JP2006518994A - 植物体における製薬に重要な蛋白質の一過性産生 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2002年12月23日に出願された米国仮出願第60/436,403号の優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
(技術分野)
本発明は、植物栽培設備の必要のない、すでに生長した商業的に入手可能な植物体で蛋白質を産生するといった実質的に改良された工程を提供する。本発明の方法は、動物の試験、多様なアッセイによる解析、結晶構造の特徴づけ、蛋白質修飾のアッセイ等に適した規模で、最小限の時間と費用により、生物学的に機能的な蛋白質を非常に迅速に提供する。本発明の方法で、少なくとも約1mg、少なくとも約5mgまた少なくとも約10mgの蛋白質を1回で産生することができる。
本発明は、商業的に入手可能な生長した植物体に於いて蛋白質の産生を可能にする方法を提供し、異種蛋白質において、バイオアッセイで利用するために必要な量を短期間で調達しなければならないという問題に新規な解決法を提供する。本発明の方法は、少なくとも約50μg−100mgの蛋白質を必要とするアッセイ、例えば、薬剤スクリーニング、蛋白質の特徴付け、結合アッセイ及び動物試験等のアッセイでの使用に対して、生物学的に活性な異種蛋白質を提供する。
以下の定義は、以下に記載される説明中で使用される特別な用語に対して与えられる。
明細書及び請求項で使用される時、単数形“a”“an”及び“the”は、文脈が別の方法で明らかに指示しない限りは、複数への言及も包含する。例えば、用語“a cell”は、複数の細胞の混合物も含む複数の細胞を包含する。用語“a protein”は複数の蛋白質を包含する。
一過性発現に対するアグロバクテリウム浸潤の初期の適用は、ポプラ及びPhaseolus(Kapila,et al.,1997)に基づいており、そらから後にたばこ(Vaquero,et al.,1999)へ応用された。ポプラ及びPhaseolusの両者は、即座に本発明で使用される植物体組織の適当な供給源となる。他の適当な植物は、レタス、アルファルファ、インゲンマメ、ホウレンソウ、タンポポ、アカチコリー、キバナスズシロ、エンダイブ、キクチシャ、チコリー、アーティチョーク、トウモロコシ、ポテト、イネ、ダイズ、Crucifera(例えば、Brassica、アラビドプシス(シロイヌナズナ))、ウキクサ、トウモロコシ、ポテト、イネ、ダイズ、ホウレンソウ、トマト及びタバコを含むがそれらに限定されない。Brassica科の例となる植物は、B.oleracea(例えば、キャベツ、コラード、カリフラワー、ブロッコリー、芽キャベツ、ケール、コールラビ)、B.campestris(例えば、ハクサイ、ターサイ、Chinese cabbage、celery cabbage、Siberian kale、カブ、カラシナ、ナタネ、スウェーデンカブ及びハツカダイコン)、Brassica juncea(例えば、Brown and Indian Mastard)、Brassica carinata(例えば、Abyssinian Mastard)、Brassica napus(スウェーデンカブ、Swede、Swede Turnip、Siberian kale、Hanover Salad、カノーラ)、Brassica nigra(例えば、Black Mastard)、Rorippa nasturtiumaquatkum(例えば、Water Cress)等を含むがそれらに限定されない。植物材料の特に好ましい供給源はレタスである。適したレタス植物は、Butterhead、Crisphead及びLeaf lettuce(例えば、Oak leaf、Salad Bowl、frilly Red Leaf及びcrinkly Green Leaf)を含むがそれらに限定されない。レタスのさらなる種類は当業界で公知であり、例えばhttp://www.thompson−morgan.com/seeds/us/list_lettuce_2.htmlに記載される。
本発明の好ましい実施形態では、野生型レタス、突然変異又は修飾された変異体レタス(例えば、トランスジェニックレタス等)が処理され、所望のDNA構築物から所定の遺伝子を発現する。このような構築物は、遺伝子の転写及び最終的な蛋白質の翻訳を容易にするために、プロモーター及び/又は他の調節要素(すなわち、発現制御配列)に作動可能に結合した、所望の蛋白質をコードする核酸配列を少なくとも含んでいる。
本発明によって産生される蛋白質については予想される制限はないが、管理され、そして再生産が可能であるという条件下で特定の産物を産生する必要性があることから、特に適した蛋白質の範疇がある。特にこれには、医薬品の製造及び品質管理に関する基準や承認された方法がその生産過程で使用されなければならない製薬及び/診断のための全種類の蛋白質が含まれる。
特定の構築物を作成するのに適した調節要素は、発現される組換え蛋白質の種類に基づいて選択されるだろう。一般に、浸潤される植物体組織において高いレベルで発現する能力が望まれる。
使用される遺伝子構築物は、生物学的に活性な蛋白質フラグメントをコードしている遺伝子全体又はその一部からなる、遺伝的な材料全てを含んでいるかもしれない。好ましくは、コード配列は発現制御配列に作動可能に結合している。発現制御配列はプロモーター、エンハンサー、IRES要素等の配列を含む。発現制御配列は、発現を誘導するための外部からの刺激として特定の栄養素又は薬剤の付加、温度変化等を要求することもできるし、植物体組織の浸潤及び/又は培養中に迅速に及び/又は自然発生的にコードされる蛋白質を発現するよう設計することもできる。
好ましい実施形態では、発現産物は、細胞膜、細胞外空間又は細胞小器官、例えばクロロプラスト等のプラスチドのような植物細胞の特異的な場所へと向けられる。好ましい実施形態では、発現産物は、細胞外空間へと向けられ、その結果、細胞内液の分離に基づく精製を可能にする。例えば、米国特許第6,096,546号、米国特許第6,284,875号及び国際公開第0,009,725号公報参照。
発現構成体は発現ベクターの一部であってもよく、細菌の複製開始点(アグロバクテリウム及び/又はE.coliの複製開始点)、アグロバクテリウム及び/又は植物細胞等の細菌中で機能的であるレポーター遺伝子(例えば、GUS、GFP、EGFP、BFP、β−ガラクトシダーゼ及びそれらの修飾体)及び選択可能なマーカー遺伝子(例えば、抗生物質耐性遺伝子等)等のさらなる所望の配列を包含することができる。このために、本発明の方法で使用される外来DNAは、マーカー遺伝子を包含していてもよく、そのマーカー遺伝子の発現により、クローニングの開始段階で、非形質転換細胞から形質転換細胞の分離が可能となる。このようなマーカー遺伝子は、一般に、形質転換細胞を非形質転換細胞から表現型により区別することを可能とする蛋白質をコードしている。植物体に於いては、選択可能なマーカー遺伝子は、このように、ホスフィノトリシン等のグルタミンシンセターゼ阻害剤を含む除草剤等の除草剤に抵抗性を与える蛋白質をコードしていてもよい(例えば、欧州特許第0242236号、欧州特許第0242246号、De Blockら,1987,EMBO J.6:2513−2518)。しかしながら、マーカー遺伝子が、発現構成体/ベクターが導入された植物体組織から異種蛋白質を分離するのに必要とされないことは、本発明に従った一過性の蛋白質生産方法の利点である。
一態様では、複数の発現構成体が、本発明に従った一過性の蛋白質発現システムにおいて変異体蛋白質配列の発現及び試験をするために、実質的に同一のコード配列(例えば、約50%以上同一、約75%以上同一、約90、95%又は99%以上同一)を含んで作成される。
特定の抗原に対する最も高い親和性を提供する構築物を同定するために、第2の選択工程を行う。
アグロバクテリウムによる植物の形質転換及び安定なトランスジェニック植物の作成におけるその使用は、十分に証明されてきた。植物細胞とT−DNA境界配列を含むアグロバクテリウム細胞の相互作用の結果、植物核へ蛋白質と複合体を形成したアグロバクテリウム T−DNAの1本鎖コピーが移入する。安定な形質転換のために、T−DNAは核のDNAへ融合する。
ある特に好ましい実施形態では、界面活性剤が、植物体組織から異種蛋白質の収量を高めるために、アグロバクテリウム懸濁液に添加される。一態様では、アグロバクテリウム細胞又はその一部は、発現構成体/発現ベクターを発現するために、宿主の植物体組織に浸潤される。好ましくは、この工程は減圧状態で実施される。
上記界面活性剤のいずれかを組み合わせて使用してもよい。特に上記に列挙されていない界面活性剤も本発明の範囲に包含される。
ある好ましい態様では、Tween20等の非イオン性界面活性剤が使用される。
採収した後、蛋白質の分離が当業界で日常的に使用されている方法を用いて実施されるかもしれない。例えば、生物量の少なくとも一部はホモジナイズされ、組換え蛋白質が抽出され、さらに精製されるかもしれない。抽出は、適する溶媒にホモジネートを浸すか又は沈めることを包含するかもしれない。蛋白質は、例えば、米国特許第6,284,875号に記載されるような、減圧浸潤方法によって、植物の組織液からも分離されるかもしれない。
(実施例)
本発明は、実用的な実施例の方法によってしめされるが、これらの実施例は説明を目的としたものであり、本発明をなんら限定するものではない。
本明細書に記載される方法は、上記のKapilaら、(1997)の教示による一過性発現システムを著しく改変するものであり、結果として劇的に改良された、低コストで、またより少ない工程で高品質な産物を発現させるものである。
植物発現ベクターの構築
所定の遺伝子を含むプラスミドベクターを標準的な分子生物学的手法を用いて構築した。基礎となる要素は、E.coli及びアグロバクテリウムの両者において複製を可能とする開始プラスミド、プロモーターによって制御される所定の遺伝子の側面に位置する右及び左T−DNA境界及び標的化配列を含む。図1A及び1Bに示されるプラスミドを作製にあたって、必要な要素を集めて組みあわせる。
所望のバイナリーベクター作製用のAgrobacterium tumefaciens C58/C1培養物を、プラスミド及び適当な細菌を選択するために、適当な抗生物質(100μg/mLのカナマイシン、15μg/mLのリファンピシン、25μg/mLのゲンタマイシン)を含む、修飾YEB培地(6g/Lの酵母抽出物、5g/Lのペプトン、5g/Lのショ糖、2mMの硫酸マグネシウム)で28℃で2日間成長させた。この培養物を、抗生物質、50mMのリン酸カリウム緩衝液pH5.6、20μMのアセトシリンゴンを補充した修飾YEB培地で1:50に希釈し、およそ18−24時間、O.D.600nmがおよそ2.5−3.5になるまで培養した。必要に応じて、(220μMのアセトシリンゴン及び60g/Lのショ糖という最大量を与えるために)細菌細胞をO.D.600nmが2.4になるよう希釈し、55g/Lのショ糖及び200μMのアセトシリンゴンを補充した。懸濁液を室温(約22℃)にて1時間インキュベートし、100μgの2,4−D(2,4−ジクロロフェノキシ酢酸、Sigma)及び0.005%Tween20を使用前に添加した。
アグロバクテリウム懸濁液を減圧浸潤に直接使用した。軽鎖が1つのプラスミド上にあり重鎖が2つめのプラスミド上にある場合(デュアルベクターシステム(dual vector system))、2つのアグロバクテリウム培養物を調製し、浸潤前に等量ずつ混合しなければならない。この例では、カッパー軽鎖をコードする軽鎖ベクターはhOATと呼ばれる抗組織因子抗体に由来し、重鎖ベクターはhOATのIgG1重鎖をコードした。レタスの葉球全体を2Lビーカー中の1.2Lの懸濁液に浸し、減圧乾燥器中に置いた。減圧(7kPaに等しい)を20分間適用した後、減圧の急激な解除による減圧衝撃を続けた。レタスの葉を水で洗浄し、閉じた透明な箱内の湿ったペーパータオル上で室温にて16時間日光をあてながら3−4日間インキュベートした。3−4日間後、葉を基部から切り、蛋白質抽出のためにホモジナイズした。
蛋白質を、葉の重量と等しい体積の緩衝液を用いて、緩衝液(100mMのTris−HCl、5mMのEDTA、pH8.0、使用前に1.5%不溶性PVPを添加)中で抽出した。葉をワーリングブレンダー中で高速で1分間ホモジナイズし、得られたホモジネートを10,000xgで15分間遠心分離した。沈降しなかった細胞破片を有する上清を12層の薄地の綿布で濾過し、20,000xgで15分間遠心分離した。濾液をrProteinA sepharose fast flow affinity column(5mL、樹脂はAmersham Pharmacia Biotech AB、Swedenより)に流速2mL/minでかけた。使用した洗浄緩衝液、溶出緩衝液はそれぞれ0.1Mの酢酸ナトリウム及び0.1Mの酢酸であった。蛋白質を、段階的な勾配pH法、すなわち2カラム容積に対して20%の0.1M酢酸、4カラム容積に対して40%、60%及び100%の0.1M酢酸を続けることによって、溶出した(図3)。ピーク画分を集め、1MのTris−HCl、pH8.0を用いてpHを8.0に調整した。精製した抗体を280nmのO.D.を用いて定量した。さらなる精製のために、Q Sepharose fast flow column(5mL、樹脂はAmersham Pharmacia Biotech AB、Swedenより)を20mMTris−HClpH8.5で平衡化し、同じ緩衝液でプロテインA精製した抗体の緩衝液を交換し、カラムにかけた。抗体を、塩段階的溶出法、すなわち2カラム容積に対して20mMのTris−HCl、pH8.0、1MのNaClの10%緩衝液、4カラム容積に対して50%緩衝液、2カラム容積に対して100%緩衝液を続けることによって、溶出した。ピーク画分を集め、280nmのO.D.を用いて定量した(図4)。緩衝液交換のために、Millipore Ultrafree Centrifugal filter device 15mL(Millipore Corporation、Bedford、MA)を少なくとも1時間0.1MのNaOHに浸した。Qセファロースカラムで精製した抗体の緩衝液の交換はPBSで行い、1000倍希釈以上を得た。緩衝液を交換した抗体をMillex−GV 0.22μm filter unit(Millipore Corporation、Bedford、MA)で濾過し、280nmのO.D.を用いて定量した。
ショ糖の濃度とショ糖による浸透圧衝撃の効果は、発現を増加させるための重要なパラメーターであろうと認識された。蛋白質の生産レベルにおけるショ糖濃度の効果を試験するため、ショ糖の濃度範囲を抗組織因子抗体の発現におけるその効果について試験した点を除いて、実施例1の手順に従った。図6の結果に基づき、ショ糖の最終濃度60g/Lを標準的な方法として選択した。
界面活性剤の効果を特徴付けるため、使用する界面活性剤の種類と濃度の両者を多様化している点を除いて、実施例1に記載される手順に従った。
多くの異なるプロモーター(5’転写調節領域)が入手可能であり、植物における異種蛋白質の発現に広く用いられている。文献の調査及び限られた試験を、本発明の方法に適したプロモーターを決定するために行った。表4は、化学的な誘導物質2,4−Dを用いた合成プロモーターOCS3MASからのhOATの発現を示す。(OCS)3MASプロモーターは様々な因子、とりわけ創傷によって誘導されることが知られていたが、この研究はアグロバクテリウムを用いた遺伝子の一過性の送達も結果的に発現を誘導するものである。この研究は、実施例1で示されるように細菌の調製及び浸潤に関しては元来のKapilaの方法(MS方法)を用いて行われた、よって、他の実施例で見られるより発現レベルは低いものであった。この研究に基づき、最終濃度100μg/mLの2,4−Dが、……
この実施例では、(実施例1に記載されるような)デュアルベクターシステムの使用を単一のベクターからの重鎖及び軽鎖の発現(2シストロン性システム)と比較した。プラスミドpSUNP4(図2)は同じプラスミドのT−DNA領域に重鎖及び軽鎖を有するプラスミドベクターを表す。(OCS)3MASプロモーターが、ズブチリシン(subtilisin)をコードするシグナル配列と共に抗組織因子遺伝子の重鎖及び軽鎖の両者の発現を制御するために使用される。
この実施例では、一過性発現が他の抗体を生産するのに使用できることを示した。cαStx2は、腸管出血性大腸菌によって産生される志賀毒素2に結合し中和するキメラ抗体である。cαStx2重鎖及び軽鎖の遺伝子を、pSUNP1及びpSUNP2に類似したcαStx2ベクターを作成するために、デュアルベクターに導入した。これらの構築物を、実施例1に記載の方法を用いて、アグロバクテリウムに移入し、レタスをagro−infiltrationするために使用した。一過性発現後、プロテインA精製により得た抗体と共に、植物細胞からの粗抽出物をELISAにより解析した。
Claims (41)
- 界面活性剤の存在下アグロバクテリウム細胞で植物体組織を浸潤すること、そこで当該アグロバクテリウム細胞は当該植物体組織の細胞及び/又は細胞間に異種ポリペプチドを発現できる発現構成体を含み、及び
当該植物体組織を当該ポリペプチドを発現するのに適した条件下でインキュベートすること、
を包含する、植物体に於いて異種蛋白質を発現する方法。 - アグロバクテリウム細胞で植物体組織を浸潤すること、そこで当該アグロバクテリウム細胞は当該植物体組織の植物細胞及び/又は細胞間に異種ポリペプチドを発現できる発現構成体を含み、
当該植物体組織を当該ポリペプチドを発現するのに適した条件下でインキュベートすること、及び、
処理された1キログラムの植物体組織から約1mg以上の当該ポリペプチドを分離すること、
を包含する、植物体に於いて異種蛋白質を発現する方法。 - アグロバクテリウム細胞で植物体組織を浸潤すること、そこで当該アグロバクテリウム細胞は当該植物体組織の植物細胞及び/又は細胞間に異種ポリペプチドを発現できる発現構成体を含み、及び
当該植物体組織を当該ポリペプチドを発現するのに適した条件下でインキュベートすること、を包含し、
そこで、当該植物体組織は収穫後少なくとも約1週間である植物から得られる、植物体に於いて異種蛋白質を発現する方法。 - 植物体組織の植物細胞及び/又は細胞間に異種ポリペプチドを発現できる発現構成体を含むアグロバクテリウム細胞を培養培地中で培養すること、
当該アグロバクテリウム細胞を含む培養培地を希釈工程あり又はなしに当該植物体組織と直接接触させること、
当該アグロバクテリウム細胞を含む当該培養培地で当該植物細胞を浸潤すること、及び、
当該植物体組織を当該ポリペプチドを発現するのに適した条件下でインキュベートすること、
を包含する、植物体に於いて異種蛋白質を発現する方法。 - 前記異種ポリペプチドが前記植物体組織から分離される、請求項1から3及び5の何れか一項に記載の方法。
- 前記ベクターが少なくとも1つのT−DNA境界を含む、請求項1から5の何れか一項に記載の方法。
- さらに、前記ベクターを少なくとも1つのアグロバクテリウム細胞に導入する、及び、当該細胞を前記植物体組織を浸潤するために十分な量の細胞が得られるまで培養する、工程を包含する、請求項1から5の何れか一項に記載の方法。
- 前記植物体が、レタス、アルファルファ、インゲンマメ、ホウレンソウ、タンポポ、アカチコリー、キバナスズシロ、エンダイブ、キクチシャ、チコリー、アーティチョーク、トウモロコシ、ポテト、イネ、ダイズ、Crucifera、ウキクサ、トウモロコシ、ポテト、イネ、ダイズ、ホウレンソウ、トマト及びタバコからなる群より選択される、請求項1から5の何れか一項に記載の方法。
- 前記アブラナ科(Crucifera)の植物が、ブラッシカ(アブラナ属)又はアラビドプシス(シロイヌナズナ)を包含する、請求項8に記載の方法。
- 前記アグロバクテリウムが一晩培養され、使用前に600nmでの吸光度が約2.5まで希釈される、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 前記アグロバクテリウムが減圧下に浸潤される、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 前記浸潤が界面活性剤の存在下で行われる、請求項2から4の何れか一項に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、Tween−20、Tween−80、Triton X−100、NP−40、Silwet L−77からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、Tween−20、Tween−80、Triton X−100、NP−40、Silwet L−77からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、約0.005%のTween−20である、請求項1に記載の方法。
- 前記界面活性剤が、約0.005%のTween−20である、請求項12に記載の方法。
- 前記浸潤が、浸透圧衝撃を誘導するための薬剤の存在下で実施される、請求項1から5の何れか一項に記載の方法。
- 前記浸透圧衝撃を誘導するための薬剤がショ糖である、請求項17に記載の方法。
- 前記ショ糖が濃度約60g/Lである、請求項18に記載の方法。
- 前記蛋白質が植物体の全部又は葉をすりつぶすことによって回収される、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 前記蛋白質が前記植物体の細胞間液から回収される、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 前記蛋白質が前記植物細胞の小胞体へ標的化されている、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 同義遺伝子(multiple genes)がアグロバクテリウムによって前記植物に送達される、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 複数のアグロバクテリウム株が組み合わされ、所望の植物に同時浸潤される、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 同義遺伝子が前記アグロバクテリウム株によって送達される、請求項24に記載の方法。
- 前記同義遺伝子が、会合してマルチサブユニット蛋白質を形成する蛋白質をコードする、請求項23に記載の方法。
- 発現した前記蛋白質が免疫グロブリンスーパーファミリーの蛋白質を包含する、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 前記蛋白質が、抗体、T細胞受容体及び主要組織適合性複合体、又はそれらの生物学的に機能的なフラグメント又は一本鎖誘導体である、請求項27に記載の方法。
- 前記同義遺伝子が経路の一員を包含する蛋白質をコードする、請求項25に記載の方法。
- 前記経路が化学合成経路又は情報伝達経路である、請求項29に記載の方法。
- 前記蛋白質がグリコシル化されている、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- すでに発現している前記発現構成体を得る、及び、それを植物体に安定に導入する、工程を更に包含する、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 前記植物体組織がトランスジェニック植物由来である、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 複数の発現構成体が、少なくとも約50%の相同性を有し、及び、1又はそれ以上の突然変異の存在によって互いに異なる、及び/又は、1又はそれ以上の変異体アミノ酸をコードする、コード配列を含み、当該複数の発現構成体を用いて複数の植物体組織サンプルにおいて請求項1から4の何れか一項に記載の方法を実施することを包含する、突然変異又は変異体の配列についてスクリーニングする方法。
- 前記1又はそれ以上の突然変異が、欠失、挿入、置換又は転位を包含する、請求項34に記載の方法。
- 1又はそれ以上の突然変異を含まず及び変異体アミノ酸配列をコードしない異種ポリペプチドと比較して、改良された特性を有する異種ポリペプチドをコードする発現構成体が同定されるものである、請求項34に記載の方法。
- 前記改良された特性が増加した活性及び/又は安定性を包含する、請求項36に記載の方法。
- 前記増加した活性が、異種蛋白質に特異的に結合する結合パートナーに対する異種蛋白質の増加した結合親和性を包含する、請求項37に記載の方法。
- 前記蛋白質が免疫グロブリンスーパーファミリーの一員を包含する、請求項38に記載の方法。
- 前記蛋白質が、抗体、T細胞受容体及び主要組織適合性複合体、又はそれらの生物学的に機能的なフラグメント又は一本鎖誘導体からなる群より選択される、請求項39に記載の方法。
- 前記1又はそれ以上の突然変異が、ヒトではない動物由来の異種コード配列にヒト配列を挿入することを包含する、請求項33に記載の方法。
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