JP6908810B2 - 4 Specific binding reagent for detecting qualitative differences in repeat tau, test methods using this, test kits, and drug screening methods. - Google Patents
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Description
タウオパチーと総称されるリン酸化タウの蓄積が見られる神経変性疾患を鑑別する検査方法に関する。特に、４リピートタウが蓄積するアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ、以下ＡＤと記載することもある。）と、進行性核上性麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｓｕｐｒａｎｕｃｌｅａｒ ｐａｌｓｙ、以下ＰＳＰと記載することもある。）／大脳皮質基底核変性症（ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、以下ＣＢＤと記載することもある。）を区別することのできる４リピートタウに対する特異的結合試薬、及びこれを用いた検査方法に関する。また、この特異的結合試薬を用いた医薬のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a test method for differentiating neurodegenerative diseases in which accumulation of phosphorylated tau, which is collectively called tauopathy, is observed. In particular, Alzheimer's disease (Alzheimer's disease, hereinafter also referred to as AD) in which 4 repeat tau accumulates, and progressive supranuclear palsy (hereinafter, also referred to as PSP) / cerebral cortex. It relates to a specific binding reagent for 4 repeat tau capable of distinguishing corticobasal degeneration (hereinafter, also referred to as CBD), and a test method using the same. The present invention also relates to a method for screening a drug using this specific binding reagent.
高齢者人口の増加とともに認知症患者も増加し、平成２４年の認知症患者数は４６２万人に達していると言われている（内閣府 平成２８年版高齢社会白書（概要版））。今後高齢者の増加とともに、認知症患者はますます増加すると考えられており、大きな社会的問題となっている。 It is said that the number of dementia patients has increased along with the increase in the elderly population, and the number of dementia patients in 2012 has reached 4.62 million (Cabinet Office 2016 White Paper on Aging Society (Summary Version)). It is expected that the number of patients with dementia will increase as the number of elderly people increases in the future, which has become a major social problem.
しかしながら、認知症と言っても、同じような症状を呈する原因疾患は多様であることが明らかとなってきた。例えば、大脳皮質基底核変性症候群（Ｃｏｒｔｉｃｏｂａｓａｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＣＢＳ）の臨床像を呈する疾患には、ＣＢＤ、ＡＤ、ＰＳＰの他に、ピック病（Ｐｉｃｋ’ｓ ｄｅｓｅａｓｅ、以下ＰｉＤと記載することもある。）をはじめとする様々な疾患が含まれていることが明らかとなっている（非特許文献１）。 However, even with dementia, it has become clear that there are various causative diseases that exhibit similar symptoms. For example, in addition to CBD, AD, and PSP, Pick's disease (hereinafter, PiD) may be described as a disease showing a clinical picture of Corticobasal syndrome (CBS). It has been clarified that various diseases including the above are included (Non-Patent Document 1).
近年、画像診断の進歩に伴い、認知症の診断にもＣＴやＭＲＩなどの画像診断が欠かせないものとなってきている。しかし、画像診断は局在性変化の確認と経時的な変化の追跡を可能とするものの、質的な変化をとらえるには十分でなく、客観的な診断基準に反映させるにも限界がある。 In recent years, with the progress of diagnostic imaging, diagnostic imaging such as CT and MRI has become indispensable for the diagnosis of dementia. However, although diagnostic imaging makes it possible to confirm localized changes and track changes over time, it is not sufficient to capture qualitative changes and there is a limit to how they can be reflected in objective diagnostic criteria.
そのため認知症はＭＲＩなどを用いた画像診断による検査所見や臨床所見だけでは正確に生前診断を行うことが未だに困難であると言われており、患者の死後に病理診断を行い、はじめて確定診断を行うことができるのが現状である。したがって、生前の臨床診断が正確でないことから、適切な治療を受けられていない患者も多いと考えられている。そのため、髄液、血液などの体液中のバイオマーカーを用いた診断精度、特異度の高い検査方法の確立が望まれている。 Therefore, it is said that it is still difficult to make an accurate prenatal diagnosis of dementia based only on laboratory findings and clinical findings by diagnostic imaging using MRI, etc., and pathological diagnosis is made after the patient's death, and a definitive diagnosis is made for the first time. The current situation is that it can be done. Therefore, it is considered that many patients are not receiving appropriate treatment because the clinical diagnosis before life is not accurate. Therefore, it is desired to establish a diagnostic accuracy and a highly specific test method using biomarkers in body fluids such as cerebrospinal fluid and blood.
さらに、神経変性疾患を正確に診断することのできるマーカーは、患者の確定診断により、治療法の選択に寄与するだけではなく、新薬開発にも大きく寄与することができる。例えば、現状では「アルツハイマー病である確率が高い患者群」を対象に、新薬の臨床試験を行っているにすぎない。その結果、臨床試験の対象としている群には、他の神経変性疾患の患者も含まれている可能性が高い。したがって、アルツハイマー病といった特定の神経変性疾患に対する薬剤の効果を的確に判断することができない。臨床症状による医師の判断だけではなく、客観的な検査結果により診断精度を高めることができれば、適切な患者群に対して臨床試験を行うことが可能となり、候補薬の効果について正しい評価をくだすことができる。 Furthermore, a marker capable of accurately diagnosing a neurodegenerative disease can not only contribute to the selection of a treatment method but also to the development of a new drug by a definitive diagnosis of a patient. For example, at present, we are only conducting clinical trials of new drugs targeting "a group of patients with a high probability of having Alzheimer's disease." As a result, the group under clinical trials is likely to include patients with other neurodegenerative diseases. Therefore, it is not possible to accurately determine the effect of a drug on a specific neurodegenerative disease such as Alzheimer's disease. If the diagnostic accuracy can be improved not only by the doctor's judgment based on clinical symptoms but also by objective test results, it will be possible to conduct clinical trials on an appropriate patient group and make a correct evaluation of the effect of the candidate drug. Can be done.
我が国の認知症の原因疾患は、脳血管性が最も多いとされてきたが、近年の疫学的研究によればアルツハイマー病が最多とも言われている。したがって、アルツハイマー病を他の神経変性疾患と臨床的に区別することは今後の治療薬の開発にとっても非常に重要なこととなる。 It has been said that the most common causative disease of dementia in Japan is cerebrovascular disease, but according to recent epidemiological studies, Alzheimer's disease is also said to be the most common. Therefore, clinically distinguishing Alzheimer's disease from other neurodegenerative diseases will be very important for the development of future therapeutic agents.
アルツハイマー病の原因としては、病理学的な特徴とされる老人斑を構成するアミロイドβにその原因を求める考えと、神経原線維を構成するタウに注目する立場があるが、原因が明らかではないのが現状である。アルツハイマー病の診断には、体液中のアミロイドβやタウタンパク質を検出する方法や、タウのイメージングプローブにより検出する方法が提案されているが、未だ臨床診断を左右できるほどの精度には達していない（特許文献１、２）。
The causes of Alzheimer's disease include the idea of seeking the cause of amyloid β, which constitutes amyloid plaque, which is a pathological feature, and the position of paying attention to tau, which constitutes neurofibrils, but the cause is not clear. is the current situation. For the diagnosis of Alzheimer's disease, a method of detecting amyloid β and tau protein in body fluids and a method of detecting with a tau imaging probe have been proposed, but the accuracy has not yet reached the level that can influence the clinical diagnosis. (
タウは微小管の重合や安定化に寄与するタンパク質であり正常脳にも存在する。タウは、ＡＤ、ＰＳＰ、ＣＢＤ、ＰｉＤなどにおいて異常に蓄積し、神経原線維変化やその他の封入体として観察される。リン酸化タウが異常に蓄積するこれらの疾患を総称して「タウオパチー」と呼んでいる（非特許文献２）。 Tau is a protein that contributes to the polymerization and stabilization of microtubules and is also present in the normal brain. Tau accumulates abnormally in AD, PSP, CBD, PiD, etc. and is observed as neurofibrillary tangles and other inclusion bodies. These diseases in which phosphorylated tau accumulates abnormally are collectively called "tauopathy" (Non-Patent Document 2).
タウオパチーでは、正常脳のタウにも起こるリン酸化が亢進して蓄積することが知られており、脳脊髄液中のリン酸化タウの全タウタンパク質に対する比により前頭側頭型認知症（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｌｏｂａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ＦＴＬＤ）のサブタイプを分類することができると報告されている（非特許文献３）。ＡＬＳ（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）を伴うＦＴＬＤ−ＴＤＰなどのサブタイプとともに、タウとアミロイドβが蓄積するＡＤもリン酸化タウの量比が異なっている。確かに、統計的にはリン酸化タウの量は、健常者や各サブタイプ群間での差がみられるものの群間の重なりが大きく、個々の臨床例の診断を髄液中のリン酸化タウの量的違いをもとに鑑別するには至っていない。 In tauopathy, it is known that phosphorylation that also occurs in normal brain tau is enhanced and accumulated, and frontotemporal lobar dementia is caused by the ratio of phosphorylated tau to total tau protein in cerebrospinal fluid. : It has been reported that subtypes of FTLD) can be classified (Non-Patent Document 3). Along with subtypes such as FTLD-TDP with ALS (Amyloid lateral sclerosis), AD in which tau and amyloid β accumulate also differ in the amount ratio of phosphorylated tau. Indeed, statistically, the amount of phosphorylated tau varies between healthy subjects and each subtype group, but there is a large overlap between the groups, and individual clinical cases can be diagnosed with phosphorylated tau in the cerebrospinal fluid. It has not been possible to distinguish based on the quantitative difference of.
タウはエクソン２、３、１０の選択的スプライシングにより６つのアイソフォームが存在する（図１（Ａ）参照。）。このうちＣ末端側に存在する微小管結合領域の繰り返し構造の数が、３つのものを３リピートタウ、４つのものを４リピートタウと呼んでいる。タウアイソフォームは、発生段階で発現調節を受けていることが知られており、タウの６つのアイソフォーム全てが成人の脳では発現している。
Tau has six isoforms due to alternative splicing of
タウオパチーの変性神経疾患患者脳の封入体中の不溶化タウの解析から、タウオパチーは３リピートタウのみが蓄積するもの（ＰｉＤ）と、４リピートタウのみが蓄積するもの（ＰＳＰ/ＣＢＤ）と、両者が蓄積するもの（ＡＤ）と大別されることが明らかになってきた（非特許文献４）。もし、３リピートタウと４リピートタウの髄液中の量を区別して定量できれば、これらの疾患を質的に区別する手がかりになると期待される。しかし、髄液中の３リピートタウ、４リピートタウの量をイムノＰＣＲ法で測定しても、これらの疾患群間を区別するにいたってはいない（非特許文献５）。これらアイソフォームは正常脳でも発現しているためか、正常例、ＡＤ、その他の認知症の個々の例をタウアイソフォームの量で鑑別できる精度には程遠い。 From the analysis of insolubilized tau in the inclusion bodies of patients with degenerative neurological diseases of tauopathy, tauopathy accumulates only 3 repeat tau (PiD) and only 4 repeat tau (PSP / CBD). It has become clear that it is roughly classified into accumulating substances (AD) (Non-Patent Document 4). If the amounts of 3-repeat tau and 4-repeat tau in the cerebrospinal fluid can be distinguished and quantified, it is expected to be a clue to qualitatively distinguish these diseases. However, even if the amount of 3-repeat tau and 4-repeat tau in the cerebrospinal fluid is measured by the immunoPCR method, it has not been possible to distinguish between these disease groups (Non-Patent Document 5). Perhaps because these isoforms are also expressed in the normal brain, it is far from accurate enough to distinguish individual cases of normal cases, AD, and other dementias by the amount of tau isoforms.
上述のように、脳に病変が生じ、認知症などを生じる疾患の鑑別診断は、現在のところ有効なバイオマーカーが存在しないため、臨床症状と画像診断による確率的推論に頼っているのが現状である。アルツハイマー病をはじめとする神経変性疾患は、同一疾患内でも病変の分布に症例毎の違いがあり、個々の症例における臨床症状、画像所見の違いも大きいことから、画像診断、臨床症状のみによる評価、診断方法は、医師の判断によるばらつきが大きいものと考えられる。適切な治療を行うためには、客観性の高い方法による信頼性の高い診断が必要である。また、各疾患に有効な医薬の開発には、正確な診断がくだされた対象群に対して臨床試験を行い、解析、評価がなされる必要がある。そのためには、各疾患の正確な診断は必須の要件である。本発明は、信頼性の高い検査方法、検査に必要な抗体、検査キット、また、これを用いた医薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。 As mentioned above, the differential diagnosis of diseases that cause brain lesions and dementia, etc., currently relies on probabilistic inference based on clinical symptoms and diagnostic imaging because there are no effective biomarkers at present. Is. For neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, the distribution of lesions differs from case to case even within the same disease, and the clinical symptoms and imaging findings in each case also differ greatly. , It is considered that the diagnostic method varies greatly depending on the judgment of the doctor. Reliable diagnosis by an objective method is necessary for proper treatment. In addition, in order to develop a drug that is effective for each disease, it is necessary to conduct clinical trials, analyze and evaluate the target group for which an accurate diagnosis has been given. For that purpose, accurate diagnosis of each disease is an indispensable requirement. An object of the present invention is to provide a highly reliable test method, an antibody necessary for the test, a test kit, and a method for screening a drug using the same.
本発明は、アルツハイマー病を他の神経変性疾患と臨床的に区別する検査方法、これに用いる検査試薬、検査キット、さらに医薬のスクリーニング方法に関する。
（１）検体中のタウタンパク質の２７９位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換しているペプチドに特異的に結合する特異的結合試薬によりアルツハイマー病と、進行性核上性麻痺／大脳皮質基底核変性症を鑑別する検査方法。
（２）前記特異的結合試薬が抗体である（１）記載の検査方法。
（３）前記検体が、髄液、血液、脳神経組織、生検組織である（１）又は（２）に記載の検査方法。
（４）ＥＬＩＳＡ、又は免疫組織染色により検出することを特徴とする（２）又は（３）記載の検査方法。
（５）アルツハイマー病と、進行性核上性麻痺／大脳皮質基底核変性症を鑑別する特異的結合試薬であって、タウタンパク質の２７９位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換しているペプチドに対して特異的に結合することを特徴とする試薬。
（６）前記特異的結合試薬が抗体である（５）記載の特異的結合試薬。
（７）前記抗体がモノクローナル抗体である（６）記載の特異的結合試薬。
（８）前記抗体がポリクローナル抗体を精製して得られたものである（６）記載の特異的結合試薬。
（９）（５）〜（８）いずれか１つ記載の特異的結合試薬と検出に必要な試薬を備えていることを特徴とする検査キット。
（１０）前記検出がＥＬＩＳＡ又は免疫染色によるものであることを特徴とする（９）記載の検査キット。
（１１）タウタンパク質の２７９位の脱アミド化を指標としてスクリーニングすることを特徴とする医薬のスクリーニング方法。
The present invention relates to a test method for clinically distinguishing Alzheimer's disease from other neurodegenerative diseases, a test reagent used for the test, a test kit, and a method for screening a drug.
(1) Alzheimer's disease and progressive supranuclear palsy / corticobasal degeneration due to a specific binding reagent that specifically binds asparagine at position 279 of the tau protein in the sample to a peptide that is replaced with aspartic acid. Inspection method to distinguish.
(2) The test method according to (1), wherein the specific binding reagent is an antibody.
(3) The test method according to (1) or (2), wherein the sample is cerebrospinal fluid, blood, cranial nerve tissue, or biopsy tissue.
(4) The test method according to (2) or (3), which is detected by ELISA or immunohistochemical staining.
(5) For a peptide that is a specific binding reagent that distinguishes Alzheimer's disease from progressive supranuclear palsy / corticobasal degeneration and in which asparagine at position 279 of tau protein is replaced with aspartic acid. A reagent characterized by specifically binding.
(6) The specific binding reagent according to (5), wherein the specific binding reagent is an antibody.
(7) The specific binding reagent according to (6), wherein the antibody is a monoclonal antibody.
(8) The specific binding reagent according to (6), wherein the antibody is obtained by purifying a polyclonal antibody.
(9) A test kit comprising the specific binding reagent according to any one of (5) to (8) and a reagent necessary for detection.
(10) The test kit according to (9), wherein the detection is by ELISA or immunostaining.
(11) A method for screening a drug, which comprises screening using the deamidation of the 279th position of tau protein as an index.
上述のように、タウオパチーは封入体に蓄積するタウアイソフォームの違いにより大別することができる。３リピートタウは、Ｃ末端側の微小管結合領域ＩとＩＩＩに隣接する領域のペプチド（ＫＨＱＰＧＧＧＫＶＩＶＹＫＰＶ：配列番号１）を認識するＲＤ３抗体により検出することができ、４リピートタウは、微小管結合領域ＩＩを含むペプチド（ＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣ：配列番号２）を認識するＲＤ４抗体により検出することができる（図１（Ａ）参照。）。本発明者は、ＡＤとＰＳＰの病理標本において、４リピートタウを認識する抗体が脱アミド化により反応性が違うことを見出し、本発明を完成させた。 As described above, tauopathy can be roughly classified according to the difference in tauisoforms accumulated in inclusion bodies. 3 repeat tau can be detected by the RD3 antibody that recognizes the peptide (KHQPGGGKVIVYKPV: SEQ ID NO: 1) in the region adjacent to the microtubule binding regions I and III on the C-terminal side, and 4 repeat tau is the microtubule binding region. It can be detected by an RD4 antibody that recognizes a peptide containing II (VQIINKKLDSNVQSKKC: SEQ ID NO: 2) (see FIG. 1 (A)). The present inventor has completed the present invention by finding that antibodies that recognize 4-repeat tau have different reactivity due to deamidation in pathological specimens of AD and PSP.
４リピートタウは２７９位がアスパラギンとして翻訳される。その一部は脱アミド化されアスパラギン酸に変化することが報告されている（非特許文献６）。今まで２７９位のアスパラギンが脱アミド化したタウタンパク質は、ＡＤ、ＰＳＰ・ＣＢＤなどの疾患に関わりなく存在すると考えられていた。 4 Repeat tau is translated as asparagine at 279th place. It has been reported that a part of it is deamidated and converted to aspartic acid (Non-Patent Document 6). Until now, the tau protein in which asparagine at position 279 was deamidated was thought to exist regardless of diseases such as AD and PSP / CBD.
これは、市販の抗体を用いて病理標本を染色すると、２７９位がアスパラギンであるタウペプチド（配列番号２）に対して作製された抗体（ＲＤ４抗体）でも、２７９位をアスパラギン酸に置換したペプチドであるＶＱＩＩＤＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣ（配列番号３、下線部は２７９位のアミノ酸を示す。）に対して作製された抗体（４Ｒ抗体）でも、４リピートタウの蓄積が同じように検出されていたからである（図１（Ｂ）参照。）。 This is because when a pathological specimen is stained with a commercially available antibody, even an antibody (RD4 antibody) prepared against a tau peptide (SEQ ID NO: 2) in which position 279 is asparagine is a peptide in which position 279 is replaced with aspartic acid. This is because the accumulation of 4 repeat tau was detected in the same manner in the antibody (4R antibody) prepared against VQII D KKLDLSNBQSKC (SEQ ID NO: 3, the underlined part indicates the amino acid at position 279). 1 (B).).
本発明者は、配列番号３のペプチドに対して作製された市販ポリクローナル抗体(４Ｒ抗体)に、配列番号２で示されるペプチドを認識する抗体と、配列番号３で示されるペプチドを認識する抗体が混在していることを見出した。精製した抗体を用いて解析した結果、２７９位が脱アミド化したタウは、ＡＤのみに存在することが明らかとなった。すなわち、２７９位が脱アミド化したペプチドに対して特異的な抗体は、ＡＤに蓄積したタウのみを検出する。 The present inventor has a commercially available polyclonal antibody (4R antibody) prepared against the peptide of SEQ ID NO: 3, which includes an antibody that recognizes the peptide represented by SEQ ID NO: 2 and an antibody that recognizes the peptide represented by SEQ ID NO: 3. I found that they were mixed. As a result of analysis using the purified antibody, it was clarified that the tau deamidated at position 279 exists only in AD. That is, the antibody specific to the peptide deamidated at position 279 detects only tau accumulated in AD.
２７９位のアスパラギンが脱アミド化したタウが、タウオパチーとして総称される神経変性疾患のうちＡＤで特異的に検出されることは、本発明者がはじめて見出したことである。脱アミド化したタウはここでは抗体により検出しているが、２７９位のアスパラギンが脱アミド化しているタウを検出することができる試薬であれば抗体に限らずどのような試薬を用いてもよい。したがって、本明細書で特異的結合試薬という場合には、抗体に限らず、アプタマーなど特定の分子と特異的に結合する試薬を含むことができる。核酸アプタマー、ペプチドアプタマーは公知の方法によって作製し、２７９位がアスパラギン酸に置換されているタウと特異的に結合することができるものを選択すればよい。さらに、本発明の特異的結合試薬には、修飾された形態のものも含む。具体的には、放射性物質により標識しＰＥＴ診断薬として用いることができるものや、蛍光物質により標識し二次抗体等を使用することなく検出することができるものなどが挙げられる。 The present inventor has found for the first time that tau in which asparagine at position 279 is deamidated is specifically detected in AD among neurodegenerative diseases collectively called tauopathy. The deamidated tau is detected by an antibody here, but any reagent is not limited to the antibody as long as it can detect the tau in which asparagine at position 279 is deamidated. .. Therefore, the term specific binding reagent in the present specification may include not only an antibody but also a reagent that specifically binds to a specific molecule such as an aptamer. Nucleic acid aptamers and peptide aptamers may be prepared by a known method, and those capable of specifically binding to tau in which the 279th position is replaced with aspartic acid may be selected. Furthermore, the specific binding reagents of the present invention also include those in a modified form. Specific examples thereof include those that can be labeled with a radioactive substance and used as a PET diagnostic agent, those that can be labeled with a fluorescent substance and can be detected without using a secondary antibody or the like.
また、本発明で抗体という場合には、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）、もしくはＣＤＲを含むペプチドなどの抗体の機能的断片が含まれる。抗体の機能的断片は、ペプシン、又はパパインなどの酵素によって消化する等公知の方法によって得ることができる。 Further, when the antibody is referred to in the present invention, the function of the antibody such as Fab, Fab', F (ab') 2 , single chain antibody (scFv), disulfide stabilized V region fragment (dsFv), or peptide containing CDR. Fragment is included. Functional fragments of the antibody can be obtained by known methods such as digestion with an enzyme such as pepsin or papain.
さらに、本発明において抗体をはじめとする特異的結合試薬の検出は、特異的結合試薬に直接標識を付与して行ってもよいし、二次抗体、三次抗体を用いた間接法、あるいはアビジン-ビオチンを用いた検出など、公知の検出技術を用いることができる。 Further, in the present invention, the detection of a specific binding reagent such as an antibody may be carried out by directly labeling the specific binding reagent, an indirect method using a secondary antibody or a tertiary antibody, or avidin-. Known detection techniques such as detection using biotin can be used.
以下、本発明について説明するが、以下の方法に限らず公知の方法を用いることができることは言うまでもない。 Hereinafter, the present invention will be described, but it goes without saying that a known method can be used without being limited to the following methods.
１．抗体の精製方法
４リピートタウを認識する抗体としては、配列番号２で示すペプチドを免疫原とするモノクローナル抗体（ＲＤ4抗体、メルク株式会社製）、配列番号３で示すペプチドを免疫原とするポリクローナル抗体（４Ｒ抗体、コスモ・バイオ株式会社製）が市販されている。
1. 1. Antibody purification method 4 As an antibody that recognizes repeat tau, a monoclonal antibody (RD4 antibody, manufactured by Merck Co., Ltd.) using the peptide shown in SEQ ID NO: 2 as an immunogen, and a polyclonal antibody using the peptide shown in SEQ ID NO: 3 as an immunogen. (4R antibody, manufactured by Cosmo Bio Co., Ltd.) is commercially available.
配列番号３で示すペプチドを免疫して得られた市販抗体は、本発明者の解析により２７９位のアミノ酸がアスパラギンのペプチド、アスパラギン酸のペプチドの両者に反応する抗体が混在していることが明らかとなった。２７９位のアミノ酸がアスパラギン酸に脱アミド化されているタウを特異的に認識する抗体（以下Ｄ２７９抗体と記載する。）は、市販の抗体、あるいは配列番号３を免疫した動物から得られた抗体を、ペプチドカラムにより精製して使用することができる。 It is clear from the analysis of the present inventor that the commercially available antibody obtained by immunizing the peptide shown in SEQ ID NO: 3 contains an antibody in which the amino acid at position 279 reacts with both the asparagine peptide and the aspartic acid peptide. It became. The antibody that specifically recognizes tau in which the amino acid at position 279 is deamidated with aspartic acid (hereinafter referred to as D279 antibody) is a commercially available antibody or an antibody obtained from an animal immunized with SEQ ID NO: 3. Can be purified by a peptide column and used.
２．抗体の作製方法
抗体は公知の方法（非特許文献７）を参考に作製することができる。配列番号２、又は３に特異的な抗体を、ウサギ、マウスに抗原を免疫することによって、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を作製することができる。
2. How to make an antibody
The antibody can be prepared by referring to a known method (Non-Patent Document 7). Polyclonal antibody and monoclonal antibody can be prepared by immunizing rabbits and mice with an antibody specific to SEQ ID NO: 2 or 3.
３．検査方法
Ｄ２７９抗体を検査に用いる場合には、脳脊髄液、血液、尿などの体液や生検検体を試料として用いることができる。生検検体としては、タウやαシヌクレインの検出が認められている鼻粘膜、皮膚、唾液腺、消化管粘膜などを好適に用いることができる。脳脊髄液を用いることが、感度の点から好ましい。免疫染色法、ＥＬＩＳＡを以下に具体例として挙げるが、特異的な反応を検出することができる方法であれば、これに限らずどのような方法を用いてもよい。
3. 3. Test method When the D279 antibody is used for the test, body fluids such as cerebrospinal fluid, blood and urine, and biopsy specimens can be used as samples. As the biopsy sample, nasal mucosa, skin, salivary glands, gastrointestinal mucosa and the like in which tau and α-synuclein are detected can be preferably used. It is preferable to use cerebrospinal fluid from the viewpoint of sensitivity. The immunostaining method and ELISA are given as specific examples below, but any method may be used as long as it can detect a specific reaction.
（１）免疫染色法
組織染色は、常法によりホルマリン固定、パラフィン包埋された組織を薄切し、上記のタウペプチドに特異的な一次抗体、標識された二次抗体を用いて染色を行い検出することができる。検出方法は、酵素標識による発色、蛍光標識を検出する方法など、公知の方法を用いて行うことができる。
(1) Immunostaining method For tissue staining, formalin-fixed and paraffin-embedded tissue is sliced by a conventional method, and stained with the above-mentioned taupeptide-specific primary antibody and labeled secondary antibody. Can be detected. The detection method can be carried out by using a known method such as a method of detecting color development by an enzyme label or a method of detecting a fluorescent label.
（２）ＥＬＩＳＡ
９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートに配列番号２又は３のペプチドを入れ、一定時間静置し、固相化を行う。固相化したプレートは洗浄、ブロッキングを行い、検査に使用すればよい。
(2) ELISA
The peptide of SEQ ID NO: 2 or 3 is placed in a 96-well ELISA plate and allowed to stand for a certain period of time to solid-phase. The solid-phased plate may be washed, blocked, and used for inspection.
抗体の反応性を確認する場合には作製した抗体や精製した抗体を、患者検体を検査する場合には検体を入れ、その後二次抗体と反応させた後、常法により発色させ、反応停止後マイクロプレートリーダーを用い測定を行う。 When confirming the reactivity of the antibody, the prepared antibody or purified antibody is put in, and when the patient sample is inspected, the sample is put in. Then, after reacting with the secondary antibody, the color is developed by a conventional method, and after the reaction is stopped. Measure using a microplate reader.
４．医薬のスクリーニング方法
Ｄ２７９抗体は、ＡＤ病変を特異的に認識することから、これを用いてアルツハイマー病を治療する医薬をスクリーニングすることが可能となる。
4. Drug screening method Since the D279 antibody specifically recognizes AD lesions, it can be used to screen drugs for treating Alzheimer's disease.
（１）培養細胞を用いたスクリーニング方法
タウタンパク質の２７９位のアスパラギン酸への脱アミド化を抑制することができる化合物はアルツハイマー病の医薬として有効である可能性が高い。培養細胞を用いて２７９位のアスパラギン酸の脱アミド化を指標として化合物をスクリーニングすることにより、アルツハイマー病に効果のある化合物を選択することができる。
(1) Screening method using cultured cells A compound capable of suppressing deamidation of tau protein to aspartic acid at position 279 is highly likely to be effective as a drug for Alzheimer's disease. By screening compounds using cultured cells using the deamidation of aspartic acid at position 279 as an index, compounds effective against Alzheimer's disease can be selected.
用いる培養細胞としては、タウの２７９位の脱アミド化が認められる細胞であればどのような細胞を用いてもよい。好適な培養細胞としては、アルツハイマー病患者、あるいはモデル動物より樹立した神経細胞、また、アルツハイマー病患者より得たｉＰＳ細胞から誘導された神経細胞、４リピートタウを強制発現させ、脱アミド化が起こることを確認した細胞などが挙げられる。 As the cultured cell to be used, any cell may be used as long as it is a cell in which deamidation at position 279 of tau is observed. Suitable cultured cells include nerve cells established from Alzheimer's disease patients or model animals, and nerve cells derived from iPS cells obtained from Alzheimer's disease patients, and 4-repeat tau is forcibly expressed to cause deamidination. Examples include cells that have been confirmed to have this.
培養液に候補化合物を添加した後、Ｄ２７９抗体や同等の反応性をもった特異的結合試薬を用いてＥＬＩＳＡなど公知の方法によりタウの２７９位の脱アミド化を定量し、脱アミド化を抑制する化合物をスクリーニングすることができる。 After adding the candidate compound to the culture solution, deamidation of tau at position 279 is quantified by a known method such as ELISA using a D279 antibody or a specific binding reagent having equivalent reactivity, and deamidation is suppressed. Compounds can be screened.
今後の解析を待つ必要があるが、脱アミド化がＡＤ発症の原因の１つであるとすると、脱アミド化を抑制することが知られている化合物は、有力な医薬の候補となる可能性がある。 It is necessary to wait for further analysis, but if deamidation is one of the causes of the onset of AD, compounds known to suppress deamidation may be potential drug candidates. There is.
（２）モデル動物を用いたスクリーニング方法
培養細胞を用いたスクリーニング系で効果が見られた化合物は、モデル動物を用いてさらに検討することができる。モデル動物としては、加齢した正常動物や老化促進モデルマウスなどの老化モデルを用いることができる。また、特許文献３〜５に記載されているタウ遺伝子を改変し、アルツハイマー様の病変を生じるトランスジェニック動物を用いてもよい。
(2) Screening method using model animals Compounds that have been found to be effective in a screening system using cultured cells can be further investigated using model animals. As the model animal, an aging model such as an aged normal animal or an aging-accelerated model mouse can be used. In addition, a transgenic animal in which the tau gene described in
いずれのモデル動物を使用する場合であっても、候補化合物を動物に投与することによって、タウタンパク質の２７９位の脱アミド化の抑制を指標として医薬のスクリーニングを行うことができる。 Regardless of which model animal is used, by administering the candidate compound to the animal, drug screening can be performed using the suppression of deamidation at position 279 of tau protein as an index.
［実施例１］抗体の精製
以下、データを示しながら、本発明の検査方法を詳細に説明する。抗体を精製するためのアフィニティカラムは、配列番号３のペプチドをセルファインホルミル（ＪＮＣ株式会社製）のホルミル基に結合させて用いた。具体的には、セルファインホルミルを蒸留水で洗浄後、カップリングバッファー（５０ｍＭ炭酸-重炭酸緩衝液、ｐＨ８．５）に配列番号３（２７９位がアスパラギン酸に置換したペプチド、以下Ｄ２７９ペプチドと記載することもある。）のペプチドとともに懸濁し、室温で約３０分振盪させる。次に、水酸化シアノホウ素ナトリウムを添加し、４℃、一晩振盪し、余剰のホルミル基を還元する。ブロッキングバッファー（０．１Ｍ モノエタノールアミン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で洗浄後、再度水酸化シアノホウ素ナトリウムを添加し、完全に還元を行う。その後、ペプチドを結合させた樹脂をカラムに充填し、蒸留水、溶出バッファー（０．１Ｍ Ｇｌｙ−ＨＣｌ、ｐＨ２．５）、蒸留水、洗浄バッファー（１Ｍ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ７．５）、蒸留水の順で洗浄し、アフィニティカラムを作製した。
[Example 1] Purification of antibody The test method of the present invention will be described in detail below with reference to the data. The affinity column for purifying the antibody was used by binding the peptide of SEQ ID NO: 3 to the formyl group of Cellfineformyl (manufactured by JNC Corporation). Specifically, after washing the cellfine formyl with distilled water, a coupling buffer (50 mM carbonate-bicarbonate buffer, pH 8.5) is added with SEQ ID NO: 3 (peptide in which position 279 is replaced with aspartic acid, hereinafter D279 peptide). Suspend with the peptide of) and shake at room temperature for about 30 minutes. Next, sodium cyanoborohydride is added and shaken at 4 ° C. overnight to reduce excess formyl groups. After washing with a blocking buffer (0.1 M monoethanolamine, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0), sodium borohydride is added again to perform complete reduction. Then, the column is filled with the resin to which the peptide is bound, and distilled water, elution buffer (0.1M Gly-HCl, pH 2.5), distilled water, washing buffer (1M NaCl, 1% Triton-X 100, 20 mM Tris). -Hcl, pH 7.5) and distilled water were washed in this order to prepare an affinity column.
市販のポリクローナル抗体（４Ｒ抗体：２７９位のアミノ酸がアスパラギンであるタウペプチドに反応する抗体と、アスパラギン酸であるタウペプチドに反応する抗体が混在している抗体、以下ＤＮ２７９抗体と記載することもある。）と配列番号２のペプチド（２７９位をアスパラギンであるペプチド、以下Ｎ２７９ペプチドと記載することもある。）を混合し、ＴＢＳ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で平衡化したアフィニティカラムに入れ、転倒混和し、４℃で８時間カラムに吸着させる。未吸着の血清を流出させた後、ＴＢＳ、洗浄バッファー、０．１５Ｍ ＮａＣｌで洗浄した後、溶出バッファーでカラムに吸着した抗体を溶出させる。溶出させた抗体は、ＥＬＩＳＡなどにより、配列番号３に示すＤ２７９ペプチドに特異的に結合することを確認して以後の実験に用いている。 Commercially available polyclonal antibody (4R antibody: an antibody in which an antibody that reacts with a tau peptide in which the amino acid at position 279 is aspartic acid and an antibody that reacts with a tau peptide that is aspartic acid are mixed, hereinafter may be referred to as a DN279 antibody. ) And the peptide of SEQ ID NO: 2 (the 279th position is a peptide which is aspartic acid, hereinafter may be referred to as N279 peptide), and equilibrated with TBS (0.15M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5). The antibody is placed in a modified affinity column, mixed by inversion, and adsorbed on the column at 4 ° C. for 8 hours. After draining the unadsorbed serum, the cells are washed with TBS, washing buffer, and 0.15M NaCl, and then the antibody adsorbed on the column is eluted with the elution buffer. The eluted antibody is used in subsequent experiments after confirming that it specifically binds to the D279 peptide shown in SEQ ID NO: 3 by ELISA or the like.
［実施例２］組織染色
病理標本を用いて、配列番号３で示すペプチドを用いて作製された未精製ポリクローナル抗体（ＤＮ２７９抗体）、又はペプチドカラムを用いて精製したＤ２７９抗体を用いて組織染色を行った。
[Example 2] Tissue staining Using a pathological specimen, tissue staining is performed using an unpurified polyclonal antibody (DN279 antibody) prepared using the peptide shown in SEQ ID NO: 3 or a D279 antibody purified using a peptide column. went.
用いた試料は確定診断によりＡＤと診断された患者の嗅内野、及びＰＳＰと診断された患者の下オリーブ核の病理標本である。ホルマリン固定、パラフィン包埋された病理標本を５〜６μｍに薄切し、脱パラフィン後、０．０１Ｍクエン酸バッファー中でオートクレーブにより１２１℃１０分間加熱し、次に、１００％ギ酸に１０分浸漬して、抗原性賦活化処理を行った。１％過酸化水素で内因性ペルオキシダーゼ不活化し、５％血清を含むＰＢＳでブロッキング後、一次抗体としてＲＤ４抗体（１０００倍希釈）、４Ｒ抗体（ＤＮ２７９抗体、３０，０００希釈）、又は精製したＤ２７９抗体（２０倍希釈）を４℃で２日以上反応させ、洗浄後、二次抗体としてビオチン化抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ社製、１０００倍希釈）、又はビオチン化抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ社製、１０００倍希釈）と室温で２時間反応させた。二次抗体を洗浄後、Ａｖｉｄｉｎ ｂｉｏｔｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ（Ｖｅｃｔｏｒ社製、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ、１０００倍希釈）で１時間反応後、ジアミノベンジジンで発色させ検出を行った（図２）。 The samples used were pathological specimens of the olfactory infield of a patient diagnosed with AD by definitive diagnosis and the inferior olivary nucleus of a patient diagnosed with PSP. Formalin-fixed, paraffin-embedded pathological specimens are sliced to 5-6 μm, deparaffinized, heated in an autoclave at 121 ° C for 10 minutes in 0.01 M citrate buffer, and then immersed in 100% formic acid for 10 minutes. Then, the antigenic activation treatment was performed. After inactivating endogenous peroxidase with 1% hydrogen peroxide and blocking with PBS containing 5% serum, RD4 antibody (1000-fold dilution), 4R antibody (DN279 antibody, 30,000 dilution), or purified D279 as the primary antibody. The antibody (diluted 20-fold) is reacted at 4 ° C. for 2 days or more, and after washing, biotinylated anti-rabbit IgG (manufactured by Vector, diluted 1000 times) or biotinylated anti-mouse IgG (manufactured by Vector, 1000) is used as a secondary antibody. (Double dilution) and reaction at room temperature for 2 hours. After washing the secondary antibody, the reaction was carried out with Avidin biotin-peroxidase complex (manufactured by Vector, ABC Elite, diluted 1000-fold) for 1 hour, and then colored with diaminobenzidine for detection (FIG. 2).
タウタンパク質２７９位のアミノ酸がアスパラギン酸、アスパラギン両者を認識する抗体が混在しているＤＮ２７９抗体は、ＡＤ、ＰＳＰどちらの試料のタウも認識するが、Ｄ２７９抗体は、ＡＤのタウは認識するもののＰＳＰのタウを認識することができない。ここでは病理組織を用いて示しているが、脳脊髄液に混入する患者の細胞を用いても同様に検出することができる。 The DN279 antibody, which contains an antibody in which the amino acid at position 279 of the tau protein recognizes both aspartic acid and aspartic acid, recognizes the tau of both AD and PSP samples, but the D279 antibody recognizes the tau of AD but PSP. I can't recognize the tau. Although the pathological tissue is used here, it can be detected in the same manner by using the cells of the patient mixed in the cerebrospinal fluid.
［実施例３］ＥＬＩＳＡ
脳脊髄液などの体液中に存在するタウタンパク質はＥＬＩＳＡによっても検出することができる。図３は、配列番号２で示すペプチド（Ｎ２７９ペプチド）、配列番号３で示すペプチド（Ｄ２７９ペプチド）の濃度を変えてマイクロタイタープレートにコートし、Ｄ２７９抗体の反応性を解析したものである。
[Example 3] ELISA
Tau proteins present in body fluids such as cerebrospinal fluid can also be detected by ELISA. FIG. 3 shows the reactivity of the D279 antibody analyzed by coating the microtiter plate with different concentrations of the peptide shown in SEQ ID NO: 2 (N279 peptide) and the peptide shown in SEQ ID NO: 3 (D279 peptide).
ペプチドの固相化は、４℃、１６時間、１．０×１０−１６〜１．０×１０−６μＭ／μｌの濃度のペプチド溶液を９６穴ＥＬＩＳＡ用プレート（住友ベークライト株式会社製）に添加して行った。ＥＬＩＳＡ用洗浄バッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ）で洗浄後、ＥＬＩＳＡ用ブロッキングバッファー（１０％ＢＳＡ／０．０１×ＰＢＳ）でブロッキングを行い、再度洗浄した後、精製したＤ２７９抗体を添加し、室温で１．５時間静置した。洗浄後、二次抗体としてＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を添加し、１時間室温で静置した。洗浄した後、Ｏ−フェニレンジアミンを用い発色させ、マイクロプレートリーダー（Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ、Ｈｉｄｅｘ社製）で測定を行った。 Immobilized peptides, 4 ° C., 16 hours, to 1.0 × 10 -16 ~1.0 × 10 -6 μM / μl concentration of the peptide solution 96 well plate for ELISA (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) It was added. After washing with a washing buffer for ELISA (0.05% Tween-20 / PBS), blocking is performed with a blocking buffer for ELISA (10% BSA / 0.01 × PBS), and after washing again, purified D279 antibody is added. Then, it was allowed to stand at room temperature for 1.5 hours. After washing, HRP-labeled goat anti-rabbit IgG (manufactured by Pierce) was added as a secondary antibody, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. After washing, the color was developed using O-phenylenediamine, and the measurement was carried out with a microplate reader (Chameleon, manufactured by Hidex).
１Ｘ１０−１６μｍｏｌ／μｌという非常に低濃度の検体であっても、Ｄ２７９抗体はＤ２７９ペプチドを認識することができる。また、Ｄ２７９抗体はＤ２７９ペプチドに非常に特異性が高いこともこの結果から明らかである。したがって、非常に特異性高くＤ２７９ペプチドを含むタウ、すなわちＡＤを検出することができる。 Even analyte very low concentration of 1X10 -16 μmol / μl, D279 antibodies can recognize the D279 peptide. It is also clear from this result that the D279 antibody is very specific for the D279 peptide. Therefore, tau containing the D279 peptide with very high specificity, that is, AD can be detected.
以上、示してきたように、Ｄ２７９抗体によれば、タウオパチーのうち、アルツハイマー病を診断することが可能となる。これまで、客観的な指標が得られなかったタウオパチーの診断を感度・精度ともによく検査を行うことが可能となる。 As described above, according to the D279 antibody, it is possible to diagnose Alzheimer's disease among tauopathy. It is possible to perform a diagnosis of tauopathy, for which an objective index has not been obtained so far, with good sensitivity and accuracy.
Claims (9)
前記特異的結合試薬が２７９位がアスパラギン酸であるペプチドを免疫原として得られたポリクローナル抗体を
２７９位がアスパラギンであるペプチドと混合し、
２７９位がアスパラギン酸であるペプチドに対して吸着させて精製した抗体であることを特徴とする検査方法。 Alzheimer's disease and progressive nuclei due to a specific binding reagent that does not bind to the peptide in which the 279th position of the tau protein in the sample is asparagine but specifically binds to the peptide in which the asparagine at the 279th position is replaced with aspartic acid. A test method for differentiating supranuclear palsy or corticobasal degeneration.
A polyclonal antibody obtained by using a peptide in which the specific binding reagent is aspartic acid at position 279 as an immunogen is mixed with a peptide in which position 279 is asparagine.
A test method characterized in that the antibody at position 279 is an antibody purified by adsorbing to a peptide which is aspartic acid.
髄液、血液、脳神経組織、生検組織である請求項１に記載の検査方法。 The sample is
The test method according to claim 1, which is cerebrospinal fluid, blood, cranial nerve tissue, and biopsy tissue.
前記特異的結合試薬が抗体であり、
タウタンパク質の２７９位がアスパラギンであるペプチドには結合せず、２７９位のアスパラギンがアスパラギン酸に置換しているペプチドに対して特異的に結合することを特徴とする特異的結合試薬。 A specific binding reagent that distinguishes Alzheimer's disease from progressive supranuclear palsy or corticobasal degeneration.
The specific binding reagent is an antibody.
A specific binding reagent characterized in that it does not bind to a peptide in which position 279 of tau protein is asparagine, but specifically binds to a peptide in which asparagine at position 279 is replaced with aspartic acid.
検出に必要な試薬を備えていることを特徴とする検査キット。 A test kit comprising the specific binding reagent according to any one of claims 4 to 6 and a reagent necessary for detection.
タウタンパク質の２７９位の脱アミド化を指標としてスクリーニングすることを特徴とする医薬のスクリーニング方法。
A method for screening a drug using the specific binding reagent according to any one of claims 4 to 6.
A method for screening a drug, which comprises screening using the deamidation of tau protein at position 279 as an index.
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