JP2006514545A - 異常局在化分子およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
しかし、ほとんどの治療アプローチは、腫瘍形成タンパク質のインヒビター(例えば、チロシンキナーゼの特異的なインヒビター)として使用され得る低分子の同定に向けられる。STI571(Bcr−Ablを含む種々のチロシンキナーゼのインヒビター)は、t(9;22)白血病に対して効果的であることが示されている(Vigneriら、2001、Nat.Med.、Vol.7、pp.228−34)。BCR−ABL関連性障害における分子標的の阻害におけるSTI571の活性にもかかわらず、完全な活性は、初期(慢性期)のCML患者においてのみ得られたが、十分に発現した障害においては得られなかった。これと対照的に、回帰は、Bcr−Ablポジティブ急性リンパ芽球性白血病およびCML急性転化のほとんどの患者に観察される。この理由はおそらく、癌が、一連の遺伝子変化の結果であり、そしてアクチベータによるこれら腫瘍形成事象のうちの一つの逆転は、障害を治療するのに不十分であることである。
(a)腫瘍特異性分子が同定され;そして
(b)この腫瘍特異性分子に対する結合親和性を有し、かつこの腫瘍特異性分子の異常局在化に影響を及ぼす化合物が同定される。
以下の材料および方法を、実施例において使用した:
(1.プラスミド:)
pcDNA3.1におけるGFP−M&M発現プラスミドを、マウスc−myb発現プラスミドおよびKCL22細胞由来のcDNAをテンプレートとして使用するPFUポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって調製し、ここで、c−mybのDNA結合ドメインに特異的なプライマー(配列番号13のヌクレオチド193〜594によってコードされ、KpnIおよびBamHIの制限部位を含む)およびMEFのAML1結合ドメインに特異的なプライマー(配列番号12のヌクレオチド251〜618によってコードされ、BamHIおよびEcoRIの制限部位を含む)を使用した。PCR産物を、GFP−pcDNA3.1(GFPは、配列番号11のヌクレオチド91〜813に対応する)内に、読み取り方向にクローン化した。同様に、GFPDM&Mを、c−MybのDNA結合ドメインの最初の159塩基対を欠くPCRフラグメントを使用して、クローン化した。
MEF−BamH1順:5’−ATA GGA TCC GCC ACC TCG CAC ACC ATG TCA−3’(配列番号3)
MEF−EcoR1逆:5’−CAG AAT TCG CCT TTG CCA TCC TTT GAT TTC−3’(配列番号4)
(c−mybのDNA結合ドメインについてのプライマー)
myb−Kpn1順:5’−CAG AGA GGT ACC GTC ATT GCC AAT TAT CTG−3’(配列番号5)
myb−BamH1逆:5’−CAG AGA GGA TCC GTA GCC TTC CTG TTC CAC−3’(配列番号6)
myb−TK(チミジンキナーゼ)ルシフェラーゼ構築物を、Prof.Klempnauerから戴いた。AML1−ETO cDNAを、pcDNA3.1内にサブクローン化した。
IL−3依存性マウス骨髄細胞株32Dcl3、ヒト骨髄細胞株KCl22およびKasumi−1、ならびにサル腎臓細胞株Cos7を、当該分野で公知の方法により培養した。32Dcl3細胞およびKCl22を、15μgのプラスミドDNAで、エレクトロポレーションによってトランスフェクトし、そしてCos細胞を、5μgのプラスミドDNAでLipofectamine(Invitrogen)を使用してトランスフェクトした。
タンパク質溶解物を、GFP、GFP−M&MまたはGFP−DM&Mについての発現ベクターでトランスフェクトしたCos細胞から調製した。3種のタンパク質を、モノクローナルマウスGFP抗体(Clonetech,Heidelberg,Germany)を使用して検出した。検出は、マウスIgGに対するダイコンペルオキシダーゼ結合体化二次IgG抗体(Jackson ImmunoResearch)を介して行った。
Cos7細胞を、c−myb、AML1−ETO、GFPおよびGFP−M&Mについての発現ベクターの種々の組み合わせ計5μgでトランスフェクトした。Cos7細胞の細胞核抽出物の調製物、結合反応およびc−myb共通結合配列を有するオリゴヌクレオチドは、Muellerら,1999,Blood,Vol.94,pp.4255−62に記載される。myb共通部位または非特異的結合部位をそれぞれ有する100ngの二本鎖オリゴヌクレオチドを、競合実験のために使用した。
KCL細胞をFLAG AML−1およびGFPまたはGFP−M&Mでトランスフェクトした。トランスフェクトの12時間後、1%ホルムアルデヒドを10分間添加することにより、細胞のタンパク質を、DNAに結合させ、次いで、0.125Mのグリシンを添加することにより反応を停止させた。細胞を氷冷したPBSで二度洗浄し、プロテアーゼインヒビター、200μMオルトバナジン酸ナトリウムおよび50μM NaFを含有するRIPA溶解緩衝液1ml中に溶解した。氷上で10分間インキュベートした後、クロマチンを、紫外線(5秒間の9パルス)を使用することにより断片化した。細胞の破片を、遠心分離により除去し、50μlを入力コントロールとして保存した。残りの溶解物を、5μgのウサギおよびマウスのIgGを含むタンパク質A/Gアガロース40μl中に前精製した。各溶解物の残りを、二つのサンプルに分け、40μlのタンパク質A/Gアガロースを含む3μgの抗FLAGまたはマウスIgGのどちらかを用いて一晩免疫沈降を行った。この免疫複合体を、低塩濃度を含む緩衝液(0.1% SDS、150mM NaCl、1% Triton X−100、2mM EDTA、pH 8.0、20mM Tris−HCl、pH 8.1)中で八回洗浄した。次いで、免疫複合体および入力コントロール中のDNAとタンパク質との間の結合を、再分解し、DNAをその溶液からフェノール/クロロホルム抽出した。その後、c−キットプロモーター領域およびp14ARFプロモーター領域に対する特異的なプロモーター配列を、PCRの手段によりそのサンプル中に検出した。
p14ARFフォーワード:5’−AGT GGC TAC GTA AGA GTG ATC GC−3’(配列番号7)
p14ARFリバース:5’−CTT ACA GAT CAG ACG TCA AGC CC−3’(配列番号8)
(c−kitプロモーター領域に対するプライマー)
c−kitフォーワード:5’−ACT GTT GTT GCT TTC CGT TCA A−3’(配列番号9)
c−kitリバース:5’−TTA AGC CCG ATT TCA CTG CC−3’(配列番号10)
(6.ルシフェラーゼ検出)
当該分野で公知の方法を使用してプロモーター活性を検出した(Mullerら、2000、Mol.Cell.Biol.、20巻、pp.3316−29)。これは、全量15.5μgの、電気泳動によりトランスフェクトしたプラスミドを必要とする。混合物は、5μgのmyb−TKルシフェラーゼ構築物、内部標準化のための0.5μgのPRL−ヌルプラスミド(Promega、Madison、WI)および種々の組み合わせにおけるAML1、AML1−ETO、GFP−DM&MおよびGFP−M&Mのための5μgの発現ベクターからなる。空ベクター(empty vector)を、同時トランスフェクトし、トランスフェクトしたDNAの総量を等しくした。18時間後、細胞を溶解し、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの活性を、Promegaのデュアルルシフェラーゼアッセイ系を使用して検出した。ウミシイタケルシフェラーゼ活性を、トランスフェクト効率の内部標準のために使用した。平均値および標準偏差を三回の独立した実験から計算した。
32Dc13細胞およびKasumi細胞を、種々の組み合わせにおけるAML1、AML1−ETO、GFP−DM&MおよびGFP−M&Mのための総量15gの発現ベクターを用いて一時的に、トランスフェクトした。クローンの増殖を調べるために、トランスフェクトした細胞を、電気泳動の翌日に、勾配遠心分離により分離し、1mlの培養混合物中で、35mmのプレートあたり1×105個の生存細胞の濃度で播種した。この混合物は、Isocove改変Dulbecco培地(IMDM、Life Technologies、Grand Island、N.Y.)、1% メチルセルロース、20% FCS、IL−3(1ng/ml)および0.6mg/dl G418からなる。全ての実験を、三連で始め、そのコロニーを、10日目で計数した。平均値および標準偏差を、三回の独立した実験から計算した(Kasumi細胞に対しては、二回の実験)。
32Dc13細胞を、種々の組み合わせにおけるGFP、GFP−DM&MおよびAML1−ETOのための総量15gの発現ベクターを用いて一時的に、トランスフェクトした。24時間後、GFPポジティブ細胞を、フロー際と娶りーにより全ての細胞から選別し、さらに研究した。GFPポジティブ細胞の中でアポトーシス細胞の割合を、TUNELアッセイ(PharMingenからのAPO−BrdUキット)を使用して定量した。その実験は、製造者の指示書に従って実施した。これらの類似した結果を伴った三回の独立した実験の内の一回の結果を示す。
骨髄細胞を、六ヶ月齢の雌のBALB/cマウスの大腿骨から取り出し、マウスのIL−3を添加したRPMI1640倍地中で培養した。フェニックス細胞を、Lipofectamine Plus(Invitrogen)を使用して、MSCV2.2中のGFPまたはGFP−M&Mでトランスフェクトした。24時間後培地を取り替えた。トランスフェクションの48時間後、上清を回収し、ろ過(0.45μm)し、そして、4μg/ml ポリブレンの添加後、骨髄細胞に添加した。次いで、その細胞を、2000gで、45分間遠心分離し、37℃で2時間インキュベートし、その後、記載したように、二回変換した。次の日に、二回のさらなる変換を行った。
強化緑色蛍光タンパク質(GFP、検出目的のため、配列番号11のヌクレオチド91〜813にコードされる)、マウスc−mybのDNA結合ドメイン(配列番号13のヌクレオチド193〜594は、マウスc−mybのアミノ酸残基65〜198をコードする;参照Sakuraら、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86巻、pp.5758−61)およびヒト脊髄elf様因子のAML1結合ドメイン、MEF(配列番号12のヌクレオチド251〜618は、ヒトMEFのアミノ酸残基87〜206をコードする;参照Mao S.ら、1999、Mol.Cell.Biol.、19巻、pp.3635−44)から成る融合タンパク質を構築した。
GFP−M&Mのmyb DNA結合部位との相互作用を分析するために、電気泳動移動度シフトアッセイを実施した(参照 図2)。この目的のために、一時的にトランスフェクトしたCos7細胞の核抽出物を調製した。二本鎖mybコンセンサスオリゴヌクレオチドは、標的DNAとして役立った。これらの実験は、GFP−M&Mが、c−mybと同様に、myb DNA結合部位に特異的に結合することを示した。AML1−ETOのみでは、myb結合部位への結合を示さなかったが、GFP−M&Mは、AML1−ETOのDNAへの結合をもたらした。このことは、DNA、GFP−M&MおよびAML1−ETOからなる複合体のスーパーシフトを生じた(図2)。
GFP−M&Mの内生c−myb標的プロモーターへの結合およびAML1−ETOの内生c−myb標的プロモーターへの結合を、クロマチン免疫沈降検出法(ChiP)を、KCL22細胞中で使用して分析した。
GFP−M&Mは、myb依存性プロモーターに結合し、AML1−ETO(存在する場合)と複合体を形成し、そのようにして遺伝子発現を阻害する。
転写因子Mybの活性およびmyb依存性遺伝子の発現は、造血細胞の増殖(growth)および増殖(proliferation)のために必須である(Whiteら,2000,Oncogene,第19巻,1196−205頁)。従って、AML1−ETO含有細胞の増殖および生存率に対するGFP−M&Mの効果を分析した。
c−myb活性を有さない造血細胞をアポトーシスに供する(Taylorら,1996,Genes Dev.,第10巻,2732−44頁)。
GFP−M&MがAML1−ETOの非存在下でMYB依存性プロモーターをインビボで抑制しないことを示す目的で、初代マウス骨髄細胞を、GFPまたはGFP−M&Mでのレトロウイルス形質導入に供した。これにより、KITの発現(図7)およびGFP陽性細胞のアポトーシス速度における有意な差異は生じなかった。このことは、本発明の化合物が、健常な細胞におけるMYB依存性プロモーターの転写の特異的抑制を誘導しないことを示す。
Claims (36)
- 腫瘍特異性分子に対する結合親和性を有し、腫瘍特異性分子の異常局在化をもたらし得る化合物。
- 前記異常局在化が、腫瘍特異性細胞の成長を阻害する、請求項1に記載の化合物。
- 前記異常局在化が、腫瘍特性細胞にアポトーシスを誘導する、請求項1または2の化合物。
- <5000、<1000もしくは<500の分子量を有するペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、融合タンパク質、または有機分子である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記腫瘍特異性分子が、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、融合タンパク質、RNAまたはDNAである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の化合物。
- 10−5〜10−12、そして特に好ましくは、10−7〜10−9の結合親和性を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記腫瘍特異性分子が、健常な細胞に存在しないか、または別の形態で存在する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記腫瘍特異性分子が、融合タンパク質である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記腫瘍特異性分子が、AML1−ETOである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記腫瘍特異性分子が、DNA結合ドメイン、単一ペプチド、キナーゼ活性、クロマチン調節特性、タンパク質−タンパク質相互作用ドメインまたは転写特性を有する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記異常局在化が、前記腫瘍特性分子を、遺伝子の転写を調節する核酸配列に結合させる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記異常局在化が、前記腫瘍特異性分子を、遺伝子の転写を調節する核酸配列に結合させ、それによって該遺伝子の転写を活性化または阻害する、請求項1〜11のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記化合物が、c−myb DNA結合ドメインのペプチド配列を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記化合物が、ミエロイドelf様因子のAML−1結合ドメインのペプチド配列を含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の化合物。
- 前記化合物が、c−myb DNA結合ドメインのペプチド配列およびミエロイドelf様因子のAML−1結合ドメインのペプチド配列を含む、請求項13または14に記載の化合物。
- 前記化合物が配列番号1に示される配列を有する、請求項15に記載の化合物。
- 請求項2〜16のいずれかに記載のペプチドまたはタンパク質をコードする核酸。
- DNAまたはRNAである、請求項17に記載の核酸。
- 請求項17または18に記載の核酸を含む、ベクター。
- 請求項17もしくは18に記載の核酸または請求項19に記載のベクターを有する、宿主細胞。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載の化合物、請求項17もしくは18に記載の核酸、請求項19に記載のベクターまたは請求項20に記載の宿主細胞を含む、医薬。
- 薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項21に記載の医薬。
- 経口投与、静脈内投与または筋肉内投与のために処方される、請求項21または22に記載の医薬。
- 腫瘍処置用の医薬の調製のための、請求項1〜16のいずれか1項に記載の化合物、請求項17もしくは18に記載の核酸、請求項19に記載のベクターまたは請求項20に記載の宿主細胞の使用。
- 前記腫瘍が、白血病、特に急性骨髄性白血病である、請求項24の使用。
- 前記ペプチドまたはタンパク質が、組換え発現されるか、あるいはタンパク質合成によって得られる、請求項1〜16のいずれか1項に記載の化合物の調製方法。
- 腫瘍の処置に適した化合物を同定する方法であって、該方法において:
(a)腫瘍特性分子が同定される;
(b)該腫瘍特異性分子に対する結合親和性を有し、該腫瘍特異性分子の異常局在化をもたらし得る化合物が同定される
方法。 - 前記化合物が同定され、前記異常局在化が腫瘍特異性細胞の成長を阻害するか、または腫瘍特異性細胞にアポトーシスを誘導する、請求項27に記載の方法。
- 前記腫瘍特異性分子が、マイクロアレイ分析、2Dタンパク質ゲル電気泳動に引き続く質量分析による同定、または該方法の組み合わせによって同定される、請求項27または28に記載の方法。
- 前記腫瘍特異性分子に対する結合親和性を有し、該腫瘍特異性分子の異常局在化をもたらし得る前記化合物が、タンパク質、RNA、DNAまたは有機化合物である、請求項27〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記腫瘍特異性分子に対する結合親和性を有し、該腫瘍特異性分子の異常局在化をもたらし得る前記化合物が、高スループットスクリーニング方法によって同定される、請求項27〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記腫瘍特異性分子に対する結合親和性を有し、該腫瘍特異性分子の異常局在化をもたらし得る前記化合物が、2つの部分から構築される、請求項27〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記化合物の1つの部分が、前記腫瘍特異性分子に対する結合親和性を有し、第2の部分が、該腫瘍特異性分子の異常局在化をもたらし得る、請求項32に記載の方法。
- 前記2つの部分が、別々のスクリーニング方法において同定される、請求項32または33に記載の方法。
- 医薬の調製方法であって、該方法は、以下の工程:
(a)請求項27〜33に記載の方法によって、腫瘍の処置に適した化合物を同定する工程;
(b)合成または組換えによって化合物を調製する工程;および
(c)医薬を得るために該化合物を処方する工程
を包含する、方法。 - 前記医薬が、腫瘍の処置、例えば、白血病の処置そして特に急性骨髄性白血病の処置に適している、請求項35に記載の方法。
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