JP4445867B2 - 異常局在化分子およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は、異常局在化分子、その調製のための方法、および医薬としてのその使用法に関連し、特に腫瘍の処置に関連する。

タンパク質の局在化（すなわち細胞内、組織内、細胞質内の所在部位）は、そのタンパク質の機能および活性に重要な影響を有する。これは特に細胞調節にかかわるタンパク質にあてはまる。

真核生物の細胞は、細胞内膜を含み、この細胞内膜は、細胞の含有物のほぼ半分を細胞小器官と称される空間的に分離した区画へと分ける。全ての真核細胞に存在する、膜で囲まれた細胞小器官の主な型は、小胞体、ゴルジ装置、細胞核、ミトコンドリア、リソソーム、エンドソームおよびペルオキシソームである。各細胞小器官は、特定のタンパク質セットを有し、このタンパク質セットは、細胞小器官特異的機能の維持を確実にする。

新たに合成されたタンパク質は、特定の輸送経路をたどることで、これらが形成される細胞質ゾルから細胞小器官へと進み、この細胞小器官で、このタンパク質は、特定の仕事を行う。この輸送経路は、このタンパク質のアミノ酸配列内のシグナルペプチドまたはシグナル領域の形態をとる、シグナルにより規定される。これらのシグナルペプチドは、その標的細胞小器官の対応するレセプターにより認識される。細胞質ゾル内でその仕事を行うタンパク質は、シグナルペプチドを含まず、そのため細胞質ゾル内に留まる（Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｅ ｄｅｒ Ｚｅｌｌｅ；ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ、第３版）。

さらに、タンパク質の標的とされた局在化は、細胞下の構造へ特異的に輸送され得る、多量体複合体としてのその機構により達成される。これらの複合体は、適切な部位に、アンカータンパク質または足場タンパク質に対するこの複合体の親和性を介して、かつこの部位の他の構造成分の手段により保持される。これらの構造物に対する個々のタンパク質の親和性は、適切な局在化ドメイン、翻訳後修飾、アロステリック変化および他の作用に依存する（Ｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、別冊（２０００）、ｐｐ．８４−９２）。

ＤＮＡ結合活性およびトランス活性化活性を有する種々のタンパク質ファミリー（例えば、Ｃａｔｅｎｉｎタンパク質、Ｎｏｔｃｈタンパク質またはＳＴＡＴタンパク質）の機能は、細胞質ゾルから細胞核への輸送に本質的に依存する。

多くの障害において、突然変異の機能的な結果は、変異遺伝子産物の変化した局在化を生じる。例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）において、Ｂｃｒ−Ａｂｌの転換ポテンシャルは、Ａｂｌの活性化キナーゼ活性に依存するだけではなく、障害性のタンパク質のアクチン結合性の局在化にも依存する。この局在化に起因して、マイトジェンシグナル経路および抗アポトーシスシグナル経路の両方は、活性化され、変形活性を生じる（Ｄａｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．２４７（１９９０）、ｐｐ．８２４−８３０）。

核の搬出機構の非特異的な阻害によるＢｃｒ−Ａｂｌの核への封じ込めは、例えば、Ｂｃｒ−Ａｂｌポジティブ細胞のアポトーシスを導く（Ｖｉｇｎｅｒｉ Ｐ．＆およびＷａｎｇ Ｊ．Ｗ．、Ｎａｔ．ｍｅｄ．、Ｖｏｌ．７（２００１）、ｐｐ．２２８−２３４）。

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）において、しばしば悪性の形質転換は、タンパク質の異常局在化に関連する。最も頻繁な染色体の転座は、キメラタンパク質を生じ、このキメラタンパク質は、転写因子を含み、しばしば転写アクチベータのＤＮＡ結合ドメインの転写レプレッサとの融合を導く。従って、この転写レプレッサは、転写アクチベータの標的遺伝子へ誤って輸送される。

ＡＭＬにおける最も頻繁な染色体の転座は、ｔ（８；２１）転座であり、この転座は、この疾患を罹患する成人患者の１０〜１５％に見出される（Ｄｏｗｎｉｎｇ Ｊ．Ｒ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．Ｖｏｌ．１０６（１９９９）、ｐｐ．２９６−３０８）。この転座のために、転写アクチベータＡＭＬ１のＣ末端は、転写レプレッサＥＴＯにより置換され、そしてＡＭＬ１−ＥＴＯ融合タンパク質を生じる（Ｍｅｙｅｒｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１５（１９９５）、ｐｐ．１９７４−１９８２；およびＬｅｎｎｙら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１１（１９９５），１７６１−１７６９）。

ＡＭＬ１−ＥＴＯ融合タンパク質は、種々のコリプレッサおよびヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の結合に影響を及ぼし得、かつこの様式においてＡＭＬ１標的遺伝子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、好中球エラスターゼおよびｃ／ＥＢＰα（Ｂｒｉｔｏｓ−Ｂｒａｙ，Ｍ．およびＦｒｉｅｄｍａｎ，Ａ．Ｄ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１７（１９９７）、ｐｐ．５１２７−５１３５）；Ｆｒａｎｋら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．１１（１９９５）、ｐｐ．２６６７−２６７４）；Ｐａｂｓｔら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、Ｖｏｌ．７（２００１）、ｐｐ．４４４−４５１；およびＯｅｌｇｅｓｃｈｌａｇｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１６（１９９６）、ｐｐ．４７１７−２５））の発現を阻害し得る。ＡＭＬ１−ＥＴＯのこの効果が、ＡＭＬの代表的な分化の遮断を担うことが想定され得る。

腫瘍性疾患は、現在普通は、外科手術、放射線照射および化学療法薬剤の投与の組合せにより処置される。血液学的な腫瘍性疾患の治療は、特に化学療法薬剤の投与に限定される。しかし、従来の化学療法のアプローチ、および放射線照射は、癌細胞に特異的に作用しない。従って、この治療法は常に、患者への重大な副作用を伴う。なぜなら、特定の治療アプローチの効果が、全ての増殖細胞に影響するからである。

この化学療法の副作用は、心臓、肺、肝臓および神経系への毒性により引き起こされる急性腎不全および器官の損傷を導き得る。この治療法の免疫抑制効果から想定されるべき結果は、死亡につながる増加した感染数である。多くの治療法は、その毒性のため、特に高齢の患者に対して、不適当である。

癌細胞に対して特異的に向けられ、かつそれらを攻撃するアクチベータの限定された利用性は、多数の癌の型の予後がいまだに非常に乏しいことが実質的な理由である。

そのため、先行技術において、腫瘍細胞特異的な治療アプローチを開発する試みがなされた。このようにして、ｐ５３シグナル伝達経路における突然変異を用いて腫瘍において限定的に複製が可能である不完全なアデノウィルスが、構築されている（Ｂｉｓｃｈｏｆｆら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．２７４、ｐｐ．３７３−６）。この方法により、ｐ５３の突然変異を有する腫瘍細胞は、感染するが、他の細胞は、冒されない。現在、この治療法の実用的価値は、臨床試験において調べられている（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ Ｆ．、２０００、Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．、Ｖｏｌ．１０、ｐｐ．４５３−９）
しかし、ほとんどの治療アプローチは、腫瘍形成タンパク質のインヒビター（例えば、チロシンキナーゼの特異的なインヒビター）として使用され得る低分子の同定に向けられる。ＳＴＩ５７１（Ｂｃｒ−Ａｂｌを含む種々のチロシンキナーゼのインヒビター）は、ｔ（９；２２）白血病に対して効果的であることが示されている（Ｖｉｇｎｅｒｉら、２００１、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、Ｖｏｌ．７、ｐｐ．２２８−３４）。ＢＣＲ−ＡＢＬ関連性障害における分子標的の阻害におけるＳＴＩ５７１の活性にもかかわらず、完全な活性は、初期（慢性期）のＣＭＬ患者においてのみ得られたが、十分に発現した障害においては得られなかった。これと対照的に、回帰は、Ｂｃｒ−Ａｂｌポジティブ急性リンパ芽球性白血病およびＣＭＬ急性転化のほとんどの患者に観察される。この理由はおそらく、癌が、一連の遺伝子変化の結果であり、そしてアクチベータによるこれら腫瘍形成事象のうちの一つの逆転は、障害を治療するのに不十分であることである。

癌治療のための分子標的は、より高い割合で同定されているが、特定の治療のために、どのようにこの知見を利用し得るのかに関してアイデアは、いまだほとんど開発されていない。

従って、本発明は、医薬の活性因子のように、腫瘍、特に白血病の処置を改善することを可能とする化合物を提供する目的に基づく。

この目的は現在、この化合物は、腫瘍特異性分子に対し結合親和性を有し、そしてこの腫瘍特異性分子の異常局在化をもたらすことを可能とする化合物により達成される。

本出願用途の全ての実施形態について、本発明の化合物によりもたらされるこの腫瘍特異性分子の異常局在化は、腫瘍特異的細胞の増殖を阻害するか、またはさらに腫瘍特異的細胞にアポトーシスを誘導することが好ましい。

先行技術の治療アプローチとは対照的に、本発明の治療アプローチは、このように腫瘍形成分子の異常局在化に関し、ここでこの癌遺伝子の機能は、阻害されないが、癌遺伝子含有細胞を排除するのに利用される。本発明の化合物は、非常に特異的であり、かつ腫瘍特異性分子を有さない細胞にどんな影響も有さない。従って、この新しい治療アプローチは、個々の腫瘍形成事象を逆転しないが、この腫瘍細胞が、排除されるような方法においてこの腫瘍細胞の特異的性質を変化させる。これに関して、この方法は、多くのタンパク質（また腫瘍形成たんぱく質）の機能が、その形状のみならず、非常に明白にその細胞内におけるこれらタンパク質の局在化にも依存する事実を利用する。

本発明の一実施形態において、この化合物は、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質または融合タンパク質である。しかし、同様に、腫瘍特異性分子に結合するその特異的結合によって特徴付けられる低分子を使用する可能性がある。多数の有機分子が、これに関連して使用され得る。この関連において、有機分子とは、低分子量の炭化水素を意味する。これらは、＜５０００Ｄａ、好ましくは＜１０００Ｄａそして特に好ましくは＜５００Ｄａの分子量を有し得る。同様に、２つの異なった構成成分からなる複合分子を使用することが考えられる。

腫瘍特異性分子は、腫瘍細胞において独占的に存在するか、または腫瘍細胞において健康な細胞と異なる濃度で存在するかどちらかの形態の分子である。腫瘍特異性分子もまた、好ましくは、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、融合タンパク質、ＲＮＡまたはＤＮＡである。腫瘍特異的転写後修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化、アセチル化、メチル化および類似の修飾）もまた、この関連において腫瘍特異的パラメータである可能性がある。

本発明の一実施形態において、腫瘍特異性分子は、腫瘍細胞において独占的に存在する融合タンパク質（例えば、ＡＭＬ１−ＥＴＯ分子）である。さらに攻撃される腫瘍特異性分子は、白血病（Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合タンパク質、ＰＭＬ−ＲＡＲα融合タンパク質、ＰＬＺＦ−ＲＡＲα融合タンパク質、ＭＬＬ融合タンパク質など）および他の悪性障害（例えば、肉腫におけるＥＷＳ−Ｆｌｉ）における他の染色体転座から生じる融合タンパク質であり得る。

本発明の化合物は、腫瘍特異性分子に対する結合親和性を示す。結合親和性は、好ましくは１０^−５〜１０^−１２の範囲であり、特に好ましくは１０^−７〜１０^−９の範囲である。

本発明の化合物は、腫瘍特異性分子の異常局在化に影響し得る。本発明の目的について、腫瘍特異性分子の異常局在化は、細胞内または他の組織内の分子の、腫瘍細胞における通常は存在しない部位への輸送を意味する。例えば、異常局在化は、腫瘍特異的タンパク質（例えば、転写アクチベータまたは転写レプレッサ）の、腫瘍特異的タンパク質が他に結合しない位置におけるゲノムＤＮＡへの結合に影響し得る。

別の例に従い、腫瘍特異性分子の異常局在化は、腫瘍細胞における細胞質分子であるにもかかわらず、これらが分泌されるかまたは細胞小器官内に輸送される結果を有し得る。例えば、腫瘍特異性分子は、腫瘍細胞における核分子であるにもかかわらず、核から曝露され得る。

本発明の特に好ましい実施形態に従い、腫瘍特異性分子の異常局在化は、腫瘍細胞の増殖の６０％を超える阻害をもたらし、８０％を超える阻害が特に好ましい。増殖阻害は、Ｍｉｚｕｋｉ，Ｍ．ら「Ｆｌｔ３ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｄｕｃｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ３２Ｄ ｃｅｌｌｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｒａｓ ａｎｄ ＳＴＡＴ５ ｐａｔｈｗａｙｓ」，Ｂｌｏｏｄ，２０００年１２月１日，Ｖｏｌ．９６（１２），３９０７−１４の方法に従い、メチルセルロースのコロニー形成の減少を介して決定され得る。

代替の実施形態に従い、異常局在化は、腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導を導く。腫瘍細胞におけるアポトーシスは、未処理細胞と比較して、好ましくは２倍、本発明の分子で処理した細胞において増加し、アポトーシスの少なくとも３倍の増加が、特に好ましい。腫瘍細胞におけるアポトーシス誘導の増加は、標準アッセイ（Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｔｚ，Ｚ．ら，「Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ」，Ｓｅｍｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００１年４月，Ｖｏｌ．３８（２），１７９−９３）によって測定され得る。

本発明に従い、腫瘍特異性分子の異常局在化は、例えば、遺伝子の転写を調節する核酸配列に対する腫瘍特異性分子の結合をもたらし得る。遺伝子の転写は、腫瘍特異性分子の結合を介して活性化または阻害され得る。

特に好ましい実施形態に従い、この化合物は、ｃ−ｍｙｂ ＤＮＡ結合ドメインのペプチド配列および／またはＭＥＦ（「骨髄性ｅｌｆ様因子（ｍｙｅｌｏｉｄ ｅｌｆ ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ）」）のＡＭＬ１結合ドメインのペプチド配列を含む。特に好ましい実施形態に従い、本発明の化合物は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。

本発明は、本発明に従うペプチドまたはタンパク質をコードする核酸にさらに関連し、これは、腫瘍特異性分子に対する結合親和性を有し、かつ腫瘍特異性分子の異常局在化に影響し得る。核酸は、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡである。核酸は、この核酸の発現のために設計され得るベクターの一部であり得る。特に好ましい実施形態に従い、本発明の化合物は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列によってコードされる。

さらなる実施形態に従い、本発明は、本発明の核酸の１つを有する宿主細胞に関連する。

本発明は、本発明に従う化合物、核酸または宿主細胞を含有する医薬をさらに含む。この医薬は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含有し得、経口投与、静脈内投与または筋肉内投与のために処方され得る。

本発明は、腫瘍、白血病（特に急性骨髄性白血病）の処置のための医薬の調製のための、本発明に従う化合物、核酸または宿主細胞の使用に関する。ｔ（８；２１）転座によって引き起こされる急性骨髄性白血病の処置が、特に好ましい。

本発明の化合物を調製するための方法は、本発明の範囲内にさらに含まれる。ペプチドまたはタンパク質の場合、これらは、組換え的に発現され得るか、またはタンパク質合成によって得られ得る。

最後に、本発明は、腫瘍の処置に好適な化合物を同定する方法に関し、この方法において：
（ａ）腫瘍特異性分子が同定され；そして
（ｂ）この腫瘍特異性分子に対する結合親和性を有し、かつこの腫瘍特異性分子の異常局在化に影響を及ぼす化合物が同定される。

腫瘍特異性分子は、この方法において、現代遺伝学および現代プロテオミクスの方法により同定される。これに関連して、例えば、マイクロアレイ分析または２Ｄタンパク質ゲル電気泳動法およびその後の質量分析法による同定、ならびにこれらの方法の組み合わせを使用し得る。

腫瘍細胞と非変性細胞との間の差異を分析するための当該分野で公知の全ての方法が、本発明に従って、腫瘍特異性分子を同定するために使用され得る。

第２工程において、腫瘍特異性分子の異常局在化のために使用され得る標的分子が同定される。この分子は、再び、タンパク質フラグメント、ＲＮＡフラグメントまたはＤＮＡフラグメントにされ得る。

このスクリーニング方法は、自動化ロボットピペッターにより、数千の物質が、腫瘍特異性分子および異常局在化分子に対するその結合について試験される様式で、高処理方法として適用されることが好ましい。その後、高い親和性および特異性で２種の分子の１つ結合するかまたは同時に両方の分子に結合する化合物が、選択される。２種の異なった分子（１種は腫瘍特異性分子に結合し、他方は異常局在化を誘導する）が同定され、これらの分子は、化学的方法（例えば、ポリリンカーの導入）によって結合される。本方法の１つの大きな利点は、各分子が、標的分子のみに対して結合する必要があるが、標的分子の機能に影響をもまた与える必要は必ずしもないことである。

以下の実施例において、組換え融合タンパク質を、骨髄細胞の生存および増殖におちえ必須であるプロモーターにおけるＡＭＬ１−ＥＴＯレプレッサ活性を指向するために産生した。種々の作用により、高度な特異性を達成した。ｃ−ｍｙｂ結合部位を、ＧＦＰ−Ｍ＆ＭおよびＡＭＬ１−ＥＴＯレプレッサ複合体についての標的として使用した。ｃ−ｍｙｂは、造血細胞に必須であるが、他の器官の発達のためには必須でない（Ｍｕｃｅｎｓｋｉ，１９９１，Ｃｅｌｌ Ｖｏｌ．６５，ｐｐ．６７７−８９）。

白血球の細胞増殖のためのｃ−ｍｙｂの不可欠な重要性は、一般に公知である。ｍｙｂ依存性遺伝子の阻害は、白血病治療の実質的な標的を表す（Ｍｕｃｅｎｓｋｉ，１９９１，Ｃｅｌｌ Ｖｏｌ．６５，ｐｐ．６７７−８９；Ｒａｔａｊｃｚａｋ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８９，ｐｐ．１１８２３７；Ｇｅｗｉｒｔｚら，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４２，ｐｐ．１３０３−６；ＧｅｗｉｒｔｚＡ．Ｍ．，１９９９，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．１８，３０５６−６２）。

実験は、本発明の異常局在化分子（この場合、組換え融合タンパク質）が、ＡＭＬ１−ＥＴＯを発現しない細胞に対し有害でないことを示す。高度に特異的な毒性は、腫瘍誘導性形質転換を受けた細胞について達成した。

（材料および方法）
以下の材料および方法を、実施例において使用した：
（１．プラスミド：）
ｐｃＤＮＡ３．１におけるＧＦＰ−Ｍ＆Ｍ発現プラスミドを、マウスｃ−ｍｙｂ発現プラスミドおよびＫＣＬ２２細胞由来のｃＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＦＵポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製し、ここで、ｃ−ｍｙｂのＤＮＡ結合ドメインに特異的なプライマー（配列番号１３のヌクレオチド１９３〜５９４によってコードされ、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩの制限部位を含む）およびＭＥＦのＡＭＬ１結合ドメインに特異的なプライマー（配列番号１２のヌクレオチド２５１〜６１８によってコードされ、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位を含む）を使用した。ＰＣＲ産物を、ＧＦＰ−ｐｃＤＮＡ３．１（ＧＦＰは、配列番号１１のヌクレオチド９１〜８１３に対応する）内に、読み取り方向にクローン化した。同様に、ＧＦＰ−ΔDＭ＆Ｍを、ｃ−ＭｙｂのＤＮＡ結合ドメインの最初の１５９塩基対を欠くＰＣＲフラグメントを使用して、クローン化した。

（ＭＥＦのＡＭＬ１結合ドメインについてのプライマー）
ＭＥＦ−ＢａｍＨ１順：５’−ＡＴＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＣＧ ＣＡＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＴＣＡ−３’（配列番号３）
ＭＥＦ−ＥｃｏＲ１逆：５’−ＣＡＧ ＡＡＴ ＴＣＧ ＣＣＴ ＴＴＧ ＣＣＡ ＴＣＣ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＴＣ−３’（配列番号４）
（ｃ−ｍｙｂのＤＮＡ結合ドメインについてのプライマー）
ｍｙｂ−Ｋｐｎ１順：５’−ＣＡＧ ＡＧＡ ＧＧＴ ＡＣＣ ＧＴＣ ＡＴＴ ＧＣＣ ＡＡＴ ＴＡＴ ＣＴＧ−３’（配列番号５）
ｍｙｂ−ＢａｍＨ１逆：５’−ＣＡＧ ＡＧＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＴＡ ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＴＧ ＴＴＣ ＣＡＣ−３’（配列番号６）
ｍｙｂ−ＴＫ（チミジンキナーゼ）ルシフェラーゼ構築物を、Ｐｒｏｆ．Ｋｌｅｍｐｎａｕｅｒから戴いた。ＡＭＬ１−ＥＴＯ ｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１内にサブクローン化した。

（２．細胞株およびトランスフェクション）
ＩＬ−３依存性マウス骨髄細胞株３２Ｄｃｌ３、ヒト骨髄細胞株ＫＣｌ２２およびＫａｓｕｍｉ−１、ならびにサル腎臓細胞株Ｃｏｓ７を、当該分野で公知の方法により培養した。３２Ｄｃｌ３細胞およびＫＣｌ２２を、１５μｇのプラスミドＤＮＡで、エレクトロポレーションによってトランスフェクトし、そしてＣｏｓ細胞を、５μｇのプラスミドＤＮＡでＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスフェクトした。

（３．免疫ブロッティング：）
タンパク質溶解物を、ＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｍ＆ＭまたはＧＦＰ−ΔＭ＆Ｍについての発現
ベクターでトランスフェクトしたＣｏｓ細胞から調製した。３種のタンパク質を、モノクローナルマウスＧＦＰ抗体（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して検出した。検出は、マウスＩｇＧに対するダイコンペルオキシダーゼ結合体化二次ＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を介して行った。

（４．電気泳動移動度シフトアッセイ）
Ｃｏｓ７細胞を、ｃ−ｍｙｂ、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＧＦＰおよびＧＦＰ−Ｍ＆Ｍについての発現ベクターの種々の組み合わせ計５μｇでトランスフェクトした。Ｃｏｓ７細胞の細胞核抽出物の調製物、結合反応およびｃ−ｍｙｂ共通結合配列を有するオリゴヌクレオチドは、Ｍｕｅｌｌｅｒら，１９９９，Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．９４，ｐｐ．４２５５−６２に記載される。ｍｙｂ共通部位または非特異的結合部位をそれぞれ有する１００ｎｇの二本鎖オリゴヌクレオチドを、競合実験のために使用した。

（５．クロマチン免疫沈降）
ＫＣＬ細胞をＦＬＡＧ ＡＭＬ１−ＥＴＯおよびＧＦＰまたはＧＦＰ−Ｍ＆Ｍでトランスフェクトした。トランスフェクトの１２時間後、１％ホルムアルデヒドを１０分間添加することにより、細胞のタンパク質を、ＤＮＡに結合させ、次いで、０．１２５Ｍのグリシンを添加することにより反応を停止させた。細胞を氷冷したＰＢＳで二度洗浄し、プロテアーゼインヒビター、２００μＭオルトバナジン酸ナトリウムおよび５０μＭ ＮａＦを含有するＲＩＰＡ溶解緩衝液１ｍｌ中に溶解した。氷上で１０分間インキュベートした後、クロマチンを、紫外線（５秒間の９パルス）を使用することにより断片化した。細胞の破片を、遠心分離により除去し、５０μｌを入力コントロールとして保存した。残りの溶解物を、５μｇのウサギおよびマウスのＩｇＧを含むタンパク質Ａ／Ｇアガロース４０μｌ中に前精製した。各溶解物の残りを、二つのサンプルに分け、４０μｌのタンパク質Ａ／Ｇアガロースを含む３μｇの抗ＦＬＡＧまたはマウスＩｇＧのどちらかを用いて一晩免疫沈降を行った。この免疫複合体を、低塩濃度を含む緩衝液（０．１％ ＳＤＳ、１５０μＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２μＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０、２０μＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．１）中で八回洗浄した。次いで、免疫複合体および入力コントロール中のＤＮＡとタンパク質との間の結合を、再分解し、ＤＮＡをその溶液からフェノール／クロロホルム抽出した。その後、ｃ−キットプロモーター領域およびｐ１４^ＡＲＦプロモーター領域に対する特異的なプロモーター配列を、ＰＣＲの手段によりそのサンプル中に検出した。

ＰＣＲを、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）上で行った（９５°Ｃで３分間、その後、９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間を３７サイクル）。その産物を２％アガロースゲル上で分離し、エチジウムブロマイドで染色した。

（ｐ１４^ＡＲＦプロモーター領域に対するプライマー）
ｐ１４^ＡＲＦフォーワード：５’−ＡＧＴ ＧＧＣ ＴＡＣ ＧＴＡ ＡＧＡ ＧＴＧ ＡＴＣ ＧＣ−３’（配列番号７）
ｐ１４^ＡＲＦリバース：５’−ＣＴＴ ＡＣＡ ＧＡＴ ＣＡＧ ＡＣＧ ＴＣＡ ＡＧＣ ＣＣ−３’（配列番号８）
（ｃ−ｋｉｔプロモーター領域に対するプライマー）
ｃ−ｋｉｔフォーワード：５’−ＡＣＴ ＧＴＴ ＧＴＴ ＧＣＴ ＴＴＣ ＣＧＴ ＴＣＡ Ａ−３’（配列番号９）
ｃ−ｋｉｔリバース：５’−ＴＴＡ ＡＧＣ ＣＣＧ ＡＴＴ ＴＣＡ ＣＴＧ ＣＣ−３’（配列番号１０）
（６．ルシフェラーゼ検出）
当該分野で公知の方法を使用してプロモーター活性を検出した（Ｍｕｌｌｅｒら、２０００、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２０巻、ｐｐ．３３１６−２９）。これは、全量１５．５μｇの、電気泳動によりトランスフェクトしたプラスミドを必要とする。混合物は、５μｇのｍｙｂ−ＴＫルシフェラーゼ構築物、内部標準化のための０．５μｇのＰＲＬ−ヌルプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）および種々の組み合わせにおけるＡＭＬ１、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＧＦＰ−ΔＭ＆ＭおよびＧＦＰ−Ｍ＆Ｍのための
５μｇの発現ベクターからなる。空ベクター（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ）を、同時トランスフェクトし、トランスフェクトしたＤＮＡの総量を等しくした。１８時間後、細胞を溶解し、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの活性を、Ｐｒｏｍｅｇａのデュアルルシフェラーゼアッセイ系を使用して検出した。ウミシイタケルシフェラーゼ活性を、トランスフェクト効率の内部標準のために使用した。平均値および標準偏差を三回の独立した実験から計算した。

（７．メチルセルロース中でのクローンの増殖）
３２Ｄｃ１３細胞およびＫａｓｕｍｉ細胞を、種々の組み合わせにおけるＡＭＬ１、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＧＦＰ、ＧＦＰ−ΔＭ＆ＭおよびＧＦＰ−Ｍ＆Ｍのための総量１５ｇの発現ベク
ターを用いて一時的に、トランスフェクトした。クローンの増殖を調べるために、トランスフェクトした細胞を、電気泳動の翌日に、勾配遠心分離により分離し、１ｍｌの培養混合物中で、３５ｍｍのプレートあたり１×１０^５個の生存細胞の濃度で播種した。この混合物は、Ｉｓｏｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．）、１％ メチルセルロース、２０％ ＦＣＳ、ＩＬ−３（１ｎｇ／ｍｌ）および０．６ｍｇ／ｄｌ Ｇ４１８からなる。全ての実験を、三連で始め、そのコロニーを、１０日目で計数した。平均値および標準偏差を、三回の独立した実験から計算した（Ｋａｓｕｍｉ細胞に対しては、二回の実験）。

（８．アポトーシスアッセイ）
３２Ｄｃ１３細胞を、種々の組み合わせにおけるＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｍ＆ＭおよびＡＭ
Ｌ１−ＥＴＯのための発現ベクターを用いて一時的に、トランスフェクトした。２４時間後、ＧＦＰポジティブ細胞を、フローサイトメトリーにより全ての細胞から選別し、さらに研究した。ＧＦＰポジティブ細胞の中でアポトーシス細胞の割合を、ＴＵＮＥＬアッセイ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎからのＡＰＯ−ＢｒｄＵキット）を使用して定量した。その実験は、製造者の指示書に従って実施した。これらの類似した結果を伴った三回の独立した実験の内の一回の結果を示す。

（９．原発性骨髄細胞のレトロウイルス形質導入）
骨髄細胞を、六ヶ月齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿骨から取り出し、マウスのＩＬ−３を添加したＲＰＭＩ１６４０倍地中で培養した。フェニックス細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＭＳＣＶ２．２中のＧＦＰまたはＧＦＰ−Ｍ＆Ｍでトランスフェクトした。２４時間後培地を取り替えた。トランスフェクションの４８時間後、上清を回収し、ろ過（０．４５μｍ）し、そして、４μｇ／ｍｌ ポリブレンの添加後、骨髄細胞に添加した。次いで、その細胞を、２０００ｇで、４５分間遠心分離し、３７℃で２時間インキュベートし、その後、記載したように、二回変換した。次の日に、二回のさらなる変換を行った。

最後の変換のの２４時間後、ＧＦＰおよびＫＩＴ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎからの抗ＣＤ１１７−ＰＥ）の細胞中での発現を、フローサイトメトリーにより調べ、製造者のプロトコルに従って、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いてアポトーシスを調べた。

（実施例１ ＧＦＰ−Ｍ＆ＭのクローニングおよびＣｏｓ細胞における発現）
強化緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、検出目的のため、配列番号１１のヌクレオチド９１〜８１３にコードされる）、マウスｃ−ｍｙｂのＤＮＡ結合ドメイン（配列番号１３のヌクレオチド１９３〜５９４は、マウスｃ−ｍｙｂのアミノ酸残基６５〜１９８をコードする；参照Ｓａｋｕｒａら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻、ｐｐ．５７５８−６１）およびヒト脊髄ｅｌｆ様因子のＡＭＬ１結合ドメイン、ＭＥＦ（配列番号１２のヌクレオチド２５１〜６１８は、ヒトＭＥＦのアミノ酸残基８７〜２０６をコードする；参照Ｍａｏ Ｓ．ら、１９９９、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９巻、ｐｐ．３６３５−４４）から成る融合タンパク質を構築した。

転写因子ｃ−ｍｙｂは、正常な造血および造血性細胞の生存に不可欠であることが知られている（Ｍｕｃｅｎｓｋｉら、１９９１、Ｃｅｌｌ、６５巻、ｐｐ．６７７−８９）。アンチセンス方法、またはｃ−ｍｙｂノックアウトマウスによるｃ−ｍｙｂの阻害により、正常な造血を発現し得なくされていることが示されている（Ｒａｔａｊｃｚａｋら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻、ｐｐ．１１８２３−７）。

ＭＥＦ（脊髄様ＥＬＦ因子）のＡＭＬ１結合ドメインを、キメラタンパク質の二番目の部分として使用した。ＭＥＦのアミノ酸８７〜２０６は、インビボおよびインビトロで、ＡＭＬ１およびＡＭＬ１−ＥＴＯに強く結合する（Ｍａｏ Ｓ．ら、１９９９、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９巻、ｐｐ．３６３５−４４）。三つ全てのドメインを、読み取り方向に、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１中にクローニングした。この構築物を、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍと称した（図１ｂ）。ｃ−ｍｙｂのＤＮＡ結合ドメインの最初の５３アミノ酸を欠如する欠失変異体を、コントロール目的で調製した。欠失変異体を、ＧＦＰ−ΔＭ＆Ｍと称した。

組替えタンパク質の発現を、Ｃｏｓ７細胞中の一時的なトランスフェクション後に、抗ＧＦＰ抗体を使用するイムノブロッティング検出方法を用いて分析した（ＧＦＰのみ ３５ｋＤａ、ＧＦＰ−ΔＭ＆Ｍ ８０ｋＤａ；ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍ ８５ｋＤａ、図１ｃ）。

（実施例２ ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍのｍｙｂ結合部位への結合の分析）
ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍのｍｙｂ ＤＮＡ結合部位との相互作用を分析するために、電気泳動移動度シフトアッセイを実施した（参照 図２）。この目的のために、一時的にトランスフェクトしたＣｏｓ７細胞の核抽出物を調製した。二本鎖ｍｙｂコンセンサスオリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡとして役立った。これらの実験は、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍが、ｃ−ｍｙｂと同様に、ｍｙｂ ＤＮＡ結合部位に特異的に結合することを示した。ＡＭＬ１−ＥＴＯのみでは、ｍｙｂ結合部位への結合を示さなかったが、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍは、ＡＭＬ１−ＥＴＯのＤＮＡへの結合をもたらした。このことは、ＤＮＡ、ＧＦＰ−Ｍ＆ＭおよびＡＭＬ１−ＥＴＯからなる複合体のスーパーシフトを生じた（図２）。

（実施例３ ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍは、内生ｃ−ｋｉｔプロモーターに対するＡＭＬ１−ＥＴＯに結合する）
ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍの内生ｃ−ｍｙｂ標的プロモーターへの結合およびＡＭＬ１−ＥＴＯの内生ｃ−ｍｙｂ標的プロモーターへの結合を、クロマチン免疫沈降検出法（ＣｈｉＰ）を、ＫＣＬ２２細胞中で使用して分析した。

ｃ−ｋｉｔプロモーターを、ｃ−ｍｙｂ依存性内生プロモーターとして選択した。実証されたＡＭＬ１−ＥＴＯのｐ１４^ＡＲＦプロモーターに対する結合（Ｌｉｎｇｇｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、８（７）、２００２年７月）を、ポジティブコントロールとして分析した。ＦＬＡＧ標識形態のＡＭＬ１−ＥＴＯを、ＫＣＬ２２細胞中でＧＦＰまたはＧＦＰ−Ｍ＆Ｍと組み合わせて発現させた。転写因子を、ホルムアルデヒドを使用して、ＤＮＡと架橋させた。細胞溶解およびＤＮＡ断片化の後、ＤＮＡ／ＡＭＬ１−ＥＴＯ複合体を、抗ＦＬＡＧ抗体またはコントロール目的で非特異的な抗体を使用することによって免疫沈降した。架橋を消滅させ、ｃ−ｋｉｔプロモーターＤＮＡ配列およびｐ１４^ＡＲＦプロモーターＤＮＡ配列の存在を、ＰＣＲによって分析した。ｃ−ｋｉｔプロモーターの配列は、ＡＭＬ−ＥＴＯおよびＧＦＰでトランスフェクトしたＫＣＬ２２細胞のＣｈｉＰサンプル中では、検出されなかった。

しかし、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍの存在下で、ｃ−ｋｉｔプロモーター配列を、ＡＭＬ１−ＥＴＯを用いて免疫沈降した（図３）。それに対して、ｐ１４^ＡＲＦプロモーター配列を、ＡＭＬ１−ＥＴＯおよびＧＦＰでトランスフェクトしたＫＣＬ２２細胞由来の免疫複合体中で検出した。その配列は、ＡＭＬ１−ＥＴＯおよびＧＦＰ−Ｍ＆Ｍの存在下では、検出されなかった（図３）。

これらの結果は、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍが、ＡＭＬ１−ＥＴＯを、インビボで内生ｃ−ｍｙｂ依存性プロモーターに結合させ得ることを示している。

（実施例４ ＧＦＰ−Ｍ＆ＭおよびＡＭＬ１−ＥＴＯの存在下でのｍｙｂ依存性プロモーターの阻害）
ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍは、ｍｙｂ依存性プロモーターに結合し、ＡＭＬ１−ＥＴＯ（存在する場合）と複合体を形成し、そのようにして遺伝子発現を阻害する。

ルシフェラーゼアッセイを、三つの追加のｍｙｂ ＤＮＡ結合部位を有する最小限のチミジンキナーゼプロモーターのコントロールの存在下で、ルシフェラーゼ遺伝子の存在を示すさらなる実証として実施した（Ｚｉｅｂｏｌｄら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、７巻、ｐｐ．２５３−６０）。ＫＣＬ２２細胞を、レポーター構築物とＧＦＰ、ＧＦＰ−Ｍ＆ＭおよびＡＭＬ１−ＥＴＯとを種々の組合せでトランスフェクトした（図４）。そのままで、ルシフェラーゼ活性に実質的に影響を有し得るタンパク質はなかった。しかし、ＧＦＰ−Ｍ＆ＭおよびＡＭＬ−ＥＴＯを一緒に発現する細胞は、プロモーター活性の５倍より高い阻害を示す（図４）。次いで、ＧＦＰ−Ｍ＆ＭとｍｙｂＤＮＡ結合部位との間の機能的相互作用が、ルシフェラーゼ活性の阻害に必要であるか否かを、ＡＭＬ１−ＥＴＯポジティブ細胞中のＧＦＰ−Ｍ＆Ｍにより分析した。ＧＦＰ−ΔＭ＆Ｍ中のＤＮＡ結合部位の変異は、組換えタンパク質のＤＮＡ結合を阻害するが、そのタンパク質の発現は、変化しない（図１ｂ）。ＧＦＰ−ΔＭ＆Ｍのみの発現も、ＧＦＰ−ΔＭ＆ＭとＡＭＬ１−ＥＴＯとが一緒になった発現も、ルシフェラーゼ活性を阻害しなかった。

これらの結果は、ＧＦＰ−Ｍ＆ＭのＤＮＡに対する結合が、ＡＭＬ１−ＥＴＯの存在下でｍｙｂ依存性遺伝子の抑制に必要であることを示す（図４）。

（実施例５ ＡＭＬ１−ＥＴＯ発現細胞におけるコロニー増殖のＧＦＰ−Ｍ＆Ｍによる阻害）
転写因子Ｍｙｂの活性およびｍｙｂ依存性遺伝子の発現は、造血細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）のために必須である（Ｗｈｉｔｅら，２０００，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，第１９巻，１１９６−２０５頁）。従って、ＡＭＬ１−ＥＴＯ含有細胞の増殖および生存率に対するＧＦＰ−Ｍ＆Ｍの効果を分析した。

最初に、トランスフェクトされた造血３２Ｄ細胞がコロニーを形成する能力を調査した。コロニー増殖は、ＡＭＬ１、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍ、またはＡＭＬ１およびＧＦＰ−Ｍ＆Ｍでトランスフェクトされた細胞において、阻害されなかった。

ＡＭＬ１−ＥＴＯ単独でトランスフェクトされた細胞は、コロニー増殖の６倍の阻害を示し、これはおそらく、ＡＭＬ１−ＥＴＯ自体の毒性効果に起因する（Ｍｕｌｌｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．，２０００，第２０巻，３３１６−２９頁）。しかし、ＡＭＬ１−ＥＴＯの存在下におけるＧＦＰ−Ｍ＆Ｍでの３２Ｄ細胞のトランスフェクションは、コロニーの増殖を約６０倍減少させた（図５ａおよび５ｂ）。コロニーアッセイにおけるＧＦＰ−Ｍ＆ＭとＧＦＰ−ΔＭ＆Ｍとの比較において、ＧＦＰ−Ｍ＆ＭおよびＡＭＬ１−ＥＴＯの同時発現が、コロニーの相対数を８０％より多く減少させることが見出された。これに対して、ＧＦＰ−ΔＭ＆ＭおよびＡＭＬ１−ＥＴＯは、コロニー増殖を阻害しなかった（図５ｃ）。後者の観察は、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍとｍｙｂ ＤＮＡ結合部位との間の機能的相互作用が、ＡＭＬ−ＥＴＯ陽性細胞におけるコロニー増殖の阻害のために必要であることを示す。

ＡＭＬ１−ＥＴＯでトランスフェクトされた細胞におけるＧＦＰ−Ｍ＆Ｍの影響に加えて、ｔ（８；２１）陽性Ｋａｓｕｍｉ−１白血病細胞におけるＧＲＰ−Ｍ＆Ｍの活性もまた調査した。そのコロニー増殖は、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍでのトランスフェクションの後に、ＧＦＰ−ｐｃＤＮＡ３．１単独でトランスフェクトされた細胞（コントロール）と比較して、１２倍減少した（図５ｄ）。

（実施例６ ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍによる、ＡＭＬ１−ＥＴＯ含有細胞におけるアポトーシスの誘導）
ｃ−ｍｙｂ活性を有さない造血細胞をアポトーシスに供する（Ｔａｙｌｏｒら，１９９６，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，第１０巻，２７３２−４４頁）。

ＡＭＬ１−ＥＴＯ陽性細胞におけるＧＦＰ−Ｍ＆Ｍの効果およびそのアポトーシスに対する影響を調査する目的で、ＤＮＡ鎖破壊の存在を、ＴＵＮＥＬアッセイによって調査した。３２Ｄ細胞を、ＧＦＰ、ＡＭＬ１−ＥＴＯまたはＧＦＰ−Ｍ＆Ｍで、あるいはＡＭＬ１−ＥＴＯとＧＦＰ−Ｍ＆Ｍとの組み合わせで、トランスフェクトした。２４時間後、ＧＦＰ、ＡＭＬ１−ＥＴＯまたはＧＦＰ−Ｍ＆Ｍ単独を発現する細胞の約１０％が、アポトーシスを起こした。これに対して、ＡＭＬ１−ＥＴＯとＧＦＰ−Ｍ＆Ｍとの両方を発現する細胞の間でのアポトーシス細胞の百分率は、３９％であった。このことは、アポトーシス割合の４倍の増加に対応する（図６ａおよびｂ）。

（実施例７ ＭＹＢ依存性プロモーターは、ＡＭＬ１−ＥＴＯなしの細胞中で、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍによってインビボで抑制されない）
ＧＦＰ−Ｍ＆ＭがＡＭＬ１−ＥＴＯの非存在下でＭＹＢ依存性プロモーターをインビボで抑制しないことを示す目的で、初代マウス骨髄細胞を、ＧＦＰまたはＧＦＰ−Ｍ＆Ｍでのレトロウイルス形質導入に供した。これにより、ＫＩＴの発現（図７）およびＧＦＰ陽性細胞のアポトーシス割合における有意な差異は生じなかった。このことは、本発明の化合物が、健常な細胞におけるＭＹＢ依存性プロモーターの転写の特異的抑制を誘導しないことを示す。

ＡＭＬ１−ＥＴＯ異常局在化タンパク質の構築。ｃ−ｍｙｂのＤＮＡ結合ドメインおよびＭＥＦのＡＭＬ１結合ドメインからなるキメラタンパク質の機能の仮説。 ＡＭＬ１−ＥＴＯ異常局在化タンパク質の構築。欠損変異体のキメラタンパク質の構造。 ＡＭＬ１−ＥＴＯ異常局在化タンパク質の構築。細胞にＧＦＰ、ＧＦＰ−ΔＭ＆ＭおよびＧＦＰ−Ｍ＆Ｍを用いて細胞を形質転換した後の、抗ＧＦＰ抗体を使用した、Ｃｏｓ７細胞溶解物からの免疫ブロッティング検出。 インビトロの、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍのｍｙｂ結合部位に対する特異的結合およびＡＭＬ１−ＥＴＯの結合。ｃ−ｍｙｂ ＧＦＰ−Ｍ＆ＭおよびＡＭＬ１−ＥＴＯでトランスフェクとさせたＣｏｓ７の細胞核抽出物を、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）において分析した。特異的ｍｙｂおよび非特異的オリゴヌクレオチドを用いた競合実験は、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍ結合の特異性を示す。ＧＦＰ−Ｍ＆ＭのＡＭＬ１−ＥＴＯとの同時トランスフェクションによって産生されるＭ＆Ｍのスーパーシフトは、ＡＭＬ１−ＥＴＯのｍｙｂ結合部位に対する異常局在化を示す。 ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍによる、ＡＭＬ１−ＥＴＯの内在性ｃ−ｋｉｔプロモーターに対する結合。ＫＣＬ２２細胞を、ＦＬＡＧ−ＡＭＬ１−ＥＴＯおよびＧＦＰまたはＧＦＰ−Ｍ＆Ｍでトランスフェクトし、ＤＮＡ結合タンパク質を、ホルムアルデヒドを用いてＤＮＡに強く結合させ、細胞を溶解し、そしてＤＮＡを断片化して抗ＦＬＡＧ抗体または非特異的抗体により免疫沈降させた。ＰＣＲを使用し、免疫沈降させたクロマチンにおいてｃ−ｋｉｔおよびｐ１４^ＡＲＦのプロモーター配列を検出した。１つの代表的な実験を示す。 ＡＭＬ１−ＥＴＯの存在下における、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍによるｍｙｂ依存性プロモーターの特異的抑制。ＫＣＬ２２細胞を、ｍｙｂ依存性ルシフェラーゼ構築物およびｃ−ｍｙｂ、ＡＭＬ１、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＧＦＰ−ΔＭ＆ＭおよびＧＦＰ−Ｍ＆Ｍ（示す）で一時的にトランスフェクトさせた。３回の独立した実験の平均値および標準誤差を示した。 ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍは、ＡＭＬ１−ＥＴＯ発現細胞におけるコロニー増殖を抑制する。３２Ｄ細胞を、ＧＦＰ（コントロールとして）またはＡＭＬ１−ＥＴＯおよびＧＦＰ−Ｍ＆Ｍ（示す）でトランスフェクトし、そして１×１０^５個の細胞を、コロニー検出方法のために播種した。写真は、１０日目の代表的なコロニーを示す。 ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍは、ＡＭＬ１−ＥＴＯ発現細胞におけるコロニー増殖を抑制する。３２Ｄ細胞を、示したようにトランスフェクトし、そしてコロニー検出方法のために播種した。コロニーを、１０日目に計数した。ＧＦＰによるコントロールトランスフェクション（＝１に設定）と比較したコロニー増殖の抑制を、ここに図示する。３回の独立した実験の平均値および標準誤差を示した。 ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍは、ＡＭＬ１−ＥＴＯ発現細胞におけるコロニー増殖を抑制する。ＡＭＬ１−ＥＴＯを、単独またはＧＦＰ−Ｍ＆ＭもしくはＧＦＰ−ΔＭ＆Ｍと組み合わせて３２Ｄ細胞内にトランスフェクトし、次いでコロニー検出方法のために播種した。３回の独立した実験の平均値および標準誤差を示した。 ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍは、ＡＭＬ１−ＥＴＯ発現細胞におけるコロニー増殖を抑制する。ＧＦＰまたはＧＦＰ−ΔＭ＆Ｍを、天然にＡＭＬ１−ＥＴＯを発現するＫａｓｕｍｉ−１細胞内にトランスフェクトし、次いでコロニー検出方法のために播種した。３回の独立した実験の平均値および標準誤差を示した。 ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍは、ＡＭＬ１−ＥＴＯ発現細胞においてアポトーシスを誘導する。３２Ｄ細胞を、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍまたは両方のベクターでトランスフェクトし、次いで、トランスフェクトした細胞を、フローサイトメトリで選別した。トランスフェクトした細胞を、次いで、ＴＵＮＥＬ検出方法で分析した。ＢｒｄＵ陽性アポトーシス細胞についてのＦＡＣＳ結果を表示する。影をつけていない曲線は、コントロール目的で、空ベクターでトランスフェクトした細胞のアポトーシス率を表す。 ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍは、ＡＭＬ１−ＥＴＯ発現細胞においてアポトーシスを誘導する。３２Ｄ細胞を、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＧＦＰ−Ｍ＆Ｍまたは両方のベクターでトランスフェクトし、次いで、トランスフェクトした細胞を、フローサイトメトリで選別した。トランスフェクトした細胞を、次いで、ＴＵＮＥＬ検出方法で分析した。トランスフェクトした３２Ｄ細胞におけるアポトーシス細胞の割合を表示する。 ＡＭＬ１−ＥＴＯを有さない細胞において、ＭＹＢ依存性プロモーターは、インビボでＧＦＰ−Ｍ＆Ｍによって抑制されない。一次マウス骨髄細胞を、ＧＦＰまたはＧＦＰ−Ｍ＆Ｍで形質導入した。その後、ＧＦＰ陽性細胞におけるＫＩＴの発現を、分析した。２回の実験のうち１回の結果を示す。

Claims (29)

1. 腫瘍特異性分子に対する結合親和性を有し、該腫瘍特異性分子の異常局在化をもたらし得る化合物であって、ここで、該腫瘍特異性分子はＡＭＬ１−ＥＴＯであり、そしてここで該化合物はｃ−ｍｙｂ ＤＮＡ結合ドメインのペプチド配列およびミエロイドｅｌｆ様因子のＡＭＬ−１結合ドメインのペプチド配列を含む、化合物。
2. 前記異常局在化が、腫瘍特異性細胞の成長を阻害する、請求項１に記載の化合物。
3. 前記異常局在化が、腫瘍特異性細胞にアポトーシスを誘導する、請求項１に記載の化合物。
4. 前記異常局在化が、腫瘍特異性細胞にアポトーシスを誘導する、請求項２に記載の化合物。
5. １０^−５〜１０^−１２ の結合親和性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
6. １０ ^−７ 〜１０ ^−９ の結合親和性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
7. 前記腫瘍特異性分子が、ＤＮＡ結合ドメイン、シグナルペプチド、キナーゼ活性、クロマチン調節特性、タンパク質−タンパク質相互作用ドメインまたは転写特性を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
8. 前記異常局在化が、前記腫瘍特異性分子を、遺伝子の転写を調節する核酸配列に結合させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
9. 前記異常局在化が、前記腫瘍特異性分子を、遺伝子の転写を調節する核酸配列に結合させ、それによって該遺伝子の転写を活性化または阻害する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
10. 前記化合物が配列番号１に示される配列を有する、請求項１に記載の化合物。
11. 請求項２〜４のいずれかに記載の化合物をコードする核酸。
12. ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１１に記載の核酸。
13. 請求項１１に記載の核酸を含む、ベクター。
14. 請求項１２に記載の核酸を含む、ベクター。
15. 請求項１１に記載の核酸を有する、宿主細胞。
16. 請求項１２に記載の核酸を有する、宿主細胞。
17. 請求項１３または１４に記載のベクターを有する、宿主細胞。
18. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物を含む、医薬。
19. 請求項１１または１２に記載の核酸を含む、医薬。
20. 請求項１３または１４に記載のベクターを含む、医薬。
21. 請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の宿主細胞を含む、医薬。
22. 薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の医薬。
23. 腫瘍処置用の医薬の調製のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
24. 腫瘍処置用の医薬の調製のための、請求項１１または１２に記載の核酸の使用。
25. 腫瘍処置用の医薬の調製のための、請求項１３または１４に記載のベクターの使用。
26. 腫瘍処置用の医薬の調製のための、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の宿主細胞の使用。
27. 前記腫瘍が、白血病である、請求項２６に記載の使用。
28. 前記白血病が急性骨髄性白血病である、請求項２７に記載の使用。
29. 前記化合物が、組換え発現されるか、あるいはタンパク質合成によって得られる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物の調製方法。

Images