JP2006514823A - 子宮頸癌の同定、評価、予防および治療を行うための組成物、キットおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
米国においては、癌の症例の増加が報告されており、実際、それは世界中で大きな問題となっている。現在、特別なタイプの癌において利用可能な治療は、ほんの一握りしかなく、これらも絶対的な成功を保証するものではない。治療効果を最も高めるためには、これらの治療は、悪性病変の早期検出のみならず、その悪性病変の重篤度の信頼できる評価を必要とする。
Cancer Society、1996)。集団健診プログラムが広範に利用されていない多くの発展途上国においては、その臨床的問題は、一層深刻である。全世界で、新たな症例の数は471,000例、4年生存率はわずかに40%であると推定されている(Munozら、1989、Epidemiology of Cervical Cancer In:"Human
Papillomavirus"、New York、Oxford Press、pp 9-39;National Institutes of
Health、Consensus Development Conference Statement on Cervical Cancer、Apr.1-3,
1996)。
Obstet Gynecol 38(3):600-609)。それは、米国および世界中の他の多くの諸国において導入されて以来、子宮頸癌の発生率および死亡率を70%より高い率で劇的に減少させてきた(Eddy
D.M., 1990, Ann. Intern. Med. 113(3):
214-226)。パップテストにおける異常な形態学的変化については、The Bethesda Systemによって記載されており、それは、ASCUS(意義不明異型扁平上皮細胞)、AGUS(意義不明異型腺細胞)、LSIL(低度扁平上皮内病変)、HSIL(高度扁平上皮内病変)、および扁平上皮腺癌を含んでいる(National
Cancer Institute Workshop: The 1988 Bethesda System for reporting
cervical/vaginal cytologic diagnosis. JAMA,
262(7): 931-934)。パップテストの成功は、前癌病変の診断および治療に主に起因する。
Epidemiol. 141: 680-689)。低い感受性と悪い再現性によって、ASCUSおよびLSIL患者の管理が複雑化していた。ASCUSまたはLSILの診断を最初に受けた女性のフォローアップとして、「促進繰り返しパップテスト(accelerated repeat Pap test)」が推められれば、患者は、潜在的な高度病変の診断の遅れの危険にさらされることになる。しかしながら、これらの患者全般に膣鏡検査を行えば、大多数の女性は過剰治療となるであろう。ASCUS女性の僅か5〜10%が膣鏡検査で高度の疾患を持つとされ、LSILの80%より多くが正常にもどるか、または現状維持とされる(Cox, J.T., 2000, Clinics in
Laboratory Medicine. 20(2): 303-343, Ostor A.G., 1993, Int. J. Gynecol. Pathol. 12(2): 186-192)。
Clin. Obstet. Gynecol. 9:105)。AGUS女性の9〜54%が、生体組織検査で子宮上皮内組織異常増殖が確認され、0〜8%が生体組織検査で上皮内悪性腺癌(AIS)であることが確認され、そして1〜9%未満が浸潤癌であることが確認されている(Wright,
T.C.ら、2002, JAMA, 287(16): 2120-2129)。危険性が高いので、AGUS患者全てに膣鏡検査を行う(Wright,
T. C. ら、2002)。
Silver Spring, MD) やPCRのようなHPV試験が客観的な測定を提供するようである (Wick, M.J., 2000, Clinics in Laboratory Medicine, 20(2):
271-287)。しかしながら、HPV感染の大部分およびその結果の扁平上皮内病変は、特に若年女性においては、自然に退化するので、HPV試験は、その病変が固定したり、浸潤癌に進行したりする患者を特異的に同定することはできない(Sasieni,
P.D., 2000, J. Am. Med. Womens Assoc.
55(4): 216-219, Sasieni, P.D., 2000, Br.
J. Cancer, 83(5): 561-565)。ASCUS−LSILトリアージスタディー(Triage Study )(ALTS)において報告されているように、LSIL女性の83%がハイリスクHPV型において陽性となり、そのレベルがあまりに高いのでトリアージを有用とすることはできない(低度の扁平上皮内病変の細胞学的証拠:無作為化試験のベースラインデータをもつ女性のトリアージを調べるためのヒトパピローマウイルス試験、The Atypical Squamous Cells
of Undetermined Significance/Low-Grade Squamous Intraepithelial Lesions Triage
Study (ALTS) Group, 2000, J. Natl. Cancer
Ist. 92:397-402)。HPV試験を用いたトリアージは、パップテストの結果がASCUSの女性におけるHSIL検出において有意に向上しているにもかかわらず、その特異性は従来の細胞診と同等であった(Solomon、D.ら、2001、J. Natl. Cancer Inst. 93(4):293-299)。より望ましい子宮頚部スクリーニングマーカーによって、全ての子宮頸癌、HSILのその大半、パップテストでLSILおよびASCUSであった患者の中で実際に前癌状態である少数を同定することができるであろう。
Chromosomes Cancer、25(3):195-204)。正常上皮から、前癌病変および浸潤癌への移行は連続的に起こる。形成異常および悪性異常の、形態学的に定義された段階は、腫瘍形成時の細胞遺伝子の変化の現れである。したがって、子宮頸癌の同定、評価、予防および治療に有用なバイオマーカーを提供することが望ましいであろう。
本発明は、表1に記載の癌マーカー(以下、「マーカー」または「本発明のマーカー」と言う)に関する。本発明は、該マーカーによってコードされた、または該マーカーに対応する核酸およびタンパク質を提供する(以下、それぞれ「マーカー核酸」および「マーカータンパク質」と言う)。表1は、添付のシーケンスリスト(配列番号1〜44)に記載の上記マーカー核酸およびタンパク質の配列の識別子を提供する。表2は、新たに同定されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を記載しており、表3は、新たに同定されたヌクレオチド配列を記載している。表1〜3は、添付のシーケンスリストに記載の上記マーカー核酸およびタンパク質の配列の識別子番号、および該マーカーの遺伝子名を提供している。本発明はさらに、上記タンパク質および/または該タンパク質の断片に特異的に結合する抗体、抗体の誘導体、および抗体断片を提供する。
a)患者のサンプルにおける本発明のマーカーの発現レベルと、
b)対照である非子宮頸癌サンプルにおける前記マーカーの発現レベルを、比較することを含む。正常レベルと比較して、患者のサンプルにおけるマーカーの発現レベルが有意に高いとき、該患者が子宮頸癌に罹っていることを示す。
a)患者のサンプルにおける本発明のマーカーセットの発現レベルと、
b)対照である非子宮頸癌サンプルにおける前記マーカーセットの正常な発現レベルを、比較することを含む。正常レベルと比較して、患者のサンプルにおけるマーカーセットの発現レベルが有意に高いとき、該患者が子宮頸癌に罹っていることを示す。
a)患者に対して少なくとも治療の一部を提供する前に、患者から採取した第1のサンプルにおける本発明のマーカーの発現と、
b)治療の一部を提供した後に患者から採取した第2のサンプルにおける前記マーカーの発現を比較することを含む。第2のサンプルにおけるマーカーの発現が、第1のサンプルのそれに比べて有意に低いとき、該治療が患者の子宮頸癌を阻害するために有効であることを示す。
a)患者から採取され、化学的もしくは生物学的薬剤の存在下で保持されている第1のサンプルにおける本発明のマーカーの発現と、
b)患者から採取され、前記薬剤の不存在下で保持されている第2のサンプルにおける本発明のマーカーの発現を比較することを含む。第2のサンプルにおけるマーカーの発現が、第1のサンプルにおけるそれに比べて有意に低いとき、前記薬剤が患者における子宮頸癌を阻害するために有効であることを示す。ある態様において、第1および第2のサンプルは、患者から採取した単一のサンプルの一部、または患者から採取したプールされたサンプルの一部であることができる。
a)第1の時点の患者のサンプルにおいて、本発明のマーカーの発現を検出すること、
b)続く時点において、ステップをa)を繰り返すこと、および
c)ステップa)およびb)において検出された発現レベルを比較し、それによって、患者における子宮頸癌の進行をモニターすることを含む。続く時点で行ったサンプルにおけるマーカーの発現レベルが、第1の時点でのそれに比べて有意に高いレベルであるとき、子宮頸癌が進行したこと、一方、有意に低いレベルであれば、子宮頸癌が退行したことを示す。
a)患者のサンプルにおける本発明のマーカーの発現レベルと、
b)対照サンプルにおける該マーカーの発現の正常レベル(もしくは非転移レベル)を比較することを含む。正常レベル(もしくは非転移レベル)と比較して患者のサンプルにおいて発現が有意に高いレベルであるとき、該子宮頸癌は、転移している、または将来転移する可能性があることを示す。
a)患者から癌細胞を含むサンプルを採取すること、
b)複数の試験組成物の存在下でサンプルのアリコートを別々に維持すること、
c)各アリコートにおける本発明のマーカーの発現を比較すること、
d)他の試験組成物の存在下で、該試験組成物を含有するアリコート中のマーカーの発現レベルを、前記マーカーの発現レベルに対して相対的に、有意に減少させる試験組成物の1つを選択すること。
a)該化合物の存在下および不存在下で、別個のアリコートの子宮頚部細胞を維持すること、
b)該アリコートのそれぞれにおける本発明のマーカーの発現を比較すること。化合物の存在下で維持されたアリコートにおいてマーカーの発現レベルが、化合物の不存在下で維持されたアリコートでのそれと比較して有意に高ければ、該化合物は子宮頸癌発癌可能性を有していることを示す。
a)患者から癌細胞を含むサンプルを採取すること、
b)複数の組成物の存在下で前記サンプルのアリコートを別々に維持すること、
c)各アリコートにおける本発明のマーカーの発現を比較すること、
d)前記他の組成物の存在下でのマーカーの発現レベルに比べて、組成物を含有するアリコートにおけるマーカーの発現レベルを有意に低下させる組成物の少なくとも1つを患者に投与すること。
- 対応するマーカータンパク質(例えば、表1中の「配列番号(AA)」に記載の配列の1つを有するタンパク質、またはタンパク質の断片(例えば、抗体、抗体の誘導体、抗体断片または一本鎖抗体などの、タンパク質もしくはタンパク質断片に特異的に結合する試薬)、
- 対応するマーカー核酸(例えば、表1中の「配列番号(nts)」に記載の核酸配列もしくはその相補配列の1つを有するヌクレオチド転写物)、または核酸の断片(例えば、サンプルから取得した転写ポリヌクレオチドを、そこに「配列番号(nts)」に記載の核酸配列の全体もしくは部分を有する1以上の核酸が固着された基質に接触させること、またはその相補物)
‐ 対応するマーカータンパク質によって直接的(すなわち、触媒される)または間接的に作製される代謝物質の存在を検出する。
発明の詳細な説明
本明細書において用いられている、以下の各用語は、本セクションにおいてそれに関連付けた意味を持つ。
本発明は、正常(すなわち、非癌性)子宮頚部細胞における発現と比較して子宮頸癌細胞において過剰発現する、新たに同定されたマーカーに部分的に基づく。ここでは、子宮頚部細胞において、これらのマーカーの1以上の発現が上昇することは、該組織が癌性状態にあることに関連する。本発明は、子宮頚部細胞(例えば、ヒトから採取した細胞、培養されたヒト細胞、保管もしくは保存されたヒト細胞およびin vivo細胞)の癌性状態を評価し、ならびに子宮頸癌に罹っている患者を治療するための組成物、キットおよび方法を提供する。
1)患者が子宮頸癌に罹っているかどうかを評価すること;
2)ヒト患者における子宮頸癌のステージを評価すること;
3)ヒト患者における子宮頸癌のグレードを評価すること;
4)患者における子宮頸癌の良性または悪性を評価すること;
5)患者における子宮頸癌の転移可能性を評価すること;
6)患者における子宮頸癌に関連する新生物の組織学的タイプを評価すること;
7)子宮頸癌の治療に有用な抗体、抗体断片または抗体の誘導体を作製すること、および/または患者が子宮頸癌に罹っているかどうかを評価すること;
8)子宮頸癌細胞の存在を評価すること;
9)患者における子宮頸癌を阻害するための1以上の試験化合物の有効性を評価すること;
10)患者における子宮頸癌を阻害するための治療の有効性を評価すること;
11)患者における子宮頸癌の進行をモニターすること;
12)患者における子宮頸癌を阻害するための組成物または治療を選択すること;
13)子宮頸癌に罹った患者を治療すること;
14)患者における子宮頸癌を阻害すること;
15)試験化合物の子宮頸癌発癌可能性を評価すること;および
16)子宮頸癌を発症させる危険性のある患者において、子宮頸癌の発症を阻止すること。
(ICN カタログ番号51006)を各ウェルに添加する。該ウェルを上記5%CO2雰囲気で維持し、選択した時間、37℃でインキュベートする。インキュベート後、150マイクロリットルのコンディション培養液を除去し、遠心分離し、浮遊細胞および残骸を除去する。上清中にタンパク質が存在すれば、タンパク質が分泌されたことを示す。
Cancer and Preinvasive Neoplasia, 1996, pp. 90-91参照)漿液性、粘液性、子宮内膜性および明細胞サブタイプならびにサブクラスおよび交互分類(alternate classifications)腺癌、乳頭状腺癌、乳頭状嚢胞腺癌、表面乳頭状癌腫、悪性腺線維腫、嚢胞腺線維腫、腺癌、嚢胞腺癌、腺棘細胞腫、類子宮内膜間質性肉腫、中胚葉(Mullerian)混合腫瘍、悪性癌種、混合上皮腫瘍、および未分化癌腫、悪性子宮頚部腫瘍の分類のためのWHO/FIGOシステムを使用;Scully、Atlas of Tumor Pathology、3d series、Washington
DC)、および種々のグレード(すなわち、グレードI(高分化型)、グレードII(中分化型)、およびグレードIII(周囲正常組織からの低分化型))の前癌状態(例えば、CINまたはSILを含む異常形成)と関連することが確認されるであろう。さらに、より多数の患者のサンプルについて、本発明のマーカーの発現を調べ、そのサンプルを取得した個々の患者の結果を関連付けたところ、本発明の特定のマーカーの発現の変化が悪性癌と強く関連していること、および本発明の他のマーカーの発現の変化が良性腫瘍と強く関連していることも確認されるであろう。したがって本発明の組成物、キットおよび方法は、患者の子宮頸癌の1以上のステージ、グレード、組織学的種類および良性/悪性の性質を特徴付けるのに有用である。
本発明のある局面は、マーカータンパク質またはその部分をコードする核酸を含む、単離された核酸分子に関する。本発明の単離された核酸はまた、マーカー核酸分子およびマーカー核酸分子の断片、例えば、マーカー核酸分子の増幅もしくは変異のためのPCRプライマーとして使用するのに好適なものを確認するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸分子を含む。本明細書において使用される、「核酸分子」という用語は、DNA分子(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)、RNA分子(例えば、mRNA)、およびヌクレオチドアナログを用いて作製したDNAもしくはRNAのアナログを含むことが意図される。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖DNAである。
Cloning: A Laboratory Manual、第2版、 Cold
Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989に記載されている方法参照)によって、核酸分子を単離することができる。
Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.
(1989)のセクション6.3.1-6.3.6において見出すことができる。特にこれらに制限されるものではないが、好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件としては、ハイブリダイゼーションを6X
塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中で約45℃で行い、一回以上の洗浄を0.2 X SSC、0.1%SDS中、50〜65℃で行う条件が挙げられる。
-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5 -メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2
-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2 -メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6-ジアミノプリンが含まれる。
または、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされた(すなわち、次の節でさらに詳しく説明するように、挿入された核酸から転写されるRNAは、関心対象の標的核酸に対してアンチセンス方向である)発現ベクターを利用して、アンチセンス核酸を生物学的に作製することができる。
IIもしくはpol III プロモーターの制御下に置くベクター構築物が好ましい。
Nucleic Acids Res. 15:6131-6148)またはRNA−DNAアナログのキメラ分子(Inoueら、(1987) FEES Lett.
215:327-330)を含み得る。
334:585-591に記載のハンマーヘッドリボザイム)は、mRNA転写物を触媒的に切断するために使用され、これによって、mRNAによってコードされるタンパク質の翻訳を阻害することが可能となる。マーカータンパク質をコードする核酸に対して特異性を有するリボザイムは、マーカーに対応するcDNAのヌクレオチド配列に基づき設計することができる。例えば、テトラヒメナL-19IVS
RNA誘導体は、切断を受けるヌクレオチド配列に相補的であるように構築することが可能である(Cechらの米国特許第4,987,071号、およびCechらの米国特許第5,116,742号参照)。あるいは、本発明のポリペプチドをコードするmRNAは、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNAをRNA分子のプールから選択する際にも用いることができる(例えば、BartelおよびSzostak、1993,
Science 261:1411-1418参照)。
、(1991) Antlcancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene 、(1992) Ann. N.Y. Acad. Sci.
660:27-36; および Maher、(1992) Bioassays 14(12) :807-15を参照されたい。
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-675に記載の標準的な固相ペプチド合成プロトコールを用いてPNAオリゴマーの合成を行うことができる。
(1996) 前掲文献; Perry-O'Keefeら、 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-675)。
Nucleic Acid Res. 17:5973-88)。次いで、PNAモノマーを段階的に結合させ、5'PNAセグメントおよび3'DNAセグメントを有するキメラ分子を製造する(Finnら、(1996)
Nucleic Acids Research 24 (17):3357-63)。あるいは、5'DNAセグメントおよび3'PNAセグメントを用いてキメラ分子を合成することができる(Peterserら、(1975)
Bioorganic Med. Chem. Lett. 5:1119-11124)。
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; 国際公開公報第88/09810号参照)、もしくは血液脳関門を介した輸送を促進するような物質(例えば、国際公開公報第89/10134号)などの他の付属基を含んでいてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション刺激開裂剤(例えば、Krolら、(1988)
Bio/Techniques 6:958-976参照)、または挿入剤(例えば、Zon の(1988) Pharm. Res. 5:539-549参照)などで修飾することもできる。末端において、オリゴヌクレオチドは、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション刺激開裂剤などの他の分子に結合することができる。
本発明の1つの局面は、単離されたマーカータンパク質およびその生物学的活性部分、ならびにマーカータンパク質またはその断片に対する抗体を作製するための免疫原として使用するのに適したポリペプチド断片に関する。ある態様において、天然のマーカータンパク質は、標準的なタンパク質精製の技術を用いることにより、適切な精製スキームで、細胞または組織源から単離することができる。別の態様において、マーカータンパク質の全部またはその一部を含むタンパク質またはペプチドは、組換えDNA技術によって作製される。そのようなタンパク質またはペプチドは、組換えDNA技術の代わりに、標準的なペプチド合成技術を用いた化学合成法で調製することも可能である。
87:2264-2268)、およびKarlinおよびAltschulによりさらに修正されたアルゴリズム( (1993) Proc. Natl Acad.
Sci. USA 90:5873-5877)がある。このようなアルゴリズムは、AltschulらのNBLASTプログラムおよびXBLASTプログラム((1990)
J. Mol. Biol. 215:403-410)に組み込まれている。BLASTによるヌクレオチドの検索は、BLASTNプログラム(本発明の核酸分子に対して相同性を有するヌクレオチド配列を得るためには、スコア
=100、ワード長 =12)で行うことができる。BLASTタンパク質検索は、BLASTPプログラム(本発明のタンパク質分子に対して相同性を有するアミノ酸配列を得るためには、スコア
=50、ワード長 =3)で行うことができる。比較を行う際にギャップの入った配列を得るためには、AltschulらがNucleic Acids Res. (1997)
25:3389-3402に記載しているGapped BLASTと呼ばれる新しいバージョンのBLASTを利用することができる。それは、BLASTN、BLASTPおよびBLASTXプログラムのギャップのある局所配列を行うことができる。あるいは、PSI-Blastは、分子間の遠隔関係を検出する繰り返しサーチを行うために使用することができる。BLAST、Gapped
BLASTおよびPSI-Blastプログラムを用いる際、それぞれのプログラム(例えば、BLASTXおよびBLASTN)のデフォルトパラメータを用いることもできる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。この例に限定されるものではないが、配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの別の好ましい例としては、MyersとMillerのアルゴリズム(CABIOS 4:11-17 (1989))がある。このようなアルゴリズムが、GCG配列並列化ソフトウエアーパッージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを用いる場合には、PAM120ウェイト残基表、ギャップ長ペナルティー12、ギャップペナルティー4が用いられる。局所的配列類似性の識別および並列にとって有用な、さらに別のアルゴリズムは、PearsonとLipman
(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:2444-2448に記載のFASTAアルゴリズムである。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較するためにFASTAアルゴリズムを用いる場合、PAM120ウェイト残基表を、例えば、k-組値=2で用いることができる。
Jolla、California)。さらに別の例においては、有用な原核細胞性の異種シグナル配列は、phoA分泌シグナル(Sambrookら、前掲文献)およびタンパク質A分泌シグナルがある(Pharmacia
Biotech;Piscataway、New Jersey)。
53:323; Itakuraら、(1984) Science 198:1056; Ikeら、(1983) Nucleic Acid Res. 11:477参照)。
(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delgraveら、(1993) Protein
Engineering 6 (3):327-331)。
Today 4:72参照)、EBV-ハイブリドーマ技法(Coleらpp. 77-96 In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss、Inc.、1985)、またはトリオーマ技法などのような標準的な技法を利用してモノクローナル抗体(mAb)を調製する。ハイブリドーマを作製するための技法は公知である(一般的に、Current Protocols in Immunology, Coliganら編、John Wiley & Sons, New York, 1994)。本発明のモノクローナル抗体を作製するハイブリドーマ細胞は、例えば、標準的なELISA法を用いて、対象のペプチドに結合する抗体のハイブリドーマ培養上清をスクリーニングして検出される。
Phage Anbitody System、カタログ番号27-9400-01;およびthe Stratagene SurfZAP Phage Display Kit、カタログ番号240612)。さらに、抗体ディスプレーライブラリーの作製およびスクリーニングに好適な方法と試薬の例としては、例えば以下の文献に記載されたものがある:米国特許第5,223/409号;
国際公開公報第92/18619号; 国際公開公報第91/17271号; 国際公開公報第92/20791号; 国際公開公報第92/15679号; 国際公開公報第93/01288号;
国際公開公報第92/01047号; 国際公開公報第92/09690号; 国際公開公報第90/02809号; Fuchsら、(1991)
Bio/Technology 9:1370-1372; Hayら、(1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huseら、(1989)
Science 246:1275-1281; Griffithsら、(1993) EMBO J 12:725-734。
Science 242:423-426;Whitlow ら、(1991) Methods in Enzymology 2:1-9;Whitlowら、(1991)
Methods in Enzymology 2:97-105;およびHustonら、(1991)
Methods in Enzymology Molecular Design
and Modeling: Concepts and Applications 203:46-88に記載の方法を用いて作製することができる。多特異的抗体は、異なる抗原に特異的に結合する、少なくとも2つの抗原結合部位を持つ抗体である。そのような分子は、当該技術分野において公知の技法によって、例えば、Segalの米国特許第4,676,980号(これを引用によって本明細書全体に援用する);Holligerら、(1993)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:6444-6448;Whitlowら、(1994) Protein Eng. 7:1017-1026および米国特許第6,121,424号に記載の方法によって作製することができる。
Betterら(1988) Science 240:1041-1043;Liuら(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:3439-3443;Liuら(1987) J.
Immunol. 139:3521- 3526;Sunら(1987) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218;Nishimuraら(1987) Cancer Res. 47:999-1005;Woodら(1985) Nature 314:446-449;およびShawら (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559);Morrison (1985) Science 229:1202-1207;Oiら(1986) Bio/Techniques 4:214;米国特許第5,225,539号;Jonesら(1986)
Nature 321:552-525;Verhoeyanら(1988) Science 239:1534;およびBeidlerら(1988) J. Immunol. 141:4053-4060に記載の方法を用いて作製することができる。
Immunol. 13:65-93)を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのこの技術ならびにそのような抗体を作製するためのプロトコルの詳細な説明については、例えば、米国特許第5,625,126号;米国特許第5,633,425号;
米国特許第5,569,825号; 米国特許第5,661,016号;および米国特許第5,545,806号を参照されたい。さらに、Abgenix, Inc.
(Freemont, CA)のような会社は、上記と類似の技術を用いて、選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事している。
Bio/technology 12:899-903)。
anthracin dione)、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにそれらのアナログまたはホモログが含まれる。治療薬としては、限定されないが、代謝物質(例えば、メトトレキサート、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン、5−フロロウラシルデカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル(thioepa
chlorambucil)、メルファラン、カルムスチン(BSNU)およびロムスチン(CCNU)、シクロトスファミド(cyclothosphamide)、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびシス−ジクロロジアンミン白金(II) (DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン(旧ダウノマイシン)およびドキソルビシン)、抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(旧アクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン(AMC))、ならびに抗有糸***剤(例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン)が含まれる。
macrophase colony stimulating factor)(GM−CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)または他の成長因子といった生物学的反応モディファイアなどのタンパク質が含まれる。
Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal
Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeldら(編)、pp.
243−56(Alan R. Liss、Inc. 1985); Hellstromら、"Antibodies
For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.)、Robinsonら(編)、pp. 623−53(Marcel Dekker、Inc. 1987);
Thorpe、"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A
Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical
Applications、Pinchera ら(編)、pp. 475−506(1985);"Analysis、Results、And
Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer
Therapy"、in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwin
ら(編)、pp. 303−16 (Academic Press 1985)、ならびにThorpe
ら、"The Preparation And Cytotoxic
Properties Of Antibody−Toxin Conjugates"、Immunol. Rev.、62:119−58(1982)を参照されたい。
本発明の別の局面は、マーカータンパク質(またはそのようなタンパク質の一部分)をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書において、「ベクター」とは、それが結合した別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味している。ベクターの一形態としては、付加的なDNAセグメントをライゲーションすることが可能な環状の二本鎖DNAループである「プラスミド」が挙げられる。ベクターの他の形態としては、付加的DNAセグメントをウイルスゲノムとライゲーションすることができるウイルスベクターがある。導入先の宿主細胞中で自己複製が可能な特定のベクターも存在する(例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、哺乳動物エピゾーマルベクター)。他のベクター(例えば、哺乳動物非エピゾーマルベクター)は、宿主細胞に導入すると宿主細胞のゲノムに組み込まれるので、宿主のゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクター、いわゆる発現ベクターは、そこに作用的に結合している場合には、その遺伝子を発現させることができる。一般的に、組換えDNA技術で用いる発現ベクターは、プラスミド(ベクター)の形態であることが多い。しかしながら、本発明では、同等の機能を行うウイルスベクター(例えば、複製能のないレトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス)などの他の形態の発現ベクターを含むことも意図される。
Gene Expression Technology vol.185、Academic
Press、San Diego、CA (1991)に記載されている。調節配列とは、様々なタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列を構成的に発現させるものを含み、かつ特定の宿主細胞でのみ、ヌクレオチド配列を発現させる(例えば、組織特異的調節配列)ものをも含む。形質転換される宿主細胞、所望のタンパク質発現レベルなどの選択すべき要素により発現ベクターの設計は変わりうるものであることは、当業者であれば理解するであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、それにより本明細書において記載される核酸によってコードされる融合タンパク質もしくは融合ペプチドを含むタンパク質またはペプチドを作製することができる。
(New England Biolabs、Beverly、MA) およびpRIT5 (Pharmacia、Piscataway、NJ)があり、これらはそれぞれ標的組換えタンパク質に対し、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE結合タンパク質、またはプロテインAとの融合タンパク質を生成する。
In Gene Expression Technology: Methods in Enzymology vol.185,
Academic Press、San Diego、CA、1991)を含む。pTrcベクターを用いた標的遺伝子の発現は、宿主のRNAポリメラーゼによるハイブリッドtrp-lac融合プロモーターからの転写に依存する。pET
11dベクターからの標的遺伝子の発現は、共発現させたウイルスRNAポリメラーゼ (T7gn1)を介したT7 gn10-lac融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、lacUV
5プロモーターの転写制御下にあるT7 gn1遺伝子を有するレジデントプロファージに由来し、宿主株BL21(DE3) もしくはHMS174(DE3)によって供給される。
Expression Technology: Methods in Enzymology vol. 185, Academic Press, San
Diego, CA, 1990)。また別の方策としては、各アミノ酸のコドンが大腸菌中で好適に利用されるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を改変することが挙げられる(Wadaら、1992、Nucleic Acids Res. 20:2111-2118)。本発明の核酸配列におけるこのような配列の改変は、標準的なDNA合成技術によって行うことができる。
Herskowitz、(1982) Cell 30:933-943)、pJRY88 (Schultzら、(1987) Gene 54:113-123)、pYES2
(Invitrogen Corporation、San Diego、CA)、および picZ (InVitrogen Corp、San Diego、CA)が含まれる。
Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) 、および一連のpVLベクター (Lucklow と Summers (1989) Virology
170:31-39)が含まれる。
J. 6:187-195)が挙げられる。哺乳動物細胞の場合、発現ベクターの制御機能はウイルスの調節要素が担うことが多い。例えば、通常用いるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス40に由来する。原核細胞および真核細胞のその他の好適な発現系に関しては、Sambrookらの前掲文献中の16章および17章を参照されたい。
(Calame と Baton (1988) Adv. Iimnunol. 43:235-275)、特にT細胞レセプタープロモーター (Winoto と
Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733)および免疫グロブリンプロモーター (Banerjiら、(1983) Cell
33:729-740; Queen と Baltimore (1983) Cell 33:741-748)、ニューロン特異的プロモーター(例えば、神経線維プロモーター;
Byrne と Ruddle (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:5473-5477)、膵臓特異的プロモーター(Ediundら、(1985)
Science 230:912-916)、および乳腺特異的プロモーター(例えば、乳漿プロモーター; 米国特許第4,873,316号および欧州特許出願第264,166号)が含まれる。発生過程の制御に関わるプロモーターもまたこれに含まれ、例えば、マウスhoxプロモーター
(Kessel と Gruss (1990) Science 249:374-379)、およびα−フェトプロテインプロモーター (Campes と
Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546)が含まれる。
1986, Trends in Genetics, Vol. 1(1)に記載がある。
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986に記載がある。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の作出にも利用できる。ゲノム中の導入遺伝子の有無、および/または動物の組織もしくは細胞における導入遺伝子をコードするmRNAの発現に基づいて、初代トランスジェニック動物を確認できる。初代トランスジェニック動物から、さらに導入遺伝子を保持した動物を繁殖させることができる。さらに、該導入遺伝子を保持したトランスジェニック動物を飼育して、さらに別の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物を創出することもできる。
と Capecchi の(1987) Cell 51:503 に、相同組換えベクターに関する記載がある)。胚性幹細胞株にこのベクターを導入し(例えば、エレクトロポレーション法を用いる)、導入した遺伝子と内因性の遺伝子との相同組換えが起こった細胞を選択する(例えば、Liら、(1992)
Cell 69:915参照)。次に、選択した細胞を動物(例えば、マウス)の胚盤胞に注入して、凝集キメラを形成させる(例えば、Bradley、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A
Practical Approach、Robertson、Ed.、IRL、Oxford、1987、pp. 113-152参照)。キメラ胚を好適な偽妊娠状態の雌を借り腹動物とし、その体内に移して胚を発生させる。相同組換えを起こしたDNAを生殖細胞中に保持する子孫を用い、導入遺伝子の生殖系列への移行を経て、目的の動物の全細胞が相同組換えを起こしたDNAを含む動物を得ることができる。相同組換えベクターの構築と相同組換え動物の作出法は、さらに詳しい説明がBradley
のCurrent Opinion in Bio/Technology 2:823-829 (1991)、国際公開公報第90/11354号、国際公開公報第91/01140号、国際公開公報第92/0968号、および国際公開公報第93/04169号に記載されている。
(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236を参照されたい。リコンビナーゼ系の他の例としては、Saccharomyces cerevisiae のFLPリコンビナーゼ系(0'Germanら、(1991)
Science 251:1351-1355)がある。導入遺伝子の発現の制御を目的としてcre/loxP
リコンビナーゼ系を利用する場合には、Creリコンビナーゼ、および選択されたタンパク質の双方をコードした導入遺伝子を含む動物が必要となる。「二重」トランスジェニック動物を創出することによって、例えば、一方が選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方がリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む二種類のトランスジェニック動物を交配させて、このような動物を得ることができる。
385:810-813ならびに国際公開公報第WO 97/07668号および第WO 97/07669号に記載の方法によっても作出することができる。
本発明の核酸分子、ポリペプチドおよび抗体(本明細書において「活性化合物」とも称する)は、投与に好適な薬学的組成物に組み込むことができる。そのような組成物は、典型的には、核酸分子、タンパク質、もしくは抗体および薬学的に許容される担体を含む。本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」とは、薬学的投与に適合性のある、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌性薬剤および抗真菌性薬剤、等張化剤および吸収遅延剤などのいずれか、またはこれら全てを含むものとする。薬学的に活性のある物質に対するこれらの媒体や薬剤の用途は、当技術分野において周知である。これらの通常用いる任意の媒体または薬剤が活性化合物に対して不適合性を示さない限り、該組成物にこれらを使用することができる。該組成物に補助的な活性化合物を添加することもできる。
J. Med. Chem. 37:2678-85参照)、空間アドレス可能固相(spatially
addressable solid phase)もしくは液相ライブラリー、デコンボリューションを要する合成ライブラリー法;「単一ビーズ・単一化合物」ライブラリー法;およびアフィニティークロマトグラフィーによる選択手法を用いた合成ライブラリー法である。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーを用いたアプローチは、ペプチドライブラリーに限定される一方、他の四種類のアプローチでは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子の化合物ライブラリーのいずれも利用可能である
(Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145)。
Erb ら、 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91:11422; Zuckermannら、 (1994).
J. Med. Chem. 37:2678; Cho ら、 (1993) Science 261:1303; Carrellら、
(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
33:2059; Carell ら、 (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; およびGallopら、(1994) J. Med. Chem. 37:1233に記載がある。
(例えば、Houghten (1992) Bio/Techniques 13:412-421)、またはビーズ表面に表出されているもの
(Lam (1991) Nature 354:82-84)、チップの形態のもの (Fodor (1993) Nature 364:555-556)、細菌および/もしくは胞子(Ladner,
USP 5,223,409)、プラスミド(Cullら、(1992) Proc
Natl Acad Sci USA 89:1865-1869)、またはファージ上(Scott と Smith、1990、Science 249:386-390; Devlin、1990、Science 249:404-406; Cwirlaら、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici、1991、J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner上掲の文献)に記載がある。
72:223-232; Maduraら、1993, J. Biol. Chem.
268:12046-12054; Bartelら1993、Biotechniques
14:920-924; Iwabuchiら、1993 Oncogene 8:1693-1696;およびBrent国際公開公報第94/10300号参照)。そのようなマーカー結合パートナーは、マーカータンパク質もしくはマーカータンパク質が介在するシグナル経路の下流エレメントによるシグナルの伝達に関与している可能性もある。または、そのようなマーカータンパク質結合パートナーはまた、マーカータンパク質のインヒビターである可能性もある。
Chemical, St. Louis, MO)、またはグルタチオンに由来するマイクロタイタープレートに吸着させ、次いでそれを試験化合物、または、試験化合物と非吸着マーカーもしくはその結合パートナーのいずれかと結合させ、その混合物を、複合体を形成させる条件下(例えば、生理学的条件)でインキュベートする。インキュベート後、ビーズもしくはマイクロタイタープレートを十分洗浄し、全ての未結合アッセイ構成成分を除去し、例えば、上記のようにして、固定された複合体を直接もしくは間接的に調べる。あるいは、複合体を基剤から分離し、マーカーの結合レベルまたは活性を標準的な技法を用いて決定することができる。
Chemicals; Rockford、IL)、ビオチン化したマーカータンパク質または標的分子を調製し、ストレプトアビジンをコーティングした96穴プレート
(Pierce Chemical)のウェルに固定化することができる。特定の態様において、タンパク質固定化された表面を予め調製し、保存しておくことができる。
Biochem Sci 1993 Aug;18(8):284-7参照)。標準的なクロマトグラフィー技法を用いて、複合体化された分子と複合体化されていない分子を分離してもよい。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーは、大きさに基づいて分子を分離し、例えば、適切なゲル濾過樹脂をカラムフォーマットに用いることによって、例えば、比較的大きな複合体と比較的小さな複合体化されていない成分とを分離することができる。同様に、複合体の複合体化されていない分子に対する相対的に異なる負荷特性を、複合体と残存する個別の反応物とを異なるように分離するために、例えば、イオン変換クロマトグラフィー樹脂を用いて、利用することもできる。そのような樹脂およびクロマトグラフィーの技法は、当業者に公知である(例えば、Heegaard、1998、J Mol. Recognit. 11:141-148;HageとTweed、1997、J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl.、699:499-525参照)。複合体分子と未結合種を分離するためにゲル電気泳動を採用することもできる(例えば、Ausubelら(編)
Current Protocols in Molecular Biology、J. Wiley & Sons、New York. 1999)。この技法においては、タンパク質または核酸複合体は、例えば、大きさまたは電荷に基づいて分離される。電気泳動プロセス中の結合相互作用を維持するために、還元剤の不存在下でゲルを変性することが典型的に好ましいが、特定の相互作用物質に好適な条件が当業者には公知であろう。免疫沈降は、タンパク質−タンパク質複合体を溶液から単離するために用いられる別の一般的な技法である(例えば、Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular
Biology、J. Wiley & Sons, New York. 1999)。この技法においては、抗体を、遠心分離によって容易に回収され得るポリマービーズに結合させることによって、結合分子の1つに特異的な抗体に結合する全てのタンパク質を溶液から析出させる。結合アッセイ成分は、ビーズから(特異的なタンパク質分解、または、複合体におけるタンパク質−タンパク質相互作用を妨害しないであろう、当該技術において公知の他の技法によって)解放させ、そして第2の免疫沈降ステップを行う。このとき、対応して異なる相互作用アッセイ成分に特異的な抗体を使用する。この方法においては、形成された複合体のみが、ビーズに付着されたままとなる。試験化合物の存在下および不存在下における複合体形成の変化量を比較することができる。これによって、マーカータンパク質とその結合パートナーの間の相互作用を調節する化合物の能力に関する情報を提供する。
(局所)、経粘膜、および直腸への投与が挙げられる。非経口、経皮的もしくは皮下への投与に用いられる溶液または懸濁液は、次のような成分を含む:注射用水等の滅菌希釈剤、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールもしくはその他の合成溶媒; ベンジルアルコールもしくはメチルパラベン類等の抗細菌剤; アスコルビン酸もしくは亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤;エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤;
酢酸、クエン酸もしくはリン酸等の緩衝剤、および塩化ナトリウムもしくはデキストロース等の等張性を調整する薬剤である。pHは、塩酸もしくは水酸化ナトリウム等の酸もしくは塩基によって調整される。非経口投与で用いる製剤は、アンプル、使い捨て注射筒または複数容量のガラスもしくはプラスチック製バイアルに詰めることができる。
コロイド状二酸化ケイ素等の滑剤; ショ糖もしくはサッカリン等の甘味剤;または ペッパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ矯味剤等の矯味矯臭剤が該当する。
J. Acquired Immune Deficiency Syndromes
and Human Retrovirology 14:193に記載されている。
Acad. Sci. USA 91:3054-3057参照)などにより、対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの薬学的製剤は、許容される希釈剤に溶かした遺伝子治療ベクターを含むものであってもよく、遺伝子送達賦形剤を埋め込まれた遅延放出基剤からなるものであってもよい。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターを組換え細胞からインタクトに作製できる場合(例えば、レトロウイルスベクター)、薬学的製剤は、遺伝子送達系を産生する1以上の細胞を含むことができる。
本発明は、予後(予測)目的で、診断アッセイ法、予後アッセイ法、薬理ゲノム学、および臨床試験モニタリングを用い、それにより個々の患者の予防的処置を行う予測医学の分野に関する。したがって、本発明の一局面は、ある個体が子宮頸癌を発症する危険性を有しているかどうかを決定するために、1以上のマーカータンパク質または核酸の発現のレベルを決定する診断アッセイに関する。このようなアッセイは、予後または予測の目的で実施することができ、これを用いることによって癌の発症前の個体を予防的に治療することができる。
生物学的サンプル中のマーカータンパク質または核酸の有無を検出する方法の例は、生物学的サンプル(例えば、子宮頚部に関連する体液)を試験対象から取得すること、および該生物学的サンプルをポリペプチドまたは核酸(例えば、mRNA、ゲノムDNAまたはcDNA)を検出することが可能な化合物もしくは薬剤に接触させることを含む。したがって、本発明の検出方法は、例えば、生物学的サンプル中のmRNA、タンパク質、cDNAまたはゲノムDNAをin vitro およびin vivoで検出するために使用することができる。例えば、mRNAを検出するためのin vitro 技法は、ノーザンハイブリダイゼーション法およびin situハイブリダイゼーション法を含む。マーカータンパク質を検出するためのin vitro 技法は、固相酵素免疫検定法(ELISA)、ウェスタンブロット法、免疫沈降法および免疫蛍光法を含む。ゲノムDNAを検出するためのin vitro 技法は、サザンハイブリダイゼーション法を含む。さらに、マーカータンパク質を検出するためのin vivo技法は、対象をタンパク質またはその断片に対する標識抗体に導入することを含む。例えば、該抗体は、その対象中における存在および位置が標準的な画像技術によって検出することが可能な放射性マーカーで標識することができる。
Chemicals; Rockford、IL)、ビオチン化したアッセイ成分を調製し、ストレプトアビジンをコーティングした96穴プレート (Pierce
Chemical)のウェルに固定化することができる。特定の態様において、アッセイ成分が固定化した表面を予め調製し、保存しておくことができる。
Current Protocols in Molecular Biology、J. Wiley & Sons、New York. 1999)。この技法においては、タンパク質または核酸複合体は、例えば、大きさまたは電荷に基づいて分離される。電気泳動プロセス中の結合相互作用を維持するために、変性されていないゲル基剤および還元剤が不存在の条件が典型的に好ましい。特定のアッセイおよびその成分に好適な条件は当業者に公知であろう。
Wiley & Sons、New York 1987-1999)。さらに、多数の組織サンプルを、当該技術分野の当業者に公知の技法、例えば、Chomczynski(1989,
米国特許第4,843,155号)のシングルステップRNA単離プロセスを用いて、容易に処理することができる。
sustained sequence replication)(Guatelliら、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878)、転写増幅系(Kwohら、1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177)、Q-ベータ複製酵素(Lizardiら、1988,
Bio/Technology 6:1197)、ローリングサークル複製(Lizardiら、米国特許第5,854,033号)、または他の核酸増幅方法、それに続く増幅された分子の、当該技術分野において公知の技法を用いた検出方法などを含む。このような核酸分子の検出法は、その分子の含量が極微量である場合の核酸分子の検出に特に有用である。本明細書において用いられているように、増幅プライマーは、遺伝子の5’または3’領域にアニールすることができ、短い領域を含む一対の核酸分子として定義される。一般的に、増幅プライマーは、約10〜30ヌクレオチド長であり、約50〜200ヌクレオチド長の領域に隣接する。適切な条件下で、かつ適切な試薬を用いて、そのようなプライマーは、プライマーが隣接するヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を行うことができる。
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New
York)に記載のような方法がある。
本発明のマーカーは、薬理ゲノミクスマーカーとして有用でもある。本明細書に用いられているように、「薬理ゲノミクスマーカー」とは、その発現レベルが患者における特異的な臨床的薬物反応または感受性に相関する1つの客観的な生化学的マーカーである(例えば、McLeodら (1999) Eur. J. Cancer
35 (12):1650-1652)。薬理ゲノミクスマーカーの発現の存在または量は、患者の予測される反応、および、より詳細には特異的な薬物もしくはクラスの薬物を用いて行う患者の腫瘍に対する治療に関する。患者における1以上の薬理ゲノミクスマーカーの発現の存在または量は、患者にとって最も適切であり、または成功率が高いことが予測される治療を選択することができる。例えば、RNAまたは特異的な腫瘍マーカーにコードされたタンパク質の存在に基づいて、患者において存在する可能性がある特異的な腫瘍の治療にとって最適化された薬物または治療のクールを選択することができる。したがって、薬理ゲノミクスマーカーの使用によって、異なる薬物または治療計画を試みることなく、各癌患者にとって最も適切な治療を選択または設計することが可能になる。
薬剤(例えば、薬物化合物)が本発明のマーカーの発現レベルに及ぼす影響をモニターすることは、基本的な薬物スクリーニングのみならず、臨床試験にも適用することができる。例えば、薬剤のマーカー発現に対する有効性は、子宮頸癌の治療を受けている対象の臨床試験においてモニターすることができる。好ましい態様において、本発明は、薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティクス、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、または他の候補薬剤)で対象を治療する際の有効性をモニタリングする方法を提供する。この方法は、次のステップを含む。すなわち、(i)薬剤投与前に対象から投与前サンプルを採取するステップ;(ii)投与前サンプル中の1以上の選択された本発明のマーカーの発現レベルを検出するステップ;(iii)対象から1以上の投与後サンプルを採取するステップ;(iv)投与後サンプルにおけるマーカーの発現レベルを検出するステップ;(v)投与前サンプルにおけるマーカーの発現レベルと投与後サンプルにおけるマーカーの発現レベルとを比較するステップ;および(vi)それにより、対象への薬剤の投与を変えるステップ。例えば、治療クールの中でマーカー遺伝子の発現が増加することで、有効でない用量と望ましい増加用量が示され得る。逆に、マーカー遺伝子の発現が減少することで、有効な治療と用量を変える必要のないことが示され得る。
本発明のマーカーを含む、媒体読取可能電子装置も提供される。本明細書において用いられている「媒体読取可能電子装置」は、電子装置によって直接的に読み取り、アクセスすることが可能なデータまたは情報を記憶、保持または格納するためのあらゆる好適な媒体を意味する。そのような媒体としては、限定されないが、フロッピー(登録商標)ディスク、ハードディスク記憶媒体および磁気テープなどの磁気記憶装置;コンパクトディスクなどの光記憶装置;RAM、ROM、EPROM、EEPROMなどの電子記憶装置;一般的なハードディスクおよびこれらのカテゴリーのハイブリッド、例えば、磁気/光記憶媒体などが含まれる。該媒体は、そこに記録された本発明のマーカーを保持するために採用され、または構成されている。
本発明のマーカーは、1以上の障害もしくは疾患状態の、または疾患状態、特に子宮頸癌に進みうる状態のサロゲートマーカー(surrogate markers)として機能することもできる。本明細書に記載されている「サロゲートマーカー」は、疾患もしくは障害の有無、または疾患もしくは障害(例えば、腫瘍の有無)の進行に関連する客観的な生物学的マーカーである。そのようなマーカーの存在または量は、疾患に依存している。したがって、これらのマーカーは、特定の治療クールが、疾患状態もしくは障害を和らげるのに有効であるか否かを示すために機能する。サロゲートマーカーは、疾患状態もしくは障害の存在または程度が、標準的な方法では評価することが困難な場合(例えば、早期段階の腫瘍)、または潜在的に危険な臨床的エンドポイントに達する前に疾患の進行の評価を行うことが望ましい場合(例えば、心筋梗塞や完全に発症したAIDSといった望ましくない臨床的転帰にいたる前に十分前もって、心臓血管系の疾患には、コレステロールレベルをサロゲートマーカーとして用い、HIV感染の分析には、HIV
RNAレベルをサロゲートマーカーとして用いることができる)。当該技術分野における、サロゲートマーカーの使用の例としては、Koomenら(2000) J. Mass. Spectrom. 35: 258-264;およびJames
(1994) AIDS Treatment News Archive
209に記載されている。
S21-S24;およびNicolau (1999) Am, J.
Health-Syst. Pharm. 56 Suppl. 3: S16-S20に記載がある。
I.材料と方法
サンプル採集およびRNA調製
子宮頚部組織を採集し、液体窒素においてスナップ凍結(snap frozen)した。RNA抽出を行う前に、組織の組織学的特性および細胞組成物を確認した。全てのRNAを凍結組織から、Trizol
Reagent (Life Technologies) を用いて抽出し、RNAプローブ標識効率を増加させるために、その後2次的なクリーンアップステップをQiagen’s
RNeasyキットを用いて行った(Qiagen、Valencia CA)。Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer
(Palo Alto、CA)を用いて計算した28S/18SリボソームRNA比率が少なくとも1.0であるRNAのみを本研究に用いた。
Research Genetics (Hunstville、AL)からの30,732のUnigeneクローンを含有するcDNAマイクロアレイをナイロンフィルター上に作製した。全RNAの合計4-6
ugを鋳型として用いて、33P−dCTP、オリゴdT−30プライマーおよびSuperscript II Reverse
Transcriptase (Life Technologies)を用いた逆転写によって、放射性同位体で標識されたcDNAを作製した。33P標識された第1の鎖のcDNAをcot-1
DNAおよびpoly-dA 40-60 (Pharmacia、Peapack, NJ)を用いて前アニーリングし、非特異的ハイブリダイゼーションを減少させた。各フィルターを65oCで16時間、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、250mM
Na3PO4 (pH7.2)、1mM EDTA、0.5%カゼイン−ハマースタインおよび0.1mg/mlの変性サケ***DNAを含有する緩衝液中、約6×106 個の標識プローブを用いてハイブリダイズした。該フィルターを4%と1%のSDS洗浄緩衝液(20mM
Na3PO4(pH7.2)、1mM EDTAおよび4%もしくは1%SDS)で洗浄した後、それらをFujiスキャナーBAS
2500を用いてFuji Phosphoimager スクリーンに露出し、走査した。自動アレイ分析プログラムGrid Guru v1.0(Millennium
Pharmaceuticals, Inc.が開発)を用いて、スポットを定量した。
ハイブリダイゼーション効率の差を補正するために、各マイクロアレイフィルターからのデジタル化されたデータを、そのフィルター上の全てのスポットの強度の中間値によって正規化した。全てのアレイベースおよび遺伝子ベースの階層的クラスタリングを行い、Stanford’s Gene Cluster and Tree Viewソフトウェアを用いて視覚化した。それぞれの遺伝子につき、Marker
Scoreを計算することによって、異なるように発現した遺伝子をランク付けした。
Scoreからの望ましい性能は、漸近的圧縮関数を用いて、テスターサンプル全体において平均折り畳み変化を行う前に、テスター:対照の発現比を変換することによって、達成した。Marker
Scoreは、テスターが対照に比べてより高度に発現しているとは思われないとき、値は1である。そして、そうでないときは1より大きい。Marker Scoreは、どの遺伝子についても10を超える値とはならない。
は、圧縮されたテスター:対照の平均として計算される。すなわち、
Sg = (ΣSgs)/ Nテスター
Sgs = C(xgs/(k+xg Q))、
但し、Sgs は、遺伝子gとサンプルsのMarker
Scoreを表し、C(r)は、圧縮関数であり、r≧1のときは、C(r) = A(1-e-r/A)、そしてr < 1のときは、C(r)
= 1であり、Aは、折り畳み変化値(ここでは10を用いている)の上漸近線であり、xgs は、サンプルsの遺伝子gの発現値であり、xg Q は、対照のサンプルの発現比のQ番目のパーセンタイルであり(典型的にはQ = 50)、kは、データの付加雑音を反映させた定数、すなわち、繰り返し測定値の固定された成分である。0.25の値は、このパラメータのために検量実験からマイクロアレイ技術を用いて導かれたものである。Nテスターは、テスターサンプルの数を表す。
正常な、低度の扁平上皮内病変(LSIL)、高度の扁平上皮内病変(HSIL)、扁平上皮癌(SCC)および腺癌(ACA)を含有するホルマリン固定、パラフィン包埋された子宮頚部組織マイクロアレイが提供された。自動Tissue-Tek DRS 2000 Slide Stainer (Sakura, Torrance, CA)で、前述のプロトコル(Duncan,
L.M.ら、2001、J. Clin. Oncol. 19 (2):
568-576)を用いて、前ハイブリダイゼーション処理を行った。子宮頚部組織を脱パラフィン化し、再水和し、4%パラホルムアルデヒド/PBS溶液を15分間添加した。PBSで洗浄後、組織マイクロアレイを2ug/mlプロテイナーゼKで37℃で15分間消化し、再び、4%パラホルムアルデヒド/PBS溶液とともに10分間インキュベートした。次いで、組織切片を0.2N
HCLとともに10分間、0.25%無水酢酸/0.1mol/Lトリエタノールアミンで10分間インキュベートし、段階的エタノールで脱水した。アンチセンスプローブを、IMAGEクローンに由来する500ngの線形プラスミドDNAを用いたin vitro 転写反応において35S-UTPで標識した(Riboprobe
Combination System、Promega、Madison、WI)。50%ホルムアルデヒド、10%硫酸デキストラン、1xDenhardt’s 溶液、0.6M
NaCl、10mM DTT、0.25%SDSおよび200 ug/ml tRNAを含有する10mM Tris−HCl(pH7.6)中で、5x107cpm/mlで標識したプローブを用いて、ハイブリダイゼーションを50℃18時間行った。ハイブリダイゼーション後、スライドを、5x塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)で50℃で10分間、50%ホルムアミド/2xSSCで50℃で10分間、10mM
Tris-HCl(pH7.6)/500mM NaCl/1mM EDTA(TNE)で37℃で10分間洗浄し、TNE中10ug/ml Rnase Aとともに37℃で30分間インキュベートし、TNE中で37℃で10分間洗浄し、2xSSCとともに50℃で20分間1回、0.2xSSC中で50℃で20分間2回インキュベートし、段階的エタノールで脱水した。mRNA転写物の位置確認を、スライドをKodak
NTB2 フォトエマルジョン(Eastman Kodak、Rochester、NY)に浸漬し、14〜21日4℃に曝すことによって行った。該スライドをMyersヘマトキシリンとアルコール性エオシンを用いて対比染色した。
cDNAマイクロアレイによる子宮頚部組織の転写プロファイリング
12の正常な子宮頚部組織(子宮膣部から9、子宮頚内膜から3)、5のLSIL、5のHSIL、9のSCCおよび3のACAを、30,732個のクローン(30Kマイクロアレイ)を含有するcDNAマイクロアレイ上でプロファイルを行った。データセットが疾患組織と正常組織を区別する能力を評価するために、遺伝子発現パターンにおける全体的な類似性に基づいて、34個のサンプルのデータセットの階層的クラスタリングを行った(図1)。デンドログラムは、12個の正常子宮頚部組織のうち10個およびLSILサンプルの全てが群を成し(「対照群」と呼ぶ)、12個の腫瘍サンプルのうち11個および5個のHSILサンプルのうち3個が他の群を成している(「疾患群」と呼ぶ)ことを示している。この分離は、正常な子宮膣部上皮、正常な子宮頚管内上皮およびLSILの全体的な遺伝子発現プロファイルは非常に類似しており、3/5HSILサンプルの発現プロファイルは子宮頸癌により詳細に類似していることを示している。これらの所見は、サンプルは、異なる年齢の患者から、および異なる臨床部位から採取されたという事実にもかかわらず、対照組織と疾患組織とを区別することが可能な強いデータセットを示している。
対照組織群と疾患群とを区別するであろう遺伝子マーカーを同定するために、各クローンについて、30K
cDNAマイクロアレイ上で、3つのマーカー選択パラダイム(9個のSCC 対 対照群(9個の子宮膣部、3個の子宮内膜および5個のLSIL)、5個のHSIL 対 対照群、ならびに3個のACA
対 対照群)からマーカースコアを計算した。子宮頚部細胞の形質転換に関連する新たなマーカーを発見するために、マーカー選択中、免疫応答(すなわち、免疫グロブリン、MHC)に関連するアップレギュレートされた遺伝子を除外した。SCCまたはACAパラダイムから、上位50位にランクされたマーカースコアを持つクローン、ならびにSCCおよびACAの双方において過剰発現した50〜100位にランクされたクローンをトップマーカーとして選択した。腫瘍における発現の増加が良好なマーカー性能にとって不可欠であると考えられたため、HSILパラダイムからのスコアは、マーカーを選択するために独立して使用しなかった。マーカーを選択し、SCC、ACAおよびHSILパラダイムにおけるそれらのスコアを表4に示す。SCCサンプルからのアップレギュレートされた遺伝子の大半は、ACAにおいても上昇することがわかった。SCCおよび/またはACAパラダイムから選択された多くのマーカーは、3.0以上のスコアを有する一方、HSILマーカーの僅かのみが2.0以上のスコアを有していた。このことは、形成異常から浸潤癌へ病変が進行するのに伴って発現が増加することを示すものであることを示している。図2は、正常、LSIL、HSIL、SCCおよびACA組織中の、典型的な、しかし明確なタイプの発現パターンを表す、表4からの2つの遺伝子を示す。MCM6は、HSIL、扁平上皮癌および腺癌中で過剰発現した。一方、Claudin
1は、扁平上皮癌のみで過剰発現した。
臨床組織サンプルにおいてISHによってマーカーも評価した。ISH実験を組織マイクロアレイを用いて行い、転写プロファイリング結果を確認し、mRNA発現の増加に関与する細胞タイプを決定した。切片化したパラフィンブロックのレベルに基づいて、26〜87個の正常子宮頚部組織コア(子宮膣部および子宮頚内膜)、2〜10個のLSIL、5〜33個のHSILならびに10〜21個の癌コア(SCC、ACAおよび低分化型癌腫)を調べた。一般的に、子宮頚部上皮細胞においてISHシグナルが検出された(表5)。上皮細胞において過剰発現する遺伝子は、細胞成長および細胞−ECM相互作用を担う。数個の遺伝子が上皮細胞によって異なるように発現した。この所見は、癌の進行中の子宮頚部上皮とそのミクロ環境との間の協調的な遺伝子制御(coordinated gene regulation)を示唆する。
1発現は、上皮に限定されており、cDNAマイクロアレイ上でプロファイルされた5個のHSILおよび3個のACAサンプルでは有意な上昇はなかった(図2)。理論に拘束されるわけではないが、この場合、ISHの感受性の増加は、シグナルの限局性によるものであろう。そのような限局性シグナルは、ISHによって容易に識別できるが、組織ホモジネート全体のRNA調製においては欠落し得るものである。
RNA調製
種々のヒト組織から、TRIZOL試薬を用いた単一ステップの抽出法によって、製造元(Invitrogen)の指示にしたがって全RNAを調製した。各RNA調製物を、DNase
I (Ambion)を用いて37℃で1時間処理した。β−2ミクログロブリンを内部単位複製配列基準として用いて、閾値レベルの蛍光発光に到達するために、サンプルが少なくとも38のPCR増幅サイクルを必要としている場合(または18sリボソーム遺伝子のための35のPCR増幅サイクル)、DNAse
I 処理は、完全であると決定された。DNase I治療後におけるRNAサンプルの完全性をアガロースゲル電気泳動とエチジウムブロミド染色によって確認した。フェノール抽出後、Taqman
Reverse Transcription Reagentsを用いて、製造元(Applied Biosytems)の指示にしたがって、cDNAをサンプルから調製した。RNAの陰性対照を逆転写酵素を用いずに、各RNAサンプルについて、模擬逆転写した。
種々の正常および疾患(例えば、癌性)ヒト組織または細胞株から調製したcDNAにおいて、遺伝子発現をTAQMAN(登録商標)定量PCR(Applied Biosystems)によって測定した。
特異的な遺伝子およびそれらの関連する転写物に基づいて、PrimerExpressソフトウェア(Applied Biosystems)を用いて、プローブを設計した。各標的遺伝子プローブを、FAM
(6-cカルボキシフルオレセイン)を用いて標識し、18s参照プローブを異なる蛍光塗料VICで標識した。したがって、標的遺伝子および内部参照遺伝子の異なる標識は、同じウェル内で測定することができた。プライマーおよびプローブを、特異的遺伝子の各転写物に対するそれらの感受性および特異性について調べた。フォワードプライマーおよびリバースプライマーならびに18sおよび標的遺伝子のプローブを、TAQMAN(登録商標)Universal
PCR Master Mix (Applied Biosystems)に添加した。プライマーとプローブの最終濃度は変わり得るが、それぞれは、所与の実験において本質的に一致していた。典型的な実験は、100nMのフォワードプライマーおよびリバースプライマーと200nMの18sのプローブ、ならびに900nM
のフォワードプライマーおよびリバースプライマーと標的遺伝子の250nMプローブを含有していた。ABI PRISM 7700 Sequence
Detection System (Applied Biosystems)上でTAQMAN(登録商標)基質実験を行った。熱サイクル条件は以下のようにした。すなわち、50℃で2分、95℃で10分保持し、2ステップのPCRを95℃で15秒、続いて、60℃で1分を40サイクル行った。
(F1)、リバース1(R1)およびプローブ 1 (P1) を用いて確認する。
異なるサンプルからの全RNAを、第1の鎖cDNAを作製するための鋳型として使用するためにプールした。子宮頚部のパネルは、子宮頚部の腫瘍プール、子宮頚部の正常プール、「その他の正常」プール、および「その他の腫瘍」プールで構成した。プールは、等量の各サンプルで構成した。
オリゴ(dT)20プライマー(容積10μl)を用いて、製造元の指示にしたがって、1μgのRNAを65℃で5分間変性した。85℃で5分間インキュベートして、反応を止めた。最終生成物を水で希釈し、最終容積を100μlとした。
表1は、本発明のマーカー(配列番号1〜44)を確認して示している。名称(「マーカー」)、適切であれば、それによって遺伝子が一般的に知られている名称 (「遺伝子名」)、マーカーによってコードされた、またはマーカーに対応するヌクレオチド転写物のcDNA配列のシーケンスリストの識別子(「配列番号(nts)」)、ヌクレオチド転写物によってコードされたタンパク質のアミノ酸配列のシーケンスリストの識別子(「配列番号(AAs)」)、およびcDNA配列内の配列をコードするタンパク質の位置
(「CDS」)で示している。
(「CDS」)で示している。
Primer 2 のマッチング位置に対応する遺伝子特異的プライマー(「マッチング位置:Taqman Primer 2」)、Taqman Probe のマッチング位置に対応する遺伝子特異的プライマー(「マッチング位置:Taqman
Probe」)、エンドポイントPCRプライマー1のマッチング位置に対応する遺伝子特異的プライマー(「マッチング位置:Endpoint PCR Primer 1」)、およびエンドポイントPCRプライマー1のマッチング位置に対応する遺伝子特異的プライマー(「マッチング位置:Endpoint
PCR Primer 1」)で示されている。表7は、フォワード1方向(「F1」);フォワード2方向(「F2」);リバース1方向(「R1」);リバース2方向(「R2」)のプライマー、ならびにプローブ(「P1」はプローブ1、「P2」は、プローブ2を示す)を確認して示している。
(F1)、リバース1プライマー(R1)およびプローブ1(P1) を用いたMarker M30Aを確認している。
当該技術分野の当業者は、ルーチンの実験以上のことを行わずに、本明細書に記載した本発明の特別な態様に対する多くの等価物を認識し、または確かめることができるであろう。このような等価物は添付した特許請求の範囲内にあると意図している。
Claims (48)
- 患者が子宮頸癌に罹っているか、または前癌状態を有しているかを評価する方法であって、前記方法は、 a)患者のサンプルにおけるマーカーであって、表1に記載のマーカーからなる群から選択されるマーカーの発現レベルと、 b)正常な対照の子宮頸癌(cervical cancer)サンプルにおけるマーカーの発現レベルとを比較することを含み、 前記患者のサンプルにおけるマーカーの発現レベルと正常レベルとの間に有意差が認められれば、前記患者が子宮頸癌に罹っている、または前癌状態を有していることを示す、方法。
- 前記患者がCINまたはSILを有している、請求項1に記載の方法。
- 前記マーカーが分泌されたタンパク質に対応する、請求項1に記載の方法。
- 前記マーカーが転写されたポリヌクレオチドまたはその一部に対応し、前記ポリヌクレオチドが前記マーカーを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルが前記患者から採取された細胞を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルが子宮頚部スミアである、請求項5に記載の方法。
- 前記細胞は、腹膜洗浄によって回収された液体、子宮洗浄によって回収された液体、子宮液、子宮滲出液、胸膜液、嚢胞液、および子宮頚部滲出液からなる群から選択される液体中にある、請求項5に記載の方法。
- 前記サンプルにおけるマーカーの発現レベルは、サンプル中の、前記マーカーに対応するタンパク質の存在を検出することによって評価される、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質の存在は、タンパク質に特異的に結合する試薬を用いて検出される、請求項8に記載の方法。
- 前記試薬は、抗体、抗体の誘導体および抗体断片からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記サンプルにおける前記マーカーの発現レベルは、サンプル中の、転写されたポリヌクレオチドまたはその一部の存在を検出することによって評価され、前記転写されたポリヌクレオチドは前記マーカーを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記転写されたポリヌクレオチドは、mRNAである、請求項11に記載の方法。
- 前記転写されたポリヌクレオチドは、cDNAである、請求項11に記載の方法。
- 前記検出ステップは、前記転写されたポリヌクレオチドを増幅することをさらに含む、請求項11に記載の方法。
- 前記サンプルにおける前記マーカーの発現レベルは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記マーカーを用いてアニーリングするか、またはポリヌクレオチドの一部を用いてアニーリングする転写されたポリヌクレオチドであって、前記マーカーを含むポリヌクレオチドの、前記サンプル中における存在を検出することによって評価される、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルにおける前記マーカーの発現レベルは、子宮頸癌に罹っていない患者におけるマーカーの発現の正常なレベルと、少なくとも約2のファクターにおいて相違する、請求項1に記載の方法。
- 前記サンプルにおける前記マーカーの発現レベルは、子宮頸癌に罹っていない患者におけるマーカーの発現の正常なレベルと、少なくとも約5のファクターにおいて相違する、請求項1に記載の方法。
- a)表1に記載のマーカーから独立に選択された、複数のマーカーのそれぞれの、前記サンプルにおける発現レベルと、
b)複数のマーカーのそれぞれの、正常な対照ヒト子宮頚部サンプルから採取したのと同じタイプのサンプルにおける発現レベルとを比較することを含み、
複数のマーカーの発現レベルが、前記マーカーの対応する正常な発現レベルに対して有意に変化していると、患者は子宮頸癌または前癌状態に罹っていることを示す、請求項1に記載の方法。 - 前記マーカーのそれぞれの発現レベルが、前記マーカーの対応する正常な発現レベルに対して有意に変化していると、患者は子宮頸癌に罹っていることを示す、請求項18に記載の方法。
- 前記複数は、前記マーカーのうち少なくとも3つを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記複数は、前記マーカーのうち少なくとも3つを含む、請求項18に記載の方法。
- 患者における子宮頸癌または前癌状態の進行をモニターする方法であって、
a)患者のサンプルにおいて、第1の時点でマーカーの発現を検出すること、ここで前記マーカーは表1に記載のマーカーからなる群から選択される、
b)続く時点において、ステップa)を繰り返すこと、および
c)ステップa)とb)で検出された発現レベルを比較し、それによって患者における子宮頸癌または前癌状態の進行をモニターすることを、含む方法。 - 前記マーカーは、分泌されたタンパク質に対応する、請求項22に記載の方法。
- 前記マーカーは、転写されたポリヌクレオチドまたはその部分に対応し、前記ポリヌクレオチドは、前記マーカーを含む、請求項22に記載の方法。
- 前記サンプルは、患者から採取した細胞を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記患者のサンプルは、子宮頚部スミアである、請求項25に記載の方法。
- 前記第1の時点と続く時点の間において、前記患者は腫瘍を摘出する手術を受ける、請求項22に記載の方法。
- 患者における子宮頸癌を阻害するための試験化合物の有効性を評価する方法であって、前記方法は、
a)患者から採取し、試験化合物に曝された第1サンプルにおけるマーカーであって、表1に記載のマーカーからなる群から選択されるマーカーの発現と、
b)患者から採取した、前記試験化合物に曝されていない第2のサンプルにおけるマーカーの発現とを比較することを含み、
前記第1サンプルにおけるマーカーの発現レベルが、第2のサンプルと比べて有意に低ければ、前記試験化合物が患者における子宮頸癌を阻害するのに有効であることを示す、方法。 - 前記第1および第2のサンプルは、患者から採取した単一のサンプルの部分である、請求項28に記載の方法。
- 前記第1および第2のサンプルは、患者から採取したプールされたサンプルの部分である、請求項28に記載の方法。
- 患者における子宮頸癌を阻害するための治療の有効性を評価する方法であって、前記方法は、
a)少なくとも治療の一部を患者に施す前に、患者から採取した第1のサンプルにおける、表1に記載のマーカーからなる群から選択されるマーカーの発現と、
b)治療の一部を施した後の患者から採取した第2のサンプルにおけるマーカーの発現とを比較することを含み、
前記第2のサンプルにおける前記マーカーの発現が、前記第1のサンプルと比べて有意に低いとき、前記治療が患者における子宮頸癌を阻害するのに有効であることを示す、方法。 - 患者における子宮頸癌を阻害するための組成物を選択する方法であって、前記方法は、
a)前記患者から癌細胞を含むサンプルを採取すること、
b)複数の試験組成物の存在下に、前記サンプルのアリコートを別々に曝すこと、
c)前記アリコートのそれぞれにおける、表1に記載のマーカーからなる群から選択されるマーカーの発現を比較すること、
d)前記試験組成物を含有するアリコートにおいて、他の試験組成物と比べて前記マーカーのより低いレベルの発現を誘発する試験組成物を選択することを含む方法。 - 患者における子宮頸癌を阻害する方法であって、前記方法は、
a)前記患者から、癌細胞を含むサンプルを採取すること、
b)複数の試験組成物の存在下に、前記サンプルのアリコートを別々に維持すること、
c)アリコートのそれぞれにおける、表1に記載のマーカーからなる群から選択される、マーカーの発現を比較すること、
d)試験組成物を含有するアリコート中の、他の試験組成物と比べて前記マーカーのより低いレベルの発現を誘発する、少なくとも1つの前記試験化合物を前記患者に投与することを含む、方法。 - 患者が子宮頸癌に罹っているか、または前癌状態であるかを評価するためのキットであって、前記キットは、表1に記載のマーカーからなる群から選択されるマーカーの発現を評価するための試薬を含む、キット。
- 子宮頸癌細胞または前癌子宮頚部細胞もしくは病変の存在を評価するためのキットであって、前記キットは核酸プローブを含み、前記プローブは、表1に記載のマーカーからなる群から選択されるマーカーに対応する転写されたポリヌクレオチドと特異的に結合する、キット。
- 患者における子宮頸癌を阻害するための複数の化合物のそれぞれの好適性を評価するためのキットであって、前記キットは、
a)前記複数の化合物と、
b)表1に記載の前記マーカーからなる群から選択されるマーカーの発現を評価するための試薬を含む、キット。 - ヒト子宮頸癌細胞または前癌子宮頚部細胞もしくは病変の存在を評価するためのキットであって、前記キットは抗体を含み、前記抗体は、表1に記載のマーカーからなる群から選択されるマーカーに対応するタンパク質と特異的に結合する、キット。
- 試験化合物の子宮頚部細胞発癌可能性を評価するための方法であって、前記方法は、
a)試験化合物の存在下および不存在下において、別個のアリコートの子宮頚部細胞を維持すること、および
b)前記各アリコート中のマーカーの発現を比較することを含み、前記マーカーは表1に記載のマーカーからなる群から選択され、
前記マーカーの発現レベルが、試験化合物の存在下に維持されたアリコート中で、試験化合物の不存在下で維持されたアリコートと比べて有意に上昇したとき、前記試験化合物がヒト子宮頚部細胞発癌可能性を持つことを示す、方法。 - 試験化合物の子宮頚部細胞発癌可能性を評価するためのキットであって、前記キットは、子宮頚部細胞とマーカーの発現を評価するための試薬とを含み、前記マーカーは、表1に記載のマーカーからなる群から選択される、キット。
- 子宮頸癌に罹った患者を治療するための方法であって、前記方法は、前記患者の細胞に、表1に記載のマーカーからなる群から選択されるマーカーに対応するポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する、方法。
- 子宮頸癌を発症する危険性がある患者において子宮頸癌を阻害する方法であって、前記方法は、表1に記載のマーカーから選択されたマーカーに対応する遺伝子の発現を阻害することを含む、方法。
- 表2および3に記載のヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
- 請求項42に記載の核酸分子を含有するベクター。
- 請求項42に記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
- 配列番号1、7、9、11、17、19、21、23、25、27、33および43からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる、単離されたポリペプチド。
- 請求項45に記載のポリペプチドに選択的に結合する抗体。
- 配列番号2、8、10、20、22、26、28および44のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
- 請求項47に記載のポリペプチドに選択的に結合する抗体。
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