JP2006509040A - 修飾されたヌクレオチド - Google Patents

修飾されたヌクレオチド Download PDF

Info

Publication number
JP2006509040A
JP2006509040A JP2005501219A JP2005501219A JP2006509040A JP 2006509040 A JP2006509040 A JP 2006509040A JP 2005501219 A JP2005501219 A JP 2005501219A JP 2005501219 A JP2005501219 A JP 2005501219A JP 2006509040 A JP2006509040 A JP 2006509040A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
nucleotide
group
nucleotides
allyl
label
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2005501219A
Other languages
English (en)
Inventor
ジョーン ミルトン，
シャオリン ウー，
マーク スミス，
ジョセフ ブレンナン，
コリン バーニーズ，
シャオハイ リュー，
シルク リューディッガー，
Original Assignee
ソレックサ リミテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46324959&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2006509040(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US10/227,131 external-priority patent/US7057026B2/en
Priority claimed from GB0230037A external-priority patent/GB0230037D0/en
Priority claimed from GB0303924A external-priority patent/GB0303924D0/en
Application filed by ソレックサ リミテッド filed Critical ソレックサ リミテッド
Publication of JP2006509040A publication Critical patent/JP2006509040A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/14—Pyrrolo-pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/186—Modifications characterised by incorporating a non-extendable or blocking moiety
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2535/00—Reactions characterised by the assay type for determining the identity of a nucleotide base or a sequence of oligonucleotides
    • C12Q2535/113—Cycle sequencing
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

プリン又はピリミジン塩基と
構造：
−Ｏ−Ｚ
（式中、Ｚは−Ｃ（Ｒ’）２−Ｏ−Ｒ’’、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｈ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｓ−Ｒ’’及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｆのいずれかであり、
ここで各Ｒ’’は除去可能な保護基であるか又はその一部であり；
各Ｒ’は別個に水素原子、アルキル、置換アルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシもしくはアミド基、又は連結基を介して付着した検出可能な標識；又は（Ｒ’）２は式＝−Ｃ（Ｒ’’’）２のアルキリデン基を表し、ここで各Ｒ’’’は同一かもしくは異なってよく、そして水素及びハロゲン原子及びアルキル基を含む群から選択され；そして
ここで前記分子は反応して、各Ｒ’’がＨと交換されるか、又はＺが−Ｃ（Ｒ’）２−Ｆの場合、ＦはＯＨ、ＳＨ又はＮＨ２、好ましくはＯＨと交換される中間体を生成してもよく、この中間体は水性条件下で解離して遊離の３’ＯＨを有する分子をもたらし；
ただしＺが−Ｃ（Ｒ’）２−Ｓ−Ｒ’’である場合、双方のＲ’基はＨではない）
の基を３’炭素原子が付着しているように、そこに共有結合した除去可能な３’−ＯＨ遮断基を有するリボース又はデオキシリボース糖部分と
を含む修飾されたヌクレオチド又はヌクレオシド分子
を本発明は提供する。

Description

本発明は修飾されたヌクレオチドに関する。とりわけ本発明は除去可能な保護基を有するヌクレオチド、ポリヌクレオチドシークエンシング方法におけるその使用及び保護基の化学的脱保護のための方法を開示する。
ひとつには分子又はその生物学的反応を特徴付けるために用いられる技術の改良により、分子の研究が進歩している。とりわけ、核酸ＤＮＡ及びＲＮＡの研究が配列分析及びハイブリダイゼーション事象の研究に用いられる技術の開発の恩恵を受けている。
核酸の研究を改善している技術の実例は、固定核酸のアレイ作製の進歩である。これらのアレイは典型的には固体支持材料に固定されたポリヌクレオチドの高密度マトリックスから成る。例えば、マスキングするが、特定の部分で暴露させて適当に修飾されたヌクレオチド・ホスホラミダイトに付着させることにより化学的に増感されたガラス表面を用いる核酸を会合させる方法について記載しているＦｏｄｏｒら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：１９−２６（１９９４）を参照のこと。アレイ作製を公知のポリヌクレオチドを固体支持体に予め決定された位置で「スポット」する技術により製造することもできる（例えばＳｔｉｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６３７９−６３８３（１９９５））。
ＤＮＡの合成によるシークエンシングは理想的には、シークエンシングされるオリゴヌクレオチドに向かい合う正確な相補的ヌクレオチドの調節された（すなわち１個ずつの）取り込みを必要とする。これにより各ヌクレオチド残基が１個ずつシークエンシングされるので、複数のサイクルでヌクレオチドを付加することにより正確なシークエンシングが可能になり、したがって調節されない一連の取り込みを生じることが阻止される。そこに付着された適当な標識を用いて、標識部分の除去及び続く次のラウンドのシークエンシングの前に取り込まれたヌクレオチドを読む。単一の取り込みのみが生じていることを確認するために、単一のヌクレオチドの取り込みを確実にするのにシークエンシングヌクレオチドの構造修飾（「遮断基」）が必要であるが、これは次いでいずれか別のヌクレオチドがポリヌクレオチド鎖に取り込まれるのを阻止する。次いでシークエンシングされるＤＮＡの完全性に干渉しない反応条件下で遮断基は除去されなければならない。次いで、次の遮断、標識ヌクレオチドの取り込みを伴って、シークエンシングサイクルを続けることができる。実用のために、全過程は複数のシークエンシングサイクルを促す高収率の、高度に特異的な化学的及び酵素的工程から構成されるべきである。
ＤＮＡシークエンシングに有用であるためには、一度ヌクレオチドの塩基が付加されると、ヌクレオチドのポリヌクレオチド鎖への取り込みに用いられるポリメラーゼが複製を続けるのを妨げるように、ヌクレオチド、及びより一般的にはヌクレオチド三リン酸は概して３’ＯＨ−遮断基を必要とする。分子の遮断基としての適性には多くの制限がある。これは、更なるヌクレオチド分子がポリヌクレオチド鎖に付加されるのを妨げるが、同時にポリヌクレオチド鎖に損傷を引き起こさずに糖部分から容易に除去されるようなものでなければならない。更に、修飾されたヌクレオチドが、それのポリヌクレオチド鎖への取り込みに用いられるポリメラーゼ又はその他の適当な酵素に耐性がなければならない。したがって、理想的な遮断基は長期安定性を呈し、ポリメラーゼ酵素により効率的に取り込まれ、２次的な又は更なる取り込みの全体的な遮断を引き起こし、そしてポリヌクレオチド構造に損傷を引き起こさない穏やかな条件下、好ましくは水性条件下で除去される能力を有する。これらのストリンジェントな要件は、必要な修飾が為されたヌクレオチドの設計及び合成には厄介な障害である。
この目的のための可逆的な遮断基は以前に記載されているが、概してポリヌクレオチド、例えばＤＮＡ適合の化学に関する上記の基準に合致するものはない。
Ｍｅｔｚｋｅｒら、（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２（２０）：４２５９−４２６７（１９９４））は８個の３’修飾２−デオキシリボヌクレオシド５’−三リン酸（３’修飾ｄＮＴＰ）の合成及び使用、並びに取り込み活性に関する２つのＤＮＡ鋳型アッセイにおける試験を開示している。３’修飾ｄＮＴＰは３’−アリルデオキシリボアデノシン５’−三リン酸（３’−アリルｄＡＴＰ）を含む。しかしながら、３’−アリル遮断化合物は完全なサイクルの終止、脱保護及びＤＮＡ合成の再開を実証するためには用いられなかった。この化合物のＤＮＡ合成を終止する能力を示す試験結果が示されたのは、各々異なるＤＮＡポリメラーゼを用いて行った８つのこのようなアッセイのうちの１つの終止アッセイのみであった。
国際公開公報第０２／２９００３号（ニューヨーク市のコロンビア大学の管財人）はポリメラーゼ反応において伸長するＤＮＡ鎖の３’−ＯＨ基をキャップするアリル保護基の使用を含めることができるシークエンシング方法について記載している。アリル基はＭｅｔｚｋｅｒ（前出）の手順にしたがって導入され、そしてＫａｍａｌら（Ｔａｔ．Ｌｅｔ．４０：３７１−３７２（１９９９））により報告される方法を用いることにより除去されると記載されている。
Ｋａｍａｌの脱保護方法は、アセトニトリル溶媒中、その場でヨードトリメチルシランを生成するために、ヨウ化ナトリウム及びクロロトリメチルシランを用い、チオ硫酸ナトリウムでクエンチする。酢酸エチルへの抽出、及び乾燥（硫酸ナトリウム）の後、次いで減圧下濃縮、及びカラムクロマトグラフィー（溶離液として酢酸エチル：ヘキサン；２：３）の後、遊離アルコールが９０〜９８％の収率で得られた。
国際公開公報第０２／２９００３号では、Ｋａｍａｌの条件は穏やかで特異的であるので、Ｋａｍａｌのアリル脱保護は、修飾せずにＤＮＡシークエンシングに直接適用できると示唆されている。
Ｍｅｔｚｋｅｒは３’アリル遮断ヌクレオチド又はヌクレオシドの調製に関して報告しており、そして国際公開公報第０２／２９００３号はシークエンシング中の３’−ＯＨキャップとしてのアリル官能基の使用を示唆しているが、これらの文献のいずれも実際には、シークエンシングプロトコールの局面における３’−アリル化ヒドロキシル基の脱保護を教示していない。ヒドロキシル保護基としてのアリル基の使用は周知である（これは導入が容易であり、そして全ｐＨ範囲にわたって、及び高温に安定である）が、今のところ、ＤＮＡ適合条件、すなわちＤＮＡの完全性が全体的又は部分的に破壊されない条件下で３’−アリル基の切断に成功する明確な実施形態はない。換言すれば、３’ＯＨアリル遮断ヌクレオチドを用いてＤＮＡシークエンシングを行うことはこれまでのところ不可能であった。
ＴＭＳ塩化物は加水分解され、ＴＭＳヨウ化物のその場での生成を妨げるので、Ｋａｍａｌの方法は水性溶媒中で行うのに不適当である。シークエンシングにおいてＫａｍａｌの脱保護（アセトニトリル中）を実施する試みは不成功であることが本発明者らの手で判明している。
本発明は多くの可逆性遮断基の驚くべき進歩及びＤＮＡ適合条件下でそれを脱保護する方法に基づいている。これらの遮断基にはそれ自体が新規であるものもあり；先行技術で開示されているものもあるが、上記したように、これらの遮断基をＤＮＡシークエンシングに利用することが可能であるとは判明されていなかった。
本発明の１つの特徴は、アリル脱保護の完全に新しい方法の開発に由来する。そしてＫａｍａｌらの方法（これはアセトニトリル中で行う）及び高度に酸素及び水分感受性である、先行技術において一般に知られているその他の方法とは対照的に、本発明者らの手順は実質的には全てのアリル保護ヒドロキシル官能基の脱保護に広く適用でき、水溶液中で行うことができる。本発明の更なる特徴は新しいクラスの保護基の開発に由来する。これらはアセタール及び関連する保護基に基づくが、先行技術で公知のアセタール脱保護のいくつかの不利益を被らない。
アリル脱保護方法は、遷移金属及び少なくとも部分的に水溶性のリガンドから形成される水溶性遷移金属触媒を利用する。水溶液中では、これらは少なくとも部分的に水溶性である遷移金属複合体を形成する。本明細書で水溶液とは、少なくとも２０容量％、好ましくは少なくとも５０％、例えば少なくとも７５容量％、とりわけ少なくとも９５容量％及び特に９８容量％以上、理想的には１００容量％の水を連続相として含む液体を意味する。
当業者には理解されるように、アリル基をヒドロキシル基のみならず、チオール及びアミン官能基を保護するためにも使用することができる。更に例えばカルボン酸及びハロゲン化アリルとの間の反応からアリルエステルを形成することができる。当分野で公知の方法を用いて１級又は２級アミドを保護することもできる。本明細書に記載する新規の脱保護方法を全てのこれらのアリル化化合物、例えばアリルエステル及びモノもしくはビスアリル化１級アミンもしくはアリル化アミドの脱保護、又はアリル化２級アミンの脱保護に用いることができる。この方法はまたアリルエステル及びチオエステルの脱保護にも適している。
アセタール官能基を含む保護基は、以前に遮断基として用いられている。しかしながら、このような基及びエーテルの除去はＤＮＡ分子に有害な強い酸性脱保護を必要とする。しかしながらアセタールの加水分解は、不安定なヘミアセタール中間物質の形成に至り、これは水性条件下で天然のヒドロキシル基に加水分解される。本発明者はこの概念を利用し、そしてこれを更に、本発明のこの特徴が水性条件下で通常加水分解される中間分子を保護するための保護基を含む遮断基の利用に在るように適用している。これらの保護基は中間物質の構造を安定化する第２の官能基を備えるが、ポリヌクレオチドへの取り込みに続く後の段階でこれを除去することができる。官能基の特徴的化学は別の反応を干渉するので、有機合成反応において保護基は、これを一時的にマスキングするために用いられている。
したがって、本発明の第１の態様によれば、
プリン又はピリミジン塩基と
構造：
−Ｏ−Ｚ
（式中、Ｚは−Ｃ（Ｒ’）２−Ｏ−Ｒ’’、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｈ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｓ−Ｒ’’及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｆのいずれかであり、
ここで各Ｒ’’は除去可能な保護基であるか又はその一部であり；
各Ｒ’は別個に水素原子、アルキル、置換アルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシもしくはアミド基、又は連結基を介して付着した検出可能な標識；又は（Ｒ’）２は式＝−Ｃ（Ｒ’’’）２のアルキリデン基を表し、ここで各Ｒ’’’は同一かもしくは異なってよく、そして水素及びハロゲン原子及びアルキル基を含む群から選択され；そして
ここで前記分子は反応して、各Ｒ’’がＨと交換されるか、又はＺが−Ｃ（Ｒ’）２−Ｆの場合、ＦはＯＨ、ＳＨ又はＮＨ２、好ましくはＯＨと交換される中間体を生成してもよく、この中間体は水性条件下で解離して遊離の３’ＯＨを有する分子をもたらし；
ただしＺが−Ｃ（Ｒ’）２−Ｓ−Ｒ’’である場合、双方のＲ’基はＨではない）
の基を３’炭素原子が付着しているように、そこに共有結合した除去可能な３’−ＯＨ遮断基を有するリボース又はデオキシリボース糖部分と
を含む修飾されたヌクレオチド又はヌクレオシド分子が提供される。
別の態様の観点から、そのヌクレオチド又はヌクレオシドが、好ましくは切断可能なリンカーによりヌクレオチド又はヌクレオシドの塩基に連結された検出可能な標識を含む３’−Ｏ−アリルヌクレオチド又はヌクレオシドを本発明は提供する。
更なる態様では、そのヌクレオチド又はヌクレオシドが、好ましくは切断可能なリンカーによりヌクレオシド又はヌクレオチドの塩基に連結された検出可能な標識を含む３’−Ｏ−アリルヌクレオチド又はヌクレオシドを含むポリヌクレオチドを本発明は提供する。
更に別の態様の観点から、式Ｒ−Ｏ−アリル、Ｒ２Ｎ（アリル）、ＲＮＨ（アリル）、ＲＮ（アリル）２又はＲ−Ｓ−アリルの化合物を、アリル基が除去され水素で置換される対応する化合物に変換する方法を本発明は提供し、該方法は式Ｒ−Ｏ−アリル、Ｒ２Ｎ（アリル）、ＲＮＨ（アリル）、ＲＮ（アリル）２又はＲ−Ｓ−アリルの化合物を、水溶液中で遷移金属並びに水溶性ホスフィン及び水溶性窒素含有ホスフィンリガンドを含む群から選択される１つ以上のリガンドを含む遷移金属と反応させるステップを備え、ここでその又は各Ｒは水溶性生物学的分子である。
更なる態様では、合成又はシークエンシング反応において標的１本鎖ポリヌクレオチドのヌクレオチドに相補的なヌクレオチド分子の取り込みを調節する方法であって、伸長中の相補的なポリヌクレオチドに本発明の分子を取り込むステップを備え、該分子の取り込みは引き続くヌクレオシド又はヌクレオチド分子が該伸長中の相補的なポリヌクレオチドへ導入されることを阻止又は遮断する方法を本発明は提供する。
別の態様では、標的１本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する方法を本発明は提供し、その方法は、相補的なヌクレオチドの逐次的な取り込みをモニターするステップを含み、ここで少なくとも１つの取り込み、及び好ましくは全ての取り込みが上記した本発明のヌクレオチドの取り込みであり、これは好ましくは切断可能なリンカーによりヌクレオチド又はヌクレオシドの塩基に連結された検出可能な標識を含み、そしてここで取り込まれたヌクレオチドの同一性は標識を検出することにより決定され、該遮断基及び該標識は次の相補的ヌクレオチドの導入の前に除去される。
別の態様から、標的１本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する方法を本発明は提供し、その方法は
（ａ）本明細書に上記した本発明の複数の異なるヌクレオチドを提供するステップであって、ヌクレオチドは好ましくは切断可能なリンカーにより塩基から検出可能な標識に連結され、そしてここで各型のヌクレオチドに連結された検出可能な標識をその他の型のヌクレオチドに用いた検出可能な標識から検出時に区別できるステップと；
（ｂ）ヌクレオチドを標的１本鎖ポリヌクレオチドの相補体に取り込むステップと；
（ｃ）（ｂ）のヌクレオチドの標識を検出し、それにより取り込まれたヌクレオチドの型を決定するステップと；
（ｄ）（ｂ）のヌクレオチドの標識及び遮断基を除去するステップと；
（ｅ）場合によっては（ｂ）〜（ｄ）のステップを１回以上繰り返すステップと；
を備え、それにより標的１本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する。
加えて、別の態様で
（ａ）本発明の複数の異なる個々のヌクレオチド；及び
（ｂ）そのための包装材料；
を含むキットを本発明は提供する。
本発明の方法による、又は本発明の方法に用いられるヌクレオシド又はヌクレオチドは、プリン又はピリミジン塩基と、好ましくは３’Ｏの位置で共有結合している遮断基を有するリボース又はデオキシリボース糖部分とを含み、これは、３’−ＯＨ基の遮断に必要な技術に有用な分子を更なるヌクレオチドの取り込みを妨げさせ、例えばシークエンシング反応、ポリヌクレオチド合成、核酸増幅、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、一塩基多型研究、及びその他のかかる技術においてである。
「遮断基」という用語を本発明の局面において本明細書で用いる場合、これはアリル及び本明細書に記載する「Ｚ」遮断基の双方を包含する。しかしながら、記載し、そして本明細書にて特許請求する本発明の方法において、ヌクレオチドの混合物を用いる場合、これらは各々同一の型の遮断、すなわちアリル遮断又は「Ｚ」遮断を含むのが非常に好ましいことは理解されよう。「Ｚ」遮断されたヌクレオチドを用いる場合、検出可能な標識が「Ｚ」基の一部を形成する場合、すなわち塩基に付着していない場合を除いて、各「Ｚ」基は概して同一の基である。
一度遮断基が除去されると、別のヌクレオチドの遊離３’−ＯＨ基への取り込みが可能になる。
塩基を介して望ましいリンカーにより分子を検出可能な標識に連結でき、この標識は例えばフルオロフォアでよい。所望の場合、検出可能な標識を代わりに式「Ｚ」の遮断基に取り込むことができる。リンカーは酸に不安定、光に不安定であるか、又はジスルフィド結合を含有することができる。その他の結合、とりわけ、以下で更に詳細に記載するようにホスフィン切断可能なアジド含有リンカーを本発明に用いることができる。
好ましい標識及び結合には、国際公開公報第０３／０４８３８７号に開示されたものが含まれる。
ヌクレオチドを取り込む方法では、例えば本発明の合成又はシークエンシング反応において標的１本鎖ポリヌクレオチドのヌクレオチドに相補的な核酸分子の取り込みを調節する方法では、分子の取り込みをターミナル・トランスフェラーゼ、ポリメラーゼ又は逆転写酵素を介して達成することができる。
好ましくは、ポリメラーゼ、及びとりわけＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種に由来するもの、例えば９°Ｎ、により分子を取り込む。より一層好ましくは、ポリメラーゼは変異体９°Ｎ Ａ４８５Ｌであり、そしてより一層好ましくは、ポリメラーゼは二重変異体Ｙ４０９Ｖ及びＡ４８５Ｌである。
本発明の相補的ヌクレオチドの逐次的な取り込みをモニターするステップを含む標的１本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する方法では、遮断基及び標識を単一の化学処理工程で除去できるのが好ましい。したがって、本発明の好ましい実施形態では、遮断基は標識と同時に切断される。これは言うまでもなく、検出可能な標識を取り込む式Ｚのこれらの遮断基に固有の特徴である。
更に、好ましくは、遮断され標識された、修飾されたヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧのヌクレオチド構築物は同一のポリメラーゼ酵素により基質として認識される。
本明細書に記載した方法では、各々のヌクレオチドを逐次的に標的と接触させ、次のヌクレオチドを添加する前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、ここで標識及び遮断基の検出及び除去を各ヌクレオチドの添加後か、又は４つ全てのヌクレオチドの添加後のいずれかに実施する。
その方法では、全てのヌクレオチドを同時に標的に接触させることができ、すなわち異なるヌクレオチド全てを含む組成物を標的と接触させ、そして標識及び遮断基の検出及び引き続く除去の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去する。
その方法は第１工程及び第２工程を含むことができ、第１工程では、４つの型の修飾されたヌクレオチドのうちの２つを含む第１の組成物を標的と接触させ、そして標識及び遮断基の検出及び引き続く除去の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、そして第２工程では、第１の組成物に含まれていない２つのヌクレオチドを含む第２の組成物を標的と接触させ、そして標識及び遮断基の検出及び引き続く除去の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、そして場合によっては第１工程及び第２工程を１回以上繰り返すことができる。
本明細書に記載する方法はまた、第１工程及び第２工程を含むことができ、第１工程では、４つのヌクレオチドのうちの１つを含む組成物を標的と接触させ、そして標識及び遮断基の検出及び引き続く除去の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、そして第２工程では、第１の組成物に含まれていない３つのヌクレオチドを含む第２の組成物を標的と接触させ、そして標識及び遮断基の検出及び引き続く除去の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、そして場合によっては第１工程及び第２工程を１回以上繰り返すことができる。
本明細書に記載する方法はまた、第１工程及び第２工程を含むことができ、第１工程では、４つのヌクレオチドのうちの３つを含む第１組成物を標的と接触させ、そして標識及び遮断基の検出及び引き続く除去の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、そして第２工程では、第１の組成物に含まれていないヌクレオチドを含む組成物を標的と接触させ、そして標識及び遮断基の検出及び引き続く除去の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、そして場合によっては第１工程及び第２工程を１回以上繰り返すことができる。
本明細書の上記で定義したようなターミナル・トランスフェラーゼ、ポリメラーゼ又は逆転写酵素により本発明の方法の取り込みステップを達成することができる。検出可能な標識及び／又は切断可能なリンカーは、第２のヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸分子への取り込みを阻止するのに十分な大きさのものでよい。
標的１本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する本明細書に記載する特定の方法では、その１つが標的ポリヌクレオチドの第１の不対塩基に相補的である４つのヌクレオチドの各々を標的と連続的に接触させることができ、場合によっては次のヌクレオチドの添加の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去してもよい。取り込みの成功の決定を各ヌクレオチドの供給後か、又は全てのヌクレオチドの添加後のいずれかに実施することができる。４つより少ないヌクレオチドの添加の後に、１つが取り込まれたと決定される場合、取り込まれたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを検出するために更にヌクレオチドを提供する必要はない。
あるいは、全てのヌクレオチドを標的に同時に接触させることができ、すなわち異なるヌクレオチド全て（すなわちＡ、Ｔ、Ｃ及びＧ又はＡ、Ｕ、Ｃ及びＧ）を含む組成物を標的と接触させ、そして標識の検出及び除去の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去する。ヌクレオチドの逐次的な添加を含む方法は、第１下位工程及び場合によっては１つ以上のそれに続く下位工程を含むことができる。第１下位工程では４つの可能なヌクレオチドのうちの１、２又は３つを含む組成物が提供される、すなわち標的と接触させる。その後、取り込まれていないヌクレオチドを除去し、そして検出工程を行ってヌクレオチドの１つが取り込まれたかどうかを決定することができる。１つが取り込まれている場合、リンカーの切断を行うことができる。この方法では標的ポリヌクレオチドのヌクレオチドの同一性を決定することができる。次いで未完成ポリヌクレオチドを伸長させて標的オリゴヌクレオチドにおける次の不対ヌクレオチドの同一性を決定することができる。
上記の第１下位工程がヌクレオチドの取り込みに至らない場合、又は第１下位工程の直後には取り込まれたヌクレオチドの存在を追及しないのでこれが不明な場合、第１下位工程で提供されなかったこれらのヌクレオチドのいくつか又は全てが、適当な場合、同時又は連続的のいずれかで提供される１つ以上の続く下位工程を行うことができる。その後、いずれかの取り込まれていないヌクレオチドを除去し、そして検出工程を行って、ヌクレオチドのクラスの１つが取り込まれているかどうかを決定することができる。１つが取り込まれている場合、リンカーの切断を行うことができる。この方法では標的ポリヌクレオチドのヌクレオチドの同一性を決定することができる。次いで未完成ポリヌクレオチドを伸長させて標的オリゴヌクレオチドにおける次の不対ヌクレオチドの同一性を決定することができる。必要な場合、第３の及び場合によっては第４の下位工程を第２下位工程に類似の様式で行うことができる。明らかに、一度４つの下位工程を行えば、４つの可能なヌクレオチド全てが提供され、そして１つは取り込まれている。
１、２又は３つのヌクレオチドを含むいずれか特定の組み合わせが提供された後、ヌクレオチドの１つの型又はクラスが取り込まれているかどうかを決定するのが望ましい。この方法では、その他の（複数の）ヌクレオチドを提供するのに費やされる不必要な経費及び時間が削減される。しかしながらこれは本発明の必要とされる特徴ではない。
シークエンシングのための方法が、更なるヌクレオチドが提供される前に取り込まれていないヌクレオチドを除去するために１つ以上の下位工程を含むこともまた望ましい。これもまた、本発明の必要とされる特徴ではない。明らかに、取り込まれたヌクレオチドの検出の前に、少なくともいくつかの、そして好ましくは実施可能なできるだけ多くの、取り込まれていないヌクレオチドを除去することが必要である。
本発明のキットは（ａ）切断可能なリンカーを介して検出可能な標識、又は場合によっては切断可能なリンカーを介して式Ｚの遮断基に連結されている検出可能な標識に連結されている塩基を各ヌクレオチドが有する、本明細書に上記した本発明による個々のヌクレオチドであって、各ヌクレオチドに連結された検出可能な標識をその他の３つのヌクレオチドに用いた検出可能な標識から検出時に区別することができるヌクレオチド；及び（ｂ）そのための包装材料；を含む。キットは更に遮断基及び検出可能な標識の除去に適当な化学物質に加えて、ヌクレオチドを相補的なヌクレオチドに取り込むための酵素及び酵素の作用に適当なバッファーを含むことができ、好ましくはこれを同一の化学処理工程により除去することができる。
ヌクレオチド／ヌクレオシドはＤＮＡ合成及びＤＮＡシークエンシングプロトコールなどの多くの多様なＤＮＡ基盤の方法における使用に適している。
本発明は、３’−ＯＨ遮断基がそれに可逆的に共有結合することにより修飾されたヌクレオチド又はヌクレオシド分子に関し、そして遮断されたヌクレオチド又はヌクレオシド分子を必要とする反応、例えばシークエンシング反応、ポリヌクレオチド合成等においてその分子を使用することができる。
遮断基がアリル基である場合、例えばＭｅｔｚｋｅｒが用いた標準的な文献記載の手順（以下参照）を用いてこれを３’位置に導入することができる。
水溶性ホスフィン及び水溶性混合窒素ホスフィンリガンドを含む群から選択される１つ以上のリガンドの存在下、式Ｒ−Ｏ−アリル、Ｒ２Ｎ（アリル）、ＲＮＨ（アリル）、ＲＮ（アリル）２又はＲ−Ｓ−アリルの化合物（式中、Ｒは水溶性の生物学的分子である）を水溶液中で金属アリル複合体を形成することができる遷移金属と反応させることによりアリル基を除去する。
言うまでもなく、水溶性の生物学的分子がアリル基で保護された１つ以上のヒドロキシル、酸、アミノ、アミド又はチオール官能基を含有すれば、それは特には制限されない。アリルエステルは式Ｒ−Ｏ−アリルの化合物の実例である。好ましい官能基はヒドロキシル及びアミノである。
本明細書で用いる生物学的分子なる用語は生物学的役割を果たすいずれかの分子又は分子のクラスを包含する。このような分子には、例えばＤＮＡ及びＲＮＡなどのポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及び単一のヌクレオチドなどがある。加えて、ペプチド及びペプチドミメティクス（ペプチド擬似物質）、例えば酵素及びホルモン等は本発明に包含される。２級アミド結合を含む化合物、例えばペプチド、又は２級アミン（このような化合物は２級アミン又はアミドの窒素原子でアリル化される）は、式Ｒ２Ｎ（アリル）の化合物の実例であり、その双方のＲ基は同一の生物学的分子に属する。しかしながら、とりわけ好ましい化合物はポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドを含む）並びにヌクレオチド及びヌクレオシド、好ましくは切断可能なリンカーにより検出可能な標識に付着されている１つの塩基を含有するものである。このような化合物は本明細書に記載するオリゴヌクレオチドの配列の決定に有用である。
本発明に有用な遷移金属は、金属アリル複合体を形成できるいずれかのものであり、例えば白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、オスミウム及びイリジウムなどがある。パラジウムが好ましい。
遷移金属、例えばパラジウムを塩、例えばハロゲン化物として導入するのが便利である。混合塩、例えばＮａ２ＰｄＣｌ４を用いることもできる。その他の適当な塩及び化合物は当業者により容易に決定され、そして、例えばＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から市販されている。
適当なリガンドは、１つ以上のスルホナート、アミン、ヒドロキシル（好ましくは複数のヒドロキシル）又はカルボキシラート残基を導入することにより、リガンドがそれに水溶性を付与するために誘導体化されていることを特徴とする、当業者に公知のいずれかのホスフィン又は混合窒素ホスフィンリガンドである。アミン残基が存在する場合、アミン塩の形成が、リガンドひいては金属アリル複合体の可溶化を補助することができる。適当なリガンドの実例は、それを水溶性にするために誘導体化されたトリアリールホスフィン、例えばトリフェニルホスフィンである。トリアルキルホスフィン、例えばトリ−Ｃ１−６−アルキルホスフィン、例えばトリエチルホスフィンもまた好ましく；このようなトリアルキルホスフィンも同様にそれを水溶性にするために誘導体化されている。スルホナート含有及びカルボキシラート含有ホスフィンはとりわけ好ましく；前者の実例である３，３’，３’’−ホスフィニジントリス（ベンゼンスルホン酸）であり、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社より三ナトリウム塩として市販されており；後者の好ましい実例はトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンであり、これはＡｌｄｒｉｃｈより塩酸塩として市販されている。
本明細書で記載する誘導体化された水溶性ホスフィン及び窒素含有ホスフィンをその塩として（例えば塩酸塩又はナトリウム塩として）、又は、例えば、本明細書で記載するスルホン酸及びカルボン酸含有ホスフィンの場合、遊離の酸として用いることができる。３，３’，３’’−ホスフィニジントリス（ベンゼンスルホン酸）及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンを三酸又は三ナトリウム塩のいずれかとして導入することができる。その他の適当な塩は当業者に明白である。ホスフィンが水溶液に可溶であれば、塩形態の存在は特には重要でない。
用いることができるその他のリガンドには以下のものなどがある：
Figure 2006509040
Figure 2006509040
水溶性複合体の遷移金属にキレートされる原子が単価又は多価リガンドの一部でよいことは、当業者には認識されよう。このような多価リガンドのいくつかを上に示す。単価リガンドが好ましいが、このように本発明は水溶性二、三、四、五及び六価水溶性ホスフィン及び水溶性窒素含有ホスフィンリガンド用いる方法をも包含する。
アリル遮断基に関連する本発明の種々の態様は、とりわけ３’−ＯＨがアリル化されているポリヌクレオチドのシークエンシングにとりわけ有用である。しかしながら、存在する場合、２’−ＯＨはアリル化、及び必要な場合本発明の方法による脱保護に同等に反応し易い。実際に、いずれのアリル化されたアルコールも本発明の方法にしたがって脱保護できる。しかしながら、好ましいアリル化アルコールは、１級及び２級アルコールから誘導されたものである。とりわけ好ましいのは、本明細書に記載するアリル化されたヌクレオシド及びヌクレオチドである。３級アリル化アルコールを脱保護することが可能であり、その反応は単純で緩徐である（しかしながらこのような、及び本発明のその他の脱保護では、必要な場合、溶液を例えば４０℃、好ましくは５０℃又はそれより高温、例えばおよそ６０℃又は８０℃までも加熱することにより脱保護を加速させることができる）。
アリル化された１級又は２級アミン及びアリル化チオールを脱保護することも可能である。
上記のように、アリル脱保護を行う水溶液は１００％（連続相として）である必要はない。しかしながら、実質的に純粋な水（例えば少なくとも９８容量％、好ましくは約１００容量％）が好ましい。コソルベントは一般的に必要ではないが、脱アリル化のためのアリル化基質の可溶化を補助することができる。通常、生体分子は水（例えば純粋な水）に容易に溶解し、本明細書に記載する脱保護をその水中で行うことができる。所望の場合、１つ以上の水混和性コソルベントを用いることができる。適当な溶媒にはアセトニトリル又はジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール及びアセトンなどがあり、メタノールが好ましい。あまり好ましくない溶媒にはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）及びジオキサンなどがある。
本発明によるアリル脱保護の方法では、遷移金属及び１つ以上の水溶性ホスフィン及び水溶性窒素含有ホスフィンリガンドを含む可溶性金属複合体が形成される。脱アリル化反応において１つ以上の型の水溶性ホスフィン／窒素含有ホスフィンリガンドを用いることができるが、概してこれらのクラスのリガンドのただ１つの型を規定の反応で用いる。本発明者らは、脱アリル化反応は触媒性であると考えている。したがって、遷移金属、例えばパラジウムの量は１モル％未満でよい（脱保護されるアリル保護化合物に相対して算出）。触媒の量は１モル％より更に少ない、例えば＜０．５０モル％、好ましくは＜０．１０モル％、とりわけ＜０．０５モル％であるのが有利である。更に低量の金属を用いることでき、例えば＜０．０３又は＜０．０１モル％でよい。しかしながら、当業者には認識されるように、触媒の量が低減されれば、反応の速度も低減される。当業者はいずれの場合でも、いずれかの特定の脱アリル化反応に最も適した遷移金属及び、したがって触媒の正確な量を判断することができよう。
活性触媒を形成するのに必要とされる金属の量と対照的に、用いる水溶性リン含有リガンドの量は１モル当量以上でなければならない（これもまた脱保護されるアリル保護化合物に相対して算出）。好ましくは４よりも多く、例えば６よりも多く、例えば８〜１２モル当量のリガンドを用いることができる。所望の場合、例えば＞２０モル当量の更に高量のリガンドを用いることができる。
当業者はいずれかの個々の反応に最も適したリガンドの量を決定することができる。
遮断基が、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｏ−Ｒ’’、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｈ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｓ−Ｒ’’及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｆのいずれか、すなわち式Ｚである場合、各Ｒ’は別個にＨ又はアルキルでよい。
生成された中間体は水性条件下で自然に解離して、別のヌクレオチドの更なる取り込みを可能にする天然の３’ヒドロキシ構造に戻るのが有利である。本明細書で論じるように、いずれかの適当な保護基を用いることができる。好ましくは、Ｚは式−Ｃ（Ｒ’）２−Ｏ−Ｒ’’、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｈ）Ｒ’’及び−Ｃ（Ｒ’）２−ＳＲ’’である。とりわけ好ましくは、Ｚは式−Ｃ（Ｒ’）２−Ｏ−Ｒ’’、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’’）２、及び−Ｃ（Ｒ’）２−ＳＲ’’である。Ｒ’’はベンジル基又は置換されたベンジル基でよい。
Ｚが−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’’）２である構造−Ｏ−Ｚの基の一例は、−Ｎ（Ｒ’’）２がアジド（−Ｎ３）のものである。このような好ましい実例の１つは、各Ｒ’がＨであるアジドメチルである。あるいは、式−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ３のＺ基及びその他のＺ基のＲ’は本明細書で論じるその他の基のいずれかでよい。
典型的なＲ’基の実例には、Ｃ１−６アルキル、とりわけメチル及びエチル、並びに以下のもの（その各構造はＲ’部分を、Ｚ基のそれが付着する炭素原子に連結する結合を示す；アスタリスク（＊）は付着の点を示す）などがある：
Figure 2006509040
 （ここで、各Ｒは置換されていてもよいＣ１−１０アルキル基、置換されていてもよいアルコキシ基、ハロゲン原子又は官能基、例えばヒドロキシル、アミノ、シアノ、ニトロ、カルボキシル等である）そして「Ｈｅｔ」は複素環である（これは例えばヘテロアリール基でよい）。上記のこれらのＲ’基は、その他のＲ’基が最初と同一であるか、又は水素である場合に好ましい。好ましいＺ基は式−Ｃ（Ｒ’）２Ｎ３（ここでＲ’基は上記した構造及び水素から選択されるか；又はここで（Ｒ’）２は式＝Ｃ（Ｒ’’’）２のアルキリデン基、例えば＝Ｃ（Ｍｅ）２を表す）のものである。
分子が式−Ｃ（Ｒ’）２Ｎ３のＺ基を含有する場合、アリル基を、式ＰＮ−Ｏ−アリル、式Ｒ−Ｏ−アリル、Ｒ２Ｎ（アリル）、ＲＮＨ（アリル）、ＲＮ（アリル）２又はＲ−Ｓ−アリルの化合物からアリル基を切断するために提供される遷移金属複合体に関連して詳記したホスフィン又は窒素含有ホスフィンリガンドとこのような分子を接触させることにより、アジド基をアミノに変換することができる。しかしながらアジドをアミノに変換する場合、遷移金属は必要ではない。あるいは、このような分子をチオール、とりわけ水溶性チオール、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）と接触させることにより、式Ｃ（Ｒ’）２Ｎ３のＺ基のアジドをアミノに変換することができる。
Ｒ’基が連結基により付着された検出可能な標識を表す場合、その他のＲ’基又は「Ｚ」のいずれかその他の部分は概して検出可能な標識を含有せず、ヌクレオシド又はヌクレオチドの塩基もまた検出可能な標識を含有しない。検出可能な標識を３’遮断基に連結するための適当な連結基は当業者に公知であり、そしてこのような基の実例を本明細書の後記で更に詳記する。
検出可能な標識を含有するＲ’基の連結の実例は１つ以上のアミド結合を含有するものである。このようなリンカーはまた鎖にアリーレン、例えばフェニレン基（すなわち連結部分−Ａｒ−（ここでフェニル環はその１，４−配置の炭素原子によるリンカーの一部である））を含有する。フェニル環はその非結合位置で１つ以上の置換基、例えばアルキル、ヒドロキシル、アルキルオキシ、ハロゲン化物、ニトロ、カルボキシル、又はシアノ等、とりわけ電子求引基で置換されていてよく、この電子求引基は誘起又は共鳴のいずれかによる。Ｒ’基の連結はまた−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｑ（ｑは０、１又は２）、ＮＨもしくはＮアルキルのごとき部分を含むこともできる。このようなＺ基の実例は以下のとおりである：
Figure 2006509040
 （ここで、ＥＷＧは電子求引基を意味し；ｎは１〜５０の整数、好ましくは２〜２０の整数、例えば３〜１０の整数であり；そしてｆｌｕｏｒはフルオロフォアを示す）。共鳴による電子求引基の実例はニトロであり；誘起により作用する基はフルオロである。その他の適当な電子求引基は当業者には認識されよう。加えて、フルオロフォアは検出可能な標識が存在するとして示されているが、本明細書の後記で更に詳細に論じるその他の検出可能な標識を代わりに含むことができることは理解されよう。
検出可能な標識が３’遮断位置でヌクレオチドに付着している場合、反応の次の工程の前に標識を「読み」そして除去することを必要とする、本明細書で記載するこれらの反応、例えばＤＮＡシークエンシングにおいて有用であるためにリンカーは切断可能である必要はない。これは、標識が３’遮断基に付着している場合、本明細書に記載する中間化合物が「Ｚ」基を水素原子と置換するために崩壊するときにヌクレオチドから分離するためである。上記したように、各Ｒ’’は除去可能な保護基であるか又はその一部である。Ｒ’’はベンジル基、又は置換されたベンジル基でよく、これは代替の実施形態である。
検出可能な標識をＲ’’基に取り込むことができる場合、本発明はこの可能性を包含することは理解されよう。したがって、Ｒ’’がベンジル基である場合、フェニル環はフルオロフォア又はその他の検出可能な基を付着するリンカー基を担持することができる。このような基の導入はこのようなＲ’’を除去する能力を妨げず、そしてこれは式Ｚの遮断基の脱保護の間の望ましい不安定な中間体の生成を妨げない。
当分野で公知であるように、「ヌクレオチド」は窒素含有塩基、糖、及び１つ以上のリン酸基から成る。これは核酸配列の単量体単位である。ＲＮＡでは糖はリボースであり、そしてＤＮＡではデオキシリボース、すなわちリボースに存在するヒドロキシル基を欠いている糖である。窒素含有塩基はプリン又はピリミジンの誘導体である。プリンはアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）であり、そしてピリミジンはシトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）（又はＲＮＡではウラシル（Ｕ））である。デオキシリボースのＣ−１原子はピリミジンのＮ−１又はプリンのＮ−９に結合する。ヌクレオチドはまた糖のＣ−５に付着しているヒドロキシル基で生じるエステル化を伴うヌクレオシドのリン酸エステルである。ヌクレオチドは通常一、二又は三リン酸エステルである。
「ヌクレオシド」は構造的にヌクレオチドに類似するが、リン酸部分を欠如している。ヌクレオシドアナログの実例は、標識が塩基に連結されており、そして糖分子に付着するリン酸基がないものである。
塩基は通常プリン又はピリミジンと称されるが、ヌクレオチド又はヌクレオシドのワトソン・クリック塩基対合を行う能力が変わらない誘導体及びアナログを利用できることは当業者には理解されよう。「誘導体」又は「アナログ」とはそのコア構造が親化合物と同一であるか又はそれに非常に類似しているが、化学的又は物理的修飾、例えば異なる又は更なる側鎖、又は誘導体化されたヌクレオチド又はヌクレオシドが別の分子に連結することを可能にする２’及び、もしくは３’遮断基を有している化合物又は分子を意味する。例えば、塩基はデアザプリンでよい。誘導体はワトソン・クリック塩基対合を行うことができるべきである。「誘導体」及び「アナログ」はまた修飾された塩基部分及び／又は修飾された糖部分を有する合成ヌクレオチド又はヌクレオシド誘導体を意味する。このような誘導体及びアナログは例えばＳｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ（１９８０））及びＵｈｌｍａｎら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３−５８４（１９９０）にて論じられている。ヌクレオチドアナログはまたホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、アルキルホスホナート、ホスホロアニリダート及びホスホロアミダート結合などの修飾されたホスホジエステル結合を含むこともできる。アナログはワトソン・クリック塩基対合を行うことができるべきである。本明細書で用いる「誘導体」、「アナログ」及び「修飾された」を互換的に用いることができ、そして本明細書で定義する「ヌクレオチド」及び「ヌクレオシド」なる用語を包含する。
本発明の局面では、「取り込む」なる用語は核酸（例えばＤＮＡ）分子又はオリゴヌクレオチド又はプライマーの一部になることを意味する。オリゴヌクレオチドは、１つのヌクレオチドの五炭糖の３’位置と隣接するヌクレオチドの五炭糖の５’位置との間のホスホジエステル又は修飾されたホスホジエステル結合により形成されるヌクレオチドの共有結合した配列を含む合成又は天然分子を意味する。
「アルキル」なる用語は直鎖、分岐鎖及びシクロアルキル基を意味する。その局面がそれ以外を示すのでなければ、「アルキル」なる用語は１〜１０個の炭素原子、例えば１〜８個の炭素原子、及び典型的には１〜６個の炭素原子、例えば１〜４個の炭素原子を有する基を意味する。アルキル基の実例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル及びｎ−ヘキシル、並びにその異性体などがある。
シクロアルキルの実例には、３〜１０個の環状原子を有するもの、とりわけシクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン及びシクロヘプタン、ビシクロヘプタン及びデカリンから誘導されたものなどの実例がある。
アルキル（シクロアルキルを含む）基が置換されている場合、とりわけこれらが本発明の分子の双方のＲ’基のいずれかを形成する場合、適当な置換基の実例にはハロゲン置換基又は官能基、例えばヒドロキシル、アミノ、シアノ、ニトロ、カルボキシル等などがある。このような基はまた適当な場合、本発明の分子の別のＲ’基の置換基でもよい。
アミノなる用語はＮＲ＊Ｒ＊＊の型の基を意味し、ここでＲ＊及びＲ＊＊は別個に、水素、Ｃ１−６アルキル基から選択される（Ｃ１−６アルキルアミノ又はジ−Ｃ１−６アルキルアミノとも称される）。
本明細書で用いる「ハロゲン」なる用語にはフッ素、塩素、臭素及びヨウ素が含まれる。
本発明のヌクレオチド分子は、ヌクレオチドの検出を必要とする多様な方法で使用するのに適している。
そのヌクレオチドを用いてＤＮＡシークエンシング方法、例えば米国特許第５，３０２，５０９号で概要が示されている方法を実施することができる。
本発明は、従来の検出可能な標識を利用することができる。蛍光分光法などのいずれかの適当な方法により、又はその他の光学的な手段により検出を行うことができる。好ましい標識は、エネルギーを吸収した後、規定の波長で放射するフルオロフォアである。多くの適当な蛍光標識が公知である。例えば、Ｗｅｌｃｈら（Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．５（３）：９５１−９６０（１９９９））は、本発明で用いることができるダンシルの官能性を持たせた蛍光部分を開示している。Ｚｈｕら（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ２８：２０６−２１１（１９９７））は、本発明で用いることができる蛍光標識Ｃｙ３及びＣｙ５の使用について記載している。使用に適した標識はまたＰｒｏｂｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：３３６−３４１（１９８７））；Ｃｏｎｎｅｌｌら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５（４）：３４２−３８４（１９８７））、Ａｎｓｏｒｇｅら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（１１）：４５９３−４６０２（１９８７））及びＳｍｉｔｈら（Ｎａｔｕｒｅ ３２１：６７４（１９８６））にも開示されている。その他の市販されている蛍光標識には、フルオレセイン、ローダミン（ＴＭＲ、テキサスレッド及びＲｏｘなどを含む）、アレクサ、ボディピー（ｂｏｄｉｐｙ）、アクリジン、クマリン、ピレン、ベンズアントラセン及びシアニンなどがあるが、これらに限定されない。
本発明において複数の標識を用いることもできる。例えばビ・フルオロフォアＦＲＥＴカセット（Ｔｅｔ．Ｌｅｔ．４６：８８６７−８８７１（２０００））は当分野で公知であり、そして本発明で利用することができる。マルチ・フルオロ・デンドリマー系（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：８１０１−８１０８（２００１））を用いることもできる。
蛍光標識が好ましいが、その他の形態の検出可能な標識も有用であるのは当業者に明らかであろう。例えば量子ドット（Ｅｍｐｏｄｏｃｌｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３９９：１２６−１３０（１９９９））、金ナノ粒子（Ｒｅｉｃｈｅｒｔら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：６０２５−６０２９（２０００））及びマイクロビーズ（Ｌａｃｏｓｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７（１７）：９４６１−９４６６（２０００））などの微粒子を全て使用することができる。
本発明において多成分標識を用いることもできる。多成分標識は検出する別の化合物との相互作用に依存する標識である。生物学で用いられる最も一般的な多成分標識はビオチン・ストレプトアビジン系である。ビオチンをヌクレオチド塩基に付着された標識として用いる。次いでストレプトアビジンを別個に加えて検出を行うのを可能にする。その他の多成分系も利用可能である。例えばジニトロフェノールは、検出に用いることができる、市販されている蛍光抗体である。
本発明はヌクレオチドに関して記載されており、そして更に記載される。しかしながら、特記しない場合、ヌクレオチドに対する言及はまたヌクレオシドにも適用できることを意図している。本発明は更にＤＮＡに関しても記載されるが、特記しない場合、その記載はＲＮＡ、ＰＮＡ及びその他の核酸にも適用できる。
本発明の修飾されたヌクレオチドは標識をヌクレオチドに付着させるために切断可能なリンカーを使用することができる。切断可能なリンカーの使用により、必要な場合、検出後に標識を除去できることを確実にし、いずれかの続いて取り込まれた標識ヌクレオチドとの干渉シグナルを避けることができる。
一般的に、とりわけ本明細書に上記した本発明の方法において、検出可能な標識が「Ｚ」基の一部を形成することによりヌクレオチドに付着している場合を除けば、切断可能なリンカーの使用が好ましい。
特定の型のヌクレオチドで無作為化された鎖終止に頼るいわゆるサンガー・シークエンシング法及び関連するプロトコール（サンガー型）におけるジデオキシヌクレオシド三リン酸の利用は当業者には認識されよう。サンガー型シークエンシングプロトコールの実例はＭｅｔｚｋｅｒに記載されるＢＡＳＳ法である（後記）。その他のサンガー型シークエンシング法は当業者に公知であろう。
サンガー及びサンガー型方法は概して、８つの型のヌクレオチドを提供し、そのうちの４つは３’ＯＨ基を含有し；４つにはＯＨがなく、そしてこれが互いに異なって標識されている実験を行なうことにより機能する。用いた３’ＯＨがないヌクレオチド、すなわちジデオキシヌクレオチドを従来どおりにｄｄＮＴＰと略する。当業者には公知であるように、ｄｄＮＴＰは異なって標識されるので、取り込まれた末端ヌクレオチドの位置を決定し、そしてこの情報を合わせることにより標的オリゴヌクレオチドの配列を決定することができる。
認識されるように、本明細書に記載する新規３’−ＯＨ遮断基を用いることにより、ｄｄＮＴＰを用いることにより達成された効果と同一の効果を達成することができる（双方共に続くヌクレオチドの取り込みを防御する）ので、本発明のヌクレオチドはサンガー法及び関連するプロトコールで有用である。
サンガー及びサンガー型シークエンシング法における本発明によるヌクレオチドの使用においては、検出可能な標識をヌクレオチドに連結するリンカーが切断可能でも切断できなくてもよく、これを更に本発明の別の態様を成す。この態様の観点から、本発明はサンガー及びサンガー型シークエンシング法におけるこのようなヌクレオチドの使用を提供する。
本発明による３’−ＯＨ Ｚ遮断ヌクレオチドを用いる場合、本発明に標識ヌクレオチドが取り込まれる各例で、続いてヌクレオチドが取り込まれる必要はなく、そして標識をヌクレオチドから除去する必要はないので、ヌクレオチドに付着された検出可能な標識は切断可能なリンカーを介して連結される必要がないことは理解されよう。
更に３’ＯＨ遮断されたヌクレオチドの取り込みのモニターを、付着されるリン酸基における放射活性３２Ｐの使用により決定できることは理解されよう。これらはｄｄＮＴＰ自体か又は伸長に使用するプライマーのいずれかに存在できる。遮断基が式「Ｚ」の基である場合、これは本発明の更なる態様を示す。
この態様の観点から、本発明はサンガー及びサンガー型シークエンシング法における、「Ｚ」基で遮断された３’ＯＨ基を有するヌクレオチドの使用を提供する。この実施形態では、３２Ｐ検出可能な標識は用いたｄｄＮＴＰ又は伸長に用いたプライマーのいずれかに存在し得る。
切断可能なリンカーは当分野で公知であり、そしてリンカーをヌクレオチド塩基及び標識に付着させるために従来の化学を適用することができる。酸、塩基、求核試薬、求電子試薬、ラジカル、金属、還元又は酸化剤、光、温度、酵素等への暴露などのいずれかの適当な方法によりリンカーを切断することができる。本明細書にて論じるリンカーを３’Ｏ−遮断基結合を切断するのに用いる触媒と同一の触媒を用いて切断することもできる。適当なリンカーを、Ｇｒｅｅｎｅ及びＷｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓで開示されるような標準的な化学遮断基から適用することができる。固相合成で用いられる更に適当な切断可能なリンカーはＧｕｉｌｌｉｅｒら（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１００：２０９２−２１５７（２０００））に開示されている。
「切断可能なリンカー」なる用語の使用は、リンカー全体が例えばヌクレオチド塩基から除去されることを必要とすることを含意することを意味するものではない。検出可能な標識が塩基に付着されている場合、切断後にリンカーの一部がヌクレオチドに付着されたままであることを確実にするリンカーの位置にヌクレオシド切断部位を定めることができる。
検出可能な標識が塩基に付着されている場合、ワトソン・クリック塩基対合を依然行うことができるならば、ヌクレオチド塩基のいずれかの位置でリンカーを付着させることができる。プリン塩基の局面では、リンカーがプリン又は好ましいデアザプリンアナログの７位を介して、８−修飾プリンを介して、Ｎ−６修飾アデノシン又はＮ−２修飾グアニンを介して付着されれば好ましい。ピリミジンに関しては、付着はシトシン、チミジン又はウラシルの５位、及びシトシンのＮ−４位置を介するのが好ましい。適当なヌクレオチド構造を図１に示す。図１の各構造に関して、ＸはＨ、リン酸、二リン酸又は三リン酸でよい。Ｒ１及びＲ２は同一か又は異なっていてよく、そしてＨ、ＯＨ、Ｏ−アリルもしくは本明細書で記載する式Ｚ、又はＲ１及びＲ２の少なくとも１つがＯ−アリルもしくは本明細書で記載する式Ｚであれば、ＯＨに変換できるいずれかその他の基、非限定例としてはカルボニル、などから選択される。Ｒ１及びＲ２に適当ないくつかの官能基には図３及び４に示す構造などがある。
適当なリンカーを図３に示し、ジスルフィドリンカー（１）、酸に不安定なリンカー（２、３、４及び５；ジアルコキシベンジルリンカー（例えば２）、シーバー（Ｓｉｅｂｅｒ）リンカー（例えば３）、インドールリンカー（例えば４）、ｔ−ブチル・シーバー（Ｓｉｅｂｅｒ）リンカー（例えば５））、求電子的に切断可能なリンカー、求核的に切断可能なリンカー、光切断可能なリンカー、還元条件下、酸化条件下での切断、セーフティ・キャッチ・リンカーの使用による切断、及び排除メカニズムによる切断などがあるが、これらに限定されない。
Ａ．求電子的に切断可能なリンカー
求電子的に切断可能なリンカーは典型的にはプロトンにより切断され、そして酸に感受性のある切断を含む。適当なリンカーには修飾されたベンジル系、例えばトリチル、ｐ−アルコキシベンジルエステル及びｐ−アルコキシベンジルアミドなどがある。その他の適当なリンカーにはｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基及びアセタール系などがある。
チオアセタール又はその他のイオウ含有保護基の切断におけるチオフィリック金属、例えばニッケル、銀又は水銀の使用を適当なリンカー分子の調製のために考慮することもできる。
Ｂ．求核的に切断可能なリンカー
求核的切断もまたリンカー分子の調製においてよく知られた方法である。基例えば水中で不安定なエステル（すなわち単純に塩基性ｐＨで切断され得る）及び非水性求核試薬に不安定な基を使用することができる。フッ素イオンを用いて基例えばトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）又はｔ−ブチルジメチルシラン（ＴＢＤＭＳ）のシリコン−酸素結合を切断することができる。
Ｃ．光切断可能なリンカー
光切断可能なリンカーは糖質化学において広く用いられている。切断を活性化するのに必要な光は、修飾されたヌクレオチドのその他の成分に影響しないのが好ましい。例えば、フルオロフォアを標識として用いる場合、これがリンカー分子を切断するのに必要な波長とは異なる波長の光を吸収すれば好ましい。適当なリンカーにはＯ−ニトロベンジル化合物及びニトロベラトリル化合物に基づくものなどがある。ベンゾイン化学に基づくリンカーを用いることもできる（Ｌｅｅら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４：３４５４−３４６０（１９９９））。
Ｄ．還元条件下での切断
還元性の切断の影響を受けやすいことが知られている多くのリンカーがある。パラジウム系の触媒を用いる接触水素化を用いてベンジル及びベンジルオキシカルボニル基の切断が行われている。ジスルフィド結合還元もまた当分野で公知である。
Ｅ．酸化条件下での切断
酸化系の方法は当分野で公知である。これにはｐ−アルコキシベンジル基の酸化並びにイオウ及びセレニウムリンカーの酸化などがある。ジスルフィド及びその他のイオウ又はセレニウム系のリンカーを切断するための水性ヨウ素の使用もまた本発明の範囲内である。
Ｆ．セーフティ・キャッチ・リンカー
セーフティ・キャッチ・リンカーは２つの工程で切断するリンカーである。好ましい系では、第１工程は反応性求核中心の作製であり、その後に切断に至る分子内環化に関与する第２工程が続く。例えばレブリン酸エステル結合をヒドラジン又は光化学で処理して活性アミンを放出させ、次いでこれを環化して分子の他の場所のエステルを切断することができる（Ｂｕｒｇｅｓｓら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５１６５−５１６８（１９９７））。
Ｇ．排除メカニズムによる切断
排除反応を用いることもできる。例えば、例えばＦｍｏｃ及びシアノエチルなどの基の塩基で触媒される排除、並びにアリル系のパラジウムで触媒される還元性排除を用いることができる。
切断部位と同様に、リンカーはスペーサーユニットを含むことができる。スペーサーは例えばヌクレオチド塩基を切断部位又は標識から遠ざける。ヌクレオチドと酵素との間の相互作用に何ら干渉されないために、標識がヌクレオチドから十分な距離を維持するのであれば、リンカーの長さは重要ではない。
好ましい実施形態では、リンカーは遮断基と同一の官能基から構成され得る。これは標識及び遮断基の双方を除去するのに必要なのは単一の処理のみであるので、脱保護及び脱遮断方法が更に効率的になる。
とりわけ好ましいリンカーはホスフィン切断可能なアジド含有リンカーである。
標的ポリヌクレオチドを別個に異なるヌクレオチドに接触させて標的ポリヌクレオチドの配列に対する相補体を形成し、そしてヌクレオチドの取り込みを検出することにより、標的ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法を実施することができる。このような方法は、標的のヌクレオチドに相補的な正確なヌクレオチドを取り込むことによりポリメラーゼ酵素が相補鎖を伸長する重合を利用する。重合反応はまた重合を開始するための特異的プライマーを必要とする。
各サイクルで、修飾されたヌクレオチドの取り込みをポリメラーゼ酵素により実施し、そして次に取り込み事象を決定する。多様なポリメラーゼ酵素が存在し、そしてどれが最も使用に適しているかは当業者に明らかであろう。好ましい酵素には、ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウフラグメント、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、Ｔ４又はＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ又はＶｅｎｔポリメラーゼなどがある。特別な特性を有するように操作されたポリメラーゼを用いることもできる。上記したように、分子はポリメラーゼ、そしてとりわけＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種に由来するもの、例えば９°Ｎにより取り込まれるのが好ましい。なお更に好ましくは、ポリメラーゼは変異体９°Ｎ Ａ４８５Ｌであり、そしてなお更に好ましくは、二重変異体Ｙ４０９Ｖ及びＡ４８５Ｌである。このような好ましい酵素の一例は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能なＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種９°Ｎ ｅｘｏ Ｙ４０９Ｖ Ａ４８５Ｌである。このような適当なポリメラーゼの実例はＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５２８１−５２８５（１９９６）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２７：２４５４−２５５３（１９９９）及びＡｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０：６０５−６１３（２００２）に開示されている。
シークエンシング方法は固体支持体に配列された標的ポリヌクレオチドを用いて実施するのが好ましい。複数の標的ポリヌクレオチドをリンカー分子により固体支持体に固定することができるか、又は固体支持体材料にも付着できる粒子、例えばマイクロスフェアに付着させることができる。ビオチン・アビジン相互作用の使用などの多くの手段によりポリヌクレオチドを固体支持体に付着させることができる。ポリヌクレオチドを固体支持体に固定する方法は当分野で公知であり、そしてリソグラフィック技術及び固体支持体上の規定の位置での個々のポリヌクレオチドの「スポッティング」などが含まれる。適当な固体支持体は当分野で公知であり、そしてガラススライド及びビーズ、セラミック及びシリコン表面並びにプラスチック材料が含まれる。支持体は通常平板な表面であるが、微視的なビーズ（マイクロスフェア）を用いることもでき、そして公知の手段により今度は別の固体支持体に付着させることができる。マイクロスフェアはいずれかの適当な大きさでよく、典型的には直径１０ｎｍから１００ｎｍの範囲でよい。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドを直接平板な表面、好ましくは平板なガラス表面上に直接付着させる。共有結合による付着が好ましい。好ましくは、例えば国際出願の国際公開公報第００／０６７７０号に開示されるような、使用されるアレイが明確に光学的に分離できる部分のポリヌクレオチドを含む単一分子アレイである。
単一のポリヌクレオチド分子及び多ポリヌクレオチド分子アレイ、すなわち明確な個々のポリヌクレオチド分子のアレイ及び１つの個々のポリヌクレオチド分子の複数のコピーを含む明確な領域のアレイの双方でシークエンシング方法を実施することができる。単一の分子アレイにより各々の個々のポリヌクレオチドが別個に分離されることが可能になる。単一の分子アレイの使用が好ましい。単一分子アレイの非破壊的シークエンシングにより空間的に位置指定が可能なアレイを形成することが可能になる。
方法は重合反応を利用して標的の相補的配列を作製する。重合反応に適合する条件は当業者に明らかであろう。
ポリメラーゼ反応を行うために、通常最初にプライマー配列を標的ポリヌクレオチドにアニーリングさせる必要があり、プライマー配列はポリメラーゼ酵素により認識され、そして相補鎖の続く伸長の開始部位として作用する。プライマー配列を標的ポリヌクレオチドに関して別個の成分として添加することができる。あるいは、プライマー及び標的ポリヌクレオチドは各々１つの１本鎖分子の一部でよく、プライマー部分は標的の一部と分子内２本鎖、すなわちヘアピンループ構造を形成する。この構造を分子のいずれかの点で固体支持体に固定することができる。ポリメラーゼ反応を実施するのに必要なその他の条件には温度、ｐＨ、バッファー組成などがあり、これは当業者に明らかであろう。
次に本発明の修飾されたヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドに接触させて、重合を生じさせる。ヌクレオチドを逐次的に加える、すなわち各ヌクレオチド型（Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）の添加を別々に行うか、又は一緒に加える。これらを一緒に加える場合、各ヌクレオチド型に関して異なる標識を用いて標識するのが好ましい。
この重合工程はヌクレオチドの取り込みを可能にするのに十分な時間で進行させる。
次いで取り込まれなかったヌクレオチドを、例えばアレイを洗浄工程に供することにより除去し、そして次に取り込まれた標識の検出を行うことができる。
検出は慣用される手段でよく、例えば標識が蛍光部分である場合、走査型共焦点顕微鏡を用いてアレイの表面をレーザーで走査し、フルオロフォアの取り込まれた塩基に対する直接的な結合を撮像することにより取り込まれた塩基の検出を行うことができる。あるいは、感受性のある２−Ｄ検出器、例えば電荷結合検出器（ＣＣＤ）を用いて生じた個々のシグナルを可視化することができる。しかしながらその他の技術、例えば近接場光学顕微鏡（ＳＮＯＭ）が利用可能であり、そしてこれを高密度なアレイを撮像する場合に用いることができる。例えばＳＮＯＭを用いて、１００ｎｍ未満、例えば１０ｎｍから１０μｍの距離で離れている場合に、個々のポリヌクレオチドを区別することができる。近接場光学顕微鏡の記載に関しては、Ｍｏｙｅｒら、Ｌａｓｅｒ Ｆｏｃｕｓ Ｗｏｒｌｄ ２９：１０（１９９３）を参照のこと。ポリヌクレオチドアレイの撮像に用いるのに適当な装置は公知であり、技術的なセットアップは当業者に明らかであろう。
検出の後、リンカー及び３’ＯＨ遮断基を切断して本発明の更なる修飾ヌクレオチドの取り込みを可能にする適当な条件を用いて標識を除去することができる。適当な条件はアリル基に関して、及び「Ｚ」基脱保護に関して本明細書に記載した条件でよい。これらの条件をリンカー（切断可能な場合）及び遮断基の双方の脱保護のために提供することができる。あるいは、当分野で公知のリンカーを切断し（これはＯ−遮断基結合を切断しない）、続いて脱保護する方法を用いることによりリンカーを別個にアリル基から脱保護することができる。
本発明の範囲を限定するためではなく、本発明を説明するために提供される以下の実施例を参照して、本発明を更に理解することができる。
ヘミアミナールの保護形態としてアジドメチル基で３’ＯＨ保護した：
Figure 2006509040
３’位置でこの遮断基を担持するヌクレオチドを合成し、ＤＮＡポリメラーゼによりうまく取り込まれ、効率的に遮断することが示され、そして続いて中性の水性条件下で水溶性ホスフィン又はチオールを用いて除去され更なる伸長が可能になる。
Figure 2006509040
 ５−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシウリジン（１）
乾燥ＤＭＦ（２１ｍｌ）中５−ヨード−２’−デオキシウリジン（１．０５ｇ，２．９６ミリモル）及びＣｕＩ（１１４ｍｇ，０．６０ミリモル）の溶液にトリエチルアミン（０．９ｍｌ）を加えた。５分間攪拌した後、トリフルオロ−Ｎ−プロパ−２−イニル−アセトアミド（１．３５ｇ，９．０ミリモル）及びＰｄ（ＰＰｈ３）４（３３０ｍｇ，０．２９ミリモル）を混合物に加え、そして反応物を室温にて暗中で１６時間攪拌した。メタノール（ＭｅＯＨ）（４０ｍｌ）及び重炭酸ｄｏｗｅｘを反応混合物に加え、そして４５分間攪拌した。混合物を濾過し、そして濾過物をＭｅＯＨで洗浄し、そして溶媒を真空下除去した。粗製混合物をシリカのクロマトグラフィーにより精製し（酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）からＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ ９５：５））、わずかに黄色の結晶が得られた（７９４ｍｇ，７１％）。1H NMR (d6 ジメチルスルホキシド (DMSO) ) δ 2.13-2.17 (m, 2H, H-2'), 3.57-3.65 (m, 2H, H-5'), 3.81-3.84 (m, 1H, H-4'), 4.23-4.27 (m, 3H, H-3', CH2N), 5.13 (t, J = 5.0 Hz, 1H, OH), 5.20 (d, J = 4.3 Hz, 1H, OH), 6.13 (t, J = 6.7 Hz, 1H, H-1'), 8.23 (s, 1H, H-6), 10.11 (t, J = 5.6 Hz, 1H, NH), 11.70 (br s, 1H, NH). Mass（−ｖｅ エレクトロスプレー）Ｃ１４Ｈ１４Ｆ３Ｎ３Ｏ６に関して計算値３７７．０８，測定値３７６。
Figure 2006509040
 ５’−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−５−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシウリジン（２）
乾燥ＤＭＦ（１５ｍｌ）中（１）の溶液（６５６ｍｇ，１．７４ミリモル）に塩化ｔ−ブチルジメチルシリル（２８８ｍｇ，１．９１ミリモル）を少しずつ、続いてイミダゾール（１３０ｍｇ，１．９１ミリモル）を加えた。ＴＬＣにより反応を追跡し、室温で８時間攪拌した後、反応が完了した。飽和ＮａＣｌ水溶液で反応をクエンチした。ＥｔＯＡｃ（２５ｍｌ）を反応混合物に加え、そして水層をＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）した後、溶媒を真空下除去した。シリカでのクロマトグラフィーによる精製（ＥｔＯＡｃ：石油エーテル ８：２）でわずかに黄色の結晶として（２）（６７６ｍｇ，８３％）が得られた。1H NMR (d6 DMSO) δ 0.00 (s, 6H, CH3), 0.79 (s, 9H, tBu), 1.93 -2.00 (m, 1H, H-2'), 2.06-2.11 (m, 1H, H-2'), 3.63-3.75 (m, 2H, H-5'), 3.79-3.80 (m, 1H, H-4'), 4.12-4.14 (m, 3H, H-3', CH2N), 5.22 (d, J = 4.1 Hz, 1H, OH), 6.03 (t, J = 6.9 Hz, 1H, H-1'), 7.86 (s, 1H, H-6), 9.95 (t, J = 5.4 Hz, 1H, NH), 11.61 (br s, 1H, NH)．Mass（−ｖｅエレクトロスプレー）Ｃ２０Ｈ２８Ｆ３Ｎ３Ｏ６Ｓｉに関して計算値４９１．１７，測定値４９０．
Figure 2006509040
 ５’−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’−Ｏ−メチルチオメチル−５−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシウリジン（３）
乾燥ＤＭＦ（７ｍｌ）中（２）の溶液（１．８４ｇ，３．７ミリモル）に酢酸（３．２ｍｌ）及び無水酢酸（１０．２ｍｌ）を加えた。次いで混合物を室温で２日間攪拌した後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で反応をクエンチした。ＥｔＯＡｃ（５０ｍｌ）を加え、そして水層を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、そして乾燥（ＭｇＳＯ４）した。減圧下で溶媒を除去した後、生成物（３）をシリカでのクロマトグラフィーにより精製（ＥｔＯＡｃ：石油エーテル ８：２）し、透明な粘着性の油状物（１．８３ｇ，８９％）が得られた。1H NMR (d6 DMSO) : δ 0.00 (s, 6H, CH3), 0.79 (s, 9H, tBu), 1.96-2.06 (m, 1H, H-2'), 1.99 (s, 3H, SCH3), 2.20-2.26 (m, 1H, H-2'), 3.63-3.74 (m, 2H, H-5'), 3.92-3.95 (m, 1H, H-4'), 4.11-4.13 (m, 2H, CH2), 4.28-4.30 (m, 1H, H-3'), 4.59 (br s, 2H, CH2), 5.97 (t, J = 6.9 Hz, 1H, H-1'), 7.85 (s, 1H, H-6), 9.95 (t, J = 5.3 Hz, 1H, NH), 11.64 (s, 1H, NH)．Mass（−ｖｅエレクトロスプレー）Ｃ２２Ｈ３２Ｆ３Ｎ３Ｏ６ＳＳｉに関して計算値５５１．１７，測定値５５０．
Figure 2006509040
 ３’−Ｏ−アジドメチル−５−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシウリジン（４）
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）中（３）（３４８ｍｇ，０．６３ミリモル）及びシクロヘキセン（０．３２ｍｌ，３．２ミリモル）の溶液に４℃で塩化スルフリル（ＣＨ２Ｃｌ２中１Ｍ，０．７６ｍｌ，０．７６ミリモル）をＮ２下で滴下した。１０分後、ＴＬＣによりヌクレオシド（３）の完全な消費が示された。溶媒を蒸発させて、残渣を高真空に２０分間供した。次いでこれを乾燥ＤＭＦ（３ｍｌ）に再溶解し、そしてＮａＮ３（２０５ｍｇ，３．１５ミリモル）で処理した。得られた懸濁液を室温で２時間攪拌した。ＣＨ２Ｃｌ２で反応をクエンチし、そして有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。溶媒を除去した後、得られた黄色ゴム状物質をＴＨＦ（２ｍｌ）に再溶解し、そして室温で３０分間ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、０．５ｍｌ）で処理した。溶媒を除去し、そしてＣＨ２Ｃｌ２及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で反応液を処理した。水層をＣＨ２Ｃｌ２で３回抽出した。シリカのクロマトグラフィーによる精製（ＥｔＯＡｃ：石油エーテル １：１からＥｔＯＡｃ）で淡黄色の泡状物として（４）（１００ｍｇ，３７％）が得られた。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.15-2.26 (m, 2H, H-2'), 3.47-3.57 (m, 2H, H-5'), 3.88-3.90 (m, 1H, H-4'), 4.14 (d, J = 4.7 Hz, 2H, CH2NH), 4.24-4.27 (m, 1H, H-3'), 4.75 (s, 2H, CH2N3), 5.14 (t, J = 5.2 Hz, 1H, OH), 5.96-6.00 (m, 1H, H-1'), 8.10 (s, 1H, H-6), 10.00 (s, 1H, NHCOCF3)), 11.26 (s, 1H, NH)．
Figure 2006509040
 ビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロリン酸の調製（ＤＭＦ中０．５Ｍ）
四ナトリウム二リン酸十水和物（１．５ｇ，３．４ミリモル）を水（３４ｍｌ）に溶解し、そして溶液をＨ＋の形態のｄｏｗｅｘのカラムに適用した。カラムを水で溶出した。溶出液を冷却し（氷浴）そして攪拌したＥｔＯＨ（１４ｍｌ）中トリ−ｎ−ブチルアミン（１．６ｍｌ，６．８ミリモル）溶液に直接滴下した。溶出液のｐＨが６に上昇するまでカラムを洗浄した。エタノール水溶液を蒸発乾固し、そして次にエタノールで２回及び無水ＤＭＦで２回同時蒸発させた。残渣をＤＭＦ（６．７ｍｌ）に溶解した。淡黄色溶液を４Åモレキュラーシーブ上で保存した。
３’−Ｏ−アジドメチル−５−（３−アミノ−プロパ−１−イニル）−２’−デオキシウリジン ５’−Ｏ−ヌクレオシド三リン酸（５）
ヌクレオシド（４）及びプロトンスポンジを真空下Ｐ２Ｏ５で一晩乾燥した。リン酸トリメチル（０．５ｍｌ）中（４）の溶液（９２ｍｇ，０．２１ミリモル）及びプロトンスポンジ（９０ｍｇ，０．４２ミリモル）を４Åモレキュラーシーブを用いて１時間攪拌した。新たに蒸留したＰＯＣｌ３（２４μｌ，０．２６ミリモル）を加え、溶液を４℃で２時間攪拌した。混合物をゆっくり室温まで加温し、そしてビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロリン酸（１．７ｍｌ，０．８５ミリモル）及び無水トリ−ｎ−ブチルアミン（０．４ｍｌ，１．７ミリモル）を加えた。３分後、０．１Ｍ ＴＥＡＢ（重炭酸トリエチルアンモニウム）バッファー（１５ｍｌ）でクエンチし、そして３時間攪拌した。減圧下、水を除去し、そして得られた残渣を濃アンモニア（ρ０．８８，１５ｍｌ）に溶解し、そして室温で１６時間攪拌した。次いで反応混合物を蒸発乾固した。残渣を水に溶解し、そして溶液をＤＥＡＥ−セファデックス Ａ−２５カラムに適用した。ＴＥＡＢの直線グラジエントを用いてＭＰＬＣを行った。０．７Ｍと０．８Ｍバッファーの間で三リン酸塩が溶出した。生成物を含有する画分を合わせて蒸発乾固した。残渣を水に溶解し、そしてＨＰＬＣで更に精製した。ＨＰＬＣ：ｔｒ（５）：１８．８分（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８調製用カラム、グラジエント：３０分で５％〜３５％Ｂ、バッファーＡ ０．１Ｍ ＴＥＡＢ、バッファーＢ ＭｅＣＮ）。生成物を白色泡状物として単離した（７６ Ｏ．Ｄ．７．６マイクロモル、３．８％、ε２８０＝１００００）。1H NMR (D2O) δ 1.79 (s, CH2), 2.23-2.30; 2.44-2.50 (2 x m, 2H, H-2'), 3.85 (m, CH2NH), 4.10-4.18 (m, 2H, H-5'), 4.27 (br s, H-4'), 4.48-4.50 (m, H-3'), 4.70-4.77 (m, CH2N3), 6.21 (t, J = 6.6 Hz, H-1'), 8.32 (s, 1H, H-6). 31P NMR (D2O) δ -6.6 (m, 1P, Pγ), -10.3 (d, J = 18.4 Hz, 1P, Pα), -21.1 (m, 1P, Pβ)．Mass（−ｖｅ エレクトロスプレー）Ｃ１３Ｈ１９Ｎ６Ｏ１４Ｐ３に関して計算値５７６．０２，測定値５７５．
Figure 2006509040
 Ｃｙ−３ジスルフィドリンカー
ＤＭＦ（３００μｌ）に出発ジスルフィド（４．０ｍｇ，１３．１ マイクロモル）を溶解し、そしてジイソプロピルエチルアミン（４μＬ）をゆっくりと加えた。混合物を室温で攪拌し、そしてＤＭＦ（３００μｌ）中Ｃｙ−３色素（５ｍｇ，６．５３マイクロモル）を１０分間かけて加えた。３．５時間後、反応完了時に、減圧下、揮発物質を蒸発させ、そして粗製残渣をＺｏｒｂａｘ分析カラムＳＢ−Ｃ１８で、流速１ｍｌ／分の０．１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウムバッファー（バッファーＡ）及びＣＨ３ＣＮ（バッファーＢ）を用いて、以下のグラジエントを用いてＨＰＬＣ精製した：５分 ２％Ｂ；３１分 ５５％Ｂ；３３分 ９５％Ｂ；３７分 ９５％；３９分 ２％Ｂ；４４分 ２％Ｂ。予測されるＣｙ−３ジスルフィドリンカーを吸湿性の固体としてｔｒ：２１．８分で収率７０％（ＵＶ測定に基づく；Ｈ２Ｏ中ε５５０ １５０，０００ｃｍ−１Ｍ−１）で溶出した。1H NMR (D2O) δ 1.31-1.20 (m + t, J = 7.2 Hz, 5H, CH2+ CH3), 1.56-1.47 (m, 2H, CH2), 1.67 (s, 12H, 4 CH3), 1.79-1.74 (m, 2H, CH2), 2.11 (t, J = 6.9 Hz, 2H, CH2), 2.37 (t, J = 6.9 Hz, 2H, CH2), 2.60 (t, J = 6.3 Hz, 2H, CH2), 2.67 (t, J = 6.9 Hz, 2H, CH2), 3.27 (t, J = 6.1 Hz, 2H, CH2), 4.10-4.00 (m, 4H, 2CH2), 6.29 (dd, J = 13.1, 8.1 Hz, 2H, 2 = CH), 7.29 (dd, 2H, J = 8.4, 6.1 Hz, 2 = CH), 7.75-7.71 (m, 2H, 2 = CH), 7.78 (s, 2H, = CH), 8.42 (t, J = 12.8 Hz, 1H, = CH)．Mass（−ｖｅエレクトロスプレー）Ｃ３６Ｈ４７Ｎ３Ｏ９Ｓ４に関して計算値７９３．２２，測定値７９２（Ｍ−Ｈ），３９６［Ｍ／２］．
Figure 2006509040
 Ｃｙ−３ジスルフィドリンカー（２．５マイクロモル）、炭酸ジサクシンイミジル（０．９６ｍｇ，３．７５マイクロモル）及びＤＭＡＰ（０．４６ｍｇ，３．７５マイクロモル）を乾燥ＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶解し、室温で１０分間攪拌した。ＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２ ３：７）により全ての色素リンカーが消費されるまで反応をモニターした。次いでＤＭＦ（０．２ｍｌ）中（５）（７．５マイクロモル）及びｎ−Ｂｕ３Ｎ（３０μｌ，１２５マイクロモル）の溶液を反応混合物に加え、そして室温で１時間攪拌した。ＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２ ４：６）により、活性化されたエステルの完全な消費が示され、そして暗赤色のスポットがベースラインに現れた。反応をＴＥＡＢバッファー（０．１Ｍ，１０ｍｌ）でクエンチし、そしてＤＥＡＥ セファデックス カラム（２×５ｃｍ）に負荷した。カラムを最初に０．１Ｍ ＴＥＡＢ バッファー（１００ｍｌ）で溶出して有機残渣を洗い流し、そして次に１Ｍ ＴＥＡＢ バッファー（１００ｍｌ）で溶出した。望ましい三リン酸アナログ（６）を１Ｍ ＴＥＡＢ バッファーで溶出した。生成物を含有する画分を合わせ、蒸発させ、そしてＨＰＬＣにより精製した。ＨＰＬＣ条件：ｔｒ（６）：１６．１分（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８ 調製用カラム、グラジエント：３０分で２％〜５５％Ｂ，バッファーＡ ０．１Ｍ ＴＥＡＢ，バッファーＢ ＭｅＣＮ）。生成物を暗赤色固体として単離した（１．３５マイクロモル、５４％，ε５５０＝１５００００）．1H NMR (D2O) δ 1.17-1.28 (m, 6H 3 x CH2), 1.41-1.48 (m, 3 H, CH3), 1.64 (s, 12H, 4 x CH3), 1.68-1.71 (m, 2H, CH2), 2.07-2.10 (m, 3H, H-2', CH2), 2.31-2.35 (m, 1H, H-2'), 2.50-2.54 (m, 2H, CH2), 2.65 (t, J = 5.9 Hz, 2H, CH2), 2.76 (t, J = 7.0 Hz, 2H, CH2), 3.26-3.31 (m, 2H, CH2), 3.88-3.91 (m, 2H CH2), 3.94-4.06 (m, 3H, CH2N, H-5'), 4.16 (br s, 1H, H-4'), 4.42-4.43 (m, 1H, H-3'), 4.72-4.78 (m, 2H, CH2N3), 6.24 (dd, J = 5.8, 8.2 Hz, H-1'), 6.25 (dd, J = 3.5, 8.5 Hz, 2H, HAr), 7.24, 7.25 (2d, J = 14.8 Hz, 2 x = CH), 7.69-7.86 (m, 4H, HAr, H-6), 8.42 (t, J = 13.4 Hz, = CH)．31P NMR (D2O) δ -4.85 (m, 1P, Pγ), -9.86 (m, 1P, Pα), -20.40 (m, 1P, Pβ)．Mass（−ｖｅエレクトロスプレー）Ｃ４９Ｈ６４Ｎ９Ｏ２２Ｐ３Ｓ４に関して計算値１３５１．２３，測定値１３７２（Ｍ−２Ｈ＋Ｎａ），１２７０［Ｍ−８０］，１１９０［Ｍ−１６０］．
Figure 2006509040
 ５−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシシチジン（７）
遮光丸底フラスコでアルゴン雰囲気下、ＤＭＦ（２００ｍｌ）中５−ヨード−２’−デオキシシチジン（１０ｇ，２８．３２ミリモル）の溶液にＣｕＩ（１．０８ｇ，５．６７ミリモル）、トリエチルアミン（７．８０ｍｌ，５５．６０ミリモル）、２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−プロパ−２−イニル−アセトアミド（１２．８ｇ，８４．７６ミリモル）及び最後にＰｄ（ＰＰｈ３）４（３．２７ｇ，２．８３ミリモル）を加えた。室温で１８時間の後、重炭酸ｄｏｗｅｘ（２０ｍｇ）を加え、そして混合物を更に１時間攪拌した。濾過し、そして減圧下、揮発性物質を蒸発させて残渣を得て、これをシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した（ＣＨ２Ｃｌ２，ＣＨ２Ｃｌ２：ＥｔＯＡｃ １：１，ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ ９：１）。予測される生成物（７）が定量的な収率でベージュ色固体として得られた。1H NMR (D2O) δ 2.24-2.17 (m, 1H, H-2'), 2.41-2.37 (m, 1H, H-2'), 3.68 (dd, J = 12.5, 5.0 Hz, 1H, H-5'), 3.77 (dd, J = 12.5, 3.2 Hz, 1H, H-5'), 3.99 (m, 1H, H-4'), 4.27 (s, 2H, CH2N), 4.34 (m, 1H, H-3'), 6.11 (t, J = 6.3 Hz, 1H, H-1'), 8.1 (br s, 1H, NH); MS (ES) :m/z (%) (M-H) 375 (100)．
Figure 2006509040
 ５’−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−５−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシシチジン（８）
ＤＭＦ（３．０ｍｌ）中（７）出発原料（１．０ｇ，２．６６ミリモル）及びイミダゾール（２００ｍｇ，２．９３ミリモル）の溶液に０℃でゆっくりと１時間にわたりＴＢＤＭＳＣｌ（４４２ｍｇ，２．９３ミリモル）を４回に分けて加えた。２時間後、減圧下、揮発物質を蒸発させ、そして残渣をシリカゲルに吸収させ、そしてフラッシュクロマトグラフィーにより精製した（ＥｔＯＡｃ，ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ ９．５：０．５）。予測される生成物（８）を結晶性固体として単離した（８２６ｍｇ，６４％）。1H NMR (d6 DMSO) δ 0.00 (s, 1H, CH3); 0.01 (s, 1H, CH3), 0.79 (s, 9 H, tBu), 1.87-1.80 (m, 1H, H-2'), 2.12 (ddd, J = 13.0, 5.8 and 3.0 Hz, 1H, H-2'), 3.65 (dd, J = 11.5, 2.9 Hz, 1H, H-5'), 3.74 (dd, J = 11.5, 2.5 Hz, 1H, H-5'), 3.81-3.80 (m, 1H, H-4'), 4.10-4.09 (m, 1H, H-3'), 4.17 (d, 2H, J = 5.1 Hz, NCH2), 5.19 (d, 1H, J = 4.0 Hz, 3’-OH), 6.04 (t, J = 6.6 Hz, 1H, H-1'), 6.83 (br s, 1H, NHH), 7.78 (br s, 1H, NHH), 7.90 (s, 1H, H-6), 9.86 (t, J = 5.1 Hz, 1H, -H2CNH); MS (ES) :m/z (%) (MH)+ 491 (40%)．
Figure 2006509040
 ４−Ｎ−アセチル−５’−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’−Ｏ−（メチルチオメチル）−５−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシシチジン（９）
ＤＭＳＯ（６．３ｍｌ）中、及びＮ２雰囲気下、出発原料（８）（８２５ｍｇ，１．６８ミリモル）の溶液に酢酸（ＡｃＯＨ）（１．３ｍｌ，２３．６０ミリモル）続いて無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）（４．８ｍｌ，５０．５０ミリモル）をゆっくりと加えた。溶液を室温で１８時間攪拌し、そして０℃で飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍｌ）を添加することによりクエンチした。生成物をＥｔＯＡに抽出し（３×３０ｍｌ）、有機抽出物を合わせ、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過し、そして揮発物質を蒸発させた。粗製残渣をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し（ＥｔＯＡｃ：石油エーテル １：１）、無色油状物（９）として予測される生成物が得られた（５７３ｍｇ，６２％）。1H NMR (d6 DMSO) δ 0.00 (s, 6H, 2 x CH3), 0.78 (s, 9H, tBu), 2.01 (s, 3H, SCH3), 2.19-1.97 (m, 2H, 2 x H2'), 2.25 (s, 3H, COCH3), 3.67 (dd, 1H, J = 11.5 Hz, H-5'), 3.78 (dd, 1H, J = 11.5, 3.3 Hz, H-5'), 4.06-4.05 (m, 1H, H-4'), 4.17 (d, 2H, J = 5.1 Hz, N-CH2), 4.30-4.28 (m, 1H, H-3'), 4.63 (s, 2H, CH2-S), 5.94 (t, 1H, J = 6.5 Hz, H-1'), 8.17 (s, 1H, H-6), 9.32 (s, 1H, NHCO), 9.91 (t, 1H, J = 5.4 Hz, NHCH2); MS (ES) :m/z (%) (MH)+ 593.
Figure 2006509040
 ４−Ｎ−アセチル−３’−Ｏ−（アジドメチル）−５’−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−５−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシシチジン（１０）
Ｎ２雰囲気下、０℃まで冷却した、ジクロロメタン（ＤＣＭ）（８ｍｌ）中出発原料（９）（４７０ｍｇ，０．８５ミリモル）の溶液にシクロヘキセン（４３０μｌ，４．２７ミリモル）続いてＳＯ２Ｃｌ２（ＤＣＭ中１Ｍ，１．０ｍｌ，１．０２ミリモル）を加えた。溶液を０℃で３０分間攪拌し、そして揮発性物質を蒸発させた。残渣をＤＭＦ（８ｍｌ）に即座に溶解し、Ｎ２下で攪拌し、そしてアジ化ナトリウム（２７５ｍｇ，４．２７ミリモル）をゆっくりと加えた。１８時間後、粗製生成物を蒸発乾固し、ＥｔＯＡｃ（３０ｍｌ）に溶解し、そしてＮａ２ＣＯ３（３×５ｍｌ）で洗浄した。合わせた有機層を別に維持した。生成物の水層からの第２の抽出をＤＣＭ（３×１０ｍｌ）で行った。全ての合わせた有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過し、そして減圧下、揮発性物質を蒸発させて予測される生成物（１０）と同定される油状物が得られた（４７１ｍｇ，収率９４％）。これを更に精製することなく使用した。1H NMR (d6 DMSO) δ 0.11 (s, 3H, CH3), 0.11 (s, 3H, CH3), 0.88 (s, 9H, tBu), 2.16-2.25 (m, 1H, H-2'), 2.35 (s, 3H, COCH3), 2.47-2.58 (m, 1H, H-2'), 3.79 (dd, J = 11.6, 3.2 Hz, 1H, H-5'), 3.90 (dd, J = 11.6, 3.0 Hz, 1H, H-5'), 4.17-4.19 (m, 1H, H-4'), 4.28 (s, 2H, NCH2), 4.32-4.35 (m, 1H, H-3'), 4.89 (dd, J = 14.4, 6.0 Hz, 2H, CH2-N3), 6.05 (t, J = 6.4 Hz, 1H, H-1'), 8.25 (s, 1H, H-6), 9.46 (br s, 1H, NHH), 10.01 (br s, 1H, NHH)．
Figure 2006509040
 ４−Ｎ−アセチル−３’−Ｏ−（アジドメチル）−５−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシシチジン及び３’−Ｏ−（アジドメチル）−５−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシシチジン（１１）
０℃、Ｎ２雰囲気下、ＴＨＦ（２０ｍｌ）中出発原料（１１）（４４０ｍｇ，０．７５ミリモル）の溶液にＴＨＦ中１．０Ｍ ＴＢＡＦ（０．８２ｍｌ，０．８２ミリモル）を加えた。１．５時間後、減圧下、揮発性物質を蒸発させ、そして残渣をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した（ＥｔＯＡｃ：石油エーテル ８：２からＥｔＯＡｃ１００％からＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ ８：２）。２つの化合物を単離し、そして前記のように同定した。最初に４−Ｎ−アセチル（１１）（５３ｍｇ，１５％）を溶出し、そして２番目に４−ＮＨ２（１２）（２７１ｍｇ，８４％）を溶出した。
４−Ｎ−アセチル化合物（１１）：1H NMR (d6 DMSO) δ 1.98 (s, 3H, CH3CO), 2.14-2.20 (m, 2H, HH-2'), 3.48-3.55 (m, 1H, H-5'), 3.57-3.63 (m, 1H, H-5'), 3.96-4.00 (m, 1H, H-4'), 4.19 (d, J = 5.3 Hz, 2H, CH2-NH), 4.23-4.28 (m, 1H, H-3'), 4.77 (s, 2H, CH2-N3), 5.2 (t, 1H, J = 5.1 Hz, 5’-OH), 5.95 (t, J = 6.2 Hz, 1H, H-1'), 8.43 (s, 1H, H-6), 9.34 (s, 1H, CONH), 9.95 (t, J = 5.3 Hz, 1H, NHCH2)．
４−ＮＨ２化合物（１２）：1H NMR (d6 DMSO) δ 1.98-2.07 (2H, CHH-2'), 3.50-3.63 (m, 2H, CHH-5'), 3.96-4.00 (m, 1H, H-4'), 4.09 (d, J = 5.3 Hz, 2H, CH2-NH), 4.24-4.28 (m, 1H, H-3'), 4.76 (s, 2H, CH2-N3), 5.13 (t, J = 5.3 Hz, 1H, 5’-OH), 5.91 (br s, 1H, NHH), 6.11 (t, J = 6.4 Hz, 1H, H-1'), 8.20 (t, J = 5.3 Hz, 1H, NCH2), 8.45 (s, 1H, H-6), 11.04 (br s, 1H, NHH)．
Figure 2006509040
 ４−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−５−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシシチジン（１３）
出発原料（８）（１０ｇ，２０．４３ミリモル）を乾燥ピリジン（２×１００ｍｌ）中で共沸し、次いでＮ２雰囲気下、乾燥ピリジン（１６０ｍｌ）に溶解した。クロロトリメチルシラン（１０ｍｌ，７９．０７ミリモル）を溶液に滴下し、そして室温で２時間攪拌した。次いで塩化ベンゾイル（２．６ｍｌ，２２．４０ミリモル）を溶液に加え、そして更に１時間攪拌した。反応混合物を０℃まで冷却し、蒸留水（５０ｍｌ）を溶液にゆっくりと加え、そして３０分間攪拌した。高真空下、ピリジン及び水を混合物から蒸発させて、褐色のゲルを生じ、これを飽和ＮａＨＣＯ３水溶液１００ｍｌとＤＣＭ溶液（１００ｍｌ）間で分配した。有機層を分離し、そして水層を更にＤＣＭ（２×１００ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過し、そして減圧下、揮発性物質を蒸発させた。得られた褐色の油状物をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ ９９：１〜９５：５）、淡黄色の結晶性固体を生じた（１３）（８．９２ｇ，７４％）。1H NMR (d6 DMSO) : δ 0.00 (s, 6H, CH3), 0.78 (s, 9H, tBu), 1.94 (m, 1H, H-2'), 2.27 (m, 1H, H-2'), 3.64 (d, 1H, J = 11.6 Hz, H-5'), 3.75 (d, 1H, J = 11.6 Hz, H-5'), 3.91 (m, 1H, H-4'), 4.09 (br m, 3H, CH2NH, H-3'), 5.24 (s, 1H, 3’-OH), 6.00 (m, 1H, H-1'), 7.39 (m, 2H, Ph), 7.52 (m, 2H, Ph), 7.86 (m, 1H, Ph), 8.0 (s, 1H, H-6), 9.79 (t, 1H, J = 5.4 Hz, NHCH2), 12.67 (br s, 1H, NH)．Mass（＋ｖｅ エレクトロスプレー）Ｃ２７Ｈ３３Ｆ３Ｎ４Ｏ６Ｓｉ に関して計算値５９４．６７，測定値５９５．
Figure 2006509040
 ４−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’−Ｏ−メチルチオメチル−５−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシシチジン（１４）
Ｎ２雰囲気下、出発原料（１３）（２．８５ｇ，４．７９ミリモル）を乾燥ＤＭＳＯ（４０ｍｌ）に溶解した。酢酸（２．７ｍｌ，４７．９ミリモル）及び無水酢酸（１４．４ｍｌ，１４３．７ミリモル）を順にゆっくりと出発原料に加え、次いでこれを室温で１８時間攪拌した。飽和ＮａＨＣＯ３（１５０ｍｌ）溶液を反応混合物に注意深く加えた。水層をＥｔＯＡｃ（３×１５０ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過し、そして蒸発させて橙色の液体を得て、これを続いて原料が固化するまでトルエン（４×１５０ｍｌ）と共沸した。粗製残渣をシリカゲルで精製し（石油エーテル：ＥｔＯＡｃ ３：１〜２：１）、黄色の結晶性固体（１４）（１．５８ｇ，５０％）を生じた。1H NMR (d6 DMSO) : δ 0.00 (s, 6H, CH3), 0.78 (s, 9H, tBu), 1.99 (s, 3H, CH3), 2.09 (m, 1H, H-2'), 2.28 (m, 1H, H-2'), 3.66 (d, 1H, J = 11.5, 2.9 Hz, H-5'), 3.74 (dd, 1H, J = 11.3, 2.9 Hz, H-5'), 3.99 (m, 1H, H-4'), 4.09 (m, 1H, CH2NH), 4.29 (m, 1H, H-3'), 4.61 (s, 2H, CH2S), 6.00 (m, 1H, H-1'), 7.37 (m, 2H, Ph), 7.50 (m, 2H, Ph), 7.80 (d, 1H, J = 7.55 Hz, HAr), 7.97 (s, 1H, H-6), 9.79 (br t, 1H, NHCH2), 12.64 (br s, 1H, NH)．Mass（−ｖｅ エレクトロスプレー）Ｃ２９Ｈ３７Ｆ３Ｎ４Ｏ６ＳＳｉに関して計算値６５４．７９，測定値６５３．２．
Figure 2006509040
 ４−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’−Ｏ−アジドメチル−５−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシシチジン（１５）
出発原料（１４）１．６５ｇ，２．９９ミリモル）をＤＣＭ（１８ｍｌ）に溶解し、そして０℃まで冷却した。シクロヘキセン（１．５ｍｌ，１４．９５ミリモル）及びＳＯ２Ｃｌ２（０．７２ｍｌ，８．９７ミリモル）を加え、そして氷浴中１時間攪拌した。ＴＬＣが、出発原料が依然存在することを示したときは、ＳＯ２Ｃｌ２（０．２４ｍｌ）の更なるアリコートを加え、そして混合物を０℃で１時間攪拌した。蒸発させて揮発物質を除去し、淡褐色固体を生じ、これをＮ２下、乾燥ＤＭＦ（１８ｍｌ）１８ｍｌに再溶解した。次いでアジ化ナトリウム（０．９７ｇ，１４．９５ミリモル）を溶液に加え、そして室温で２．５時間攪拌した。反応混合物をシリカのパッドに通し、そしてＥｔＯＡｃで溶出し、そして高真空蒸発により揮発性物質を除去した。得られた褐色のゲルをフラッシュクロマトグラフィーにより精製し（石油エーテル：ＥｔＯＡｃ ４：１〜２：１）、白色の結晶性固体として所望の生成物を生じた（１５）（０．９ｇ，５５％）。1H NMR (d6 DMSO) : δ 0.00 (s, 6H, CH3), 0.78 (s, 9H, tBu), 2.16 (m, 1H, H-2'), 2.22 (m, 1H, H-2'), 3.70 (d, 1H, J = 11.5 Hz, H-5'), 3.75 (d, 1H, J = 11.3 Hz, H-5'), 4.01 (m, 1H, H-4'), 4.10 (m, 1H, CH2NH), 4.23 (m, 1H, H-3'), 4.76 (s, 2H, CH2S), 5.99 (m, 1H, H-1'), 7.37 (m, 2H, Ph), 7.50 (m, 2H, Ph), 7.81 (d, 1H, J = 7.4 Hz, Ph), 7.95 (s, 1H, H-6), 9.78 (br s, 1H, NHCH2), 12.64 (br s, 1H, NH)．Mass（−ｖｅ エレクトロスプレー）Ｃ２８Ｈ３４Ｆ３Ｎ７Ｏ６Ｓｉに関して計算値６４９．７１，測定値６４８．２
Figure 2006509040
 ４−Ｎ−ベンゾイル−３’−Ｏ−アジドメチル−５−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシシチジン（１６）
出発原料（１５）（１４０ｍｇ，０．２２ミリモル）をＴＨＦ（７．５ｍｌ）に溶解した。ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ 溶液，０．２５ｍｌ）をゆっくりと加え、そして室温で２時間攪拌した。減圧下、揮発性材料を除去し、そして褐色のゲルを生じ、これをフラッシュクロマトグラフィーにより精製し（ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ ７：３）、薄く着色した結晶性固体として所望の生成物（１６）を生じた（０．９ｇ，７６％）。1H NMR (d6 DMSO) : δ 2.16 (m, 1H, H-2'), 2.22 (m, 1H, H-2'), 3.70 (d, 1H, J = 11.5 Hz, H-5'), 3.75 (d, 1H, J = 11.3 Hz, H-5'), 4.01 (m, 1H, H-4'), 4.10 (m, 1H, CH2NH), 4.23 (m, 1H, H-3'), 4.76 (s, 2H, CH2S), 5.32 (s, 1H, 5’ OH), 5.99 (m, 1H, H-1'), 7.37 (m, 2H, Ph), 7.50 (m, 2H, Ph), 7.81 (d, 1H, J = 7.35 Hz, Ph), 7.95 (s, 1H, H-6), 9.78 (br s, 1H, NHCH2), 12.64 (br s, 1H, NH)．Mass（−ｖｅエレクトロスプレー）Ｃ２２Ｈ２０Ｆ３Ｎ７Ｏ６に関して計算値５３５．４４，測定値５３４．
Figure 2006509040
 ５−（３−アミノ−プロパ−１−イニル）−３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシシチジン ５’−Ｏ−ヌクレオシド三リン酸（１７）
ＰＯ（ＯＭｅ）３（６００μｌ）中（１１）及び（１２）（２９０ｍｇ，０．６７ミリモル）並びにプロトンスポンジ（１７５ｍｇ，０．８２ミリモル）（双方共に予めＰ２Ｏ５下、少なくとも２４時間乾燥した）の溶液に０℃でアルゴン雰囲気下、ＰＯＣｌ３（新たに蒸留した）（８２μｌ，０．８８ミリモル）をゆっくりと加えた。溶液を０℃で３時間、激しく攪拌し、そして次にＤＭＦ中二リン酸テトラ・トリブチルアンモニウム（０．５Ｍ）（５．２ｍｌ，２．６０ミリモル）、続いてｎＢｕ３Ｎ（１．２３ｍｌ，５．２０ミリモル）及び０．１Ｍ 重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）（２０ｍｌ）の添加によりクエンチした。室温で１時間の後、アンモニア水溶液（ρ０．８８，２０ｍｌ）を混合物に加えた。溶液を室温で１５分間攪拌し、減圧下、揮発性物質を蒸発させ、そして残渣をＭＰＬＣにより、０．０５Ｍから０．７Ｍ ＴＥＡＢのグラジエントで精製した。予測される三リン酸塩をおよそ０．６０Ｍ ＴＥＡＢでカラムから溶出した。Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８カラム（内径２１．２ｍｍ×２５ｃｍ）のＨＰＬＣで２回目の精製を行い、以下のグラジエント：０〜５分 ５％Ｂ，Φ．２ｍｌ；５〜２５分 ８０％Ｂ，Φ．８ｍｌ；２５〜２７分 ９５％Ｂ，Φ．８ｍｌ；２７〜３０分 ９５％Ｂ，Φ．８ｍｌ；３０−３２分 ５％Ｂ，Φ．８ｍｌ；３２〜３５分 ９５％Ｂ，Φ．２ｍｌ、を用いて０．１Ｍ ＴＥＡＢ（ポンプＡ）及び０．１Ｍ ＴＥＡＢ中３０％ＣＨ３ＣＮ（ポンプＢ）で溶出しｒｔ（１７）：２０．８（１４．５マイクロモル，収率 ２．５％）の前記の生成物が得られた；31P NMR (D2O, 162MHz) δ -5.59 (d, J = 20.1 Hz, Pc), -10.25 (d, J = 19.3 Hz, 1P, Pα), -20.96 (t, J = 19.5 Hz, 1P, Pβ); 1H NMR (D2O) δ 2.47-2.54 (m, 1H, H-2'), 2.20-2.27 (m, 1H, H-2'), 3.88 (s, 2H, CH2N), 4.04-4.12 (m, 1H, HH-5'), 4.16-4.22 (m, 1H, HH-5'), 4.24-4.30 (m, 1H, H-4'), 4.44-4.48 (m, 1H, H-3'), 6.13 (t, J = 6.3 Hz, 1H, H-1'), 8.35 (s, 1H, H-6); MS (ES) :m/z (%) (M-H) 574 (73%), 494 (100%)．
Figure 2006509040
 Ａｌｅｘａ４８８ジスルフィドリンカー
市販されているＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−ＮＨＳ（３５ｍｇ，５４マイクロモル）をＤＭＦ（７００μｌ）に溶解し、そして完全な活性化を確実にし、４−ＤＭＡＰ（７ｍｇ，５９マイクロモル）及び炭酸Ｎ，Ｎ’−ジサクシンイミジル（１５ｍｇ，５９マイクロモル）を順に加えた。１５分後、完全に活性化したときに、ジイソプロピルエチルアミン（４μｌ）含有ＤＭＦ（３００μｌ）中、出発ジスルフィド（３２．０ｍｇ，１０８マイクロモル）を活性化した色素溶液上に加えた。最終混合物にジイソプロピルエチルアミン（２０μｌ）を更に添加し、５分間超音波処理し、そして暗中室温で１８時間反応させた。減圧下、揮発性物質を蒸発させ、そして粗製残渣を短いイオン交換樹脂セファデックス−ＤＥＡＥ Ａ−２５（４０−１２０μ）カラムを通すことにより最初に精製し、最初に０．１Ｍ ＴＥＡＢ（２５ｍｌ）、次に１．０Ｍ ＴＥＡＢ（７５ｍｌ）で溶出した。２つの最終化合物を含有する最終混合物を濃縮し、そして残渣をＺｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８ カラム（内径２１．２ｍｍ×２５ｃｍ）で、０．１Ｍ ＴＥＡＢ（ポンプＡ）及びＣＨ３ＣＮ（ポンプＢ）で以下のグラジエント：０〜２分 ２％Ｂ，Φ．２ｍｌ；２〜４分 ２％Ｂ，Φ．８ｍｌ；４〜１５分 ２３％Ｂ，Φ．８ｍｌ；１５〜２４分 ２３％Ｂ，Φ．８ｍｌ；２４〜２６分 ９５％Ｂ，Φ．８ｍｌ；２６〜２８分 ９５％Ｂ，Φ．８ｍｌ、２８〜３０分 ２％Ｂ，Φ．８ｍｌ，３０〜３３分 ２％Ｂ，Φ．２ｍｌを用いて溶出してＨＰＬＣ精製し、ｔｒ：１９．０（左の位置異性体）及びｔｒ：１９．５（右の位置異性体）の前記で詳記した双方の化合物が得られた。双方の位置異性体の各々をｄｏｗｅｘイオン交換樹脂カラムに通し、各々１６．２マイクロモル及び１０．０マイクロモル、全収率６２％が得られた（純度７６％の市販されているＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−ＮＨＳに基づく）。；Ｈ２Ｏ中ε４９３＝７１，０００ｃｍ−１Ｍ−１。1H NMR (D2O) (左の位置異性体) δ 2.51 (t, J = 6.8 Hz, 2H, CH2), 2.66 (t, J = 6.8 Hz, 2H, CH2), 2.71 (t, J = 5.8 Hz, 2H, CH2), 3.43 (t, J = 5.8 Hz, 2H, CH2), 6.64 (d, J = 9.2 Hz, 2H, HAr), 6.77 (d, J = 9.2 Hz, 2H, HAr), 7.46 (s, 1H, HAr), 7.90 (dd, J = 8.1 and 1.5 Hz, 1H, HAr), 8.20 (d, J = 8.1 Hz, 1H, HAr)．1H NMR (D2O) (右の位置異性体) δ 2.67 (t, J = 6.8 Hz, 2H, CH2), 2.82 (t, J = 6.8 Hz, 2H, CH2), 2.93 (t, J = 6.1 Hz, 2H, CH2), 3.68 (t, J = 6.1 Hz, 2H, CH2), 6.72 (d, J = 9.3 Hz, 2H, HAr), 6.90 (d, J = 9.3 Hz, 2H, HAr), 7.32 (d, J = 7.9 Hz, 1H, HAr), 8.03 (dd, J = 7.9, 1.7 Hz, 1H, HAr), 8.50 (d, J = 1.8 Hz, 1H, HAr).Mass （−ｖｅエレクトロスプレー） Ｃ２６Ｈ２３Ｎ３Ｏ１２Ｓ４ ６９７．０２，測定値６９２ （Ｍ−Ｈ），３４７［Ｍ／２］．
Figure 2006509040
 ＤＭＦ（２００μｌ）中Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ジスルフィドリンカー（３．４マイクロモル，２．３７ｍｇ）の溶液に４−ＤＭＡＰ（０．７５ｍｇ，５．１マイクロモル）及び炭酸Ｎ，Ｎ’−ジサクシンイミジル（１．７０ｍｇ，５．１マイクロモル）を加えた。酸が完全に活性化するまで混合物を１５分攪拌し、次いでこれを０℃でｎＢｕ３Ｎ（４０μｌ）含有ＤＭＦ（０．３ｍｌ）中ヌクレオチド（１７）（３．４５ｍｇ，６．０マイクロモル）の溶液に加えた。混合物を３分間超音波処理し、次いで遮光して連続的に１６時間攪拌した。減圧下、揮発性物質を蒸発させ、そして残渣を最初に短いイオン交換樹脂セファデックス−ＤＥＡＥ Ａ−２５カラムを通す濾過により、最初に０．１Ｍ ＴＥＡＢ（５０ｍｌ）で溶出して精製して未反応の色素−リンカーを除去し、次いで１．０Ｍ ＴＥＡＢ（１００ｍｌ）で溶出して予測される生成物（１８）を回収した。濃縮後、残渣をＺｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８カラム（内径２１．２ｍｍ×２５ｃｍ）で０．１Ｍ ＴＥＡＢ（ポンプＡ）及びＣＨ３ＣＮ（ポンプＢ）で以下のグラジエント：０〜２分 ２％Ｂ，Φ．２ｍｌ；２〜４分 ２％Ｂ，Φ．８ｍｌ；４〜１５分 ２３％Ｂ，Φ．８ｍｌ；１５〜２４分 ２３％Ｂ，Φ．８ｍｌ；２４〜２６分 ９５％Ｂ，Φ．８ｍｌ；２６〜２８分 ９５％Ｂ，Φ．８ｍｌ、２８〜３０分 ２％Ｂ，Φ．８ｍｌ，３０〜３３分 ２％Ｂ，Φ．２ｍｌを用いて溶出してＨＰＬＣ精製し、ｒｔ（１８）１９．８（０．２６マイクロモル，ＵＶ測定に基づいて収率 １２％）の前記で詳記した生成物が得られた；λｍａｘ＝４９３ｎｍ，ε７１，０００ｃｍ−１Ｍ−１ Ｈ２Ｏ中）；31P NMR (D2O, 162MHz) δ -5.06 (d, J = 20.6 Hz, 1P, Pc), -10.25 (d, J = 19.3 Hz, 1P, Pα), -21.21 (t, J = 19.5 Hz, 1P, Pβ); 1H NMR (D2O) δ 2.09-2.17 (m, 1H, HH-2'), 2.43-2.50 (m, 1H, HH-2'), 2.61 (t, J = 6.8 Hz, 2H, H2C-S), 2.83 (2H, S-CH2), 3.68 (t, J = 6.0 Hz, 2H, ArCONCH2), 4.06 (s, 2H, CH2N), 4.08-4.17 (m, 4H, HH-5'), 4.25-4.29 (m, 1H, H-4'), 4.46-4.50 (m, 1H, H-3'), 6.09 (t, J = 6.4 Hz, 1H, H-1'), 6.88 (d, J = 9.1 Hz, 1H, HAr), 6.89 (d, J = 9.3 Hz, 1H, HAr), 7.15 (d, J = 9.3 Hz, 1H, HAr), 7.17 (d, J = 9.1 Hz, 1H, HAr), 7.64 (br s, 1H, HAr), 8.00-7.94 (m, 2H, HAr), 8.04 (s, 1H, H-6); MS (ES) :m/z (%) (M-H) 1253 (46%), (M-H+ Na)- 1275 (100%)．
Figure 2006509040
 ７−デアザ−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシグアノシン（１９）
Ｎ２下、ＤＭＦ（４０ｍｌ）中７−デアザ−７−ヨード−グアノシン（２ｇ，２．７５ミリモル）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（５８２ｍｇ，０．５５ミリモル）、ＣｕＩ（２１０ｍｇ，１．１ミリモル）、Ｅｔ３Ｎ（１．５２ｍｌ，１１ミリモル）及びプロパギルアミン（２．５ｇ，１６．５ミリモル）の懸濁液をＮ２下室温で攪拌した。アルミ箔で遮光した。ＴＬＣが出発原料の完全な消費を示した後、反応混合物を濃縮した。残渣をＭｅＯＨ（２０ｍｌ）で希釈し、そしてｄｏｗｅｘ−ＨＣＯ３ −で処理した。混合物を３０分間攪拌し、そして濾過した。溶液を濃縮し、そしてシリカゲルクロマトグラフィーで精製し（石油エーテル：ＥｔＯＡｃ ５０：５０から石油エーテル：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ ４０：４０：２０）、黄色粉末として（１９）が得られた（２．１ｇ，９２％）。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.07-2.11 (m, 1H, H-2'), 2.31-2.33 (m, 1H, H-2'), 3.49-3.53 (m, 2H, H-5'), 3.77 (br s, 1H, H-4'), 4.25 (d, J = 4.3 Hz, 2H, ≡CCH2), 4.30 (br s, 1H, H-3'), 4.95 (t, J = 5.2 Hz, 1H, 5’-OH), 5.25 (d, J = 3.4 Hz, 1H, 3’-OH), 6.27-6.31 (m, 1H, H-1'), 6.37 (s, 2H, NH2), 7.31 (s, 1H, H-8), 10.10 (br s, 1H, NHCOCF3), 10.55 (s, 1H, NH)．Mass（−ｖｅエレクトロスプレー）Ｃ１６Ｈ１６Ｆ３Ｎ５Ｏ５に関して計算値４１５，測定値４１４．
Figure 2006509040
 ５’−Ｏ−（ｔ−ブチルジフェニル）−７−デアザ−７−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシグアノシン（２０）
ピリジン（５０ｍｌ）中（１９）（２．４ｇ，５．８ミリモル）の溶液に０℃で塩化ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳＣｌ）（１．６５ｍｌ，６．３ミリモル）を滴下した。次いで反応混合物を室温まで加温した。４時間後、別のＴＢＤＰＳＣｌ（２６０μＬ，１ミリモル）を加えた。出発原料が完全に消費されるまでＴＬＣにより反応をモニターした。ＭｅＯＨ（〜５ｍｌ）で反応をクエンチし、そして蒸発乾固した。残渣をＤＣＭに溶解し、そしてＮａＨＣＯ３飽和水溶液を加えた。水層をＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、そして真空下濃縮した。シリカゲルのクロマトグラフィーによる精製（ＥｔＯＡｃからＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ ８５：１５）で黄色泡状物（２０）が得られた（３．１ｇ，８２％）。1H NMR (d6 DMSO) δ 1.07 (s, 9H, CH3), 2.19-2.23 (m, 1H, H-2'), 2.38-2.43 (m, 1H, H-2'), 3.73-3.93 (m, 2H, H-5'), 4.29 (d, J = 5.0 Hz, 2H, CH2N), 4.42-4.43 (m, 1H, H-3'), 5.41 (br s, 1H, OH), 6.37 (t, J = 6.5 Hz, H-1'), 6.45 (br s, 2H, NH2), 7.24-7.71 (m, 11H, H-8, HAr), 10.12 (t, J = 3.6 Hz, 1H, NH), 10.62 (s, 1H, H-3)．Mass（＋ｖｅエレクトロスプレー）Ｃ３２Ｈ３４Ｆ３Ｎ５Ｏ５Ｓｉに関して計算値６５３，測定値６５４．
Figure 2006509040
 ５’−Ｏ−（ｔ−ブチルジフェニル）−７−デアザ−３’−Ｏ−メチルチオールメチル−７−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシグアノシン（２１）
ＤＭＳＯ（１５ｍｌ）中（２０）の溶液（１．９７ｇ，３．０ミリモル）をＡｃ２Ｏ（８．５ｍｌ，９０ミリモル）及びＡｃＯＨ（２．４ｍｌ，４２ミリモル）と処理し、そして室温で１５時間、次いで４０℃で２時間攪拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）で希釈し、そして飽和ＮａＨＣＯ３ 水溶液（２００ｍｌ）と共に１時間攪拌した。水層をＥｔＯＡｃで２回洗浄した。有機層を合わせ、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、そして真空下濃縮した。シリカのクロマトグラフィーによる精製（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン １：１からＥｔＯＡｃ：ヘキサン：ＭｅＯＨ １０：１０：１）により黄色泡状物として（２１）が得られた（１．３ｇ，６０％）。1H NMR (CDCl3) δ 1.04 (s, 9H, CH3), 2.08 (s, 3H, SCH3), 2.19-2.35 (m, 2H, H-2), 3.67-3.71 (m, 2H, H-5'), 3.97-3.99 (m, 2H, H-4', H-3'), 4.23 (br s, 2H, CH2N), 4.58 (s, 2H, CH2S), 6.31 (dd, J = 5.7, 7.9 Hz, H-1'), 7.19-7.62 (m, 11H, H8, HAr)．Mass（＋ｖｅ エレクトロスプレー）Ｃ３４Ｈ３８Ｆ３Ｎ５Ｏ５ＳＳｉに関して計算値７１３，測定値：７１４．
Figure 2006509040
 ３’−Ｏ−アジドメチル−７−デアザ−７−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシグアノシン（２２）
ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）中（２１）（１．３ｍｇ，１．８ミリモル）、シクロヘキセン（０．９１ｍｌ，９ミリモル）の溶液に４℃でＮ２下、塩化スルフリル（ＣＨ２Ｃｌ２中１Ｍ）（１．１ｍｌ，１．１ミリモル）を滴下した。３０分後、ＴＬＣによりヌクレオシド（２２）の完全な消費が示された。蒸発させて溶媒を除去した後、次に残渣を高真空に２０分間供し、そして次にＮａＮ３（５８５ミリモル，９ミリモル）及びＤＭＦ（１０ｍｌ）で処理した。得られた懸濁液を室温で２時間攪拌した。ＣＨ２Ｃｌ２／ＮａＣｌ（１０％）で抽出し、黄色ガム状物質を得て、これを室温で２０分間、ＴＨＦ（１Ｍ，３ｍｌ）中ＴＢＡＦ及びＴＨＦ（３ｍｌ）で処理した。蒸発させて溶媒を除去し、ＥｔＯＡｃ／飽和ＮａＨＣＯ３で抽出し、続いてシリカのクロマトグラフィーにより精製し（ＥｔＯＡｃからＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ ９：１）、黄色泡状物が得られた（４２０ｍｇ，５０％）。1H NMR (d6 DMSO) : δ 2.36-2.42 (m, 1H, H-2'), 2.49-2.55 (m, 1H, H-2'), 3.57-3.59 (m, 2H, H-5'), 3.97-4.00 (m, 1H, H-4'), 4.29 (m, 2H, CH2N), 4.46-4.48 (m, 1H, H-3'), 4.92-4.96 (m, 2H, CH2N3), 5.14 (t, J = 5.4 Hz, 1H, 5’-OH), 5.96-6.00 (dd, J = 5.7, 8.7 Hz, 1H, H-1'), 6.46 (br s, 2H, NH2), 7.39 (s, 1H, H-6), 10.14 (s, 1H, NH), 10.63 (s, 1H, H-3)．
Figure 2006509040
 ３’−Ｏ−アジドメチル−７−デアザ−７−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシグアノシン ５’−Ｏ−ヌクレオシド三リン酸（２３）
四ナトリウム二リン酸十水和物（１．５ｇ，３．４ミリモル）を水（３４ｍｌ）に溶解し、そしてその溶液をＨ＋形態のｄｏｗｅｘ ５０カラムに適用した。カラムを水で洗浄した。溶出液を冷却し（氷浴）そして攪拌した、ＥｔＯＨ（１４ｍｌ）中トリ−ｎ−ブチルアミン（１．６ｍｌ，６．８ミリモル）溶液に直接滴下した。溶出液のｐＨが６まで上昇するまでカラムを洗浄した。エタノール水溶液を蒸発乾固し、そして次にエタノールで２回、そして無水ＤＭＦで２回同時蒸発させた。残渣をＤＭＦ（６．７ｍｌ）に溶解した。淡黄色溶液を４Åモレキュラーシーブ上に保存した。ヌクレオシド（２２）及びプロトンスポンジを真空下で一晩Ｐ２Ｏ５上で乾燥した。リン酸トリメチル（０．４ｍｌ）中（２２）（１０４ｍｇ，０．２２ミリモル）及びプロトンスポンジ（７１ｍｇ，０．３３ミリモル）の溶液を４Åモレキュラーシーブで１時間攪拌した。新たに蒸留したＰＯＣｌ３（２５μｌ，０．２６ミリモル）を加え、そして溶液を４℃で２時間攪拌した。混合物をゆっくりと室温まで加温し、そしてビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロリン酸（１．７６ｍｌ，０．８８ミリモル）及び無水トリ−ｎ−ブチルアミン（０．４２ｍｌ，１．７６ミリモル）を加えた。５分後、０．１Ｍ ＴＥＡＢ（重炭酸トリエチルアンモニウム）バッファー（１５ｍｌ）で反応をクエンチし、そして３時間攪拌した。減圧下、水を除去し、そして得られた残渣を濃アンモニア（ρ０．８８，１０ｍｌ）に溶解し、そして室温で１６時間攪拌した。次いで反応混合物を蒸発乾固した。残渣を水に溶解し、そして溶液をＤＥＡＥ−セファデックス Ａ−２５ カラムに適用した。０．０５Ｍ及び１Ｍ ＴＥＡＢ 各２Ｌの直線グラジエントを用いてＭＰＬＣを行った。０．７Ｍと０．８Ｍ バッファーの間で三リン酸塩を溶出した。生成物を含有する画分を合わせ、そして蒸発乾固した。残渣を水に溶解し、そしてＨＰＬＣにより更に精製した。ｔｒ（２３）＝ ２０．５分（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８調製用カラム，グラジエント：３０分で５％〜３５％Ｂ，バッファーＡ ０．１Ｍ ＴＥＡＢ，バッファーＢ ＭｅＣＮ）。白色泡状物として生成物を単離した（２２５ Ｏ．Ｄ．，２９．６ マイクロモル，１３．４％，ε２６０＝７，６００）。1H NMR (D2O) δ 2.43-2.5 (m, 2H, H-2'), 3.85 (m, 2H, CH2N), 3.97-4.07 (m, 2H, H-5'), 4.25 (br s, 1H, H-4'), 4.57 (br s, 1H, H-3'), 4.74-4.78 (m, 2H, CH2N3), 6.26-6.29 (m, 1H, H-1'), 7.41 (s, 1H, H-8)．31P-NMR (D2O) δ -8.6 (m, 1P, Pγ), -10.1 (d, J = 19.4 Hz, 1P, Pα), -21.8 (t, J = 19.4 Hz, 1P, Pβ)．Mass（−ｖｅ エレクトロスプレー）Ｃ１５Ｈ２１Ｎ８Ｏ１３Ｐ３ に関して計算値６１４，測定値６１３．
Figure 2006509040
 ＤＭＦ（０．９ｍｌ）中ジスルフィドリンカーＣｙ３（２．５マイクロモル）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（０．９５ｍｇ，５マイクロモル）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（０．６８ｍｇ，５マイクロモル）及びＮ−メチルモルホリン（０．５５μＬ，５マイクロモル）の混合物を室温で１時間攪拌した。水０．１ｍｌ中（２３）の溶液（４４ Ｏ．Ｄ．，３．７５マイクロモル）を４℃で反応混合物に加え、そして室温で３時間放置した。ＴＥＡＢバッファー（０．１Ｍ，１０ｍｌ）で反応をクエンチし、ＤＥＡＥ セファデックスカラム（２×５ｃｍ）に負荷した。最初に０．１Ｍ ＴＥＡＢバッファー（１００ｍｌ）で、そして次に１Ｍ ＴＥＡＢバッファー（１００ｍｌ）で溶出した。所望の三リン酸生成物を１Ｍ ＴＥＡＢバッファーで溶出した。生成物を含有する画分を濃縮し、そしてＨＰＬＣに適用した。ｔｒ（２４）＝２３．８分（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８調製用カラム，グラジエント：３０分で５％〜５５％Ｂ，バッファーＡ ０．１Ｍ ＴＥＡＢ，バッファーＢＭｅＣＮ）。生成物を赤色泡状物として単離した（０．５マイクロモル，２０％，εｍａｘ＝１５０，０００）。1H NMR (D2O) δ 1.17-1.71 (m, 20H, 4 x CH2, 4 x CH3), 2.07-2.15 (m, 1H, H-2'), 2.21-2.30 (m, 1H, H-2'), 2.52-2.58 (m, 2H, CH2), 2.66-2.68 (m, 2H, CH2), 2.72-2.76 (m, 2H, CH2), 3.08-3.19 (m, 2H, CH2), 3.81-3.93 (m, 6H, CH2, H-5'), 4.08-4.16 (m, 1H, H-4'), 4.45-4.47 (m, 1H, H-3'), 4.70-4.79 (m, 2H, CH2N3), 6.05-6.08 (m, 2H, HAr), 6.15-6.18 (m, 1H, H-1'), 7.11 (s, 1H, H-8), 7.09-7.18 (m, 2H, CH), 7.63-7.72 (m, 4H, HAr), 8.27-8.29 (m, 1H, CH)．31P NMR (D2O) δ -4.7 (m, 1P, Pγ), -9.8 (m, 1P, Pα), -19.7 (m, 1P, Pβ)．Mass（−ｖｅエレクトロスプレー）Ｃ５１Ｈ６６Ｎ１１Ｏ２１Ｐ３Ｓ４に関して計算値１３８９．２５，測定値１３８８（Ｍ−Ｈ），６９４［Ｍ−２Ｈ］，４６２［Ｍ−３Ｈ］．
Figure 2006509040
 ７−デアザ−７−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシアデノシン（２５）
乾燥ＤＭＦ（２０ｍｌ）中７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン（１ｇ，２．６５ミリモル）及びＣｕＩ（１００ｍｇ，０．５３ミリモル）の懸濁液にトリエチルアミン（７４０μｌ，５．３ミリモル）を加えた。５分間攪拌した後、トリフルオロ−Ｎ−プロパ−２−イニル−アセトアミド（１．２ｇ，７．９５ミリモル）及びＰｄ（ＰＰｈ３）４（３０８ｍｇ，０．２６ミリモル）を混合物に加え、そして反応物を室温で暗中、１６時間攪拌した。ＭｅＯＨ（４０ｍｌ）及び重炭酸ｄｏｗｅｘを反応混合物に加え、そして４５分間攪拌した。混合物を濾過した。濾液をＭｅＯＨで洗浄し、そして溶媒を真空下除去した。粗製混合物をシリカのクロマトグラフィーにより精製し（ＥｔＯＡｃからＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ ９５：２０）、わずかに黄色の粉末が得られた（２５）（１．０ｇ，９５％）。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.11-2.19 (m, 1H, H-2'), 2.40-2.46 (m, 1H, H-2'), 3.44-3.58 (m, 2H, H-5'), 3.80 (m, 1H, H-4'), 4.29 (m, 3H, H-3', CH2N), 5.07 (t, J = 5.5 Hz, 1H, OH), 5.26 (d, J = 4.0 Hz, 1H, OH), 6.45 (dd, J = 6.1, 8.1 Hz, 1H, H-1'), 7.74 (s, 1H, H-8), 8.09 (s, 1H, H-2), 10.09 (t, J = 5.3 Hz, 1H, NH)．
Figure 2006509040
 ５’−Ｏ−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−７−デアザ−７−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシアデノシン（２６）
ヌクレオシド（２５）（１．１３ｇ，２．８２ミリモル）を乾燥ピリミジン（２×１０ｍｌ）中で２回同時蒸発させ、そして乾燥ピリジン（１８ｍｌ）に溶解した。この溶液に塩化ｔ−ブチルジフェニルシリル（７４８μｌ，２．８７ミリモル）を０℃で少しずつ加えた。反応混合物を室温まで加温し、そして一晩攪拌した。飽和ＮａＣｌ水溶液で反応をクエンチした。ＥｔＯＡｃ（２５ｍｌ）を反応混合物に加え、そして水層をＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥（ＭｇＳＯ４）した後、真空下、溶媒を除去した。シリカのクロマトグラフィーによる精製（ＤＣＭ、次いでＥｔＯＡｃからＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ ８５：１５）によりわずかに黄色の粉末として（２６）が得られた（１．７６ｇ，９７％）。1H NMR (d6 DMSO) δ 1.03 (s, 9H, tBu), 2.25-2.32 (m, 1H, H-2'), 2.06-2.47 (m, 1H, H-2'), 3.71-3.90 (m, 2H, H-5'), 3.90-3.96 (m, 1H, H-4'), 4.32 (m, 2H, CH2N), 4.46 (m, 1H, H-3'), 5.42 (br s, 1H, OH), 6.53 (t, J = 6.7 Hz, 1H, H-1'), 7.38-7.64 (m, 11H, H-8 and HAr), 8.16 (s, 1H, H-2), 10.12 (t, J = 5.3 Hz, 1H, NH)．
Figure 2006509040
 ５’−Ｏ−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−７−デアザ−４−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルマジン−７−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシアデノシン（２７）
ヌクレオシド（２６）の溶液（８３１ｍｇ，１．３０ミリモル）をＭｅＯＨ：Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタール（３０ｍｌ：３ｍｌ）に溶解し、そして４０℃で攪拌した。反応をＴＬＣによりモニターし、１時間後に反応は完了した。真空下溶媒を除去した。シリカのクロマトグラフィーによる精製により．（ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ ９５：５）わずかに褐色の粉末として（２７）が得られた（７７７ｍｇ，８６％）。1H NMR (d6 DMSO) δ 0.99 (s, 9H, tBu), 2.22-2.29 (m, 1H, H-2'), 2.50-2.59 (m, 1H, H-2'), 3.13 (s.3H, CH3), 3.18 (s.3H, CH3), 3.68-3.87 (m, 2H, H-5'), 3.88-3.92 (m, 1H, H-4'), 4.25 (m, 2H, CH2N), 4.43 (m, 1H, H-3'), 6.56 (t, J = 6.6 Hz, 1H, H-1'), 7.36-7.65 (m, 10H, HAr), 7.71 (s, 1H, H-8), 8.33 (s, 1H, CH), 8.8 (s, 1H, H-2), 10.12 (t, J = 5.3 Hz, 1H, NH)．
Figure 2006509040
 ５’−Ｏ−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−７−デアザ−４−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルマジン−３’−Ｏ−メチルチオメトキシ−７−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシアデノシン（２８）
乾燥ＤＭＳＯ（８ｍｌ）中（２７）の溶液（６２３ｍｇ，０．８９ミリモル）に酢酸（７７５μｌ，１３．３５ミリモル）及び無水酢酸（２．５４ｍｌ，２６．７ミリモル）を加えた。混合物を室温で一晩攪拌した。次いで反応物をＥｔＯＡｃ及び飽和ＮａＨＣＯ３（１：１）溶液に注ぎ、そして激しく攪拌した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で１回以上洗浄し、そしてＭｇＳＯ４上で乾燥した。減圧下、溶媒を除去した後、シリカのクロマトグラフィーにより生成物（２８）を精製し（ＥｔＯＡｃ：石油エーテル １：２、次いでＥｔＯＡｃ）（２８）を生じた（３５０ｍｇ，５２％）。1H NMR (d6 DMSO) : δ , 1.0 (s, 9H, tBu), 2.09 (s, 3H, SCH3), 2.41-2.48 (m, 1H, H-2'), 2.64-2.72 (m, 1H, H-2'), 3.12 (s, 3H, CH3), 3.17 (s, 3H, CH3), 3.66-3.89 (m, 2H, H-5'), 4.04 (m, 1H, H-4'), 4.26 (m, J = 5.6 Hz, 2H, CH2), 4.67 (m, 1H, H-3'), 4.74 (br s, 2H, CH2), 6.49 (t, J = 6.1, 8.1 Hz, 1H, H-1'), 7.37-7.48 (m, 5H, HAr), 7.58-7.67 (m, 5H, HAr), 7.76 (s, 1H, H-8), 8.30 (s, 1H, CH), 8.79 (s, 1H, H-2), 10.05 (t, J = 5.6 Hz, 1H, NH)．
Figure 2006509040
 ３’−Ｏ−アジドメチル−５’−Ｏ−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−７−デアザ−４−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルマジン−７−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシアデノシン（２９）
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）中（２８）（２００ｍｇ，０．２６ミリモル）及びシクロヘキセン（０．１３５ｍｌ，１．３ミリモル）の溶液にＮ２下、０℃で塩化スルフリル（３２μｌ，０．３９ミリモル）を加えた。１０分後、ＴＬＣによりヌクレオシド（２８）の完全な消費が示された。溶媒を蒸発させ、そして残渣を２０分間高真空に供した。次いでこれを乾燥ＤＭＦ（３ｍｌ）に溶解し、０℃まで冷却し、そしてＮａＮ３（８６ｍｇ，１．３ミリモル）で処理した。得られた懸濁液を室温で３時間攪拌した。反応物をＥｔＯＡｃ及び水で分配した。水層をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層の抽出物を合わせ、そして乾燥（ＭｇＳＯ４）した。減圧下、溶媒を除去した後、混合物をシリカのクロマトグラフィーにより精製し（ＥｔＯＡｃ）、油状物（２９）が得られた（１５５ｍｇ，８０％）。1H NMR (d6 DMSO) : δ 0.99 (s, 9H, tBu), 2.45-2.50 (m, 1H, H-2'), 2.69-2.78 (m, 1H, H-2'), 3.12 (s, 3H, CH3), 3.17 (s, 3H, CH3), 3.67-3.88 (m, 2H, H-5'), 4.06 (m, 1H, H-4'), 4.25 (m, 2H, CH2), 4.61 (m, 1H, H-3'), 4.84-4.97 (m, 2H, CH2), 6.58 (t, J = 6.6 Hz, 1H, H-1'), 7.35-7.47 (m, 5H, HAr), 7.58-7.65 (m, 5H, HAr), 7.77 (s, 1H, H-8), 8.30 (s, 1H, CH), 8.79 (s, 1H, H-2), 10.05 (br s, 1H, NH)．
Figure 2006509040
 ３’−Ｏ−アジドメチル−７−デアザ−４−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルマジン−７−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシアデノシン（３０）
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（３ｍｌ）中（２９）の溶液（１５５ｍｇ，０．２０７ミリモル）を０℃でＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ，２２８μｌ）で処理した。次いで氷浴をはずし、そして反応混合物を室温で攪拌した。２時間後、ＴＬＣによりヌクレオシドの完全な消費が示された。溶媒を除去した。シリカのクロマトグラフィーによる精製により（ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ ９５：５）、淡褐色油状物として（３０）（８６ｍｇ，８２％）が得られた。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.40-2.48 (dd, J = 8.1 , 13.6 Hz, 1H, H-2'), 2.59-2.68 (dd, J = 8.3, 14 Hz, 1H, H-2'), 3.12 (s, 3H, CH3), 3.17 (s, 3H, CH3), 3.52-3.62 (m, 2H, H-5'), 4.02 (m, 1H, H-4'), 4.28 (d, J = 5.6 Hz, 2H, CH2NH), 4.47 (m, 1H, H-3'), 4.89 (s, 2H, CH2N3), 5.19 (t, J = 5.6 Hz, 1H, OH), 6.49 (dd, J = 8.1, 8.7 Hz, 1H, H-1'), 7.88 (s, 1H, H-8), 8.34 (s, 1H, CH), 8.80 (s, 1H, H-2), 10.08 (s, 1H, NH)．
Figure 2006509040
 ７−（３−アミノプロパ−１−イニル）−３’−Ｏ−アジドメチル−７−デアザ−２’−デオキシアデノシン ５’−Ｏ−ヌクレオシド三リン酸（３１）
ヌクレオシド（３０）及びプロトンスポンジを真空下で一晩、Ｐ２Ｏ５上で乾燥した。リン酸トリメチル（９８０μｌ）中（３０）（１５０ｍｇ，０．２９４ミリモル）及びプロトンスポンジ（１２６ｍｇ，０．５８８ミリモル）の溶液を４Åモレキュラーシーブで１時間攪拌した。新たに蒸留したＰＯＣｌ３（３６μｌ，０．３８８ミリモル）を加え、そして溶液を４℃で２時間攪拌した。混合物をゆっくりと室温まで加温し、そしてＤＭＦ中０．５Ｍビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロリン酸溶液（２．３５ｍｌ，１．１７ミリモル）及び無水トリ−ｎ−ブチルアミン（５６０μｌ，２．３５ミリモル）を加えた。５分後、０．１Ｍ ＴＥＡＢ（重炭酸トリエチルアンモニウム）バッファー（１５ｍｌ）で反応をクエンチし、そして３時間攪拌した。減圧下、水を除去し、そして得られた残渣を濃アンモニア（ρ０．８８，１５ｍｌ）に溶解し、室温で１６時間攪拌した。次いで反応混合物を蒸発乾固した。残渣を水に溶解し、そして溶液をＤＥＡＥ−セファデックス Ａ−２５カラムに適用した。０．０５Ｍ から１Ｍ ＴＥＡＢの直線グラジエントでＭＰＬＣを行った。生成物を含有する画分を合わせ、そして蒸発乾固した。残渣を水に溶解し、そしてＨＰＬＣで更に精製した。ＨＰＬＣ：ｔｒ（３１）：１９．９４分（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８調製用カラム，グラジエント：２０分で５％〜３５％Ｂ，バッファーＡ ０．１Ｍ ＴＥＡＢ，バッファーＢ ＭｅＣＮ）。生成物（３１）を白色泡状物として単離した（１７．５ マイクロモル，５．９％，ε２８０＝１５０００）。1H NMR (D2O) δ 2.67-2.84 (2m, 2H, H-2'), 4.14 (m, 2H, CH2NH), 4.17-4.36 (m, 2H, H-5'), 4.52 (br s, H-4'), 6.73 (t, J = 6.6 Hz, H-1'), 8.06 (s, 1H, H-8), 8.19 (s, 1H, H-2)． 31P NMR (D2O) δ -5.07 (d, J = 21.8 Hz, 1P, Pγ), -10.19 (d, J = 19.8 Hz, 1P, Pα), -21.32 (t, J = 19.8 Hz, 1P, Pβ)．Mass（−ｖｅ エレクトロスプレー）Ｃ１５Ｈ２１Ｎ８Ｏ１２Ｐ３ に関して計算値５９８．０５，測定値５９６．
Figure 2006509040
 ＤＭＦ（４５０μｌ）中Ｃｙ３ジスルフィドリンカー（１．３ マイクロモル）の溶液中にＤＭＦ中１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物及びＮ−メチルモルホリン（各２６μＭ）の混合物５０μｌを０℃で加えた。反応混合物を室温で１時間攪拌した。全ての色素リンカーが消費されるまでＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２ ３：７）により反応をモニターした。次いでＤＭＦ（４００μｌ）を０℃で加え、続いてヌクレオチド（３１）（１．２ マイクロモル）を水溶液（１００μｌ）で加え、そして反応混合物を室温で一晩攪拌した。ＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２ ４：６）により活性化されたエステルの完全な消費が示され、そしてベースラインに暗赤色スポットが現れた。ＴＥＡＢバッファー（０．１Ｍ，１０ｍｌ）により反応をクエンチし、そしてＤＥＡＥ セファデックスカラム（２×５ｃｍ）に負荷した。カラムを最初に０．１Ｍ ＴＥＡＢバッファー（１００ｍｌ）で溶出し、そして有機残渣を洗い流し、そして次に１Ｍ ＴＥＡＢバッファー（１００ｍｌ）で溶出した。所望の三リン酸塩（３２）が１Ｍ ＴＥＡＢバッファーで溶出された。生成物を含有する画分を合わせ、蒸発させ、そしてＨＰＬＣにより精製した。ＨＰＬＣ条件：ｔｒ（２４）：２２．４４分（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８調製用カラム，グラジエント：２０分で ５％〜３５％Ｂ，バッファーＡ ０．１Ｍ ＴＥＡＢ，バッファーＢＭｅＣＮ）。生成物を暗桃色固体として単離した（０．１５ マイクロモル，１２．５％，ε５５０＝１５００００）。1H NMR (D2O) δ 2.03 (t, 2H, CH2), 2.25 (m, 1H, H-2'), 2.43 (m, 1H, H-2'), 2.50 (m, 2H, CH2), 2.66 (m, 2H, CH2), 3.79 (m, 2H CH2), 3.99 (m, 4H, CH2N, H-5'), 4.18 (br s, 1H, H-4'), 6.02, 6.17 (2d, J = 13.64 Hz, 2H, HAr), 6.30 (dd, J = 6.06, 8.58 Hz, H-1'), 7.08, 7.22 (2d, 2H, 2 x = CH), 7.58-7.82 (m, 5H, HAr, H-2, H-8), 8.29 (m, = CH)．31P NMR (D2O) δ -4.83 (m, 1P, Pγ), -10.06 (m, 1P, Pα), -20.72 (m, 1P, Pβ)．
３’−アジドメチル ｄＮＴＰの酵素取り込み
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０及び４ｍＭ ＭｇＳＯ４中１００ｎＭ ＤＮＡプライマー／鋳型（予めＰ３２及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識したプライマー）に、２μＭ 化合物６及び１００ｎＭ ポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種 ９°Ｎ ｅｘｏ −Ｙ４０９Ｖ Ａ４８５Ｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓより入手）を加えた。遮断の影響を示すため、鋳型は１０個のアデニン塩基の並びから成る。反応液を６５℃で１０分間加熱する。完全な遮断を示すために、４つの元来の遮断されていないヌクレオシド三リン酸で追跡を行う。単一のアジドメチル遮断されたｄＴＴＰの定量的な取り込みを観察することができ、そしてアジドメチル基が更なる取り込みに対する有効な遮断として作用することを示すことができる。
ヘアピンＤＮＡ（共有結合した自己相補的プライマー／鋳型）をストレプトアビジンビーズに付着させることにより、図５及び６で示すように、反応を複数のサイクルで実施することができる。
ストレプトアビジンビーズの調製
保存バッファーを除去し、そしてビーズをＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）及び１ｍＭ ＥＤＴＡ）で３回洗浄する。Ｂ＆Ｗバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び２．０Ｍ ＮａＣｌ）に再懸濁し、そして適当な突出鋳型配列を有するビオチン化３２Ｐ標識ヘアピンＤＮＡを加える。室温で１５分間放置する。バッファーを除去し、そしてビーズをバッファーで３回洗浄する。
完全に機能化されたヌクレオシド三リン酸（ＦＦＮ）の取り込み
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、４ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．４ｍＭ ＭｎＣｌ２、（サイクル１（０．２ｍＭ）を除く）の溶液に２μＭ ＦＦＮ及び１００ｎＭ ポリメラーゼを加える。次いでこの溶液をビーズに加え、そして十分に混合し、そして６５℃で１０〜１５分間インキュベートする。反応混合物を除去し、そしてビーズをＴＥバッファーで３回洗浄する。
脱遮断工程
トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン三ナトリウム塩（ＴＣＥＰ）（０．１Ｍ）をビーズに加え、そして十分に混合する。次いで混合物を６５℃で１５分間インキュベートした。脱遮断溶液を除去し、そしてビーズをＴＥバッファーで３回洗浄する。
キャッピング工程
０．１ｍＭ リン酸塩（ｐＨ６．５）中ヨードアセトアミド（４３１ｍＭ）をビーズに加え、そして十分に混合し、次いでこれを室温で５分間放置する。キャッピング溶液を除去し、そしてビーズをＴＥバッファーで３回洗浄する。
必要に応じて反復
ビーズ溶液を標準的な１２％ポリアクリルアミド ＤＮＡシークエンシングゲルのウェルの４０％ホルムアミド負荷バッファー中に配置することにより反応生成物を分析することができる。変性条件下でゲルを作動させ、ＤＮＡをビーズからゲル上に放出させる。ＤＮＡバンドシフトは色素の存在及び余分なヌクレオチドの添加の双方により影響を受け、そして、ホスフィンによる色素（及び遮断基）の切断によりゲル上での移動度のシフトが引き起こされる。
化合物１８（Ｃ）、２４（Ｇ）及び３２（Ａ）の取り込みの２サイクル並びに化合物６での６サイクルを図５及び図６で示す。
アリル基での３’−ＯＨ保護：
Figure 2006509040
 ３’位置でこの遮断基を担持するヌクレオチドが合成され、ＤＮＡポリメラーゼによる取り込みの成功、有効な遮断が示され、そして続いて水溶性ホスフィン又はチオールを用いて中性の水性条件下で除去することができ、更なる伸長が可能になる。
Figure 2006509040
 ５’−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（３３）
乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）７０ｍｌ中５−ヨード−２’−デオキシウリジン（５．０ｇ，１４ミリモル）の溶液にイミダゾール（１．０９ｇ，１６ミリモル）、続いてＴＢＤＭＳＣｌ（２．４１ｇ，１６ミリモル）を０℃で加えた。混合物を氷浴中に置き、そして一晩攪拌した。反応物を飽和ＮａＣｌ水溶液でクエンチし、そしてＥｔＯＡｃで抽出した。乾燥（ＭｇＳＯ４）後、溶媒を除去し、そして粗製混合物をシリカのクロマトグラフィーにより精製した（ＥｔＯＡｃ：石油エーテル ３：７）。無色固体として生成物（３３）（５．９ｇ，９０％）が得られた。1H NMR (d6 DMSO) δ 0.00 (s, 3H, CH3), 0.79 (s, 9H, tBu), 1.88-1.97 (m, 1H, H-2'), 2.00-2.05 (m, 1H, H-2'), 3.59-3.71 (m, 2H, H-5'), 3.75 (br s, 1H, H-4'), 4.06 (br s, 1H, H-3'), 5.18 (d, J = 4.0 Hz, 1H, OH), 5.98 (t, J = 5.9 Hz, 1H, H-1'), 7.89 (s, 1H, H-6), 11.62 (s, 1H, NH)．Mass（−ｖｅ エレクトロスプレー）Ｃ１５Ｈ２５ＩＮ２Ｏ５Ｓｉに関して計算値４６８．０６ 測定値４６７．
Figure 2006509040
３’−Ｏ−アリル−５’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（３４）
乾燥ＴＨＦ（２０ｍｌ）中ＮａＨの懸濁液（４９７ｍｇ，１２．４ミリモル，鉱物油中６０％）に乾燥ＴＨＦ（５０ｍｌ）中５’−ＴＢＤＭＳ保護した５−ヨード−２’−デオキシウリジン（２．８ｇ，５．９ミリモル）の溶液を滴下した。気体発生が停止した後、混合物を更に１０分間攪拌し、そして次に臭化アリル（５６１μｌ，６．５ミリモル）を滴下した。添加が完了した後、乳白色の反応混合物を室温で１６時間攪拌した。飽和ＮａＣｌ水溶液（３０ｍｌ）の添加により反応をクエンチし、ＥｔＯＡｃを用いて水層を３回抽出し、そして飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した後、有機層を乾燥（ＭｇＳＯ４）した。溶媒を除去した後、粗製生成物をクロマトグラフィーにより精製した（ＥｔＯＡｃ：石油エーテル １：１）。無色泡状物としてアリル化生成物（２．３９ｇ，８０％）が得られた。1H NMR (d6 DMSO) δ -0.01 (s, 3H, CH3), 0.78 (s, 9H, tBu), 1.94-2.01 (m, 1H, H-2'), 2.16-2.21 (m, 1H, H-2'), 3.61-3.71 (m, 2H, H-5'), 3.87-3.94 (m, 4H, H-3', H-4', OCH2), 5.04 (dd, J = 1.6, 10.4 Hz, 1H, = CH2), 5.15 (dd, J = 1.8, 17.3 Hz, 1H, = CH2), 5.72-5.81 (m, 1H, CH = ), 5.92 (t, J = 5.7 Hz, 1H, H-1'), 7.88 (s, 1H, 6-H), 11.6 (s, 1H, NH)．Mass（−ｖｅエレクトロスプレー）Ｃ１８Ｈ２９ＩＮ２Ｏ５Ｓｉに関して計算値５０８．０９，測定値５０７．
Figure 2006509040
 ３’−Ｏ−アリル−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（３５）
乾燥ＴＨＦ中（３４）の溶液（２．３４ｇ，４．７１ミリモル）にＴＢＡＦ（５．２ｍｌ，５．２ミリモル，ＴＨＦ中 １Ｍ 溶液）を０℃で加えた。反応混合物を室温まで加温し、そして次に１６時間攪拌した。飽和ＮａＣｌ溶液（２０ｍｌ）の添加により反応をクエンチし、そしてＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機層を合わせてＭｇＳＯ４で乾燥した。粗製混合物をシリカのクロマトグラフィーにより精製した（ＥｔＯＡｃ：石油 ７：３）。生成物（３５）（１．４ｇ，７５％）を無色固体として単離した。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.02-2.39 (m, 2H, H-2'), 3.42-3.52 (m, 2H, H-5'), 3.84-3.88 (m, 3H, H-4', CH2], 3.97-4.00 (m, 1H, H-3'), 5.02-5.09 (m, 2H, OH, = CH2), (dd, J = 1.9, 17.3 Hz, 1H, = CH2), 5.73-5.82 (m, 1H, CH = ), 5.94 (t, J = 6.8 Hz, 1H, H-1'), 8.24 (s, 1H, H-6), 11.56 (s, 1H, NH)．Mass（−ｖｅエレクトロスプレー）Ｃ１２Ｈ１６ＩＮ２Ｏ５に関して計算値３９４．０ 測定値３９３．
Figure 2006509040
 ３’−Ｏ−アリル−５−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシウリジン（３６）
乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）中（３５）（４００ｍｇ，１．０ミリモル）の溶液にＣｕＩ（３８ｍｇ，２０マイクロモル）及びトリエチルアミン（３００μｌ，２．０ミリモル）を加えた。プロパルギルトリフルオロアセトアミド（４５３ｍｇ，３．０ミリモル）を滴下し、続いてＰｄ（ＰＰｈ３）４（１１０ｍｇ，９．５マイクロモル）を加えた。反応物を暗中で１６時間攪拌した。ＭｅＯＨ（１０ｍｌ）、ＤＣＭ（１０ｍｌ）及び重炭酸ｄｏｗｅｘを添加して反応をクエンチした。混合物を３０分間攪拌し、そして次に濾過した。真空下溶媒を除去し、そしてシリカのクロマトグラフィーにより粗製生成物を精製した（ＥｔＯＡｃ：石油 ３：７〜７：３）。生成物をわずかに黄色の結晶として単離した（３９８ｍｇ，９５％）。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.25-2.43 (m, 2H, H-2'), 3.65-3.76 (m, 2H, H-5'), 4.07-4.17 (m, 3H, H-4', CH2), 4.21-4.23 (m, 1H, H-3'), 4.34 (d, J = 5.5 Hz, 2H, CH2N), 5.25-5.27 (m, 2H, = CH2, OH), 5.38 (dd, J = 1.83, 17.3 Hz, 1H, = CH2), 5.96-6.06 (m, 1H, = CH), 6.17 (t, J = 6.9 Hz, 1H, H-1'), 8.29 (s, 1H, H-6), 10.17 (t, J = 5.5 Hz, 1H, NHTFA), 11.78 (s, 1H, NH)．Mass（−ｖｅ エレクトロスプレー）Ｃ１７Ｈ１８Ｆ３Ｎ３Ｏ６ に関して計算値４１７．１１，測定値４１６．
Figure 2006509040
 ３’−Ｏ−アリル−５−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシウリジン ５’−Ｏ−ヌクレオシド三リン酸（３７）
窒素下で、双方共に真空下Ｐ２Ｏ５上で２４時間乾燥した（３６）（１００ｍｇ，０．２４ミリモル）及びプロトンスポンジ（６１．５ｍｇ，０．２８ミリモル）をＯＰ（ＯＭｅ）３（２２５μｌ）に溶解した。０℃で新たに蒸留したＰＯＣｌ３を滴下し、そして混合物を１．５時間攪拌した。次いでピロリン酸塩（１．４４ｍｌ，０．７２マイクロモル，ＤＭＦ中０．５Ｍ）及びｎＢｕ３Ｎ（０．３６ｍｌ，１．５ミリモル）を加え、そして得られた混合物を更に１．５時間攪拌した。重炭酸トリエチルアンモニウム溶液（４．５ｍｌ，０．１Ｍ溶液，ＴＥＡＢ）を加え、そして反応混合物を２時間攪拌した。次いでＮＨ３水溶液（４．５ｍｌ）を加え、そして混合物を１６時間攪拌した。溶媒を除去して乾燥した後、残渣を水に再溶解し、濾過し、そしてＭＰＬＣで精製し、続いてＨＰＬＣ精製した。無色泡状物として望ましい三リン酸塩（３７）（１０．２マイクロモル，４％，ε２８０＝１００００）を単離した。ＭＰＬＣ条件：ＤＥＡＥ セファデックスカラムで０．０５Ｍ ＴＥＡＢから０．７Ｍ ＴＥＡＢ、各々２ｌを用いてグラジエントを実行した。生成物を含有する画分は〜０．４Ｍ ＴＥＡＢで溶出される。溶媒を除去した後、生成物をＨＰＬＣ精製した。ＨＰＬＣ条件：ｔｒ（三リン酸）：２１．９分（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ−１８調製用カラム、バッファーＡ ０．１Ｍ ＴＥＡＢ、バッファーＢ ０．１Ｍ ＴＥＡＢ＋３０％アセトニトリル、グラジエント ３５分で５−３５％バッファーＢ）。1H NMR (D2O) δ 2.17-2.23 (m, 1H, H-2'), 2.40-2.45 (m, 1H, H-2'), 3.67 (s, 2H, CH2N), 3.99 (d, J = 5.9 Hz, 2H, OCH2), 4.02-4.17 (m, 2H, H-5'), 4.25 (br s, 1H, H-4'), 4.32-4.33 (m, 1H, H-3'), 5.13 (d, J = 10.3 Hz, 1H, = CH2), 5.23 (d, J = 17.2 Hz, 1H, = CH2), 5.78-5.88 (m.1H, = CH), 6.16 (t, J = 6.7 Hz, 1H, H-1'), 8.33 (s, 1H, H-6)．31P NMR (161.9MHz, D2O) δ -21.3 (t, J = 19.5 Hz, 1P, Pγ), -10.3 (d, J = 19 Hz, 1P, Pα), -7.1 (d, J = 15.5 Hz, 1P, Pβ)．Mass（−ｖｅ エレクトロスプレー）Ｃ１５Ｈ２２Ｎ３Ｏ１４Ｐ３ に関して計算値５６１．０３，測定値５６０，４８０［Ｍ−リン酸］，４０１［Ｍ−２ｘリン酸］．
Figure 2006509040
 ＤＭＦ（０．２ｍｌ）中Ｃｙ３ジスルフィドリンカー（２．５マイクロモル）の溶液に０℃で炭酸ジサクシンイミジル（０．９６ｍｇ ３．７５マイクロモル）及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）（０．４６ｍｇ ３．７５マイクロモル）を加えた。反応混合物を１０分間攪拌し、そして次にＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ ３：７）で検査した（活性化エステル ｒｆ＝０．５）。別のフラスコで３’−Ｏ−アリルチミジン三リン酸（３７）（５３２μｌ，水中１４．１ｍＭ，７．５マイクロモル）をＢｕ３Ｎ（１４３μｌ）と混合し、そして蒸発乾固した。その後、三リン酸塩（３７）を乾燥ＤＭＦ（０．２ｍｌ）に溶解した。三リン酸塩（３７）溶液に０℃で活性色素を加え、そして反応混合物を室温まで加温し、そして次に１６時間攪拌した。溶媒を除去し、そして残渣を水に溶解した。反応混合物を０．１Ｍ ＴＥＡＢ（１００ｍｌ）を用いて小型のＤＥＡＥセファデックスカラム（２ｘ５ｃｍ）に通してカップリング試薬及び未反応リンカー除去した。１Ｍ ＴＥＡＢ（１００ｍｌ）で三リン酸塩（３８）を溶出した。次いで混合物をＨＰＬＣにより分離した。収量：暗赤色固体の生成物１．４１マイクロモル（５６％，ε５５０＝１５００００）を単離した。ＨＰＬＣ条件ｔｒ（３８）：１９．６分（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ−１８調製用カラム、バッファーＡ ０．１Ｍ ＴＥＡＢ、バッファーＢ アセトニトリル、グラジエント ２９分で２−５８％バッファーＢ）。1H (d6 DMSO) δ 0.75-0.79 (m, 3H, CH3), 1.17-1.28 (m, 2H, CH2), 1.48-1.55 (m, 2H, CH2), 1.64 (s, 12H, 4 x CH3),1.70-1.77 (m, 2H, CH2), 1.96-2.02 (m, 1H, H-2'), 2.07-2.11 (m, 2H, CH2), 2.25-2.30 (m, 1H, H-2'), 2.51-2.55 (m, 2H, CH2), 2.64-2.68 (m, 2H, CH2), 2.75-2.81 (m, 2H, CH2), 3.27-3.31 (m, 2H, CH2),3.91-4.05 (m, 9H, H-5', OCH2, NCH2, 2 x NCH2-dye), 4.13 (s, 1H, H-4'), 4.22-4.24 (m, 1H, H-3'), 5.06 (d, J = 10.5 Hz, 1H, = CH2), 5.15 (dd, J = 1.4 Hz, 17.3 Hz,1H, = CH2), 5.72-5.82 (m, 1H, = CH), 6.03-6.06 (m, 1H, H-1'), 6.20-6.29 (m, 2H, αH), 7.23- 7.31 (m, 2H, HAr), 7.63-7.79 (m, 5H, H-6,4x HAr), 8.31-8.45 (m, 1H, βH)． 31P (161.9 MHz, d6 DMSO) δ -20.2 (m, 1P, Pβ), -10.0 (d, J 18.5 Hz, 1P, Pα), -4.8 (d, J 19.5 Hz, 1P, Pγ)．Mass（−ｖｅエレクトロスプレー）Ｃ５１Ｈ６７Ｓ４Ｎ６Ｏ２２Ｐ３に関して計算値１３３６．２４，測定値１３３５．１，６８８．１［切断されたジスルフィド（色素），６４７．９［切断されたジスルフィド（ヌクレオチド）］．
化合物３８の酵素取り込み
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０及び４ｍＭ ＭｇＳＯ４中１００ｎＭ ＤＮＡ プライマー／鋳型（予めＰ３２及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識したプライマー）に２μＭ 化合物３８及び１００ｎＭ ポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種 ９°Ｎ ｅｘｏ −Ｙ４０９Ｖ Ａ４８５Ｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓより入手）を加えた。遮断の影響を示すため、鋳型は１０個のアデノシン塩基の並びから成る。反応物を６５℃で１０分間加熱する。完全な遮断を示すために、４つの元来の遮断されていないヌクレオシド三リン酸で追跡を行う。アリル遮断の定量的な取り込みを観察することができ（図７）、そしてこれが更なる取り込みに対する有効な遮断として作用することを示すことができる。
Figure 2006509040
 ５’−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−５−ヨード−２’−デオキシシチジン（３９）
ＤＭＦ（１３０ｍｌ）中５−ヨード−２’−デオキシシチジン（２．２ｇ，６．２３ミリモル）の溶液にイミダゾール（４６７ｍｇ，６．８５ミリモル）を加えた。混合物を０℃で冷却し、そして、塩化ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳＣｌ）（１．３３ｇ，６．８５ミリモル）を５分間かけて加えた。室温で１８時間の後、減圧下揮発性物質を蒸発させ、そして残渣をシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーによりＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（９５：５〜９０：１０）で精製して、予測される生成物（３９）（２．１０ｇ，７２％）が未反応出発原料（４９０ｍｇ）と共に得られた。1H NMR (d6 DMSO) δ 0.11 (s, 3H, CH3), 0.12 (s, 3H, CH3), 0.89 (s, 9H, 3CH3), 1.90 (ddd, J = 13.2, 7.7 and 5.7 Hz, 1H, HH-2'), 2.18 (ddd, J = 13.2, 5.7 and 2.3 Hz, 1H, HH-2'), 3.72 (dd, J = 11.5, 3.6 Hz, 1H, HH-5'), 3.80 (dd, J = 11.5, 2.8 Hz, 1H, HH-5'), 3.86-3.89 (m, 1H, H-4'), 4.14-4.18 (m, 1H, H-3'), 5.22 (1H, d, J = 4.1 Hz, OH), 6.09 (1H, dd, J = 7.8, 5.8 Hz, H-1'), 6.60 (br s, 1H, NHH), 7.81 (br s, 1H, NHH), 7.94 (s, 1H, H-6); MS (ES) :m/z (%) (M + H) 468 (90%)．
Figure 2006509040
 ３’−Ｏ−アリル−５’−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−５−ヨード−２’−デオキシシチジン（４０）
Ｎ２雰囲気下、ＴＨＦ（２６ｍｌ）中ＮａＨの溶液（６０％，１１３ｍｇ，２．８４ミリモル）にＴＨＦ（６ｍｌ）中出発ヌクレオシド（３９）（６６９ｍｇ，１．４３ミリモル）の溶液をゆっくりと加えた。混合物を室温で４５分間攪拌し、０℃で冷却し、そして臭化アリル（１３４μＬ，１．５８ミリモル）をゆっくりと加えた。室温で１５分後、溶液を０℃まで冷却し、Ｈ２Ｏ（５ｍｌ）の添加により反応をクエンチした。減圧下、ＴＨＦを蒸発させ、そして生成物をＥｔＯＡｃ（３×２５ｍｌ）に抽出した。有機抽出物を合わせ、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過し、そして減圧下揮発性物質を蒸発させて、残渣が得られ、これをシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して無色油状の予測される３’−Ｏ−アリル生成物（４０）（３２３ｍｇ，４４％）がいくつかの未反応出発原料（１７０ｍｇ）と共に得られた；1H NMR (d6 DMSO) δ 0.00 (s, 3H, CH3), 0.01 (s, 3H, CH3), 0.79 (s, 9H, 3CH3), 1.84 (ddd, J = 13.3, 8.2 and 5.5 Hz, 1H, H-2'), 2.20-2.25 (m, 1H, H-2'), 3.62-3.72 (m, 2H, H-5'), 3.88-3.93 (m, 4H, H-3', 4', HHC-CH = ), 5.1 (dd, J = 8.5, 1.7 Hz, 1H, CH = CHH), 5.16 (dd, J = 17.2, 1.7 Hz, 1H, CH = CHH), 5.75-5.83 (m, 1H, CH = CHH), 5.94 (dd, J = 8.4, 5.6 Hz, 1H, H-1'), 6.53 (br s, 1H, NHH), 7.74 (br s, 1H, NHH), 7.83 (s, 1H, H-6); MS (ES) :m/z (%) (M-H) 506 (100%)．
Figure 2006509040
 ３’−Ｏ−アリル−５−ヨード−２’−デオキシシチジン（４１）
Ｎ２保護雰囲気下、ＴＨＦ（１５ｍｌ）中出発ヌクレオシド（４０）（３２３ｍｇ，０．６４ミリモル）の溶液に室温でＴＨＦ中１Ｍ フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）（０．７ｍｌ，０．７ミリモル）を加えた。混合物を１時間攪拌し、そして次にＨ２Ｏ（５ｍｌ）の添加により反応をクエンチした。ＴＨＦを蒸発させ、そして水性残渣をＥｔＯＡｃ（３×２５ｍｌ）に抽出した。有機層を合わせて乾燥（ＭｇＳＯ４）し、濾過し、そして減圧下揮発性物質を蒸発させて粗製物質が得られ、これをプレパック式シリカカラムのフラッシュクロマトグラフィーにより、ＥｔＯＡｃで溶出して精製した。生成物（４１）が白色固体として得られた（２３３ｍｇ，９３％）。1H NMR (d6 DMSO) δ 1.96-2.05 (m, 1H, H-2') 2.24 (ddd, J = 13.5, 5.8 and 2.8 Hz, 1H, H-2'), 3.50-3.62 (m, 2H, H5'), 3.91-3.97 (m, 2H, H3', H4'), 4.03-4.07 (m, 2H, HHC-CH = ), 5.11-5.16 (m, 2H, OH, CH = CHH), 5.24 (dd, J = 17.2, 1.6 Hz, 1H, CH = CHH), 5.82-5.91 (m, 1H, CH = CHH), 6.02 (dd, J = 7.6, 6.0 Hz, 1H, H-1'), 6.60 (s, 1H, NHH), 7.79 (s, 1H, NHH), 8.21 (s, 1H, H-6)．MS (ES) :m/z (%) (M-H) 392 (100%)．
Figure 2006509040
 ３’−Ｏ−アリル−５−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル］−２’−デオキシシチジン（４２）
乾燥ＤＭＦ（８．５ｍｌ）中出発ヌクレオシド（４１）（２００ｍｇ，０．５１ミリモル）の溶液に室温及びアルゴン雰囲気下でＣｕＩ（１９ｍｇ，０．１０ミリモル）、ＮＥｔ３（１４８μｌ，１．０２ミリモル），２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−プロパ−２−イニル−アセトアミド（２３０ｍｇ，１．５３ミリモル）及びＰｄ（ＰＰｈ３）４（５８ｍｇ，０．０５ミリモル）をゆっくりと加えた。混合物を室温で攪拌し、そして４時間遮光し、重炭酸ｄｏｗｅｘを添加して反応をクエンチし、そして１時間攪拌し、次いで濾過し、そして減圧下揮発性物質を蒸発させた。残渣をを更にＭｅＯＨ（１５ｍｌ）から蒸発させ、そして次にシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製した（ＣＨ２Ｃｌ２、ＣＨ２Ｃｌ２：ＥｔＯＡｃ １：１、ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ ９７．５：２．５）。予測される生成物（４２）がベージュ色の固体として得られた（１８０ｍｇ，８５％）。1H NMR (d6 DMSO) δ 1.90 (ddd, J = 13.6, 7.7 and 6.0 Hz, 1H, H-2'), 2.16 (ddd, J = 13.6, 5.7 and 2.4 Hz, 1H, H-2'), 3.42-3.50 (m, 2H, H-5'), 3.84-3.87 (m, 3H, H-4', OHHC-CH = ), 3.94-3.96 (m, 1H, H-3'), 4.16 (d, J = 5.1 Hz, 2H, H2C-N), 4.98-5.05 (m, 2H, OH, CH = CHH), 5.14 (dd, J = 17.3, 1.7 Hz, 1H, CH = CHH), 5.72-5.82 (m, 1H, CH = CHH), 5.95 (dd, J = 7.7, 5.8 Hz, 1H, H-1'), 6.74 (br s, 1H, NHH), 7.72 (br s, 1H, NHH), 8.01 (1H, s, H-6), 9.82 (br t, 1H, HN-CH2)．MS (ES) :m/z (%) (M-H) 415 (100%)．
Figure 2006509040
 ３’−Ｏ−アリル−５−（３−アミノ−プロパ−１−イニル）−５’−Ｏ−三リン酸−２’−デオキシシチジン（４３）
アルゴン雰囲気下で、ＰＯ（ＯＭｅ）３（３６０μｌ）中ヌクレオシド（２４）（１７０ｍｇ，０．４１ミリモル）及びプロトンスポンジ（１０５ｍｇ，０．５０ミリモル）（双方共に予めＰ２Ｏ５上で少なくとも２４時間乾燥した）の溶液に０℃でＰＯＣｌ３（新たに蒸留した）（５０μｌ，０．５４ミリモル）をゆっくりと加えた。溶液を０℃で３時間激しく攪拌し、そして次にＤＭＦ中０．５Ｍ テトラトリブチルアンモニウム 二リン酸（３．２０ｍｌ，１．６０ミリモル）、続いてｎＢｕ３Ｎ（０．７５ｍｌ，３．２ミリモル）及び０．１Ｍ 重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）（１２ｍｌ）の添加によりクエンチした。混合物を室温で３時間攪拌し、そして次にアンモニア水溶液（ρ０．８８ １．０ｍｌ）（１２ｍｌ）を加えた。溶液を室温で１５時間攪拌し、減圧下揮発性物質を蒸発させ、そして残渣をＭＰＬＣにより、０．０５Ｍから０．７Ｍ ＴＥＡＢのグラジエントで精製した。予測される三リン酸塩（４３）をおよそ０．５１Ｍ ＴＥＡＢでカラムから溶出した。Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８調製用カラム（内径２１．２ｍｍ×２５ｃｍ）のＨＰＬＣにより、以下のグラジエント：０〜５分 ５％Ｂ，Φ．２ｍｌ；５〜２５分 ８０％Ｂ，Φ．８ｍｌ；２５〜２７分 ９５％Ｂ，Φ．８ｍｌ；２７〜３０分 ９５％Ｂ，Φ．８ｍｌ；３０〜３２分 ５％Ｂ，Φ．８ｍｌ；３２〜３５分 ９５％Ｂ，Φ．２ｍｌを用いて０．１Ｍ ＴＥＡＢ（ポンプＡ）及び０．１Ｍ ＴＥＡＢ中３０％ＣＨ３ＣＮ（ポンプＢ）で溶出して第２の精製を行い、ｔｒ（４３）：２０．５（２０マイクロモル，収率 ５％）の前記で詳記した生成物（４３）が得られた；31P NMR (D2O) δ -6.01 (d, J = 19.9 Hz, 1P, Pγ), -10.24 (d, J = 19.3 Hz, 1P, Pα), -21.00 (t, J = 19.6 Hz, 1P, Pβ); 1H NMR (D2O) δ 2.19-2.26 (m, 1H, H-2'), 2.51 (1H, ddd, J = 14.2, 6.1 and 3.2 Hz, H-2'), 3.96-4.07 (m, 4H, NCH2, OHHC-CH = ), 4.09-4.14 (m, 1H, H-5') 4.22-4.26 (m, 1H, H-5'), 4.30-4.37 (m, 2H, H-3', 4'), 5.20 (d, J = 10.4 Hz, 1H, CH = CHH), 5.30 (1H, dd, J = 17.3, 1.5 Hz, CH = CHH), 5.85-5.95 (m, 1H, CH = CHH), 6.18 (t, J = 6.5 Hz, 1H, H-1'), 8.40 (s, 1H, H-6); MS (ES) :m/z (%) (M-H) 559 (100%)．
Figure 2006509040
 ＤＭＦ（５００μｌ）中Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ジスルフィドリンカー（２．３７ｍｇ，３．４マイクロモル）の溶液に炭酸Ｎ，Ｎ−ジサクシンイミジル（１．３ｍｇ，５．１マイクロモル）及び４−ＤＭＡＰ（０．６ｍｇ，５．１マイクロモル）を加えた。混合物を１０分間攪拌し、次いでこれをｎＢｕ３Ｎ（３０μｌ）含有ＤＭＦ（１００μｌ）中ヌクレオチド（４３）の溶液（３．２３ｍｇ，５．８マイクロモル）に加えた。混合物を室温で連続的に１６時間攪拌した。減圧下、揮発性物質を蒸発させ、そして残渣を最初に短いイオン交換樹脂セファデックスＤＥＡＥ Ａ−２５（４０−１２０μ）−カラムを通し、最初に０．１Ｍ ＴＥＡＢ（７０ｍｌ）次いで１．０Ｍ ＴＥＡＢ（１００ｍｌ）で溶出して精製した。予測される生成物（４４）を含有する最終画分を濃縮し、そして残渣をＺｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ１８カラム（内径２１．２ｍｍ×２５ｃｍ）で０．１Ｍ ＴＥＡＢ（ポンプＡ）及びＣＨ３ＣＮ（ポンプＢ）で以下のグラジエント：０〜２分 ２％Ｂ，Φ．２ｍｌ；２〜４分 ２％Ｂ，Φ．８ｍｌ；４〜１５分 ２３％Ｂ，Φ．８ｍｌ；１５〜２４分 ２３％Ｂ，Φ．８ｍｌ；２４〜２６分 ９５％Ｂ，Φ．８ｍｌ；２６〜２８分 ９５％Ｂ，Φ．８ｍｌ、２８〜３０分 ２％Ｂ，Φ．８ｍｌ，３０〜３３分 ２％Ｂ，Φ．２ｍｌを用いて溶出してＨＰＬＣ精製し、ｒｔ（４４）：１９．９（０．５６ マイクロモル，ＵＶ測定に基づいた収率１７％；Ｈ２Ｏ 中λｍａｘ＝４９３ｎｍ，ε ７１，０００ｃｍ−１Ｍ−１）の前記で詳記した生成物が得られた；31P NMR (D2O) δ -5.07 (d, J = 22.2 Hz, 1P, Pc), -10.26 (d, J = 19.4 Hz, 1P, Pα), -21.09 (t, J = 19.7 Hz, 1P, Pβ); 1H NMR (D2O) δ 2.44-2.26 (m, 2H, HH-2'), 2.50 (t, J = 6.7 Hz, 2H, CH2), 2.83 (4H, CH2, CH2), 3.58 (t, J = 6.0 Hz, 2H, CH2), 4.07-3.91 (m, 6H, HH-5', NCH2, OHHC-CH = ), 4.16-4.12 (m, 1H, H-4'), 4.23-4.17 (m, 1H, H-3'), 5.24-5.09 (m, 2H, CH = CHH, CH = CHH), 5.84-5.74 (m, 1H, CH = CHH), 5.98 (t, J = 8.1 Hz, 1H, H-1'), 6.79 (d, J = 9.1 Hz, 1H, HAr), 6.80 (d, J = 9.3 Hz, 1H, HAr), 7.06 (t, J = 8.8 Hz, 2H, HAr), 7.55 (br s, 1H, HAr), 7.90-7.85 (m, 2H, HAr), 7.94 (s, 1H, H-6); MS (ES) :m/z (%) (M-H)- 1239 (27%)．
Figure 2006509040
 ５’−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシグアノシン（４５）
ＤＭＦ（１０ｍｌ）中（４４）の溶液（０．５５ｇ，１．４ミリモル）をイミダゾール（１９０ｍｇ，２．８ミリモル）及びＴＢＤＭＳＣｌ（２７４ｍｇ，１．８２ミリモル）と室温で１５分間処理した。反応をＭｅＯＨ（〜５ｍｌ）でクエンチした。混合物を蒸発乾固した。水（〜３００ｍｌ）を残渣に加え、そして少なくとも１時間攪拌してイミダゾールを完全に溶解した。濾過により褐色の固体が得られ、これを乾燥し、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製し（ＤＣＭからＤＣＭ：ＭｅＯＨ ９０：１０）、淡黄色粉末として（４５）が得られた（３９４ｍｇ，５６％）。1H NMR (d6 DMSO) δ 0.00, 0.01 (2s, 6H, CH3), 0.82 (s, 9H, CH3), 1.99-2.05, 2.16-2.22 (2m, 2H, H-2'), 3.58-3.66 (m, 2H, H-5'), 3.72-3.74 (m, 1H, H-4'), 4.18-4.19 (m, 1H, H-3'), 5.16 (d, J = 3.0 Hz, 1H, OH), 6.20 (dd, J = 6.0, 8.0 Hz, 1H, H-1'), 6.25 (br s, 2H, NH2), 7.58 (s, 1H, H-8), 10.37 (s, 1H, HN)．Mass（−ｖｅ エレクトロスプレー）Ｃ１７Ｈ２７ＩＮ４Ｏ４Ｓｉに関して計算値５０６，測定値５０５．
Figure 2006509040
 ３’−Ｏ−アリル−５’−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシグアノシン（４６）
ＴＨＦ（２５ｍｌ）中（４５）の溶液（３５４ｍｇ，０．７ミリモル）をＮａＨ（４２ｍｇ，１．７５ミリモル）と室温で１時間反応させた。臭化アリルを加え、懸濁液を室温で２日間攪拌した。〜６０％出発原料（４５）を生成物（４６）に変換した。飽和ＮａＣｌ水溶液で反応をクエンチし、そしてＤＣＭで３回抽出した。有機層を合わせ、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、そして真空下濃縮した。残渣をＴＨＦ（１ｍｌ）中ＴＢＡＦ及びＴＨＦ（１ｍｌ）と３０分間処理した。ＴＨＦを蒸発させて除去した。残渣をＤＣＭに溶解し、そしてＮａＨＣＯ３（飽和）水溶液を加えた。水層をＤＣＭで３回抽出した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、そして真空下濃縮した。シリカのクロマトグラフィーによる精製（ＥｔＯＡｃからＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ ８５：１５）で黄色泡状の（４６）が得られた（１０１ｍｇ，３５％）。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.15-2.31 (m, 2H, H-2'), 3.41-3.45 (m, 2H, H-5'), 3.82-3.85 (m, 1H, H-4'), 3.93 (d, J = 2.6 Hz, 2H, OCH2), 4.04-4.06 (m, 1H, H-3'), 4.99 (t, J = 5.4 Hz, OH), 5.08-5.24 (m, 2H, = CH2), 5.79-5.89 (m, 1H, CH = ), 6.15 (dd, J = 5.9, 9.1 Hz, 1H, H-1'), 6.27 (br s, 2H, NH2), 7.07 (s, H-8), 10.39 (s, 1H, NH)．Mass（−ｖｅ ｅエレクトロスプレー）Ｃ１４Ｈ１７ＩＮ４Ｏ４に関して計算値４３２，測定値４３１．
Figure 2006509040
 ３’−Ｏ−アリル−５’−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−７−デアザ−７−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）−プロパ−１−イニル）−２’−デオキシグアノシン（４７）
Ｎ２下、ＤＭＦ（２ｍｌ）中（４６）（１０４ｍｇ，０．２４ミリモル）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（２４ｍｇ，０．０２４ミリモル）、ＣｕＩ（９．１ｍｇ，０．０４８ミリモル）、Ｅｔ３Ｎ（６６μｌ，０．４８ミリモル）及びＣＨ≡ＣＣＨ２ＮＨＣＯＣＦ３（８９μＬ，０．７２ミリモル）の懸濁液を室温で１５時間攪拌した。アルミ箔で反応物を遮光した。ＴＬＣが出発物質の完全な消費を示した後、反応混合物を濃縮した。残渣をＭｅＯＨ（２０ｍｌ）で希釈し、そしてｄｏｗｅｘ−ＨＣＯ３ −で処理した。混合物を３０分間攪拌し、そして濾過した。溶液を濃縮し、シリカゲルのクロマトグラフィー（石油エーテル：ＥｔＯＡｃ ５０：５０から石油エーテル：ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ ４０：４０：２０）により精製し、黄色粉末として（４７）が得られた（７４ｍｇ，７０％）。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.15-2.39 (m, 2H, H-2'), 3.42-3.44 (m, 2H, H-5'), 3.83-3.87 (m, 1H, H-4'), 3.93-3.95 (m, 2H, OCH2), 4.0-4.07 (m, 1H, H-3'), 4.15 (d, J = 5.3 Hz, 2H, ≡CCH2), 4.91 (t, J = 5.4 Hz, OH), 5.08-5.24 (m, 2H, = CH2), 5.80-5.89 (m, 1H, CH = ), 6.15 (dd, J = 5.6, 8.9 Hz, 1H, H-1'), 6.28 (br s, 2H, NH2), 7.24 (s, H-8), 9.98 (t, J = 5.3 Hz, 1H, NH), 10.44 (s, 1H, NH)．Mass（−ｖｅ エレクトロスプレー）Ｃ１９Ｈ２０Ｆ３Ｎ５Ｏ５ に関して計算値４５５，測定値４５４．
Figure 2006509040
 ヌクレオシド（４７）及びプロトンスポンジをＰ２Ｏ５上で２４時間乾燥した。リン酸トリメチル（０．５ｍｌ）、（４７）（７３ｍｇ，０．１６ミリモル）及びプロトンスポンジ（６９ｍｇ，０．３２ミリモル）を４Åモレキュラーシーブで１時間攪拌した。新たに蒸留したＰＯＣｌ３（１８μｌ，０．１９ミリモル）を加え、そして溶液を４℃で２時間攪拌した。混合物をゆっくりと室温まで加温し、そしてビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロリン酸（１．３ｍｌ，０．８８ミリモル）及び無水トリ−ｎ−ブチルアミン（０．３ｍｌ，１．２８ミリモル）を加えた。５分後、０．１Ｍ ＴＥＡＢ（重炭酸トリエチルアンモニウム）バッファー（１０ｍｌ）で反応をクエンチし、そして３時間攪拌した。減圧下、水を除去し、そして得られた残渣を濃アンモニア（ρ０．８８，１０ｍｌ）に溶解し、そして室温で１６時間攪拌した。次いで反応混合物を蒸発乾固した。残渣を水に溶解し、そして溶液をＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５ カラムに適用した。０．０５Ｍ及び１Ｍ ＴＥＡＢ、各２ｌの直線グラジエントでＭＰＬＣを実施した。三リン酸塩を０．７Ｍと０．８Ｍ バッファーの間で溶出した。生成物を含有する画分を合わせ、そして蒸発乾固した。残渣を水に溶解し、更にＨＰＬＣで精製した。ｔｒ（４８）：２０．３分（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ−１８調製用カラム、グラジエント ３０分で５−３５％Ｂ、バッファーＡ ０．１Ｍ ＴＥＡＢ、バッファーＢＭｅＣＮ）。生成物（４８）を白色泡状物として単離した（１４７ Ｏ．Ｄ．，１９．３ マイクロモル，１２％，ε２６０＝７，６００）。1H NMR (D2O) δ 2.38-2.46 (m, 2H, H-2'), 3.91 (m, 2H, ≡CCH2), 3.98-4.07 (m, 4H, H-5', 2H, OCH2), 4.25 (br s, 1H, H-4'), 4.40 (br s, 1H, H-3'), 5.16-5.30 (m, 1H, = CH2), 5.83-5.91 (m, 1H, = CH), 6.23-6.27 (m, 1H, H-1'), 7.44 (s, 1H, H-8)．31P NMR δ -7.1 (d, J = 16.5 Hz, 1P, Pγ), -10.1 (d, J = 19.9 Hz, 1P, Pα), -21.5 (t, J = 18.0 Hz, 1P, Pβ)．Mass（−ｖｅ エレクトロスプレー）Ｃ１７Ｈ２４Ｎ５Ｏ１３Ｐ３に関して計算値５９９，測定値５９８．
Figure 2006509040
 ７−デアザ−５’−Ｏ−ジフェニルシリル−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン（４９）
ＴＢＤＰＳＣｌ（０．８７ｇ，２．７８ミリモル）を乾燥ピリジン（１９ｍｌ）中７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン（１．０５ｇ，２．７８ミリモル）の攪拌溶液にＮ２下５℃で加えた。１０分後、溶液を室温まで上昇させ、そして１８時間攪拌した。溶液を減圧下蒸発させ、そして残渣をシリカのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した（ＤＣＭからＤＣＭ：ＭｅＯＨ １９：１）。これにより所望の生成物（４９）が得られた（１．６ｇ，８３％）。1H NMR (d6 DMSO) δ 1.07 (s, 9H), 2.31-2.36 (m, 1H), 3.76-3.80 (dd, 1H, J = 11.1, 4.7 Hz), 3.88-3.92 (dd, 1H, J = 11.2, 3.9 Hz), 3.97-4.00 (m, 1H), 4.49-4.50 (m, 1H), 5.83 (s, 1H), 6.58-6.61 (t, 1H, J = 6.7 Hz), 7.44-7.55 (m, 6H), 7.68-7.70 (m, 5H), 8.28 (s, 1H)．Mass（エレクトロスプレー）Ｃ２７Ｈ３１ＩＮ４Ｏ３Ｓｉに関して計算値６１４．１２，測定値６１３．
Figure 2006509040
 ７−デアザ−６−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルマジン−５’−Ｏ−ジフェニルシリル−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン（５０）
ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（６．３ｇ，５３ミリモル）含有ＭｅＯＨ（７０ｍｌ）中（４９）の溶液（１．６ｇ，２．６１ミリモル）を４５℃で１８時間加熱した。溶液を冷却し、減圧下蒸発させ、そしてシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した（ＥｔＯＡｃからＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ ９８：２）。これにより望ましい生成物（５０）１．５２ｇ（８７％）が得られた。1H NMR (d6 DMSO) δ 0.85 (s, 9H), 2.05-2.11 (m, 1H), 3.03 (s, 3H), 3.06 (s, 3H), 3.53-3.57 (dd, 1H, J = 11.1, 4.8 Hz), 3.65-3.69 (dd, 1H, J = 11.1, 4 Hz), 3.73-3.76 (q, 1H, J = 4 Hz), 4.26-4.28 (m, 1H), 5.21-5.22 (d, 1H, J = 4.3 Hz), 6.39-6.42 (t, 1H, J = 6.8 Hz), 7.21-7.32 (m, 6H), 7.46 (s, 1H), 7.45-7.48 (m, 4H), 8.15 (s, 1H), 8.68 (s, 1H)．Mass（＋ｖｅエレクトロスプレー）Ｃ３０Ｈ３６ＩＮ５Ｏ３Ｓｉに関して計算値６６９．１６，測定値６７０．
Figure 2006509040
 ３’−Ｏ−アリル−７−デアザ−６−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルマジン−５’−Ｏ−ジフェニルシリル−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン（５１）
乾燥ＴＨＦ（５ｍｌ）中（５０）の溶液（１．５２ｇ，２．２８ミリモル）を乾燥ＴＨＦ（３５ｍｌ）中水素化ナトリウムの攪拌懸濁液（６０％，１０９ｍｇ，２．７３ミリモル）に室温で滴下した。４５分後、黄色の溶液を５℃まで冷却し、そして臭化アリル（０．４１３ｇ，３．４１ミリモル）を加えた。溶液を室温まで上昇させ、そして１８時間攪拌した。イソプロパノール（１０滴）を加えた後、溶液を水（５ｍｌ）及びＥｔＯＡｃ（５０ｍｌ）間で分配した。有機層を分離し、そして水溶液を更にＥｔＯＡｃ（２ｘ５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機溶液を乾燥（ＭｇＳＯ４）し、そして減圧下蒸発させた。残渣をシリカのフラッシュクロマトグラフィーにより精製し（石油エーテル：ＥｔＯＡｃ １：３からＥｔＯＡｃ）、ゴム状の所望の生成物（５１）１．２ｇ（７４％）が得られた。1H NMR (d6 DMSO) δ 1.03 (s, 9H), 2.39-2.45 (m, 1H), 2.60-2.67 (m, 1H), 3.2 (s, 3H), 3.23 (s, 3H), 3.70-3.74 (dd, 1H, J = 11.2, 4.6 Hz), 3.83-3.87 (dd, 1H, J = 11, 5.4 Hz), 4.03-4.08 (m, 3H), 4.30-4.31 (m, 1H), 5.18-5.21 (m, 1H), 5.28-5.33 (m, 1H), 5.89-5.98 (m, 1H), 6.49-6.53 (dd, 1H, J = 8.4, 5.8 Hz), 7.41-7.51 (m, 6H), 7.62-7.66 (m, 5H), 8.31 (s, 1H), 8.85 (s, 1H)．Mass（＋ｖｅエレクトロスプレー）Ｃ３３Ｈ４０ＩＮ５Ｏ３Ｓｉに関して計算値７０９．１９，測定値７１０．
Figure 2006509040
 ３’−Ｏ−アリル−７−デアザ−６−Ｎ，Ｎ−ジメチルホルマジン−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン（５２）
ＴＨＦ中１Ｍ ＴＢＡＦ溶液（４．４ｍｌ，４．４ミリモル）をＴＨＦ（１００ｍｌ）中（５１）の溶液（１．２ｇ，１．６９ミリモル）にＮ２下、５℃で加えた。溶液を室温まで上昇させ、そして２日間攪拌した。溶液を減圧下蒸発させ、そしてシリカのフラッシュクロマトグラフィーにより精製した（ＥｔＯＡｃからＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ ９７：３）．これにより所望の生成物（５２）５９３ｍｇ（７７％）が得られた。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.54 (m, 2H), 3.40 (s, 3H), 3.44 (s, 3H), 3.72-3.8 (m, 2H), 4.18-4.21 (m, 1H), 4.23-4.27 (m, 3H), 4.4-4.42 (d, 1H, J = 5.7 Hz), 5.35-5.41 (m, 2H), 5.49-5.5 (q, 1H, J = 1.7 Hz), 5.53-5.55 (q, 1H, J = 1.7 Hz), 6.1-6.2 (m, 1H), 6.67-6.70 (dd, 1H, J = 8.8, 5.5 Hz), 7.96 (s, 1H), 8.53 (s, 1H), 9.06 (s, 1H)．Mass（＋ｖｅエレクトロスプレー）Ｃ１７Ｈ２２ＩＮ５Ｏ３に関して計算値４７１．０８，測定値４７２．
Figure 2006509040
 ３’−Ｏ−アリル−７−デアザ−７−ヨード−２’−デオキシアデノシン（５３）
３５％アンモニア水（２０ｍｌ）含有ＭｅＯＨ（２０ｍｌ）中（５２）の溶液（５９３ｍｇ，１．３ミリモル）を５０℃で２日間加熱した。冷却後、溶液を減圧下蒸発させ、そして次にトルエン（３×１０ｍｌ）で共沸した。これにより固体の所望の生成物（５３）５３０ｍｇ（９８％）が得られた。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.39 (m, 1H), 3.56-3.65 (m, 2H), 4.03-4.05 (m, 1H), 4.09-4.11 (m, 2H), 5.23-5.25 (d, 1H, J = 10.6 Hz), 5.35-5.4 (d, 1H, J = 15.4 Hz), 5.95-6.05 (m, 1H), 6.48-6.51 (dd, 1H, J = 8.9, 5.5 Hz), 6.6-6.95 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 8.16 (s, 1H)．Mass（＋ｖｅエレクトロスプレー）Ｃ１４Ｈ１７ＩＮ４Ｏ３に関して計算値４１６．０３，測定値４１７．
Figure 2006509040
 ３’−Ｏ−アリル−７−デアザ−７−［３−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）］−２’−デオキシアデノシン（５４）
乾燥ＤＭＦ（１７ｍｌ）中（５３）の溶液（４９４ｍｇ，１．１９ミリモル）にヨウ化銅（I）（４５．１ｍｇ，０．２４ミリモル）、Ｎ−２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−プロパ−２−イニルアセトアミド（５３８ｍｇ，３．５６ミリモル）、Ｅｔ３Ｎ（２４０ｍｇ，２．３８ミリモル）及びＰｄ（Ｐｈ３Ｐ）４（１３７ｍｇ，０．１２ミリモル）を室温で順に加えた。フラスコをホイルで包んで遮光し、そしてＮ２下１８時間攪拌した。ＭｅＯＨ（１０ｍｌ）及び小スパーテル１杯の重炭酸ｄｏｗｅｘ Ｈ＋形態を加え、そして混合物を３０分間攪拌した。混合物を濾過し、減圧下蒸発させ、そして残渣をＭｅＯＨで粉砕してパラジウム塩を除去した。濾液を減圧下蒸発させ、そしてシリカのフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭからＤＣＭ：ＭｅＯＨ ９７：３）により精製した。所望の生成物（５４）が褐色固体として得られた（４９０ｍｇ，９４％）。1H NMR (d6 DMSO) δ 2.25-2.31 (m, 1H), 2.98-3.04 (m, 1H), 3.41-3.49 (m, 2H), 3.88-3.95 (m, 3H), 4.10-4.12 (d, 1H, J = 5.2 Hz), 4.22-4.23 (d, 2H, J = 5.3 Hz), 5.07-5.12 (m, 2H), 5.19-5.24 (dd, 1H, J = 17.3, 1.9 Hz), 5.79-5.89 (m, 1H), 6.31-6.35 (dd, 1H, J = 8.6, 5.6 Hz), 7.69 (s, 1H), 8.02 (S, 1H)．Mass（−ｖｅエレクトロスプレー）Ｃ１９Ｈ２０Ｆ３Ｎ５Ｏ４に関して計算値４３９．１５，測定値４３８．
Figure 2006509040
 ３’−Ｏ−アリル−７−［３−アミノプロパ−１−イニル］−７−デアザ−２’−デオキシアデノシン ５’−Ｏ−ヌクレオシド三リン酸（５５）
ヌクレオシド（５４）及びプロトンスポンジをＰ２Ｏ５上で真空下で一晩乾燥した。リン酸トリメチル（６００μｌ）中（５４）の溶液（８４ｍｇ，０．１９１ミリモル）及びプロトンスポンジ（４９ｍｇ，０．３８２ミリモル）の溶液を４Åモレキュラーシーブで１時間攪拌した。新たに蒸留したＰＯＣｌ３（３６μｌ，０．３８８ミリモル）を加え、そして溶液を４℃で２時間攪拌した。混合物を室温までゆっくりと加温し、そしてＤＭＦ中０．５Ｍ ビス（トリ−ｎ−ブチルアンモニウム）ピロリン酸の溶液（１．５２ｍｌ，０．７６４ミリモル）及び無水トリ−ｎ−ブチルアミン（３６４μｌ，１．５２ミリモル）を加えた。５分後、０．１Ｍ ＴＥＡＢ（重炭酸トリエチルアンモニウム）バッファー（５ｍｌ）で反応をクエンチし、そして３時間攪拌した。減圧下水を除去し、そして得られた残渣を濃アンモニア（ρ０．８８，５ｍｌ）に溶解し、そして室温で１６時間攪拌した。次いで反応混合物を蒸発乾固した。残渣を水に溶解し、そして溶液をＤＥＡＥ−セファデックス Ａ−２５カラムに適用した。０．０５Ｍ から１Ｍ ＴＥＡＢの直線グラジエントでＭＰＬＣを実施した。生成物を含有する画分を合わせ、そして蒸発乾固した。残渣を水に溶解し、そしてＨＰＬＣで更に精製した。ＨＰＬＣ：ｔｒ（５５）＝：２２．６０分（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８ 調製用カラム，グラジエント：２０分で５％〜３５％Ｂ，バッファーＡ ０．１Ｍ ＴＥＡＢ，バッファーＢＭｅＣＮ）生成物を白色泡状物として単離した（１７．５マイクロモル，５．９％，ε２８０＝１５０００）。1H NMR (D2O) δ 2.67-2.84 (2m, 2H, H-2'), 4.14 (br s, 2H, CH2NH), 4.17-4.36 (m, 2H, H-5'), 4.52 (br s, 1H, H-4'), 6.73 (t, J = 6.6 Hz, 1H, H-1'), 8.06 (s, 1H, H-8), 8.19 (s, 1H, H-2)． 31P NMR (D2O) δ -5.07 (d, J = 21.8 Hz, 1P, Pγ), -10.19 (d, J = 19.8 Hz, 1P, Pα), -21.32 (t, J = 19.8 Hz, 1P, Pβ)．Mass（−ｖｅエレクトロスプレー）Ｃ１５Ｈ２１Ｎ８Ｏ１２Ｐ３に関して計算値５９８．０５，測定値５９６
Figure 2006509040
 ＤＭＦ（４５０μｌ）中Ｃｙ３ジスルフィドリンカー（２．６マイクロモル）の溶液にＤＭＦ中１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物及びＮ−メチルモルホリン（各２６μＭ）の混合物１００μｌを０℃で加える。反応混合物を室温で１時間攪拌した。全ての色素リンカーが消費されるまでＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２ ４：６）により反応をモニターした。次いでＤＭＦ（４００μｌ）を０℃で加え、続いてヌクレオチド（５５）（３．９ マイクロモル）を水溶液（１００μｌ）で加え、そして反応混合物を室温で一晩攪拌した。ＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２ ４：６）により活性化されたエステルの完全な消費が示され、そしてベースラインに暗赤色スポットが現れた。ＴＥＡＢバッファー（０．１Ｍ，１０ｍｌ）により反応をクエンチし、そしてＤＥＡＥセファデックスカラム（２×５ｃｍ）に負荷した。カラムを最初に０．１Ｍ ＴＥＡＢバッファー（１００ｍｌ）で溶出し、そして有機残渣を洗い流し、そして次に１Ｍ ＴＥＡＢバッファー（１００ｍｌ）で溶出した。望ましい三リン酸塩（５６）が１Ｍ ＴＥＡＢバッファーで溶出された。生成物を含有する画分を合わせ、蒸発させ、そしてＨＰＬＣにより精製した。ＨＰＬＣ条件：ｔｒ（５６）：２１．３８分（Ｚｏｒｂａｘ Ｃ１８調製用カラム，グラジエント：１分で５％〜１５％Ｂ、次いで４分で１５％Ｂ、次いで１５分で１５％〜３５％Ｂ，バッファーＡ ０．１Ｍ ＴＥＡＢ，バッファーＢＭｅＣＮ）。生成物を暗桃色固体として単離した（０．１５ マイクロモル，１２．５％，ε５５０＝１５０００）．1H NMR (D2O) δ 2.03 (t, J = 6.4 Hz, 2H, CH2), 2.21-2.33 (m, 1H, H-2'), 2.37-2.49 (m, 1H, H-2'), 2.50 (t, J = 6.3 Hz, 2H, CH2), 2.66 (t, J = 5.4 Hz, 2H, CH2), 3.79 (t, J = 6.4 Hz, 2H CH2), 3.99 (m, 4H, CH2N, H-5'), 4.18 (br s, 1H, H-4'), 6.02, 6.17 (2d, J = 13.6 Hz, 2H, Har), 6.30 (dd, J = 6.1, 8.6 Hz, H-1'), 7.08, 7.22 (2d, J = 7.8, 8.6 Hz, 2H, 2 x = CH), 7.58-7.82 (m, 6H, 2HAr, H-2, H-8), 8.29 (t, J = 13.6 Hz, , = CH)．31P NMR (D2O) δ -4.83 (m, 1P, Pγ), -10.06 (m, 1P, Pα), -20.72 (m, 1P, Pβ)．
水性条件での３’−アリル基の切断
以下は３’遮断されたヌクレオチドのための典型的な遮断手順を示し、ここでＮａ２ＰｄＣｌ４およそ０．５当量及び水溶性ホスフィンリガンドＬ ４当量を水中、５０℃で用いた。Ｔｆａはトリフルオロアセチルを意味する：
Figure 2006509040
エッペンドルフバイアル内で、脱気した水（２２５μｌ）中リガンドＬ（７．８ｍｇ，１３．７マイクロモル）の溶液に脱気した水（２５μｌ）中Ｎａ２ＰｄＣｌ４（０．５ｍｇ，１．６マイクロモル）の溶液を加えた。２つの溶液を十分に混合し、そして５分後、Ｈ２Ｏ（２５０μｌ）中Ｂの溶液（１ｍｇ，２．３マイクロモル）を加えた。次いで反応混合物を５０℃の加熱ブロックに置いた。反応をＨＰＬＣで追跡できた。反応混合物から５０μｌのアリコートを取り、エッペンドルフフィルターバイアル（多孔性 ０．２μｍ）を通して濾過し；溶液２２μｌをＨＰＬＣに注入して反応をモニターした。ＨＰＬＣにより反応物を精製した。典型的な実験では、切断は終了した（すなわち３０分後に＞９８％の切断が生じた）。
ヘミアセタールの保護形態としての３，４ジメトキシベンジルオキシメチル基での３’−ＯＨ保護：
Figure 2006509040
この遮断基を担持するヌクレオチドはアリルの実例に類似する特性を有するが、取り込みはあまり迅速ではない。硝酸セリウムアンモニウム水溶性緩衝液又はＤＤＱの使用により脱遮断を有効に達成することができ、双方の条件は更なる伸長の前に必要とされる（２）に分解されるヘミアセタール（１）を最初に遊離させることである：
Figure 2006509040
３’−ＯＨをフェニル基が置換されていないベンジル基、例えばベンジルオキシメチルで保護することができ、またフェニル基が電子供与置換基を担持するベンジル基で保護することもできる；このような電子豊富なベンジル保護基の実例は３，４−ジメトキシベンジルオキシメチルである。
対照的に、電子欠乏性ベンジル保護基、例えばフェニル環が１つ又はそれ以上のニトロ基で置換されているものは、式−Ｃ（Ｒ’）２−ＯＨ、−Ｃ（Ｒ’）２−ＮＨ２及び−Ｃ（Ｒ’）２−ＳＨの中間基を形成するのに必要な条件が十分に厳しく、ポリヌクレオチドの取り込みがこのような電子欠乏性ベンジル保護基を脱保護するのに必要な条件により影響され得るので、あまり好ましくない。
ヘミアセタールの保護形態としてのフルオロメチルオキシメチル基での３’−ＯＨ保護：
−Ｏ−ＣＨ２−Ｆ
この遮断基を担持するヌクレオチドを当業者に公知の触媒反応、例えば重金属イオン、例えば銀の使用により中間ヘミアセタールに変換することができる。
本発明に有用な例示的なヌクレオチド構造を示す。各構造に関してＸはＨ、リン酸、二リン酸又は三リン酸でよい。Ｒ１及びＲ２は同一か又は異なっていてよく、そしてＨ、ＯＨ又はＯＨに転換できるいずれかの基、カルボニルが含まれるがこれに限定されない、から選択することができる。Ｒ１及びＲ２に適当ないくつかの官能基には図３及び図４に示す構造などがある。 本発明の特定の態様に有用なリンカーの構造を示し、（１）ジスルフィドリンカー及び酸に不安定なリンカー、（２）ジアルコキシベンジルリンカー、（３）シーバー（Ｓｉｅｂｅｒ）リンカー、（４）インドールリンカー、並びに（５）ｔ−ブチルシーバー（Ｓｉｅｂｅｒ）リンカーなどがある。 いくつかの切断可能なリンカー及びいくつかの適当なヒドロキシ保護基などの本発明に有用ないくつかの機能的分子を示す。これらの構造では、Ｒ１及びＲ２は同一か又は異なっていてよく、そしてＨ、ＯＨ又はカルボニルなどのＯＨに転換できるいずれかの基でよい。Ｒ３はアルキル、アルコキシル、アミノ又はハロゲン基から別個に選択される１つ又はそれ以上の置換基を表す。Ｒ４及びＲ５はＨ又はアルキルでよく、そしてＲ６はアルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル又はベンジルでよい。ＸはＨ、リン酸、二リン酸又は三リン酸でよい。 本発明にしたがって用いることができるいくつかのＺ遮断基の略図である。 各々標識され、そして遮断されたＤＧＴＰ、ＤＣＴＰ及びｄＡＴＰ（化合物１８、２４及び３２）の取り込みの２サイクルを示す。 標識され、そして遮断されたＤＴＴＰ（化合物６）の取り込みの６サイクルを示す。 化合物３８（本発明の３’−Ｏアリルヌクレオチド）による有効な遮断を示す。

Claims (50)

  1. プリン又はピリミジン塩基と
    構造：
    −Ｏ−Ｚ
    （式中、Ｚは−Ｃ（Ｒ’）２−Ｏ−Ｒ’’、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｈ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｓ−Ｒ’’及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｆのいずれかであり、
    ここで各Ｒ’’は除去可能な保護基であるか又はその一部であり；
    各Ｒ’は別個に水素原子、アルキル、置換アルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシもしくはアミド基、又は連結基を介して付着した検出可能な標識；又は（Ｒ’）２は式＝−Ｃ（Ｒ’’’）２のアルキリデン基を表し、ここで各Ｒ’’’は同一かもしくは異なってよく、そして水素及びハロゲン原子及びアルキル基を含む群から選択され；そして
    ここで前記分子は反応して、各Ｒ’’がＨと交換されるか、又はＺが−Ｃ（Ｒ’）２−Ｆの場合、ＦはＯＨ、ＳＨ又はＮＨ２、好ましくはＯＨと交換される中間体を生成してもよく、この中間体は水性条件下で解離して遊離の３’ＯＨを有する分子をもたらし；
    ただしＺが−Ｃ（Ｒ’）２−Ｓ−Ｒ’’である場合、双方のＲ’基はＨではない）
    の基を３’炭素原子が付着しているように、そこに共有結合した除去可能な３’−ＯＨ遮断基を有するリボース又はデオキシリボース糖部分と
    を含む修飾されたヌクレオチド又はヌクレオシド分子。
  2. Ｒ’がアルキル又は置換アルキルである、請求項１に記載の分子。
  3. −Ｚが式−Ｃ（Ｒ’）−Ｎ３である、請求項１又は２に記載の分子。
  4. Ｚがアジドメチル基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分子。
  5. Ｒ’’がベンジル又は置換ベンジル基である、請求項１又は２に記載の分子。
  6. 前記塩基が切断可能なリンカー又は切断不能なリンカーを介して検出可能な標識に連結されている、先行する請求項のいずれか一項に記載の分子。
  7. 前記リンカーが切断可能なリンカーである、請求項６に記載の分子。
  8. 検出可能な標識が切断可能な又は切断不能なリンカーにより遮断基を介して分子に連結されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分子。
  9. 前記検出可能な標識がフルオロフォアである、請求項６〜８のいずれか一項に記載の分子。
  10. 前記リンカーが酸に不安定か、光に不安定か、又はジスルフィド結合を含有する、請求項６〜９のいずれか一項に記載の分子。
  11. １つ以上の３２Ｐ原子をそのリン酸部分に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子。
  12. 式ＰＮ−Ｏ−アリルのヌクレオシド、ヌクレオチド又はポリヌクレオチド分子であって、ここでＰＮは前記ヌクレオシドもしくはヌクレオチドであるか、又は前記ポリヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドであり；そして前記ヌクレオシド又はヌクレオチドはアリル遮断基に加えて更に切断可能な又は切断不能なリンカーによりその塩基に連結された検出可能な標識を含む、ヌクレオシド、ヌクレオチド又はポリヌクレオチド分子。
  13. 前記リンカーが切断可能である、請求項１２に記載の分子。
  14. 前記検出可能な標識がフルオロフォアである、請求項１２又は１３に記載の分子。
  15. 前記リンカーが酸に不安定か、光に不安定か、又はジスルフィド結合を含有する、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の分子。
  16. 式Ｒ−Ｏ−アリル、Ｒ２Ｎ（アリル）、ＲＮＨ（アリル）、ＲＮ（アリル）２又はＲ−Ｓ−アリルの化合物を、アリル基が除去され、水素で置換される対応する化合物に変換する方法であって、式Ｒ−Ｏ−アリル、Ｒ２Ｎ（アリル）、ＲＮＨ（アリル）、ＲＮ（アリル）２又はＲ−Ｓ−アリルの化合物を、遷移金属並びに水溶性ホスフィン及び水溶性窒素含有ホスフィンリガンドを含む群から選択される１つ以上のリガンドを含む遷移金属と水溶液中で反応させるステップを含み、ここで、その、又は各Ｒは、水溶性生物学的分子である方法。
  17. 前記化合物が式Ｒ−Ｏ−アリルである、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記Ｒがヌクレオシド、ヌクレオチド又はポリヌクレオチド分子の一部である、請求項１６又は１７に記載の方法。
  19. 前記ヌクレオシド、ヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、切断可能な又は切断不能なリンカーによりその塩基に連結された検出可能な標識を更に含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記リンカーが切断可能である、請求項１９に記載の分子。
  21. 前記検出可能な標識がフルオロフォアである、請求項１９又は２０に記載の方法。
  22. 前記リンカーが酸に不安定か、光に不安定か、又はジスルフィド結合を含有する、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記アリル基及び前記標識が単一のステップで除去される、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記遷移金属が白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、オスミウム及びイリジウムを含む群から選択される、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記遷移金属がパラジウムである、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記リガンドの群が誘導体化されたトリアリールホスフィンリガンド又は誘導体化されたトリアルキルホスフィンリガンドを含む、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記リガンドの群がアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル及びスルホナート基を含む群から選択される１つ以上の官能基で誘導体化されている、請求項１６〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. リガンドの群が３，３’、３’’−ホスフィニジントリス（ベンゼンスルホン酸）及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン並びにその塩を含む、請求項１６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 合成又はシークエンシング反応において、請求項６〜１０のいずれかで定義されるか又は請求項１２〜１５のいずれかで定義され、標的１本鎖ポリヌクレオチドの第２のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドの取り込みを調節する方法であって、前記ヌクレオチドを伸長中の相補的なポリヌクレオチドに取り込むことを含み、前記ヌクレオチドの取り込みは引き続くヌクレオシド又はヌクレオチド分子が前記伸長中の相補的なポリヌクレオチドへ導入されることを阻止又は遮断する、方法。
  30. 前記ヌクレオチドの取り込みがターミナル・トランスフェラーゼ又はポリメラーゼ又は逆転写酵素により達成される、請求項２９に記載の方法。
  31. ポリメラーゼがＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種である、請求項３０に記載の方法。
  32. Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種が９°Ｎ又はその単一変異体もしくは二重変異体である、請求項３１に記載の方法。
  33. 二重変異体が−Ｙ４０９Ｖ Ａ４８５Ｌである、請求項３２に記載の方法。
  34. 標的１本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって、
    相補的ヌクレオチドの逐次的な取り込みをモニターするステップを含み、ここで少なくとも１つの取り込みは請求項６〜１０のいずれかで定義されるか又は請求項１２〜１５のいずれかで定義されるヌクレオチドの取り込みであり、そしてここで取り込まれたヌクレオチドの同一性は塩基に連結された標識を検出することにより決定され、そして遮断基及び前記標識は次の相補的ヌクレオチドの導入の前に除去される、方法。
  35. ヌクレオチドの標識及び遮断基が単一の化学的処理ステップで除去される、請求項３４に記載の方法。
  36. 標的１本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって：
    （ａ）複数の異なるヌクレオチドを提供するステップであって、前記複数の異なるヌクレオチドは請求項６〜１０のいずれかで定義されるか又は請求項１２〜１５のいずれかで定義されるいずれかであり、そしてここで各型のヌクレオチドに連結された検出可能な標識をその他の型のヌクレオチドに用いた検出可能な標識から検出時に区別できるステップと；
    （ｂ）ヌクレオチドを標的１本鎖ポリヌクレオチドの相補体に取り込むステップと；
    （ｃ）（ｂ）のヌクレオチドの標識を検出し、それにより取り込まれたヌクレオチドの型を決定するステップと；
    （ｄ）（ｂ）のヌクレオチドの標識及び遮断基を除去するステップと；
    （ｅ）場合によっては（ｂ）〜（ｄ）のステップを１回以上繰り返すステップと；
    を備え、それにより標的１本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定する、方法。
  37. 前記取り込みステップがＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種により達成される、請求項３６に記載の方法。
  38. Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種が９°Ｎ又はその単一変異体もしくは二重変異体である、請求項３７に記載の方法。
  39. 二重変異体が−Ｙ４０９Ｖ Ａ４８５Ｌである、請求項３８に記載の方法。
  40. ヌクレオチドの標識及び遮断基が単一の化学的処理ステップで除去される、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 各々のヌクレオチドを連続的に標的と接触させ、次のヌクレオチドを添加する前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、標識及び遮断基の検出及び除去を各ヌクレオチドの添加後か、又は４つ全てのヌクレオチドの添加後のいずれかに実施する、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 各々のヌクレオチドを同時に一緒に標的に接触させ、そして標識及び遮断基の検出の前及び除去に続いて取り込まれていないヌクレオチドを除去する、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  43. 第１工程及び第２工程を含み、第１工程では、４つのヌクレオチドのうちの２つを含む第１の組成物を標的と接触させ、そして標識の検出及び引き続く除去の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、そして第２工程では、第１の組成物に含まれていない２つのヌクレオチドを含む第２の組成物を標的と接触させ、そして標識及び遮断基の検出及び引き続く除去の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、そして場合によっては第１工程及び第２工程を１回以上繰り返す、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  44. 第１工程及び第２工程を含み、第１工程では、４つのヌクレオチドのうちの１つを含む組成物を標的と接触させ、そして標識及び遮断基の検出及び引き続く除去の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、そして第２工程では、第１の組成物に含まれていない３つのヌクレオチドを含む第２の組成物を標的と接触させ、そして標識及び遮断基の検出及び引き続く除去の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、そして場合によっては第１工程及び第２工程を１回以上繰り返す、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  45. 第１工程及び第２工程を含み、第１工程では、４つのヌクレオチドのうちの３つを含む第１の組成物を標的と接触させ、そして標識及び遮断基の検出及び引き続く除去の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、そして第２工程では、第１の組成物に含まれていないヌクレオチドを含む組成物を標的と接触させ、そして標識及び遮断基の検出及び引き続く除去の前に取り込まれていないヌクレオチドを除去し、そして場合によっては第１工程及び第２工程を１回以上繰り返す、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
  46. （ａ）請求項６〜１０のいずれかで定義されるか又は請求項１２〜１５のいずれかで定義されるヌクレオチドのいずれかである複数の異なるヌクレオチド；及び
    （ｂ）そのための包装材料；
    を含むキット。
  47. 各ヌクレオチドの検出可能な標識をその他の３つの型のヌクレオチドのいずれかに用いた検出可能な標識から検出時に区別することができる、請求項４６に記載のキット。
  48. 酵素及び酵素の作用に適当なバッファーを更に含む、請求項４６又は４７に記載のキット。
  49. サンガー又はサンガー型シークエンシング方法における、請求項１〜１５のいずれかで定義されるヌクレオチドの使用。
  50. サンガー又はサンガー型シークエンシング方法を含む、請求項１に記載のヌクレオチドを使用する方法。
JP2005501219A 2002-08-23 2003-08-22 修飾されたヌクレオチド Pending JP2006509040A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/227,131 US7057026B2 (en) 2001-12-04 2002-08-23 Labelled nucleotides
GB0230037A GB0230037D0 (en) 2002-12-23 2002-12-23 Modified nucleotides
GB0303924A GB0303924D0 (en) 2003-02-20 2003-02-20 Modified nucleotides
PCT/GB2003/003686 WO2004018497A2 (en) 2002-08-23 2003-08-22 Modified nucleotides for polynucleotide sequencing

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2010254204A Division JP2011088898A (ja) 2002-08-23 2010-11-12 修飾されたヌクレオチド

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2006509040A true JP2006509040A (ja) 2006-03-16

Family

ID=46324959

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2005501219A Pending JP2006509040A (ja) 2002-08-23 2003-08-22 修飾されたヌクレオチド
JP2010254204A Pending JP2011088898A (ja) 2002-08-23 2010-11-12 修飾されたヌクレオチド
JP2013150717A Expired - Lifetime JP5748805B2 (ja) 2002-08-23 2013-07-19 修飾されたヌクレオチド

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2010254204A Pending JP2011088898A (ja) 2002-08-23 2010-11-12 修飾されたヌクレオチド
JP2013150717A Expired - Lifetime JP5748805B2 (ja) 2002-08-23 2013-07-19 修飾されたヌクレオチド

Country Status (10)

Country Link
US (9) US7541444B2 (ja)
EP (6) EP1530578B1 (ja)
JP (3) JP2006509040A (ja)
AU (1) AU2003259350A1 (ja)
CY (1) CY1120186T1 (ja)
DK (3) DK3002289T3 (ja)
ES (2) ES2407681T3 (ja)
GB (1) GB2395954A (ja)
SI (3) SI3002289T1 (ja)
WO (1) WO2004018497A2 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016512206A (ja) * 2013-03-15 2016-04-25 イルミナ ケンブリッジ リミテッド 修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチド
JP2017525695A (ja) * 2014-08-08 2017-09-07 イルミナ ケンブリッジ リミテッド 修飾ヌクレオチドリンカー
JP2018039842A (ja) * 2017-12-05 2018-03-15 イルミナ ケンブリッジ リミテッド 修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチド
JP2018528959A (ja) * 2015-09-25 2018-10-04 イルミナ ケンブリッジ リミテッド ポリメチン化合物および蛍光標識としてのそれらの使用
JP2022515944A (ja) * 2018-12-26 2022-02-24 イルミナ ケンブリッジ リミテッド ３’－ヒドロキシブロッキング基を有するヌクレオシドおよびヌクレオチド、ならびにそれらのポリヌクレオチドシーケンシング方法における使用
JP2022516684A (ja) * 2019-01-08 2022-03-01 シンギュラー・ゲノミクス・システムズ・インコーポレイテッド ヌクレオチドの開裂可能なリンカーおよびその使用

Families Citing this family (686)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3034627B1 (en) 2000-10-06 2019-01-30 The Trustees of Columbia University in the City of New York Massive parallel method for decoding dna and rna
US9708358B2 (en) 2000-10-06 2017-07-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding DNA and RNA
US7057026B2 (en) * 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
GB0129012D0 (en) 2001-12-04 2002-01-23 Solexa Ltd Labelled nucleotides
WO2004018493A1 (en) 2002-08-23 2004-03-04 Solexa Limited Labelled nucleotides
EP1530578B1 (en) 2002-08-23 2013-03-13 Illumina Cambridge Limited Modified nucleotides for polynucleotide sequencing
US7414116B2 (en) 2002-08-23 2008-08-19 Illumina Cambridge Limited Labelled nucleotides
US11008359B2 (en) 2002-08-23 2021-05-18 Illumina Cambridge Limited Labelled nucleotides
US20100022414A1 (en) 2008-07-18 2010-01-28 Raindance Technologies, Inc. Droplet Libraries
GB0307428D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Compartmentalised combinatorial chemistry
US20060078893A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
GB0307403D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Selection by compartmentalised screening
GB0321306D0 (en) 2003-09-11 2003-10-15 Solexa Ltd Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues
EP1725572B1 (de) 2003-11-05 2017-05-31 AGCT GmbH Makromolekulare nukleotidverbindungen und methoden zu deren anwendung
EP2436778A3 (en) 2004-03-03 2012-07-11 The Trustees of Columbia University in the City of New York Photocleavable fluorescent nucleotides for DNA sequencing on chip constructed by site-specific coupling chemistry
JP4627625B2 (ja) * 2004-03-11 2011-02-09 三井化学株式会社 Ｎ−アセチルシチジン類の製造方法
US20050221339A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Medical Research Council Harvard University Compartmentalised screening by microfluidic control
US7968287B2 (en) 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
AU2006210553A1 (en) 2005-02-01 2006-08-10 Ab Advanced Genetic Analysis Corporation Reagents, methods and libraries for bead-based sequencing
EP2233582A1 (en) 2005-02-01 2010-09-29 AB Advanced Genetic Analysis Corporation Nucleic acid sequencing by performing successive cycles of duplex extension
GB0507835D0 (en) * 2005-04-18 2005-05-25 Solexa Ltd Method and device for nucleic acid sequencing using a planar wave guide
US8623628B2 (en) 2005-05-10 2014-01-07 Illumina, Inc. Polymerases
DK2620510T4 (da) 2005-06-15 2020-03-30 Complete Genomics Inc Enkeltmolekyle-arrays til genetisk og kemisk analyse
US9169510B2 (en) * 2005-06-21 2015-10-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Pyrosequencing methods and related compositions
GB0514935D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Methods for sequencing a polynucleotide template
JP4621921B2 (ja) * 2005-07-27 2011-02-02 国立大学法人群馬大学 新規核酸誘導体及びそれを用いたポリヌクレオチドの製造方法
GB0517097D0 (en) 2005-08-19 2005-09-28 Solexa Ltd Modified nucleosides and nucleotides and uses thereof
WO2007050811A2 (en) 2005-10-27 2007-05-03 The President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for labeling nucleic acids
WO2007053719A2 (en) 2005-10-31 2007-05-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chemically cleavable 3'-o-allyl-dntp-allyl-fluorophore fluorescent nucleotide analogues and related methods
US7982029B2 (en) 2005-10-31 2011-07-19 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Synthesis of four color 3′O-allyl, modified photocleavable fluorescent nucleotides and related methods
GB0524069D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Solexa Ltd Preparation of templates for solid phase amplification
EP3913375A1 (en) 2006-01-11 2021-11-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic devices and methods of use in the formation and control of nanoreactors
DK1991273T4 (da) 2006-02-10 2022-02-07 Life Technologies Corp Mærkning og påvisning af post-translationelt modificerede proteiner
US8114636B2 (en) * 2006-02-10 2012-02-14 Life Technologies Corporation Labeling and detection of nucleic acids
CN101460953B (zh) 2006-03-31 2012-05-30 索雷克萨公司 用于合成分析的序列的***和装置
EP2002017B1 (en) 2006-04-04 2015-06-10 Keygene N.V. High throughput detection of molecular markers based on restriction fragments
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
US20080003142A1 (en) 2006-05-11 2008-01-03 Link Darren R Microfluidic devices
US8178360B2 (en) 2006-05-18 2012-05-15 Illumina Cambridge Limited Dye compounds and the use of their labelled conjugates
US8921073B2 (en) 2006-06-23 2014-12-30 Illumina, Inc. Devices and systems for creation of DNA cluster arrays
PL2038425T3 (pl) 2006-07-12 2011-03-31 Keygene Nv Wysokowydajne mapowanie fizyczne z zastosowaniem techniki AFLP
EP2077912B1 (en) 2006-08-07 2019-03-27 The President and Fellows of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
WO2008037568A2 (en) * 2006-09-04 2008-04-03 Quiatech Ab Reversible terminators for efficient sequencing by synthesis
EP2071927A2 (en) 2006-09-28 2009-06-24 Illumina, Inc. Compositions and methods for nucleotide sequencing
US7754429B2 (en) 2006-10-06 2010-07-13 Illumina Cambridge Limited Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides
WO2008045158A1 (en) 2006-10-10 2008-04-17 Illumina, Inc. Compositions and methods for representational selection of nucleic acids fro complex mixtures using hybridization
DE112007002932B4 (de) 2006-12-01 2015-08-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Vierfarben DNA-Sequenzierung mittels Synthese unter Verwendung von abspaltbaren, reversiblen, fluoreszierenden Nucleotidterminatoren
US7897737B2 (en) 2006-12-05 2011-03-01 Lasergen, Inc. 3′-OH unblocked, nucleotides and nucleosides, base modified with photocleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing
US7893227B2 (en) * 2006-12-05 2011-02-22 Lasergen, Inc. 3′-OH unblocked nucleotides and nucleosides base modified with non-cleavable, terminating groups and methods for their use in DNA sequencing
US11940413B2 (en) 2007-02-05 2024-03-26 IsoPlexis Corporation Methods and devices for sequencing nucleic acids in smaller batches
US8772046B2 (en) 2007-02-06 2014-07-08 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
WO2008130623A1 (en) 2007-04-19 2008-10-30 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
EP3431615A3 (en) * 2007-10-19 2019-02-20 The Trustees of Columbia University in the City of New York Dna sequencing with non-fluorescent nucleotide reversible terminators cleavable label modified nucleotide terminators
EP2207900B1 (en) 2007-10-19 2015-04-29 The Trustees of Columbia University in the City of New York Design and synthesis of cleavable fluorescent nucleotides as reversible terminators for dna sequencing by synthesis
CN101925366B (zh) 2007-11-21 2015-02-04 乔治亚大学研究基金公司 炔烃以及炔烃与1,3-偶极-官能化合物反应的方法
WO2009097368A2 (en) 2008-01-28 2009-08-06 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions
NZ588112A (en) 2008-03-17 2013-04-26 Expressive Res Bv Expression-linked gene discovery
US9017973B2 (en) 2008-03-19 2015-04-28 Intelligent Biosystems, Inc. Methods and compositions for incorporating nucleotides
US8623598B2 (en) * 2008-03-19 2014-01-07 Intelligent Bio Systems, Inc. Methods and compositions for inhibiting undesired cleaving of labels
AU2009242546B2 (en) * 2008-04-30 2015-01-22 Integrated Dna Technologies, Inc. RNase-H-based assays utilizing modified RNA monomers
US8911948B2 (en) 2008-04-30 2014-12-16 Integrated Dna Technologies, Inc. RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers
US8039817B2 (en) 2008-05-05 2011-10-18 Illumina, Inc. Compensator for multiple surface imaging
WO2009137521A2 (en) * 2008-05-07 2009-11-12 Illumina, Inc. Compositions and methods for providing substances to and from an array
WO2009140541A2 (en) 2008-05-16 2009-11-19 Life Technologies Corporation Dual labeling methods for measuring cellular proliferation
CA2725239C (en) * 2008-05-27 2019-02-26 Trilink Biotechnologies Chemically modified nucleoside 5'-triphosphates for thermally initiated amplification of nucleic acid
KR101677772B1 (ko) 2008-06-11 2016-11-18 레이저젠, 인코퍼레이티드 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 그리고 시퀀싱에서의 이들의 이용 방법
WO2010003132A1 (en) 2008-07-02 2010-01-07 Illumina Cambridge Ltd. Using populations of beads for the fabrication of arrays on surfaces
US12038438B2 (en) 2008-07-18 2024-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enzyme quantification
US8383345B2 (en) 2008-09-12 2013-02-26 University Of Washington Sequence tag directed subassembly of short sequencing reads into long sequencing reads
WO2010038042A1 (en) 2008-10-02 2010-04-08 Illumina Cambridge Ltd. Nucleic acid sample enrichment for sequencing applications
WO2010048337A2 (en) 2008-10-22 2010-04-29 Illumina, Inc. Preservation of information related to genomic dna methylation
AU2009319907B2 (en) 2008-11-03 2015-10-01 The Regents Of The University Of California Methods for detecting modification resistant nucleic acids
EP2373817A4 (en) * 2008-12-10 2013-01-02 Illumina Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR HYBRIDIZING NUCLEIC ACIDS
EP2379748A4 (en) 2008-12-23 2012-08-29 Illumina Inc MULTIBASE RELEASE FOR LONG READINGS IN SEQUENCING BY SYNTHESIS PROTOCOLS
EP2379751B1 (en) 2009-01-13 2013-03-20 Keygene N.V. Novel genome sequencing strategies
EP3415235A1 (en) 2009-03-23 2018-12-19 Raindance Technologies Inc. Manipulation of microfluidic droplets
WO2010111674A2 (en) * 2009-03-27 2010-09-30 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for single molecule sequencing using energy transfer detection
US20100330569A1 (en) * 2009-04-23 2010-12-30 Intelligent Bio-Systems, Inc. Hydroxymethyl Linkers For Labeling Nucleotides
JP2012525147A (ja) 2009-04-30 2012-10-22 グッド スタート ジェネティクス， インコーポレイテッド 遺伝マーカーを評価するための方法および組成物
US20100279882A1 (en) * 2009-05-01 2010-11-04 Mostafa Ronaghi Sequencing methods
WO2010141390A2 (en) 2009-06-05 2010-12-09 Life Technologies Corporation Nucleotide transient binding for sequencing methods
US10036063B2 (en) 2009-07-24 2018-07-31 Illumina, Inc. Method for sequencing a polynucleotide template
PL2669387T3 (pl) 2009-08-25 2016-12-30 Sposoby selekcji i amplifikacji polinukleotydów
EP2486409A1 (en) 2009-10-09 2012-08-15 Universite De Strasbourg Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof
WO2011050938A1 (de) 2009-10-26 2011-05-05 Genovoxx Gmbh Konjugate von nukleotiden und methoden zu deren anwendung
US10837883B2 (en) 2009-12-23 2020-11-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic systems and methods for reducing the exchange of molecules between droplets
US8422031B2 (en) 2010-02-01 2013-04-16 Illumina, Inc. Focusing methods and optical systems and assemblies using the same
EP3392349A1 (en) 2010-02-12 2018-10-24 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US10351905B2 (en) 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US8603741B2 (en) 2010-02-18 2013-12-10 Pacific Biosciences Of California, Inc. Single molecule sequencing with two distinct chemistry steps
US8759037B2 (en) 2010-02-23 2014-06-24 Illumina Cambridge Limited Amplification methods to minimise sequence specific bias
CN202281746U (zh) 2010-03-06 2012-06-20 伊鲁米那股份有限公司 检测来自样品光信号的测定设备及其光学组件和光学***
US8951940B2 (en) 2010-04-01 2015-02-10 Illumina, Inc. Solid-phase clonal amplification and related methods
US20190300945A1 (en) 2010-04-05 2019-10-03 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially Encoded Biological Assays
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
WO2011127099A1 (en) 2010-04-05 2011-10-13 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US9029103B2 (en) 2010-08-27 2015-05-12 Illumina Cambridge Limited Methods for sequencing polynucleotides
WO2012034007A2 (en) 2010-09-10 2012-03-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. Size selection of dna for chromatin analysis
US8483969B2 (en) 2010-09-17 2013-07-09 Illuminia, Inc. Variation analysis for multiple templates on a solid support
US8759038B2 (en) 2010-09-29 2014-06-24 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for sequencing nucleic acids
EP2622103B2 (en) 2010-09-30 2022-11-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Sandwich assays in droplets
EP2633069B1 (en) 2010-10-26 2015-07-01 Illumina, Inc. Sequencing methods
WO2012058096A1 (en) 2010-10-27 2012-05-03 Illumina, Inc. Microdevices and biosensor cartridges for biological or chemical analysis and systems and methods for the same
US8575071B2 (en) 2010-11-03 2013-11-05 Illumina, Inc. Reducing adapter dimer formation
US9074251B2 (en) 2011-02-10 2015-07-07 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
AU2011323107B2 (en) 2010-11-05 2015-09-10 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
EP2643484A4 (en) 2010-11-22 2014-04-16 Univ California METHOD OF IDENTIFYING AN RNA TRANSCRIPTION OF CELLULAR ORIGIN
WO2013082164A1 (en) 2011-11-28 2013-06-06 Life Technologies Corporation Enhanced ligation reactions
US9163281B2 (en) 2010-12-23 2015-10-20 Good Start Genetics, Inc. Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction
US8951781B2 (en) 2011-01-10 2015-02-10 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis
ES2627851T3 (es) 2011-01-31 2017-07-31 Illumina, Inc. Métodos para reducir el daño en ácidos nucleicos
WO2012106546A2 (en) 2011-02-02 2012-08-09 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Massively parallel continguity mapping
EP3859011A1 (en) 2011-02-11 2021-08-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods for forming mixed droplets
EP2675819B1 (en) 2011-02-18 2020-04-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
AU2012236896A1 (en) 2011-03-25 2013-05-16 Integrated Dna Technologies, Inc. RNase H-based assays utilizing modified RNA monomers
GB201106254D0 (en) 2011-04-13 2011-05-25 Frisen Jonas Method and product
DE102012008375A1 (de) 2011-04-27 2012-10-31 Genovoxx Gmbh Methoden und Komponenten zur Detektion von Nukleinsäureketten
WO2012150035A1 (de) 2011-05-04 2012-11-08 Genovoxx Gmbh Nukleosid-triphosphat-konjugate und methoden zu deren anwendung
WO2012162429A2 (en) 2011-05-23 2012-11-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Dna sequencing by synthesis using raman and infrared spectroscopy detection
DE202012013668U1 (de) 2011-06-02 2019-04-18 Raindance Technologies, Inc. Enzymquantifizierung
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
WO2012170936A2 (en) 2011-06-09 2012-12-13 Illumina, Inc. Patterned flow-cells useful for nucleic acid analysis
DK2729580T3 (en) 2011-07-08 2015-12-14 Keygene Nv SEQUENCE BASED genotyping BASED ON OLIGONUKLEOTIDLIGERINGSASSAYS
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
CA2848049C (en) 2011-09-13 2021-01-26 Lasergen, Inc. 5-methoxy, 3'-oh unblocked, fast photocleavable terminating nucleotides and methods for nucleic acid sequencing
HUE056246T2 (hu) 2011-09-23 2022-02-28 Illumina Inc Készítmények nukleinsav-szekvenáláshoz
WO2013049135A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Gen-Probe Incorporated Algorithms for sequence determinations
US10378051B2 (en) 2011-09-29 2019-08-13 Illumina Cambridge Limited Continuous extension and deblocking in reactions for nucleic acids synthesis and sequencing
EP2768983A4 (en) 2011-10-17 2015-06-03 Good Start Genetics Inc METHODS OF IDENTIFYING MUTATIONS ASSOCIATED WITH DISEASES
CA2856163C (en) 2011-10-28 2019-05-07 Illumina, Inc. Microarray fabrication system and method
EP2776165A2 (en) 2011-11-07 2014-09-17 Illumina, Inc. Integrated sequencing apparatuses and methods of use
EP2788499B1 (en) 2011-12-09 2016-01-13 Illumina, Inc. Expanded radix for polymeric tags
WO2013117595A2 (en) 2012-02-07 2013-08-15 Illumina Cambridge Limited Targeted enrichment and amplification of nucleic acids on a support
WO2013126741A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Raindance Technologies, Inc. Labeling and sample preparation for sequencing
NO2694769T3 (ja) 2012-03-06 2018-03-03
US20130261984A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Illumina, Inc. Methods and systems for determining fetal chromosomal abnormalities
EP2834622B1 (en) 2012-04-03 2023-04-12 Illumina, Inc. Integrated optoelectronic read head and fluidic cartridge useful for nucleic acid sequencing
US8209130B1 (en) 2012-04-04 2012-06-26 Good Start Genetics, Inc. Sequence assembly
US8812422B2 (en) 2012-04-09 2014-08-19 Good Start Genetics, Inc. Variant database
US9444880B2 (en) 2012-04-11 2016-09-13 Illumina, Inc. Cloud computing environment for biological data
US20130274148A1 (en) 2012-04-11 2013-10-17 Illumina, Inc. Portable genetic detection and analysis system and method
US10227635B2 (en) 2012-04-16 2019-03-12 Molecular Loop Biosolutions, Llc Capture reactions
WO2013166305A1 (en) 2012-05-02 2013-11-07 Ibis Biosciences, Inc. Dna sequencing
EP2844775B1 (en) 2012-05-02 2018-07-18 Ibis Biosciences, Inc. Dna sequencing
WO2013166303A1 (en) 2012-05-02 2013-11-07 Ibis Biosciences, Inc. Dna sequencing
US9012022B2 (en) 2012-06-08 2015-04-21 Illumina, Inc. Polymer coatings
US8895249B2 (en) 2012-06-15 2014-11-25 Illumina, Inc. Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
EP2870264A4 (en) 2012-07-03 2016-03-02 Sloan Kettering Inst Cancer QUANTITATIVE ASSESSMENT OF THE RECOVERY OF HUMAN T-CELL REPERTOIR AFTER TRANSPLANTATION OF ALLOGENIC BLOOD-GENERATING STEM CELLS
US9092401B2 (en) 2012-10-31 2015-07-28 Counsyl, Inc. System and methods for detecting genetic variation
EP2875173B1 (en) 2012-07-17 2017-06-28 Counsyl, Inc. System and methods for detecting genetic variation
NL2017959B1 (en) 2016-12-08 2018-06-19 Illumina Inc Cartridge assembly
CA3178340A1 (en) 2012-08-20 2014-02-27 Illumina, Inc. Method and system for fluorescence lifetime based sequencing
US9150896B2 (en) 2012-09-06 2015-10-06 Illumina, Inc. Nucleotides and primers with removable blocking groups
US9181583B2 (en) 2012-10-23 2015-11-10 Illumina, Inc. HLA typing using selective amplification and sequencing
US9116139B2 (en) 2012-11-05 2015-08-25 Illumina, Inc. Sequence scheduling and sample distribution techniques
US9683230B2 (en) 2013-01-09 2017-06-20 Illumina Cambridge Limited Sample preparation on a solid support
US9805407B2 (en) 2013-01-25 2017-10-31 Illumina, Inc. Methods and systems for using a cloud computing environment to configure and sell a biological sample preparation cartridge and share related data
US9512422B2 (en) 2013-02-26 2016-12-06 Illumina, Inc. Gel patterned surfaces
ES2662598T3 (es) 2013-03-08 2018-04-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Análisis de sangre para la detección de mutaciones de EGFR
WO2014135223A1 (en) 2013-03-08 2014-09-12 Illumina Cambridge Ltd Rhodamine compounds and their use as fluorescent labels
ES2620423T3 (es) 2013-03-08 2017-06-28 Illumina Cambridge Limited Compuestos de polimetina y su uso como marcadores fluorescentes
US10557133B2 (en) 2013-03-13 2020-02-11 Illumina, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sequencing
EP2969479B1 (en) 2013-03-13 2021-05-05 Illumina, Inc. Multilayer fluidic devices and methods for their fabrication
US9146248B2 (en) 2013-03-14 2015-09-29 Intelligent Bio-Systems, Inc. Apparatus and methods for purging flow cells in nucleic acid sequencing instruments
WO2014152421A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Good Start Genetics, Inc. Methods for analyzing nucleic acids
US10421996B2 (en) 2013-03-14 2019-09-24 Illumina, Inc. Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues
US20140274747A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Illumina, Inc. Super resolution imaging
US9193998B2 (en) 2013-03-15 2015-11-24 Illumina, Inc. Super resolution imaging
WO2014144883A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Raman cluster tagged molecules for biological imaging
US9591268B2 (en) 2013-03-15 2017-03-07 Qiagen Waltham, Inc. Flow cell alignment methods and systems
US9845493B2 (en) 2013-04-19 2017-12-19 Agency For Science, Technology And Research Tunable fluorescence using cleavable linkers
EP3005200A2 (en) 2013-06-03 2016-04-13 Good Start Genetics, Inc. Methods and systems for storing sequence read data
WO2014210225A1 (en) 2013-06-25 2014-12-31 Prognosys Biosciences, Inc. Methods and systems for determining spatial patterns of biological targets in a sample
DK3431614T3 (da) 2013-07-01 2021-12-06 Illumina Inc Katalysator fri overfladefunktionalisering og polymerpodning
EP3017063B1 (en) 2013-07-03 2017-04-05 Illumina, Inc. Sequencing by orthogonal synthesis
MX370560B (es) 2013-08-08 2019-12-17 Illumina Inc Sistema de fluidos para distribución de reactivo a una celda de flujo.
US9352315B2 (en) 2013-09-27 2016-05-31 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. Method to produce chemical pattern in micro-fluidic structure
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
CN103601778A (zh) * 2013-10-17 2014-02-26 上海交通大学 7-去氮-7-取代鸟嘌呤核苷的合成方法
US10851414B2 (en) 2013-10-18 2020-12-01 Good Start Genetics, Inc. Methods for determining carrier status
US11041203B2 (en) 2013-10-18 2021-06-22 Molecular Loop Biosolutions, Inc. Methods for assessing a genomic region of a subject
US10540783B2 (en) 2013-11-01 2020-01-21 Illumina, Inc. Image analysis useful for patterned objects
EP2876166B1 (en) 2013-11-20 2016-12-14 Roche Diagnostics GmbH New compound for sequencing by synthesis
EP3940082A1 (en) 2013-12-03 2022-01-19 Illumina, Inc. Methods and systems for analyzing image data
BR112016013353B1 (pt) 2013-12-10 2020-11-24 Illumina, Inc Biossensor e metodo para produzir um biossensor
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
CN106414765A (zh) 2013-12-20 2017-02-15 Illumina公司 在片段化的基因组dna样品中保留基因组连接信息
EP3087181B1 (en) 2013-12-23 2020-12-02 Illumina, Inc. Structured substrates for improving detection of light emissions and methods relating to the same
US11193176B2 (en) 2013-12-31 2021-12-07 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detecting and quantifying latent retroviral RNA species
US10537889B2 (en) 2013-12-31 2020-01-21 Illumina, Inc. Addressable flow cell using patterned electrodes
AU2014377537B2 (en) 2014-01-16 2021-02-25 Illumina, Inc. Amplicon preparation and sequencing on solid supports
US9677132B2 (en) 2014-01-16 2017-06-13 Illumina, Inc. Polynucleotide modification on solid support
EP3105695B1 (en) 2014-02-13 2022-06-01 Illumina, Inc. Integrated consumer genomic services
LT3108009T (lt) 2014-02-18 2021-07-12 Illumina, Inc. Būdai ir kompozicijos, skirti dnr profiliavimui
US10767219B2 (en) 2014-03-11 2020-09-08 Illumina, Inc. Disposable, integrated microfluidic cartridge and methods of making and using same
FR3020071B1 (fr) 2014-04-17 2017-12-22 Dna Script Procede de synthese d'acides nucleiques, notamment d'acides nucleiques de grande longueur, utilisation du procede et kit pour la mise en œuvre du procede
SG11201609053YA (en) 2014-04-29 2016-11-29 Illumina Inc Multiplexed single cell gene expression analysis using template switch and tagmentation
GB201408077D0 (en) 2014-05-07 2014-06-18 Illumina Cambridge Ltd Polymethine compounds and their use as fluorescent labels
WO2015175530A1 (en) 2014-05-12 2015-11-19 Gore Athurva Methods for detecting aneuploidy
WO2015175832A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Illumina, Inc. Nucleic acid synthesis techniques
US10427155B2 (en) 2014-05-27 2019-10-01 Illumina, Inc. Systems and methods for biochemical analysis including a base instrument and a removable cartridge
US9708655B2 (en) 2014-06-03 2017-07-18 Illumina, Inc. Compositions, systems, and methods for detecting events using tethers anchored to or adjacent to nanopores
US20150353989A1 (en) 2014-06-09 2015-12-10 Illumina Cambridge Limited Sample preparation for nucleic acid amplification
EP3155125A1 (en) 2014-06-13 2017-04-19 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for preparing sequencing libraries
US10017759B2 (en) 2014-06-26 2018-07-10 Illumina, Inc. Library preparation of tagged nucleic acid
EP3161154B1 (en) 2014-06-27 2020-04-15 Illumina, Inc. Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues
DK3161152T3 (en) 2014-06-30 2019-03-25 Illumina Inc Methods and compositions using one-sided transposition
EP3169805B1 (en) 2014-07-15 2018-08-29 Illumina, Inc. Biochemically activated electronic device
SG11201702066UA (en) 2014-07-21 2017-04-27 Illumina Inc Polynucleotide enrichment using crispr-cas systems
US9982250B2 (en) 2014-08-21 2018-05-29 Illumina Cambridge Limited Reversible surface functionalization
FR3025201B1 (fr) 2014-09-02 2018-10-12 Dna Script Nucleotides modifies pour la synthese d'acides nucleiques, un kit renfermant de tels nucleotides et leur utilisation pour la production de genes ou sequences d'acides nucleiques synthetiques
WO2016040446A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Good Start Genetics, Inc. Methods for selectively suppressing non-target sequences
WO2016040602A1 (en) 2014-09-11 2016-03-17 Epicentre Technologies Corporation Reduced representation bisulfite sequencing using uracil n-glycosylase (ung) and endonuclease iv
EP3191606B1 (en) 2014-09-12 2020-05-27 Illumina, Inc. Methods for detecting the presence of polymer subunits using chemiluminescence
WO2016044233A1 (en) 2014-09-18 2016-03-24 Illumina, Inc. Methods and systems for analyzing nucleic acid sequencing data
WO2016048829A1 (en) 2014-09-24 2016-03-31 Good Start Genetics, Inc. Process control for increased robustness of genetic assays
DK3201355T3 (en) 2014-09-30 2019-10-14 Illumina Inc Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues
US9897791B2 (en) 2014-10-16 2018-02-20 Illumina, Inc. Optical scanning systems for in situ genetic analysis
WO2016061517A2 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Illumina Cambridge Limited Contiguity preserving transposition
US10059929B2 (en) 2014-10-20 2018-08-28 Molecular Assemblies, Inc. Modified template-independent enzymes for polydeoxynucleotide synthesis
WO2016065248A1 (en) 2014-10-23 2016-04-28 Complete Genomics, Inc. Signal confinement sequencing (scs) and nucleotide analogues for signal confinement sequencing
PL3212684T3 (pl) 2014-10-31 2020-10-19 Illumina Cambridge Limited Polimery i powłoki z kopolimeru DNA
US10000799B2 (en) 2014-11-04 2018-06-19 Boreal Genomics, Inc. Methods of sequencing with linked fragments
WO2016073237A1 (en) 2014-11-05 2016-05-12 Illumina Cambridge Limited Reducing dna damage during sample preparation and sequencing using siderophore chelators
GB201419731D0 (en) 2014-11-05 2014-12-17 Illumina Cambridge Ltd Sequencing from multiple primers to increase data rate and density
CN114438174A (zh) 2014-11-11 2022-05-06 伊鲁米那股份有限公司 使用crispr-cas***的多核苷酸扩增
WO2016075204A1 (en) 2014-11-11 2016-05-19 Illumina, Inc. Methods and arrays for producing and sequencing monoclonal clusters of nucleic acid
EP3227684B1 (en) 2014-12-03 2019-10-02 Isoplexis Corporation Analysis and screening of cell secretion profiles
EP3234187B1 (en) 2014-12-15 2021-02-17 Illumina, Inc. Method for single molecular placement on a substrate
EP3271480B8 (en) 2015-01-06 2022-09-28 Molecular Loop Biosciences, Inc. Screening for structural variants
SG11201706504RA (en) 2015-02-10 2017-09-28 Illumina Inc Methods and compositions for analyzing cellular components
GB201503534D0 (en) * 2015-03-03 2015-04-15 Nuclera Nucleics Ltd Novel method
CN107847930B (zh) 2015-03-20 2020-06-30 亿明达股份有限公司 在竖直或大致竖直的位置中使用的流体盒
AU2016235288B2 (en) 2015-03-24 2019-02-28 Illumina Cambridge Limited Methods, carrier assemblies, and systems for imaging samples for biological or chemical analysis
CN107532205B (zh) 2015-03-31 2021-06-08 伊卢米纳剑桥有限公司 模板的表面连环化
JP6828007B2 (ja) 2015-04-10 2021-02-10 スペーシャル トランスクリプトミクス アクチボラグ 生物学的試料の空間識別されるマルチプレックスな核酸分析
CN112229834A (zh) 2015-04-14 2021-01-15 亿明达股份有限公司 用于改进对光发射的检测的结构化基底及涉及其的方法
US10844428B2 (en) 2015-04-28 2020-11-24 Illumina, Inc. Error suppression in sequenced DNA fragments using redundant reads with unique molecular indices (UMIS)
US9868947B2 (en) 2015-05-04 2018-01-16 Washington University Compositions and methods for the construction of a random allelic series
CN106117288B (zh) * 2015-05-08 2019-10-15 生捷科技控股公司 二硫键连接的可逆终止子
BR112017023188B1 (pt) 2015-05-11 2023-11-14 Illumina, Inc Plataforma para descoberta e análise de agentes terapêuticos
GB201508858D0 (en) 2015-05-22 2015-07-01 Illumina Cambridge Ltd Polymethine compounds with long stokes shifts and their use as fluorescent labels
WO2016196358A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Epicentre Technologies Corporation Methods of analyzing nucleic acids
WO2016196210A2 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Illumina, Inc. Sample carrier and assay system for conducting designated reactions
CN107849598B (zh) 2015-05-29 2021-12-14 伊卢米纳剑桥有限公司 簇中的表面引物的增强利用
SG10202107427PA (en) 2015-06-03 2021-08-30 Illumina Inc Compositions, systems, and methods for sequencing polynucleotides using tethers anchored to polymerases adjacent to nanopores
CN107849600A (zh) 2015-06-09 2018-03-27 生命技术公司 用于分子标记的方法、***、组合物、试剂盒、装置和计算机可读媒体
CN115261468A (zh) 2015-07-06 2022-11-01 伊卢米纳剑桥有限公司 用于核酸扩增的样品制备
US10808282B2 (en) 2015-07-07 2020-10-20 Illumina, Inc. Selective surface patterning via nanoimprinting
GB201512372D0 (en) * 2015-07-15 2015-08-19 Nuclera Nucleics Ltd Novel method
EP3325648B1 (en) 2015-07-17 2023-03-29 Illumina, Inc. Polymer sheets for sequencing applications
CA2993463A1 (en) 2015-07-27 2017-02-02 Illumina, Inc. Spatial mapping of nucleic acid sequence information
IL294145B2 (en) * 2015-07-30 2024-02-01 Illumina Inc Removal of orthogonal blocking of nucleotides
IL295355B2 (en) 2015-08-14 2023-11-01 Illumina Inc System and methods for determining genetic characteristics using magnetically responsive sensors
CN116338219A (zh) 2015-08-24 2023-06-27 亿明达股份有限公司 用于生物和化学测定的线路内蓄压器和流量控制***
EP3341494A1 (en) 2015-08-28 2018-07-04 Illumina, Inc. Nucleic acid sequence analysis from single cells
CN107921432A (zh) 2015-09-02 2018-04-17 伊卢米纳剑桥有限公司 改善流控***中的液滴操作的***和方法
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
WO2017042040A1 (en) 2015-09-09 2017-03-16 Qiagen Gmbh Polymerase enzyme
US10450598B2 (en) 2015-09-11 2019-10-22 Illumina, Inc. Systems and methods for obtaining a droplet having a designated concentration of a substance-of-interest
EP3356381A4 (en) 2015-09-28 2019-06-12 The Trustees of Columbia University in the City of New York DESIGN AND SYNTHESIS OF NUCLEOTIDES BASED ON NOVEL DISULFIDE COMPOUNDS AS REVERSIBLE TERMINATORS FOR DNA SEQUENCING BY SYNTHESIS
US10577643B2 (en) 2015-10-07 2020-03-03 Illumina, Inc. Off-target capture reduction in sequencing techniques
US10465232B1 (en) 2015-10-08 2019-11-05 Trace Genomics, Inc. Methods for quantifying efficiency of nucleic acid extraction and detection
WO2017065194A1 (ja) 2015-10-13 2017-04-20 国立研究開発法人海洋研究開発機構 二本鎖ｒｎａの断片化方法およびその利用
EP3373818B1 (en) 2015-11-09 2024-03-06 Radiaction Ltd. Radiation shielding apparatuses
WO2017087724A1 (en) 2015-11-17 2017-05-26 Omniome, Inc. Methods for determining sequence profiles
WO2017106481A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Illumina, Inc. Distinguishing methylation levels in complex biological samples
CA3008031A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Illumina Singapore Pte Ltd Detection apparatus having a microfluorometer, a fluidic system, and a flow cell latch clamp module
CN108474744B (zh) 2016-03-24 2019-11-05 伊鲁米那股份有限公司 在发光成像中使用的基于光子超晶格的设备和组成物及其使用方法
WO2017168331A1 (en) 2016-03-28 2017-10-05 Boreal Genomics, Inc. Linked duplex fragment sequencing
WO2017172798A1 (en) 2016-03-28 2017-10-05 Illumina, Inc. Multi-plane microarrays
US10961573B2 (en) 2016-03-28 2021-03-30 Boreal Genomics, Inc. Linked duplex target capture
US11326206B2 (en) 2016-04-07 2022-05-10 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods of quantifying target nucleic acids and identifying sequence variants
IL262447B2 (en) 2016-04-22 2023-09-01 Illumina Inc Photonic structure-based devices and compositions for use in luminescent imaging of sites in a pixel and methods of using the devices and compositions
CN109790196B (zh) * 2016-04-22 2022-09-27 深圳华大智造科技股份有限公司 可逆封闭的核苷类似物及其用途
DK3455372T3 (da) 2016-05-11 2020-01-06 Illumina Inc Polynukleotidberigelse og -amplifikation ved anvendelse af argonautsystemer
CN109313396B (zh) 2016-05-18 2022-11-22 Illumina公司 使用图案化疏水性表面进行的自组装图案化
FI3464628T3 (fi) 2016-06-06 2024-05-03 Redvault Biosciences Lp Kohdereportterikonstruktit ja niiden käyttö
EP3472376A4 (en) 2016-06-16 2019-12-18 Richard Edward Watts DIRECTED AND RECORDED COMBINATORY SYNTHESIS OF OLIGONUCLEOTIDES OF CODED PROBE MOLECULES
CA3026773C (en) 2016-07-22 2022-10-18 Oregon Health & Science University Single cell whole genome libraries and combinatorial indexing methods of making thereof
CN117352050A (zh) 2016-09-22 2024-01-05 Illumina公司 体细胞拷贝数变化检测
WO2018064116A1 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Illumina, Inc. Methods and systems for data compression
US10385214B2 (en) 2016-09-30 2019-08-20 Illumina Cambridge Limited Fluorescent dyes and their uses as biomarkers
CN111781139B (zh) 2016-10-14 2023-09-12 亿明达股份有限公司 夹盒组件
PL3529380T3 (pl) 2016-10-19 2022-10-24 Illumina, Inc. Sposoby chemicznej ligacji kwasów nukleinowych
DK3538891T3 (da) 2016-11-11 2022-03-28 Isoplexis Corp Sammensætninger og fremgangsmåder til samtidig genomisk, transkriptomisk og proteomisk analyse af enkeltceller
WO2018093780A1 (en) 2016-11-16 2018-05-24 Illumina, Inc. Validation methods and systems for sequence variant calls
GB201619458D0 (en) 2016-11-17 2017-01-04 Spatial Transcriptomics Ab Method for spatial tagging and analysing nucleic acids in a biological specimen
WO2018098372A1 (en) 2016-11-22 2018-05-31 IsoPlexis Corporation Systems, devices and methods for cell capture and methods of manufacture thereof
WO2018104908A2 (en) 2016-12-09 2018-06-14 Boreal Genomics, Inc. Linked ligation
AU2017371324B2 (en) 2016-12-09 2024-06-13 Massachusetts Institute Of Technology CRISPR effector system based diagnostics
US20180195115A1 (en) 2016-12-22 2018-07-12 Illumina, Inc. Arrays with quality control tracers
RU2765075C2 (ru) 2016-12-22 2022-01-25 Иллюмина, Инк. Биочип, включающий праймер секвенирования и несеквенирующую единицу
AU2017382202B2 (en) 2016-12-22 2022-06-09 Illumina Cambridge Limited Arrays including a resin film and a patterned polymer layer
EP4257596A3 (en) 2016-12-22 2023-12-06 Illumina Cambridge Limited Coumarin compounds and their uses as fluorescent labels
AU2017386515B2 (en) 2016-12-30 2021-08-19 Pacific Biosciences Of California, Inc. Method and system employing distinguishable polymerases for detecting ternary complexes and identifying cognate nucleotides
GB201704754D0 (en) 2017-01-05 2017-05-10 Illumina Inc Kinetic exclusion amplification of nucleic acid libraries
CA3049142A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Illumina, Inc. Phasing correction
WO2018128544A1 (en) 2017-01-06 2018-07-12 Agendia N.V. Biomarkers for selecting patient groups, and uses thereof.
AU2018208462B2 (en) 2017-01-10 2021-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Polymerases engineered to reduce nucleotide-independent DNA binding
CN110178184B (zh) 2017-01-17 2024-04-19 Illumina公司 致癌剪接变体确定
CA3050247A1 (en) 2017-01-18 2018-07-26 Illumina, Inc. Methods and systems for generation and error-correction of unique molecular index sets with heterogeneous molecular lengths
US10415029B2 (en) 2017-01-20 2019-09-17 Omniome, Inc. Allele-specific capture of nucleic acids
EP3565900B1 (en) 2017-01-20 2021-04-07 Omniome, Inc. Genotyping by polymerase binding
US10975427B2 (en) 2017-01-20 2021-04-13 Omniome, Inc. Process for cognate nucleotide detection in a nucleic acid sequencing workflow
GB201701686D0 (en) 2017-02-01 2017-03-15 Illunina Inc System & method with fiducials having offset layouts
GB201701688D0 (en) 2017-02-01 2017-03-15 Illumia Inc System and method with fiducials in non-recliner layouts
GB201701689D0 (en) 2017-02-01 2017-03-15 Illumia Inc System and method with fiducials of non-closed shapes
WO2018148724A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Qiagen Waltham Inc. Polymerase enzyme from pyrococcus furiosus
WO2018148723A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Qiagen Waltham Inc. Polymerase enzyme from pyrococcus abyssi
WO2018148726A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Qiagen Waltham Inc. Polymerase enzyme from phage t4
US20200002689A1 (en) 2017-02-13 2020-01-02 Qiagen Sciences, Llc Polymerase enzyme from 9°n
WO2018148727A1 (en) 2017-02-13 2018-08-16 Qiagen Waltham Inc. Polymerase enzyme from 9°n
US11492666B2 (en) 2017-02-15 2022-11-08 Pacific Biosciences Of California, Inc. Distinguishing sequences by detecting polymerase dissociation
EP3494235A1 (en) 2017-02-17 2019-06-12 Stichting VUmc Swarm intelligence-enhanced diagnosis and therapy selection for cancer using tumor- educated platelets
IL263118B2 (en) 2017-02-21 2023-12-01 Illumina Inc Tegumentation using fixed transpososomes with linkers
WO2018165207A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Singular Genomic Systems, Inc. Nucleic acid sequencing-by-synthesis (sbs) methods that combine sbs cycle steps
US11021740B2 (en) 2017-03-15 2021-06-01 The Broad Institute, Inc. Devices for CRISPR effector system based diagnostics
US11174515B2 (en) 2017-03-15 2021-11-16 The Broad Institute, Inc. CRISPR effector system based diagnostics
CA3056411A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 The Broad Institute, Inc. Crispr effector system based diagnostics for virus detection
US11104937B2 (en) 2017-03-15 2021-08-31 The Broad Institute, Inc. CRISPR effector system based diagnostics
JP7062681B2 (ja) 2017-03-20 2022-05-06 イルミナ インコーポレイテッド 核酸ライブラリを調製するための方法および組成物
EP3601611B1 (en) 2017-03-24 2022-01-05 Life Technologies Corporation Polynucleotide adapters and methods of use thereof
US12018325B2 (en) 2017-03-28 2024-06-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York 3′-O-modified nucleotide analogues with different cleavable linkers for attaching fluorescent labels to the base for DNA sequencing by synthesis
US10737267B2 (en) 2017-04-04 2020-08-11 Omniome, Inc. Fluidic apparatus and methods useful for chemical and biological reactions
AU2018259206B2 (en) 2017-04-23 2024-07-11 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
SG11201909394PA (en) 2017-04-23 2019-11-28 Illumina Inc Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
AU2018259202B2 (en) 2017-04-23 2022-03-24 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for improving sample identification in indexed nucleic acid libraries
DK3872187T3 (da) 2017-04-23 2022-12-05 Illumina Cambridge Ltd Sammensætninger og fremgangsmåder til forbedring af prøveidentificering i indekserede nukleinsyrebiblioteker
US10161003B2 (en) 2017-04-25 2018-12-25 Omniome, Inc. Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency
CN110799653A (zh) 2017-05-01 2020-02-14 伊鲁米那股份有限公司 用于多重大规模平行测序的最佳索引序列
EP3619340A4 (en) 2017-05-02 2021-01-20 Haystack Sciences Corporation MOLECULES FOR THE VERIFICATION OF OLIGONUCLEOTIDE DIRECTED COMBINATIONAL SYNTHESIS AND METHOD OF MANUFACTURING AND USING THEREOF
SG11201910070PA (en) 2017-05-08 2019-11-28 Illumina Inc Universal short adapters for indexing of polynucleotide samples
NZ759895A (en) 2017-06-07 2023-05-26 Illumina Inc Single cell whole genome libraries for methylation sequencing
WO2018231818A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 Life Technologies Corporation Control nucleic acids, and compositions, kits, and uses thereof
EP3642362A1 (en) 2017-06-20 2020-04-29 Illumina, Inc. Methods and compositions for addressing inefficiencies in amplification reactions
GB201711219D0 (en) 2017-07-12 2017-08-23 Illumina Cambridge Ltd Short pendant arm linkers for nucleotides in sequencing applications
AU2018302034B2 (en) 2017-07-18 2021-05-20 Pacific Biosciences Of California, Inc. Method of chemically modifying plastic surfaces
US20200202977A1 (en) 2017-07-31 2020-06-25 Illumina, Inc. Sequencing system with multiplexed biological sample aggregation
AU2018312560B2 (en) 2017-08-01 2022-03-10 Illumina, Inc. Hydrogel beads for nucleotide sequencing
EP3545106B1 (en) 2017-08-01 2022-01-19 Helitec Limited Methods of enriching and determining target nucleotide sequences
ES2941083T3 (es) 2017-08-01 2023-05-16 Mgi Tech Co Ltd Método de secuenciación de ácidos nucleicos
SG11201911869XA (en) 2017-08-01 2020-01-30 Illumina Inc Spatial indexing of genetic material and library preparation using hydrogel beads and flow cells
CN111182972B (zh) 2017-08-15 2022-03-08 欧姆尼奥姆股份有限公司 用于检测化学和生物分析物的扫描装置和方法
US20190077726A1 (en) * 2017-09-13 2019-03-14 Singular Genomics Systems, Inc. Methods of synthesizing labeled nucleosides
US11447818B2 (en) 2017-09-15 2022-09-20 Illumina, Inc. Universal short adapters with variable length non-random unique molecular identifiers
CN116850284A (zh) 2017-09-20 2023-10-10 瑞泽恩制药公司 用于其肿瘤携带高过客基因突变负荷的患者的免疫治疗方法
GB201716931D0 (en) 2017-10-16 2017-11-29 Illumina Cambridge Ltd New fluorescent compounds and their use as biomarkers
SG10202108020VA (en) 2017-10-16 2021-09-29 Illumina Inc Deep learning-based techniques for training deep convolutional neural networks
NZ759880A (en) 2017-10-16 2022-04-29 Illumina Inc Aberrant splicing detection using convolutional neural networks (cnns)
EP4289996A3 (en) 2017-11-06 2024-01-17 Illumina Inc. Nucleic acid indexing techniques
JP6955035B2 (ja) 2017-11-16 2021-10-27 イルミナ インコーポレイテッド マイクロサテライト不安定性を決定するためのシステム及び方法
JP7013490B2 (ja) 2017-11-30 2022-02-15 イルミナ インコーポレイテッド 配列バリアントコールのためのバリデーションの方法及びシステム
KR102494589B1 (ko) 2018-01-08 2023-02-07 일루미나, 인코포레이티드 반도체-기반 검출을 사용한 고-처리율 서열분석
US11561196B2 (en) 2018-01-08 2023-01-24 Illumina, Inc. Systems and devices for high-throughput sequencing with semiconductor-based detection
US11705219B2 (en) 2018-01-15 2023-07-18 Illumina, Inc. Deep learning-based variant classifier
AU2019213047A1 (en) 2018-01-29 2020-07-16 Massachusetts Institute Of Technology CRISPR effector system based diagnostics
AU2019217824A1 (en) 2018-02-06 2020-07-30 Omniome, Inc. Compositions and techniques for nucleic acid primer extension
CA3067140C (en) 2018-02-13 2023-03-21 Illumina, Inc. Dna sequencing using hydrogel beads
WO2019195225A1 (en) 2018-04-02 2019-10-10 Illumina, Inc. Compositions and methods for making controls for sequence-based genetic testing
US20190318806A1 (en) 2018-04-12 2019-10-17 Illumina, Inc. Variant Classifier Based on Deep Neural Networks
AU2019255987A1 (en) 2018-04-19 2020-12-10 Pacific Biosciences Of California, Inc. Improving accuracy of base calls in nucleic acid sequencing methods
JP7511344B2 (ja) 2018-04-20 2024-07-05 イルミナ インコーポレイテッド 単一細胞を封入する方法、封入された細胞およびその使用
JP2021521820A (ja) 2018-04-26 2021-08-30 オムニオム インコーポレイテッドＯｍｎｉｏｍｅ， Ｉｎｃ． 核酸−ヌクレオチド−ポリメラーゼ複合体を安定化するための方法及び組成物
JP7100069B2 (ja) 2018-05-15 2022-07-12 イルミナ インコーポレイテッド 表面結合オリゴヌクレオチドを化学開裂および脱保護するための組成物および方法
JP7234146B2 (ja) 2018-05-17 2023-03-07 イルミナ インコーポレイテッド 低減した増幅バイアスによるハイスループット単一細胞シークエンシング
WO2019227015A1 (en) 2018-05-25 2019-11-28 Illumina, Inc. Circulating rna signatures specific to preeclampsia
US11180794B2 (en) 2018-05-31 2021-11-23 Omniome, Inc. Methods and compositions for capping nucleic acids
CA3101337A1 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Omniome, Inc. Increased signal to noise in nucleic acid sequencing
AU2019282158B2 (en) 2018-06-04 2021-08-12 Illumina, Inc. High-throughput single-cell transcriptome libraries and methods of making and of using
US20200251183A1 (en) 2018-07-11 2020-08-06 Illumina, Inc. Deep Learning-Based Framework for Identifying Sequence Patterns that Cause Sequence-Specific Errors (SSEs)
US11421262B2 (en) 2018-07-24 2022-08-23 Pacific Biosciences Of California, Inc. Serial formation of ternary complex species
WO2020022891A2 (en) 2018-07-26 2020-01-30 Stichting Vumc Biomarkers for atrial fibrillation
SG11202101934SA (en) 2018-07-30 2021-03-30 Readcoor Llc Methods and systems for sample processing or analysis
CN112955568A (zh) 2018-08-15 2021-06-11 Illumina公司 用于改善文库富集的组合物和方法
SG11202102029TA (en) 2018-08-28 2021-03-30 10X Genomics Inc Methods for generating spatially barcoded arrays
EP3844308A1 (en) 2018-08-28 2021-07-07 10X Genomics, Inc. Resolving spatial arrays
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
WO2020056044A1 (en) 2018-09-11 2020-03-19 Singular Genomics Systems, Inc. Modified archaeal family b polymerases
WO2020060811A1 (en) 2018-09-17 2020-03-26 Omniome, Inc. Engineered polymerases for improved sequencing
WO2020069424A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Centrillion Technologies, Inc. Disulfide-linked reversible terminators
WO2020073734A1 (zh) 2018-10-12 2020-04-16 深圳市真迈生物科技有限公司 一种生物芯片及其制备方法
SG11201911777QA (en) 2018-10-15 2020-05-28 Illumina Inc Deep learning-based techniques for pre-training deep convolutional neural networks
EP3870593A4 (en) 2018-10-25 2022-11-16 Singular Genomics Systems, Inc. NUCLEOTIDE ANALOGUES
US11085036B2 (en) 2018-10-26 2021-08-10 Illumina, Inc. Modulating polymer beads for DNA processing
EP3874036A1 (en) 2018-10-31 2021-09-08 Illumina, Inc. Polymerases, compositions, and methods of use
SG11202104099VA (en) 2018-11-07 2021-05-28 Egi Tech Shen Zhen Co Limited Method for sequencing polynucleotides
NL2022043B1 (en) 2018-11-21 2020-06-03 Akershus Univ Hf Tagmentation-Associated Multiplex PCR Enrichment Sequencing
AU2019390388A1 (en) 2018-11-30 2021-05-06 Illumina, Inc. Analysis of multiple analytes using a single assay
CN211311438U (zh) 2018-12-04 2020-08-21 欧姆尼欧美公司 流动池
AU2019391274A1 (en) 2018-12-05 2021-01-07 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for cluster generation by bridge amplification
KR20210098844A (ko) 2018-12-05 2021-08-11 일루미나, 인코포레이티드 중합효소, 조성물, 및 사용 방법
CN112368077B (zh) 2018-12-07 2023-11-24 元素生物科学公司 流动池装置及其用途
US20220025446A1 (en) 2018-12-10 2022-01-27 10X Genomics, Inc. Methods of using master / copy arrays for spatial detection
GB201820300D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 10X Genomics Inc Method for spatial tagging and analysing genomic DNA in a biological specimen
SG11202105441WA (en) 2018-12-13 2021-06-29 Dna Script Direct oligonucleotide synthesis on cells and biomolecules
GB201820341D0 (en) 2018-12-13 2019-01-30 10X Genomics Inc Method for transposase-mediated spatial tagging and analysing genomic DNA in a biological specimen
CN112639126A (zh) 2018-12-14 2021-04-09 伊卢米纳剑桥有限公司 降低测序期间用未标记的核苷酸的定相
WO2020126593A1 (en) 2018-12-17 2020-06-25 Illumina Cambridge Limited Compositions for use in polyunucleotide sequencing
AU2019411267A1 (en) 2018-12-17 2021-01-07 Illumina Cambridge Limited Primer oligonucleotide for sequencing
CA3103633A1 (en) 2018-12-18 2020-06-25 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for paired end sequencing using a single surface primer
EP3898643B1 (en) 2018-12-19 2024-04-17 Roche Diagnostics GmbH 3' reversibly protected nucleotides for sequencing by synthesis using nanopores
DK3899037T3 (da) 2018-12-19 2023-11-06 Illumina Inc Fremgangsmåder til forbedring af polynukleotidklyngeklonalitetsprioritet
EP3899032A2 (en) 2018-12-20 2021-10-27 Omniome, Inc. Temperature control for analysis of nucleic acids and other analytes
KR20220058487A (ko) 2019-01-02 2022-05-09 레디액션 엘티디. 환자 머리 보호 장치
EP3884071A4 (en) 2019-01-03 2022-04-06 Boreal Genomics, Inc. LINKED TARGET CAPTURE
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
IL281664B2 (en) 2019-01-11 2024-07-01 Illumina Cambridge Ltd A complex bound to the surface of transposome complexes
EP3921418A4 (en) 2019-02-06 2023-02-08 Singular Genomics Systems, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCE
WO2020165137A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 Dna Script Efficient product cleavage in template-free enzymatic synthesis of polynucleotides.
EP3924513B1 (en) 2019-02-14 2023-04-12 Pacific Biosciences of California, Inc. Mitigating adverse impacts of detection systems on nucleic acids and other biological analytes
US11680950B2 (en) 2019-02-20 2023-06-20 Pacific Biosciences Of California, Inc. Scanning apparatus and methods for detecting chemical and biological analytes
WO2020176788A1 (en) 2019-02-28 2020-09-03 10X Genomics, Inc. Profiling of biological analytes with spatially barcoded oligonucleotide arrays
NL2023327B1 (en) 2019-03-01 2020-09-17 Illumina Inc Multiplexed fluorescent detection of analytes
WO2020178231A1 (en) 2019-03-01 2020-09-10 Illumina, Inc. Multiplexed fluorescent detection of analytes
EP3931263A1 (en) 2019-03-01 2022-01-05 Illumina Cambridge Limited Exocyclic amine substituted coumarin compounds and their uses as fluorescent labels
AU2020233166A1 (en) 2019-03-01 2021-01-07 Illumina Cambridge Limited Tertiary amine substituted coumarin compounds and their uses as fluorescent labels
CN113302300A (zh) 2019-03-01 2021-08-24 伊路敏纳公司 高通量单细胞核和单细胞文库及其制备和使用方法
EP3938538A1 (en) 2019-03-15 2022-01-19 10X Genomics, Inc. Methods for using spatial arrays for single cell sequencing
NL2023316B1 (en) 2019-03-21 2020-09-28 Illumina Inc Artificial intelligence-based sequencing
WO2020191390A2 (en) 2019-03-21 2020-09-24 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based quality scoring
NL2023314B1 (en) 2019-03-21 2020-09-28 Illumina Inc Artificial intelligence-based quality scoring
NL2023310B1 (en) 2019-03-21 2020-09-28 Illumina Inc Training data generation for artificial intelligence-based sequencing
US11210554B2 (en) 2019-03-21 2021-12-28 Illumina, Inc. Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata
NL2023311B9 (en) 2019-03-21 2021-03-12 Illumina Inc Artificial intelligence-based generation of sequencing metadata
US11347965B2 (en) 2019-03-21 2022-05-31 Illumina, Inc. Training data generation for artificial intelligence-based sequencing
NL2023312B1 (en) 2019-03-21 2020-09-28 Illumina Inc Artificial intelligence-based base calling
WO2020198071A1 (en) 2019-03-22 2020-10-01 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US11421271B2 (en) 2019-03-28 2022-08-23 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for nucleic acid sequencing using photoswitchable labels
US20220193670A1 (en) 2019-04-12 2022-06-23 Roche Sequencing Solutions, Inc. Nucleic acid sequencing by synthesis using magnetic sensor arrays
US11609208B2 (en) 2019-04-12 2023-03-21 Western Digital Technologies, Inc. Devices and methods for molecule detection based on thermal stabilities of magnetic nanoparticles
US11327073B2 (en) 2019-04-12 2022-05-10 Western Digital Technologies, Inc. Thermal sensor array for molecule detection and related detection schemes
US11112468B2 (en) 2019-04-12 2021-09-07 Western Digital Technologies, Inc. Magnetoresistive sensor array for molecule detection and related detection schemes
US11579217B2 (en) 2019-04-12 2023-02-14 Western Digital Technologies, Inc. Devices and methods for frequency- and phase-based detection of magnetically-labeled molecules using spin torque oscillator (STO) sensors
US11738336B2 (en) 2019-04-12 2023-08-29 Western Digital Technologies, Inc. Spin torque oscillator (STO) sensors used in nucleic acid sequencing arrays and detection schemes for nucleic acid sequencing
CA3139169A1 (en) 2019-05-15 2020-11-19 Egi Tech (Shen Zhen) Co., Limited Single-channel sequencing method based on self-luminescence
US11593649B2 (en) 2019-05-16 2023-02-28 Illumina, Inc. Base calling using convolutions
WO2020243579A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
WO2020252186A1 (en) 2019-06-11 2020-12-17 Omniome, Inc. Calibrated focus sensing
JP2022540268A (ja) 2019-07-12 2022-09-15 イルミナ ケンブリッジ リミテッド 固体支持体上で固定化されたｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９を使用する核酸シークエンシングライブラリを調製するための組成物及び方法
MX2021007774A (es) 2019-07-12 2021-08-05 Illumina Cambridge Ltd Preparacion de genoteca de acido nucleico usando electroforesis.
WO2021011803A1 (en) 2019-07-16 2021-01-21 Omniome, Inc. Synthetic nucleic acids having non-natural structures
US10656368B1 (en) 2019-07-24 2020-05-19 Omniome, Inc. Method and system for biological imaging using a wide field objective lens
US20230242979A1 (en) 2019-08-20 2023-08-03 Egi Tech (Shen Zhen) Co., Limited Method for sequencing polynucleotides based on optical signal kinetics of luminescent labels and secondary luminescent signals
WO2021050681A1 (en) 2019-09-10 2021-03-18 Omniome, Inc. Reversible modification of nucleotides
WO2021050962A1 (en) 2019-09-11 2021-03-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Cancer detection and classification
US11512295B2 (en) 2019-09-12 2022-11-29 Singular Genomics Systems, Inc. Modified thermoccocus polymerases
US11208682B2 (en) 2019-09-13 2021-12-28 Western Digital Technologies, Inc. Enhanced optical detection for nucleic acid sequencing using thermally-dependent fluorophore tags
CN117036248A (zh) 2019-10-01 2023-11-10 10X基因组学有限公司 用于识别组织样品中的形态学模式的***和方法
CN118186063A (zh) 2019-10-18 2024-06-14 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 用于对核酸加帽的方法和组合物
WO2021092433A2 (en) 2019-11-08 2021-05-14 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
WO2021092431A1 (en) 2019-11-08 2021-05-14 Omniome, Inc. Engineered polymerases for improved sequencing by binding
EP4055185A1 (en) 2019-11-08 2022-09-14 10X Genomics, Inc. Spatially-tagged analyte capture agents for analyte multiplexing
EP4062373A1 (en) 2019-11-21 2022-09-28 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of analytes
WO2021102236A1 (en) 2019-11-22 2021-05-27 Illumina, Inc. Circulating rna signatures specific to preeclampsia
US11747329B2 (en) 2019-11-22 2023-09-05 Western Digital Technologies, Inc. Magnetic gradient concentrator/reluctance detector for molecule detection
EP4065646A1 (en) 2019-11-27 2022-10-05 Illumina Cambridge Limited Cyclooctatetraene containing dyes and compositions
DE202019106694U1 (de) 2019-12-02 2020-03-19 Omniome, Inc. System zur Sequenzierung von Nukleinsäuren in Fluidschaum
DE202019106695U1 (de) 2019-12-02 2020-03-19 Omniome, Inc. System zur Sequenzierung von Nukleinsäuren in Fluidschaum
CA3131632A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Tong Liu Preparation of dna sequencing libraries for detection of dna pathogens in plasma
WO2021118349A1 (en) 2019-12-10 2021-06-17 Prinses Máxima Centrum Voor Kinderoncologie B.V. Methods of typing germ cell tumors
EP4077344A1 (en) 2019-12-18 2022-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of sequencing by synthesis using a consecutive labeling scheme
US20220356461A1 (en) 2019-12-19 2022-11-10 Illumina, Inc. High-throughput single-cell libraries and methods of making and of using
US11747262B2 (en) 2019-12-23 2023-09-05 Singular Genomics Systems, Inc. Flow cell carrier and methods of use
CN114885610A (zh) 2019-12-23 2022-08-09 10X基因组学有限公司 使用rna模板化连接进行空间分析的方法
US11225688B2 (en) 2019-12-23 2022-01-18 Singular Genomics Systems, Inc. Methods for long read sequencing
US11498078B2 (en) 2019-12-23 2022-11-15 Singular Genomics Systems, Inc. Flow cell receiver and methods of use
CA3166578A1 (en) 2019-12-31 2021-07-08 Singular Genomics Systems, Inc. Polynucleotide barcodes for long read sequencing
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
EP4097251A1 (en) 2020-01-29 2022-12-07 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for analyte detection
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
CN115243792A (zh) 2020-02-04 2022-10-25 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 流通池及其制造和使用方法
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
WO2021167986A1 (en) 2020-02-17 2021-08-26 10X Genomics, Inc. In situ analysis of chromatin interaction
BR112022016415A2 (pt) 2020-02-20 2022-10-11 Illumina Inc Múltiplas chamadas de base à base de inteligência artificial
US20210265015A1 (en) 2020-02-20 2021-08-26 Illumina, Inc. Hardware Execution and Acceleration of Artificial Intelligence-Based Base Caller
US20210265018A1 (en) 2020-02-20 2021-08-26 Illumina, Inc. Knowledge Distillation and Gradient Pruning-Based Compression of Artificial Intelligence-Based Base Caller
WO2021168326A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Readcoor, Llc Compositions, methods and systems for sample processing
WO2021168287A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for integrated in situ spatial assay
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
US11034942B1 (en) 2020-02-27 2021-06-15 Singular Genomics Systems, Inc. Modified pyrococcus polymerases and uses thereof
CA3173798A1 (en) 2020-03-03 2021-09-10 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and compositions for sequencing double stranded nucleic acids
WO2021178893A2 (en) 2020-03-06 2021-09-10 Singular Genomics Systems, Inc. Linked paired strand sequencing
PT3969618T (pt) 2020-03-09 2023-11-15 Illumina Inc Métodos para sequenciação de polinucleótidos
EP4117818A2 (en) 2020-03-10 2023-01-18 Western Digital Technologies Inc. Magnetic sensor arrays for nucleic acid sequencing and methods of making and using them
KR20220160661A (ko) 2020-03-30 2022-12-06 일루미나, 인코포레이티드 핵산 라이브러리를 제조하기 위한 방법 및 조성물
CN113512083B (zh) * 2020-04-10 2023-05-23 深圳华大生命科学研究院 合成核苷酸或核苷酸类似物的方法
ES2965354T3 (es) 2020-04-22 2024-04-12 10X Genomics Inc Métodos para análisis espacial que usan eliminación de ARN elegido como diana
WO2021221500A1 (en) 2020-04-27 2021-11-04 Agendia N.V. Treatment of her2 negative, mammaprint high risk 2 breast cancer.
US11739359B2 (en) 2020-05-01 2023-08-29 Microsoft Technology Licensing, Llc Universal template strands for enzymatic polynucleotide synthesis
CN115836135A (zh) 2020-05-05 2023-03-21 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 用于修饰聚合酶-核酸复合物的组合物和方法
WO2021224677A1 (en) 2020-05-05 2021-11-11 Akershus Universitetssykehus Hf Compositions and methods for characterizing bowel cancer
US11188778B1 (en) 2020-05-05 2021-11-30 Illumina, Inc. Equalization-based image processing and spatial crosstalk attenuator
KR20230009878A (ko) 2020-05-08 2023-01-17 일루미나, 인코포레이티드 게놈 서열분석 및 검출 기술
US20210355518A1 (en) 2020-05-12 2021-11-18 Illumina, Inc. Generating nucleic acids with modified bases using recombinant terminal deoxynucleotidyl transferase
EP4153776A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
EP4153775B1 (en) 2020-05-22 2024-07-24 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
US11702683B2 (en) 2020-05-28 2023-07-18 Microsoft Technology Licensing, Llc De novo polynucleotide synthesis with substrate-bound polymerase
US12031177B1 (en) 2020-06-04 2024-07-09 10X Genomics, Inc. Methods of enhancing spatial resolution of transcripts
WO2021252499A1 (en) 2020-06-08 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
WO2021252617A1 (en) 2020-06-09 2021-12-16 Illumina, Inc. Methods for increasing yield of sequencing libraries
WO2021252591A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
AU2021288692A1 (en) 2020-06-11 2023-02-02 Nautilus Subsidiary, Inc. Methods and systems for computational decoding of biological, chemical, and physical entities
MX2022016492A (es) * 2020-06-22 2023-03-06 Illumina Cambridge Ltd Nucleosidos y nucleotidos con grupo de bloqueo de acetal 3'.
WO2021263111A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of dna methylation
WO2022006081A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 Illumina, Inc. Catalytically controlled sequencing by synthesis to produce scarless dna
CN111732623B (zh) * 2020-06-30 2022-01-18 中国科学院化学研究所 一种三异丙基硅乙炔修饰的脱氧胞苷亚磷酰胺单体及其制备方法与应用
AU2021300252A1 (en) 2020-07-02 2023-01-05 Illumina, Inc. A method to calibrate nucleic acid library seeding efficiency in flowcells
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
WO2022010965A1 (en) 2020-07-08 2022-01-13 Illumina, Inc. Beads as transposome carriers
WO2022015600A2 (en) 2020-07-13 2022-01-20 Singular Genomics Systems, Inc. Methods of sequencing complementary polynucleotides
US11993801B2 (en) 2020-07-21 2024-05-28 Illumina Singapore Pte. Ltd. Base-modified nucleotides as substrates for TdT-based enzymatic nucleic acid synthesis
US11981964B2 (en) 2020-07-28 2024-05-14 Illumina Cambridge Limited Substituted coumarin dyes and uses as fluorescent labels
KR20230041725A (ko) 2020-08-06 2023-03-24 일루미나, 인코포레이티드 비드-연결된 트랜스포좀을 사용한 rna 및 dna 시퀀싱 라이브러리의 제작
WO2022040176A1 (en) 2020-08-18 2022-02-24 Illumina, Inc. Sequence-specific targeted transposition and selection and sorting of nucleic acids
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US20220067489A1 (en) 2020-08-28 2022-03-03 Illumina, Inc. Detecting and Filtering Clusters Based on Artificial Intelligence-Predicted Base Calls
KR20230069135A (ko) 2020-09-11 2023-05-18 일루미나 케임브리지 리미티드 헤어핀 어댑터를 사용하여 시퀀싱 라이브러리에서 표적 서열을 농축시키는 방법
JP2023541449A (ja) 2020-09-14 2023-10-02 シンギュラー・ゲノミクス・システムズ・インコーポレイテッド 多次元撮像のための方法およびシステム
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
IL302207A (en) 2020-10-21 2023-06-01 Illumina Inc Sequencing templates that include several additions and compositions and methods to improve sequencing output
EP4200444A1 (en) 2020-10-30 2023-06-28 Singular Genomics Systems, Inc. Methods and compositions for reducing nucleotide impurities
GB2617481A (en) 2020-10-30 2023-10-11 Element Biosciences Inc Reagents for massively parallel nucleic acid sequencing
US20220145345A1 (en) 2020-11-11 2022-05-12 Microsoft Technology Licensing, Llc Spatial control of polynucleotide synthesis by strand capping
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
EP4247966A2 (en) * 2020-11-20 2023-09-27 The General Hospital Corporation Methods for dna methylation analysis
US20220170010A1 (en) 2020-12-02 2022-06-02 Illumina Software, Inc. System and method for detection of genetic alterations
US20220186300A1 (en) 2020-12-11 2022-06-16 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for multimodal in situ analysis
US20220195516A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Methods, systems and compositions for nucleic acid sequencing
US20220195196A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Alkylpyridinium coumarin dyes and uses in sequencing applications
US20220195517A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Long stokes shift chromenoquinoline dyes and uses in sequencing applications
WO2022140291A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 Singular Genomics Systems, Inc. Systems and methods for multicolor imaging
EP4121555A1 (en) 2020-12-21 2023-01-25 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
US20220195518A1 (en) 2020-12-22 2022-06-23 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for nucleic acid sequencing
US20220298568A1 (en) 2021-01-13 2022-09-22 Pacific Biosciences Of California, Inc. Surface structuring with colloidal assembly
US20220228200A1 (en) 2021-01-19 2022-07-21 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for internally controlled in situ assays
WO2022164809A1 (en) 2021-01-26 2022-08-04 10X Genomics, Inc. Nucleic acid analog probes for in situ analysis
EP4284944A1 (en) 2021-01-29 2023-12-06 Illumina, Inc. Methods, compositions and kits to improve seeding efficiency of flow cells with polynucleotides
CN116829731A (zh) 2021-02-04 2023-09-29 Illumina公司 转座体结合珠粒上的长带索引连接的读段生成
US11486001B2 (en) 2021-02-08 2022-11-01 Singular Genomics Systems, Inc. Methods and compositions for sequencing complementary polynucleotides
US20240043915A1 (en) 2021-02-13 2024-02-08 The General Hospital Corporation Methods and compositions for in situ macromolecule detection and uses thereof
EP4301873A1 (en) 2021-03-03 2024-01-10 10X Genomics, Inc. Analyte detection in situ using nucleic acid origami
US11884977B2 (en) 2021-03-12 2024-01-30 Singular Genomics Systems, Inc. Nanoarrays and methods of use thereof
WO2022192671A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Singular Genomics Systems, Inc. Nanoarrays and methods of use thereof
WO2022197754A1 (en) 2021-03-16 2022-09-22 Illumina Software, Inc. Neural network parameter quantization for base calling
AU2022245985A1 (en) 2021-03-22 2023-09-21 Illumina Cambridge Limited Methods for improving nucleic acid cluster clonality
MX2023010814A (es) 2021-03-29 2023-09-27 Illumina Inc Metodos mejorados de preparacion de genotecas.
CA3214282A1 (en) 2021-03-29 2022-10-06 Illumina, Inc. Compositions and methods for assessing dna damage in a library and normalizing amplicon size bias
MX2023010495A (es) 2021-03-30 2023-09-18 Illumina Inc Metodos mejorados de preparacion de genoteca y adn complementarios isotermicos.
WO2022207804A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Illumina Cambridge Limited Nucleic acid library sequencing techniques with adapter dimer detection
CA3183578A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Illumina Inc. Artificial intelligence-based base caller with contextual awareness
MX2023011218A (es) 2021-03-31 2023-10-02 Illumina Inc Métodos de preparación de genotecas de secuenciación de tagmentación direccional usando tecnología basada en transposón con identificadores moleculares únicos para la corrección de errores.
CA3214148A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 Brandon Tyler WESTERBERG Machine-learning model for detecting a bubble within a nucleotide-sample slide for sequencing
US20220336054A1 (en) 2021-04-15 2022-10-20 Illumina, Inc. Deep Convolutional Neural Networks to Predict Variant Pathogenicity using Three-Dimensional (3D) Protein Structures
WO2022232308A1 (en) 2021-04-27 2022-11-03 Singular Genomics Systems, Inc. High density sequencing and multiplexed priming
IL308031A (en) 2021-04-29 2023-12-01 Illumina Inc Amplification techniques for nucleic acid characterization
CA3215598A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Michael Callingham Fluorescent dyes containing bis-boron fused heterocycles and uses in sequencing
EP4334475A1 (en) 2021-05-07 2024-03-13 Agendia N.V. Endocrine treatment of hormone receptor positive breast cancer typed as having a low risk of recurrence
EP4337786A1 (en) 2021-05-10 2024-03-20 Pacific Biosciences of California, Inc. Single-molecule seeding and amplification on a surface
US20220356515A1 (en) 2021-05-10 2022-11-10 Pacific Biosciences Of California, Inc. Dna amplification buffer replenishment during rolling circle amplification
US20220372468A1 (en) 2021-05-19 2022-11-24 Microsoft Technology Licensing, Llc Real-time detection of errors in oligonucleotide synthesis
US20220396832A1 (en) * 2021-05-20 2022-12-15 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for sequencing by synthesis
JP2024521196A (ja) 2021-05-28 2024-05-28 イルミナ インコーポレイテッド 核酸調製のためのオリゴ修飾ヌクレオチド類似体
WO2022256324A1 (en) 2021-06-01 2022-12-08 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for analyte detection and probe resolution
WO2022256422A1 (en) 2021-06-02 2022-12-08 10X Genomics, Inc. Sample analysis using asymmetric circularizable probes
US20220403450A1 (en) 2021-06-03 2022-12-22 Illumina Software, Inc. Systems and methods for sequencing nucleotides using two optical channels
EP4355476A1 (en) 2021-06-15 2024-04-24 Illumina, Inc. Hydrogel-free surface functionalization for sequencing
US20220411864A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Illumina, Inc. Compositions, methods, kits, cartridges, and systems for sequencing reagents
WO2023278609A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Illumina, Inc. Self-learned base caller, trained using organism sequences
IL309308A (en) 2021-06-29 2024-02-01 Illumina Inc A signal-to-noise ratio measure for determining nucleotide base reads and base call quality
WO2023278184A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Illumina, Inc. Methods and systems to correct crosstalk in illumination emitted from reaction sites
KR20240026932A (ko) 2021-06-29 2024-02-29 일루미나, 인코포레이티드 게놈 좌표에 대한 신뢰도 분류를 생성하기 위한 기계 학습 모델
US20230005253A1 (en) 2021-07-01 2023-01-05 Illumina, Inc. Efficient artificial intelligence-based base calling of index sequences
WO2023287617A1 (en) 2021-07-13 2023-01-19 Illumina, Inc. Methods and systems for real time extraction of crosstalk in illumination emitted from reaction sites
US20230026886A1 (en) 2021-07-13 2023-01-26 10X Genomics, Inc. Methods for preparing polymerized matrix with controllable thickness
EP4374343A1 (en) 2021-07-19 2024-05-29 Illumina, Inc. Intensity extraction with interpolation and adaptation for base calling
US11455487B1 (en) 2021-10-26 2022-09-27 Illumina Software, Inc. Intensity extraction and crosstalk attenuation using interpolation and adaptation for base calling
US20230021577A1 (en) 2021-07-23 2023-01-26 Illumina Software, Inc. Machine-learning model for recalibrating nucleotide-base calls
CN117813391A (zh) 2021-07-23 2024-04-02 因美纳有限公司 制备用于dna测序的基底表面的方法
IL309786A (en) 2021-07-28 2024-02-01 Illumina Inc Quality score calibration of BASECALLING systems
EP4381095A1 (en) 2021-08-03 2024-06-12 10X Genomics, Inc. Nucleic acid concatemers and methods for stabilizing and/or compacting the same
KR20240035413A (ko) 2021-08-03 2024-03-15 일루미나, 인코포레이티드 다중 염기 호출자 모델을 사용한 염기 호출
US20230047225A1 (en) 2021-08-14 2023-02-16 Illumina, Inc. Polymerases, compositions, and methods of use
WO2023023484A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 10X Genomics, Inc. Probes comprising a split barcode region and methods of use
AU2022331421A1 (en) 2021-08-17 2024-01-04 Illumina, Inc. Methods and compositions for identifying methylated cytosines
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
CN117580961A (zh) 2021-09-01 2024-02-20 Illumina公司 用于加速碱基判读的幅度调制
EP4396372A2 (en) 2021-09-03 2024-07-10 Singular Genomics Systems, Inc. Amplification oligonucleotides
WO2023035110A1 (zh) 2021-09-07 2023-03-16 深圳华大智造科技股份有限公司 一种用于分析靶多核苷酸的序列的方法
CN115917006A (zh) 2021-09-07 2023-04-04 深圳华大智造科技股份有限公司 一种用于分析靶多核苷酸的序列的方法
US20230093253A1 (en) 2021-09-17 2023-03-23 Illumina, Inc. Automatically identifying failure sources in nucleotide sequencing from base-call-error patterns
US20230095961A1 (en) 2021-09-21 2023-03-30 Illumina, Inc. Graph reference genome and base-calling approach using imputed haplotypes
WO2023049215A1 (en) 2021-09-22 2023-03-30 Illumina, Inc. Compressed state-based base calling
US20230096386A1 (en) 2021-09-30 2023-03-30 Illumina Cambridge Limited Polynucleotide sequencing
WO2023056328A2 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Illumina, Inc. Solid supports and methods for depleting and/or enriching library fragments prepared from biosamples
CN118355128A (zh) 2021-10-20 2024-07-16 因美纳有限公司 用于捕获测序用文库dna的方法
AU2022375723A1 (en) * 2021-11-01 2024-05-30 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for synthesis
WO2023081485A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Pacific Biosciences Of California, Inc. Stepwise sequencing of a polynucleotide with a homogenous reaction mixture
WO2023085932A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Omnigen B.V. Prediction of response following folfirinox treatment in cancer patients
EP4305195A2 (en) 2021-12-01 2024-01-17 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for improved in situ detection of analytes and spatial analysis
US20230343415A1 (en) 2021-12-02 2023-10-26 Illumina Software, Inc. Generating cluster-specific-signal corrections for determining nucleotide-base calls
WO2023107622A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Illumina, Inc. Parallel sample and index sequencing
WO2023119164A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 Illumina Cambridge Limited Wax-microsphere matrix compositions and methods of making and using the same
US20230215515A1 (en) 2021-12-23 2023-07-06 Illumina Software, Inc. Facilitating secure execution of external workflows for genomic sequencing diagnostics
WO2023122363A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Illumina Software, Inc. Dynamic graphical status summaries for nucelotide sequencing
WO2023129898A2 (en) 2021-12-27 2023-07-06 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for rolling circle amplification
US20230207050A1 (en) 2021-12-28 2023-06-29 Illumina Software, Inc. Machine learning model for recalibrating nucleotide base calls corresponding to target variants
CA3242624A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Shannon Whitmore Automatically switching variant analysis model versions for genomic analysis applications
CA3222937A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Jonathan Mark Boutell Methods of nucleic acid sequencing using surface-bound primers
WO2023141154A1 (en) 2022-01-20 2023-07-27 Illumina Cambridge Limited Methods of detecting methylcytosine and hydroxymethylcytosine by sequencing
WO2023141588A1 (en) 2022-01-21 2023-07-27 10X Genomics, Inc. Multiple readout signals for analyzing a sample
WO2023164570A1 (en) 2022-02-23 2023-08-31 Insitro, Inc. Pooled optical screening and transcriptional measurements of cells comprising barcoded genetic perturbations
WO2023164660A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Illumina, Inc. Calibration sequences for nucelotide sequencing
WO2023164492A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Illumina, Inc. Machine-learning models for detecting and adjusting values for nucleotide methylation levels
WO2023172665A2 (en) 2022-03-10 2023-09-14 Singular Genomics Systems, Inc. Nucleic acid delivery scaffolds
WO2023175021A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Illumina, Inc. Methods of preparing loop fork libraries
WO2023183937A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Illumina, Inc. Sequence-to-sequence base calling
US20230304086A1 (en) 2022-03-28 2023-09-28 Illumina Cambridge Limited Labeled avidin and methods for sequencing
WO2023192163A1 (en) 2022-03-29 2023-10-05 Illumina Cambridge Limited Systems and methods of sequencing polynucleotides
WO2023192917A1 (en) 2022-03-29 2023-10-05 Nautilus Subsidiary, Inc. Integrated arrays for single-analyte processes
US20230357845A1 (en) 2022-03-31 2023-11-09 Illumina, Inc. Compositions and methods for improving sequencing signals
CA3222797A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Ramesh NEELAKANDAN Nucleosides and nucleotides with 3' vinyl blocking group
WO2023192616A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for targeted masking of autofluorescence
US20230323427A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for multiplex cell analysis
WO2023196572A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Illumina Singapore Pte. Ltd. Altered cytidine deaminases and methods of use
AU2023250540A1 (en) 2022-04-08 2024-01-18 Illumina, Inc. Aptamer dynamic range compression and detection techniques
WO2023212601A1 (en) 2022-04-26 2023-11-02 Illumina, Inc. Machine-learning models for selecting oligonucleotide probes for array technologies
WO2023209606A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Illumina Cambridge Limited Methods and systems for encapsulating lyophilised microspheres
US20240002902A1 (en) 2022-05-06 2024-01-04 10X Genomics, Inc. Analysis of antigen and antigen receptor interactions
WO2023220627A1 (en) 2022-05-10 2023-11-16 Illumina Software, Inc. Adaptive neural network for nucelotide sequencing
WO2023225095A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Illumina Cambridge Limited Preparation of size-controlled nucleic acid fragments
WO2023224487A1 (en) 2022-05-19 2023-11-23 Agendia N.V. Prediction of response to immune therapy in breast cancer patients
WO2023224488A1 (en) 2022-05-19 2023-11-23 Agendia N.V. Dna repair signature and prediction of response following cancer therapy
US20230383342A1 (en) 2022-05-31 2023-11-30 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for nucleic acid sequencing
US20230392207A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 Illumina, Inc. Circulating rna biomarkers for preeclampsia
WO2023239917A1 (en) 2022-06-09 2023-12-14 Illumina, Inc. Dependence of base calling on flow cell tilt
US20240035071A1 (en) 2022-06-17 2024-02-01 10X Genomics, Inc. Catalytic de-crosslinking of samples for in situ analysis
US20230420080A1 (en) 2022-06-24 2023-12-28 Illumina Software, Inc. Split-read alignment by intelligently identifying and scoring candidate split groups
WO2024006769A1 (en) 2022-06-27 2024-01-04 Illumina Software, Inc. Generating and implementing a structural variation graph genome
WO2024006705A1 (en) 2022-06-27 2024-01-04 Illumina Software, Inc. Improved human leukocyte antigen (hla) genotyping
WO2024006779A1 (en) 2022-06-27 2024-01-04 Illumina, Inc. Accelerators for a genotype imputation model
WO2024003087A1 (en) 2022-06-28 2024-01-04 Illumina, Inc. Fluorescent dyes containing fused tetracyclic bis-boron heterocycle and uses in sequencing
WO2024015962A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Blocked asymmetric hairpin adaptors
US20240038327A1 (en) 2022-07-26 2024-02-01 Illumina Software, Inc. Rapid single-cell multiomics processing using an executable file
CN115260262A (zh) * 2022-08-09 2022-11-01 深圳赛陆医疗科技有限公司 一种胞嘧啶叠氮化合物的制备方法
WO2024036304A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 10X Genomics, Inc. Puma1 polymerases and uses thereof
US20240084373A1 (en) 2022-08-16 2024-03-14 10X Genomics, Inc. Ap50 polymerases and uses thereof
WO2024039516A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Illumina, Inc. Third dna base pair site-specific dna detection
WO2024059852A1 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Illumina, Inc. Cluster segmentation and conditional base calling
WO2024073516A1 (en) 2022-09-29 2024-04-04 Illumina, Inc. A target-variant-reference panel for imputing target variants
US20240120027A1 (en) 2022-09-30 2024-04-11 Illumina, Inc. Machine-learning model for refining structural variant calls
WO2024068889A2 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Compositions and methods for reducing photo damage during sequencing
US20240141427A1 (en) 2022-09-30 2024-05-02 Illumina, Inc. Polymerases, compositions, and methods of use
WO2024069581A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina Singapore Pte. Ltd. Helicase-cytidine deaminase complexes and methods of use
WO2024073047A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Cytidine deaminases and methods of use in mapping modified cytosine nucleotides
WO2024073043A1 (en) 2022-09-30 2024-04-04 Illumina, Inc. Methods of using cpg binding proteins in mapping modified cytosine nucleotides
WO2024077096A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Illumina, Inc. Integrating variant calls from multiple sequencing pipelines utilizing a machine learning architecture
WO2024077162A2 (en) 2022-10-06 2024-04-11 Illumina, Inc. Probes for improving coronavirus sample surveillance
WO2024077202A2 (en) 2022-10-06 2024-04-11 Illumina, Inc. Probes for improving environmental sample surveillance
WO2024077152A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 Illumina, Inc. Probes for depleting abundant small noncoding rna
US20240127906A1 (en) 2022-10-11 2024-04-18 Illumina, Inc. Detecting and correcting methylation values from methylation sequencing assays
WO2024081869A1 (en) 2022-10-14 2024-04-18 10X Genomics, Inc. Methods for analysis of biological samples
WO2024098185A1 (en) * 2022-11-07 2024-05-16 GeneSense Technology Inc., Shanghai (CN) Nucleic acid sequencing using self-luminescence
WO2024102736A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 10X Genomics, Inc. Immobilization methods and compositions for in situ detection
WO2024107887A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for assessing performance of in situ assays
WO2024118903A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Illumina, Inc. Chemoenzymatic correction of false positive uracil transformations
US20240177802A1 (en) 2022-11-30 2024-05-30 Illumina, Inc. Accurately predicting variants from methylation sequencing data
WO2024123866A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Illumina, Inc. Nucleosides and nucleotides with 3´ blocking groups and cleavable linkers
WO2024129672A1 (en) 2022-12-12 2024-06-20 The Broad Institute, Inc. Trafficked rnas for assessment of cell-cell connectivity and neuroanatomy
US20240209419A1 (en) 2022-12-14 2024-06-27 Illumina, Inc. Systems and Methods for Capture and Enrichment of Clustered Beads on Flow Cell Substrates
WO2024130031A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Illumina, Inc. Boranes on solid supports
WO2024130203A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for assessing performance
WO2024137860A1 (en) 2022-12-21 2024-06-27 10X Genomics, Inc. Methods for tethering ribonucleic acids in biological samples
WO2024137886A1 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Illumina, Inc. Context-dependent base calling
US20240247311A1 (en) 2022-12-22 2024-07-25 Illumina, Inc. Palladium catalyst compositions and methods for sequencing by synthesis
WO2024137765A1 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Illumina, Inc. Transition-metal catalyst compositions and methods for sequencing by synthesis
WO2024145154A1 (en) 2022-12-27 2024-07-04 Illumina, Inc. Methods of sequencing using 3´ allyl blocked nucleotides
WO2024147904A1 (en) 2023-01-06 2024-07-11 Illumina, Inc. Reducing uracils by polymerase
WO2024148300A1 (en) 2023-01-06 2024-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for in situ analysis of variant sequences
CN117886850B (zh) * 2024-03-14 2024-07-05 深圳赛陆医疗科技有限公司 一种叠氮化合物的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002029003A2 (en) * 2000-10-06 2002-04-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding dna and rna

Family Cites Families (127)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US227131A (en) 1880-05-04 Heney o
GB230037A (en) 1924-02-27 1925-10-01 Panhard & Levassor Improvements in internal combustion engines provided with valve sleeves
GB303924A (en) 1927-10-13 1929-01-14 Gregorio John Boonzaier Improvements in or relating to carburettors for internal combustion engines
US4711955A (en) * 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
US5175269A (en) * 1984-01-30 1992-12-29 Enzo Diagnostics, Inc. Compound and detectable molecules having an oligo- or polynucleotide with modifiable reactive group
US5118605A (en) * 1984-10-16 1992-06-02 Chiron Corporation Polynucleotide determination with selectable cleavage sites
US4824775A (en) * 1985-01-03 1989-04-25 Molecular Diagnostics, Inc. Cells labeled with multiple Fluorophores bound to a nucleic acid carrier
US4772691A (en) * 1985-06-05 1988-09-20 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Chemically cleavable nucleotides
US4863849A (en) * 1985-07-18 1989-09-05 New York Medical College Automatable process for sequencing nucleotide
US4888274A (en) 1985-09-18 1989-12-19 Yale University RecA nucleoprotein filament and methods
US5047519A (en) 1986-07-02 1991-09-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alkynylamino-nucleotides
US5242796A (en) 1986-07-02 1993-09-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method, system and reagents for DNA sequencing
GB8810400D0 (en) 1988-05-03 1988-06-08 Southern E Analysing polynucleotide sequences
SE8801070D0 (sv) 1988-03-23 1988-03-23 Pharmacia Ab Method for immobilizing a dna sequence on a solid support
US4971903A (en) 1988-03-25 1990-11-20 Edward Hyman Pyrophosphate-based method and apparatus for sequencing nucleic acids
US5174962A (en) * 1988-06-20 1992-12-29 Genomyx, Inc. Apparatus for determining DNA sequences by mass spectrometry
GB8910880D0 (en) 1989-05-11 1989-06-28 Amersham Int Plc Sequencing method
US6346413B1 (en) 1989-06-07 2002-02-12 Affymetrix, Inc. Polymer arrays
US5547839A (en) * 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
US5302509A (en) 1989-08-14 1994-04-12 Beckman Instruments, Inc. Method for sequencing polynucleotides
EP0450060A1 (en) 1989-10-26 1991-10-09 Sri International Dna sequencing
AU2674092A (en) 1991-09-09 1993-04-05 Baylor College Of Medicine Method and device for rapid dna or rna sequencing determination by a base addition sequencing scheme
DE4141178A1 (de) 1991-12-13 1993-06-17 Europ Lab Molekularbiolog Verfahren zur sequenzierung von nukleinsaeuren
GB9208733D0 (en) 1992-04-22 1992-06-10 Medical Res Council Dna sequencing method
GB9210176D0 (en) * 1992-05-12 1992-06-24 Cemu Bioteknik Ab Chemical method
US5516664A (en) * 1992-12-23 1996-05-14 Hyman; Edward D. Enzymatic synthesis of repeat regions of oligonucleotides
US5436143A (en) * 1992-12-23 1995-07-25 Hyman; Edward D. Method for enzymatic synthesis of oligonucleotides
US6074823A (en) * 1993-03-19 2000-06-13 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation
FR2703052B1 (fr) * 1993-03-26 1995-06-02 Pasteur Institut Nouvelle méthode de séquençage d'acides nucléiques.
US5959089A (en) 1993-07-19 1999-09-28 Hannessian; Stephen Amino-cyclodextrin syntheses
GB9315847D0 (en) * 1993-07-30 1993-09-15 Isis Innovation Tag reagent and assay method
US5547859A (en) * 1993-08-02 1996-08-20 Goodman; Myron F. Chain-terminating nucleotides for DNA sequencing methods
WO1995014108A1 (en) * 1993-11-17 1995-05-26 Amersham International Plc Primer extension mass spectroscopy nucleic acid sequencing method
US5872244A (en) * 1994-09-02 1999-02-16 Andrew C. Hiatt 3' protected nucleotides for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds
US6214987B1 (en) * 1994-09-02 2001-04-10 Andrew C. Hiatt Compositions for enzyme catalyzed template-independent formation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
US5808045A (en) * 1994-09-02 1998-09-15 Andrew C. Hiatt Compositions for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
US6232465B1 (en) * 1994-09-02 2001-05-15 Andrew C. Hiatt Compositions for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
US5763594A (en) 1994-09-02 1998-06-09 Andrew C. Hiatt 3' protected nucleotides for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds
US5604097A (en) 1994-10-13 1997-02-18 Spectragen, Inc. Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags
US6013445A (en) 1996-06-06 2000-01-11 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
EP0785941B1 (en) 1994-10-14 2000-04-19 Stratagene Porphyrin labeling of polynucleotides
US5681940A (en) 1994-11-02 1997-10-28 Icn Pharmaceuticals Sugar modified nucleosides and oligonucleotides
DE4438918A1 (de) 1994-11-04 1996-05-09 Hoechst Ag Modifizierte Oligonukleotide, deren Herstellung sowie deren Verwendung
SE9500342D0 (sv) 1995-01-31 1995-01-31 Marek Kwiatkowski Novel chain terminators, the use thereof for nucleic acid sequencing and synthesis and a method of their preparation
WO1996027025A1 (en) 1995-02-27 1996-09-06 Ely Michael Rabani Device, compounds, algorithms, and methods of molecular characterization and manipulation with molecular parallelism
EP0745686A1 (en) * 1995-06-01 1996-12-04 Roche Diagnostics GmbH The use of DNA polymerase 3'-intrinsic editing activity
US5728528A (en) 1995-09-20 1998-03-17 The Regents Of The University Of California Universal spacer/energy transfer dyes
US6312893B1 (en) * 1996-01-23 2001-11-06 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for determining the sequence of nucleic acid molecules
US6613508B1 (en) * 1996-01-23 2003-09-02 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid molecules utilizing sizing techniques
EP0992511B1 (en) 1996-01-23 2009-03-11 Operon Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for determining the sequence of nucleic acid molecules
US5821356A (en) * 1996-08-12 1998-10-13 The Perkin Elmer Corporation Propargylethoxyamino nucleotides
US5885775A (en) * 1996-10-04 1999-03-23 Perseptive Biosystems, Inc. Methods for determining sequences information in polynucleotides using mass spectrometry
WO1998030720A1 (en) 1997-01-08 1998-07-16 Proligo Llc Bioconjugation of oligonucleotides
US6046005A (en) * 1997-01-15 2000-04-04 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequencing with solid phase capturable terminators comprising a cleavable linking group
WO1998033939A1 (fr) 1997-01-31 1998-08-06 Hitachi, Ltd. Procede pour determiner une sequence de base d'acide nucleique et appareil correspondant
JP3489991B2 (ja) 1997-07-07 2004-01-26 理化学研究所 ３’−デオキシリボヌクレオチド誘導体
EP1017848B2 (en) 1997-07-28 2012-02-22 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid sequence analysis
US6008379A (en) * 1997-10-01 1999-12-28 The Perkin-Elmer Corporation Aromatic-substituted xanthene dyes
US6485944B1 (en) 1997-10-10 2002-11-26 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
US6511803B1 (en) 1997-10-10 2003-01-28 President And Fellows Of Harvard College Replica amplification of nucleic acid arrays
JP2001519538A (ja) 1997-10-10 2001-10-23 プレジデント・アンド・フェローズ・オブ・ハーバード・カレッジ 核酸アレイのレプリカ増幅
GB9815163D0 (en) 1998-07-13 1998-09-09 Brax Genomics Ltd Compounds
AU3199699A (en) 1998-03-23 1999-10-18 Invitrogen Corporation Modified nucleotides and methods useful for nucleic acid sequencing
WO1999057321A1 (en) 1998-05-01 1999-11-11 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and dna molecules
US6780591B2 (en) * 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US6096875A (en) 1998-05-29 2000-08-01 The Perlein-Elmer Corporation Nucleotide compounds including a rigid linker
US6218530B1 (en) * 1998-06-02 2001-04-17 Ambergen Inc. Compounds and methods for detecting biomolecules
US6287821B1 (en) * 1998-06-11 2001-09-11 Orchid Biosciences, Inc. Nucleotide analogues with 3'-pro-fluorescent fluorophores in nucleic acid sequence analysis
US6335155B1 (en) 1998-06-26 2002-01-01 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapidly identifying small organic molecule ligands for binding to biological target molecules
US6218118B1 (en) * 1998-07-09 2001-04-17 Agilent Technologies, Inc. Method and mixture reagents for analyzing the nucleotide sequence of nucleic acids by mass spectrometry
GB0002310D0 (en) 2000-02-01 2000-03-22 Solexa Ltd Polynucleotide sequencing
US6787308B2 (en) * 1998-07-30 2004-09-07 Solexa Ltd. Arrayed biomolecules and their use in sequencing
JP2002521064A (ja) 1998-07-30 2002-07-16 ソレックサ リミテッド アレイ生体分子およびシークエンシングにおけるその使用
DE19844931C1 (de) 1998-09-30 2000-06-15 Stefan Seeger Verfahren zur DNS- oder RNS-Sequenzierung
US6221592B1 (en) 1998-10-20 2001-04-24 Wisconsin Alumi Research Foundation Computer-based methods and systems for sequencing of individual nucleic acid molecules
US6451525B1 (en) 1998-12-03 2002-09-17 Pe Corporation (Ny) Parallel sequencing method
WO2000036151A1 (en) 1998-12-14 2000-06-22 Li-Cor, Inc. A heterogeneous assay for pyrophosphate detection
US6380378B1 (en) * 1998-12-24 2002-04-30 Toagosei Company, Ltd. Nucleotide compound, nucleotide block oligonucleotide, and method for producing them
US6087112A (en) 1998-12-30 2000-07-11 Oligos Etc. Inc. Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions
AU3372800A (en) * 1999-02-23 2000-09-14 Caliper Technologies Corporation Manipulation of microparticles in microfluidic systems
US7270951B1 (en) 1999-03-10 2007-09-18 Asm Scientific, Inc. Method for direct nucleic acid sequencing
US7037654B2 (en) * 1999-04-30 2006-05-02 Aclara Biosciences, Inc. Methods and compositions for enhancing detection in determinations employing cleavable electrophoretic tag reagents
US7056661B2 (en) 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
US6818395B1 (en) * 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US6242193B1 (en) * 1999-07-30 2001-06-05 Hitachi, Ltd. Apparatus for determining base sequence of nucleic acid
US6982146B1 (en) * 1999-08-30 2006-01-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services High speed parallel molecular nucleic acid sequencing
WO2001016375A2 (en) 1999-08-30 2001-03-08 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services High speed parallel molecular nucleic acid sequencing
EP1218543A2 (en) 1999-09-29 2002-07-03 Solexa Ltd. Polynucleotide sequencing
US6309836B1 (en) 1999-10-05 2001-10-30 Marek Kwiatkowski Compounds for protecting hydroxyls and methods for their use
CA2388528A1 (en) 1999-11-04 2001-05-10 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
AU3015801A (en) * 1999-12-23 2001-07-09 Axaron Bioscience Ag Method for carrying out the parallel sequencing of a nucleic acid mixture on a surface
GB0002389D0 (en) 2000-02-02 2000-03-22 Solexa Ltd Molecular arrays
WO2001060315A2 (en) 2000-02-18 2001-08-23 Shire Biochem Inc. Method for the treatment or prevention of flavivirus infections using nucleoside analogues
EP1182267B1 (en) 2000-03-30 2012-01-18 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Method of determining base sequence of single nucleic acid molecule
GB0013276D0 (en) 2000-06-01 2000-07-26 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Nucleotide analogues
GB0016473D0 (en) 2000-07-05 2000-08-23 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Sequencing method
DE10041539A1 (de) * 2000-08-24 2002-03-07 Febit Ferrarius Biotech Gmbh Neue Amiditderivate zur Synthese von Polymeren auf Oberflächen
WO2002022883A1 (en) 2000-09-11 2002-03-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Combinatorial fluorescence energy transfer tags and uses thereof
AU2002241803A1 (en) 2000-10-20 2002-06-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Transient electrical signal based methods and devices for characterizing molecular interaction and/or motion in a sample
JP2004523243A (ja) 2001-03-12 2004-08-05 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー 非同期性塩基伸長によってポリヌクレオチド配列を分析するための方法および装置
US20030027140A1 (en) 2001-03-30 2003-02-06 Jingyue Ju High-fidelity DNA sequencing using solid phase capturable dideoxynucleotides and mass spectrometry
DE10120798B4 (de) 2001-04-27 2005-12-29 Genovoxx Gmbh Verfahren zur Bestimmung der Genexpression
DE10120797B4 (de) 2001-04-27 2005-12-22 Genovoxx Gmbh Verfahren zur Analyse von Nukleinsäureketten
US6613523B2 (en) * 2001-06-29 2003-09-02 Agilent Technologies, Inc. Method of DNA sequencing using cleavable tags
CA2452474C (en) * 2001-07-13 2012-03-06 Ambergen, Inc. Nucleotide compositions comprising photocleavable markers and methods of preparation thereof
WO2003020968A2 (de) 2001-08-29 2003-03-13 Genovoxx Gmbh Verfahren zur analyse von nukleinsäurekettensequenzen und der genexpression
GB0128526D0 (en) 2001-11-29 2002-01-23 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd Nucleotide analogues
GB0129012D0 (en) 2001-12-04 2002-01-23 Solexa Ltd Labelled nucleotides
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
WO2003066812A2 (en) 2002-02-05 2003-08-14 Baylor College Of Medecine Substituted 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene compounds for 8-color dna sequencing
DE60301622T2 (de) 2002-04-04 2006-06-14 Biotage Ab Uppsala Auf primer verlängerung basierendes verfahren, das nukleotide verwendet, die über spaltbare linker markiert sind
WO2003087302A2 (en) * 2002-04-12 2003-10-23 Stratagene Dual-labeled nucleotides
US7074597B2 (en) * 2002-07-12 2006-07-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Multiplex genotyping using solid phase capturable dideoxynucleotides and mass spectrometry
EP1530578B1 (en) 2002-08-23 2013-03-13 Illumina Cambridge Limited Modified nucleotides for polynucleotide sequencing
WO2004018493A1 (en) 2002-08-23 2004-03-04 Solexa Limited Labelled nucleotides
US7414116B2 (en) 2002-08-23 2008-08-19 Illumina Cambridge Limited Labelled nucleotides
GB0321306D0 (en) 2003-09-11 2003-10-15 Solexa Ltd Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues
EP2436778A3 (en) 2004-03-03 2012-07-11 The Trustees of Columbia University in the City of New York Photocleavable fluorescent nucleotides for DNA sequencing on chip constructed by site-specific coupling chemistry
US7393533B1 (en) 2004-11-08 2008-07-01 La Jolla Institute For Allergy And Immunology H3L envelope protein immunization methods and H3L envelope passive protection methods
GB0517097D0 (en) 2005-08-19 2005-09-28 Solexa Ltd Modified nucleosides and nucleotides and uses thereof
US8481259B2 (en) 2007-02-05 2013-07-09 Intelligent Bio-Systems, Inc. Methods and devices for sequencing nucleic acids in smaller batches
EP3431615A3 (en) 2007-10-19 2019-02-20 The Trustees of Columbia University in the City of New York Dna sequencing with non-fluorescent nucleotide reversible terminators cleavable label modified nucleotide terminators
US8623598B2 (en) 2008-03-19 2014-01-07 Intelligent Bio Systems, Inc. Methods and compositions for inhibiting undesired cleaving of labels
US9309569B2 (en) 2010-08-26 2016-04-12 Intelligent Bio-Systems, Inc. Methods and compositions for sequencing nucleic acid using charge
US10443096B2 (en) 2010-12-17 2019-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York DNA sequencing by synthesis using modified nucleotides and nanopore detection
WO2012162429A2 (en) 2011-05-23 2012-11-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Dna sequencing by synthesis using raman and infrared spectroscopy detection
AU2013382358B2 (en) 2013-03-15 2017-01-12 Illumina Cambridge Limited Modified nucleosides or nucleotides

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002029003A2 (en) * 2000-10-06 2002-04-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding dna and rna

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016512206A (ja) * 2013-03-15 2016-04-25 イルミナ ケンブリッジ リミテッド 修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチド
KR101874680B1 (ko) * 2013-03-15 2018-07-04 일루미나 케임브리지 리미티드 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드
KR20180077296A (ko) * 2013-03-15 2018-07-06 일루미나 케임브리지 리미티드 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드
KR102230831B1 (ko) * 2013-03-15 2021-03-22 일루미나 케임브리지 리미티드 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드
JP2017525695A (ja) * 2014-08-08 2017-09-07 イルミナ ケンブリッジ リミテッド 修飾ヌクレオチドリンカー
JP2022000435A (ja) * 2014-08-08 2022-01-04 イルミナ ケンブリッジ リミテッド 修飾ヌクレオチドリンカー
JP2018528959A (ja) * 2015-09-25 2018-10-04 イルミナ ケンブリッジ リミテッド ポリメチン化合物および蛍光標識としてのそれらの使用
JP2018039842A (ja) * 2017-12-05 2018-03-15 イルミナ ケンブリッジ リミテッド 修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチド
JP2022515944A (ja) * 2018-12-26 2022-02-24 イルミナ ケンブリッジ リミテッド ３’－ヒドロキシブロッキング基を有するヌクレオシドおよびヌクレオチド、ならびにそれらのポリヌクレオチドシーケンシング方法における使用
JP2022516684A (ja) * 2019-01-08 2022-03-01 シンギュラー・ゲノミクス・システムズ・インコーポレイテッド ヌクレオチドの開裂可能なリンカーおよびその使用

Also Published As

Publication number Publication date
DK3587433T3 (da) 2020-05-18
US20160032378A1 (en) 2016-02-04
EP3587433A1 (en) 2020-01-01
ES2407681T3 (es) 2013-06-13
US20100292452A1 (en) 2010-11-18
US8071739B2 (en) 2011-12-06
WO2004018497A2 (en) 2004-03-04
EP2607369B1 (en) 2015-09-23
SI3587433T1 (sl) 2020-08-31
EP3363809B1 (en) 2020-04-08
US20120095201A1 (en) 2012-04-19
CY1120186T1 (el) 2018-12-12
AU2003259350A8 (en) 2004-03-11
JP5748805B2 (ja) 2015-07-15
US20200399692A1 (en) 2020-12-24
EP1530578A2 (en) 2005-05-18
US20160362737A1 (en) 2016-12-15
US20090325172A1 (en) 2009-12-31
US9121060B2 (en) 2015-09-01
US7771973B2 (en) 2010-08-10
ES2550513T3 (es) 2015-11-10
DK3363809T3 (da) 2020-05-04
EP2607369A1 (en) 2013-06-26
US10513731B2 (en) 2019-12-24
GB0405884D0 (en) 2004-04-21
US7541444B2 (en) 2009-06-02
SI3363809T1 (sl) 2020-08-31
GB2395954A (en) 2004-06-09
SI3002289T1 (en) 2018-07-31
US9388464B2 (en) 2016-07-12
EP3363809A1 (en) 2018-08-22
EP3587433B1 (en) 2020-04-22
EP3002289A1 (en) 2016-04-06
US20070166705A1 (en) 2007-07-19
JP2014011999A (ja) 2014-01-23
EP3795577A1 (en) 2021-03-24
WO2004018497A3 (en) 2004-06-17
EP3002289B1 (en) 2018-02-28
AU2003259350A1 (en) 2004-03-11
US20200017908A1 (en) 2020-01-16
US8597881B2 (en) 2013-12-03
JP2011088898A (ja) 2011-05-06
EP1530578B1 (en) 2013-03-13
DK3002289T3 (en) 2018-04-23
US20130197209A1 (en) 2013-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5748805B2 (ja) 修飾されたヌクレオチド
US10480025B2 (en) Labelled nucleotides
ES2694651T3 (es) Nucleótidos etiquetados
US20170002408A1 (en) Labelled nucleotides
US11028115B2 (en) Labelled nucleotides
ES2790586T3 (es) Nucleótidos modificados

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20060811

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100216

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20100517

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20100524

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100609

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20100713

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20101112