CN111103678B - 晶格光片显微镜和在晶格光片显微镜中平铺晶格光片的方法 - Google Patents

晶格光片显微镜和在晶格光片显微镜中平铺晶格光片的方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种晶格光片显微镜和在晶格光片显微镜中平铺晶格光片的方法。该晶格光片显微镜包括：单个空间光调制器(SLM)，其光学调制平面与激发物镜的像平面共轭，且配置为：通过加载从期望晶格光片的相应光学晶格的中央截面处获取的相位图来生成光学晶格，且通过加载从所述相应光学晶格的偏离中央的截面处获取的相位图来平铺光学晶格；透明环状光阑，布置在与激发物镜的入瞳共轭的平面处；以及第一振镜，配置为：在光学晶格的延展方向上对各个光学晶格进行扫描，以形成平铺的晶格光片。如此，在不改变常规LLSM的硬件结构的情况下能够方便地平铺LLS，并在远远大于光片尺寸的成像视野上保持了LLSM的高分辨率和高速成像能力，实现方便、成本较低且易于推广。

Description

晶格光片显微镜和在晶格光片显微镜中平铺晶格光片的方法
技术领域
本公开涉及一种精密光学仪器及其使用方法，更具体地，涉及一种晶格光片显微镜和在晶格光片显微镜中平铺晶格光片的方法。
背景技术
晶格光片显微镜(Lattice light sheet microscopy，LLSM)使用由各种2D光学晶格(Optical Lattice)形成的光片来照射样本进行成像，LLSM可以在两种工作模式下成像：抖动模式，在抖动模式下，对光学晶格进行连续扫描以形成晶格光片，从而实现高速成像；以及超分辨率结构照明显微镜(SR-SIM)模式，在该模式下，对光学晶格进行离散扫描，以借助SR-SIM方法得到分辨率超出衍射极限的成像结果。
与光片显微镜中的其他常用光片相比，晶格光片(Lattice light sheet，LLS)具有三大优势。首先，LLS更好的在长距离上保持了光片厚度和对照明光的限制，确保了高空间分辨率和良好的光学切片能力。其次，LLS用平行照明光束的阵列照射样本，这显著降低了光片峰值强度和诱发的光损伤。第三，LLS是相干的，这使得LLSM在SR-SIM模式下操作以进行超分辨率成像时能够获得高信噪比(SNR)图像。
但是，LLSM的成像能力仍然受到光衍射的限制。随着光片尺寸增加，LLS变得更厚，对照明光的约束力变弱，从而严重降低了LLSM对大样本的成像能力。虽然通过平移样本也可以达到更大的视野(FOV)，但是这样显著降低了成像速度，引入了图像拼接问题，并且增加了显微镜的复杂性和成本。此外，很多生物样本，尤其是易受损害且较为脆弱的生物样本，不适合在成像过程中快速移动。
近期发展的平铺光片选择性平面照明显微镜(TLS-SPIM)技术，通过在期望的成像视野内(FOV)平铺小而薄的光片，并采集额外图像来克服光片尺寸、光片厚度和照明光约束力之间的矛盾，从而在远远大于光片尺寸的成像视野上保持了光片显微镜的3D成像能力。平铺光片显微镜可以使用包括LLS在内的所有的光片进行成像。然而，已经报道的TLS-SPIM显微镜使用两个空间光调制器(Spatial Light Modulator,SLM)来产生和平铺LLS。这种显微镜的光学构造和广泛采用的LLSM的光学构造差异很大，这使得多数LLSM用户无法容易地运用平铺LLS技术。
发明内容
提供了本公开以解决背景技术中存在的上述缺陷。需要一种晶格光片显微镜和在晶格光片显微镜中平铺晶格光片的方法，使其能够在不改变常规LLSM的硬件结构的情况下方便地平铺LLS，并在远远大于光片尺寸的成像视野上保持了LLSM的成像能力，实现方便、成本较低且易于推广。
根据本公开的第一方案，提供一种晶格光片显微镜，所述晶格光片显微镜包括空间光调制器、激发物镜、透明环状光阑和第一振镜，其中，所述空间光调制器的光学调制平面与所述激发物镜的像平面共轭且所述空间光调制器构造为对照明光进行调制；所述透明环状光阑布置在与所述激发物镜的入瞳共轭的平面处，以对所述空间光调制器调制后的照明光进行滤光。所述空间光调制器为单个空间光调制器，且配置为：通过向其加载从期望晶格光片的相应光学晶格的中央截面处获取的相位图来生成光学晶格，且通过向其加载从所述相应光学晶格的偏离中央的截面处获取的相位图来平铺光学晶格。以及，所述第一振镜被配置为：在光学晶格的延展方向上对各个光学晶格进行扫描，以形成平铺的晶格光片。
在一些实施例中，在对样本的成像过程中，晶格光片在激发光的传播方向上的位置动态改变。
在一些实施例中，所述单个空间光调制器为二元空间光调制器，且向其加载的相位图为二元相位图，所述二元相位图通过将相应截面处光场的幅度或相位图二值化来得到。
在一些实施例中，所述单个空间光调制器为连续空间光调制器，且向其加载的相位图为连续相位图，所述连续相位图通过相应截面处光场的幅度或相位图得到。
在一些实施例中，晶格光片的平铺距离等于用于获取相位图的偏离中央的截面相对于相应光学晶格的中央截面的距离。
在一些实施例中，晶格光片的平铺距离基于所述照明光的光束宽度和相位图来设置。
在一些实施例中，所述光学晶格基于相干光束阵列构成。
根据本公开的第二方案，提供了一种晶格光片显微镜，其包括：激光生成组件，其配置为生成激光束；柱面透镜，其配置为对来自激光生成组件的激光束在光学晶格的延展方向上进行扩展；二元空间光调制器组件，其包括所述二元空间光调制器且配置为对扩展后的激光束进行相位调制；所述透明环状光阑；至少一对中继透镜；所述第一振镜，其中，所述透明环状光阑经由所述至少一对中继透镜共轭到所述第一振镜以及所述激发物镜的入瞳；所述激发物镜；检测物镜，其配置为采集被激发平面的荧光信号；以及相机，其配置为对所述被激发平面成像。
在一些实施例中，所述晶格光片显微镜还包括第二振镜，其配置为在所述检测物镜的光轴方向上对晶格光片进行扫描，所述中继透镜为三对，所述透明环状光阑经由三对中继透镜共轭到所述第一振镜、所述第二振镜以及所述激发物镜的入瞳，所述二元空间光调制器组件包括偏振分光棱镜、半波片和所述二元空间光调制器。
在一些实施例中，所述激光生成组件包括：多个激光器，其配置为发出不同波长的多个激光束；第一透镜组，其与各个激光器对应地布置且配置为将激光束扩束并准直到第一直径。
根据本公开的第三方案，提供了一种在晶格光片显微镜中平铺晶格光片的方法，所述晶格光片显微镜包括空间光调制器、激发物镜、透明环状光阑和第一振镜，所述空间光调制器的光学调制平面与所述激发物镜的像平面共轭且所述空间光调制器构造为对照明光进行调制，所述透明环状光阑布置在与所述激发物镜的入瞳共轭的平面处，以对所述空间光调制器调制后的照明光进行滤光，并且所述空间光调制器为单个空间光调制器。所述方法包括：通过仿真计算确定期望晶格光片的相应光学晶格；从所述相应光学晶格的中央截面处获取相位图，并将其加载到所述单个空间光调制器，以生成光学晶格；从所述相应晶格光片的偏离中央的截面处获取相位图，并将其加载到所述单个空间光调制器，以平铺光学晶格；在光学晶格的延展方向上对各个光学晶格进行扫描，从而形成平铺的晶格光片。
在一些实施例中，所述方法包括：在对样本的成像过程中，动态地改变晶格光片在激发光的传播方向上的位置。
在一些实施例中，在所述单个空间光调制器是二元空间光调制器的情况下，向其加载的相位图为二元相位图，且所述二元相位图通过将相应截面处光场的幅度或相位图二值化来得到。
在一些实施例中，所述方法还包括：根据设置的晶格光片的平铺距离来确定获取相位图的偏离中央的截面。
在一些实施例中，所述方法还包括：根据所述照明光的光束宽度和相位图，来设置晶格光片的平铺距离。
在一些实施例中，所述方法还包括：基于平铺的晶格光片的强度，来校准所述晶格光片显微镜的照明激光功率。
在一些实施例中，所述方法还包括：利用各个晶格光片，采集样本的图像；从利用各个晶格光片所采集的各个图像中，提取与相应各个光学晶格的中央位置附近区域对应的部分图像；以及将所提取的各个部分图像粘合。
在一些实施例中，所述方法还包括：基于各个晶格光片的强度，来重新调整样本的相应图像的强度。
利用根据本公开各种实施例的晶格光片显微镜和在晶格光片显微镜中平铺晶格光片的方法，其能够在不改变常规LLSM的硬件结构的情况下方便地平铺LLS，并在远远大于光片尺寸的成像视野上保持了LLSM的高分辨率和高速的成像能力，实现方便、成本较低且易于推广。
附图说明
在不一定按比例绘制的附图中，相同的附图标记可以在不同的视图中描述相似的部件。具有字母后缀或不同字母后缀的相同附图标记可以表示相似部件的不同实例。附图大体上通过举例而不是限制的方式示出各种实施例，并且与说明书以及权利要求书一起用于对所公开的实施例进行说明。这样的实施例是例证性的，而并非旨在作为本装置或方法的穷尽或排他实施例。
图1(a)示出根据本公开实施例的LLSM的照明路径的概要光学配置；
图1(b)示出根据本公开实施例的模拟光学晶格的中央截面处光场(opticalfield)的幅值和相位分布以及由此获得的相应二元相位图，其用于在LLSM中生成光学晶格；
图1(c)示出根据本公开实施例的与图1(b)中所示同个模拟光学晶格在偏离中央的截面处光场的幅值和相位分布以及由此获得的相应二元相位图，其用于在LLSM中平铺光学晶格；
图1(d)示出通过对LLSM中的SLM加载图1(b)中所示的模拟光学晶格的中央截面处光场的幅值和相位分布所得到的相位图来调制照明光，所产生的模拟光学晶格的3D体绘制；
图1(e)示出通过对LLSM中的SLM加载图1(c)中所示的同个模拟光学晶格在偏离中央的截面处光场的幅值和相位分布所得到的连续相位图来调制照明光，所平铺的模拟光学晶格的3D体绘制；
图1(f)示出通过对LLSM中的SLM加载图1(c)中所示的同个模拟光学晶格在偏离中央的截面处光场的幅值和相位分布所得到的二元相位图来调制照明光，所平铺的模拟光学晶格的3D体绘制；
图2(a)-图2(d)示出根据本公开实施例的通过对LLSM中的二元SLM加载同一个光学晶格的不同截面获得的二元相位图、在所指示的截面处的相应的平铺光学晶格、LLS以及强度分布；
图3(a)示出根据本公开实施例的用于调制不同光束宽度(从amp1到amp3)的照明光的二元相位图；
图3(b)到图3(d)示出根据本公开实施例的利用图3(a)中所示的相同二元相位图对不同宽度(从amp1到amp3)的照明光束进行调制所获得的平铺光学晶格的仿真结果；
图4示出根据本公开实施例的LLSM的示意图；
图5示出根据本公开另一实施例的LLSM的示意图；
图6示出根据本公开另一实施例的在LLSM中平铺晶格光片的方法的流程图；
图7(a)示出在染料溶液中平铺的光学晶格的图像；
图7(b)示出使用根据本公开实施例的在LLSM中平铺LLS的方法对嵌入琼脂糖凝胶中的荧光颗粒的三维成像结果。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好的理解本公开的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本公开作详细说明。下面结合附图和具体实施例对本公开的实施例作进一步详细描述，但不作为对本公开的限定。
本公开中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指在该词前的要素涵盖在该词后列举的要素，并不排除也涵盖其他要素的可能。
图1(a)示出根据本公开实施例的LLSM的照明路径的概要光学配置，该LLSM可以直接采用目前广泛使用的LLSM且可避免对硬件的改变。具体说来，LLSM 100可以包括空间光调制器(SLM)101、激发物镜102和透明环状光阑103，如图1所示，SLM 101的光学调制平面与所述激发物镜102的像平面共轭且SLM 101构造为对照明光进行调制，所述透明环状光阑193布置在与所述激发物镜102的入瞳共轭的平面处，以对由SLM 101调制后的照明光进行滤光。经过SLM 101调制的激发光在经过与激发物镜102的入瞳共轭的透明环状光阑103滤光后在激发物镜102的像平面获得相应的光学晶格105。其中，x方向表示光学晶格的延展方向，y方向表示激发光的传播方向，z方向表示检测物镜104的光轴方向。
所述SLM 101可以为单个SLM，且配置为：通过向其加载从期望晶格光片的相应光学晶格105的中央截面处获取的相位图(如图1(b)所示)来生成光学晶格(如图1(d)所示)，且通过向其加载从所述相应光学晶格的偏离中央的截面处获取的相位图(如图1(c)所示)来平铺光学晶格(图1(e)-图1(f)所示)。具体说来，可以根据对于样本的具体成像要求，例如但不限于期望的成像视野、所需晶格光片的厚度、相对于厚度垂直方向的二维尺寸以及所需的照明光限制能力等，来确定期望晶格光片。然后，根据期望晶格光片可以确定透明环状光阑103的几何形状和尺寸，主要例如外径参数NAOD和内径参数NAID，并确定LLSM的各种光学元件的参数(例如可以采用惯常参数)，通过光学模拟仿真(例如可以通过MATLAB编程仿真，也可以通过其他仿真程序计算来实现)，可以确定该期望晶格光片的相应光学晶格105及其各个截面处光场的相位图。所获得的光学晶格的强度分布可以由所加载的相位图和透明环状光阑103的几何形状来确定。
目前广泛使用的LLSM通常包括单个SLM，通过利用单个SLM的LLSM来实现光学晶格的平铺，避免引入额外的SLM，显著降低了硬件成本。
在一些实施例中，所述单个SLM 101可以为连续SLM，且向其加载的相位图相应地可以为连续相位图，所述连续相位图通过相应截面处光场的幅度或相位图得到，例如，如图1(e)所示。对同个光学晶格105平铺一次可以得到单个平铺光学晶格，如图1(e)所示，且平铺距离等于用于获取相位图的偏离中央的截面相对于相应光学晶格105的中央截面的距离。
在一些实施例中，所述单个SLM 101可以为二元SLM，二元SLM具有快刷新速率、可由外部触发器控制和低成本的优点，因此被广泛用于通常的LLSM 100。所加载的二元相位图可以通过将期望光学晶格105的相应截面处光场的幅度或相位图二值化，例如将其像素值分别重置为0和π来获得(如
图1(a)和图1(b)中第三列的图所示)。如图1(f)所示，在使用二元SLM的情况下，对同个光学晶格105平铺一次可以得到一对平铺光学晶格，该对平铺光学晶格相对于该同个光学晶格105的中央截面对称，在相对于中央截面的相反方向上平铺，且每个光学晶格的平铺距离均等于用于获取相位图的偏离中央的截面相对于该同个光学晶格105的中央截面的距离。
根据本公开各个实施例的LLSM 100可以进一步包括第一振镜(图1(a)中未示出)，其配置为：在x方向上对各个光学晶格进行扫描，从而使得生成的光学晶格成为晶格光片，且使得平铺的各个晶格光片也成为晶格光片，如此可以形成平铺的晶格光片。在对样本的成像过程中，平铺的过程可以是动态的，也就是说，所平铺的晶格光片在y方向上的位置可以动态改变。通过扫描光学晶格形成晶格光片，相较其他晶格光片更好的在长距离上保持了光片厚度和对照明光的限制，确保了高空间分辨率和良好的光学切片能力。其次，晶格光片用平行照明光束的阵列照射样本，这显著降低了光片峰值强度和诱发的光损伤。第三，晶格光片是相干的，例如其对应的光学晶格可以基于相干光束阵列构成，包括但不限于相干高斯光束阵列、相干贝塞尔光束阵列等。受益于相干贝塞尔光束，可以显著减少衍射，以便在进行超分辨率成像时能够获得高信噪比(SNR)图像。
下面对本公开各种实施例的LLSM及在其中平铺晶格光片的方法的原理进行具体说明。
由于LLSM中使用的SLM的光学调制平面与激发物镜的像平面共轭，因此，当光学晶格离开激发物镜的像平面时，SLM的光学调制平面与该光学晶格的偏离中央的截面共轭。因此，通过向SLM加载从同个光学晶格的偏离中央的截面获得的相位图(相位分布)来调制像平面处的照明光，等效于在入瞳平面(与激发物镜的入瞳共轭的平面)处的照明光波前上叠加球面相位分布，而在入瞳平面(与激发物镜的入瞳共轭的平面)处的照明光波前上叠加球面相位分布可以实现光学晶格的平铺。这一原理已经通过图1(b)-图1(f)的图示完成了数值模拟验证。其中，图1(b)和图1(c)分别示出了同一光学晶格的中央截面和偏离中央的截面处光场的相位分布，模拟结果(如图1(e)和图1(f))证实了可以通过向SLM加载从相应光学晶格的偏离中央的截面处获得的相位分布图来调制像平面处的照明光，进而实现光学晶格的平铺。
图2(a)-图2(d)每幅图中，从左到右，分别示出根据本公开实施例的通过对LLSM中的二元SLM加载同一个光学晶格的4个不同截面获得的二元相位图、在所指示的截面处的光学晶格、平铺相应光学晶格且扫描所实现的LLS以及强度分布，该光学晶格的NAOD＝0.4，NAID＝0.22。其中，图2(a)所加载的是同一个光学晶格的中央截面处获得的二元相位图。
图2(a)-图2(d)示出了通过对LLSM中的二元SLM分别加载在这4个不同的截面处获得的二元相位图而产生平铺光学晶格(以及平铺晶格光片)的仿真结果。XZ面板中的比例尺为5μm，YZ面板中的比例尺为10μm。
利用根据本公开各种实施例的LLSM及在其中平铺晶格光片的方法，无需添加额外的相位调制装置，不会改变普通LLSM的光学配置，从而使得LLSM的构造、操作和维修都更简单，也便利了这一技术的用户友好度和推广。
图3(a)示出根据本公开实施例的用于调制不同光束宽度(从amp1到amp3)的照明光的二元相位图，该同个二元相位图被加载到二元SLM来对从从amp1到amp3的不同光束宽度的照明光进行调制，其中，例如，amp1的光束宽度为-0.75到0.75，amp2的光束宽度为-1.5到1.5，amp3的光束宽度大于amp3。
图3(b)到图3(d)示出根据本公开实施例的利用图3(a)中所示的相同二元相位图对不同宽度(从amp1到amp3)的照明光束进行调制所获得的平铺光学晶格的仿真结果。图3(b)中，XZ面板中的比例尺为5μm，YZ面板中的比例尺为10μm。图3(b)到图3(d)示出了照明光的光束宽度所导致的平铺距离限制，具体说来，较窄的光束宽度amp1所能实现的最大平铺距离较小，即适用更小的平铺距离，而较宽的光束宽度amp3所能实现的最大平铺距离较大，即适用更大的平铺距离。对于较宽的光束宽度amp3能够实现良好平铺效果的平铺距离，转用于较窄的光束宽度amp1和amp2，则会由于SLM对光束的调制效率的降低，难以在相同的大范围内得到高质量的平铺光学晶格。
在一些实施例中，晶格光片的平铺距离可以基于照明光的光束宽度和相位图来设置。可以例如通过数值模拟，来估计本公开实施例的LLSM可以达到的最大平铺距离。
图4示出根据本公开实施例的LLSM的示意图。如图4所示，该LLSM 400可以包括：激光生成组件401，其配置为生成激光束；柱面透镜402，其配置为对来自激光生成组件的激光束在光学晶格的延展方向上进行扩展；二元SLM组件403，其包括所述二元SLM且配置为对扩展后的激光束进行相位调制，可以通过向所述二元SLM加载从期望晶格光片的相应光学晶格的中央截面处获取的相位图来生成光学晶格，且通过向其加载从所述相应光学晶格的偏离中央的截面处获取的相位图来平铺光学晶格；透明环状光阑404，其布置在与激发物镜407的入瞳共轭的平面处，以对二元SLM组件403调制后的照明光进行滤光；至少一对中继透镜405，中继透镜405对表示两个焦点重合的透镜，其技术含义在显微镜领域是清楚明确的，在此不赘述；第一振镜406，其中，所述透明环状光阑404经由所述至少一对中继透镜405共轭到所述第一振镜406以及所述激发物镜407的入瞳，且第一振镜406被配置为：在光学晶格的延展方向上对各个光学晶格，包括在中央生成的光学晶格以及在偏离中央的平铺距离处平铺的光学晶格进行扫描，以形成平铺的晶格光片；所述激发物镜407；检测物镜408，其光轴与激发物镜407的光轴方向垂直且配置为采集被激发平面的荧光信号；以及相机409，其配置为对所述被激发平面成像。在一些实施例中，在二元SLM组件403与透明环状光阑404之间的光路上可以设置透镜411。
在一些实施例中，LLSM 400还可以包括第二振镜410，其配置为在所述检测物镜408的光轴方向上对晶格光片进行扫描。所述第一振镜406和第二振镜410例如可以分别实现为X Galvo镜和Z Galvo镜。通过引入第二振镜410，可以实现在在所述检测物镜408的光轴方向上的不同深度处对样本进行成像，从而能够实现样本的3D成像。
在一些实施例中，所述二元SLM组件403可以包括偏振分光棱镜、半波片和所述二元空间光调制器，这种二元SLM组件403刷新速率快，可由外部触发器控制从而控制便利，成本低，作为脉冲元件其衍射光的效率也较高，从而可以显著加快LLSM 400对样本的成像速率，且降低平铺晶格光片的成本，简化其控制流程，提高成像效率。
图5示出根据本公开另一实施例的LLSM的示意图。该LLSM所采用的激光生成组件可以包括多个激光器，其配置为发出不同波长的多个激光束，例如，如图5所示，激光器可以为三个，其发出激光束的波长可以分别是488nm、561nm和638nm激光器，但不限于此。LLSM可以包括第一透镜组，其与各个激光器对应地布置，例如，与激光束的波长为488nm的激光器对应布置的L1和L4，与激光束的波长为561nm的激光器对应布置的L2和L5，以及与激光束的波长为638nm的激光器对应布置的L3和L6，合束后的激光束可以利用该第一透镜组准直扩束到第一直径，例如但不限于4mm。在一些实施例中，L1、L2和L3的焦距相等，例如但不限于8mm，L4、L5和L6的焦距相等，例如但不限于20mm。准直扩束到第一直径后的激光束可以馈送到声光可调谐滤波器(AOTF)以进行波长选择和强度调制。从AOFT出射的激光束可以利用一对柱面透镜L7和L8在X方向(也就是晶格的延展方向)上进一步扩展多倍，例如但不限于10倍，然后被引导到二元SLM组件用于相位调制。在一些实施例中，L7的焦距例如但不限于25mm，L8的焦距例如但不限于250mm。优选地，所述二元SLM组件可以由偏振分光棱镜、半波片和2048×1536二元SLM(Forth Dimension Displays公司，QXGA-3DM、SXGA-3DM等型号)构成。
经调制的激光束可以先投射到透明环状光阑。在一些实施例中，二元SLM组件与透明环状光阑之间的光路上可以设有透镜L9，L9的焦距例如但不限于350mm。透明环状光阑可以采用各种结构，例如，可以设置在石英掩膜上。透明环状光阑可以经由三对中继透镜，例如L10和L11、L12和L13以及L14和L15共轭到X Galvo振镜和Z Galvo振镜，从而实现对光学晶格在x方向和z方向(检测物镜的光轴方向)上的扫描。透明环状光阑还共轭到激发物镜(例如Special Optics公司生产且参数为0.65 NA和3.74mm WD的激发物镜)的入瞳。激发出的荧光信号可以由安装在压电扫描器上的水浸物镜(例如由Nikon公司生产的型号为CFIApo且参数为LWD 25XW、1.1 NA和2mm WD的水浸物镜)，成像到例如sCMOS相机的相机上。
该LLSM通过向所述二元SLM组件加载从所述相应光学晶格的中央截面处获取的相位图和从所述相应晶格光片的偏离中央的截面处获取的相位图能够以较快的速度实现晶格光片的动态平铺，且能够对z方向上的样本的不同深度进行成像，至少受益于由偏振分光棱镜、半波片和2048×1536的二元SLM(Forth Dimension Displays公司，QXGA-3DM型号)构成的二元SLM组件的快速扫描，不仅能够对样本在大视野上进行高分辨率且高速率的成像，而且可以捕捉样本的3D动态变化。
图6示出根据本公开另一实施例的在LLSM中平铺晶格光片的方法600的流程图。该LLSM可以是根据本公开各个实施例的LLSM，也可以是市面上可以购买到的各种普通的LLSM，其中包括单个SLM。该方法600始于步骤601，通过仿真计算确定期望晶格光片的相应光学晶格。然后，在步骤602，从所述相应光学晶格的中央截面处获取相位图，并将其加载到所述单个SLM，以生成光学晶格。在步骤603，从所述相应晶格光片的偏离中央的截面处获取相位图，并将其加载到所述单个空间光调制器，以平铺光学晶格。接着，可以在光学晶格的延展方向上对各个光学晶格进行扫描，从而形成平铺的晶格光片(步骤604)。所述“平铺”是动态执行的，也就是说，在对样本的成像过程中，动态地改变晶格光片在激发光的传播方向上的位置，从而可以对大样本的不同位置动态成像。如此，可以利用各个晶格光片(包括通过对生成的中央的光学晶格和平铺的各个光学晶格进行扫描所得到的晶格光片)，采集样本的图像。可以从利用各个晶格光片所采集的各个图像中，提取与相应各个光学晶格的中央位置附近区域对应的部分图像。具体说来，晶格光片中偏离中央的位置光片变厚，随着偏离越远光片厚度也越大，可以提取利用晶格光片的厚度比较小的中央位置附近区域(例如可以限定为中央位置左右的小范围)采集的部分图像，这些部分图像分辨率较高，将这些分辨率较高的部分图像都粘合起来，就可以得到样本的大视野且高空间分辨率的完整图像。由于在成像过程中无需平移样本，粘合这些部分图像也无需图像配准处理，从而大大便利了后处理。
在一些实施例中，在所述单个空间光调制器是二元空间光调制器的情况下，向其加载的相位图为二元相位图，且所述二元相位图通过将相应截面处光场的幅度或相位图二值化来得到。
在一些实施例中，所述方法600还可以包括：根据设置的晶格光片的平铺距离来确定获取相位图的偏离中央的截面。在一些实施例中，所述方法600还可以包括：根据所述照明光的光束宽度和相位图，来设置晶格光片的平铺距离。
结合图6描述的上述步骤的细节在本公开的其他实施例中已经详述，在此不赘述。
在一些实施例中，所述方法600还可以包括：基于平铺的晶格光片的强度，来校准所述晶格光片显微镜的照明激光功率。或者，所述方法600还可以包括：基于各个晶格光片的强度，来重新调整样本的相应图像(由该晶格光片采集的图像)的强度。如此，可以补偿各处平铺的晶格光片的强度变化，使得各个晶格光片采集的各个部分图像亮度均匀，使得粘合得到的完整图像亮度均一性良好，呈现效果更好。
通过在Alexa 488染料溶液中对平铺的光学晶格进行成像验证了该方法。图7(a)示出在染料溶液中平铺的光学晶格的图像；图7(b)示出使用根据本公开实施例的在LLSM中平铺LLS的方法对嵌入琼脂糖凝胶中的荧光颗粒的三维成像结果。
如图7(a)所示，光学晶格(NAOD＝0.4，NAID＝0.22)算***位置，总共平铺了4次，分别为第1次平铺(tile 1，也就是在中央处生成光学晶格)、第2-第4次平铺(tile 2-tile4,在偏离中央的位置处平铺光学晶格)，该光学晶格在不同位置平铺时大致保持了强度分布。接着，使用相同的平铺晶格光片对嵌入4.5％琼脂糖凝胶中的一组尺寸大约为100nm的黄绿色荧光颗粒成像，如图7(b)所示，其中总共平铺了5次，也就是tile 1-tile 5，示出了成像结果在XY平面和YZ平面内的最大强度投影以及标记区域的放大视图，其中，除了放大视图以外的比例尺为10μm，在放大视图中的比例尺为1μm。从中可见，LLSM在远大于晶格光片长度的视野上保持了横向约260nm且轴向约600nm的空间分辨率。
此外，尽管已经在本文中描述了示例性实施例，其范围包括任何和所有基于本公开的具有等同元件、修改、省略、组合(例如，各种实施例交叉的方案)、改编或改变的实施例。权利要求书中的元件将被基于权利要求中采用的语言宽泛地解释，并不限于在本说明书中或本申请的实施期间所描述的示例，其示例将被解释为非排他性的。因此，本说明书和示例旨在仅被认为是示例，真正的范围和精神由以下权利要求以及其等同物的全部范围所指示。
以上描述旨在是说明性的而不是限制性的。例如，上述示例(或其一个或更多方案)可以彼此组合使用。例如本领域普通技术人员在阅读上述描述时可以使用其它实施例。另外，在上述具体实施方式中，各种特征可以被分组在一起以简单化本公开。这不应解释为一种不要求保护的公开的特征对于任一权利要求是必要的意图。相反，本公开的主题可以少于特定的公开的实施例的全部特征。从而，以下权利要求书作为示例或实施例在此并入具体实施方式中，其中每个权利要求独立地作为单独的实施例，并且考虑这些实施例可以以各种组合或排列彼此组合。本发明的范围应参照所附权利要求以及这些权利要求赋权的等同形式的全部范围来确定。
以上实施例仅为本公开的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本公开的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (18)

1.一种晶格光片显微镜，所述晶格光片显微镜包括空间光调制器、激发物镜、透明环状光阑和第一振镜，其特征在于，
所述空间光调制器的光学调制平面与所述激发物镜的像平面共轭，且构造为对照明光进行调制；
所述透明环状光阑布置在与所述激发物镜的入瞳共轭的平面处，以对所述空间光调制器调制后的照明光进行滤光；
所述空间光调制器为单个空间光调制器，且配置为：通过向其加载从期望晶格光片的相应光学晶格的中央截面处获取的相位图来生成光学晶格，且通过向其加载从所述相应光学晶格的偏离中央的截面处获取的相位图来平铺光学晶格；以及
所述第一振镜被配置为：在光学晶格的延展方向上对各个光学晶格进行扫描，以形成平铺的晶格光片。
2.根据权利要求1所述的晶格光片显微镜，其特征在于，在对样本的成像过程中，晶格光片在激发光的传播方向上的位置动态改变。
3.根据权利要求1所述的晶格光片显微镜，其特征在于，所述单个空间光调制器为二元空间光调制器，且向其加载的相位图为二元相位图，所述二元相位图通过将相应截面处光场的幅度或相位图二值化来得到。
4.根据权利要求1所述的晶格光片显微镜，其特征在于，所述单个空间光调制器为连续空间光调制器，且向其加载的相位图为连续相位图，所述连续相位图通过相应截面处光场的幅度或相位图得到。
5.根据权利要求2所述的晶格光片显微镜，其特征在于，晶格光片的平铺距离等于用于获取相位图的偏离中央的截面相对于相应光学晶格的中央截面的距离。
6.根据权利要求1所述的晶格光片显微镜，其特征在于，晶格光片的平铺距离基于所述照明光的光束宽度和相位图来设置。
7.根据权利要求2所述的晶格光片显微镜，其特征在于，所述光学晶格基于相干光束阵列构成。
8.根据权利要求1所述的晶格光片显微镜，其特征在于，所述晶格光片显微镜包括：
激光生成组件，其配置为生成激光束；
柱面透镜，其配置为对来自激光生成组件的激光束在光学晶格的延展方向上进行扩展；
二元空间光调制器组件，其包括所述二元空间光调制器且配置为对扩展后的激光束进行相位调制；
所述透明环状光阑；
至少一对中继透镜；
所述第一振镜，其中，所述透明环状光阑经由所述至少一对中继透镜共轭到所述第一振镜以及所述激发物镜的入瞳；
所述激发物镜；
检测物镜，其配置为采集被激发平面的荧光信号；以及
相机，其配置为对所述被激发平面成像。
9.根据权利要求8所述的晶格光片显微镜，其特征在于，所述晶格光片显微镜还包括第二振镜，其配置为在所述检测物镜的光轴方向上对晶格光片进行扫描，
所述中继透镜为三对，所述透明环状光阑经由三对中继透镜共轭到所述第一振镜、所述第二振镜以及所述激发物镜的入瞳，
所述二元空间光调制器组件包括偏振分光棱镜、半波片和所述二元空间光调制器。
10.根据权利要求8所述的晶格光片显微镜，其特征在于，所述激光生成组件包括：
多个激光器，其配置为发出不同波长的多个激光束；
第一透镜组，其与各个激光器对应地布置且配置为将激光束扩束并准直到第一直径。
11.一种在晶格光片显微镜中平铺晶格光片的方法，所述晶格光片显微镜包括空间光调制器、激发物镜、透明环状光阑和第一振镜，其特征在于，所述空间光调制器的光学调制平面与所述激发物镜的像平面共轭且所述空间光调制器构造为对照明光进行调制，所述透明环状光阑布置在与所述激发物镜的入瞳共轭的平面处，以对所述空间光调制器调制后的照明光进行滤光，并且所述空间光调制器为单个空间光调制器，所述方法包括：
通过仿真计算确定期望晶格光片的相应光学晶格；
从所述相应光学晶格的中央截面处获取相位图，并将其加载到所述单个空间光调制器，以生成光学晶格；
从所述相应光学晶格的偏离中央的截面处获取相位图，并将其加载到所述单个空间光调制器，以平铺光学晶格；
在光学晶格的延展方向上对各个光学晶格进行扫描，从而形成平铺的晶格光片。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法包括：在对样本的成像过程中，动态地改变晶格光片在激发光的传播方向上的位置。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，在所述单个空间光调制器是二元空间光调制器的情况下，向其加载的相位图为二元相位图，且所述二元相位图通过将相应截面处光场的幅度或相位图二值化来得到。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：根据设置的晶格光片的平铺距离来确定获取相位图的偏离中央的截面。
15.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：根据所述照明光的光束宽度和相位图，来设置晶格光片的平铺距离。
16.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：基于平铺的晶格光片的强度，来校准所述晶格光片显微镜的照明激光功率。
17.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
利用各个晶格光片，采集样本的图像；
从利用各个晶格光片所采集的各个图像中，提取与相应各个光学晶格的中央位置附近区域对应的部分图像；以及
将所提取的各个部分图像粘合。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：基于各个晶格光片的强度，来重新调整样本的相应图像的强度。
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