JP2006509040A - 修飾されたヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
構造:
−O−Z
(式中、Zは−C(R’)2−O−R’’、−C(R’)2−N(R’’)2、−C(R’)2−N(H)R’’、−C(R’)2−S−R’’及び−C(R’)2−Fのいずれかであり、
ここで各R’’は除去可能な保護基であるか又はその一部であり;
各R’は別個に水素原子、アルキル、置換アルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシもしくはアミド基、又は連結基を介して付着した検出可能な標識;又は(R’)2は式=−C(R’’’)2のアルキリデン基を表し、ここで各R’’’は同一かもしくは異なってよく、そして水素及びハロゲン原子及びアルキル基を含む群から選択され;そして
ここで前記分子は反応して、各R’’がHと交換されるか、又はZが−C(R’)2−Fの場合、FはOH、SH又はNH2、好ましくはOHと交換される中間体を生成してもよく、この中間体は水性条件下で解離して遊離の3’OHを有する分子をもたらし;
ただしZが−C(R’)2−S−R’’である場合、双方のR’基はHではない)
の基を3’炭素原子が付着しているように、そこに共有結合した除去可能な3’−OH遮断基を有するリボース又はデオキシリボース糖部分と
を含む修飾されたヌクレオチド又はヌクレオシド分子
を本発明は提供する。
Description
プリン又はピリミジン塩基と
構造:
−O−Z
(式中、Zは−C(R’)2−O−R’’、−C(R’)2−N(R’’)2、−C(R’)2−N(H)R’’、−C(R’)2−S−R’’及び−C(R’)2−Fのいずれかであり、
ここで各R’’は除去可能な保護基であるか又はその一部であり;
各R’は別個に水素原子、アルキル、置換アルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシもしくはアミド基、又は連結基を介して付着した検出可能な標識;又は(R’)2は式=−C(R’’’)2のアルキリデン基を表し、ここで各R’’’は同一かもしくは異なってよく、そして水素及びハロゲン原子及びアルキル基を含む群から選択され;そして
ここで前記分子は反応して、各R’’がHと交換されるか、又はZが−C(R’)2−Fの場合、FはOH、SH又はNH2、好ましくはOHと交換される中間体を生成してもよく、この中間体は水性条件下で解離して遊離の3’OHを有する分子をもたらし;
ただしZが−C(R’)2−S−R’’である場合、双方のR’基はHではない)
の基を3’炭素原子が付着しているように、そこに共有結合した除去可能な3’−OH遮断基を有するリボース又はデオキシリボース糖部分と
を含む修飾されたヌクレオチド又はヌクレオシド分子が提供される。
(a)本明細書に上記した本発明の複数の異なるヌクレオチドを提供するステップであって、ヌクレオチドは好ましくは切断可能なリンカーにより塩基から検出可能な標識に連結され、そしてここで各型のヌクレオチドに連結された検出可能な標識をその他の型のヌクレオチドに用いた検出可能な標識から検出時に区別できるステップと;
(b)ヌクレオチドを標的1本鎖ポリヌクレオチドの相補体に取り込むステップと;
(c)(b)のヌクレオチドの標識を検出し、それにより取り込まれたヌクレオチドの型を決定するステップと;
(d)(b)のヌクレオチドの標識及び遮断基を除去するステップと;
(e)場合によっては(b)〜(d)のステップを1回以上繰り返すステップと;
を備え、それにより標的1本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する。
(a)本発明の複数の異なる個々のヌクレオチド;及び
(b)そのための包装材料;
を含むキットを本発明は提供する。
求電子的に切断可能なリンカーは典型的にはプロトンにより切断され、そして酸に感受性のある切断を含む。適当なリンカーには修飾されたベンジル系、例えばトリチル、p−アルコキシベンジルエステル及びp−アルコキシベンジルアミドなどがある。その他の適当なリンカーにはt−ブチルオキシカルボニル(Boc)基及びアセタール系などがある。
求核的切断もまたリンカー分子の調製においてよく知られた方法である。基例えば水中で不安定なエステル(すなわち単純に塩基性pHで切断され得る)及び非水性求核試薬に不安定な基を使用することができる。フッ素イオンを用いて基例えばトリイソプロピルシラン(TIPS)又はt−ブチルジメチルシラン(TBDMS)のシリコン−酸素結合を切断することができる。
光切断可能なリンカーは糖質化学において広く用いられている。切断を活性化するのに必要な光は、修飾されたヌクレオチドのその他の成分に影響しないのが好ましい。例えば、フルオロフォアを標識として用いる場合、これがリンカー分子を切断するのに必要な波長とは異なる波長の光を吸収すれば好ましい。適当なリンカーにはO−ニトロベンジル化合物及びニトロベラトリル化合物に基づくものなどがある。ベンゾイン化学に基づくリンカーを用いることもできる(Leeら、J.Org.Chem.64:3454−3460(1999))。
還元性の切断の影響を受けやすいことが知られている多くのリンカーがある。パラジウム系の触媒を用いる接触水素化を用いてベンジル及びベンジルオキシカルボニル基の切断が行われている。ジスルフィド結合還元もまた当分野で公知である。
酸化系の方法は当分野で公知である。これにはp−アルコキシベンジル基の酸化並びにイオウ及びセレニウムリンカーの酸化などがある。ジスルフィド及びその他のイオウ又はセレニウム系のリンカーを切断するための水性ヨウ素の使用もまた本発明の範囲内である。
セーフティ・キャッチ・リンカーは2つの工程で切断するリンカーである。好ましい系では、第1工程は反応性求核中心の作製であり、その後に切断に至る分子内環化に関与する第2工程が続く。例えばレブリン酸エステル結合をヒドラジン又は光化学で処理して活性アミンを放出させ、次いでこれを環化して分子の他の場所のエステルを切断することができる(Burgessら、J.Org.Chem.62:5165−5168(1997))。
排除反応を用いることもできる。例えば、例えばFmoc及びシアノエチルなどの基の塩基で触媒される排除、並びにアリル系のパラジウムで触媒される還元性排除を用いることができる。
乾燥DMF(21ml)中5−ヨード−2’−デオキシウリジン(1.05g,2.96ミリモル)及びCuI(114mg,0.60ミリモル)の溶液にトリエチルアミン(0.9ml)を加えた。5分間攪拌した後、トリフルオロ−N−プロパ−2−イニル−アセトアミド(1.35g,9.0ミリモル)及びPd(PPh3)4(330mg,0.29ミリモル)を混合物に加え、そして反応物を室温にて暗中で16時間攪拌した。メタノール(MeOH)(40ml)及び重炭酸dowexを反応混合物に加え、そして45分間攪拌した。混合物を濾過し、そして濾過物をMeOHで洗浄し、そして溶媒を真空下除去した。粗製混合物をシリカのクロマトグラフィーにより精製し(酢酸エチル(EtOAc)からEtOAc:MeOH 95:5))、わずかに黄色の結晶が得られた(794mg,71%)。1H NMR (d6 ジメチルスルホキシド (DMSO) ) δ 2.13-2.17 (m, 2H, H-2'), 3.57-3.65 (m, 2H, H-5'), 3.81-3.84 (m, 1H, H-4'), 4.23-4.27 (m, 3H, H-3', CH2N), 5.13 (t, J = 5.0 Hz, 1H, OH), 5.20 (d, J = 4.3 Hz, 1H, OH), 6.13 (t, J = 6.7 Hz, 1H, H-1'), 8.23 (s, 1H, H-6), 10.11 (t, J = 5.6 Hz, 1H, NH), 11.70 (br s, 1H, NH). Mass(−ve エレクトロスプレー)C14H14F3N3O6に関して計算値377.08,測定値376。
乾燥DMF(15ml)中(1)の溶液(656mg,1.74ミリモル)に塩化t−ブチルジメチルシリル(288mg,1.91ミリモル)を少しずつ、続いてイミダゾール(130mg,1.91ミリモル)を加えた。TLCにより反応を追跡し、室温で8時間攪拌した後、反応が完了した。飽和NaCl水溶液で反応をクエンチした。EtOAc(25ml)を反応混合物に加え、そして水層をEtOAcで3回抽出した。合わせた有機層を乾燥(MgSO4)した後、溶媒を真空下除去した。シリカでのクロマトグラフィーによる精製(EtOAc:石油エーテル 8:2)でわずかに黄色の結晶として(2)(676mg,83%)が得られた。1H NMR (d6 DMSO) δ 0.00 (s, 6H, CH3), 0.79 (s, 9H, tBu), 1.93 -2.00 (m, 1H, H-2'), 2.06-2.11 (m, 1H, H-2'), 3.63-3.75 (m, 2H, H-5'), 3.79-3.80 (m, 1H, H-4'), 4.12-4.14 (m, 3H, H-3', CH2N), 5.22 (d, J = 4.1 Hz, 1H, OH), 6.03 (t, J = 6.9 Hz, 1H, H-1'), 7.86 (s, 1H, H-6), 9.95 (t, J = 5.4 Hz, 1H, NH), 11.61 (br s, 1H, NH).Mass(−veエレクトロスプレー)C20H28F3N3O6Siに関して計算値491.17,測定値490.
乾燥DMF(7ml)中(2)の溶液(1.84g,3.7ミリモル)に酢酸(3.2ml)及び無水酢酸(10.2ml)を加えた。次いで混合物を室温で2日間攪拌した後、飽和NaHCO3水溶液で反応をクエンチした。EtOAc(50ml)を加え、そして水層を酢酸エチルで3回抽出した。合わせた有機層を飽和NaHCO3水溶液で洗浄し、そして乾燥(MgSO4)した。減圧下で溶媒を除去した後、生成物(3)をシリカでのクロマトグラフィーにより精製(EtOAc:石油エーテル 8:2)し、透明な粘着性の油状物(1.83g,89%)が得られた。1H NMR (d6 DMSO) : δ 0.00 (s, 6H, CH3), 0.79 (s, 9H, tBu), 1.96-2.06 (m, 1H, H-2'), 1.99 (s, 3H, SCH3), 2.20-2.26 (m, 1H, H-2'), 3.63-3.74 (m, 2H, H-5'), 3.92-3.95 (m, 1H, H-4'), 4.11-4.13 (m, 2H, CH2), 4.28-4.30 (m, 1H, H-3'), 4.59 (br s, 2H, CH2), 5.97 (t, J = 6.9 Hz, 1H, H-1'), 7.85 (s, 1H, H-6), 9.95 (t, J = 5.3 Hz, 1H, NH), 11.64 (s, 1H, NH).Mass(−veエレクトロスプレー)C22H32F3N3O6SSiに関して計算値551.17,測定値550.
乾燥CH2Cl2(5ml)中(3)(348mg,0.63ミリモル)及びシクロヘキセン(0.32ml,3.2ミリモル)の溶液に4℃で塩化スルフリル(CH2Cl2中1M,0.76ml,0.76ミリモル)をN2下で滴下した。10分後、TLCによりヌクレオシド(3)の完全な消費が示された。溶媒を蒸発させて、残渣を高真空に20分間供した。次いでこれを乾燥DMF(3ml)に再溶解し、そしてNaN3(205mg,3.15ミリモル)で処理した。得られた懸濁液を室温で2時間攪拌した。CH2Cl2で反応をクエンチし、そして有機層を飽和NaCl水溶液で洗浄した。溶媒を除去した後、得られた黄色ゴム状物質をTHF(2ml)に再溶解し、そして室温で30分間TBAF(THF中1M、0.5ml)で処理した。溶媒を除去し、そしてCH2Cl2及び飽和NaHCO3水溶液で反応液を処理した。水層をCH2Cl2で3回抽出した。シリカのクロマトグラフィーによる精製(EtOAc:石油エーテル 1:1からEtOAc)で淡黄色の泡状物として(4)(100mg,37%)が得られた。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.15-2.26 (m, 2H, H-2'), 3.47-3.57 (m, 2H, H-5'), 3.88-3.90 (m, 1H, H-4'), 4.14 (d, J = 4.7 Hz, 2H, CH2NH), 4.24-4.27 (m, 1H, H-3'), 4.75 (s, 2H, CH2N3), 5.14 (t, J = 5.2 Hz, 1H, OH), 5.96-6.00 (m, 1H, H-1'), 8.10 (s, 1H, H-6), 10.00 (s, 1H, NHCOCF3)), 11.26 (s, 1H, NH).
四ナトリウム二リン酸十水和物(1.5g,3.4ミリモル)を水(34ml)に溶解し、そして溶液をH+の形態のdowexのカラムに適用した。カラムを水で溶出した。溶出液を冷却し(氷浴)そして攪拌したEtOH(14ml)中トリ−n−ブチルアミン(1.6ml,6.8ミリモル)溶液に直接滴下した。溶出液のpHが6に上昇するまでカラムを洗浄した。エタノール水溶液を蒸発乾固し、そして次にエタノールで2回及び無水DMFで2回同時蒸発させた。残渣をDMF(6.7ml)に溶解した。淡黄色溶液を4Åモレキュラーシーブ上で保存した。
ヌクレオシド(4)及びプロトンスポンジを真空下P2O5で一晩乾燥した。リン酸トリメチル(0.5ml)中(4)の溶液(92mg,0.21ミリモル)及びプロトンスポンジ(90mg,0.42ミリモル)を4Åモレキュラーシーブを用いて1時間攪拌した。新たに蒸留したPOCl3(24μl,0.26ミリモル)を加え、溶液を4℃で2時間攪拌した。混合物をゆっくり室温まで加温し、そしてビス(トリ−n−ブチルアンモニウム)ピロリン酸(1.7ml,0.85ミリモル)及び無水トリ−n−ブチルアミン(0.4ml,1.7ミリモル)を加えた。3分後、0.1M TEAB(重炭酸トリエチルアンモニウム)バッファー(15ml)でクエンチし、そして3時間攪拌した。減圧下、水を除去し、そして得られた残渣を濃アンモニア(ρ0.88,15ml)に溶解し、そして室温で16時間攪拌した。次いで反応混合物を蒸発乾固した。残渣を水に溶解し、そして溶液をDEAE−セファデックス A−25カラムに適用した。TEABの直線グラジエントを用いてMPLCを行った。0.7Mと0.8Mバッファーの間で三リン酸塩が溶出した。生成物を含有する画分を合わせて蒸発乾固した。残渣を水に溶解し、そしてHPLCで更に精製した。HPLC:tr(5):18.8分(Zorbax C18調製用カラム、グラジエント:30分で5%〜35%B、バッファーA 0.1M TEAB、バッファーB MeCN)。生成物を白色泡状物として単離した(76 O.D.7.6マイクロモル、3.8%、ε280=10000)。1H NMR (D2O) δ 1.79 (s, CH2), 2.23-2.30; 2.44-2.50 (2 x m, 2H, H-2'), 3.85 (m, CH2NH), 4.10-4.18 (m, 2H, H-5'), 4.27 (br s, H-4'), 4.48-4.50 (m, H-3'), 4.70-4.77 (m, CH2N3), 6.21 (t, J = 6.6 Hz, H-1'), 8.32 (s, 1H, H-6). 31P NMR (D2O) δ -6.6 (m, 1P, Pγ), -10.3 (d, J = 18.4 Hz, 1P, Pα), -21.1 (m, 1P, Pβ).Mass(−ve エレクトロスプレー)C13H19N6O14P3に関して計算値576.02,測定値575.
DMF(300μl)に出発ジスルフィド(4.0mg,13.1 マイクロモル)を溶解し、そしてジイソプロピルエチルアミン(4μL)をゆっくりと加えた。混合物を室温で攪拌し、そしてDMF(300μl)中Cy−3色素(5mg,6.53マイクロモル)を10分間かけて加えた。3.5時間後、反応完了時に、減圧下、揮発物質を蒸発させ、そして粗製残渣をZorbax分析カラムSB−C18で、流速1ml/分の0.1M重炭酸トリエチルアンモニウムバッファー(バッファーA)及びCH3CN(バッファーB)を用いて、以下のグラジエントを用いてHPLC精製した:5分 2%B;31分 55%B;33分 95%B;37分 95%;39分 2%B;44分 2%B。予測されるCy−3ジスルフィドリンカーを吸湿性の固体としてtr:21.8分で収率70%(UV測定に基づく;H2O中ε550 150,000cm−1M−1)で溶出した。1H NMR (D2O) δ 1.31-1.20 (m + t, J = 7.2 Hz, 5H, CH2+ CH3), 1.56-1.47 (m, 2H, CH2), 1.67 (s, 12H, 4 CH3), 1.79-1.74 (m, 2H, CH2), 2.11 (t, J = 6.9 Hz, 2H, CH2), 2.37 (t, J = 6.9 Hz, 2H, CH2), 2.60 (t, J = 6.3 Hz, 2H, CH2), 2.67 (t, J = 6.9 Hz, 2H, CH2), 3.27 (t, J = 6.1 Hz, 2H, CH2), 4.10-4.00 (m, 4H, 2CH2), 6.29 (dd, J = 13.1, 8.1 Hz, 2H, 2 = CH), 7.29 (dd, 2H, J = 8.4, 6.1 Hz, 2 = CH), 7.75-7.71 (m, 2H, 2 = CH), 7.78 (s, 2H, = CH), 8.42 (t, J = 12.8 Hz, 1H, = CH).Mass(−veエレクトロスプレー)C36H47N3O9S4に関して計算値793.22,測定値792(M−H),396[M/2].
遮光丸底フラスコでアルゴン雰囲気下、DMF(200ml)中5−ヨード−2’−デオキシシチジン(10g,28.32ミリモル)の溶液にCuI(1.08g,5.67ミリモル)、トリエチルアミン(7.80ml,55.60ミリモル)、2,2,2−トリフルオロ−N−プロパ−2−イニル−アセトアミド(12.8g,84.76ミリモル)及び最後にPd(PPh3)4(3.27g,2.83ミリモル)を加えた。室温で18時間の後、重炭酸dowex(20mg)を加え、そして混合物を更に1時間攪拌した。濾過し、そして減圧下、揮発性物質を蒸発させて残渣を得て、これをシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した(CH2Cl2,CH2Cl2:EtOAc 1:1,EtOAc:MeOH 9:1)。予測される生成物(7)が定量的な収率でベージュ色固体として得られた。1H NMR (D2O) δ 2.24-2.17 (m, 1H, H-2'), 2.41-2.37 (m, 1H, H-2'), 3.68 (dd, J = 12.5, 5.0 Hz, 1H, H-5'), 3.77 (dd, J = 12.5, 3.2 Hz, 1H, H-5'), 3.99 (m, 1H, H-4'), 4.27 (s, 2H, CH2N), 4.34 (m, 1H, H-3'), 6.11 (t, J = 6.3 Hz, 1H, H-1'), 8.1 (br s, 1H, NH); MS (ES) :m/z (%) (M-H) 375 (100).
DMF(3.0ml)中(7)出発原料(1.0g,2.66ミリモル)及びイミダゾール(200mg,2.93ミリモル)の溶液に0℃でゆっくりと1時間にわたりTBDMSCl(442mg,2.93ミリモル)を4回に分けて加えた。2時間後、減圧下、揮発物質を蒸発させ、そして残渣をシリカゲルに吸収させ、そしてフラッシュクロマトグラフィーにより精製した(EtOAc,EtOAc:MeOH 9.5:0.5)。予測される生成物(8)を結晶性固体として単離した(826mg,64%)。1H NMR (d6 DMSO) δ 0.00 (s, 1H, CH3); 0.01 (s, 1H, CH3), 0.79 (s, 9 H, tBu), 1.87-1.80 (m, 1H, H-2'), 2.12 (ddd, J = 13.0, 5.8 and 3.0 Hz, 1H, H-2'), 3.65 (dd, J = 11.5, 2.9 Hz, 1H, H-5'), 3.74 (dd, J = 11.5, 2.5 Hz, 1H, H-5'), 3.81-3.80 (m, 1H, H-4'), 4.10-4.09 (m, 1H, H-3'), 4.17 (d, 2H, J = 5.1 Hz, NCH2), 5.19 (d, 1H, J = 4.0 Hz, 3’-OH), 6.04 (t, J = 6.6 Hz, 1H, H-1'), 6.83 (br s, 1H, NHH), 7.78 (br s, 1H, NHH), 7.90 (s, 1H, H-6), 9.86 (t, J = 5.1 Hz, 1H, -H2CNH); MS (ES) :m/z (%) (MH)+ 491 (40%).
DMSO(6.3ml)中、及びN2雰囲気下、出発原料(8)(825mg,1.68ミリモル)の溶液に酢酸(AcOH)(1.3ml,23.60ミリモル)続いて無水酢酸(Ac2O)(4.8ml,50.50ミリモル)をゆっくりと加えた。溶液を室温で18時間攪拌し、そして0℃で飽和NaHCO3(20ml)を添加することによりクエンチした。生成物をEtOAに抽出し(3×30ml)、有機抽出物を合わせ、乾燥(MgSO4)し、濾過し、そして揮発物質を蒸発させた。粗製残渣をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し(EtOAc:石油エーテル 1:1)、無色油状物(9)として予測される生成物が得られた(573mg,62%)。1H NMR (d6 DMSO) δ 0.00 (s, 6H, 2 x CH3), 0.78 (s, 9H, tBu), 2.01 (s, 3H, SCH3), 2.19-1.97 (m, 2H, 2 x H2'), 2.25 (s, 3H, COCH3), 3.67 (dd, 1H, J = 11.5 Hz, H-5'), 3.78 (dd, 1H, J = 11.5, 3.3 Hz, H-5'), 4.06-4.05 (m, 1H, H-4'), 4.17 (d, 2H, J = 5.1 Hz, N-CH2), 4.30-4.28 (m, 1H, H-3'), 4.63 (s, 2H, CH2-S), 5.94 (t, 1H, J = 6.5 Hz, H-1'), 8.17 (s, 1H, H-6), 9.32 (s, 1H, NHCO), 9.91 (t, 1H, J = 5.4 Hz, NHCH2); MS (ES) :m/z (%) (MH)+ 593.
N2雰囲気下、0℃まで冷却した、ジクロロメタン(DCM)(8ml)中出発原料(9)(470mg,0.85ミリモル)の溶液にシクロヘキセン(430μl,4.27ミリモル)続いてSO2Cl2(DCM中1M,1.0ml,1.02ミリモル)を加えた。溶液を0℃で30分間攪拌し、そして揮発性物質を蒸発させた。残渣をDMF(8ml)に即座に溶解し、N2下で攪拌し、そしてアジ化ナトリウム(275mg,4.27ミリモル)をゆっくりと加えた。18時間後、粗製生成物を蒸発乾固し、EtOAc(30ml)に溶解し、そしてNa2CO3(3×5ml)で洗浄した。合わせた有機層を別に維持した。生成物の水層からの第2の抽出をDCM(3×10ml)で行った。全ての合わせた有機層を乾燥(MgSO4)し、濾過し、そして減圧下、揮発性物質を蒸発させて予測される生成物(10)と同定される油状物が得られた(471mg,収率94%)。これを更に精製することなく使用した。1H NMR (d6 DMSO) δ 0.11 (s, 3H, CH3), 0.11 (s, 3H, CH3), 0.88 (s, 9H, tBu), 2.16-2.25 (m, 1H, H-2'), 2.35 (s, 3H, COCH3), 2.47-2.58 (m, 1H, H-2'), 3.79 (dd, J = 11.6, 3.2 Hz, 1H, H-5'), 3.90 (dd, J = 11.6, 3.0 Hz, 1H, H-5'), 4.17-4.19 (m, 1H, H-4'), 4.28 (s, 2H, NCH2), 4.32-4.35 (m, 1H, H-3'), 4.89 (dd, J = 14.4, 6.0 Hz, 2H, CH2-N3), 6.05 (t, J = 6.4 Hz, 1H, H-1'), 8.25 (s, 1H, H-6), 9.46 (br s, 1H, NHH), 10.01 (br s, 1H, NHH).
0℃、N2雰囲気下、THF(20ml)中出発原料(11)(440mg,0.75ミリモル)の溶液にTHF中1.0M TBAF(0.82ml,0.82ミリモル)を加えた。1.5時間後、減圧下、揮発性物質を蒸発させ、そして残渣をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した(EtOAc:石油エーテル 8:2からEtOAc100%からEtOAc:MeOH 8:2)。2つの化合物を単離し、そして前記のように同定した。最初に4−N−アセチル(11)(53mg,15%)を溶出し、そして2番目に4−NH2(12)(271mg,84%)を溶出した。
4−N−アセチル化合物(11):1H NMR (d6 DMSO) δ 1.98 (s, 3H, CH3CO), 2.14-2.20 (m, 2H, HH-2'), 3.48-3.55 (m, 1H, H-5'), 3.57-3.63 (m, 1H, H-5'), 3.96-4.00 (m, 1H, H-4'), 4.19 (d, J = 5.3 Hz, 2H, CH2-NH), 4.23-4.28 (m, 1H, H-3'), 4.77 (s, 2H, CH2-N3), 5.2 (t, 1H, J = 5.1 Hz, 5’-OH), 5.95 (t, J = 6.2 Hz, 1H, H-1'), 8.43 (s, 1H, H-6), 9.34 (s, 1H, CONH), 9.95 (t, J = 5.3 Hz, 1H, NHCH2).
4−NH2化合物(12):1H NMR (d6 DMSO) δ 1.98-2.07 (2H, CHH-2'), 3.50-3.63 (m, 2H, CHH-5'), 3.96-4.00 (m, 1H, H-4'), 4.09 (d, J = 5.3 Hz, 2H, CH2-NH), 4.24-4.28 (m, 1H, H-3'), 4.76 (s, 2H, CH2-N3), 5.13 (t, J = 5.3 Hz, 1H, 5’-OH), 5.91 (br s, 1H, NHH), 6.11 (t, J = 6.4 Hz, 1H, H-1'), 8.20 (t, J = 5.3 Hz, 1H, NCH2), 8.45 (s, 1H, H-6), 11.04 (br s, 1H, NHH).
出発原料(8)(10g,20.43ミリモル)を乾燥ピリジン(2×100ml)中で共沸し、次いでN2雰囲気下、乾燥ピリジン(160ml)に溶解した。クロロトリメチルシラン(10ml,79.07ミリモル)を溶液に滴下し、そして室温で2時間攪拌した。次いで塩化ベンゾイル(2.6ml,22.40ミリモル)を溶液に加え、そして更に1時間攪拌した。反応混合物を0℃まで冷却し、蒸留水(50ml)を溶液にゆっくりと加え、そして30分間攪拌した。高真空下、ピリジン及び水を混合物から蒸発させて、褐色のゲルを生じ、これを飽和NaHCO3水溶液100mlとDCM溶液(100ml)間で分配した。有機層を分離し、そして水層を更にDCM(2×100ml)で抽出した。有機層を合わせ、乾燥(MgSO4)し、濾過し、そして減圧下、揮発性物質を蒸発させた。得られた褐色の油状物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し(DCM:MeOH 99:1〜95:5)、淡黄色の結晶性固体を生じた(13)(8.92g,74%)。1H NMR (d6 DMSO) : δ 0.00 (s, 6H, CH3), 0.78 (s, 9H, tBu), 1.94 (m, 1H, H-2'), 2.27 (m, 1H, H-2'), 3.64 (d, 1H, J = 11.6 Hz, H-5'), 3.75 (d, 1H, J = 11.6 Hz, H-5'), 3.91 (m, 1H, H-4'), 4.09 (br m, 3H, CH2NH, H-3'), 5.24 (s, 1H, 3’-OH), 6.00 (m, 1H, H-1'), 7.39 (m, 2H, Ph), 7.52 (m, 2H, Ph), 7.86 (m, 1H, Ph), 8.0 (s, 1H, H-6), 9.79 (t, 1H, J = 5.4 Hz, NHCH2), 12.67 (br s, 1H, NH).Mass(+ve エレクトロスプレー)C27H33F3N4O6Si に関して計算値594.67,測定値595.
N2雰囲気下、出発原料(13)(2.85g,4.79ミリモル)を乾燥DMSO(40ml)に溶解した。酢酸(2.7ml,47.9ミリモル)及び無水酢酸(14.4ml,143.7ミリモル)を順にゆっくりと出発原料に加え、次いでこれを室温で18時間攪拌した。飽和NaHCO3(150ml)溶液を反応混合物に注意深く加えた。水層をEtOAc(3×150ml)で抽出した。有機層を合わせ、乾燥(MgSO4)し、濾過し、そして蒸発させて橙色の液体を得て、これを続いて原料が固化するまでトルエン(4×150ml)と共沸した。粗製残渣をシリカゲルで精製し(石油エーテル:EtOAc 3:1〜2:1)、黄色の結晶性固体(14)(1.58g,50%)を生じた。1H NMR (d6 DMSO) : δ 0.00 (s, 6H, CH3), 0.78 (s, 9H, tBu), 1.99 (s, 3H, CH3), 2.09 (m, 1H, H-2'), 2.28 (m, 1H, H-2'), 3.66 (d, 1H, J = 11.5, 2.9 Hz, H-5'), 3.74 (dd, 1H, J = 11.3, 2.9 Hz, H-5'), 3.99 (m, 1H, H-4'), 4.09 (m, 1H, CH2NH), 4.29 (m, 1H, H-3'), 4.61 (s, 2H, CH2S), 6.00 (m, 1H, H-1'), 7.37 (m, 2H, Ph), 7.50 (m, 2H, Ph), 7.80 (d, 1H, J = 7.55 Hz, HAr), 7.97 (s, 1H, H-6), 9.79 (br t, 1H, NHCH2), 12.64 (br s, 1H, NH).Mass(−ve エレクトロスプレー)C29H37F3N4O6SSiに関して計算値654.79,測定値653.2.
出発原料(14)1.65g,2.99ミリモル)をDCM(18ml)に溶解し、そして0℃まで冷却した。シクロヘキセン(1.5ml,14.95ミリモル)及びSO2Cl2(0.72ml,8.97ミリモル)を加え、そして氷浴中1時間攪拌した。TLCが、出発原料が依然存在することを示したときは、SO2Cl2(0.24ml)の更なるアリコートを加え、そして混合物を0℃で1時間攪拌した。蒸発させて揮発物質を除去し、淡褐色固体を生じ、これをN2下、乾燥DMF(18ml)18mlに再溶解した。次いでアジ化ナトリウム(0.97g,14.95ミリモル)を溶液に加え、そして室温で2.5時間攪拌した。反応混合物をシリカのパッドに通し、そしてEtOAcで溶出し、そして高真空蒸発により揮発性物質を除去した。得られた褐色のゲルをフラッシュクロマトグラフィーにより精製し(石油エーテル:EtOAc 4:1〜2:1)、白色の結晶性固体として所望の生成物を生じた(15)(0.9g,55%)。1H NMR (d6 DMSO) : δ 0.00 (s, 6H, CH3), 0.78 (s, 9H, tBu), 2.16 (m, 1H, H-2'), 2.22 (m, 1H, H-2'), 3.70 (d, 1H, J = 11.5 Hz, H-5'), 3.75 (d, 1H, J = 11.3 Hz, H-5'), 4.01 (m, 1H, H-4'), 4.10 (m, 1H, CH2NH), 4.23 (m, 1H, H-3'), 4.76 (s, 2H, CH2S), 5.99 (m, 1H, H-1'), 7.37 (m, 2H, Ph), 7.50 (m, 2H, Ph), 7.81 (d, 1H, J = 7.4 Hz, Ph), 7.95 (s, 1H, H-6), 9.78 (br s, 1H, NHCH2), 12.64 (br s, 1H, NH).Mass(−ve エレクトロスプレー)C28H34F3N7O6Siに関して計算値649.71,測定値648.2
出発原料(15)(140mg,0.22ミリモル)をTHF(7.5ml)に溶解した。TBAF(THF中1M 溶液,0.25ml)をゆっくりと加え、そして室温で2時間攪拌した。減圧下、揮発性材料を除去し、そして褐色のゲルを生じ、これをフラッシュクロマトグラフィーにより精製し(EtOAc:DCM 7:3)、薄く着色した結晶性固体として所望の生成物(16)を生じた(0.9g,76%)。1H NMR (d6 DMSO) : δ 2.16 (m, 1H, H-2'), 2.22 (m, 1H, H-2'), 3.70 (d, 1H, J = 11.5 Hz, H-5'), 3.75 (d, 1H, J = 11.3 Hz, H-5'), 4.01 (m, 1H, H-4'), 4.10 (m, 1H, CH2NH), 4.23 (m, 1H, H-3'), 4.76 (s, 2H, CH2S), 5.32 (s, 1H, 5’ OH), 5.99 (m, 1H, H-1'), 7.37 (m, 2H, Ph), 7.50 (m, 2H, Ph), 7.81 (d, 1H, J = 7.35 Hz, Ph), 7.95 (s, 1H, H-6), 9.78 (br s, 1H, NHCH2), 12.64 (br s, 1H, NH).Mass(−veエレクトロスプレー)C22H20F3N7O6に関して計算値535.44,測定値534.
PO(OMe)3(600μl)中(11)及び(12)(290mg,0.67ミリモル)並びにプロトンスポンジ(175mg,0.82ミリモル)(双方共に予めP2O5下、少なくとも24時間乾燥した)の溶液に0℃でアルゴン雰囲気下、POCl3(新たに蒸留した)(82μl,0.88ミリモル)をゆっくりと加えた。溶液を0℃で3時間、激しく攪拌し、そして次にDMF中二リン酸テトラ・トリブチルアンモニウム(0.5M)(5.2ml,2.60ミリモル)、続いてnBu3N(1.23ml,5.20ミリモル)及び0.1M 重炭酸トリエチルアンモニウム(TEAB)(20ml)の添加によりクエンチした。室温で1時間の後、アンモニア水溶液(ρ0.88,20ml)を混合物に加えた。溶液を室温で15分間攪拌し、減圧下、揮発性物質を蒸発させ、そして残渣をMPLCにより、0.05Mから0.7M TEABのグラジエントで精製した。予測される三リン酸塩をおよそ0.60M TEABでカラムから溶出した。Zorbax SB−C18カラム(内径21.2mm×25cm)のHPLCで2回目の精製を行い、以下のグラジエント:0〜5分 5%B,Φ.2ml;5〜25分 80%B,Φ.8ml;25〜27分 95%B,Φ.8ml;27〜30分 95%B,Φ.8ml;30−32分 5%B,Φ.8ml;32〜35分 95%B,Φ.2ml、を用いて0.1M TEAB(ポンプA)及び0.1M TEAB中30%CH3CN(ポンプB)で溶出しrt(17):20.8(14.5マイクロモル,収率 2.5%)の前記の生成物が得られた;31P NMR (D2O, 162MHz) δ -5.59 (d, J = 20.1 Hz, Pc), -10.25 (d, J = 19.3 Hz, 1P, Pα), -20.96 (t, J = 19.5 Hz, 1P, Pβ); 1H NMR (D2O) δ 2.47-2.54 (m, 1H, H-2'), 2.20-2.27 (m, 1H, H-2'), 3.88 (s, 2H, CH2N), 4.04-4.12 (m, 1H, HH-5'), 4.16-4.22 (m, 1H, HH-5'), 4.24-4.30 (m, 1H, H-4'), 4.44-4.48 (m, 1H, H-3'), 6.13 (t, J = 6.3 Hz, 1H, H-1'), 8.35 (s, 1H, H-6); MS (ES) :m/z (%) (M-H) 574 (73%), 494 (100%).
市販されているAlexa Fluor 488−NHS(35mg,54マイクロモル)をDMF(700μl)に溶解し、そして完全な活性化を確実にし、4−DMAP(7mg,59マイクロモル)及び炭酸N,N’−ジサクシンイミジル(15mg,59マイクロモル)を順に加えた。15分後、完全に活性化したときに、ジイソプロピルエチルアミン(4μl)含有DMF(300μl)中、出発ジスルフィド(32.0mg,108マイクロモル)を活性化した色素溶液上に加えた。最終混合物にジイソプロピルエチルアミン(20μl)を更に添加し、5分間超音波処理し、そして暗中室温で18時間反応させた。減圧下、揮発性物質を蒸発させ、そして粗製残渣を短いイオン交換樹脂セファデックス−DEAE A−25(40−120μ)カラムを通すことにより最初に精製し、最初に0.1M TEAB(25ml)、次に1.0M TEAB(75ml)で溶出した。2つの最終化合物を含有する最終混合物を濃縮し、そして残渣をZorbax SB−C18 カラム(内径21.2mm×25cm)で、0.1M TEAB(ポンプA)及びCH3CN(ポンプB)で以下のグラジエント:0〜2分 2%B,Φ.2ml;2〜4分 2%B,Φ.8ml;4〜15分 23%B,Φ.8ml;15〜24分 23%B,Φ.8ml;24〜26分 95%B,Φ.8ml;26〜28分 95%B,Φ.8ml、28〜30分 2%B,Φ.8ml,30〜33分 2%B,Φ.2mlを用いて溶出してHPLC精製し、tr:19.0(左の位置異性体)及びtr:19.5(右の位置異性体)の前記で詳記した双方の化合物が得られた。双方の位置異性体の各々をdowexイオン交換樹脂カラムに通し、各々16.2マイクロモル及び10.0マイクロモル、全収率62%が得られた(純度76%の市販されているAlexa Fluor 488−NHSに基づく)。;H2O中ε493=71,000cm−1M−1。1H NMR (D2O) (左の位置異性体) δ 2.51 (t, J = 6.8 Hz, 2H, CH2), 2.66 (t, J = 6.8 Hz, 2H, CH2), 2.71 (t, J = 5.8 Hz, 2H, CH2), 3.43 (t, J = 5.8 Hz, 2H, CH2), 6.64 (d, J = 9.2 Hz, 2H, HAr), 6.77 (d, J = 9.2 Hz, 2H, HAr), 7.46 (s, 1H, HAr), 7.90 (dd, J = 8.1 and 1.5 Hz, 1H, HAr), 8.20 (d, J = 8.1 Hz, 1H, HAr).1H NMR (D2O) (右の位置異性体) δ 2.67 (t, J = 6.8 Hz, 2H, CH2), 2.82 (t, J = 6.8 Hz, 2H, CH2), 2.93 (t, J = 6.1 Hz, 2H, CH2), 3.68 (t, J = 6.1 Hz, 2H, CH2), 6.72 (d, J = 9.3 Hz, 2H, HAr), 6.90 (d, J = 9.3 Hz, 2H, HAr), 7.32 (d, J = 7.9 Hz, 1H, HAr), 8.03 (dd, J = 7.9, 1.7 Hz, 1H, HAr), 8.50 (d, J = 1.8 Hz, 1H, HAr).Mass (−veエレクトロスプレー) C26H23N3O12S4 697.02,測定値692 (M−H),347[M/2].
N2下、DMF(40ml)中7−デアザ−7−ヨード−グアノシン(2g,2.75ミリモル)、Pd(PPh3)4(582mg,0.55ミリモル)、CuI(210mg,1.1ミリモル)、Et3N(1.52ml,11ミリモル)及びプロパギルアミン(2.5g,16.5ミリモル)の懸濁液をN2下室温で攪拌した。アルミ箔で遮光した。TLCが出発原料の完全な消費を示した後、反応混合物を濃縮した。残渣をMeOH(20ml)で希釈し、そしてdowex−HCO3 −で処理した。混合物を30分間攪拌し、そして濾過した。溶液を濃縮し、そしてシリカゲルクロマトグラフィーで精製し(石油エーテル:EtOAc 50:50から石油エーテル:EtOAc:MeOH 40:40:20)、黄色粉末として(19)が得られた(2.1g,92%)。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.07-2.11 (m, 1H, H-2'), 2.31-2.33 (m, 1H, H-2'), 3.49-3.53 (m, 2H, H-5'), 3.77 (br s, 1H, H-4'), 4.25 (d, J = 4.3 Hz, 2H, ≡CCH2), 4.30 (br s, 1H, H-3'), 4.95 (t, J = 5.2 Hz, 1H, 5’-OH), 5.25 (d, J = 3.4 Hz, 1H, 3’-OH), 6.27-6.31 (m, 1H, H-1'), 6.37 (s, 2H, NH2), 7.31 (s, 1H, H-8), 10.10 (br s, 1H, NHCOCF3), 10.55 (s, 1H, NH).Mass(−veエレクトロスプレー)C16H16F3N5O5に関して計算値415,測定値414.
ピリジン(50ml)中(19)(2.4g,5.8ミリモル)の溶液に0℃で塩化t−ブチルジフェニルシリル(TBDPSCl)(1.65ml,6.3ミリモル)を滴下した。次いで反応混合物を室温まで加温した。4時間後、別のTBDPSCl(260μL,1ミリモル)を加えた。出発原料が完全に消費されるまでTLCにより反応をモニターした。MeOH(〜5ml)で反応をクエンチし、そして蒸発乾固した。残渣をDCMに溶解し、そしてNaHCO3飽和水溶液を加えた。水層をDCMで3回抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥(MgSO4)し、そして真空下濃縮した。シリカゲルのクロマトグラフィーによる精製(EtOAcからEtOAc:MeOH 85:15)で黄色泡状物(20)が得られた(3.1g,82%)。1H NMR (d6 DMSO) δ 1.07 (s, 9H, CH3), 2.19-2.23 (m, 1H, H-2'), 2.38-2.43 (m, 1H, H-2'), 3.73-3.93 (m, 2H, H-5'), 4.29 (d, J = 5.0 Hz, 2H, CH2N), 4.42-4.43 (m, 1H, H-3'), 5.41 (br s, 1H, OH), 6.37 (t, J = 6.5 Hz, H-1'), 6.45 (br s, 2H, NH2), 7.24-7.71 (m, 11H, H-8, HAr), 10.12 (t, J = 3.6 Hz, 1H, NH), 10.62 (s, 1H, H-3).Mass(+veエレクトロスプレー)C32H34F3N5O5Siに関して計算値653,測定値654.
DMSO(15ml)中(20)の溶液(1.97g,3.0ミリモル)をAc2O(8.5ml,90ミリモル)及びAcOH(2.4ml,42ミリモル)と処理し、そして室温で15時間、次いで40℃で2時間攪拌した。反応混合物をEtOAc(200ml)で希釈し、そして飽和NaHCO3 水溶液(200ml)と共に1時間攪拌した。水層をEtOAcで2回洗浄した。有機層を合わせ、乾燥(MgSO4)し、そして真空下濃縮した。シリカのクロマトグラフィーによる精製(EtOAc:ヘキサン 1:1からEtOAc:ヘキサン:MeOH 10:10:1)により黄色泡状物として(21)が得られた(1.3g,60%)。1H NMR (CDCl3) δ 1.04 (s, 9H, CH3), 2.08 (s, 3H, SCH3), 2.19-2.35 (m, 2H, H-2), 3.67-3.71 (m, 2H, H-5'), 3.97-3.99 (m, 2H, H-4', H-3'), 4.23 (br s, 2H, CH2N), 4.58 (s, 2H, CH2S), 6.31 (dd, J = 5.7, 7.9 Hz, H-1'), 7.19-7.62 (m, 11H, H8, HAr).Mass(+ve エレクトロスプレー)C34H38F3N5O5SSiに関して計算値713,測定値:714.
CH2Cl2(10ml)中(21)(1.3mg,1.8ミリモル)、シクロヘキセン(0.91ml,9ミリモル)の溶液に4℃でN2下、塩化スルフリル(CH2Cl2中1M)(1.1ml,1.1ミリモル)を滴下した。30分後、TLCによりヌクレオシド(22)の完全な消費が示された。蒸発させて溶媒を除去した後、次に残渣を高真空に20分間供し、そして次にNaN3(585ミリモル,9ミリモル)及びDMF(10ml)で処理した。得られた懸濁液を室温で2時間攪拌した。CH2Cl2/NaCl(10%)で抽出し、黄色ガム状物質を得て、これを室温で20分間、THF(1M,3ml)中TBAF及びTHF(3ml)で処理した。蒸発させて溶媒を除去し、EtOAc/飽和NaHCO3で抽出し、続いてシリカのクロマトグラフィーにより精製し(EtOAcからEtOAc:MeOH 9:1)、黄色泡状物が得られた(420mg,50%)。1H NMR (d6 DMSO) : δ 2.36-2.42 (m, 1H, H-2'), 2.49-2.55 (m, 1H, H-2'), 3.57-3.59 (m, 2H, H-5'), 3.97-4.00 (m, 1H, H-4'), 4.29 (m, 2H, CH2N), 4.46-4.48 (m, 1H, H-3'), 4.92-4.96 (m, 2H, CH2N3), 5.14 (t, J = 5.4 Hz, 1H, 5’-OH), 5.96-6.00 (dd, J = 5.7, 8.7 Hz, 1H, H-1'), 6.46 (br s, 2H, NH2), 7.39 (s, 1H, H-6), 10.14 (s, 1H, NH), 10.63 (s, 1H, H-3).
四ナトリウム二リン酸十水和物(1.5g,3.4ミリモル)を水(34ml)に溶解し、そしてその溶液をH+形態のdowex 50カラムに適用した。カラムを水で洗浄した。溶出液を冷却し(氷浴)そして攪拌した、EtOH(14ml)中トリ−n−ブチルアミン(1.6ml,6.8ミリモル)溶液に直接滴下した。溶出液のpHが6まで上昇するまでカラムを洗浄した。エタノール水溶液を蒸発乾固し、そして次にエタノールで2回、そして無水DMFで2回同時蒸発させた。残渣をDMF(6.7ml)に溶解した。淡黄色溶液を4Åモレキュラーシーブ上に保存した。ヌクレオシド(22)及びプロトンスポンジを真空下で一晩P2O5上で乾燥した。リン酸トリメチル(0.4ml)中(22)(104mg,0.22ミリモル)及びプロトンスポンジ(71mg,0.33ミリモル)の溶液を4Åモレキュラーシーブで1時間攪拌した。新たに蒸留したPOCl3(25μl,0.26ミリモル)を加え、そして溶液を4℃で2時間攪拌した。混合物をゆっくりと室温まで加温し、そしてビス(トリ−n−ブチルアンモニウム)ピロリン酸(1.76ml,0.88ミリモル)及び無水トリ−n−ブチルアミン(0.42ml,1.76ミリモル)を加えた。5分後、0.1M TEAB(重炭酸トリエチルアンモニウム)バッファー(15ml)で反応をクエンチし、そして3時間攪拌した。減圧下、水を除去し、そして得られた残渣を濃アンモニア(ρ0.88,10ml)に溶解し、そして室温で16時間攪拌した。次いで反応混合物を蒸発乾固した。残渣を水に溶解し、そして溶液をDEAE−セファデックス A−25 カラムに適用した。0.05M及び1M TEAB 各2Lの直線グラジエントを用いてMPLCを行った。0.7Mと0.8M バッファーの間で三リン酸塩を溶出した。生成物を含有する画分を合わせ、そして蒸発乾固した。残渣を水に溶解し、そしてHPLCにより更に精製した。tr(23)= 20.5分(Zorbax C18調製用カラム,グラジエント:30分で5%〜35%B,バッファーA 0.1M TEAB,バッファーB MeCN)。白色泡状物として生成物を単離した(225 O.D.,29.6 マイクロモル,13.4%,ε260=7,600)。1H NMR (D2O) δ 2.43-2.5 (m, 2H, H-2'), 3.85 (m, 2H, CH2N), 3.97-4.07 (m, 2H, H-5'), 4.25 (br s, 1H, H-4'), 4.57 (br s, 1H, H-3'), 4.74-4.78 (m, 2H, CH2N3), 6.26-6.29 (m, 1H, H-1'), 7.41 (s, 1H, H-8).31P-NMR (D2O) δ -8.6 (m, 1P, Pγ), -10.1 (d, J = 19.4 Hz, 1P, Pα), -21.8 (t, J = 19.4 Hz, 1P, Pβ).Mass(−ve エレクトロスプレー)C15H21N8O13P3 に関して計算値614,測定値613.
乾燥DMF(20ml)中7−デアザ−7−ヨード−2’−デオキシアデノシン(1g,2.65ミリモル)及びCuI(100mg,0.53ミリモル)の懸濁液にトリエチルアミン(740μl,5.3ミリモル)を加えた。5分間攪拌した後、トリフルオロ−N−プロパ−2−イニル−アセトアミド(1.2g,7.95ミリモル)及びPd(PPh3)4(308mg,0.26ミリモル)を混合物に加え、そして反応物を室温で暗中、16時間攪拌した。MeOH(40ml)及び重炭酸dowexを反応混合物に加え、そして45分間攪拌した。混合物を濾過した。濾液をMeOHで洗浄し、そして溶媒を真空下除去した。粗製混合物をシリカのクロマトグラフィーにより精製し(EtOAcからEtOAc:MeOH 95:20)、わずかに黄色の粉末が得られた(25)(1.0g,95%)。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.11-2.19 (m, 1H, H-2'), 2.40-2.46 (m, 1H, H-2'), 3.44-3.58 (m, 2H, H-5'), 3.80 (m, 1H, H-4'), 4.29 (m, 3H, H-3', CH2N), 5.07 (t, J = 5.5 Hz, 1H, OH), 5.26 (d, J = 4.0 Hz, 1H, OH), 6.45 (dd, J = 6.1, 8.1 Hz, 1H, H-1'), 7.74 (s, 1H, H-8), 8.09 (s, 1H, H-2), 10.09 (t, J = 5.3 Hz, 1H, NH).
ヌクレオシド(25)(1.13g,2.82ミリモル)を乾燥ピリミジン(2×10ml)中で2回同時蒸発させ、そして乾燥ピリジン(18ml)に溶解した。この溶液に塩化t−ブチルジフェニルシリル(748μl,2.87ミリモル)を0℃で少しずつ加えた。反応混合物を室温まで加温し、そして一晩攪拌した。飽和NaCl水溶液で反応をクエンチした。EtOAc(25ml)を反応混合物に加え、そして水層をEtOAcで3回抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥(MgSO4)した後、真空下、溶媒を除去した。シリカのクロマトグラフィーによる精製(DCM、次いでEtOAcからEtOAc:MeOH 85:15)によりわずかに黄色の粉末として(26)が得られた(1.76g,97%)。1H NMR (d6 DMSO) δ 1.03 (s, 9H, tBu), 2.25-2.32 (m, 1H, H-2'), 2.06-2.47 (m, 1H, H-2'), 3.71-3.90 (m, 2H, H-5'), 3.90-3.96 (m, 1H, H-4'), 4.32 (m, 2H, CH2N), 4.46 (m, 1H, H-3'), 5.42 (br s, 1H, OH), 6.53 (t, J = 6.7 Hz, 1H, H-1'), 7.38-7.64 (m, 11H, H-8 and HAr), 8.16 (s, 1H, H-2), 10.12 (t, J = 5.3 Hz, 1H, NH).
ヌクレオシド(26)の溶液(831mg,1.30ミリモル)をMeOH:N,N−ジメチルアセタール(30ml:3ml)に溶解し、そして40℃で攪拌した。反応をTLCによりモニターし、1時間後に反応は完了した。真空下溶媒を除去した。シリカのクロマトグラフィーによる精製により.(EtOAc:MeOH 95:5)わずかに褐色の粉末として(27)が得られた(777mg,86%)。1H NMR (d6 DMSO) δ 0.99 (s, 9H, tBu), 2.22-2.29 (m, 1H, H-2'), 2.50-2.59 (m, 1H, H-2'), 3.13 (s.3H, CH3), 3.18 (s.3H, CH3), 3.68-3.87 (m, 2H, H-5'), 3.88-3.92 (m, 1H, H-4'), 4.25 (m, 2H, CH2N), 4.43 (m, 1H, H-3'), 6.56 (t, J = 6.6 Hz, 1H, H-1'), 7.36-7.65 (m, 10H, HAr), 7.71 (s, 1H, H-8), 8.33 (s, 1H, CH), 8.8 (s, 1H, H-2), 10.12 (t, J = 5.3 Hz, 1H, NH).
乾燥DMSO(8ml)中(27)の溶液(623mg,0.89ミリモル)に酢酸(775μl,13.35ミリモル)及び無水酢酸(2.54ml,26.7ミリモル)を加えた。混合物を室温で一晩攪拌した。次いで反応物をEtOAc及び飽和NaHCO3(1:1)溶液に注ぎ、そして激しく攪拌した。有機層を飽和NaHCO3水溶液で1回以上洗浄し、そしてMgSO4上で乾燥した。減圧下、溶媒を除去した後、シリカのクロマトグラフィーにより生成物(28)を精製し(EtOAc:石油エーテル 1:2、次いでEtOAc)(28)を生じた(350mg,52%)。1H NMR (d6 DMSO) : δ , 1.0 (s, 9H, tBu), 2.09 (s, 3H, SCH3), 2.41-2.48 (m, 1H, H-2'), 2.64-2.72 (m, 1H, H-2'), 3.12 (s, 3H, CH3), 3.17 (s, 3H, CH3), 3.66-3.89 (m, 2H, H-5'), 4.04 (m, 1H, H-4'), 4.26 (m, J = 5.6 Hz, 2H, CH2), 4.67 (m, 1H, H-3'), 4.74 (br s, 2H, CH2), 6.49 (t, J = 6.1, 8.1 Hz, 1H, H-1'), 7.37-7.48 (m, 5H, HAr), 7.58-7.67 (m, 5H, HAr), 7.76 (s, 1H, H-8), 8.30 (s, 1H, CH), 8.79 (s, 1H, H-2), 10.05 (t, J = 5.6 Hz, 1H, NH).
乾燥CH2Cl2(5ml)中(28)(200mg,0.26ミリモル)及びシクロヘキセン(0.135ml,1.3ミリモル)の溶液にN2下、0℃で塩化スルフリル(32μl,0.39ミリモル)を加えた。10分後、TLCによりヌクレオシド(28)の完全な消費が示された。溶媒を蒸発させ、そして残渣を20分間高真空に供した。次いでこれを乾燥DMF(3ml)に溶解し、0℃まで冷却し、そしてNaN3(86mg,1.3ミリモル)で処理した。得られた懸濁液を室温で3時間攪拌した。反応物をEtOAc及び水で分配した。水層をEtOAcで抽出した。合わせた有機層の抽出物を合わせ、そして乾燥(MgSO4)した。減圧下、溶媒を除去した後、混合物をシリカのクロマトグラフィーにより精製し(EtOAc)、油状物(29)が得られた(155mg,80%)。1H NMR (d6 DMSO) : δ 0.99 (s, 9H, tBu), 2.45-2.50 (m, 1H, H-2'), 2.69-2.78 (m, 1H, H-2'), 3.12 (s, 3H, CH3), 3.17 (s, 3H, CH3), 3.67-3.88 (m, 2H, H-5'), 4.06 (m, 1H, H-4'), 4.25 (m, 2H, CH2), 4.61 (m, 1H, H-3'), 4.84-4.97 (m, 2H, CH2), 6.58 (t, J = 6.6 Hz, 1H, H-1'), 7.35-7.47 (m, 5H, HAr), 7.58-7.65 (m, 5H, HAr), 7.77 (s, 1H, H-8), 8.30 (s, 1H, CH), 8.79 (s, 1H, H-2), 10.05 (br s, 1H, NH).
テトラヒドロフラン(THF)(3ml)中(29)の溶液(155mg,0.207ミリモル)を0℃でTBAF(THF中1M,228μl)で処理した。次いで氷浴をはずし、そして反応混合物を室温で攪拌した。2時間後、TLCによりヌクレオシドの完全な消費が示された。溶媒を除去した。シリカのクロマトグラフィーによる精製により(EtOAc:MeOH 95:5)、淡褐色油状物として(30)(86mg,82%)が得られた。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.40-2.48 (dd, J = 8.1 , 13.6 Hz, 1H, H-2'), 2.59-2.68 (dd, J = 8.3, 14 Hz, 1H, H-2'), 3.12 (s, 3H, CH3), 3.17 (s, 3H, CH3), 3.52-3.62 (m, 2H, H-5'), 4.02 (m, 1H, H-4'), 4.28 (d, J = 5.6 Hz, 2H, CH2NH), 4.47 (m, 1H, H-3'), 4.89 (s, 2H, CH2N3), 5.19 (t, J = 5.6 Hz, 1H, OH), 6.49 (dd, J = 8.1, 8.7 Hz, 1H, H-1'), 7.88 (s, 1H, H-8), 8.34 (s, 1H, CH), 8.80 (s, 1H, H-2), 10.08 (s, 1H, NH).
ヌクレオシド(30)及びプロトンスポンジを真空下で一晩、P2O5上で乾燥した。リン酸トリメチル(980μl)中(30)(150mg,0.294ミリモル)及びプロトンスポンジ(126mg,0.588ミリモル)の溶液を4Åモレキュラーシーブで1時間攪拌した。新たに蒸留したPOCl3(36μl,0.388ミリモル)を加え、そして溶液を4℃で2時間攪拌した。混合物をゆっくりと室温まで加温し、そしてDMF中0.5Mビス(トリ−n−ブチルアンモニウム)ピロリン酸溶液(2.35ml,1.17ミリモル)及び無水トリ−n−ブチルアミン(560μl,2.35ミリモル)を加えた。5分後、0.1M TEAB(重炭酸トリエチルアンモニウム)バッファー(15ml)で反応をクエンチし、そして3時間攪拌した。減圧下、水を除去し、そして得られた残渣を濃アンモニア(ρ0.88,15ml)に溶解し、室温で16時間攪拌した。次いで反応混合物を蒸発乾固した。残渣を水に溶解し、そして溶液をDEAE−セファデックス A−25カラムに適用した。0.05M から1M TEABの直線グラジエントでMPLCを行った。生成物を含有する画分を合わせ、そして蒸発乾固した。残渣を水に溶解し、そしてHPLCで更に精製した。HPLC:tr(31):19.94分(Zorbax C18調製用カラム,グラジエント:20分で5%〜35%B,バッファーA 0.1M TEAB,バッファーB MeCN)。生成物(31)を白色泡状物として単離した(17.5 マイクロモル,5.9%,ε280=15000)。1H NMR (D2O) δ 2.67-2.84 (2m, 2H, H-2'), 4.14 (m, 2H, CH2NH), 4.17-4.36 (m, 2H, H-5'), 4.52 (br s, H-4'), 6.73 (t, J = 6.6 Hz, H-1'), 8.06 (s, 1H, H-8), 8.19 (s, 1H, H-2). 31P NMR (D2O) δ -5.07 (d, J = 21.8 Hz, 1P, Pγ), -10.19 (d, J = 19.8 Hz, 1P, Pα), -21.32 (t, J = 19.8 Hz, 1P, Pβ).Mass(−ve エレクトロスプレー)C15H21N8O12P3 に関して計算値598.05,測定値596.
50mM Tris−HCl(pH8.8)、0.01% Tween−20及び4mM MgSO4中100nM DNAプライマー/鋳型(予めP32及びT4ポリヌクレオチドキナーゼで標識したプライマー)に、2μM 化合物6及び100nM ポリメラーゼ(Thermococcus種 9°N exo −Y409V A485L、New England Biolabsより入手)を加えた。遮断の影響を示すため、鋳型は10個のアデニン塩基の並びから成る。反応液を65℃で10分間加熱する。完全な遮断を示すために、4つの元来の遮断されていないヌクレオシド三リン酸で追跡を行う。単一のアジドメチル遮断されたdTTPの定量的な取り込みを観察することができ、そしてアジドメチル基が更なる取り込みに対する有効な遮断として作用することを示すことができる。
保存バッファーを除去し、そしてビーズをTEバッファー(10mM Tris−HCl(pH8)及び1mM EDTA)で3回洗浄する。B&Wバッファー(10mM Tris−HCl(pH7.5)、1mM EDTA及び2.0M NaCl)に再懸濁し、そして適当な突出鋳型配列を有するビオチン化32P標識ヘアピンDNAを加える。室温で15分間放置する。バッファーを除去し、そしてビーズをバッファーで3回洗浄する。
50mM Tris−HCl(pH8.8)、0.01% Tween−20、4mM MgSO4、0.4mM MnCl2、(サイクル1(0.2mM)を除く)の溶液に2μM FFN及び100nM ポリメラーゼを加える。次いでこの溶液をビーズに加え、そして十分に混合し、そして65℃で10〜15分間インキュベートする。反応混合物を除去し、そしてビーズをTEバッファーで3回洗浄する。
トリス−(2−カルボキシエチル)ホスフィン三ナトリウム塩(TCEP)(0.1M)をビーズに加え、そして十分に混合する。次いで混合物を65℃で15分間インキュベートした。脱遮断溶液を除去し、そしてビーズをTEバッファーで3回洗浄する。
0.1mM リン酸塩(pH6.5)中ヨードアセトアミド(431mM)をビーズに加え、そして十分に混合し、次いでこれを室温で5分間放置する。キャッピング溶液を除去し、そしてビーズをTEバッファーで3回洗浄する。
乾燥N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)70ml中5−ヨード−2’−デオキシウリジン(5.0g,14ミリモル)の溶液にイミダゾール(1.09g,16ミリモル)、続いてTBDMSCl(2.41g,16ミリモル)を0℃で加えた。混合物を氷浴中に置き、そして一晩攪拌した。反応物を飽和NaCl水溶液でクエンチし、そしてEtOAcで抽出した。乾燥(MgSO4)後、溶媒を除去し、そして粗製混合物をシリカのクロマトグラフィーにより精製した(EtOAc:石油エーテル 3:7)。無色固体として生成物(33)(5.9g,90%)が得られた。1H NMR (d6 DMSO) δ 0.00 (s, 3H, CH3), 0.79 (s, 9H, tBu), 1.88-1.97 (m, 1H, H-2'), 2.00-2.05 (m, 1H, H-2'), 3.59-3.71 (m, 2H, H-5'), 3.75 (br s, 1H, H-4'), 4.06 (br s, 1H, H-3'), 5.18 (d, J = 4.0 Hz, 1H, OH), 5.98 (t, J = 5.9 Hz, 1H, H-1'), 7.89 (s, 1H, H-6), 11.62 (s, 1H, NH).Mass(−ve エレクトロスプレー)C15H25IN2O5Siに関して計算値468.06 測定値467.
乾燥THF(20ml)中NaHの懸濁液(497mg,12.4ミリモル,鉱物油中60%)に乾燥THF(50ml)中5’−TBDMS保護した5−ヨード−2’−デオキシウリジン(2.8g,5.9ミリモル)の溶液を滴下した。気体発生が停止した後、混合物を更に10分間攪拌し、そして次に臭化アリル(561μl,6.5ミリモル)を滴下した。添加が完了した後、乳白色の反応混合物を室温で16時間攪拌した。飽和NaCl水溶液(30ml)の添加により反応をクエンチし、EtOAcを用いて水層を3回抽出し、そして飽和NaCl水溶液で洗浄した後、有機層を乾燥(MgSO4)した。溶媒を除去した後、粗製生成物をクロマトグラフィーにより精製した(EtOAc:石油エーテル 1:1)。無色泡状物としてアリル化生成物(2.39g,80%)が得られた。1H NMR (d6 DMSO) δ -0.01 (s, 3H, CH3), 0.78 (s, 9H, tBu), 1.94-2.01 (m, 1H, H-2'), 2.16-2.21 (m, 1H, H-2'), 3.61-3.71 (m, 2H, H-5'), 3.87-3.94 (m, 4H, H-3', H-4', OCH2), 5.04 (dd, J = 1.6, 10.4 Hz, 1H, = CH2), 5.15 (dd, J = 1.8, 17.3 Hz, 1H, = CH2), 5.72-5.81 (m, 1H, CH = ), 5.92 (t, J = 5.7 Hz, 1H, H-1'), 7.88 (s, 1H, 6-H), 11.6 (s, 1H, NH).Mass(−veエレクトロスプレー)C18H29IN2O5Siに関して計算値508.09,測定値507.
乾燥THF中(34)の溶液(2.34g,4.71ミリモル)にTBAF(5.2ml,5.2ミリモル,THF中 1M 溶液)を0℃で加えた。反応混合物を室温まで加温し、そして次に16時間攪拌した。飽和NaCl溶液(20ml)の添加により反応をクエンチし、そしてEtOAcで3回抽出した。有機層を合わせてMgSO4で乾燥した。粗製混合物をシリカのクロマトグラフィーにより精製した(EtOAc:石油 7:3)。生成物(35)(1.4g,75%)を無色固体として単離した。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.02-2.39 (m, 2H, H-2'), 3.42-3.52 (m, 2H, H-5'), 3.84-3.88 (m, 3H, H-4', CH2], 3.97-4.00 (m, 1H, H-3'), 5.02-5.09 (m, 2H, OH, = CH2), (dd, J = 1.9, 17.3 Hz, 1H, = CH2), 5.73-5.82 (m, 1H, CH = ), 5.94 (t, J = 6.8 Hz, 1H, H-1'), 8.24 (s, 1H, H-6), 11.56 (s, 1H, NH).Mass(−veエレクトロスプレー)C12H16IN2O5に関して計算値394.0 測定値393.
乾燥DMF(10ml)中(35)(400mg,1.0ミリモル)の溶液にCuI(38mg,20マイクロモル)及びトリエチルアミン(300μl,2.0ミリモル)を加えた。プロパルギルトリフルオロアセトアミド(453mg,3.0ミリモル)を滴下し、続いてPd(PPh3)4(110mg,9.5マイクロモル)を加えた。反応物を暗中で16時間攪拌した。MeOH(10ml)、DCM(10ml)及び重炭酸dowexを添加して反応をクエンチした。混合物を30分間攪拌し、そして次に濾過した。真空下溶媒を除去し、そしてシリカのクロマトグラフィーにより粗製生成物を精製した(EtOAc:石油 3:7〜7:3)。生成物をわずかに黄色の結晶として単離した(398mg,95%)。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.25-2.43 (m, 2H, H-2'), 3.65-3.76 (m, 2H, H-5'), 4.07-4.17 (m, 3H, H-4', CH2), 4.21-4.23 (m, 1H, H-3'), 4.34 (d, J = 5.5 Hz, 2H, CH2N), 5.25-5.27 (m, 2H, = CH2, OH), 5.38 (dd, J = 1.83, 17.3 Hz, 1H, = CH2), 5.96-6.06 (m, 1H, = CH), 6.17 (t, J = 6.9 Hz, 1H, H-1'), 8.29 (s, 1H, H-6), 10.17 (t, J = 5.5 Hz, 1H, NHTFA), 11.78 (s, 1H, NH).Mass(−ve エレクトロスプレー)C17H18F3N3O6 に関して計算値417.11,測定値416.
窒素下で、双方共に真空下P2O5上で24時間乾燥した(36)(100mg,0.24ミリモル)及びプロトンスポンジ(61.5mg,0.28ミリモル)をOP(OMe)3(225μl)に溶解した。0℃で新たに蒸留したPOCl3を滴下し、そして混合物を1.5時間攪拌した。次いでピロリン酸塩(1.44ml,0.72マイクロモル,DMF中0.5M)及びnBu3N(0.36ml,1.5ミリモル)を加え、そして得られた混合物を更に1.5時間攪拌した。重炭酸トリエチルアンモニウム溶液(4.5ml,0.1M溶液,TEAB)を加え、そして反応混合物を2時間攪拌した。次いでNH3水溶液(4.5ml)を加え、そして混合物を16時間攪拌した。溶媒を除去して乾燥した後、残渣を水に再溶解し、濾過し、そしてMPLCで精製し、続いてHPLC精製した。無色泡状物として望ましい三リン酸塩(37)(10.2マイクロモル,4%,ε280=10000)を単離した。MPLC条件:DEAE セファデックスカラムで0.05M TEABから0.7M TEAB、各々2lを用いてグラジエントを実行した。生成物を含有する画分は〜0.4M TEABで溶出される。溶媒を除去した後、生成物をHPLC精製した。HPLC条件:tr(三リン酸):21.9分(Zorbax C−18調製用カラム、バッファーA 0.1M TEAB、バッファーB 0.1M TEAB+30%アセトニトリル、グラジエント 35分で5−35%バッファーB)。1H NMR (D2O) δ 2.17-2.23 (m, 1H, H-2'), 2.40-2.45 (m, 1H, H-2'), 3.67 (s, 2H, CH2N), 3.99 (d, J = 5.9 Hz, 2H, OCH2), 4.02-4.17 (m, 2H, H-5'), 4.25 (br s, 1H, H-4'), 4.32-4.33 (m, 1H, H-3'), 5.13 (d, J = 10.3 Hz, 1H, = CH2), 5.23 (d, J = 17.2 Hz, 1H, = CH2), 5.78-5.88 (m.1H, = CH), 6.16 (t, J = 6.7 Hz, 1H, H-1'), 8.33 (s, 1H, H-6).31P NMR (161.9MHz, D2O) δ -21.3 (t, J = 19.5 Hz, 1P, Pγ), -10.3 (d, J = 19 Hz, 1P, Pα), -7.1 (d, J = 15.5 Hz, 1P, Pβ).Mass(−ve エレクトロスプレー)C15H22N3O14P3 に関して計算値561.03,測定値560,480[M−リン酸],401[M−2xリン酸].
50mM Tris−HCl(pH8.8)、0.01% Tween−20及び4mM MgSO4中100nM DNA プライマー/鋳型(予めP32及びT4ポリヌクレオチドキナーゼで標識したプライマー)に2μM 化合物38及び100nM ポリメラーゼ(Thermococcus種 9°N exo −Y409V A485L、New England Biolabsより入手)を加えた。遮断の影響を示すため、鋳型は10個のアデノシン塩基の並びから成る。反応物を65℃で10分間加熱する。完全な遮断を示すために、4つの元来の遮断されていないヌクレオシド三リン酸で追跡を行う。アリル遮断の定量的な取り込みを観察することができ(図7)、そしてこれが更なる取り込みに対する有効な遮断として作用することを示すことができる。
DMF(130ml)中5−ヨード−2’−デオキシシチジン(2.2g,6.23ミリモル)の溶液にイミダゾール(467mg,6.85ミリモル)を加えた。混合物を0℃で冷却し、そして、塩化t−ブチルジメチルシリル(TBDMSCl)(1.33g,6.85ミリモル)を5分間かけて加えた。室温で18時間の後、減圧下揮発性物質を蒸発させ、そして残渣をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーによりEtOAc:MeOH(95:5〜90:10)で精製して、予測される生成物(39)(2.10g,72%)が未反応出発原料(490mg)と共に得られた。1H NMR (d6 DMSO) δ 0.11 (s, 3H, CH3), 0.12 (s, 3H, CH3), 0.89 (s, 9H, 3CH3), 1.90 (ddd, J = 13.2, 7.7 and 5.7 Hz, 1H, HH-2'), 2.18 (ddd, J = 13.2, 5.7 and 2.3 Hz, 1H, HH-2'), 3.72 (dd, J = 11.5, 3.6 Hz, 1H, HH-5'), 3.80 (dd, J = 11.5, 2.8 Hz, 1H, HH-5'), 3.86-3.89 (m, 1H, H-4'), 4.14-4.18 (m, 1H, H-3'), 5.22 (1H, d, J = 4.1 Hz, OH), 6.09 (1H, dd, J = 7.8, 5.8 Hz, H-1'), 6.60 (br s, 1H, NHH), 7.81 (br s, 1H, NHH), 7.94 (s, 1H, H-6); MS (ES) :m/z (%) (M + H) 468 (90%).
N2雰囲気下、THF(26ml)中NaHの溶液(60%,113mg,2.84ミリモル)にTHF(6ml)中出発ヌクレオシド(39)(669mg,1.43ミリモル)の溶液をゆっくりと加えた。混合物を室温で45分間攪拌し、0℃で冷却し、そして臭化アリル(134μL,1.58ミリモル)をゆっくりと加えた。室温で15分後、溶液を0℃まで冷却し、H2O(5ml)の添加により反応をクエンチした。減圧下、THFを蒸発させ、そして生成物をEtOAc(3×25ml)に抽出した。有機抽出物を合わせ、乾燥(MgSO4)し、濾過し、そして減圧下揮発性物質を蒸発させて、残渣が得られ、これをシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して無色油状の予測される3’−O−アリル生成物(40)(323mg,44%)がいくつかの未反応出発原料(170mg)と共に得られた;1H NMR (d6 DMSO) δ 0.00 (s, 3H, CH3), 0.01 (s, 3H, CH3), 0.79 (s, 9H, 3CH3), 1.84 (ddd, J = 13.3, 8.2 and 5.5 Hz, 1H, H-2'), 2.20-2.25 (m, 1H, H-2'), 3.62-3.72 (m, 2H, H-5'), 3.88-3.93 (m, 4H, H-3', 4', HHC-CH = ), 5.1 (dd, J = 8.5, 1.7 Hz, 1H, CH = CHH), 5.16 (dd, J = 17.2, 1.7 Hz, 1H, CH = CHH), 5.75-5.83 (m, 1H, CH = CHH), 5.94 (dd, J = 8.4, 5.6 Hz, 1H, H-1'), 6.53 (br s, 1H, NHH), 7.74 (br s, 1H, NHH), 7.83 (s, 1H, H-6); MS (ES) :m/z (%) (M-H) 506 (100%).
N2保護雰囲気下、THF(15ml)中出発ヌクレオシド(40)(323mg,0.64ミリモル)の溶液に室温でTHF中1M フッ化テトラブチルアンモニウム(TBAF)(0.7ml,0.7ミリモル)を加えた。混合物を1時間攪拌し、そして次にH2O(5ml)の添加により反応をクエンチした。THFを蒸発させ、そして水性残渣をEtOAc(3×25ml)に抽出した。有機層を合わせて乾燥(MgSO4)し、濾過し、そして減圧下揮発性物質を蒸発させて粗製物質が得られ、これをプレパック式シリカカラムのフラッシュクロマトグラフィーにより、EtOAcで溶出して精製した。生成物(41)が白色固体として得られた(233mg,93%)。1H NMR (d6 DMSO) δ 1.96-2.05 (m, 1H, H-2') 2.24 (ddd, J = 13.5, 5.8 and 2.8 Hz, 1H, H-2'), 3.50-3.62 (m, 2H, H5'), 3.91-3.97 (m, 2H, H3', H4'), 4.03-4.07 (m, 2H, HHC-CH = ), 5.11-5.16 (m, 2H, OH, CH = CHH), 5.24 (dd, J = 17.2, 1.6 Hz, 1H, CH = CHH), 5.82-5.91 (m, 1H, CH = CHH), 6.02 (dd, J = 7.6, 6.0 Hz, 1H, H-1'), 6.60 (s, 1H, NHH), 7.79 (s, 1H, NHH), 8.21 (s, 1H, H-6).MS (ES) :m/z (%) (M-H) 392 (100%).
乾燥DMF(8.5ml)中出発ヌクレオシド(41)(200mg,0.51ミリモル)の溶液に室温及びアルゴン雰囲気下でCuI(19mg,0.10ミリモル)、NEt3(148μl,1.02ミリモル),2,2,2−トリフルオロ−N−プロパ−2−イニル−アセトアミド(230mg,1.53ミリモル)及びPd(PPh3)4(58mg,0.05ミリモル)をゆっくりと加えた。混合物を室温で攪拌し、そして4時間遮光し、重炭酸dowexを添加して反応をクエンチし、そして1時間攪拌し、次いで濾過し、そして減圧下揮発性物質を蒸発させた。残渣をを更にMeOH(15ml)から蒸発させ、そして次にシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製した(CH2Cl2、CH2Cl2:EtOAc 1:1、EtOAc:MeOH 97.5:2.5)。予測される生成物(42)がベージュ色の固体として得られた(180mg,85%)。1H NMR (d6 DMSO) δ 1.90 (ddd, J = 13.6, 7.7 and 6.0 Hz, 1H, H-2'), 2.16 (ddd, J = 13.6, 5.7 and 2.4 Hz, 1H, H-2'), 3.42-3.50 (m, 2H, H-5'), 3.84-3.87 (m, 3H, H-4', OHHC-CH = ), 3.94-3.96 (m, 1H, H-3'), 4.16 (d, J = 5.1 Hz, 2H, H2C-N), 4.98-5.05 (m, 2H, OH, CH = CHH), 5.14 (dd, J = 17.3, 1.7 Hz, 1H, CH = CHH), 5.72-5.82 (m, 1H, CH = CHH), 5.95 (dd, J = 7.7, 5.8 Hz, 1H, H-1'), 6.74 (br s, 1H, NHH), 7.72 (br s, 1H, NHH), 8.01 (1H, s, H-6), 9.82 (br t, 1H, HN-CH2).MS (ES) :m/z (%) (M-H) 415 (100%).
アルゴン雰囲気下で、PO(OMe)3(360μl)中ヌクレオシド(24)(170mg,0.41ミリモル)及びプロトンスポンジ(105mg,0.50ミリモル)(双方共に予めP2O5上で少なくとも24時間乾燥した)の溶液に0℃でPOCl3(新たに蒸留した)(50μl,0.54ミリモル)をゆっくりと加えた。溶液を0℃で3時間激しく攪拌し、そして次にDMF中0.5M テトラトリブチルアンモニウム 二リン酸(3.20ml,1.60ミリモル)、続いてnBu3N(0.75ml,3.2ミリモル)及び0.1M 重炭酸トリエチルアンモニウム(TEAB)(12ml)の添加によりクエンチした。混合物を室温で3時間攪拌し、そして次にアンモニア水溶液(ρ0.88 1.0ml)(12ml)を加えた。溶液を室温で15時間攪拌し、減圧下揮発性物質を蒸発させ、そして残渣をMPLCにより、0.05Mから0.7M TEABのグラジエントで精製した。予測される三リン酸塩(43)をおよそ0.51M TEABでカラムから溶出した。Zorbax SB−C18調製用カラム(内径21.2mm×25cm)のHPLCにより、以下のグラジエント:0〜5分 5%B,Φ.2ml;5〜25分 80%B,Φ.8ml;25〜27分 95%B,Φ.8ml;27〜30分 95%B,Φ.8ml;30〜32分 5%B,Φ.8ml;32〜35分 95%B,Φ.2mlを用いて0.1M TEAB(ポンプA)及び0.1M TEAB中30%CH3CN(ポンプB)で溶出して第2の精製を行い、tr(43):20.5(20マイクロモル,収率 5%)の前記で詳記した生成物(43)が得られた;31P NMR (D2O) δ -6.01 (d, J = 19.9 Hz, 1P, Pγ), -10.24 (d, J = 19.3 Hz, 1P, Pα), -21.00 (t, J = 19.6 Hz, 1P, Pβ); 1H NMR (D2O) δ 2.19-2.26 (m, 1H, H-2'), 2.51 (1H, ddd, J = 14.2, 6.1 and 3.2 Hz, H-2'), 3.96-4.07 (m, 4H, NCH2, OHHC-CH = ), 4.09-4.14 (m, 1H, H-5') 4.22-4.26 (m, 1H, H-5'), 4.30-4.37 (m, 2H, H-3', 4'), 5.20 (d, J = 10.4 Hz, 1H, CH = CHH), 5.30 (1H, dd, J = 17.3, 1.5 Hz, CH = CHH), 5.85-5.95 (m, 1H, CH = CHH), 6.18 (t, J = 6.5 Hz, 1H, H-1'), 8.40 (s, 1H, H-6); MS (ES) :m/z (%) (M-H) 559 (100%).
DMF(10ml)中(44)の溶液(0.55g,1.4ミリモル)をイミダゾール(190mg,2.8ミリモル)及びTBDMSCl(274mg,1.82ミリモル)と室温で15分間処理した。反応をMeOH(〜5ml)でクエンチした。混合物を蒸発乾固した。水(〜300ml)を残渣に加え、そして少なくとも1時間攪拌してイミダゾールを完全に溶解した。濾過により褐色の固体が得られ、これを乾燥し、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製し(DCMからDCM:MeOH 90:10)、淡黄色粉末として(45)が得られた(394mg,56%)。1H NMR (d6 DMSO) δ 0.00, 0.01 (2s, 6H, CH3), 0.82 (s, 9H, CH3), 1.99-2.05, 2.16-2.22 (2m, 2H, H-2'), 3.58-3.66 (m, 2H, H-5'), 3.72-3.74 (m, 1H, H-4'), 4.18-4.19 (m, 1H, H-3'), 5.16 (d, J = 3.0 Hz, 1H, OH), 6.20 (dd, J = 6.0, 8.0 Hz, 1H, H-1'), 6.25 (br s, 2H, NH2), 7.58 (s, 1H, H-8), 10.37 (s, 1H, HN).Mass(−ve エレクトロスプレー)C17H27IN4O4Siに関して計算値506,測定値505.
THF(25ml)中(45)の溶液(354mg,0.7ミリモル)をNaH(42mg,1.75ミリモル)と室温で1時間反応させた。臭化アリルを加え、懸濁液を室温で2日間攪拌した。〜60%出発原料(45)を生成物(46)に変換した。飽和NaCl水溶液で反応をクエンチし、そしてDCMで3回抽出した。有機層を合わせ、乾燥(MgSO4)し、そして真空下濃縮した。残渣をTHF(1ml)中TBAF及びTHF(1ml)と30分間処理した。THFを蒸発させて除去した。残渣をDCMに溶解し、そしてNaHCO3(飽和)水溶液を加えた。水層をDCMで3回抽出した。有機層を合わせ、MgSO4上で乾燥し、そして真空下濃縮した。シリカのクロマトグラフィーによる精製(EtOAcからEtOAc:MeOH 85:15)で黄色泡状の(46)が得られた(101mg,35%)。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.15-2.31 (m, 2H, H-2'), 3.41-3.45 (m, 2H, H-5'), 3.82-3.85 (m, 1H, H-4'), 3.93 (d, J = 2.6 Hz, 2H, OCH2), 4.04-4.06 (m, 1H, H-3'), 4.99 (t, J = 5.4 Hz, OH), 5.08-5.24 (m, 2H, = CH2), 5.79-5.89 (m, 1H, CH = ), 6.15 (dd, J = 5.9, 9.1 Hz, 1H, H-1'), 6.27 (br s, 2H, NH2), 7.07 (s, H-8), 10.39 (s, 1H, NH).Mass(−ve eエレクトロスプレー)C14H17IN4O4に関して計算値432,測定値431.
N2下、DMF(2ml)中(46)(104mg,0.24ミリモル)、Pd(PPh3)4(24mg,0.024ミリモル)、CuI(9.1mg,0.048ミリモル)、Et3N(66μl,0.48ミリモル)及びCH≡CCH2NHCOCF3(89μL,0.72ミリモル)の懸濁液を室温で15時間攪拌した。アルミ箔で反応物を遮光した。TLCが出発物質の完全な消費を示した後、反応混合物を濃縮した。残渣をMeOH(20ml)で希釈し、そしてdowex−HCO3 −で処理した。混合物を30分間攪拌し、そして濾過した。溶液を濃縮し、シリカゲルのクロマトグラフィー(石油エーテル:EtOAc 50:50から石油エーテル:EtOAc:MeOH 40:40:20)により精製し、黄色粉末として(47)が得られた(74mg,70%)。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.15-2.39 (m, 2H, H-2'), 3.42-3.44 (m, 2H, H-5'), 3.83-3.87 (m, 1H, H-4'), 3.93-3.95 (m, 2H, OCH2), 4.0-4.07 (m, 1H, H-3'), 4.15 (d, J = 5.3 Hz, 2H, ≡CCH2), 4.91 (t, J = 5.4 Hz, OH), 5.08-5.24 (m, 2H, = CH2), 5.80-5.89 (m, 1H, CH = ), 6.15 (dd, J = 5.6, 8.9 Hz, 1H, H-1'), 6.28 (br s, 2H, NH2), 7.24 (s, H-8), 9.98 (t, J = 5.3 Hz, 1H, NH), 10.44 (s, 1H, NH).Mass(−ve エレクトロスプレー)C19H20F3N5O5 に関して計算値455,測定値454.
TBDPSCl(0.87g,2.78ミリモル)を乾燥ピリジン(19ml)中7−デアザ−7−ヨード−2’−デオキシアデノシン(1.05g,2.78ミリモル)の攪拌溶液にN2下5℃で加えた。10分後、溶液を室温まで上昇させ、そして18時間攪拌した。溶液を減圧下蒸発させ、そして残渣をシリカのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した(DCMからDCM:MeOH 19:1)。これにより所望の生成物(49)が得られた(1.6g,83%)。1H NMR (d6 DMSO) δ 1.07 (s, 9H), 2.31-2.36 (m, 1H), 3.76-3.80 (dd, 1H, J = 11.1, 4.7 Hz), 3.88-3.92 (dd, 1H, J = 11.2, 3.9 Hz), 3.97-4.00 (m, 1H), 4.49-4.50 (m, 1H), 5.83 (s, 1H), 6.58-6.61 (t, 1H, J = 6.7 Hz), 7.44-7.55 (m, 6H), 7.68-7.70 (m, 5H), 8.28 (s, 1H).Mass(エレクトロスプレー)C27H31IN4O3Siに関して計算値614.12,測定値613.
ジメチルホルムアミドジメチルアセタール(6.3g,53ミリモル)含有MeOH(70ml)中(49)の溶液(1.6g,2.61ミリモル)を45℃で18時間加熱した。溶液を冷却し、減圧下蒸発させ、そしてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した(EtOAcからEtOAc:MeOH 98:2)。これにより望ましい生成物(50)1.52g(87%)が得られた。1H NMR (d6 DMSO) δ 0.85 (s, 9H), 2.05-2.11 (m, 1H), 3.03 (s, 3H), 3.06 (s, 3H), 3.53-3.57 (dd, 1H, J = 11.1, 4.8 Hz), 3.65-3.69 (dd, 1H, J = 11.1, 4 Hz), 3.73-3.76 (q, 1H, J = 4 Hz), 4.26-4.28 (m, 1H), 5.21-5.22 (d, 1H, J = 4.3 Hz), 6.39-6.42 (t, 1H, J = 6.8 Hz), 7.21-7.32 (m, 6H), 7.46 (s, 1H), 7.45-7.48 (m, 4H), 8.15 (s, 1H), 8.68 (s, 1H).Mass(+veエレクトロスプレー)C30H36IN5O3Siに関して計算値669.16,測定値670.
乾燥THF(5ml)中(50)の溶液(1.52g,2.28ミリモル)を乾燥THF(35ml)中水素化ナトリウムの攪拌懸濁液(60%,109mg,2.73ミリモル)に室温で滴下した。45分後、黄色の溶液を5℃まで冷却し、そして臭化アリル(0.413g,3.41ミリモル)を加えた。溶液を室温まで上昇させ、そして18時間攪拌した。イソプロパノール(10滴)を加えた後、溶液を水(5ml)及びEtOAc(50ml)間で分配した。有機層を分離し、そして水溶液を更にEtOAc(2x50ml)で抽出した。合わせた有機溶液を乾燥(MgSO4)し、そして減圧下蒸発させた。残渣をシリカのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し(石油エーテル:EtOAc 1:3からEtOAc)、ゴム状の所望の生成物(51)1.2g(74%)が得られた。1H NMR (d6 DMSO) δ 1.03 (s, 9H), 2.39-2.45 (m, 1H), 2.60-2.67 (m, 1H), 3.2 (s, 3H), 3.23 (s, 3H), 3.70-3.74 (dd, 1H, J = 11.2, 4.6 Hz), 3.83-3.87 (dd, 1H, J = 11, 5.4 Hz), 4.03-4.08 (m, 3H), 4.30-4.31 (m, 1H), 5.18-5.21 (m, 1H), 5.28-5.33 (m, 1H), 5.89-5.98 (m, 1H), 6.49-6.53 (dd, 1H, J = 8.4, 5.8 Hz), 7.41-7.51 (m, 6H), 7.62-7.66 (m, 5H), 8.31 (s, 1H), 8.85 (s, 1H).Mass(+veエレクトロスプレー)C33H40IN5O3Siに関して計算値709.19,測定値710.
THF中1M TBAF溶液(4.4ml,4.4ミリモル)をTHF(100ml)中(51)の溶液(1.2g,1.69ミリモル)にN2下、5℃で加えた。溶液を室温まで上昇させ、そして2日間攪拌した。溶液を減圧下蒸発させ、そしてシリカのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した(EtOAcからEtOAc:MeOH 97:3).これにより所望の生成物(52)593mg(77%)が得られた。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.54 (m, 2H), 3.40 (s, 3H), 3.44 (s, 3H), 3.72-3.8 (m, 2H), 4.18-4.21 (m, 1H), 4.23-4.27 (m, 3H), 4.4-4.42 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 5.35-5.41 (m, 2H), 5.49-5.5 (q, 1H, J = 1.7 Hz), 5.53-5.55 (q, 1H, J = 1.7 Hz), 6.1-6.2 (m, 1H), 6.67-6.70 (dd, 1H, J = 8.8, 5.5 Hz), 7.96 (s, 1H), 8.53 (s, 1H), 9.06 (s, 1H).Mass(+veエレクトロスプレー)C17H22IN5O3に関して計算値471.08,測定値472.
35%アンモニア水(20ml)含有MeOH(20ml)中(52)の溶液(593mg,1.3ミリモル)を50℃で2日間加熱した。冷却後、溶液を減圧下蒸発させ、そして次にトルエン(3×10ml)で共沸した。これにより固体の所望の生成物(53)530mg(98%)が得られた。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.39 (m, 1H), 3.56-3.65 (m, 2H), 4.03-4.05 (m, 1H), 4.09-4.11 (m, 2H), 5.23-5.25 (d, 1H, J = 10.6 Hz), 5.35-5.4 (d, 1H, J = 15.4 Hz), 5.95-6.05 (m, 1H), 6.48-6.51 (dd, 1H, J = 8.9, 5.5 Hz), 6.6-6.95 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 8.16 (s, 1H).Mass(+veエレクトロスプレー)C14H17IN4O3に関して計算値416.03,測定値417.
乾燥DMF(17ml)中(53)の溶液(494mg,1.19ミリモル)にヨウ化銅(I)(45.1mg,0.24ミリモル)、N−2,2,2−トリフルオロ−N−プロパ−2−イニルアセトアミド(538mg,3.56ミリモル)、Et3N(240mg,2.38ミリモル)及びPd(Ph3P)4(137mg,0.12ミリモル)を室温で順に加えた。フラスコをホイルで包んで遮光し、そしてN2下18時間攪拌した。MeOH(10ml)及び小スパーテル1杯の重炭酸dowex H+形態を加え、そして混合物を30分間攪拌した。混合物を濾過し、減圧下蒸発させ、そして残渣をMeOHで粉砕してパラジウム塩を除去した。濾液を減圧下蒸発させ、そしてシリカのフラッシュクロマトグラフィー(DCMからDCM:MeOH 97:3)により精製した。所望の生成物(54)が褐色固体として得られた(490mg,94%)。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.25-2.31 (m, 1H), 2.98-3.04 (m, 1H), 3.41-3.49 (m, 2H), 3.88-3.95 (m, 3H), 4.10-4.12 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 4.22-4.23 (d, 2H, J = 5.3 Hz), 5.07-5.12 (m, 2H), 5.19-5.24 (dd, 1H, J = 17.3, 1.9 Hz), 5.79-5.89 (m, 1H), 6.31-6.35 (dd, 1H, J = 8.6, 5.6 Hz), 7.69 (s, 1H), 8.02 (S, 1H).Mass(−veエレクトロスプレー)C19H20F3N5O4に関して計算値439.15,測定値438.
ヌクレオシド(54)及びプロトンスポンジをP2O5上で真空下で一晩乾燥した。リン酸トリメチル(600μl)中(54)の溶液(84mg,0.191ミリモル)及びプロトンスポンジ(49mg,0.382ミリモル)の溶液を4Åモレキュラーシーブで1時間攪拌した。新たに蒸留したPOCl3(36μl,0.388ミリモル)を加え、そして溶液を4℃で2時間攪拌した。混合物を室温までゆっくりと加温し、そしてDMF中0.5M ビス(トリ−n−ブチルアンモニウム)ピロリン酸の溶液(1.52ml,0.764ミリモル)及び無水トリ−n−ブチルアミン(364μl,1.52ミリモル)を加えた。5分後、0.1M TEAB(重炭酸トリエチルアンモニウム)バッファー(5ml)で反応をクエンチし、そして3時間攪拌した。減圧下水を除去し、そして得られた残渣を濃アンモニア(ρ0.88,5ml)に溶解し、そして室温で16時間攪拌した。次いで反応混合物を蒸発乾固した。残渣を水に溶解し、そして溶液をDEAE−セファデックス A−25カラムに適用した。0.05M から1M TEABの直線グラジエントでMPLCを実施した。生成物を含有する画分を合わせ、そして蒸発乾固した。残渣を水に溶解し、そしてHPLCで更に精製した。HPLC:tr(55)=:22.60分(Zorbax C18 調製用カラム,グラジエント:20分で5%〜35%B,バッファーA 0.1M TEAB,バッファーBMeCN)生成物を白色泡状物として単離した(17.5マイクロモル,5.9%,ε280=15000)。1H NMR (D2O) δ 2.67-2.84 (2m, 2H, H-2'), 4.14 (br s, 2H, CH2NH), 4.17-4.36 (m, 2H, H-5'), 4.52 (br s, 1H, H-4'), 6.73 (t, J = 6.6 Hz, 1H, H-1'), 8.06 (s, 1H, H-8), 8.19 (s, 1H, H-2). 31P NMR (D2O) δ -5.07 (d, J = 21.8 Hz, 1P, Pγ), -10.19 (d, J = 19.8 Hz, 1P, Pα), -21.32 (t, J = 19.8 Hz, 1P, Pβ).Mass(−veエレクトロスプレー)C15H21N8O12P3に関して計算値598.05,測定値596
以下は3’遮断されたヌクレオチドのための典型的な遮断手順を示し、ここでNa2PdCl4およそ0.5当量及び水溶性ホスフィンリガンドL 4当量を水中、50℃で用いた。Tfaはトリフルオロアセチルを意味する:
−O−CH2−F
Claims (50)
- プリン又はピリミジン塩基と
構造:
−O−Z
(式中、Zは−C(R’)2−O−R’’、−C(R’)2−N(R’’)2、−C(R’)2−N(H)R’’、−C(R’)2−S−R’’及び−C(R’)2−Fのいずれかであり、
ここで各R’’は除去可能な保護基であるか又はその一部であり;
各R’は別個に水素原子、アルキル、置換アルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシもしくはアミド基、又は連結基を介して付着した検出可能な標識;又は(R’)2は式=−C(R’’’)2のアルキリデン基を表し、ここで各R’’’は同一かもしくは異なってよく、そして水素及びハロゲン原子及びアルキル基を含む群から選択され;そして
ここで前記分子は反応して、各R’’がHと交換されるか、又はZが−C(R’)2−Fの場合、FはOH、SH又はNH2、好ましくはOHと交換される中間体を生成してもよく、この中間体は水性条件下で解離して遊離の3’OHを有する分子をもたらし;
ただしZが−C(R’)2−S−R’’である場合、双方のR’基はHではない)
の基を3’炭素原子が付着しているように、そこに共有結合した除去可能な3’−OH遮断基を有するリボース又はデオキシリボース糖部分と
を含む修飾されたヌクレオチド又はヌクレオシド分子。 - R’がアルキル又は置換アルキルである、請求項1に記載の分子。
- −Zが式−C(R’)−N3である、請求項1又は2に記載の分子。
- Zがアジドメチル基である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の分子。
- R’’がベンジル又は置換ベンジル基である、請求項1又は2に記載の分子。
- 前記塩基が切断可能なリンカー又は切断不能なリンカーを介して検出可能な標識に連結されている、先行する請求項のいずれか一項に記載の分子。
- 前記リンカーが切断可能なリンカーである、請求項6に記載の分子。
- 検出可能な標識が切断可能な又は切断不能なリンカーにより遮断基を介して分子に連結されている、請求項1〜5のいずれか一項に記載の分子。
- 前記検出可能な標識がフルオロフォアである、請求項6〜8のいずれか一項に記載の分子。
- 前記リンカーが酸に不安定か、光に不安定か、又はジスルフィド結合を含有する、請求項6〜9のいずれか一項に記載の分子。
- 1つ以上の32P原子をそのリン酸部分に含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子。
- 式PN−O−アリルのヌクレオシド、ヌクレオチド又はポリヌクレオチド分子であって、ここでPNは前記ヌクレオシドもしくはヌクレオチドであるか、又は前記ポリヌクレオチドの3’末端ヌクレオチドであり;そして前記ヌクレオシド又はヌクレオチドはアリル遮断基に加えて更に切断可能な又は切断不能なリンカーによりその塩基に連結された検出可能な標識を含む、ヌクレオシド、ヌクレオチド又はポリヌクレオチド分子。
- 前記リンカーが切断可能である、請求項12に記載の分子。
- 前記検出可能な標識がフルオロフォアである、請求項12又は13に記載の分子。
- 前記リンカーが酸に不安定か、光に不安定か、又はジスルフィド結合を含有する、請求項12〜14のいずれか一項に記載の分子。
- 式R−O−アリル、R2N(アリル)、RNH(アリル)、RN(アリル)2又はR−S−アリルの化合物を、アリル基が除去され、水素で置換される対応する化合物に変換する方法であって、式R−O−アリル、R2N(アリル)、RNH(アリル)、RN(アリル)2又はR−S−アリルの化合物を、遷移金属並びに水溶性ホスフィン及び水溶性窒素含有ホスフィンリガンドを含む群から選択される1つ以上のリガンドを含む遷移金属と水溶液中で反応させるステップを含み、ここで、その、又は各Rは、水溶性生物学的分子である方法。
- 前記化合物が式R−O−アリルである、請求項16に記載の方法。
- 前記Rがヌクレオシド、ヌクレオチド又はポリヌクレオチド分子の一部である、請求項16又は17に記載の方法。
- 前記ヌクレオシド、ヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、切断可能な又は切断不能なリンカーによりその塩基に連結された検出可能な標識を更に含む、請求項18に記載の方法。
- 前記リンカーが切断可能である、請求項19に記載の分子。
- 前記検出可能な標識がフルオロフォアである、請求項19又は20に記載の方法。
- 前記リンカーが酸に不安定か、光に不安定か、又はジスルフィド結合を含有する、請求項19〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アリル基及び前記標識が単一のステップで除去される、請求項19〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遷移金属が白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、オスミウム及びイリジウムを含む群から選択される、請求項16〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遷移金属がパラジウムである、請求項16〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リガンドの群が誘導体化されたトリアリールホスフィンリガンド又は誘導体化されたトリアルキルホスフィンリガンドを含む、請求項16〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リガンドの群がアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル及びスルホナート基を含む群から選択される1つ以上の官能基で誘導体化されている、請求項16〜26のいずれか一項に記載の方法。
- リガンドの群が3,3’、3’’−ホスフィニジントリス(ベンゼンスルホン酸)及びトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン並びにその塩を含む、請求項16〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 合成又はシークエンシング反応において、請求項6〜10のいずれかで定義されるか又は請求項12〜15のいずれかで定義され、標的1本鎖ポリヌクレオチドの第2のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの取り込みを調節する方法であって、前記ヌクレオチドを伸長中の相補的なポリヌクレオチドに取り込むことを含み、前記ヌクレオチドの取り込みは引き続くヌクレオシド又はヌクレオチド分子が前記伸長中の相補的なポリヌクレオチドへ導入されることを阻止又は遮断する、方法。
- 前記ヌクレオチドの取り込みがターミナル・トランスフェラーゼ又はポリメラーゼ又は逆転写酵素により達成される、請求項29に記載の方法。
- ポリメラーゼがThermococcus種である、請求項30に記載の方法。
- Thermococcus種が9°N又はその単一変異体もしくは二重変異体である、請求項31に記載の方法。
- 二重変異体が−Y409V A485Lである、請求項32に記載の方法。
- 標的1本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって、
相補的ヌクレオチドの逐次的な取り込みをモニターするステップを含み、ここで少なくとも1つの取り込みは請求項6〜10のいずれかで定義されるか又は請求項12〜15のいずれかで定義されるヌクレオチドの取り込みであり、そしてここで取り込まれたヌクレオチドの同一性は塩基に連結された標識を検出することにより決定され、そして遮断基及び前記標識は次の相補的ヌクレオチドの導入の前に除去される、方法。 - ヌクレオチドの標識及び遮断基が単一の化学的処理ステップで除去される、請求項34に記載の方法。
- 標的1本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって:
(a)複数の異なるヌクレオチドを提供するステップであって、前記複数の異なるヌクレオチドは請求項6〜10のいずれかで定義されるか又は請求項12〜15のいずれかで定義されるいずれかであり、そしてここで各型のヌクレオチドに連結された検出可能な標識をその他の型のヌクレオチドに用いた検出可能な標識から検出時に区別できるステップと;
(b)ヌクレオチドを標的1本鎖ポリヌクレオチドの相補体に取り込むステップと;
(c)(b)のヌクレオチドの標識を検出し、それにより取り込まれたヌクレオチドの型を決定するステップと;
(d)(b)のヌクレオチドの標識及び遮断基を除去するステップと;
(e)場合によっては(b)〜(d)のステップを1回以上繰り返すステップと;
を備え、それにより標的1本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する、方法。 - 前記取り込みステップがThermococcus種により達成される、請求項36に記載の方法。
- Thermococcus種が9°N又はその単一変異体もしくは二重変異体である、請求項37に記載の方法。
- 二重変異体が−Y409V A485Lである、請求項38に記載の方法。
- ヌクレオチドの標識及び遮断基が単一の化学的処理ステップで除去される、請求項36〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 各々のヌクレオチドを連続的に標的と接触させ、次のヌクレオチドを添加する前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、標識及び遮断基の検出及び除去を各ヌクレオチドの添加後か、又は4つ全てのヌクレオチドの添加後のいずれかに実施する、請求項36〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 各々のヌクレオチドを同時に一緒に標的に接触させ、そして標識及び遮断基の検出の前及び除去に続いて取り込まれていないヌクレオチドを除去する、請求項36〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 第1工程及び第2工程を含み、第1工程では、4つのヌクレオチドのうちの2つを含む第1の組成物を標的と接触させ、そして標識の検出及び引き続く除去の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、そして第2工程では、第1の組成物に含まれていない2つのヌクレオチドを含む第2の組成物を標的と接触させ、そして標識及び遮断基の検出及び引き続く除去の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、そして場合によっては第1工程及び第2工程を1回以上繰り返す、請求項36〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 第1工程及び第2工程を含み、第1工程では、4つのヌクレオチドのうちの1つを含む組成物を標的と接触させ、そして標識及び遮断基の検出及び引き続く除去の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、そして第2工程では、第1の組成物に含まれていない3つのヌクレオチドを含む第2の組成物を標的と接触させ、そして標識及び遮断基の検出及び引き続く除去の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、そして場合によっては第1工程及び第2工程を1回以上繰り返す、請求項36〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 第1工程及び第2工程を含み、第1工程では、4つのヌクレオチドのうちの3つを含む第1の組成物を標的と接触させ、そして標識及び遮断基の検出及び引き続く除去の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、そして第2工程では、第1の組成物に含まれていないヌクレオチドを含む組成物を標的と接触させ、そして標識及び遮断基の検出及び引き続く除去の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、そして場合によっては第1工程及び第2工程を1回以上繰り返す、請求項36〜40のいずれか一項に記載の方法。
- (a)請求項6〜10のいずれかで定義されるか又は請求項12〜15のいずれかで定義されるヌクレオチドのいずれかである複数の異なるヌクレオチド;及び
(b)そのための包装材料;
を含むキット。 - 各ヌクレオチドの検出可能な標識をその他の3つの型のヌクレオチドのいずれかに用いた検出可能な標識から検出時に区別することができる、請求項46に記載のキット。
- 酵素及び酵素の作用に適当なバッファーを更に含む、請求項46又は47に記載のキット。
- サンガー又はサンガー型シークエンシング方法における、請求項1〜15のいずれかで定義されるヌクレオチドの使用。
- サンガー又はサンガー型シークエンシング方法を含む、請求項1に記載のヌクレオチドを使用する方法。
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