JP2006525032A - Baceのグリコシル化変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
Δ3−−N223A(図2、配列番号:2);
Δ2、3−−S174I及びN223A(図3、配列番号:3)
Δ1、2、3−−N153Q、S174I及びN223A(図4、配列番号:4);
Δ1、2、3、4−−N153Q、S174I、N223A及びN354S(図5、配列番号:5)。
本発明の別の態様では、配列は残基451後でトランケートされ、残基452がフラッグ配列で置換されてその後に終止配列が続いて、膜貫通及び細胞質ドメインが除かれている。本明細書でこれらの配列は、452フラッグ配列、例えば、Δ3−452フラッグと呼ばれる。別の態様では、本発明のBACEポリペプチドの膜貫通領域が、ヒスチジン標識で置換されている。このような配列は452H配列、例えば、Δ3−452Hと呼ばれる。
5%ジェファミン(Jeffamine)
5%ポリプロピレングリコールP400
5%ポリエチレングリコール400
5%エチレングリコール
5%2−メチル−2,4−ペンタンジオール
5%グリセロール
5%ジオキサン
5%ジメチルスルホキシド
5%n−オクタノール
100mM (NH4)2SO4
100mM CsC1
100mM CoSO4
100mM MnCl2
100mM KCl
100mM ZnSO4
100mM LiCl2
100mM MgCl2
100mMグルコース
100mM 1,6−ヘキサンジオール
100mM硫酸デキストラン
100mM 1,6ヘキサンジアミン
100mM 1,8ジアミノオクタン
100mMスペルミジン
100mMスペルミック
0.17mM n−ドデシル−β−DマルトシドNP40
20mM n−オクチル−β−D−グルコピラノシド
が含まれるがこれには限定されない。
BACEの調製
BACEをコードするcDNAを、発現を指示するCMVプロモーター及びCOS細胞においてプラスミドの複製を推進するSV40複製起源を含む哺乳類発現ベクター中に挿入した。この発現カセットを、FuGENE(商標)試薬(Roche Applied Science)を使用してCOSA2細胞にトランスフェクトした。細胞のペレットをトランスフェクション後48時間して採集した。凍結細胞ペレットを20mM HEPES、2mM EDTA、5μg/mlE−64、10μg/mlペプスタチン、1mMフェニルメチルスルホニルフッ化物、pH7.5中でホモジェナイズした。膜分画粗製物を15,000×gで40分間の遠心分離で回収した。膜ペレットを20mMトリス、2mM EDTA、0.2%トリトンX−100中、5μg/mlE−64、10μg/mlペプスタチン、1mMフェニルメチルスルホニルフッ化物、pH7.5で抽出した。この抽出物を4体積量のSP緩衝液(20mM酢酸ナトリウム、2mM EDTA、0.2%トリトンX−100、60mM塩化ナトリウム、pH5.0)で希釈し、HiTrap(商標)SPカチオン交換カラム(Amersham Biosciences)に通した。BACEをSinhaら(Nature、1999)に記載のように、P10−P4’staV−セファロース上で親和性クロマトグラフによってSP流から精製した。親和性精製したBACEは、銀染色SDSポリアクリルゲルによって均質化した。
BACE細胞外ドメイン構築物の調製
膜トランケートBACEのC末端フラッグエピトープ標識構築物を、BACEcDNA鋳型(Sinhaら)を使用し、非相補性BamHI部位(下の事例)をコードする下記順方向プライマーでPCRにより工作した。
及び逆方向プライマー(下記事例ではフラッグ標識配列をプラス)
2つの逆方向プライマーは、PCR増幅断片のクローニングを促進するためSalI部位を含んでいた。増幅断片をDNA配列確認のため、pCRScript(登録商標)(Stratagene)にクローンした。452トランケート構築物をコードするcDNA挿入物を、pIRES−EGFP(Clonetech)にサブクローンした。このクローンを、pSV2Neo(Clonetech)と一緒にA293細胞中に共トランスフェクトし、抗菌剤耐性細胞を選択して大量に増幅させた。大量の選択した細胞を、限界希釈法によりクローンし、またフローサイトメトリーで選別し、中レベル又は高レベルのEGFPを発現する濃縮細胞集団を産生した。細胞を50μMエタノールアミン、10nM亜セレン酸ナトリウム及び1mMピルビン酸を補給したDMEM:F12(1:1)で16から48時間増殖させた。調製された培地を回収して、4体積量の、5μg/ml E−64、10μg/mlペプスタチン、1mMフェニルメチルスルホニルフッ化物を含むSP緩衝液で希釈し、HiTrap(商標)SPカラムに通した。BACEをSP流からカラムを抽出前に、125mM、250mM及び500mM塩化ナトリウムをこの順番で含む20mMの酢酸ナトリウム、2mM EDTA、0.2%トリトンX−100、pH4.5で洗浄した以外は上記に記載のように親和性クロマトグラフィーによって精製した。精製されたBACEは、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で均質化した。
βセクレターゼ分析
ペプチド基質MBP−C125SWeをすべての分析に使用した。MBP−C125Sweは、APPのスウェーデン変異体(リジン670アスパラギン、メチオニン671ロイシンの二重変異)のC末端125アミノ酸に融合させたマルトース結合タンパク質MBPを含むバクテリア融合タンパク質(Sinhaら)(1999)である。C末端125アミノ酸を発現ベクターpMALc(New England Biolabs)にクローンして、大腸菌にトランスフェクトした。融合タンパク質をペレット化したバクテリアを音波処理することによって誘導し溶解した。タンパク質をアミロースアガロース上で親和性クロマトグラフィーで精製して、3Mグアニジンとして、10mMトリス、pH7.5、0.2%トリトンX−100及び0.15Mグアニジン中で貯蔵した。
nM産物/時間(ng酵素)×45ng酵素/pm酵素×1/220nM基質×1/3,660秒/時間×50,000nL/反応物。
BACE変異物の昆虫細胞中でのバキュロウィルスベクターによる発現
物質から結晶学作品を生成するためBACEの変異型をバキュロウィルス中で産生した。最小限にグリコシル化した溶解性βセレクターゼの活性型を産生するため、ヒスチジン標識(Δ2、3−452H)を付した酵素のS174I、N223Aグリコシル化変異型を、バキュロウィルス発現ベクターpVL1392中に入れた。さらに、プロ領域変異体を溶解性野生型及びグリコシル化変異酵素(452H、NINL及びΔ2、3−452H、NINL)から作成し、均質にプロセスされた可溶性酵素を生成させた。このNINL変異物は、切断部位のアミノ酸配列を、R42L43P44R45からNINLに変えて、上記に記載のようにプロ領域の切断を最適化している。
Claims (18)
- 以下のアミノ酸置換:S174I、N223A、N153Q及びN354Sの少なくとも1つを有するBACEポリペプチドのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
- アミノ酸置換N223Aを有する、請求項1に記載のポリペプチド。
- アミノ酸置換S174I及びN223Aを有する、請求項1に記載のポリペプチド。
- 配列番号2を含む単離されたポリペプチド。
- 配列番号3を含む単離されたポリペプチド。
- 452と501との間の残基から選択されたC末端を有する、請求項1から3までに記載の単離されたポリペプチド。
- 残基位置46に対応するN末端残基を有する、請求項1から3までに記載の単離されたポリペプチド。
- 前記N末端が位置42から45にアミノ酸NINLを含む、請求項1から3までに記載の単離されたポリペプチド。
- (i)長さ約450未満のアミノ酸残基であり、(ii)その同類置換を含む配列番号2から5のいずれか1つと少なくとも90%同一であって、グリコシル化部位は配列番号2から5と同一であり、(iii)基質MBP−C125Sweを切断する能力によりβセクレターゼ活性を示すポリペプチドを含む単離されたタンパク質。
- 前記ポリペプチドが配列番号2から5のいずれかと少なくとも95%同一である、請求項9に記載のタンパク質。
- 請求項1から10までに記載の精製されたポリペプチドから形成される結晶性タンパク質組成物。
- 請求項1から10までに記載の単離されたポリペプチドと(a)試験化合物及び(ii)βセクレターゼ基質とを接触させるステップと、前記ポリペプチドが、前記化合物の非存在下よりも存在下でより小さいβセクレターゼ活性を示す場合にAβ産生を阻害することが可能な前記試験化合物を選択するステップとを含む、Aβの産生を阻害する化合物のスクリーニング方法。
- 請求項1から10までのいずれか一項に記載の精製されたβセクレターゼポリペプチドとβセクレターゼ阻害剤化合物との、試験化合物の存在下での結合を測定するステップと、前記試験化合物存在下での前記阻害剤の結合が、前記試験化合物の非存在下での前記阻害剤の結合よりも少ない場合に、Aβ産生の阻害剤として前記試験化合物を選択するステップとを含む、Aβ産生を阻害する化合物をスクリーニングする方法。
- 前記阻害剤がP10−4’staD→Vである、請求項13に記載の方法。
- 遺伝子コードの縮重により請求項1から10までのポリペプチドのいずれかをコードする精製及び単離されたDNA配列。
- 請求項15に記載のDNA配列を含む発現ベクター。
- 請求項7に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
- 請求項17に記載の細胞を、細胞の成長及びポリペプチドの発現を促進する条件下で培養するステップと、ポリペプチドを精製するステップとを含む、請求項1から10までのいずれか一項に記載の単離されたポリペプチドを産生する方法。
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