JP2007178442A6 - イメージングの装置及び方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】生体物質等の検体の測定のためのイメージングの際に、面全体の各点の状態をタイムラグを生じさせずに同時並行で取得することを可能とし、検体への分子タグ付けのための付加的なステップを不要として速やかな検査を可能とする。
【解決手段】光ビームの内部全反射に関連付けられているエバネッセント場内に、生物学的研究、化学的研究、若しくは遺伝学的研究の対象である検体が配置されているTIR面(39)で1回反射させることによって、内部全反射構造体(14)を通過する光ビーム(20)の偏光状態が変化することを利用して光学的測定を行うイメージング装置(10)及び方法を提供する。
【選択図】図2
【解決手段】光ビームの内部全反射に関連付けられているエバネッセント場内に、生物学的研究、化学的研究、若しくは遺伝学的研究の対象である検体が配置されているTIR面(39)で1回反射させることによって、内部全反射構造体(14)を通過する光ビーム(20)の偏光状態が変化することを利用して光学的測定を行うイメージング装置(10)及び方法を提供する。
【選択図】図2
Description
本発明は、光学的透過性のある材料の境界面での内部全反射に関するものであり、特に、光学的透過性のある基板上での物質の存在、組成、量、及び空間的分布に関するものである。
材料面上の物質の存在若しくは特性が、光ベースのセンサによって決定されるということは公知である。偏光ベースの技術は、特に感度が高く、例えば、偏光解析法は、面の解析に幅広く用いられる技法であり、面に付着しているタンパク質及びより小さい分子を検出するのにうまく利用されている。特許文献1では、テスト面上での免疫測定法において抗体−抗原の付着を測定するのに楕円偏光計が用いられている。最近では、面全体の照射に光源を用いており、且つ検知のために2次元アレイを用いており、それにより面全体の各点に対する面の特性を並行して測定するイメージング偏光解析法(非特許文献1)が示されている。イメージング法は、走査法を用いて複数の単一点測定を実行するのとは対照的に、効果的である。なぜならば、走査法では、走査プロセスがかなりの時間(例えば、数分間)を要し、且つ個々の点の測定の間でタイムラグを生じてしまうのに対して、イメージング法では、面の各点の状態を同時に取得するからである。面の特性が種々の位置で動的な変化を生じる場合の測定を実行する際には、測定間のタイムラグによって、任意の所定時間における面全体の状態の取得が困難若しくは不可能になる。報告されているイメージング偏光解析法の適用例では、シリコン面上で実行されており、周囲の媒体(キュベット内に含まれる空気若しくは液体のいずれか)を通過させる測定のために、光を用いている。測定プロセスの際に、周囲の媒体の光学的な特性が変化し得る場合の適用例では、光が媒体を通過するのは、それによって測定が阻害されてしまうので不都合である。
光学的透過性のある基板を用いることによって、この問題は、照射光及び反射光が共に基板を通過する、内部全反射(TIR)の原理を用いることで克服することが可能である。TIRでは、面上の物質と相互作用する光は、面の上の非常に薄い領域、いわゆるエバネッセント場に閉込められる。これによって、周囲の媒体の影響が大幅に減少されるので、非常に高コントラストの読出しが提供される。特許文献2では、TIRを利用した、透過性材料面上の物質の検出及び分析するための偏光の利用方法が説明されている。しかしながら、Butzerによって説明されているシステムでは、分析される前に光が複数の内部反射を受けており、新たに出現する光ビームの各部分で検出される局所的な偏光の変化が多重反射のいずれによって生じているか区別することが不可能なので、イメージング技法の実行は困難若しくは不可能にされている。特許文献3では、エバネッセント場を利用した生化学的なアレイの読出しが説明されている。この特許は、検出及び解析がなされる基板上に取付けられた蛍光マーカーを励起するのにエバネッセント場を利用する蛍光測定法に焦点をあてている。面上の検出される物質に蛍光マーカー若しくはその他の分子タグを取付けることによって、測定を実行する際に付加的なステップを必要とするが、本発明ではそれは必要としない。更に、この特許では、分析物を励起させるように、エバネッセント場上に提供される共振空洞の使用の説明がなされている。
この発明の原理によれば、光源構成要素からの光によって、透過性のある基板を通るように方向付けられて、TIR構成要素の内部での一回の反射によって基板面で内部全反射を受ける、拡張及び偏光された光ビームが提供される。この反射光は、偏光感応性2次元アレイ検出器によって検出される。内部全反射によって生じるビーム断面内の局所的な偏光状態の変化が、基板面上の物質のアレイの存在及び組成に関する情報をその面の各点に対して取得するのに用いられる。内部全反射は、非特許文献2に説明されている。本発明の一態様によれば、光源構成要素内部で光を生成する要素は、中程度の帯域幅から成る準単色光源である。好適実施例では、光源構成要素内の光生成要素は、中程度の帯域幅から成るLEDである。光源構成要素からの光は、内部反射構成要素を通して方向付けられて検体に反射される。光ビームの断面内の任意の点での内部全反射によって、入射光の、平面内で偏光される成分と平面に垂直に偏光される成分との間で位相シフトを生じる。反射光が偏光感応性2次元アレイ検出器によって検出されて、この検出器からの信号がコンピュータ内で処理されて、それにより、検体面上の物質に関する2次元情報が提供される。反射ビームの断面内で空間的に分布する偏光状態の変化によって、検出器内の位置に対応する検体アレイ内の位置における検体内の物質が示される。この装置及び方法は、水溶液中の材料のイメージングに対して特に適合している。更に、この装置及び方法は、バイオセンサ・システムの一部として内部全反射構成要素上に配置されている2次元生体高分子アレイへの分析物の付着及び分離を検出するのに特に適している。種々の適用において、アレイ内には複数の別個の検体スポットが存在しており、この方法及び装置によって、別個の各検体スポットの内部の偏光状態の変化を示すイメージを用いて別個の検体が各々区別されるように、そのアレイがイメージングされる。この発明を用いる場合には、検体に蛍光タグ若しくは分子タグを付けることは不必要であるか、若しくは実用的でない。
本発明は、イメージング技法を用いて、化学物質の2次元配置を解析するための方法及び装置を有する。内部全反射面(TIR面)で1回反射して、TIR構成要素を退出するように構成されている内部全反射構成要素(TIR構成要素)の中に、既知の偏光状態に偏光された光源が方向付けられる。本明細書中では、層の厚さが照射光のコヒーレンス長よりも小さい層状光学的構造で生じる複数の反射の重ね合わせは、単一の反射とみなされている。化学検体は、反射光ビームのエバネッセント場内のTIR面の上の所定位置に配置される。反射後に、このビームは、偏光器及びカメラ等の偏光感応性2次元検出器に渡される。ビームの中身は、このビームの2次元断面内での偏光状態の変化を局所的に測定するように処理され得る。これによって、検体内での偏光状態の変化の空間的な分布図が提供される。ゼロ状態からの偏りの測定、若しくは入力偏光状態と出力偏光状態との比較等によって、偏光の変化を測定する多種多様の技法が利用可能である。
エバネッセント場の内部の材料の屈折率の成分によって、TIR面での反射に起因するビームの偏光状態の変化が決定される。TIR面内でのこの成分の2次元的な変化は、反射光ビームの断面に渡って空間的に分布している偏光状態の各変化に関連付けられている。
一適用例では、化学的な検体が、各々の他の分子(ここでは、リガンドを指している)に対して特別の結合性を備えている分子(ここでは、レセプタを指している)から成る2次元的なアレイを形成している。この適用例では、本発明は、アレイ上でレセプタとリガンドとの間の結合の存在若しくは欠如を示すために利用されている。そのようなアレイは、一般に、複数の別個の検体スポットで構成されている。本方法及び本装置は、反射ビームの断面内の偏光状態の局所的な変化によって別個の検体スポットの各々が示されるように、アレイをイメージングする。
本発明によって、検出器の解像度の制限に従って、領域全体に渡って空間分解されたオングストローム以下の非常に高解像度の調査に基づいて、検体の厚み及び/又は屈折率の成分を測定することが可能である。この発明は、検体が水溶液中にある場合に特に有用である。ある特定の実施例では、例えば、エバネッセント場内でのTIR面上の抗体への生物因子の付着を測定することによって、免疫センサ内に関して適用される場合のように、溶液中に生物因子の存在を決定するのに本発明が用いられる。別実施例では、本発明は、溶液中の核酸配列の存在及び構造を、エバネッセント場内でのTIR面上の他の核酸配列へのそれらの付着を測定することによって、決定するのに用いられる。以下では、本発明の種々の実施例が、より詳細に説明されている。
図1及び図2を参照すると、本発明の一実施例が実装されている装置及び方法が図示されている。図1に示されるように、装置10は、3つの概略的な部分から成るものとして便宜的に描写し得る。部分12は、偏光光源アセンブリであり、部分14は、内部全反射アセンブリであり、且つ部分16は、偏光感応性2次元アレイ検出器アセンブリである。検出器アセンブリ16からのデータは、特別にプログラミングされたコンピュータ等のプロセッサ18、及びプリント・アウト装置若しくはイメージ・ディスプレイ等のユーザ・アクセス・システムに、電気信号24により送信される。データは、イメージ、データ・テーブル、若しくはその他の形態で存在していてよい。この偏光光源アセンブリ12が、既知の偏光状態(既に偏光されていてもよいし、これから偏光されてもよい)20の偏光された光を内部全反射アセンブリ14に渡して、次に、変化された偏光状態を有する反射光22が検出器アセンブリ16に渡されて、そこで、ビームの断面に渡って空間的に記録される。この記録されたデータがプロセッサ18に送信されて、そこで、偏光状態の変化が決定されて、偏光状態の変化が空間的に分解されたマップが提供される。この際に、この検体は別個のスポットから成るアレイとして存在しており、各スポットが、スポット領域内での各々の偏光状態の変化に関してイメージングされる。
図2には、より詳述された好適実施例が示されている。偏光光源アセンブリ12は、光源26、ビーム形成構成要素28(光源の種類がビーム形成を必要とする場合、若しくはビーム形成が有用である場合)、偏光器30、及び光学リターダ32を有する。内部光全反射アセンブリ14は、光学面36を備えた光学素子34を有する。更に、光学面36上に検体スライド38が示されており、且つそれらの間には屈折率整合物質36が存在している。屈折率整合のおかげで、内部全反射面(TIR面)は、検体スライド38の上面39として規定される。検体42は、スライド38の全反射面39上に載置されている。光学素子34は、ビームがTIR面39で1回だけ反射してプリズムを退出するように、入射光ビーム20及び出射光ビーム22と関係付けられている、屈折率整合スライド38に沿って構成されたプリズムである。検体が光学面36上に直接的に配置される場合には、光学面36がTIR面になる。しかし、通常、(バイオチップ等の)検体は、検体スライド38上に非常に都合よく載置されて装置内に配置されるので、これは一般的な適用例ではない。いずれにせよ、何らかの方法でTIR面を有する光学的構造体が構成されて、ビームは、この構造体への入射及び出射の間にこのTIR面で1回だけ反射する。換言すると、内部全反射に関連付けられるエバネッセント場が検体と相互作用するように、検体と光学的接触(オプティカル・コンタクト)するTIR面が存在して、且つそのTIR面で1回のみ反射される。
反射後検出器アセンブリ16は、偏光器14と、2次元アレイ検出器46(好適には、CCD型カメラ)とを有する。プロセッサ18は、特別にプログラミングされたコンピュータであり、且つイメージを処理してイメージング領域の断面に渡って空間分解されている膜厚変化の表現にするための出力手段である。このイメージングは、内部全反射によって生じるビーム断面内で局所的な偏光状態の空間的に分布している変化を検出することによって取得される。これによって、その面上の解決可能な各点に対して、基板面上の物質のアレイの存在及びその内部組成に関する情報が提供される。反射ビームの断面内に異なる偏光状態の変化が含まれていることによって、検出器の位置に対応する検体アレイ内の位置の検体上に物質が存在することが示される。プロセッサ18は、データを電気信号24として受信して、2次元アレイ上の偏光状態の変化を空間的に特性付ける。一実施例では、ビーム内部で2次元的に空間分解されている、光処理アセンブリ12からの入射光の既知の偏光状態と、反射光22の変化した偏光状態とを比較して、検体アレイ内の分布点若しくは分布スポットのマップを得ることによって、プロセッサ18内で解析及び処理がなされる。次に、プロセッサ18によって偏光シフトが解析されて、化学的検体内の要素の存在及び特性の情報が提供される。偏光状態の変化を測定するのに、零位法等の別の公知の技法が用いられてもよい。
代替的に、光源構成要素26は、LED、SLD(スーパー・ルミネッセント・ダイオード)、白熱光源、若しくはレーザであってよい。LED若しくはSLDが用いられる場合には、図2に図示される設定が適切であり、その際に、ビーム形成構成要素28はコリメータである。白熱光源が用いられる場合には、更に、光学フィルタも用いられる。
一実施例では、装置に対する光源26は、中程度の帯域幅を備えた準単色光源である。本発明によれば、好適には、光源26は、中程度の帯域幅のLEDである。好適には、帯域幅は、半値全幅波長が約10nm乃至約50nmの範囲であり、より好適には、半値全幅波長が約30nm乃至約50nmの範囲である。
図2に図示される光学リターダ32に関して、代替実施例では、この光学リターダが代替的に出射ビーム経路22上に偏光器44の前に配置されてもよい。
図3を参照すると、代替実施例が図示されている。光源がレーザ50である場合には、レーザによって生じるスペックル・パターン内で最小及び最大のスペックル補正変動を生じるように可動散光器52が適合される。この可動散光器52は、好適には、スペックル補正変動を提供するためのサーボ装置及びモータである機構的なアクチュエータ54に取付けられる。次に、ビーム20は、ビーム形成要素28、偏光器30、及び光学リターダ32を通って進んで、光源アセンブリ20を退出する。
偏光器30としては、既知の偏光状態が選択されている偏光器が利用される。偏光器30は、光ビーム20の偏光状態を変化及び選択することが可能であるように、モータ制御信号によって駆動される機構的アクチュエータを備えている種類のものであってよい。
上述のように、単独で、若しくは屈折率整合スライドと共に用いられる内部全反射光学素子34は、検体が反射ビーム20、22のエバネッセント場内に配置されていさえすれば、内部全反射アセンブリを規定する多種多様の方法で、検体と共に使用するように配置されてよい。
上記で示したように、検体42を光学面36上に直接設けることも可能であり、その場合には、光学面36がTIR面となるが、これは不便であり、且つ繰返して使用すると光学面36の光学的な品質を劣化させる可能性があるので、バイオチップ若しくはその他の化学的な測定検体に対する従来的な実施例と同様に、検体スライド38若しくはその他の支持装置が用いられる。バイオチップの場合には、従来的には、各スポットの分析結果を取得するように、構造上に支持されている別個の検体スポットから成るアレイが提供される。用語「内部全反射光学素子」は、内部全反射として公知の現象を提供する、単独で、若しくはその他の素子と共に用いられる公知の光学素子を示している。図2には、TIR面39が存在するように屈折率整合がされたスライド38と併用されているプリズムが図示されている。
図4には、代替的な光学配置が図示されており、そこでは、平坦な光学的構成要素56が、検体スライド60及び屈折率整合物質62が上に載置されている上面58を備えており、更に、検体スライド60上には検体64が載置されている。TIR面66は、スライド60の上部である。ビーム20は、このアセンブリに進入して、進入の際に屈折されて、TIR面66で1回反射した後に、ビーム22としてこの光学構成要素56を退出する。上に検体が配置されているTIR面で1回だけの反射が生じて、この反射に関連付けられているエバネッセント場内に検体が存在していさえすれば、この発明を実行するのに内部全反射及びエバネッセント場を提供するその他の機構が用いられてもよい。
図5で見られるように、ビーム22が通り抜ける反射後処理配置16は、代替的に、偏光器構成要素70、ビーム形成構成要素72、及び2次元アレイ検出器74から構成されてよい。
この方法及び装置は、別個の検体スポットを有する種類のバイオチップ、若しくは解析用の別個のスポット若しくは別個の部位(検出される偏光状態の変化は、反射ビーム内のその別個の部位と空間的に関連している)で構成されるアレイを含有するマイクロタイター・プレートと組合わせて用いられてよい。それゆえに、本明細書で用いられているスライド及び検体は、試験が望まれる、任意の種類の化学的アレイ若しくは生物学的アレイのことを示し得る。
前述の装置及び方法は、水性媒体中の材料をイメージングする場合に特に有益である。
本明細書では、本発明の特定の実施例が説明及び図示されてきたが、当業者による修正及び変更は容易に実行可能であり、従って、本発明の請求項は、そのような修正及び同等物を網羅しているものとして解釈されるように企図されていることに留意されたい。
Claims (3)
- 検体をイメージングするための装置であって、
偏光された光ビームを放射する光源と、
面を備えている構造体であって、前記光源からの前記光が前記面で反射されてエバネッセント場を提供し、前記面に載せられて前記エバネッセント場に存在する前記検体が前記光ビームの断面において空間的に分布している偏光変化を引き起こすように構成された、該構造体と、
前記検体によって引き起こされた空間的に分布している偏光変化を検出するように配置され、その空間における全ての位置で偏光変化を同時に検出する2次元アレイ検出器とを有することを特徴とする装置。 - イメージングするための方法であって、
光学的構造体の面で反射されてエバネッセント場を提供するように、偏光ビームを前記光学的構造体の中に通過させるステップであって、前記エバネッセント場に存在する検体が前記光ビームの断面において空間的に分布している偏光変化を引き起こす、該ステップと、
前記検体によって生じた空間的に分布している偏光変化を、その空間における全ての位置で同時に検出するステップと、
前記検体のイメージを提供するように、検出された空間的な分布している偏光変化を処理するステップとを有することを特徴とする方法。 - ビームの内部全反射に関連付けられているエバネッセント場内で2次元的に分布している化学的な検体アレイの特性を明らかにする方法であって、
偏光状態が既知である拡張された光ビームを内部全反射面に方向付けるステップであって、前記ビームが、前記内部全反射面で1回、内部全反射される、ステップと、
エバネッセント場内の前記の化学的な検体アレイによって生じる、前記ビームの前記空間的に分布している偏光変化を、その空間における全ての位置で同時に測定するステップとを有することを特徴とする方法。
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