it is reacted with a secondary antibody. The secondary antibody here is an antibody having specific binding property to an anti-esRAGE antibody or the like. For example, when an anti-esRAGE antibody or the like is prepared as a rabbit antibody, an anti-rabbit IgG antibody is used. Labeled secondary antibodies that can be used against various types of antibodies such as rabbits, goats, and mice are commercially available (for example, DAKO, Funakoshi Co., Ltd., Cosmo Bio Co., etc.), and anti-esRAGE antibodies used in the present invention Appropriate ones can be selected and used according to the conditions. Examples of labeling substances include peroxidase, β-D-galactosidase, microperoxidase, horseradish peroxidase (HRP), fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine isothiocyanate (RITC), alkaline phosphatase, biotin, and radioactive substances. What is selected is preferably used. Furthermore, according to the method of reacting avidin peroxidase using biotin as a labeling substance, detection with higher sensitivity is possible. Further, as the secondary antibody, a polymer (commercial name: Envision, Histofine, etc.) attached with an enzyme such as peroxidase or alkaline phosphatase can be used. Finally, if necessary, the substrate is reacted, and the labeling substance is colored brown, red, blue, etc., and is used for various microscope observations. The above procedure was basically adopted in the following examples.

6. 診断方法
本発明では被検試料中のesRAGEの量の減少を指標としてアルツハイマー病を診断する。本発明者らは驚くべきことに、アルツハイマー病患者では、アストロサイト、オリゴデンドログリアなどのグリア細胞においてはesRAGEが健常者と同程度に存在しているにも関わらず、神経細胞（特に神経細胞の細胞質）においてはesRAGEが健常者と比較して顕著に少ないことを見出した。従って、神経細胞（特に神経細胞の細胞質）におけるesRAGEの量の減少は、アルツハイマー病の診断指標として特に好適である。また、本発明の方法では神経細胞の状態を直接評価することから、間接的に評価する特許文献1,2等に記載の技術と比較して、アルツハイマー病の正確な診断が可能となる。 6. Diagnosis method In the present invention, Alzheimer's disease is diagnosed by using a decrease in the amount of esRAGE in a test sample as an index. The present inventors have surprisingly found that in Alzheimer's disease patients, esRAGE is present in the glial cells such as astrocytes and oligodendroglia in the same degree as in healthy individuals, particularly in nerve cells. In the cytoplasm), esRAGE was found to be significantly less than that of healthy subjects. Therefore, a decrease in the amount of esRAGE in nerve cells (particularly the cytoplasm of nerve cells) is particularly suitable as a diagnostic index for Alzheimer's disease. In addition, since the method of the present invention directly evaluates the state of nerve cells, it is possible to accurately diagnose Alzheimer's disease as compared with the techniques described in Patent Documents 1 and 2 that are indirectly evaluated.

本発明において「診断」とは、被検体がアルツハイマー病に羅患しているか否かの判定、アルツハイマー病の重症度の判定、治療の効果の判定、および治療後にアルツハイマー病を再発する危険性が存在するか否かの判定を包含する概念である。 In the present invention, “diagnosis” refers to the determination of whether a subject suffers from Alzheimer's disease, the determination of the severity of Alzheimer's disease, the determination of the effect of treatment, and the risk of recurrence of Alzheimer's disease after treatment. It is a concept that includes the determination of whether or not it exists.

被検体がアルツハイマー病に羅患しているか否かの判定の際には、健常検体の試料中におけるesRAGEの量を基準とすることができる。治療の効果の判定の際には、治療前の被検体から採取された試料中のesRAGEの量を基準値とすることもできるであろう。本発明では、対比対象となるこれらの検体を「対照検体」と称する。 When determining whether or not a subject suffers from Alzheimer's disease, the amount of esRAGE in a sample of a healthy sample can be used as a reference. When determining the effect of treatment, the amount of esRAGE in a sample collected from a subject before treatment may be used as a reference value. In the present invention, these samples to be compared are referred to as “control samples”.

本発明の方法では、典型的には、被検体からの試料中のesRAGEの量と、対照検体からの試料中のesRAGEの量とを対比し、前者が後者より少ないときに、被検体がアルツハイマー病に罹患している、あるいは対照検体と比較してより重度のアルツハイマー病患者であると判断する。例えば、esRAGEの量の評価を、抗esRAGE抗体を用いてesRAGEを染色する免疫染色法により行う場合には、本発明の方法は、被検体から単離された神経細胞を含有する試料中のesRAGEを染色する工程と、対照検体から単離された神経細胞を含有する試料中のesRAGEを染色する工程と、被検体から単離された前記試料中の神経細胞（特にその細胞質）の染色強度と、対照検体から単離された前記試料中の神経細胞（特にその細胞質）の染色強度とを対比する工程と、被検体から単離された前記試料中の神経細胞の染色強度が、対照検体から単離された前記試料中の神経細胞の染色強度と対比して弱いときに、被検体がアルツハイマー病に罹患している、あるいは対照検体と比較してより重度のアルツハイマー病患者であると判断する工程とを含む。 In the method of the present invention, the amount of esRAGE in the sample from the subject is typically compared with the amount of esRAGE in the sample from the control sample, and when the former is less than the latter, the subject is Alzheimer's. Judged as having Alzheimer's disease or having more severe disease compared to a control sample. For example, when the amount of esRAGE is evaluated by an immunostaining method in which esRAGE is stained using an anti-esRAGE antibody, the method of the present invention can be used for esRAGE in a sample containing nerve cells isolated from a subject. A step of staining esRAGE in a sample containing nerve cells isolated from a control specimen, and a staining intensity of nerve cells (particularly the cytoplasm) in the sample isolated from a subject, The step of comparing the staining intensity of nerve cells (particularly the cytoplasm) in the sample isolated from the control specimen with the staining intensity of nerve cells in the sample isolated from the specimen. When the intensity of staining of the nerve cells in the isolated sample is weak compared to that of the neuron, it is determined that the subject is suffering from Alzheimer's disease or is a more severe Alzheimer's disease patient compared to the control sample. Process.

本発明の方法の他の実施形態では、神経細胞とグリア細胞とを含有する試料を使用し、神経細胞におけるesRAGEの量と、グリア細胞におけるesRAGEの量とを対比して、神経細胞におけるesRAGEの量が、グリア細胞におけるesRAGEの量と対比して少ないときに、被検体がアルツハイマー病に罹患していると判断する。例えば、esRAGEの量の評価を、抗esRAGE抗体を用いてesRAGEを染色する免疫染色法により行う場合には、本発明の方法は、免疫染色法により試料中のesRAGEを染色する工程と、試料中の神経細胞の染色強度と、グリア細胞の染色強度とを対比する工程と、神経細胞の染色強度が、グリア細胞の染色強度と対比して弱いときに、被検体がアルツハイマー病に罹患していると判断する工程とを含む。 In another embodiment of the method of the present invention, a sample containing nerve cells and glial cells is used, and the amount of esRAGE in nerve cells is compared with the amount of esRAGE in glial cells to compare the amount of esRAGE in nerve cells. When the amount is small compared to the amount of esRAGE in glial cells, the subject is judged to have Alzheimer's disease. For example, when the amount of esRAGE is evaluated by an immunostaining method that stains esRAGE using an anti-esRAGE antibody, the method of the present invention includes a step of staining esRAGE in a sample by an immunostaining method, The subject is suffering from Alzheimer's disease when the staining intensity of the nerve cells and the staining intensity of the glial cells are weak and the staining intensity of the nerve cells is weak compared with the staining intensity of the glial cells. And a step of judging.

本発明の方法は既存のアルツハイマー病の診断方法と組み合わせて使用することが好ましい。既存のアルツハイマー病の診断指標としては、図6に示すように、海馬の容量の減少、正常では平行に規則正しく配列する海馬錐体細胞の配列、方向性の乱れ、老人斑の出現・増加、神経原線維変化の出現・増加などが挙げられる。これらの既存の指標に加えて、図7に示すように、アルツハイマー病脳では既に海馬錐体細胞数自体の減少に加え、現存する海馬錐体細胞でのesRAGEの染色性は対照検体に比べアルツハイマー病では著しく低下している点が指摘できる。このesRAGEの染色性の減少を新たな指標として用いることにより、より正確な診断が可能となる。 The method of the present invention is preferably used in combination with an existing method for diagnosing Alzheimer's disease. As shown in Fig. 6, the existing diagnostic indices of Alzheimer's disease include a decrease in hippocampal capacity, normal and regularly arranged hippocampal pyramidal cells, disordered orientation, appearance and increase of senile plaques, and nerves. Appearance / increase of fibrillar change can be mentioned. In addition to these existing indicators, as shown in Fig. 7, in the Alzheimer's disease brain, in addition to the decrease in the number of hippocampal pyramidal cells themselves, the staining ability of esRAGE in existing hippocampal pyramidal cells was higher than that in control samples. It can be pointed out that the disease is markedly reduced. By using this decrease in esRAGE staining as a new indicator, more accurate diagnosis is possible.

7. 診断薬又は診断用キット
本発明はまた、esRAGEに特異的に結合し得る抗体を含む、アルツハイマー病の診断薬に関する。 7. Diagnostic Agent or Diagnostic Kit The present invention also relates to a diagnostic agent for Alzheimer's disease comprising an antibody that can specifically bind to esRAGE.

本発明の診断薬は、必要な試薬とともにキット化することもできる。例えば免疫染色用のキットには抗esRAGE抗体に加えて、発色試薬等の種々の試薬が含まれ得る。
キットには更に、緩衝液、洗浄液、使用説明書等が含まれていてもよい。 The diagnostic agent of the present invention can be made into a kit together with necessary reagents. For example, a kit for immunostaining can contain various reagents such as a coloring reagent in addition to the anti-esRAGE antibody.
The kit may further contain a buffer solution, a washing solution, instructions for use, and the like.

これらの診断薬又は診断用キット中の抗体は、本明細書に開示する、神経細胞を含有する試料中のesRAGE量を指標としたアルツハイマー病の診断方法において、前記試料中のesRAGE量を評価するために使用される。診断薬又は診断用キットの他の構成成分は、本明細書で開示した方法を用いて前記試料中のesRAGE量を評価するためのものであることが好ましい。 The antibodies in these diagnostic agents or diagnostic kits evaluate the amount of esRAGE in the sample disclosed in the present specification in the Alzheimer's disease diagnosis method using the amount of esRAGE in the sample containing nerve cells as an index Used for. The other component of the diagnostic agent or diagnostic kit is preferably for evaluating the amount of esRAGE in the sample using the method disclosed herein.

参考例：海馬の容量の比較
剖検例を使用し、健常コントロールとアルツハイマー病患者の脳の海馬を比較した写真を図１に示す。黒で囲った部分は特に記憶に関係する部分である。
図１に示されるように、アルツハイマー病患者では側頭葉下部に位置する海馬領域の高度の萎縮が認められる。 Reference Example: Comparison of Hippocampal Capacity FIG. 1 shows a photograph comparing the hippocampus of a healthy control and an Alzheimer's disease brain using an autopsy example. The part enclosed in black is particularly related to memory.
As shown in FIG. 1, in patients with Alzheimer's disease, severe atrophy of the hippocampal region located in the lower temporal lobe is observed.

実施例１：esRAGE特異抗体による染色１
アルツハイマー病患者と健常コントロールの脳の海馬を、esRAGE特異抗体を用いて染色し、比較した。 Example 1: Staining with esRAGE-specific antibody 1
The hippocampus of Alzheimer's disease patients and healthy control brains were stained with esRAGE-specific antibodies and compared.

アルツハイマー病患者の脳サンプルは死亡時78歳の女性からのものである。66歳ころから記憶障害が発生し76歳時より医療法人さわらび会福祉村病院に入院中であった。洞不全症候群もあり、77歳から徐脈傾向。78歳ころから肺炎の軽快・増悪を繰り返し呼吸不全にて死亡した。神経病理学的には典型的なアルツハイマー病であった。一方、健常コントロールの脳サンプルは死亡時91歳の女性からのものである。87歳より数回の脳梗塞を併発している。X年7月に右後頭葉に脳梗塞を認め医療法人さわらび会福祉村病院に入院した。8月に胃ろうを増設し経管栄養管理となった。X+1年2月に大量に嘔吐し、誤嚥性の呼吸不全、右肺大葉性肺炎に陥り死亡した。神経病理学的には脳梗塞を右後大脳動脈領域にみとめ、他にも多発性の脳梗塞を認めたが、アルツハイマー病変化は皆無であった。 Brain samples from patients with Alzheimer's disease are from a 78-year-old woman at death. Memory disorder occurred around the age of 66, and he was hospitalized at the Sawarabikai Welfare Village Hospital since 76. There is also sinus syndrome, and bradycardia has been observed since 77 years old. He died of respiratory failure after remission and exacerbation of pneumonia since about 78 years old. Neuropathologically, it was typical Alzheimer's disease. On the other hand, healthy control brain samples are from a 91-year-old woman at the time of death. He has had several strokes since the age of 87. In July X, a cerebral infarction was found in the right occipital lobe and he was admitted to the medical corporation Sawarabikai Welfare Village Hospital. In August, gastrostomy was added and tube feeding was managed. In February X + 1, she vomited massively and died of aspiration respiratory failure and right lobe pneumonia. Neuropathologically, cerebral infarction was observed in the right posterior cerebral artery region, and other multiple cerebral infarctions were observed, but there was no change in Alzheimer's disease.

使用したesRAGE特異抗体は、ヒトesRAGEのC末端の16アミノ酸部分に対するウサギポリクローナル抗体である。具体的には、抗原となるペプチドとして、配列表の配列番号1のC末端の16個のアミノ酸の配列 (第332番〜第347番) からなるポリペプチドを化学合成し、その際にキャリア蛋白との結合に使用するためにＣ末にCysを加えておいた。キャリア蛋白としてはKLH (Keyhole Limpet Hemocyanin)を使用し、KLH-Peptideで、それらをFreund's Complete Adjuvantと混合、エマルジョンを作製し、ウサギに免疫を開始した。２回目以降の免疫はFreund's Incomplete Adjuvantを用いた。抗体価の上昇を確認し抗血清を得、その後免疫に使用した合成ぺプチドでカラムクロマトグラフィーを行うことでアフィニティー精製した。これを抗esRAGE抗体として使用した。 The esRAGE-specific antibody used was a rabbit polyclonal antibody against the C-terminal 16 amino acid portion of human esRAGE. Specifically, as a peptide serving as an antigen, a polypeptide consisting of a sequence of 16 amino acids at the C-terminus of SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing (No. 332 to No. 347) is chemically synthesized, and the carrier protein Cys was added to the C-terminal for use in conjugation. KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) was used as a carrier protein, and KLH-peptide was mixed with Freund's Complete Adjuvant to prepare an emulsion to start immunization of rabbits. Freund's Incomplete Adjuvant was used for the second and subsequent immunizations. Antiserum was obtained by confirming the increase in antibody titer, and then affinity purified by column chromatography with the synthetic peptide used for immunization. This was used as an anti-esRAGE antibody.

こうして得られた抗esRAGE抗体を用いて免疫染色を行った。免疫染色は、一般的なプロトコールにしたがってEnvision法による酵素抗体法を施行した。 Immunostaining was performed using the anti-esRAGE antibody thus obtained. For immunostaining, the enzyme antibody method by Envision method was performed according to a general protocol.

結果を図２に示す。図２において、上段は健常コントロールの脳の海馬の染色結果（低倍率x40倍，高倍率x400倍）を示し、下段はアルツハイマー病患者の脳の海馬の染色結果（低倍率x40倍，高倍率x400倍）を示す。上下各段の右図は左図の枠内の拡大図である。アルツハイマー病の脳においては、コントロールに比べて神経細胞（錐体ニューロン）の数の減少が認められた。また、残存している神経細胞のesRAGEの染色性が欠落していることが認められた。図2中の矢印は海馬錐体細胞（神経細胞）を示している。アルツハイマー病患者では神経細胞は存在するがesRAGEの染色性はないことが分かる。一方、コントロールの脳では神経細胞の細胞質が濃く染色されたことから、esRAGEが細胞質に多く含まれることが確認された。 The results are shown in FIG. In Fig. 2, the upper row shows the hippocampal staining results of healthy control brain (low magnification x40 times, high magnification x400 times), and the lower row shows the hippocampal staining results of Alzheimer's disease patients (low magnification x40 times, high magnification x400). Times). The right figure in each of the upper and lower stages is an enlarged view in the frame of the left figure. In the brain of Alzheimer's disease, a decrease in the number of neurons (cone neurons) was observed compared to the control. In addition, it was confirmed that the remaining nerve cells lacked the staining ability of esRAGE. The arrows in FIG. 2 indicate hippocampal pyramidal cells (neural cells). It can be seen that Alzheimer's disease patients have neurons but no esRAGE staining. On the other hand, in the control brain, the cytoplasm of nerve cells was deeply stained, confirming that esRAGE is contained in a large amount in the cytoplasm.

図２下段の写真を更に拡大した写真（高倍率x1200倍）を図３に示す。図3中の矢印は海馬錐体細胞（神経細胞）を示している。図３から、アルツハイマー病患者の脳の海馬におけるesRAGE特異抗体による染色性の低下は矢印で示す神経細胞のみに特異的に生じる現象であり、その他のグリア細胞の染色性は保たれていることが確認された。 FIG. 3 shows a further enlarged photograph (high magnification × 1200 times) of the photograph in the lower part of FIG. The arrows in FIG. 3 indicate hippocampal pyramidal cells (neuronal cells). From FIG. 3, it can be seen that the decrease in staining by the esRAGE-specific antibody in the hippocampus of the brain of Alzheimer's disease patients is a phenomenon that occurs specifically only in the nerve cells indicated by the arrows, and that the staining of other glial cells is maintained. confirmed.

実施例2: esRAGE特異抗体による染色２
実施例１とは異なるアルツハイマー病患者と健常コントロールの脳の海馬について、実施例１と同様の手順によりesRAGE特異抗体で染色し、比較した。
結果を図４に示す。図４において、上段は健常コントロールの脳の海馬の染色結果（低倍率x40倍，高倍率x400倍）を示し、下段はアルツハイマー病患者の脳の海馬の染色結果（低倍率x40倍，高倍率x400倍）を示す。上下各段の右図は左図の枠内の拡大図である。図4中の矢印は海馬錐体細胞（神経細胞）を示している。
本実験においても実施例１と同様の傾向が認められた。 Example 2: Staining with esRAGE-specific antibody 2
The hippocampus of Alzheimer's disease patients and healthy control brains different from those in Example 1 were stained with esRAGE-specific antibodies and compared in the same manner as in Example 1.
The results are shown in FIG. In FIG. 4, the upper row shows the hippocampal staining results of the healthy control brain (low magnification x40 times, high magnification x400 times), and the lower row shows the staining results of the brain hippocampus of Alzheimer's disease patients (low magnification x40 times, high magnification x400). Times). The right figure in each of the upper and lower stages is an enlarged view in the frame of the left figure. The arrows in FIG. 4 indicate hippocampal pyramidal cells (neuronal cells).
In this experiment, the same tendency as in Example 1 was observed.

実施例3: 特異性の異なる3種類の抗体による染色
アルツハイマー型老年痴呆患者の脳に対して、特異性の異なる3種類の抗体を用いて染色を行った。比較のために、脳梗塞患者又は健常コントロールの脳に対しても同様の染色を行った。 Example 3: Staining with three types of antibodies with different specificities The brains of Alzheimer type senile dementia patients were stained with three types of antibodies with different specificities. For comparison, the same staining was performed on cerebral infarction patients or healthy control brains.

本実験で使用した3種類の抗体とは、抗膜型RAGE抗体、抗全RAGE抗体、及び抗esRAGE抗体である。膜型RAGE（完全長RAGE）は、C末端からN末端の方向に順に、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、Cドメイン、Cドメイン、Vドメインを有する。一方esRAGEは、細胞内ドメイン及び膜貫通ドメインが欠損しており、C末端からN末端の方向に順に、Cドメイン、Cドメイン、Vドメインを有する。従って、細胞内ドメインに特異的に結合する抗体は膜型RAGE特異的抗体（抗膜型RAGE抗体）となり、Vドメインに特異的に結合する抗体は膜型RAGE及びesRAGEの両者に結合する抗体（抗全RAGE抗体）となり、esRAGEのC末端領域に特異的に結合する抗体はesRAGE特異的抗体（抗esRAGE抗体）となる。 The three types of antibodies used in this experiment are an anti-membrane RAGE antibody, an anti-total RAGE antibody, and an anti-esRAGE antibody. Membrane-type RAGE (full-length RAGE) has an intracellular domain, a transmembrane domain, a C domain, a C domain, and a V domain in order from the C terminal to the N terminal. On the other hand, esRAGE lacks an intracellular domain and a transmembrane domain, and has a C domain, a C domain, and a V domain in order from the C terminal to the N terminal. Therefore, an antibody that specifically binds to the intracellular domain is a membrane-type RAGE-specific antibody (anti-membrane-type RAGE antibody), and an antibody that specifically binds to the V-domain is an antibody that binds to both membrane-type RAGE and esRAGE ( An antibody that specifically binds to the C-terminal region of esRAGE is an esRAGE-specific antibody (anti-esRAGE antibody).

抗膜型RAGE抗体は、ヒト膜型RAGEのC末端の20アミノ酸部分に対するヤギポリクローナル抗体（RAGE(C-20)goat polyclonal antibody、Santa Cruz Biotechnology社）である。 The anti-membrane type RAGE antibody is a goat polyclonal antibody (RAGE (C-20) goat polyclonal antibody, Santa Cruz Biotechnology) against the 20 amino acid portion at the C-terminus of human membrane type RAGE.

抗全RAGE抗体は、ヒトRAGEのVドメインに対するヤギポリクローナル抗体である（RAGE goat polyclonal antibody、Chemicon International社）。
抗esRAGE抗体は実施例1で使用したものと同一である。 The anti-total RAGE antibody is a goat polyclonal antibody against the V domain of human RAGE (RAGE goat polyclonal antibody, Chemicon International).
The anti-esRAGE antibody is the same as that used in Example 1.

免疫染色は、一次抗体として上記の3種類の抗体のいずれかを使用した点と、一次抗体として抗膜型RAGE抗体、抗全RAGE抗体を使用した場合には実施例1における「ウサギポリクローナル抗体に対するペルオキシダーゼ標識ポリマー (EnVision, DAKO,アメリカ合衆国カリフォルニア州カーピンテリア)」に代えて「ヤギポリクローナル抗体に対するペルオキシダーゼ標識ポリマー (Histofine, Simple Stain, NICHIREI, 東京)」を使用した点を除いて、実施例1と同様の手順で行った。 For immunostaining, one of the above-mentioned three kinds of antibodies was used as the primary antibody, and when anti-membrane RAGE antibody or anti-total RAGE antibody was used as the primary antibody, the “anti-rabbit polyclonal antibody against” in Example 1 was used. Except for using `` peroxidase labeled polymer for goat polyclonal antibody (Histofine, Simple Stain, NICHIREI, Tokyo) '' instead of `` peroxidase labeled polymer (EnVision, DAKO, Carpinteria, CA, USA) '' and Example 1 The same procedure was performed.

結果を図5に示す。図5において、左列は抗膜型RAGE抗体による染色結果を示し、中列は抗全RAGE抗体による染色結果を示し、右列は抗esRAGE抗体による染色結果を示す。各写真が、どの検体の脳に由来する写真であるかは、各写真中の説明を参照されたい。第1段及び第3段は低倍率（x40倍）での写真であり、第2段及び第4段は高倍率（x400倍）での写真である。 The results are shown in FIG. In FIG. 5, the left column shows the staining result with the anti-membrane RAGE antibody, the middle column shows the staining result with the anti-total RAGE antibody, and the right column shows the staining result with the anti-esRAGE antibody. Please refer to the explanation in each photograph for each specimen's brain. The first and third stages are photographs at a low magnification (x40 times), and the second and fourth stages are photographs at a high magnification (x400 times).

図5から、アルツハイマー型老年痴呆患者の脳においては、神経細胞に膜型RAGEは存在するものの、esRAGEの量は少なくなっていることが認められた。一方、脳梗塞患者又は健常コントロールの脳の神経細胞には膜型RAGE、esRAGEともに存在していることが認められた。 From FIG. 5, it was confirmed that in the brain of Alzheimer type senile dementia patients, the amount of esRAGE was decreased although the membrane type RAGE was present in the nerve cells. On the other hand, it was confirmed that both membrane-type RAGE and esRAGE were present in cerebral infarction patients or in healthy control brain neurons.

健常コントロールとアルツハイマー病患者の脳の海馬を比較した写真である。It is the photograph which compared the hippocampus of the brain of healthy control and Alzheimer's disease patient. esRAGE特異抗体を用いて染色された、アルツハイマー病患者と健常コントロールの脳の海馬の写真である。It is a photograph of the hippocampus of Alzheimer's disease patients and healthy control brains stained with an esRAGE specific antibody. esRAGE特異抗体を用いて染色された、アルツハイマー病患者の脳の海馬の写真である。It is the photograph of the hippocampus of the brain of an Alzheimer's disease patient dye | stained using the esRAGE specific antibody. esRAGE特異抗体を用いて染色された、アルツハイマー病患者と健常コントロールの脳の海馬の写真である。It is a photograph of the hippocampus of Alzheimer's disease patients and healthy control brains stained with an esRAGE specific antibody. ３種類の抗体を用いて染色された、アルツハイマー型老年痴呆患者、脳梗塞患者、健常コントロールの脳試料の写真である。It is the photograph of the brain sample of Alzheimer type senile dementia patient, cerebral infarction patient, and a healthy control dye | stained using three types of antibodies. アルツハイマー病に対する既存の診断指標を示す図である。It is a figure which shows the existing diagnostic parameter | index with respect to Alzheimer's disease. 本発明により提供される、アルツハイマー病に対する診断指標を示す図である。It is a figure which shows the diagnostic parameter | index with respect to Alzheimer's disease provided by this invention.

Claims

被検体から単離された神経細胞を含有する試料中の、内在性分泌型後期糖化反応生成物受容体 (esRAGE) の量を指標としてアルツハイマー病を診断することを特徴とする、アルツハイマー病の診断方法。 Diagnosis of Alzheimer's disease characterized by diagnosing Alzheimer's disease using the amount of endogenous secretory late glycation reaction product receptor (esRAGE) in a sample containing neurons isolated from a subject as an indicator Method.

前記試料が海馬に由来する試料である、請求項1記載の方法。 2. The method according to claim 1, wherein the sample is a sample derived from the hippocampus.

指標として用いられるesRAGEの量が、神経細胞の細胞質におけるesRAGEの量である、請求項1又は2記載の方法。 3. The method according to claim 1, wherein the amount of esRAGE used as an indicator is the amount of esRAGE in the cytoplasm of nerve cells.

被検体から単離された前記試料中のesRAGEの量と、対照検体から単離された神経細胞を含有する試料中のesRAGEの量とを対比する工程と、
被検体から単離された前記試料中のesRAGEの量が、対照検体から単離された神経細胞を含有する試料中のesRAGEの量と対比して少ないときに、被検体がアルツハイマー病に罹患している、あるいは対照検体と比較してより重度のアルツハイマー病患者であると判断する工程とを含む、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。 Comparing the amount of esRAGE in the sample isolated from a subject with the amount of esRAGE in a sample containing neurons isolated from a control sample;
A subject suffers from Alzheimer's disease when the amount of esRAGE in the sample isolated from the subject is small compared to the amount of esRAGE in the sample containing neurons isolated from the control sample. Or determining that the patient is a more severe Alzheimer's disease patient compared to a control sample.

被検体から単離された前記試料が神経細胞とグリア細胞とを含有するものであり、
前記試料中の神経細胞におけるesRAGEの量と、グリア細胞におけるesRAGEの量とを対比する工程と、
神経細胞におけるesRAGEの量が、グリア細胞におけるesRAGEの量と対比して少ないときに、被検体がアルツハイマー病に罹患していると判断する工程とを含む、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。 The sample isolated from the subject contains nerve cells and glial cells,
Comparing the amount of esRAGE in nerve cells in the sample with the amount of esRAGE in glial cells;
Determining that the subject is suffering from Alzheimer's disease when the amount of esRAGE in the nerve cell is small compared to the amount of esRAGE in the glial cell. The method described.

esRAGEの量の評価が、esRAGEに特異的に結合し得る抗体を用いて行われる、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the amount of esRAGE is evaluated using an antibody capable of specifically binding to esRAGE.

esRAGEに特異的に結合し得る抗体を用いた免疫染色法により、被検体から単離された前記試料中のesRAGEを染色する工程と、
esRAGEに特異的に結合し得る抗体を用いた免疫染色法により、対照検体から単離された神経細胞を含有する試料中のesRAGEを染色する工程と、
被検体から単離された前記試料中の神経細胞の染色強度と、対照検体から単離された前記試料中の神経細胞の染色強度とを対比する工程と、
被検体から単離された前記試料中の神経細胞の染色強度が、対照検体から単離された前記試料中の神経細胞の染色強度と対比して弱いときに、被検体がアルツハイマー病に罹患している、あるいは対照検体と比較してより重度のアルツハイマー病患者であると判断する工程とを含む、請求項6記載の方法。 a step of staining esRAGE in the sample isolated from the specimen by an immunostaining method using an antibody that can specifically bind to esRAGE;
a step of staining esRAGE in a sample containing nerve cells isolated from a control specimen by an immunostaining method using an antibody capable of specifically binding to esRAGE;
Comparing the staining intensity of neurons in the sample isolated from a subject with the staining intensity of neurons in the sample isolated from a control specimen;
The subject suffers from Alzheimer's disease when the staining intensity of neurons in the sample isolated from the subject is weak compared to the staining intensity of neurons in the sample isolated from the control sample. Or determining that the patient is a more severe Alzheimer's disease patient compared to a control sample.

被検体から単離された前記試料が神経細胞とグリア細胞とを含有するものであり、
esRAGEに特異的に結合し得る抗体を用いた免疫染色法により、前記試料中のesRAGEを染色する工程と、
前記試料中の神経細胞の染色強度と、グリア細胞の染色強度とを対比する工程と、
神経細胞の染色強度が、グリア細胞の染色強度と対比して弱いときに、被検体がアルツハイマー病に罹患していると判断する工程とを含む、請求項6記載の方法。 The sample isolated from the subject contains nerve cells and glial cells,
a step of staining esRAGE in the sample by an immunostaining method using an antibody capable of specifically binding to esRAGE;
Comparing the staining intensity of nerve cells in the sample with the staining intensity of glial cells;
7. The method according to claim 6, further comprising the step of determining that the subject is suffering from Alzheimer's disease when the staining intensity of nerve cells is weak as compared with the staining intensity of glial cells.

前記抗体が、配列表の配列番号1のC末端の16個のアミノ酸の配列からなるポリペプチドを抗原として用いて誘導された抗体である、請求項6〜8のいずれか1項記載の方法。 The method according to any one of claims 6 to 8, wherein the antibody is an antibody derived from a polypeptide comprising a sequence of 16 amino acids at the C-terminus of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing as an antigen.

esRAGEに特異的に結合し得る抗体を含有し、該抗体が請求項6〜8のいずれか1項記載の方法に使用されるものであることを特徴とする、アルツハイマー病の診断薬。 A diagnostic agent for Alzheimer's disease comprising an antibody that can specifically bind to esRAGE, wherein the antibody is used in the method according to any one of claims 6 to 8.

前記抗体が、配列表の配列番号1のC末端の16個のアミノ酸の配列からなるポリペプチドを抗原として用いて誘導された抗体である、請求項10記載の診断薬。 11. The diagnostic agent according to claim 10, wherein the antibody is an antibody derived using a polypeptide comprising a sequence of 16 amino acids at the C-terminus of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing as an antigen.

esRAGEに特異的に結合し得る抗体を含有し、該抗体が請求項6〜8のいずれか1項記載の方法に使用されるものであることを特徴とする、アルツハイマー病の診断用キット。 A diagnostic kit for Alzheimer's disease, comprising an antibody capable of specifically binding to esRAGE, wherein the antibody is used in the method according to any one of claims 6 to 8.

前記抗体が、配列表の配列番号1のC末端の16個のアミノ酸の配列からなるポリペプチドを抗原として用いて誘導された抗体である、請求項12記載の診断用キット。 13. The diagnostic kit according to claim 12, wherein the antibody is an antibody derived using a polypeptide consisting of a sequence of 16 amino acids at the C-terminus of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing as an antigen.