JP2006512371A - 植物材料由来のace阻害ペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、特異的活性の高いACE阻害ペプチド組成物を植物供給源から得るための、改善されたプロセスに関する。
高血圧症すなわち血圧が高いことは、一般的な健康問題であり、北米では成人4人に1人が高血圧症である。高血圧症は無症状であるため、たとえ高血圧症が認識される前であっても、不可逆的な心血管合併症が生じている可能性がある。
本発明の一つの態様によると、アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害ペプチド含有加水分解物を調製するためのプロセスであって、以下の工程を含むプロセスが提供される:
実質的に油非含有の種子の粗びき粉(seed meal)または細粉(flour)と有機溶媒を接触させる工程;
粗びき粉または細粉を溶媒から分離する工程;および
粗びき粉または細粉を少なくとも一つのタンパク質分解酵素で処理し、ACE阻害ペプチド含有加水分解物を産生する工程。
実質的に油非含有の亜麻種子の粗びき粉または実質的に油非含有のアブラナ種子の粗びき粉を少なくとも一つのタンパク質分解酵素で処理し、ACE阻害ペプチド含有加水分解物を産生する工程。
本発明は、高度に濃縮されたまたは精製されたタンパク質画分を植物材料から始めに単離する必要なく、粗びき粉または細粉などの植物材料からACE阻害組成物を調製するための、改善されたプロセス及び新規供給源を提供する。
本実施例は例示の目的で記載されるものであって、本発明の範囲を制限することを意図したものではない。
化学薬品および酵素は、以下のように入手した:アンジオテンシン変換酵素(ウサギ肺由来)およびHHL(Sigma Chemical Co.、St. Louis、MO、USA);HAおよびトリフルオロ酢酸(TFA)(Acros Organics、New Jersey、USA);HPLC級のアセトニトリル(Fisher Scientific、Nepean、ON、Canada)。その他全ての化学薬品は試薬級であり、これも同様にFisher Scientificから入手した。HPLC級の水は、Milli-Qシステム(Millipore、Bedford、MA、USA)により作製した。
ACE阻害活性の決定
CushmanおよびCheungの方法(1971)から改変された、新規の改善HPLC法(Wu, J.P. et al., (2002))により、インビトロ抗高血圧活性(ACE阻害活性)を測定した。この方法は、逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて、馬尿酸(HA)のACE触媒性産生を分離しかつ定量化する。トリフルオロ酢酸(TFA)/アセトニトリルおよびTFA/水(溶媒として)の混合液を用いた勾配溶出により、Symmetry C18カラムによりヒプリル(hippuryl)-ヒスチジル-ロイシン(HHL)およびHAを分離した。標準的な分光光度法と比べて、新規HPLC法は、HAの酢酸エチル抽出の必要性を排除し、かつ、HPLCカラムへのACE反応混合物の直接注入を可能にする。
直接HPLC分析用に、2.17mM HHL(50μl)、2mUのACE(10μl)、および、様々な濃度のタンパク質加水分解物(10μl)(全て、300mM NaClを含む100mMホウ酸緩衝液(pH8.3)で調製した)から構成される反応総量を、70μlとした。対照試験用に、緩衝液10μlを使用した。HHLと、タンパク質加水分解物または対照緩衝液を混合し、37℃で10分間、1.5mlポリエチレン微量遠心管中で維持した。ACEも同様に37℃で10分間維持し、その後、2種類の溶液を混合して、Eppendorf Thermomixer R(Brinkmann Instruments, Inc.、New York、USA)中で450rpmで連続撹拌しながら、37℃でインキュベーションした。30分後、85μlの1N HClの添加により反応を終結させ、溶液を、逆相RP-HPLC(RP-HPLC)分析用に、0.45μmナイロンシリンジフィルターで濾過した。
996 Photodiode Array Detectorを備えた2690 Separation Module(Waters Inc, MA. USA)上で、HPLCを行った。計器対照(instrument control)、データ収集、および分析は、Millennium Chromatography Manager Software version 2.15(Waters Inc, MA. USA)を用いて行った。試料(10μl)は、Symmetry C18カラム(3.0×150mm、5μm、Waters Inc.、MA、USA)上で解析し、HAおよびHHLは228nmにて検出した。カラムは、以下の2種類の溶媒系により溶出した(0.5ml.min-1):(A)0.05%トリフルオロ酢酸(TFA)の水溶液および(B)0.05%TFAのアセトニトリル溶液;初めの10分間は5〜60%のアセトニトリル勾配で、60%アセトニトリルで2分間維持し、その後1分間、5%アセトニトリルに戻した。続いて、一定の流速0.5ml.min-1で、定組成溶出(isocratic elution)を4分間行った。外部標準であるHA試料を新たに調製し、タンパク質加水分解物の存在下(HA加水分解物)またはタンパク質加水分解物の非存在下(HA対照)におけるACEの作用により形成されたHAの濃度計算のために使用した。ブランクの試料は以下のように調製した:HClの添加によりまずACEを不活性化した後、インキュベーションした。
阻害活性は、以下の等式に従って計算した:阻害活性(%)= [(HA加水分解物-HA対照) / (HA対照-HAブランク)] ×100。IC50値とは、上述のように測定されるACE活性の50%阻害をもたらす、反応混合物中の阻害物質の量と定義された。少なくとも5種類の異なる濃度の同一の加水分解物試料を用いて、阻害活性(%)に対するタンパク質加水分解物濃度(μg粉末/ml)のプロットを作成した。Microsoft Excel 97 SR-1ソフトウェア(Microsoft Corporation)を用いて回帰を行った。
アルカリ性または中性の条件下でpHをモニタリングし、塩基の添加により一定に維持した。添加した塩基の量を、設定した時間間隔で記録し、加水分解度(DH)の計算に使用した。DHは、一定のpHを維持するための塩基の体積およびモル濃度から計算され、Adler-Nissen(1986)の式に従って、単位重量あたりの結合の総数に対する壊れたペプチド結合の数(h)の割合(%)として表される。
加水分解反応混合物の試料を様々な時間間隔で取り出し、迅速に試験管に移した。各試料から、2.0mlのアリコートを10mlの1%NaDodSO4を含む試験管それぞれ2本に迅速にピペットで移し、試験管を少なくとも15分間振とうしながら水浴中に浸けることによって75℃で維持して、タンパク質加水分解物を分散させた。
0.25mlの調製試料、またはブランク(1.0%SDS)、または標準液を、2.0mlのリン酸緩衝液(pH8.2)と混合した。2mlの0.1%TNBS溶液を加えて、試験管を振とうし、50℃の湯浴に60分おき、アルミホイルで覆った。4.00mlの0.1N HClを加えて反応を終結させ、30分後に340nmにおいて水に対する吸光度を読み取った。
DH = (Lt-L0)/(Lmax-L0)×100
式中、Ltは、時間tにおいて放出されたαアミノ酸の量であり;L0は、元のアブラナ溶液中のαアミノ酸の量であり;かつ、Lmaxは、(100℃において24時間、6N HCl下で行われる)酸分解後の、アブラナ粗びき粉中のαアミノ酸の最大量である。
反応は、スターラー、温度計、およびpH電極を備えた反応容器中で、バッチで行った。40メッシュスクリーンを通過するように粉砕された、溶媒抽出エキスペラーケーキの商業用アブラナ粗びき粉(solvent extracted cake commercial canola meal)(Canbra Foods, Lethbridge, Alberta, Canada)(31.16g)(タンパク質含量:40.1%)を、磁気スターラーを用いて蒸留水と十分に混合し、250mlの5%タンパク質スラリーを形成した。評価されたタンパク質分解酵素を、そのpHおよび温度の最適条件と共に、表2に列挙した。スラリーのpHを、被験酵素に適したpHおよび温度に調整した。酵素(4%、スラリーのタンパク質含量に基づいたw/w)を添加し、反応を開始させた。反応物のpHは、0.5N NaOHまたは1N HClのいずれかの添加により、一定値に維持された。加水分解度(DH)の計算のために、アルカリの体積を特定の間隔で記録した。
実施例1同様、反応は、反応容器中で、バッチで行った。40メッシュスクリーンを通過するように粉砕された、溶媒抽出エキスペラーケーキの商業用亜麻仁粗びき粉(CanAmera Foods, Atton, Manitoba, Alberta)(50g)(タンパク質含量:33.9%)を、磁気スターラーを用いて蒸留水と十分に混合し、スラリー750mlを得た。アルカラーゼ2.4酵素加水分解用に、スラリーのpHを8.0に調整し、温度を60℃に調整した。酵素を、4%(w/w、スラリーのタンパク含量に基づく)の割合で添加した。反応中、スラリーのpHを、0.5N NaOHの添加により一定値に維持した。6N HClを用いてpH4.0前後に調整することにより、酵素を不活性化させた。非加水分解性タンパク質、大きなペプチド、および不溶性物質を、6,000×gで25分間遠心分離することにより除去した。残渣を水250ml中に再懸濁し、同じ条件で遠心分離した。その後、得られた透明な上清を一つにして、凍結乾燥させ、さらなる分析まで-5℃で保存した。同時に、対照抽出物(酵素非含有)を同一条件下で調製した。加水分解物の収量は53.54%(重量)で、タンパク質含量は39.9%であり、ACE阻害性のIC50が64.3μg粉末/mlであった。
Nutrisoy 7B大豆細粉(87g、Archer Daniels Midland CO., Decatur, Illinois)を、磁気スターラーを用いて蒸留水と十分に混合し、スラリー600mlを得た。実施例2と同様、アルカラーゼ2.4による酵素的加水分解のために、スラリーをpH8.0および60℃に調整した。酵素を、4%(w/w、スラリーのタンパク含量に基づく)の割合で添加した。反応中、0.5N NaOHの添加により、スラリーのpHを一定に維持した。6N HClを用いてpH4.0前後に調整することにより、酵素を不活性化させた。非加水分解性タンパク質および大きなペプチド、ならびにその他のポリマーを、6,000×gで25分間遠心分離することにより除去した。残渣を水300ml中に再懸濁し、同じ条件で遠心分離した。その後、得られた透明な上清を一つにして、凍結乾燥させ、さらなる分析まで-5℃で保存した。アルカラーゼ2.4により産生された加水分解物のACE阻害性のIC50は126.3μg粉末/mlであり、産物の収量は82.8% W/Wであった。
エンドウマメ細粉およびカラス麦細粉(Parrheim Foods, Saskatoon, Canada)を、実施例2と同一の条件下で、アルカラーゼ2.4と共にインキュベーションした。カラス麦細粉加水分解物のACE阻害活性(1200μg粉末/ml)は、全被験植物材料の中で最も小さかった。エンドウマメ細粉は、IC50が87.1μg粉末/mlのACE阻害活性を有していた。
地元の食品雑貨店からソバの実(buckweat)を購入し、粉砕して、40メッシュスクリーンを通過させた。粗びき粉試料を、実施例2と同様に、アルカラーゼ2.4Lまたはサーモリシンで加水分解した。サーモリシンにより産生されたタンパク質加水分解物は、ACE阻害性のIC50が78.6μg粉末/mlで産物収量は18%であったのに対し、アルカラーゼ2.4L処理された加水分解物は、ACE阻害性のIC50が174.3μg粉末/mlで産物収量は37.1%であった。
40メッシュスクリーンを通過するように粉砕された、実施例1記載の脱脂された市販のアブラナ粗びき粉(31.2g)を、室温で12時間または50℃で3時間撹拌しながら、1:10(重量/体積)の70%(v/v)エタノール:水溶液で抽出した。粗びき粉を回収し、蒸留水で洗浄して、アルカラーゼ2.4、プロテアーゼM、プロテアーゼS、または、アルカラーゼ2.4とアルカリプロテアーゼの連続処理による、1酵素あたり3時間以内の加水分解(合計6時間のインキュベーションと組み合わせた)に供した。エタノール処理されたアブラナ粗びき粉の酵素的消化物を、次に、遠心分離により分画して、加水分解ペプチドを含む上清、ならびに、非加水分解タンパク質および残存粗びき粉を含む沈殿物を産生した。これらの加水分解物は、40.0μg粉末/ml〜64.3μg粉末/mlのACE阻害活性(IC50)を示した(表3)。エタノール処理された粗びき粉から産生された加水分解物のタンパク質含量は、プロテアーゼSを用いたインキュベーションにより得られた加水分解物(タンパク質収量が僅か28.7%)を除き、41.7%から54.6%〜60.4%まで有意に増大した。
40メッシュスクリーンを通過するように粉砕された、実施例2記載の脱脂された亜麻仁粗びき粉(50g)(タンパク質含量:33.9%)を50℃で3時間、70%(v/v)エタノール:水溶液(1/15. w/v)で抽出した。抽出された亜麻仁粗びき粉を、濾過によって回収し、磁気スターラーを用いて水中に分散させて750mlの水スラリー(water slurry)を形成させた。アルカラーゼ2.4を用いた酵素的加水分解物の産生を、実施例2に記載したのと同様に行った。エタノール処理された、脱脂された亜麻仁加水分解物の収量は、産物の重量ベースで52.0%であり、タンパク質含量は45.5%で、ACE阻害性のIC50は51.4μg粉末/mlであった。
Nutrisoy 7B大豆細粉(87g、Archer Daniels Midland CO., Decatur, Illinois)を、50℃で3時間、70%エタノールで処理した。濾過された残渣を、磁気スターラーを用いて蒸留水と十分に混合し、スラリー600mlを得た。表2に記載したように、アルカラーゼ2.4Lまたはサーモリシンによる消化のために、スラリーを適切なpHおよび温度に調整した。アルカラーゼ2.4については4%(w/w、スラリーのタンパク含量に基づく)またはサーモリシンについては1%(w/w、スラリーのタンパク含量に基づく)の割合で、酵素を添加した。反応中、必要に応じて、0.5N NaOHを用いてスラリーのpHを一定に維持した。6N HClを用いてpH4.0前後に調整することにより、酵素を不活性化させた。非加水分解性タンパク質および大きなペプチド、ならびにその他のポリマーを、6,000×gで25分間遠心分離することにより除去した。残渣を水300ml中に再懸濁し、同じ条件を用いて遠心分離した。その後、得られた透明な上清を一つにして、凍結乾燥させ、さらなる分析まで-5℃で保存した。サーモリシンにより産生された加水分解物は、ACE阻害性のIC50が42.9μg粉末/mlで産物の収量が64.7%であったが、一方で、アルカラーゼ2.4処理により、ACE阻害性のIC50が118.1μg粉末/mlの加水分解物が産生され、産物の収量は55.7%であった。
40メッシュスクリーンを通過するように粉砕された、実施例2に記載された脱脂亜麻仁粗びき粉(50g)(タンパク質含量: 33.9%)を、磁気スターラーを用いて蒸留水と十分に混合し、スラリー750mlを得た。サーモリシン(39ユニット/mg固体)酵素用に、または、アルカラーゼ2.4を用いた3時間のインキュベーションおよびその後のサーモリシンを用いたさらに3時間のインキュベーション用に、スラリーのpHを、適切なpHおよび温度に調整した。アルカラーゼ2.4については4%(w/w、スラリーのタンパク含量に基づく)またはサーモリシンについては1%(w/w、スラリーのタンパク含量に基づく)の割合で、酵素を添加した。反応開始後、必要に応じて0.5N NaOHを添加することにより、スラリーのpHを一定値に維持した。6N HClを用いてpH4.0前後に調整することにより、酵素を不活性化させた。非加水分解性タンパク質および大きなペプチド、ならびにその他のポリマーを、6,000×gで25分間遠心分離することにより除去した。残渣を水250ml中に再度懸濁し、同じ条件を用いて遠心分離した。得られた透明な上清を一つにして、凍結乾燥させ、さらなる分析まで-5℃で保存した。サーモリシンにより産生された加水分解物のACE阻害性のIC50は37.1μg粉末/mlであった。サーモリシンおよびアルカラーゼ2.4の連続加水分解により生じた加水分解物のACE阻害性のIC50は34.2μg粉末/mlであった。亜麻仁由来のACE阻害ペプチドの産生に関しては、IC50が64.3mg粉末/mlである加水分解物を産生したアルカラーゼ2.4単独と比べると、サーモリシンの方がより効果的な酵素である。
40メッシュスクリーンを通過するように粉砕された、脱脂されたアブラナ粗びき粉(62.3g)を、1:10(W/V)の比率で、70%エタノール(v/v)で処理した。アルコール水溶液を除去するための濾過後、残渣をさらにアルカラーゼ2.4で消化して、エタノール処理されたアブラナタンパク質加水分解物を産生した。得られたタンパク質加水分解物を、10000分子量カットオフ(MWCO)、3000MWCO、1000MWCOの膜による限外濾過によって、さらに精製した。Amicon Ultrafiltration Cell Model 8200(Amicon Division, W.R. Grace & Co., Beverly, USA)を用いて、膜の保持(retentate)側で、35PSIの圧力で溶液にアルゴンを適用することにより、限外濾過を行った。最初に、10000MWCO膜を用いて、ペプチド加水分解物を保持物(retentate)画分と透過物(permeate)画分へと分離する。10000膜由来の透過物を次に3000MWCO膜による限外濾過に供して、3000MWCO保持物と3000MWCO透過物を作製した。10000MWCO膜による限外濾過によって、3000MWCO透過物をさらに分画し、1000MWCO透過物と1000MWCO保持物を作製した。第二の一連の実験を行ったが、ここでは、全タンパク質加水分解物を、10000MWCO膜で初めに処理することなく、3000MWCOおよび1000MWCO膜による限外濾過に供した。ACE阻害性のIC50を決定するために、透過物および保持物を回収して凍結乾燥させた。透過物は全て、対応する保持物画分よりもACE阻害活性の高いペプチドを含んでいた。1000MWCO膜によるタンパク質加水分解物の直接限外濾過によって得られた透過物において、ACE阻害活性が最も高い(IC50=25.7μg粉末/ml)ことが見出された(表4)。ACE阻害活性の高いペプチド画分(IC50=30.0〜31.4μg粉末/ml)もまた、3000MWCO膜による直接限外濾過、または10000MWCO膜による限外濾過後の3000MWCO膜による限外濾過のいずれかによって得られた。3000MWCO透過産物の収量は、1000MWCO膜を用いて得られるものよりも高かったので、1000MWCO段階へと進行するメリットはほとんど無い。膜のフラックス(flux)は孔サイズの減少と共に減少するため、最適収量は、3000MWCO膜を用いて得られる。
実施例7および9で調製された液体加水分解物を、実施例10記載のように、10000分子量カットオフ(MWCO)および100000MWCOの膜による限外濾過によって、さらに精製した。限外濾過は個別に行い、透過物および保持物の両方を回収して、ACE阻害性のIC50決定のために凍結乾燥した。先の実施例同様、透過物は全て、保持物において見出されたものよりもACE阻害活性の高いペプチドを含んでいる(表5)。亜麻仁加水分解物の粘度は、アブラナタンパク質加水分解物について観察されたものよりもずっと大きく、したがって、3000MWCOおよび1000MWCOの膜による限外濾過は実行不可能であった。10K MWCOおよび100K MWCOの膜を用いた操作の場合には、膜表面におけるフィルム形成のために、限外濾過の実行の際に困難に直面した。A)溶液の撹拌および40℃を上回る温度までの加熱、B)pH3〜4までpHを調整、または、C)AとBの併用により、このフィルムの形成は回避可能である。100K MWCO膜の孔サイズが大きいので大きなペプチドも膜を通過して透過物に含まれるため、元の亜麻仁加水分解物のACE阻害性のIC50値(64.2μg粉末/ml)と比べて、これらの限外濾過段階において有意な改善は達成されなかった。エタノール処理された加水分解物の場合、透過物のIC50値は、元の値である51.4μg粉末/mlと比べて、30.0μg粉末/mlおよび35.7μg粉末/mlと改善されており、これによって、アルコール洗浄された脱脂亜麻粗びき粉から産生されたACE阻害ペプチド画分の活性が、10K MWCOまたは100K MWCOの膜いずれかによる濾過により改善できることが示された。
実施例6のように調製された脱脂アブラナ粗びき粉のアルカラーゼ2.4加水分解物を、調製用クロマトグラフィーのために、100mg/mlの濃度で1%酢酸水溶液(v/v)に溶解した。3つのPrepPak 40mmカートリッジ(Bondapack C-18 15〜20μm、40×100mm、Waters)で構成された分節(segmented)カラムおよび保護(guard)カラム(40×100mm)を、PrepLC 4000システム(Waters)と接続した。計器対照、データ収集、および分析は、Millennium Chromatography Manager software v 2.15(Waters Inc., MA. USA)を用いて行った。試料(20ml)は、溶媒送達系を介して自動で注入した。吸光度プロフィールは、2487 Absorbance Detectorを用いて280nmでモニタリングした。Waters Fraction Collectorを用いて、画分を自動で収集した。2種の溶媒系(A:1%酢酸水溶液、およびB:メタノール(100%))を用いて、カラムを溶出した(50ml.min-1)(表6)。
Claims (45)
- アンジオテンシン変換酵素(ACE)阻害ペプチド含有加水分解物を調製するためのプロセスであって、以下の段階を含むプロセス:
実質的に油を含まない種子の粗びき粉(meal)または細粉(flour)と、有機溶媒とを接触させる段階;
粗びき粉または細粉を溶媒から分離する段階;および
少なくとも一つのタンパク質分解酵素で粗びき粉または細粉を処理して、ACE阻害ペプチド含有加水分解物を作製する段階。 - 処理された種子の粗びき粉または細粉を加水分解物から分離する工程をさらに含む、請求項1記載のプロセス。
- 溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、および酢酸エチルからなる群より選択される少なくとも一種類の溶媒である、請求項1または2記載のプロセス。
- 溶媒がエタノールである、請求項1または2記載のプロセス。
- 溶媒が水性有機溶媒である、請求項1から4のいずれか一項記載のプロセス。
- 溶媒が70:30 v/v エタノール:水である、請求項5記載のプロセス。
- 種子の粗びき粉または細粉を、約20℃から溶媒の沸点の温度の溶媒に、約1時間から約24時間接触させる、請求項1から6のいずれか一項記載のプロセス。
- ACE阻害ペプチド含有加水分解物を限外濾過する、請求項1から7のいずれか一項記載のプロセス。
- 孔サイズが約1000MWCOから約100,000MWCOの限外濾過膜を用いて加水分解物を限外濾過する、請求項8記載のプロセス。
- 加水分解物を乾燥させて粉末を形成する、請求項1から9のいずれか一項記載のプロセス。
- 種子の粗びき粉または細粉が、亜麻、アブラナ(canola)、大豆、綿実、ヒマワリ、落花生、カラシ、エンドウ、レンズマメ、マメ(bean)、ヒヨコマメ、小麦、カラス麦、大麦、ライ麦、およびソバからなる群より選択される植物に由来する、請求項1から10のいずれか一項記載のプロセス。
- 少なくとも一つのタンパク質分解酵素が、約0.25%から約8.0% w/wの濃度で存在する、請求項1から11のいずれか一項記載のプロセス。
- 少なくとも一つのタンパク質分解酵素が、約0.5%から約4.0% w/wの濃度で存在する、請求項1から11のいずれか一項記載のプロセス。
- 少なくとも一つのタンパク質分解酵素が、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、およびメタロエンドペプチダーゼからなる群より選択される、請求項1から13のいずれか一項記載のプロセス。
- 少なくとも一つのタンパク質分解酵素が、アルカラーゼ2.4L、アルカリプロテアーゼL-FG、中性プロテアーゼNBP-L、ウマミザイム、プロテアーゼPアマノ6、ペプチダーゼR、プロテアーゼM「アマノ」、プロレザー(Proleather)FG-F、およびサーモリシンからなる群より選択される、請求項1から13のいずれか一項記載のプロセス。
- 少なくとも一つのタンパク質分解酵素がアルカリプロテアーゼであり、かつ、NaOH、KOH、およびNH4OHからなる群より選択される塩基の添加によって反応混合液がアルカリ性pHに調整される、請求項1から13のいずれか一項記載のプロセス。
- 添加される塩基がKOHである、請求項16記載のプロセス。
- 少なくとも一つのタンパク質分解酵素が酸性プロテアーゼであり、かつ、反応混合液が酸性pHに調整される、請求項1から13のいずれか一項記載のプロセス。
- タンパク質分解の程度が、インキュベーション時間の変化によって制御される、請求項1から18のいずれか一項記載のプロセス。
- 種子の粗びき粉がアブラナ粗びき粉であり、かつ、加水分解物がペプチドVal-Ser-ValおよびPhe-Leuの少なくとも一方を含む、請求項1から19のいずれか一項記載のプロセス。
- 種子の粗びき粉が亜麻粗びき粉または大豆粗びき粉であり、かつ、タンパク質分解酵素がメタロエンドペプチダーゼである、請求項1から19のいずれか一項記載のプロセス。
- 亜麻またはアブラナからACE阻害ペプチド含有加水分解物を調製するためのプロセスであって、以下の段階を含むプロセス:
実質的に油非含有の亜麻種子粗びき粉または実質的に油非含有のアブラナ種子粗びき粉を少なくとも一つのタンパク質分解酵素で処理して、ACE阻害ペプチド含有加水分解物を作製する段階。 - 処理された種子粗びき粉を、加水分解物から分離する段階をさらに含む、請求項22記載のプロセス。
- 孔サイズが約1000MWCOから約100,000MWCOの限外濾過膜を用いて、ACE阻害ペプチド含有加水分解物を限外濾過する、請求項22または23記載のプロセス。
- 加水分解物を乾燥させて粉末を形成する、請求項24記載のプロセス。
- 少なくとも一つのタンパク質分解酵素が、約0.25%から約8.0% w/wの濃度で存在する、請求項22から25のいずれか一項記載のプロセス。
- 少なくとも一つのタンパク質分解酵素が、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、およびメタロエンドペプチダーゼからなる群より選択される、請求項22から26のいずれか一項記載のプロセス。
- 少なくとも一つのタンパク質分解酵素が、アルカラーゼ2.4L、アルカリプロテアーゼL-FG、中性プロテアーゼNBP-L、ウマミザイム、プロテアーゼPアマノ6、ペプチダーゼR、プロテアーゼM「アマノ」、プロレザーFG-F、およびサーモリシンからなる群より選択される、請求項22から26のいずれか一項記載のプロセス。
- 少なくとも一つのタンパク質分解酵素がアルカリプロテアーゼであり、かつ、NaOH、KOH、およびNH4OHからなる群より選択される塩基の添加によって反応混合液がアルカリ性pHに調整される、請求項22から26のいずれか一項記載のプロセス。
- 添加される塩基がKOHである、請求項29記載のプロセス。
- 請求項1から21のいずれか一項記載のプロセスによって調製される、ACE阻害ペプチド含有加水分解物。
- 亜麻粗びき粉またはアブラナ粗びき粉の部分的タンパク質分解性消化によって作製される、ACE阻害ペプチド含有加水分解物。
- 請求項22から29のいずれか一項記載のプロセスによって調製される、請求項32記載の加水分解物。
- IC50が200μg粉末/ml未満のACE阻害性を有する、請求項31から33のいずれか一項記載の加水分解物。
- 請求項31から34のいずれか一項記載の加水分解物を乾燥させることによって作製される、粉末。
- 請求項31から34のいずれか一項記載の加水分解物または請求項35記載の粉末を含む、食用製品。
- 食品または飲料である、請求項36記載の製品。
- 栄養補助食品(food supplement)である、請求項36記載の製品。
- ペプチドVal-Ser-ValおよびPhe-Leuの少なくとも一方を含む、請求項31から34のいずれか一項記載の加水分解物、または請求項35記載の粉末、または請求項36から38のいずれか一項記載の製品。
- ペプチドVal-Ser-ValおよびPhe-Leuの少なくとも一方、ならびに担体を含む、組成物。
- 式Val-Ser-Valのペプチド。
- 式Phe-Leuのペプチド。
- 哺乳動物においてACE活性を阻害する方法であって、以下の段階を含む方法:
請求項31から34のいずれか一項記載の加水分解物、または請求項35記載の粉末、または請求項36から39のいずれか一項記載の製品、または請求項40記載の薬学的組成物の有効量を、哺乳動物に投与する段階。 - ACE活性の阻害により、哺乳動物において上昇した血圧の低下がもたらされる、請求項43記載の方法。
- 哺乳動物において上昇した血圧を治療するための、請求項31から34のいずれか一項記載の加水分解物、または請求項35記載の粉末、または請求項36から39のいずれか一項記載の製品の使用。
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