CN1997742A - 植物中药用的重要蛋白质的瞬间制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种在真核***中制备生物医药学蛋白质及其它重要蛋白质的快速且多用途的方法。本发明的特征为用于单克隆抗体及其它医药学上重要蛋白质的瞬时制造的有效且不昂贵的方法，本方法为将带有兴趣蛋白质基因的农杆菌导入已生长的植物宿主中而后回收兴趣蛋白质。

Description

植物中药用的重要蛋白质的瞬间制造方法
相关申请案
本发明请求美国临时申请案，序号60/436,403，申请于2002年12月23日的优先权，其内容将合并于此作为参考。
技术领域
本发明涉及在植物中大量瞬时生成蛋白质产物的方法及试剂盒。
背景技术
医药学上重要的重组蛋白质通常是用微生物或哺乳动物宿主进行表达的。微生物***通常在克隆和转染细胞的速度上有优势。然而异种基因产物的量通常很高，所累积的产物常无生物活性，而需要高价及困难的重新折迭(re-folding)使之成为活性物质。再者，许多在细菌类中的转译后修饰与在真核类中的是不同的，所以某些蛋白质在原核***中无法正确表达。
使用杂合***表达医药学上重要蛋白质的主要问题是由克隆基因开始到产生足够量可用于相关动物模型的功能性蛋白质所需要的时间。在多数***中，这个时间可为数月至一年或更久。除了费时外，在细胞培养中重组蛋白质的瞬时制造(例如，藉由COS或CHO细胞的瞬时转染或藉由昆虫细胞培养的杆状病毒感染)通常需要特殊的设备而且该种细胞及病毒的操作也需要特殊的技术。此外，除非完成大规模制备过程，否则所取得的蛋白质的量通常非常少(毫微克至微克量)，而大规模制备则更昂贵且需要特殊的设备及训练。
从1980年后期，已有多种示例揭示可在农作物中具有成本效益地表达外来或异种蛋白质。特别是近年来，植物成为单克隆抗体及其它医药学上重要蛋白质的制造和表达***。植物具有非常类似于动物细胞的蛋白质合成途径，而主要差异在于蛋白质的糖化作用(glycosylation)(Fischer and Emans，Transgenic Res. 9：279-299(2000)；Cabanes-Macheteau，et al.，Glycobiology  9：365-72(1999))。此外，一些感兴趣的蛋白质已显示在植物中能累积至高浓度。又，植物来源的抗体在功能上与藉由杂交瘤制造的抗体相同(Fischer and Emans，supra，(2000))。最后，植物来源的抗体和蛋白质不含有其它***中经纯化得来的重组蛋白质所具有的人类或动物病原体或纯化后的血源性病原体及致癌性序列(Fischer and Emans，supra(2000))。
重组蛋白质可在转基因植物中藉由稳定的整合基因制备。另一种产生蛋白质的方法是使用由异种基因形成的瞬时表达***。已有多种***可用于基因克隆、质粒构建、启动子等，这些***的最终目的是表达重组蛋白质。特别是，原生质粒(protoplast)的电穿孔法(electroporation)及粒子轰炸法(particle bombardment)已被广泛使用，病毒载体也在一定程度上被应用。
粒子轰炸法通常仅能到达少数细胞，而且为了完成转录，DNA必需到达细胞核(Christou，Plant Mol.Biol. 35：197-203(1996)；Fischer and Emans，spura(2000))。利用藉由渗入法(infiltration)传送的农杆菌属(Agrobacterium)(农杆菌-渗入法)可显着地将外来基因传送至较多数目的细胞。此外，带有T-DNA的感兴趣基因在细菌蛋白质的协助下能有效地转移至核(Kapila et al.，Plant Sci. 122：101-108(1997)；Fischer andEmans，supra(2000))。粒子轰炸法及农杆菌-渗入法两者皆在处理后3至5天内产生异种基因表达，而病毒传送需要2至4周。粒子轰炸法的使用对于瞬时表达不是非常有效但是对于转基因谷类作物的再生更为重要(Christou，supra(1996)；Fischerand Emans，supra(2000))。
用经修饰的病毒载体转染可使病毒在多数植物细胞中广泛扩散。导入基因酶细胞质中病毒RNA复制酶(replicase)转录后翻译为兴趣蛋白。由于病毒复制期间浓度倍增，所以目标基因会在重组病毒载体中高浓度表达(Porta and Lomonssoff，Mol.Biotechnol. 5：209-21(1996))。然而，此***通常限制蛋白质的分子质量小于60至70Kd。
用于瞬时表达的农杆菌-渗入法有数种优势。此方法在数天内制造兴趣蛋白质而且蛋白质生产量足以用于蛋白质稳定性及蛋白质功能的检测(Fischer and Emans，supra(2000))。已有人提出农杆菌-渗入法无须用稳定转染的植物而能放大制造数十毫克重组白质。然而，报导的表达浓度(Fischer andEmans，supra(2000))并不实用于任何大规模研究，例如需要更大量蛋白质(10至100毫克)的活体内动物模型。
农杆菌-渗入法用于瞬时表达最早是Kapila提出的。(Kapila et al.，supra(1997))经开发后用于快速测定具有植物组织抗病性的蛋白质的功能。由于全部的植物组织可用于生物检定所以蛋白质无须为此应用而经纯化。
此***后来用于表达医药学上重要的蛋白质(Vaquero etal.，Mol.Biotechnol. 5：209-21(1996))。抗人类瘤胚源性抗原的嵌合抗体及抗相同抗原的重组单链抗体经生产、纯化、生化分析显示类似动物来源蛋白质。然而，此***的产量仍相对较低。
发明内容
本发明提供了一个无须植物生长设备，应用现有的市售的植物来制造蛋白质的更完善的方法。此方法非常快速的以最低花费合成一定数量的，适用于动物中测试、多重分析、结晶结构的认定、蛋白质修饰的分析等的生物功能性蛋白质。此方法可用于一次蛋白质的生产量最少约为1毫克，至少约5毫克，至少约10毫克的生产。
本发明能很容易地有稳定规模地提供满足重复测试及医药学上蛋白质的功能性评估所需要的毫克量蛋白质。
本发明提供用于单克隆抗体及其它医药学上重要蛋白质的瞬时表达的方法及试剂盒。此方法特别成功的应用于含有整合到有或无病毒调节序列的质粒上的兴趣基因的根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)以真空-渗入的方式在莴苣中制造蛋白质。
一方面，本发明提供的细菌/植物融合表达***能非常快速且具规模的制造每公斤10至50mg/kg的蛋白质。在优选方面，一或多种异种基因经由解毒或有毒的农杆菌株传送至植物组织。优选的是，植物组织来自已生长的植物(例如从售货店得到的植物)。植物组织特别优选的来源为莴苣。本发明披露的方法具有在细菌***中快速进行基因克隆和操作以及在能为准确地定靶、增殖、修饰及装配提供所需环境的真核细胞中进行蛋白质制造的双重优势，而且无须种植植物或应用转基因植物。
一方面，带有异种基因或兴趣基因表达结构的农杆菌细胞被用于将异种基因传送至植物组织并植物组织的细胞中及/或细胞间隙瞬时表达。一般而言，合适的表达结构包含：至少一个T-DNA边缘序列，表达控制序列(例如，可诱导的，和/或组织特异性的，或可构建的启动子)，和一个可操作连结至表达控制序列的兴趣基因。另一方面，表达结构为载体部分，其含有一或多个复制起点，至少含有适合于在农杆菌中复制含有表达结构载体的一个复制起点。
培养的含有表达结构的农杆菌细胞系在表面活性剂存在下渗入植物组织。优选地，渗入在真空下发生。在能使表达结构在多种植物细胞中表达蛋白质的适宜条件下孵育植物组织后，将蛋白质从细胞中分离。为了取得约500微克至500毫克的产量，本方法仅需要单循环地将植物组织与含有载体的农杆菌接触，使载体渗入植物组织及表达异种蛋白质。然而，想放大产量就要进行额外的循环。优选地，在本方法的单循环中使用更多植物组织。
所使用的农杆菌可为野生型(例如有毒性的)或无毒的。每种表达不同基因的多种农杆菌株可用来制造单独的蛋白质或异源多体蛋白质(例如抗体)或再生途径，例如代谢途径、化学合成途径或信号途径。可选择的是，或者为单一的农杆菌株可含有含有不同异种基因的多个序列。不同的异种基因可包含于单一核酸分子内(例如单一载体)或可由不同的载体提供。一方面，至少一种农杆菌株包含根瘤土壤杆菌。
由于本发明提供了表达异种蛋白的高产量的表达***(high throughput system)，此***能用于测定基因和/或兴趣蛋白质(protein of interest)的变异对于蛋白质功能的影响。一方面，为了评估大量变异的异种蛋白质，大多数的表达结构是在细菌中，使用标准的分子生物技术(例如随机突变(randommutagenesis)，组合克隆技术(combinatorial cloning techniques)等制造的，含有编码实质上同一蛋白质(例如同一性超过约50％，优选的同一性超过75％相同，更优选的同一性超过约90％或95％相同)的核酸，而且能使用根据本发明的瞬时表达***制造用以快速筛选其生物活性。另一方面，大多数表达结构包含的变异编码序列约大于100、约大于500、约大于1×103、约大于1×104、约大于1×105、约大于1×106、约大于1×107、约大于1×108、或约大于1×109。
大多数的表达结构可包含在异种多肽的编码序列中含有随机或半随机变异的序列库。此序列库可为基于大肠杆菌的序列库(亦即各个序列库中成员系在大肠杆菌中经克隆及复制)或基于农杆菌的序列库(亦即各个序列库中成员系在农杆菌中经克隆及复制)或其结合(亦即克隆可在大肠杆菌中开始进行而序列库成员后续地可导入农杆菌细胞以进行进一步的复制及/或克隆)。在植物组织中瞬时表达后检测序列库各个成员的多肽功能，例如鉴定多肽是否适合较大规模的制造及/或在转基因植物中制造。
优选方面，此方法用于将多-次单元蛋白质复合体的交互次单元组件(interacting subunit elements；ISEs)的功能最适化以使活性及/或结合部最适化。例如，为了最适化抗体结合部，在细菌中使用标准分子生物技术(例如随机突变(randommutagenesis)，组合式选质技术(combinatorial cloningtechniques)等)制备大量的具有抗体可变区的变异体。优选的是，能制造约大于1×103、约大于1×104、约大于1×105、约大于1×106、约大于1×107、约大于1×108或约大于1×109的变异表达结构。适当的可变区序列包括抗体的轻链(lightchain；LC)，或重链(heavy chain；HC)，或轻链与重链两者。分析含有这些序列的变异多肽中对选定抗原的特异的结合部位。变异多肽可包括全长抗体或其抗原结合片段(scFv，Fab’等)。不同的变异体可依前述而稳定地克隆至农杆菌载体上，且能快速测定HC及LC的所有结合。优选的，测定为平行发生。
本方法能用于最合适于在生长的植物中蛋白质表达的预筛选表达载体。一方面，本方法用于快速筛选不同的表达控制序列和/或翻译控制序列，从而提供了最适的蛋白质表达。或者，用此方法筛选编码具有较高稳定性的或其它需要的医药学特性的蛋白质的序列。
本发明也提供有用于进行本方法的试剂盒。一方面，根据本发明的需要，试剂盒包括至少适用于一种农杆菌种，例如根瘤土壤杆菌，表达的克隆/表达载体，一或多种用于从植物中渗入、萃取及/或纯化所要异种蛋白质的成分。另一方面，该试剂盒包含一或多种细菌菌株(例如大肠杆菌及根瘤土壤杆菌)。进一步，该试剂盒含有具有编码变异异种序列的核酸的表达结构。
附图说明
本发明的目的及特征可参照下列的详细说明及附图而更加了解。
图1A及1B为根据本发明一方面使用于植物组织的共渗入的质粒pSUNP1及pSUNP2的示意图。质粒pSUNP1表达来自OCS3MAS启动子的hOAT的重链而pSUNP2表达轻链。使介于TR及TL之间的所有基因移动至植物核的T-DNA边缘被表示出来。带有各质粒的农杆菌用于共-渗入植物例如莴苣中，而产hOAT的瞬时表达。
图2为在植物组织中由单一质粒藉由瞬时表达而用于表达hOAT的重链及轻链两者的双基因表达质粒pSUNP4的示意图。
图3显示从含有hOAT重链及轻链基因的农杆菌渗入的莴苣中萃取的蛋白质的溶离剖面图。蛋白质被施用至蛋白质A管柱而被溶离。
图4显示根据本发明，蛋白质被施用至Q琼脂糖管柱的溶离剖面图。所施用的蛋白质由图3所示的蛋白质A管柱所得溶离液收集。
图5A显示在还原条件下，根据本发明所取得的hOAT蛋白质分离液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并且经科麦西蓝(coomassie-blue)染色的胶片。第1栏，分子量(Mr)标准品；第2栏，纯化的CHO制造的hOAT；第3栏，在莴苣中表达，经蛋白质A管柱溶离的hOAT。图5B显示根据本发明，以抗H+L抗体为探针对经SDS-PAGE-分离的蛋白质进行蛋白质印迹杂交。A栏，市售的IgG；B栏，纯化的蛋白质A灌注得到的hOAT；C栏，阴性对照-来自无农杆菌-渗入的莴苣萃取液。
图6显示不同浓度的蔗糖对于莴苣中hOAT的表达浓度的渗入性干扰的效果。hOAT表达以每公斤用于萃取的莴苣原料所制造的抗体毫克数(以ELISA为基准)表示。
具体实施方式
本发明提供利用在已生长，市售可得的植物中得到制造蛋白质的方法及提供在短时间内获得用于生物分析中所需要量的异种蛋白质的问题的新的技术方案。本发明的方法提供使用于需要至少约50微克至100毫克蛋白质的分析，例如药物筛选，蛋白质特征化、结合分析以及动物测试的生物活性异种蛋白。
本发明的一方面，此方法包括将含有编码异种蛋白质的序列或其生物活性片段的表达结构导入植物组织，而后在植物组织中瞬时的表达蛋白质。此编码序列系可操作地连结至能在植物组织细胞中及/或细胞间隙驱动编码序列转录的表达控制序列。优选地，表达结构包含至少一个来自大的肿瘤引发(Ti)质粒的T-DNA的T边缘序列。同时，优选地，表达结构包含能在至少一种农杆菌种中，例如根瘤土壤杆菌，复制的载体。一方面，植物组织包括来自己生长的植物(例如取得售货店的植物)的叶组织。优选地，此植物包含相对大的叶片(例如，在一维中至少大过约3英时)，例如该植物是莴苣(Lactuca sativa)。
定义
以下是使用于下列叙述说明中的特有名词的定义。
除非文中特别指明，使用于说明书及权利要求书中的，单数形式的「一」(a)、「一」(an)及「该」(the)包含复数的意思。例如术语「细胞」包含多个细胞的含义，包含其混合物。术语「蛋白质」含有多数蛋白质的含义。
用于本文的术语「植物细胞」包含植物细胞或经分离的或半分单离的细胞。「植物组织」包含植物的经分化或未经分化的组织，包含但不限于，根、茎、叶、花粉、及种子。
用于本文的「植物材料」包含其经处理的衍生物，包含但不限于：食品、食品原料、食品补充剂、萃取物、浓缩物、药丸、菱形剂、可嚼组成物、粉末、配方、糖浆、糖果、饼干、胶囊及锭剂。
用于本文的「多次单元蛋白质」为含有超过一种分开的多肽或蛋白质链彼此结合形成复合体的蛋白质，其中至少有两种分开的多肽由不同基因编码。优选的，多次单元蛋白质至少包含抗体的免疫活性部分而因此能特异地与抗原结合。例如，多次单元白质能包含抗体分子的重链及轻链或其部分。多重抗原结合部分可由不同结构基因编码而产生多价抗体。
对于医药学产品而言，术语「充分地纯化」一般是指至少90％纯化，更优选的为至少95％纯化及最优选的为至少98％纯化的产品。
「间质性液体」(interstitial fluid)意指由不为质膜(plasmalemma)，亦即细胞表面膜，所包围的所有植物区域获得的萃取物。此术语意欲包含非细胞内的所有液体、物质、区域或间隔(其中细胞内系定义为细胞膜内的内含物)，且包含无须显着的细胞溶解藉由由质膜释放的分子。此术语的同意词包含，但不限于「外浆」(exoplasm)、「非原质粒」(apoplasm)、「细胞间液」(intercellular fluid)、「细胞外液」(extracellularfluid)及「吐水液」(guttation fiuid)。
术语「启动子」系指位于基因的5’端而直接启动基因的转录核苷酸序列。一般而言，为驱动连结基因的表达，启动子序列是必要的，但不一定足够。在启动子/异种基因组合的结构中，该基因的位置相对于启动子要足够接近且有恰当的方向，因而能藉由启动子序列控制基因的表达。启动子优选的定位于基因的上游而且距离转录起始点有一定的距离，从而使启动子及基因间的距离控制在接近其天然的设定中。正如已知的，在此距离中的一些变异不致使启动子的功能有损失。如用于文中的术语「可操作连接」意指将启动子连结至编码区域以使该编码区域的转录为该启动子所控制和调节。将启动子可操作性与编码区域连结的方法已被本领域所公知。
用于文中的「表达控制序列」包括启动子及还可包括，但不限于：一或多个增强序列、转录终止序列、多腺嘌呤化序列、3’或5’非翻译序列、内含子(intronic)序列、核糖体结合位置及其它在植物细胞中能稳定或者控制基因表达的序列。表达控制序列可为内源的(亦即天然地在植物宿主中发生的)或外源的(并非天然地在植物宿主中发生的)。外源的表现序裂可为或不为植物序列因而其仅在经选择的条件下在植物细胞中有功用。
「异种基因」或「异种编码序列」是指对于要被转化或被处理的植物而言为外源的，或并非天然的，而且编码「异种多肽」或其生物活性片段。异种基因序列包括病毒的、原核的、及真核的序列。原核编码序列包括，但不限于，微生物序列(例如生产作为疫苗应用的抗原的序列-病毒序列也能用于此目的)。真核编码序列包括哺乳类序列，但也包括来自非哺乳类序列，甚至其它植物，包括但不限于引导或分泌信号序列、目标序列等。优选的，异种基因核酸可编码人类蛋白质。术语「异种基因」或「异种编码序列」包括，但不限于，天然发生的、经突变的、变异的、化学合成的、组基因的、cDNA、或该等序列的任何组合。而「基因」是指全长的基因或其编码生物活性蛋白质的片段。
用于文中的术语「蛋白质」通常指由基因编码的完整的氨基酸序列，或其经加工或修饰的形式或其生物活性片段(例如多肽或者肽)。
「融合蛋白质」是指含有至少两个不同氨基酸序列的连结于多肽的蛋白质，其序列组合并非天然地表现位单一蛋白质。
用于文中的「T DNA边缘」(T DNA border)是指含有约25个核苷酸长序列而能被诸如根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)或生根土壤杆菌(A.rhizogenes)等农杆菌株的有毒性基因产物识别的DNA片段，或其经修饰或突变的形式，而且足以能用于转移DNA序列至其所连结的真核细胞，优选的为植物细胞的。此定义包括，但不限于，来自野生型Ti质粒的所有天然的T-DNA边缘，及其功能性衍生物，以及化学合成的T-DNA边缘。一方面，本发明的表达结构的编码序列及表达控制序列位于两T-DNA边缘之间。
植物种类
用于瞬时表达的农杆菌渗入法的早期应用系为杨树(poplar)及豆科植物(Phaseolus)(Kapila，et al.，1997)，而后延伸至烟草，(Vaquero，et al.，1999)而杨树及豆科植物两者为快速发明提供了合适的植物组织来源。其它适合的植物包括，但不限于：莴苣、苜宿、绿豆、菠菜、蒲公英、菊苣(radicchio)、芝麻菜(arugula)、苣菜(endive)、菊苣茅菜(escarole)、野苦苣(chicory)、朝鲜蓟、玉米、马铃薯、米、大豆、十字花科(Crucifra)(例如芥蓝菜(Brassica)，芥末(Arabidopsis))、浮萍、蕃茄及烟草。芥蓝菜家族的示例包括，但不限于：B.oleracea(例如包心甘蓝、羽衣甘蓝(collards)、花椰菜、绿花椰菜、茅甘蓝(brussel sprouts)、芥蓝菜(kale)、球茎甘蓝(kohlrabi))；B.campestris(例如白菜、小白菜、结球白菜、包心白菜、西伯利亚甘蓝、芜菁、芥末、欧洲油菜(rape)、芜菁甘蓝(rutabaga)及萝卜)；Brassicajuncea(例如棕与印度芥菜)；Brassica carinata(例如地中海芥菜，Abyssinian Mustard)；油菜(芜菁甘蓝(Rutabaga)、芜菁(Swede或Swede Turnip)、西伯利亚甘蓝、焊诺瓦色拉(Hanover Salad)、油菜)；Brassicanigra(例如黑芥末)；Rorippa nasturtium-aquatkum(例如西洋菜)等。特别优选的植物原料的来源为莴苣。适合的莴苣植物包括，但不限于：包被莴苣(Butterhead)、抱合莴苣(Crisphead)及叶莴苣(例如橡叶、色拉碗、修饰红叶(frilly Read Leaf)及波状绿叶(crinkly Green Leaf)。其它典型的莴苣种已被周知和描述，例如在
http://www.thompson-morgan.com/seeds/us/list lettuce 2.html
优选的，适合的植物为整年中皆从市售可得而且能支持可连结于表达控制序列的报导基因(例如GUS)的高浓度瞬时表达。用于文中的「高浓度瞬时表达」意指在每公斤植物组织上至少能表达约250微克、至少约500微克、至少约750微克、至少约1毫克、至少约2毫克、至少约3毫克、至少约4毫克、至少约5毫克、至少约10毫克、至少约15毫克、至少约25毫克、至少约50毫克、至少约75毫克、至少约100毫克、至少约150毫克、至少约200毫克、或至少约500毫克。用于文中的「瞬时」意指长到足以允许从植物组织中分蛋白质的一段时间。优选的，将表达结构导入植物组织后，蛋白质表达适当的高浓度至少要在约1天内、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天。在一方面，将表达结构导入植物组织后，适合地高浓度可在3至7天内获得而更优选的为3至5天内。
合适的植物组织一般指植物的任何部分。优选的，植物组织为叶组织。一方面，植物组织为来自含有一维中至少约3英时的叶片的植物的叶组织。然而，叶的大小并无限定而且在某方面，此方法用于在***芥中获得瞬时蛋白质表达。
另一方面，要选择其细胞中含有少量或不含分解异种蛋白质的蛋白酶的植物组织，否则，从表达异种蛋白质的核酸导入到由植物组织分离蛋白质的时间内，少于约5％、少于约1％、少于约0.1％的在植物中表达的异种蛋白质被蛋白酶分解。蛋白酶的浓度可用常规的方法加以分析，如异种蛋白质表达的蛋白质斑点印迹法。
本发明的一个特别优势为可用已生长的植物作为植物组织来源，包括已采收及经储存至少约1天、至少约2天、至少约5天、至少约1周或至少约2周的植物。因此植物组织可由任何一般商品店获得。
因为莴苣容易取得而且提供高浓度的异种蛋白质表达、具有稳定性及功能性，所以莴苣特别合适提供叶组织来源以用于本发明的方法。此外，莴苣细胞含有非常低量的辨认异种蛋白质的蛋白酶。在多种适合使用的莴苣中，特别优选的为红叶表现型(red leaf phenotype)。在莴苣中除了观察到异种蛋白质的高浓度表达以外，使用叶莴苣的另一优势为此植物在无须特别设计的装置下能容易的长出易于操作的叶片。
玉米为最广泛的用于由稳定的转基因植物生产医药蛋白质的农作物。应用玉米，异种蛋白质可产生并被储存于种子中。然而，玉米难以被转化，生产周期长而且难以在室内产生种子。玉米为能极大的受益于瞬时表达***的农作物。目前相当普及的使用农杆菌进行玉米转化，根据本发明的瞬时表达***藉由处理玉米胚牙能加速由玉米生产蛋白质的制造而能快速地评估及确认玉米衍生的异种蛋白质的使用性及功能。
表达框
在本发明的优选的具体实例中，莴苣的野生型、变异或经修饰的品种(例如，转基因莴苣)经处理而由所欲的DNA结构表达兴趣基因。该等结构至少含有连结至支持基因的转录及最终蛋白质的翻译的启动子及/或其它调控单元(亦即表达控制序列)的编码所需蛋白质的核酸序列。
一方面，表达结构设计为含有下列连结在5’至3’的方向的：启动子，基因及终止子。另一方面，基因结构包括连结在共同质粒上或共-转化至植物(该共转化结构包含于文中的名词「基因结构」)上的多个编码区域。多种基因可编码为分开的顺反子(cistron)或为聚顺反子单位的一部份。另一方面，基因结构包含一或多个IRES单元。
基因结构不需要含有选择标记也不需要形态学上正常稳定转基因植物的制造所需要的欠缺「肿瘤诱发」基因的DNA结构。
蛋白质
藉由此发明而制造的蛋白质并无预先的限制，然而本发明特别适用于在经调控及可再现的条件下制得某些蛋白质。特别是，包括用于在制造过程中必须使用优良药品制造规范(GoodManufacturing Practices)及认证方法的医药上及/或诊断上蛋白质的所有类别。
因为有些蛋白质是使用于人类直接摄取、注射或施用(例如局部施用)，在营养医学保健或医学美容上的用途的等蛋白质也可被表达。用于相似经调控的兽医产品制造上的蛋白质也可被表达。
可制造的蛋白质的示例包括，但不限于：生长因子(例如血小板增生因子(platelet-derived growth factor)、类胰岛素生长因子等)，受体，配体，信号分子；激酶，酶，激素，肿瘤抑制子(tumor suppressors)，血液凝集蛋白质，细胞周期蛋白质-端粒(telomerases)，代谢蛋白质，神经蛋白质，心肌蛋白质，在特殊疾病状态缺乏的蛋白质，抗体，T-细胞受体(TCR)，主要组织兼容性复合物(major histocompatibility complexes；MHC)，抗原，对疾病提供抗性的蛋白质，抗微生物蛋白质，干扰素，及细胞激动素(cytokines)。
一方面，抗原编码序列包括用于引发保护性免疫反应的序列(例如使用于疫苗配方中)。该等适合的抗原包括但不限于微生物抗原(包括病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原，寄生虫抗原等)；来自多细胞生物的抗原(例如多细胞寄生虫)；过敏原；及与人类或动物病理相关的抗原(例如癌症、自体免疫疾病等)。在优选方面，病毒抗原包括但不限于：HIV抗原；对于天花给予保护性免疫反应的抗原(例如疫苗病毒抗原)；炭疽抗原；狂犬病抗原等。疫苗抗原可分为多价多肽或多肽，例如在表达结构中含有不同的或相同的重复抗原编码序列，而且选择地由一或多个连结子序列加以分开。
植物也可用于表达生产用于化学合成或用于工业合成的酵素途径的一个或多个基因。
一方面，核苷酸序列是经选择以编码所欲的蛋白质，其中该核苷酸序列经设计提供对于莴苣或植物为较佳的密码子，该密码子的选择不会减低在瞬时***的表达低于有用浓度，最后能用于所需蛋白质的大规模制造。对于数种植物的密码子使用的特征已可被公开且被叙述于Wada等人的著作「Codon UsageTabulated From The GenBank Genetic Sequence Data 」NucleicAcids Research 19(Supp.)：1981-1986(1991)。
如下所述，在一方面，本发明提供表达多种重组蛋白质的方法。该等蛋白质可由独立结构的共渗入而表达或由叙述于下的聚顺反子(polycistronic)表达单位而表达。该等蛋白质包括为了具有生物活性而需要多种结构基因协调表达的蛋白。一方面，蛋白质需要多个次单元的组装而成为活化的。另一方面，蛋白质未成熟形式被制造而需要处理，例如蛋白质切割，或藉由一或多个外加蛋白质而修饰(例如磷酸化、糖化、核糖化、乙酰化、法呢基化(farnesylation)等)而成为活化的。
该等蛋白质的非限制示例包括异二元(heterodimeric)或异多元(heteromultimeric)蛋白质，例如T细胞受体，主要组织兼容性抗原分子，或免疫球蛋白超家族(immunoglobulinsuperfamily)的其它蛋白质(包括片段及单链变异体)，核酸结合蛋白质(例如复制因子、转录因子等)，酶，抗体酶(abzymes)，受体(特别是可溶受体)，生长因子，细胞膜蛋白质，分化因子，类血红素蛋白质，多元激酶等。
本发明的优选方面，表达框编码人类蛋白质(亦即表达于人类的蛋白质)或编码含有人类多肽区域的非人类蛋白质。
较优选的，表达框编码一或多个单克隆抗体的基因。该等基因可由鼠类，人类及/或其它动物源取得。或者，该等基因可经合成的，例如编码抗体分子的重链或轻链组成份的基因的嵌合或修饰的形式。在结构上编码区域的次序，例如先重链而后轻链，或先轻链而后重链并不重要。用于编码重及轻链多肽的基因(例如可变化重链及可变化轻链域(domian)多肽)可衍生自产生IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的细胞。为了克隆免疫球蛋白可变化区域的基因而制备组DNA片段的方法已为此领域的人们熟知。参见示例，Herrmann等人的Methods in Enzymol.152：180-183(1987)；Frischauf的Methods in Enzymol. 152：183-190(1987)；Frischauf的Methods in Enzymol  152：199-217(1987)。在如下所述的一个优选的例子中，该等基因编码聚顺反子单位的一部份。
调控因子
产生特别结构的适合的调控因子是基于所表达的重组蛋白质形式来选择的。一般而言，希望能在渗入的植物组织中高浓度表达的蛋白质。
植物启动子
所使用的基因结构可包括基因或其编码生物活性蛋白质片段部分的所有基因物质。优选的，编码序列与表达控制序列相连结。表达控制区域包括例如启动子，增强子，IRES单元等序列。表达控制序列能被外来刺激引发表达，如添加特别营养素或药剂，改变温度等，也能经设计为在植物组织的渗入及/或培养中立即及/或自发地表达编码蛋白质。
因此，构成的或被调控的启动子能控制编码所欲蛋白质的基因表达。启动子可为经环境信号调控者，或藉由化学引发剂或抑制剂而被控制者，而且该等药剂可为天然或合成的，启动子也可为天然起源或经设计的。启动子也可为嵌合的，亦即使用来自两个或多个不同的天然或合成的启动子的序列的衍生者。
优选的，使用于结构中产生基因的高表达浓度的启动子，容许蛋白质的累积在每公斤植物组织中(亦即叶组织生质量)至少约250微克、至少约500微克、至少约750微克、至少约1毫克、至少约2毫克、至少约3毫克、至少约4毫克、至少约5毫克、至少约10毫克、至少约15毫克、至少约25毫克、至少约50毫克、至少约75毫克、至少约100毫克、至少约150毫克、至少约200毫克、或至少约500毫克。
本发明中，优选的为***芥Actin 2启动子，OCS3(MAS)启动子，CaMV 35S启动子，及玄参科镶嵌(figwort mosaic virus)病毒34S启动子。然而，其它构成的或可引发的启动子也能使用。例如，泛肽(ubiquitin)启动子能由数种类克隆而用于植物中(例如，向日葵(Binet et al.，Plant Science 79：87-94(1991)；及玉米(Christensen et al.，Plant Molec.Biol.12：619-632(1989))。此外有用的启动子为来自玉米的U2及U5snRNA启动子(Brown et al.，Nucleic Acids Res.17：8997(1989))及来自酒精脱氢酶(alcohol dehydrogenase)的启动子(Dennis etal.，Nucleic Acids Res.12：3983(1984))。
另一方面，经调控的启动子可操作连接至基因。经调控的启动子包括，但不限于，藉由外部影响的启动子(例如藉由化学药品、光线、温度等外部药剂的应用)或藉内部调控的启动子，例如藉由植物的发育改变调控的启动子。经调控的启动子有利于诱导所需基因的高浓度表达，特别是在、或接近收集的时间。其特别适用于当所需蛋白质会限制或抑制植物生长时，或所需的蛋白质为某些不稳定的蛋白质时。当期望将表达结构使用于转基因植物的制造及瞬时表达分析中时，该等启动子是所希望的。
在不同植物组织中控制转基因表达的植物启动子已为本领域技术人员所熟知(Gasser & Fraley，Science 244：1293-99(1989))。花椰菜镶嵌病毒(cauliflower mosaic virus)35S启动子(CaMV)及CaMV启动子的增强衍生物(Odell et al.，Nature，3(13)：810(1985))，肌动蛋白启动子(McElroy et al.，Plant Cell 2：163-71(1990))，AdhI启动子(Fromm et al.，Bio/Technology 8：833-39(1990)，Kyozuka et al.，Mol.Gen.Genet.22 8：40-48(1991))，泛肽启动子，玄参科镶嵌病毒启动子，甘露碱合成酵素(mannopine synthase)启动子，胭脂碱合成酵素(nopaline synthase)启动子及章鱼碱(octopine)合成酵素启动子及该等的衍生物皆为构成性启动子(consitutivepromoters)。经调控启动子被描述为光可引发者(例如双磷酸核酮糖羧化酵素(ribulose biphosphatecarboxylase)启动子的小次单元)，热休克启动子，硝酸盐及其它化学性可引发启动子(参照，例如美国专利编号5,364,780；及5,777,200)。
当表达植物特定部分的蛋白质时可使用组织特异性启动子。叶特异性启动子可包括35S增强子(Sheen，EMBO，12：3497-505(1993))之前的C4PPDK启动子或任何其它特异性在叶中表达的启动子。
一般而言，任何植物可表达的基因结构皆合适使用于本发明的方法。根据所表达的重组蛋白质的类型可选择特别的启动子。
本发明特别有趣的为衍生自OCS增强子多重单位的启动子及衍生自MAS的核启动子使用，而其中的OCS及MAS来自农杆菌(Gelvin等人的美国专利号5,955,646)。在渗入及以植物荷尔蒙2，4-D处理后该启动子显示特别强烈，在高浓度时也可用作除草剂。
定位序列(Targeting Sequences)
优选的，表达产物以植物细胞中的特定位置为靶标，例如细胞膜、细胞外间隙或胞器例如叶绿体的色质粒。优选的，表达产物以细胞外间隙为靶标，因此在细胞内液分离的基础上而纯化蛋白质。参照，美国专利号6,096,546，美国专利号6,284,875及WO 0,009,725。
蛋白质能藉由定位序列而定位于次细胞或细胞间位置。在某些情况下氨基酸序列是从多肽的氨基末端部分合成而在移位(translocation)或定位以后或其间藉由蛋白质分解酶而裂解。例如，在真核生物中蛋白质分泌途径的模型是在核糖体结合至mRNA后而初生多肽链(nascent polypeptide chain)开始翻译。假定蛋白质的目的是用于分泌，则蛋白质的氨基端会辨识信号辨识粒子(signal recognition particlel；SRP)而在mRNA、核糖体及SRP复合体与内质网(endoplastic reticulum；ER)接合(dock)时引来翻译的暂时延迟。在接合后，虽然此时多肽链是共同位于ER腔，但恢复翻译。
用于在内膜***中使蛋白质至定位在滤泡中或用于分泌的信号序列在植物及动物中是相似的。信号肽可根据标准技术而适用于本发明(例如以合适端制备用于任何其它基因架构内克隆)。
一方面，编码所欲蛋白质的表达框包含融合至编码所欲蛋白质的信号序列构架内的信号序列。优选的，信号序列能将基因表达产物指引导至分泌途径。
由于抗体常常为分泌蛋白质，在成熟抗体分子的制造中分泌步骤扮演重要角色。为能在植物中完成此步骤，合成或以他法取得(例如克隆)的基因或具有哺乳类固有的编码区域信号肽，或以融合形式连结至兴趣基因，在此融合形式中，植物分泌信号肽被信号肽所取代。信号肽及蛋白质的融合应为藉由植物处理的，而此蛋白质的所得氨基端与人类宿主中所产生者相同。此外定位于叶绿体也是可预期的。
在一个优选的具体例子中，使用来自网蛋白(calreticulin)信号序列(Borisjuk et al.，Nature Biotechnology  17：466-69(1999))。一个更优选的具体例子是使用来自蕃茄的枯草酶(subtilase)序列(Janzik et al.，2000)。已经证实该等植物信号肽足以将外来蛋白质定位至植物的外质粒间隙(参照例如Janzik et al.，2000)。其它植物蛋白质信号肽也可使用例如经叙述的大麦(淀粉酶(α-amylase)，During et al.Plant MolecularBiology 15：287-93(1990)；Schillberg et al.TransgenicResearch 8：255-63(1999))。
对于那些一般需要氨基端加工以达其成熟的蛋白质而言，定位蛋白质于植物内膜***为本发明的较优选例，因为由此能提供蛋白质氨基端合适的成熟度。此外，假定感兴趣的蛋白质具有或经重组过而带有额外的定位信息则可定位至内膜***的特定区域(参照例如叙述于：Voss et al.，Mol Breeding 1：39-50(1995)；During et al.，Plant Mol.Biol. 15：281-93(1990)；Baum et al.，Mol.Plant-Microbe Interact. 9：382-87(1996)；DeWilde et al.，Plant Sci. 114：231-41(1996)；Ma et al.，Immunology  24：131-38(1994)；Schouten et al.，Plant Mol.Biol.30：781-93(1996)；Firek et al.，Plant Mol.Biol. 23：861-70(1993)；Artsaenko et al.，Plant J. 8：745-50(1995)；Conrad &Fiedler，Plant Mol.Biol. 38：101-09(1998))。
由于定位于如质粒(例如叶绿体及线粒体)等细胞器是藉由氨基端信号序列所指令而后续地进行裂解作用的，因此定位于此区域也有利于达成所需的氨基端成熟。在一个优选的具体例子中，信号肽指引表达产物至质粒(例如叶绿体)或其它次细胞器。例如α核糖-双磷酸羧化酵素的小的次单元的瞬时肽(Khoudi et al.，Gene 197：343-5(1997))。过氧化体定位序列(peroxisomal targeting sequence)意指任何能将蛋白质定位至过氧化体的肽序列，可为N-端、内部或C-端，例如植物C-端靶标三肽SKL(Banioko et al.，Plant Physiol. 107：1201-08(1995))。
此外，或者作为定位蛋白至特定次细胞的替代方式，一方面，将「抗原决定基标志」(epitope tags)及/或端点特异裂解点(site-specific cleavage site)加入以而设计融合蛋白质。该等标志的功效在于能提供便利的纯化机制。例如，可将含有来自生物素(biotin)用于结合抗生蛋白链菌素(streptavidin)的重要氨基酸的小肽设计于感兴趣的基因的5’端。则新合成的蛋白质可以基于生物素：抗生蛋白链菌素的结合被许多已知方法获得。如果欲从蛋白质移除类-生物素肽，也能利用蛋白质分解酶辨认点。蛋白质分解酶辨认点可以被***到「抗原决定基标志」序列的下游，而就在编码所需蛋白质的成熟形式的序列前。本领域技术人员应了解抗原决定基标志及蛋白酶具有多种选择(例如Xa因子、烟草蚀纹病毒蛋白酶(Tobacco Etch VirusProtease)、肠激酶(enterokinase)等)而较佳点及蛋白酶的选择可取决于有疑问的特定蛋白质胺基酸及DNA序列。
如前所述，启动子、增强子、IRES单元、及信号序列等调控单元的选择，一般而言取决于所表达蛋白质的类型。例如，一方面，某些用于制造IgG的较佳结构会包括具有5’OCS3MAS启动子：枯草酶(任何生物)信号肽：用于编码IgG重链成熟区域的基因：翻译中止信号：转录中止及聚腺苷酸化序列，及含有前述相似成分的第二个结构，此结构以轻链基因取代重链基因(亦即，两载体，如用于本文的二重(binary)或双(dual)载体)的结构。或者，在另一优选的具体例子中，重链及轻链基因位于相同DNA结构。在另一具体例子中，重链及轻链基因在相同DNA结构上由相同启动子表达而以IRES单元分开。
其它序列
表达结构可为一部分表达载体及额外的所欲的序列例如细菌的复制起点(bacterial origins of replication)(农杆菌及/或大肠杆菌复制起点)，能在例如细菌如农杆菌及/或植物细胞中作用的报导基因(reporter gene)(例如GUS、GFP、EGFP、BFP、β-半乳糖(β-galactosidase)及其改质型式)及可选择标记基因(例如抗生素抗性基因等)。使用于本发明方法中的外来DNA也可包含标记基因，其能在起初的克隆阶段中分离经转化细胞与未经转化细胞。该标记基因通常编码蛋白质使能由表现型而分辨经转化细胞与未经转化细胞。在植物中，可选择性标记基因也可编码某种除草剂抗性蛋白质，如该等除草剂包含谷氨酸合成酵素抑制剂，例如草丁膦(phosphinothricin)(参照例如EP 0 242 236；EP 0 242 246；De Block et al.，1987，EMBO J.6：2513-2518)。然而，根据本发明，瞬时蛋白质制造方法具有不需要标记基因而由经导入表达结构/载体的植物组织中分离异种蛋白质的优点。
能融合至编码异种蛋白质的序列的其它序列包括，但不限于：卷曲(coiled-coil)序列(如述于Martin et al.，EMBO J.13(22)：5303-5309(1994))；微体(minobody)序列或组成最小微抗体互补区域的序列(参见Bianchi et al.，J.Mol.Biol. 236(2)：649-59(1994))；稳定序列、二聚作用序列、连结子序列、十四烷基化(myristilation)序列(参见如述于美国专利公开编号2002/0146710)、Fc区域(例如用于制造免疫黏附素)等
表达结构的数据库
一方面，根据本发明的瞬时蛋白质表达***中用于表达及测试中变异蛋白质序列的大多数表达结构包含具同一性的编码序列(例如同一性大于50％，同一性大于75％，同一性大于90％、同一性95％或99％)。
一方面，结构的编码部份为随机的。结构可完全随机或在其随机中有偏差(亦即随机或在一个或多个经选择位置)。一方面，产生表达结构的数据，其库包含足够的不同族群而使至少一个藉由表达结构所编码蛋白质在结构的多样性中具有所欲的生物活性(例如结合至例如抗原的特定结合搭档的能力)。另一方面，表达结构的多样性包含变异编码序列多于100，多于500，多于1×103，多于1×104，多于1×105，多于1×106，多于1×107，多于1×108，或多于1×109。优选地，数据库的多样性是指包含约1×107至1×109不同变异编码序列。蛋白质的一个或多个胺基酸可一次随机化。在一方面，一次约一个，约二个，约三个，约四个，约五个，或约六个或更多个胺基酸随机化。在一方面，含有「n」个胺基酸的蛋白质，n个胺基酸的各个独立地随机化而且蛋白质被测试看是否有活性。因为异种蛋白质的某些特定区域(例如抗原结合点或特定胺基酸)有变异而其它区域仍为不变，随机化可有偏差。
用于蛋白质的定向演化(directed evolution)的突变核酸序列的方法叙述于Leung et al.，Technique  1：11-15(1989)；Cadwell and Joyce PCR Methods Appl. 2：28-33(1992)；Shafikhani et al.，Biotechniques 23：304-310(1997)；Wan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 95：12825-12831(1998)；You andArnold，Protein Eng. 9：77-83(1996)；Cherry et al.，Nat.Biotechnol. 17：379-384(1999)；Tukey et al.，J.ImmunolMethods  270(2)：247-57(2002)；Cho et al.，Mol.Biol. 297(2)：309-19(2000)。
植物组织样品可如后述的被多样表达结构渗入而表达所欲类型蛋白质的组织/细胞及/或生物活性的程度能经选择用于高通量分析。在显出所欲类型/活性的程度的样品中，表达结构能由样品的一个或多个细胞中取回，并被测序或被鉴定其伴随类型/活性的程度的变异序列。不论在结构序列被特征化前或后，此结构都能被再导入至一个或多个其它植物组织样品以确定其结果。有偏差随机化的第二轮可用于改变蛋白质的未变化点及/或蛋白质的经选择区域以鉴定有增强性质的蛋白质(例如对特定的搭档具有增强的亲和性的蛋白质)。
一方面，此方法用于模仿抗体产生的天然选择步骤，亦即鉴定能结合至特定抗原的表达结构，而后突变结构而表达第二轮选择性以鉴定对于特定抗原提供最高亲和性的结构。
农杆菌转化及培养制备
以农杆菌转化植物及其用于稳定植物转基因的产生已有被报道很多了。含有T-DNA边缘序列的农杆菌细胞与植物的交互作用导致农杆菌T-DNA的单股复制物与蛋白质复合而转移至植物核。稳定的转化中，T-DNA被整合至核DNA。
虽然此步骤显然十分有效，然而未经整合的T-DNA复制物能瞬时地转录而导致T-DNA基因与共转化的任何其它基因的短时间表达。由于瞬时表达不依赖DNA的整合或植物的再生，因此能使用农杆菌的更有毒性株而无需使用去毒性载体(disarmed vector)(亦即，不含有瘤产生基因的载体)，虽然后者也能使用。
合适的去毒性载体包括SEV系列，其中T-DNA的右边缘与编码细胞***素(cytokinin)及生长素(auxin)植物激素基因一起被移除而以细菌的康那霉素(kanamycin)抗性基因取代，而左边缘及部份左内侧类似(Left Inside Homology；LIH)序列仍保持不变；去毒性载体还包括pGV系列，其中植物激素基因经去除而代以部份pBR322载体序列，左，右边缘序列及Ti质粒的胭脂碱(nopaline)合成酶基因被保留。中间体载体可与帮助型序列(helper sequence)合并。优选的，使用双重载体而在其中一载体中包含T-区域，而在另一载体中包含vir区域。双重载体在此领域被认知并被叙述于例如美国专利号4,940,838,EP 120516 B1，及美国专利号5,464,763。
农杆菌的合适菌株包括野生型株(例如根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens))或一个或多个基因经突变而增加转化效率的菌株，例如农杆菌中因突变或嵌合virA或virG基因的存在而改变vir基因的表达及/或其诱发(例如Chen andWinans，1991，J.Bacteriol.173：1139-1144；及Scheeren-Grootet al.，1994，J.Bacteriol.176：6418-6246)。在另一具体实例中，农杆菌株包含额外的virG基因复制物，例如衍生自pTiBo542的超级virG基因，优选的连结至多复制的质粒中，如美国专利号6,483,013中叙述。
其它合适菌株包括，但不限于：根瘤土壤农杆菌A.tumefaciens C58C1(Van Larebeke et al.，Nature  252：169-170(1974))，A136(Watson et al.，J.Bacteriol  123：255-264(1975))；LBA401 1(Klapwijk et al.，J.Bacteriol  141：128-136(1980))，LBA4404(Hoekema et al.，Nature 303：179-180(1983))；EHA101(Hood et al.，J.Bac. 168：1291-1301(1986))；EHA105(Hood et al.，Trans Res. 2：208-218(1993))lAGL1(Lazo et al.，Bio/Technology  9：963-967(1991))；A281(Hood et al.，supra(1986))。
在一方面，本发明提供农杆菌操作的简化方法。优选地，将农杆菌株在合适培养基中培养至600nm的波长下，光密度(optical density；O.D.)2.5至3.5。通常将细胞稀释至2.5 O.D.。而后将农杆菌细胞直接接触(亦即无起始的浓缩步骤或离心步骤)植物组织，每份体积的植物组织使用约1至3份体积的农杆菌的培养基悬浮液，优选的为2至3份体积。一具体实例，每1kg植物物质用少于约4L的菌液可提供异种蛋白质至少约250μg，至少约500μg，至少约750μg，至少约1mg，至少约2mg，至少约3mg，至少约4mg，至少约5mg，至少约10mg，至少约15mg，至少约25mg，至少约50mg，至少约75mg，至少约100mg，至少约150mg，至少约200mg，或至少约500mg。
相较于先前使用的其它方法，本方法可在较少步骤中完成，所需人力较少而且减少15到20倍的制造成本。
真空渗入(Vacuum Infiltration)
在优选的具体实例中，表面活性剂被添加到农杆菌悬浮液中以增加植物组织的异种蛋白质的产量。在一方面，农杆菌细胞或其部份渗入宿主植物组织以用于表达结构及/或表达载体的表达。优选的，此步骤在真空中进行。
如用于本文，术语「表面活性剂」是指通常含有亲油性部份及亲水性部份的表面活性试剂(参照例如Bhairi，A.Guide tothe Properties and Uses of Detergents in Biological Systems，Calbiochem-Novabiochem Corp.1997)。表面活性剂可依其含有一个或多个电荷基团而分类为阴离子性，非离子性，两性离子性或阳离子性。阴离子性表面活性剂带负电荷基团而具有净负电荷。非离子性表面活性剂含有不带电荷极性基团而不具电荷。该等表面活性剂通常为烷氧化物与烷酚，或一级或二级醇，或胺氧化物，膦氧化物或二烷基硫氧化物的反应产物。
非离子性表面活性剂的包括，但不限于：第三-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(Triton X-100)，聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯(Tween 20)，聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯(Tween 21)，聚氧乙烯去水山梨醇单棕榈酸酯(Tween 40)，聚氧乙烯去水山梨醇单硬脂酸酯(Tween 60)，聚氧乙烯去水山梨醇单油脂酸酯(Tween 80)，聚氧乙烯去水山梨醇三油脂酸酯(Tween 85)，(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)，三乙二醇单月桂醚(Brij 30)，及去水山梨醇单月桂酸酯(Span 20)。
两性离子表面活性剂含有正电荷基团及负电荷基团且无净电荷。合适的两性离子性表面活性剂包括，但不限于：甜菜碱，例如羧基甜菜碱(carboxybetaines)，磺基甜菜碱(sulfobetaines，也为sultaines)，酰胺基甜菜碱(amidobetaines)，及磺酰胺基甜菜碱(sulfoamidonetaines)，例如可含有C8-C18，优选的为C10-C18，的烷基甜菜碱，磺基甜菜碱，及磺酰胺基甜菜碱，例如，月桂基酰胺基丙基甜菜碱(LAB)型甜菜碱，正-烷基二甲基胺甲烷羧酸盐(DAMC)，正-烷基二甲基胺乙烷羧酸盐(DAEC)，正-烷基二甲基丙烷羧酸盐(DAPC)，正-烷基磺基甜菜碱，正-烷基二甲基胺烷基磺酸盐，N-烷基二甲基胺乙烷磺酸盐(DAES)，正-二甲基胺丙烷磺酸盐(DAPS)及正-烷基二甲基胺丁烷磺酸盐(DABS)，十六烷基二甲基胺丙烷磺酸盐，正-烷基酰胺基甲烷二甲基胺甲烷羧酸盐，正烷基酰胺基甲烷二甲基胺乙烷羧酸盐，月桂基酰胺基丙基甜菜碱(LAB)，正-烷基酰胺基甲烷二甲基胺甲烷磺酸盐，正-烷基酰胺基乙烷二甲基胺乙烷磺酸盐，及正-烷基酰胺基丙烷二甲基胺丙烷磺酸盐，3-[(3-胆烷酰胺基丙基)二甲基胺]-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)，及3-[(3-胆烷酰胺丙基)二甲基胺]-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)，磷酯(例如磷酯酰乙醇胺(phosphatidylethanolamines)，磷酯酰甘油(phosphatidylglycerols)，磷酯酰肌醇(phosphatidylinositols)，二酰基磷酯酰胆碱(diacyl phosphatidyl-cholines)，二-O-烷基磷酯酰胆碱(di-O-alkyl phosphatidylcholines)，溶血磷酯酰胆碱(lysophosphatidylcholines)，溶血磷酯酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamines)，溶血磷酯酰甘油(lysophosphatidylglycerols)，溶血磷酯酰肌醇(lysophosphatidylinositols))，饱和及不饱和脂肪酸衍生物(例如乙基酯，丙基酯，胆固醇酯，辅 A酯，硝苯基酯，基酯，单甘油酯，二甘油酯，及三甘油酯，脂肪醇，脂肪醇乙酸酯等)，脂多醣，糖-及神经鞘脂质(sphingolipids)(例如神经酰胺(ceramides)，脑酯(cerebrosides)，半乳糖基二甘油酯(galactosyldiglycerids)，神经节甘酯(gangliosides)，乳糖脑酯(lactocerebrosides)，溶血脑硫酯(lysosulfatides)等)。
「阳离子性表面活性剂」在渗入条件下具有正电荷基团。合适的阳离子性表面活性剂的示例包括，但不限于：四级胺类或三级胺类。四级胺类表面活性剂的示例包括，但不限于：氯化十六烷基吡啶盐，溴化十六烷基三甲基铵盐(CTAB；Calibiochem#B22633或Aldrich#85582-0)，氯化十六烷基三甲基铵盐(CTACI；Aldrich#29273-7)，溴化十二烷基三甲基铵盐(DTAB，Sigma#D-8638)，氯化十二烷基三甲基铵盐(DTACI)，溴化辛基三甲基铵盐，溴化十四烷基三甲基铵盐(TTAB)，氯化十四烷基三甲基铵盐(TTACI)，溴化十二烷基乙基二甲基铵盐(DEDTAB)，溴化癸基三甲基铵盐(DIOTAB)，溴化十二烷基三苯基膦盐(DTPB)，溴化十八烷基三甲基铵盐，氯化硬脂四级胺(stearoalkonium chloride)，氯化油酸四级胺(olealkonium chioride)，氯化十六烷基三甲铵(centrimoniumchloride)，烷基三甲基铵甲基硫酸盐，棕榈酰胺基丙基三甲基氯，感光素(quaternium)84(Mackernium NLE；Mcintyre Group，Ltd)，及小麦脂质环氧化物(Mackernium WLE；Mcintyre Group，Ltd)。三级胺类表面活性剂的示例包括，但不限于，辛基二甲基胺，癸基二甲基胺，十二烷基二甲基胺，十四烷基二甲基胺，十六烷基二甲基胺，辛基癸基二甲基胺，辛基癸基甲基胺，二癸基甲基胺，十二烷基甲基胺，氯化三乙酰基铵，氯化十六烷基三甲铵(centrimonium chloride)，及氯化烷基二甲基苄基铵。阳离子性表面活性剂的其它类别包括，但不限于：磷盐，酰胆碱盐(imidzolines)，及乙基化胺类。
阴离子性表面活性剂一般为有机硫酸盐及磺酸盐的水可溶碱金属盐。该等包括，但不限于：月桂钾盐，月桂硫酸钠，十二烷基硫酸钠，烷基聚氧乙烯硫酸盐，褐藻酸钠，二辛基磺基琥珀酸钠，磷脂酰胆碱，磷脂酰甘油，磷脂酰肌，磷脂酰丝胺酸，磷脂酸及其盐，甘油酯，羧甲基纤维素钠，胆酸及其它胆汁酸(例如胆酸，脱氧胆酸，甘胺胆酸，牛磺胆酸，甘胺脱氧胆酸)及其盐(例如脱氧胆盐钠等)。
混合表面活性剂(co-surfactants)，如乙醇，1-丙醇，及1-丁醇的短链醇，也可被使用。
可使用前述表面活性剂的任何组合。未特别列于前述的表面活性剂也包含于本发明的范围中。
表面活性剂使用量可依表面活性剂的类型及欲处理的植物组织(亦即，包覆于叶片表面的蜡的厚度等)而变化。一般而言，表面活性剂使用浓度范围为农杆菌悬浮液体积的0.005％至约1％。优选的，浓度范围为0.005％至约0.5％，而更优选的为0.005％至约0.05％。一般而言，离子性表面活性剂的使用浓度低于非离子性表面活性剂。
优选的，使用非离子性表面活性剂，例如Tween 20。
除了加入表面活性剂外，加入渗透性冲击步骤(osmoticshock step)以增大真空冲击，可用于增加蛋白质表达。因此，一方面，渗透性冲击试剂，例如蔗糖被用于增加蛋白质表达。渗透性冲击试剂的合适浓度范围由20g/L至100g/L。一方面，当植物组织为莴苣时，约使用蔗糖60g/L。
在方法示例中，重组农杆菌培养介质(亦即含有本发明的表达结构)在经改质的YEB培养基中(酵母抽出物(yeastextract)6g/L，蛋白胴(peptone)5g/L，硫酸镁2mM及蔗糖5g/L)生长约两天，而该培养基补充有合适的抗生素以选择载体及宿主上的抗性决定株。为了生长瞬时表达的细胞，将起始农杆菌培养液以1∶50稀释至新鲜经改质的YEB培养基。添加抗生素，50mM磷酸钾缓冲液(pH5.8)及20μM乙酰丁香酮(acetosyringone)。于28℃下培养18至24小时后，细胞达到600nm的吸收度(也称为光密度或O.D.)为2.5至3.5。优选的，将细胞稀释至600nm的吸收度为2.5，需要时用相同培养基进行稀释。
而后将蔗糖及乙酰丁香酮补充至细胞内而得最大值为220μM乙酰丁香酮及60g/L蔗糖的。此悬浮液于22℃下培养约1小时而后用于渗入。
而后在真空下将细胞直接渗入而无任何离心或浓缩步骤，删除回溶步骤的需求。此项改变能使新鲜的已生长的农杆菌悬浮液直接真空渗入，而删除了由对数相培养基中离心细胞并将细胞回溶于Murishigi Skoog(MS)培养基(Kapila et al.，supra(1997))的需求。农杆菌细胞的生长达O.D.600nm值2.5至3.5而非0.7至0.8(Kapila et al.，1997)，使用经改质的YEB培养基及磷酸钾缓冲液取代MES，并不能改变表达浓度或渗入效率但能显着地降低此部份步骤所需的成本及劳力。
在一方面，例如在叶片组织来自莴苣时，在一烧杯中将植物物质与100μg/ml 2，4-D及0.005％Tween 20一起浸渍于预先培养的农杆菌悬浮液。将此烧杯置于真空干燥器中并且在快速达真空而产生真空冲击后维持20分钟真空(相当于水的29”体积或约7kPa)。如前述(Kaplia et al.，supra(1997)；Vaquero etal.，supra(1999))，相较于大量无组织的叶片，使用莴苣的完整叶球显着地具有便利性。一般而言，相较于相等量的叶片，莴苣的完整叶球具有较佳的表达浓度。此方法可藉由同时处理多数莴苣叶球或大量叶片而轻易地放大规模。一个农杆菌细胞悬浮液可至少使用两次真空渗入而表达效率不会显着降低，其更减少制造成本及劳力。
在一方面，约300至400克莴苣的完整叶球被使用。在另一方面，先期实验中使用分离叶片于以最优化表面活性剂及/或渗透试剂的量及组合。
优选的，在真空渗入后，于室温下将莴苣叶球培养于光照下约3至7天，而后将其均质化而抽取蛋白质。应用适当的纯化步骤将单株抗体及其它医药学上重要的蛋白质由植物均质中纯化出来。
相较于先前技术，此过程简单而含有较少步骤且结果能显着增加异种蛋白质的表达。
蛋白质分离
在收集后，蛋白质分离可使用此领域中的被熟知的方法进行。例如，至少一部份生物质量被均质化后，抽取重组蛋白质并进一步纯化。抽取可包含将均质物浸泡或浸渍在合适的溶剂中。蛋白质也可由植物的组织液分离，例如美国专利编号6,284,875所述的真空渗入方法。
纯化方法包括，但不限于：免疫亲和纯化及基于蛋白质或蛋白质复合体的特定大小、电泳泳动性、生物活性、及/或欲分离的异种蛋白质的净电荷，或基于蛋白质中标志分子的存在的纯化步骤。
分离蛋白质的特征化可藉由免疫分析或其它熟知于此领域的方法进行。例如，蛋白质可藉由蛋白质杂交印迹法(Western Blotting)在十二烷基硫酸钠-聚丙烯基酰胺电泳凝胶上(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis；SDS-PAGE)分析，或者当蛋白质充分地被纯化后藉由科麦西蓝染色分析。经分离的蛋白质可用于生物活性分析，蛋白质结构的特征化(例如在结晶分析)，在疾病的非动物人类模型中进行药效测试，筛选最佳蛋白质活性及/或最佳医药学特性等。
本说明书中引用于的所有专利及非专利文献皆为相关于熟习此领域者的技艺程度。所有文献及专利将以相同程度而合并于此作为参考文献，特别地单独引用的文献或专利也将合并于此作为参考文献。
实施例
本发明将以下列数个实施例加以叙述。该等实施例的目的是详加阐明而非以任何方式局限本发明。
实施例1：藉由新颖快速蛋白质表达***制造hOAT
本文所叙述的方法与Kapila等人(Kapila et al.，supra(1997))所教示的瞬时表达***相比有显着的改变，在低成本及较少步骤下，结果为大幅地增加高质量产物的表达。
    表1瞬时表达的比较
    步骤 Kapila方法 本发明的方法
1 在YEB中生长农杆菌(参见内文) 在经改质的YEB中生长农杆菌(参见内文)
2 渗入前，农杆菌在YEB+MES(pH 5.6)+20μM乙酰丁香酮中生长。稀释1∶500，过夜生长至O.D.600nm约为0.7至1。 渗入前，农杆菌在YEB+PO4(pH5.6)+20μM乙酰丁香酮中生长。稀释1∶500，过夜生长至O.D.600nm约2.5至3.5。
    3 沉淀细胞 无浓缩步骤
4 在MS培养基+MES(Ph5.6)+20g/L蔗糖，200μM乙酰丁香酮中回溶细胞至O.D.600nm约2.4 调整培养基至55g/L蔗糖，200μM乙酰丁香酮。如果细胞的O.D.600nm＞2.5稀释细胞至O.D.600nm约2.5。
5 培养细胞1小时；在2至3小时用于渗入 培养细胞1小时。渗入前添加0.005％Tween 20。
在高浓度蔗糖存在下的预处理
植物表达载体的构筑
含有感兴趣基因的质粒载体可使用标准分子生物技术而构筑。基本单元包括：能在大肠杆菌及农杆菌中复制的起始质粒，有T-DNA的右及左边缘夹于两侧的藉由启动子驱动的感兴趣基因及定位序列。必需单元经组装而构建的质粒显示于图1A及图1B。
图1A显示质粒pSUNP1，其含有2，4-D可诱发的(OCS)3Mas启动子(Gelvin et al.，美国专利编号5,955,646)，驱动枯草酶分泌序列(Janzik et al.，Biol.Chem. 275：5193-5199(2000))，而能翻译地融合至抗组织因子抗体(IgG1)的重链。此外此质粒含有康那霉素抗性的选择标记及在瞬时表达***中无利用性的bialphos抗性的BAR基因。
示于图1B的质粒pSUNP2除了抗组织因子抗体的重链被相同抗体的轻链(卡帕；Kappa)所取代外，与pSUNP1相似。
农杆菌的转化及制备
将带有所需双重载体的农杆菌C58/C1(Agrobacteriumtumifaciens C58/C1)在28℃下培养于在经改质的YEB培养基(6g/L酵母抽出物(yeast extract)，5g/L蛋白胴(peptone)，5g/L蔗糖及2mM硫酸镁)生长两天，而该培养基含有合适的抗生素(100μg/mL康那霉素，15μg/mL利法霉素(rifampicin)，25μg/mL庆大霉素(gentamycin))用于选择质粒及正确的细菌。用补充有抗生素，50mM磷酸钾缓冲液(pH5.6)及20μM乙酰丁香酮(acetosyringone)的改质的YEB培养基中以1∶50稀释培养菌并培养18至24小时直到O.D.600nm为约2.5至3.5。当需要时将细胞稀释至O.D.600nm为2.4而后补充55g/L蔗糖及200μM乙酰丁香酮(最大量为220μM乙酰丁香酮及60g/L蔗糖)。悬浮液于室温下(约22℃)培养1小时；使用前添加100μg 2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸，Sigma)及0.005％Tween 20。
与Kapila等人supra(1977)所教示的方法相比，在其方法中YEB培养基由5g/L牛肉抽出物，lg/L酵母抽出物，5g/L蛋白胴，5g/L蔗糖，2mM的硫酸镁及用于选择质粒的合适抗生素(100μg/mL康那霉素，15μg/mL利法霉素，25μg/mL庆大霉素)组成。起始培养菌在补充有抗生素，10mM MES，pH5.6，20μM乙酰丁香酮的YEB培养基中以1∶500稀释且培养18至24小时直到O.D.600nm为约0.7至1。将培养液离心收集细胞后回溶于含有10mM MES，pH5.6，20g/L蔗糖，及200μM乙酰丁香酮的Murashigi-Skoog培养基(Kapila et al.，supra(1997))，使O.D.600nm为2.4。悬浮液在室温下(约22℃)培养1小时后；于使用前添加100μg2，4-D。
经处理莴苣的真空渗入及培养
农杆菌悬浮液直接使用于真空渗入。在轻链位于一质粒且重链位于另一质粒(双载体***)情况下，必需制备两种农杆菌培养液且在渗入前将其以相等比率混合。在此例中，编码卡帕轻链的轻链载体系来自称为hOAT的抗组织因子抗体而重链载体则编码hOAT的IgG1重链。在2L烧杯中将莴苣的整个叶球浸渍于1.2L悬浮液中且置于真空干燥机中。使用真空(相当于7kPa)20分钟后以快速释放真空进行真空冲击。以水清洗莴苣叶球后在室温下且在湿纸巾上于密闭透光盒中光照16小时来培养3至4天。在3至4天后由基部切下叶片且将其均质化以用于蛋白质抽取。
蛋白质的抽取及纯化
蛋白质在与叶片重量相等体积份的缓冲液(100mMTris-HCl，5mM EDTA，pH8.0，使用前添加1.5％不溶性PVP)中抽取。将叶片在Waring均质机中以高速均质化1分钟后将所得的均质物于10,000xg下离心15分钟。将上清液与未沉淀的细胞碎渣以12层的粗棉布过滤后于20,000xg下离心15分钟。将滤液以2mL/min填充至r蛋白A琼脂糖快速亲和管柱(5mL，树酯得自Amersham Pharmacia Biotech AB，Sweden)。所使用的清洗缓冲液及洗提缓冲液分别为0.1M乙酸钠及0.1M乙酸。以阶梯pH梯度方式洗提蛋白质，亦即以20％0.1M乙酸洗提2管柱体积，而后以40％、60％及100％的0.1M乙酸各洗提4管柱体积(图3)。收集到吸收峰并使用1MTris-HCl，pH8.0，将pH调整至8.0。经纯化的抗体并以O.D.280nm定量。为进一步纯化，将Q琼脂糖快速管柱(5mL，得自AmershamPharmacia Biotech AB Sweden的树酯，)以20mM Tris-HClpH8.5平衡后而将经ProteinA纯化的抗体缓冲液与相同缓冲液交换后填充至该管柱。使用盐阶梯洗提方法洗提抗体，亦即10％的含有20mM Tris-HCl，pH8.0，1M NaCl的缓冲液洗提2管柱体积，而后以50％的该缓冲液洗提4管柱体积及100％的该缓冲液洗提2管柱体积。收集峰值部分并以O.D.280nm定量(图4)。为换液，系将Millipore Ultrafree离心过滤装置15mL(Millipore Coporation Bedford，MA)浸泡于0.1M NaOH中至少1小时。用于经Q琼脂糖管柱纯化的抗体的换液是以PBS进行的以取得大于1000倍稀释。更换缓冲液的抗体用Millex-GV 0.22μm过滤器(Millipore Corporation，Bedfore，MA)过滤且以O.D.280nm定量。
hOAT抗体以ELISA(Enzyme-linked immunosobent assay；酶联免疫吸附测试法)分析定量。为了制备分析盘，制备5.5μg包覆溶液或者重组组织因子(rTF)的11mL包覆缓冲液(35mM NaHCO3，15mM碳酸氢钠，50mM NaCl，pH9.0)。将100μL包覆溶液移至各孔中且于4℃下储存2周。将分析盘以400μL的清洗缓冲液(Kirkegaard&Perry)清洗3次后将100μL样品移至各孔中。于室温下震荡此分析盘1小时后以清洗缓冲液清洗6次。加入过氧化物酶联接的驴抗人IgG(Peroxidase-conjugated Donkey Anti-Human IgG(H+L)(JacksonImmuno Research)，于室温下培养10分钟后以清洗缓冲液清洗6次。添加ABTS底物(BioFX)(100μL)，10分钟后添加100μL的1％SDS中止反应。测定450nm的吸收度。实施例1的具体方法与Kapila方法的表达浓度的比较示于表2。
表2.hOAT的表达*
方法 试验1 试验2 试验3     平均值
Kapila*     2.4     6.0     3.2     3.9
实施例1结果 27.0 17.6 12.5 19.0
*表达浓度以mg/kg-生物质量表示，表示由使用同批次植物物质的三次独立渗入试验的测定的平均值
如Laemmli(1970)所述，在12％Tris-甘氨酸小电泳胶上进行SDS-PAGE。将蛋白质抽取物与填充缓冲液(4∶1，v/v)混合后于70℃加热10分钟而制备样品。蛋白质电泳带由科麦西蓝染色(第5A图)或由电泳性地转移至PVDF膜上来检测。将该膜在室温下于的含有10％脱脂牛奶的1∶10稀释的2X PBS缓冲液中阻断(block)1小时。在清洗后，于室温下将该膜与联有辣根过氧化酶(horseradish peroxidase)的抗人类IgG抗体联合培养1小时。图5B显示根据操作者使用说明(Pierce)，将膜与增强化学发光的蛋白印记杂交所用的试剂一起培养而测得的IgG重链及轻链。
实施例2.蔗糖浓度的最优化
人们以意识到蔗糖浓度及蔗糖所引起渗透性冲击的效果为增强表达的重要参数。为测试蔗糖浓度对于蛋白质产物浓度的影响，依照实施例1的步骤测试蔗糖浓度的范围对于抗组织因子抗体的表达的影响。基于图6的结果选择60g/L为最终蔗糖浓度作为标准方法。
实施例3.表面活性剂的最优化
为了特征化表面活性剂的效果，依照实施例1的步骤改变了表面活性剂的种类及浓度。
    表3.不同表面活性剂对于hOAT表达的影响
清洁剂 清洁剂浓度 表达浓度(mg/kg-生物质量)
    Tween 20     0.002％ 12.6
    Tween 20     0.005％ 16.0
    Tween 20     0.01％ 11.9
    Tween 80     0.005％ 13.2
    Nonidet NP40     0.005％ 9.6
    Triton X-100     0.005％ 15.0
    SDS     0.005％ 1.3
    Silwet L-77     0.005％ 3.2
    Silwet L-77     0.02％ 14.5
    无清洁剂     ---- 3.5
表3表示不同非离子性及离子性清洁剂的研究结果。该清单并不意味详尽的而仅显示由改变此参数而得的显着效果。0.005％的Tween-20提供了特别高浓度的异种蛋白质表达。
实施例4.2，4-D对于瞬时表达***中籍由(OCS)3MAS启动子的表达的效果
在植物中有多种不同的启动子(5’转录调控区域)常常被应用于异种蛋白质的表达。文献研究及有限的测试用来决定本方法的合适启动子。表4表示使用化学诱发剂2，4-D由合成启动子OCS3MAS的hOAT的表达。虽然已知(OCS)3MAS启动子可由多种引起明显伤害的因子诱发，此研究显示使用农杆菌的基因瞬时传递也引起可诱发的表达。此研究以实施例1中所述的原始Kaipla方法(MS方法)进行细菌制备及渗入，而此为其表达低于其它实施例的原因。基于此研究而选择100μg/mL为的2，4-D最终浓度作为标准方法。
    表4.2，4-D浓度对于hOAT表达的影响
    2，4-D浓度(M)     hOAT的表达(mg/kg)
    0     0.25
    10     0.45
    50     0.5
    100     2.5
    200     2.1
此有限的研究仅作为一个实施例，还有可能通过无氧诱发的启动子，如由Adh基因，或者由报导有强启动子作用的管家基因eIF4或由RUBISCO的小亚单位等诱发的启动子可获得更高的表达。
实施例5.用于hOAT瞬时表达的双载体与双顺反子载体的比较
在此实施例中，将双载体***(如述于实施例1中)的使用与重链及轻链来自单个载体(双顺反子载体)的表达相比较。质粒pSUNP4(图2)叙述一种在相同质粒的T-DNA区域具有重链及轻链两者的质粒。(OCS)3MAS被用来驱动抗组织因子的重链及轻链的表达及编码枯草酶的信号序列。
如实施例1中所示，莴苣以带有双载体的两种农杆菌培养菌或以带有双顺反子载体pSUNP4的单一农杆菌培养菌进行渗入而测定hOAT的表达浓度。使用该两种载体***的hOAT的表达浓度的结果显示于表5。
    表5.使用双载体或双顺反子载体的hOAT表达*的比较
    载体***     试验1     试验2
    共瞬时表达     13.4     15.6
    双顺反子表达     25.9     27.6
*表达浓度以mg/kg-生物质量显示，表示由使用同批次植物物质的两次独立渗入试验的测定的平均值
实施例6.抗志贺毒素2(Shiga toxin 2)的重组抗体的瞬时表达
在此实施例中，显示瞬时表达可用于制造另一种抗体。cαStx2为嵌合抗体能结合且中和由肠出血性大肠杆菌所制造的志贺毒素2。将编码cαStx2重链及轻链的基因导入双载体而产生相似于pSUNP1及pSUNP2的cαStx2载体。利用叙述于实施例1的方法将该等结构转移至农杆菌且用以7渗入莴苣。在瞬时表达后，由植物细胞制得抽出物和Protein A纯化后取得的抗体以ELISA分析。
藉由在maxisorp 96-孔盘上包覆Stx2抗原而进行ELISA，该96-孔盘以塑料膜包覆，在使用前储存于4℃。为测量抗体产物，在使用前，将孔以缓冲液清洗3次除去包覆溶液。将植物细胞抽出物或经纯化的蛋白质溶液加至经包覆的孔中。于室温1孵育小时后，以缓冲液将孔清洗3次，而后添加抗-人类卡帕链-HRP抗体的稀释液。于室温下培养1小时后以清洗缓冲液清洗3次。为测定探针抗体的存在，添加ABTS底物试剂且于室温下培养数分钟，接着使用ABST中止缓冲液(quenchbuffer)。在自动读取仪上读出405nm的吸收度。
ELISA分析显示样品有含有功能活性cαStx2抗体的瞬时表达蛋白质。
本领域的技术人员应能辨识，或能确定，常规试验中，与本文所述多种等同的底物及步骤。该相等物皆被认为在本发明的范畴中，且包含于权利要求书中。
虽然本发明以参考特定的具体例而说明，但应了解该具体例仅仅为了阐明本发明的原理及应用。因此应了解有多种修改可用于说明实施例而其它安排皆不偏离权利要求书所界定的本发明的精神与范畴。
叙述于本文中的专利，专利申请案及国际申请案及参考文献，其全文皆合并于此。
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Claims (41)

1.在植物中表达异种蛋白质的方法，包括：
在表面活性剂存在的情况下，用农杆菌细胞渗入植物组织，该农杆菌细胞包含能在植物组织细胞或/和细胞间隙中表达异种多肽的表达结构；在适当的条件下培养植物组织使之表达所述的多肽。
2.在植物中表达异种蛋白质的方法，包括：
用农杆菌细胞渗入植物组织，该农杆菌细胞包含能在植物组织细胞或/和细胞间隙中表达异种多肽的表达结构；在适当的条件下培养植物组织使之表达所述的多肽；从每公斤经处理的植物组织中分离出大约超过1毫克的多肽。
3.在植物中表达异种蛋白质的方法，包括：
用农杆菌细胞渗入植物组织，该农杆菌细胞包含能在植物组织细胞或/和细胞间隙中表达异种多肽的表达结构；在适当的条件下培养植物组织使之表达多肽；其中所用的植物组织来自至少收获1周后的植物。
4.在植物中表达异种蛋白质的方法，包括：
在培养介质中培养包含能在植物组织细胞或/和细胞间隙中表达异种多肽的表达结构的农杆菌细胞；在稀释或未稀释的步骤下，使含有农杆菌细胞的培养介质直接接触植物组织；用含有该农杆菌细胞的培养介质渗入植物组织；在适当的条件下培养植物组织使之表达所述的多肽。
5.根据权利要求1-3和5中的任何一项所述的方法，其中，所述的异种多肽从植物组织中分离出来。
6.根据权利要求1-5中的任何一项所述的方法，其中，载体含有至少一个T-DNA边缘。
7.根据权利要求1-5中的任何一项所述的方法，进一步包括的步骤为把所述的载体导入至少一种农杆菌细胞并进行培养使之获得足够用于植物组织渗入的细胞量。
8.根据权利要求1-5中的任何一项所述的方法，其中所述的植物选自莴苣、苜宿、绿豆、菠菜、蒲公英、菊苣、芝麻菜、苣菜、菊苣茅菜、野苦苣、朝鲜蓟、玉米、马铃薯、米、大豆、十字花科植物、浮萍、蕃茄或烟草。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述的十字花科植物包含芥蓝菜或***芥。
10.根据权利要求1-4中的任何一项所述的方法，其中，所述的农杆菌在使用前经过夜培养且经稀释至600nm吸收度约为2.5。
11.根据权利要求1-4中的任何一项所述的方法，其中，所述的农杆菌使用真空渗入。
12.根据权利要求2-4中的任何一项所述的方法，其中，渗入是在于表面活性剂存在的情况下完成的。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，表面活性剂选自吐温-20、吐温-80、Triton X-100、NP-40或Silwet L-77。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述的表面活性剂选自吐温-20、吐温-80、Triton X-100、NP-40或Silwet L-77。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，表面活性剂为约0.005％的吐温-20。
16.根据权利要求12所述的方法，，其中，表面活性剂为约0.005％的吐温-20。
17.根据权利要求1-5中的任何一项所述的方法，其中，渗入是在用于诱发渗透性震扰(osmotic shock)的试剂存在下进行。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，用于诱发渗透性震扰的试剂为蔗糖。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述的蔗糖的浓度约为60g/L。
20.根据权利要求1-4中的任何一项所述的方法，其中，所述的蛋白质是藉由研磨全植物或叶片而收集的。
21.根据权利要求1-4中的任何一项所述的方法，其中，所述的蛋白质是从植物的细胞间质液收集的。
22.根据权利要求1-4中的任何一项所述的方法，其中，所述的蛋白质被定位到植物细胞的内质网的。
23.根据权利要求1-4中的任何一项所述的方法，其中，多基因是藉由农杆菌传递至植物的。
24.根据权利要求1-4中的任何一项所述的方法，其中，多种农杆菌菌株经结合并被共同渗入到所要的植物中。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，多基因是经由农杆菌株传递的。
26.根据权利要求23所述的方法，其中，多基因编码能被组装而形成多次单元蛋白质。
27.根据权利要求1-4中的任何一项所述的方法，其中，经表达的蛋白质包括免疫球蛋白超级家族蛋白质。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述的蛋白质为抗体、T细胞受体及主要组织相容性复合物、或其生物功能性片段或单链衍生物。
29.根据权利要求25所述的方法，其中，多基因编码包括途径成员的蛋白质。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，该途径指化学合成途径或信号途径。
31.根据权利要求1-4中的任何一项所述的方法，其中，所述的蛋白质是经糖化的。
32.根据权利要求1-4中的任何一项所述的方法，其中，进一步包括的步骤为获得经表达并稳定的导入植物的表达结构。
33.根据权利要求1-4中的任何一项所述的方法，其中，该植物组织来自转基因植物。
34.筛选突变或变异序列的方法，包括：
在多种植物组织样品中以多种表达结构操作根据权利要求1-4中的任何一项所述的方法，该表达结构包括至少约50％同一性的，与其他编码序列相比，存在有一或多个突变的和/或编码一个或多个变异氨基酸的编码序列。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，一个或多个突变包括缺失、***、取代、或重组。
36.根据权利要求34所述的方法，其中，相较于不包括一个或多个突变及不包括编码变异氨基酸序列的异种多肽而言，识别编码具有改善性能的异种多肽的表达结构。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，改善性能包含增加的活性和/或稳定性。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，增加的活性包含异种蛋白质增加的结合亲和力，用以特异性结合所述的异种蛋白质的结合体。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，该蛋白质包含免疫球蛋白超家族的成员。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，该蛋白质选自抗体、T细胞受体及主要组织相容性复合物、或其生物功能性片段或单链衍生物。
41.根据权利要求33所述的方法，其中，一个或多个突变包括将人类序列***来自非人类的动物的异种编码序列。
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