JP2006129800A - alpha-AMYLASE Km VALUE-MAINTAINING AGENT OF REAGENT FOR MEASURING ELECTROLYTE - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はα−アミラーゼの基質に対する見かけのＫｍ値維持剤に関する。更に詳細には、体液、特に血液または尿中の電解質、例えばカルシウムイオン塩素イオンなどの電解質を測定する試薬中のα−アミラーゼの基質に対する見かけのＫｍ値維持剤、Ｋｍ値維持方法、電解質測定の精密性向上方法に関する。 The present invention relates to an agent for maintaining an apparent Km value for an α-amylase substrate. More specifically, an apparent Km value maintenance agent for a substrate of α-amylase in a reagent for measuring an electrolyte in a body fluid, particularly blood or urine, for example, an electrolyte such as calcium ion chloride ion, a Km value maintenance method, and an electrolyte measurement method. The present invention relates to a precision improvement method.
生体内の電解質の濃度は、通常厳密に代謝調節されていることから、体液中の電解質の測定は生体機能のバロメータとして生化学的臨床検査の中で最も一般的な分析であり、これらを測定することにより各種疾患の診断が行われる。例えば、血清中のカルシウムイオン量の測定は、低カルシウム血症として、低タンパク質血症、低リン血症、腎炎、ネフローゼ、ビタミンＤ欠乏症、副甲状腺機能低下症、クル病などの疾患、高カルシウム血症としては、骨腫瘍、アジソン病、肺気腫、副甲状腺機能亢進症、腎不全などの疾患の診断に用いられる。また例えば、血清中の塩素イオンの測定は低クロール血症として、低張性脱水症、グルココルチコイド過剰症、呼吸性アシドーシスなどの疾患、高クロール結晶としては、高張性脱水症、尿細管性アシドーシス、呼吸性アルカローシスなどの疾患の診断に用いられる。 Since the concentration of electrolytes in the living body is usually strictly regulated by metabolism, the measurement of electrolytes in body fluids is the most common analysis in biochemical clinical tests as a barometer of biological functions. By doing so, various diseases are diagnosed. For example, the amount of calcium ion in serum is measured as hypocalcemia such as hypoproteinemia, hypophosphatemia, nephritis, nephrosis, vitamin D deficiency, hypoparathyroidism, kulu disease, high calcium, etc. As the blood serum, it is used for diagnosis of diseases such as bone tumor, Addison's disease, emphysema, hyperparathyroidism, and renal failure. In addition, for example, measurement of serum chloride ion is hypochloremic, hypotonic dehydration, glucocorticoid excess, respiratory acidosis and other diseases, and high chloric crystals are hypertonic dehydration, tubular acidosis Used for diagnosis of diseases such as respiratory alkalosis.
本発明者らは先にα−アミラーゼを用いた体液中のカルシウムの測定法を提案している。
（特許文献１参照）。この方法はカルシウムによりα−アミラーゼが活性化されることを利用し、糖基質を分解し、分解した生成物をレート法により測定することにより、体液中のカルシウムを定量するものである。α−アミラーゼは活性発現に必要なカルシウムをそれ自体に含むため、前記方法に使用されるα−アミラーゼは脱塩処理によりカルシウムが除去され不活化する必要がある。α−アミラーゼを用いたカルシウム測定は他の酵素法であるホスホリパーゼＤを利用する方法（特許文献２参照）、カルモジュリンを利用する方法（特許文献３参照）と比較して正確性かつ簡便性に優れているとして実際に臨床検査分野で用いられている。
(See Patent Document 1). This method utilizes the fact that α-amylase is activated by calcium, decomposes the sugar substrate, and measures the decomposed product by the rate method, thereby quantifying calcium in the body fluid. Since α-amylase itself contains calcium necessary for expression of activity, the α-amylase used in the above method needs to be inactivated by removing calcium by desalting treatment. Calcium measurement using α-amylase is superior in accuracy and convenience compared to a method using phospholipase D which is another enzyme method (see Patent Document 2) and a method using calmodulin (see Patent Document 3). It is actually used in the clinical laboratory field.
また、カルシウムを除去され、不活性化されたα−アミラーゼがカルシウムを取り込んで再度活性化されるためには、塩素イオンの存在が必須であり、その活性化の度合は塩素イオン濃度に比例することが知られている（非特許文献１、２参照）。この原理に基づきα−アミラーゼを用いて塩素イオン濃度を測定する方法（特許文献４、５参照）は、現在実際に臨床検査分野で用いられており、他の測定法と比較して正確性、簡便性、分析効率の点で優れている。
α−アミラーゼを安定化する方法は、いくつか知られており、例えば、カルシウムイオンを加える方法、塩素イオンを加える方法、アルブミンを加える方法（非特許文献３参照）、アミノ酸を加える方法（特許文献６参照）、酸のアルカリ金属塩等を加える方法（特許文献７参照）、メチオニンを加える方法（特許文献８参照）、アルミニウム塩を加える方法（特許文献９参照）などが上げられる。ここでいう安定化とは長期保存安定性を高めることである。
しかし、上述した方法ではカルシウムを除去して不安定になったα−アミラーゼを完全に安定化するには不十分であり、また金属イオン等の使用は測定対象が微量のカルシウムであるために、測定に影響を及ぼすおそれがあり、好ましくない。更にアルブミン、アミノ酸、メチオニン等を加える方法は腐敗のおそれがあるため好ましいものではない。それに対して、不活性型α−アミラーゼの安定化方法としてマルトース、α−シクロデキストリン等の小糖類、またはこれらの混合物が有効であることが知られている（特許文献１０参照）。
α−アミラーゼの基質としてｐ−ニトロフェニル−β−ガラクトシル−α−ペンタオシド（以下ＧａｌＧ２−ＣＮＰと表記）を用いた場合の、α−アミラーゼの基質に対するＫｍ値は０．６−０．９ｍＭと小さいため（非特許文献４）、このままの状態で電解質測定に用いると定量域が狭くなる。電解質測定において測定したい濃度範囲の定量性を持たせるためには、測定項目に応じて基質に対するＫｍ値を調整する必要がある。例えば体液中カルシウムの場合、α−アミラーゼ活性を阻害してやる、つまり基質に対する見かけのＫｍ値を１０ｍＭ以上、好ましくは３０ｍＭ以上、より好ましくは４０ｍＭ以上に制御することで測定に耐えうる定量性を確保することが出来る。
しかしながら、上述の検討により長期保存安定性は確保されたものの、臨床検査の現場においては原因不明の異常値が見出されたとの指摘が散見されているのが実情であった。 However, although the long-term storage stability was ensured by the above-described examination, it was actually pointed out that an abnormal value of unknown cause was found at the clinical laboratory site.
本発明は従来技術の課題を背景になされたもので、電解質測定に用いられる再活性化されたα−アミラーゼの基質に対する見かけのＫｍ値を任意レベルに一定に保ち、異常値の頻度を低減し、測定の再現性を向上させることを課題とするものである。 The present invention has been made against the background of the problems of the prior art. The apparent Km value for the substrate of reactivated α-amylase used for electrolyte measurement is kept constant at an arbitrary level, and the frequency of abnormal values is reduced. It is an object to improve the reproducibility of measurement.
測定の再現性とは同一試料を複数回連続して測定した際の測定値の変動程度を示す。通常、測定値の最大値と最小値の差、標準偏差および変動係数で評価する。測定の回数は限定しないが、通常２０乃至３０回測定を行う。 The reproducibility of the measurement indicates the degree of fluctuation of the measured value when the same sample is continuously measured a plurality of times. Usually, the evaluation is based on the difference between the maximum and minimum measured values, the standard deviation, and the coefficient of variation. Although the number of times of measurement is not limited, the measurement is usually performed 20 to 30 times.
我々は、α−アミラーゼを用いた電解質測定において異常値が現れたり再現性が悪くなる理由は、何らかの理由により基質に対する見かけのＫｍ値が変動するためではないかと考えた。つまり、再現性を向上させるためには、α−アミラーゼの基質に対する見かけのＫｍ値を一定に保つ必要がある。しかしα−アミラーゼの安定化剤としてマルトース、α−シクロデキストリン等の小糖類、またはこれらの混合物を使用した場合、α−アミラーゼに対する阻害能力が高くないために、見かけのＫｍ値を厳密に一定に保つことが出来ず、測定の再現性が良くないのではないかと考えた。 We thought that the reason why abnormal values appear or the reproducibility deteriorates in electrolyte measurement using α-amylase is that the apparent Km value for the substrate fluctuates for some reason. That is, in order to improve the reproducibility, it is necessary to keep the apparent Km value for the α-amylase substrate constant. However, when a maltose, α-cyclodextrin or other small sugar or a mixture thereof is used as a stabilizer for α-amylase, the apparent Km value is kept strictly constant because the inhibitory ability against α-amylase is not high. I couldn't keep it and thought that the reproducibility of the measurement was not good.
本発明者らは上記課題を解決するため、体液中の電解質（特にカルシウム、塩素イオン）測定に用いることのできる再活性型α−アミラーゼの基質に対する見かけのＫｍ値を一定に制御する方法を鋭意研究した結果、α−アミラーゼが基質を分解した際に生成される生成物を不活性型α−アミラーゼと共存させることにより、再活性化α−アミラーゼによる電解質測定の再現性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have earnestly devised a method for uniformly controlling the apparent Km value for a substrate of a reactivated α-amylase that can be used for measurement of electrolytes (particularly calcium and chloride ions) in body fluids. As a result of research, it was found that the reproducibility of electrolyte measurement by reactivated α-amylase is improved by coexisting the product produced when α-amylase decomposes the substrate with inactive α-amylase. The present invention has been completed.
すなわち本発明は、以下のような構成よりなる。
［項１］
α−アミラーゼとその基質として化学式１：Ｘ−（グルコース）n−Ｙ（Ｘは単糖；（グルコース）nの非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基に結合している、Ｙは発色基；（グルコース）nの還元末端グルコースの１位の水酸基に結合している、ｎは２〜７）を用いた電解質測定方法における、化学式２：Ｘ−（グルコース）nで示される、α−アミラーゼの基質に対するＫｍ値維持剤
［項２］
発色基Ｙが２−クロロ−４−ニトロフェニル基であり、（グルコース）nの還元末端グルコースの１位の水酸基にα−結合により結合している項１記載の基質およびＫｍ値維持剤
［項３］
Ｘがα−,β−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼなどのブロック剤として機能する単糖である項１乃至２記載の基質およびＫｍ値維持剤
［項４］
Ｘが６炭糖である項１乃至３記載の基質およびＫｍ値維持剤
［項５］
Ｘがガラクトースであり、かつn数が２〜４である項１乃至４記載の基質およびＫｍ値維持剤
［項６］
ｎ数が２であり、かつＸが非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基とβ−結合したガラクトースである項１乃至５記載の基質およびＫｍ値維持剤
［項７］
α−アミラーゼと同一試薬中に添加されている項１乃至６記載のＫｍ値維持剤
［項８］
電解質がカルシウムイオンである項１乃至７記載のＫｍ値維持剤
［項９］
電解質が塩素イオンである項１乃至７記載のＫｍ値維持剤
［項１０］
化学式２：Ｘ−（グルコース）nで示されるα−アミラーゼの基質に対するＫｍ値維持剤を含有することを特徴とする、α−アミラーゼとその基質として化学式１：Ｘ−（グルコース）n−Ｙ（Ｙは発色基）を用いた電解質測定のための組成物
［項１１］
化学式２：Ｘ−（グルコース）nで示される化合物を含有させることを特徴とする、α−アミラーゼとその基質として化学式１：Ｘ−（グルコース）n−Ｙ（Ｙは発色基）を用いた電解質測定系における、α−アミラーゼの基質に対する見かけのＫｍ値を一定に維持する方法
［項１２］
化学式２：Ｘ−（グルコース）nで示される化合物を含有させることを特徴とする、α−アミラーゼとその基質として化学式１：Ｘ−（グルコース）n−Ｙ（Ｙは発色基）を用いた電解質測定系における、測定の精密性を向上する方法
［項１３］
化学式２：Ｘ−（グルコース）nで示される化合物を含有させることを特徴とする、α−アミラーゼとその基質として化学式１：Ｘ−（グルコース）n−Ｙ（Ｙは発色基）を用いた、電解質測定系におけるα−アミラーゼの基質に対する見かけのＫｍ値が一定に維持された電解質測定試薬を製造する方法
［項１４］
化学式２：Ｘ−（グルコース）nで示される化合物を含有させることを特徴とする、α−アミラーゼとその基質として化学式１：Ｘ−（グルコース）n−Ｙ（Ｙは発色基）を用いた、電解質測定系における測定の精密性が向上した電解質測定試薬を製造する方法
That is, the present invention has the following configuration.
[Claim 1]
α-Amylase and its substrate as chemical formula 1: X- (glucose) n -Y (X is a monosaccharide; (glucose) n is bonded to the 4- or 6-position hydroxyl group of non-reducing terminal glucose, Y is colored In the electrolyte measurement method using the group; (glucose) n bonded to the hydroxyl group at the 1-position of the reducing terminal glucose of n, where n is 2 to 7), α − represented by the chemical formula 2: X- (glucose) n Km value maintenance agent for amylase substrate [Claim 2]
Item 7. The Km value maintaining agent according to
Chemical formula 2: A Km value maintaining agent for a substrate of α-amylase represented by X- (glucose) n is contained, and α-amylase and its substrate are represented by chemical formula 1: X- (glucose) n -Y ( Y is a composition for measuring an electrolyte using a coloring group [Item 11]
Formula 2: X- (glucose) is characterized by the inclusion of the compound represented by n, chemical formula as its substrate and α- amylase 1: X- (glucose) n -Y (Y is chromophore) electrolyte with Method for maintaining a constant apparent Km value for α-amylase substrate in the measurement system [Item 12]
Formula 2: X- (glucose) is characterized by the inclusion of the compound represented by n, chemical formula as its substrate and α- amylase 1: X- (glucose) n -Y (Y is chromophore) electrolyte with Method for improving measurement precision in a measurement system [Claim 13]
Chemical formula 2: A compound represented by X- (glucose) n is contained, α-amylase and chemical formula 1: X- (glucose) n -Y (Y is a chromophoric group) are used as its substrate, Method for producing an electrolyte measurement reagent in which an apparent Km value for an α-amylase substrate in an electrolyte measurement system is maintained constant [Item 14]
Chemical formula 2: A compound represented by X- (glucose) n is contained, α-amylase and chemical formula 1: X- (glucose) n -Y (Y is a chromophoric group) are used as its substrate, Method for producing an electrolyte measurement reagent with improved measurement precision in an electrolyte measurement system
上述したように、本発明における電解質測定用試薬に用いられるα−アミラーゼＫｍ値維持剤により、再活性化後のα−アミラーゼの基質に対する見かけのＫｍ値を一定に保つことができ、体液中のカルシウムや塩素イオン等の電解質を測定する際の再現性および精密性を大幅に向上させることが可能となった。これにより体液中の電解質を精度良く正確に測定することができる。 As described above, the α-amylase Km value maintenance agent used in the electrolyte measurement reagent in the present invention can keep the apparent Km value for α-amylase substrate after reactivation constant, The reproducibility and precision when measuring electrolytes such as calcium and chloride ions can be greatly improved. Thereby, the electrolyte in the body fluid can be measured accurately and accurately.
本願発明は、α−アミラーゼとその基質として化学式１：Ｘ−（グルコース）n−Ｙ（Ｘは単糖；（グルコース）nの非還元末端グルコースの４位または６位の水酸基に結合している、Ｙは発色基；（グルコース）nの還元末端グルコースの１位の水酸基に結合している、ｎは２〜７）を用いた電解質測定方法における、化学式２：Ｘ−（グルコース）nで示される、α−アミラーゼの基質に対するＫｍ値維持剤である。 In the present invention, α-amylase and its substrate are bonded to the 4- or 6-position hydroxyl group of non-reducing terminal glucose of chemical formula 1: X- (glucose) n —Y (X is a monosaccharide; (glucose) n . , Y is a coloring group; (glucose) n is bonded to the hydroxyl group at the 1-position of the reducing end glucose, n is 2 to 7), and is represented by chemical formula 2: X- (glucose) n It is a Km value maintenance agent with respect to the substrate of α-amylase.
本発明でいう電解質測定方法あるいは電解質測定系とはα−アミラーゼの活性化剤であるカルシウム、または塩素イオン等によりα−アミラーゼが活性化されることを利用し、分解された糖基質を測定することにより試料中の電解質を測定するものである。ここでいう電解質とは、水その他の溶媒に溶解して溶液がイオン電導を行うような物質をいうものであり、具体的には、カルシウムイオン、塩素イオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等を指す。 The electrolyte measurement method or the electrolyte measurement system as used in the present invention measures the decomposed sugar substrate by utilizing the fact that α-amylase is activated by calcium or chloride ions which are activators of α-amylase. Thus, the electrolyte in the sample is measured. The electrolyte here refers to a substance that dissolves in water or other solvent and causes the solution to conduct ion conduction. Specifically, calcium ion, chlorine ion, magnesium ion, barium ion, manganese ion, It refers to zinc ions.
本発明でいうＫｍ値維持とは、不活性化α−アミラーゼの再活性化後の基質に対する見かけの親和性、つまりＫｍ値を一定にすることを意味する。α−アミラーゼを用いた電解質測定の場合、上述したように測定反応開始後の発色基吸収波長の１分間当たりの吸光度変化から電解質濃度を算出するレート法を採用する場合、再活性化されたα−アミラーゼの基質に対するＫｍ値が一定でないと、反応開始後の基質の分解速度が時間の経過あるいは測定毎に変動し、それが再現性不良の原因となりうると考える。 The maintenance of the Km value in the present invention means that the apparent affinity to the substrate after reactivation of the inactivated α-amylase, that is, the Km value is made constant. In the case of electrolyte measurement using α-amylase, when the rate method for calculating the electrolyte concentration from the change in absorbance per minute of the chromophore absorption wavelength after the start of the measurement reaction as described above is employed, the reactivated α -If the Km value for the substrate of amylase is not constant, the decomposition rate of the substrate after the start of the reaction varies with the passage of time or every measurement, which may cause poor reproducibility.
アミラーゼの基質に対するＫｍ値維持の指標を、測定に自動分析機を使用した場合の測光ポイント間の吸光度変化（１分間あたりに換算）の変動とした場合、最終測光ポイントでの吸光度変化±１０％以内に反応開始後１分以内に到達すれば、Ｋｍ値が維持されていると評価できる。 When the Km value maintenance index for the amylase substrate is the change in absorbance change between photometric points (converted per minute) when an automatic analyzer is used for measurement, the absorbance change at the final photometric point is ± 10%. Within 1 minute after the start of the reaction, it can be evaluated that the Km value is maintained.
図１は、Ｋｍ値維持剤としてＧａｌＧ２（ガラクトシルマルトース）の濃度を変えたときの、各測光ポイントでの吸光度変化（1分間あたりに換算）を示したものである。使用した測定装置は日立７１７０形自動分析機である。ＧａｌＧ２濃度を変えた測定試薬の構成は以下に示すとおりである。 FIG. 1 shows the change in absorbance (converted per minute) at each photometric point when the concentration of GalG2 (galactosyl maltose) is changed as a Km value maintenance agent. The measuring device used is a Hitachi 7170 automatic analyzer. The configuration of the measurement reagent with the GalG2 concentration changed is as follows.
（１）第一試薬組成
グッド緩衝液（ｐＨ７．１）５０ｍＭ
１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸 ０．８ｍＭ
ＮａＣｌ ２００ｍＭ
マルトース一水和物 ５０ｍＭ
２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド ０．９ｍＭ
(1) First reagent composition Good buffer (pH 7.1) 50 mM
1,2-bis (o-aminophenoxy) ethanetetraacetic acid 0.8 mM
Maltose monohydrate 50 mM
2-Chloro-4-nitrophenyl-4-o-β-D-galactopyranosyl-α-maltoside 0.9 mM
（２）第二試薬組成
グッド緩衝液（ｐＨ６．４）３００ｍＭ
ＮａＣｌ ２００ｍＭ
ガラクトシルマルトース （第二試薬中の濃度は図１の各表上部に記載）
不活性型α−アミラーゼ（ヒト唾液由来） ２６ＩＵ／ｍＬ
(2) Second reagent composition Good buffer (pH 6.4) 300 mM
Galactosyl maltose (concentration in the second reagent is listed at the top of each table in FIG. 1)
Inactive α-amylase (derived from human saliva) 26 IU / mL
各図の縦軸は1分間あたりの吸光度変化、横軸は反応開始後の経過時間を示す。図中のプロットは各測光ポイントでの吸光度変化（1分間あたりに換算）であることを示す。破線は最終測光ポイントでの吸光度変化±１０％の値を示す。
この図から、Ｋｍ値維持剤の添加濃度の上昇に伴い、最終測光ポイントでの吸光度変化±１０％以内に到達する反応開始後からの時間が短くなることがわかる。
In each figure, the vertical axis represents the change in absorbance per minute, and the horizontal axis represents the elapsed time after the start of the reaction. The plot in the figure shows the change in absorbance at each photometric point (converted per minute). The broken line indicates the value of ± 10% change in absorbance at the final photometric point.
From this figure, it can be seen that the time after the start of the reaction that reaches within ± 10% of the change in absorbance at the final photometric point is shortened as the concentration of the Km value maintenance agent is increased.
上記の測定に使用する自動分析機とは病院の検査室などで一般に使用されている生化学項目分析用自動分析機を指し、例えば日立製７０８０形、７１８０形、７７００形、９０００形自動分析機、日本電子製ＢＭ１２５０形、ＢＭ２２５０形、ＢＭ６０１０形、ＢＭ９０３０形自動分析機、オリンパス製ＡＵ６４０形、ＡＵ２７００形、ＡＵ５４００形自動分析機、東芝製ＴＢＡ−１２０ＦＲ形自動分析機などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。当然、用手法であってもよい。 The automatic analyzer used for the above measurement refers to an automatic analyzer for biochemical item analysis generally used in hospital laboratories, for example, Hitachi 7080, 7180, 7700, 9000 automatic analyzers. , BM1250 type, BM2250 type, BM6010 type, BM9030 type automatic analyzer made by JEOL, Olympus AU640 type, AU2700 type, AU5400 type automatic analyzer, Toshiba TBA-120FR type automatic analyzer, etc. It is not limited. Of course, it may be a technique.
本発明でいう精密性の向上とは日間差の低減を指す。検査室では測定機器の日常管理を特定サンプルの測定値変動の有無で実施している。同時測定における再現性の向上とは同一サンプルを測定した場合の測定値変動が少なくなると言い換えることができ、さらに言い換えればそれは同一サンプル測定における日間差が低減される、つまり精密性の向上と言うことができる。 In the present invention, the improvement in precision refers to a reduction in the daily difference. In the laboratory, daily management of measuring instruments is performed based on the presence or absence of fluctuations in the measured values of specific samples. Improving reproducibility in simultaneous measurement can be paraphrased as less fluctuation in measured values when measuring the same sample, and in other words it means reducing the difference in days in the same sample measurement, that is, improving accuracy. Can do.
本発明でいう基質とは、α−アミラーゼの基質となりうる物質であって、かつ発色基を有するものである。発色基としてはｐ−ニトロフェニル、２−クロロ−４−ニトロフェニルなどの基が挙げられる。その結合様式は、α−型、β−型があるが、本発明においては、α−型が好ましい。α−アミラーゼの基質となりうるために、発色基は（グルコース）nの還元末端に結合する必要がある。従ってα−アミラーゼの基質の一例として、２−クロロ−４−ニトロフェニル４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドが挙げられる。該化合物の製造法は、特許文献１１、特許文献１２などに記載される。
また、基質およびＫｍ値維持剤の（グルコース）nの非還元末端に結合する単糖は特に限定されるものではない。例えばキシロース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、メリビオース、リビトース、イノシトール、ズルシトール、グルシトール、グルコノ−１，５−ラクトン、マンノース等が挙げられるが、好ましくはグルコース以外の単糖、より好ましくはヘキソース、より好ましくはガラクトースである。いずれも、市販のものなどを使用することができる。
これらの単糖の結合様式は特に問わないが、このましくは、β１、４結合、あるいはβ１、６結合である
Moreover, the monosaccharide couple | bonded with the non-reducing terminal of (glucose) n of a substrate and a Km value maintenance agent is not specifically limited. For example, xylose, glucose, galactose, fructose, 2-deoxy-D-glucose, melibiose, ribitose, inositol, dulcitol, glucitol, glucono-1,5-lactone, mannose, etc., preferably monosaccharides other than glucose, More preferred is hexose, more preferred is galactose. In any case, commercially available products can be used.
The binding mode of these monosaccharides is not particularly limited, and is preferably β1,4 bond, or β1,6 bond.
本発明でいうＫｍ値維持剤は測定試薬中での添加位置は制限しないが、特にα−アミラーゼと共存させることで効果を発揮する。電解質測定方法に用いる試薬は、その構成に制限はないが、通常、自動分析機に適用できるような構成であることが好ましく、さらには２試薬で構成されていることが好ましい。電解質測定方法に用いる方法が２試薬系であり、かつα−アミラーゼが第二試薬に添加されている場合、Ｋｍ値維持剤の第二試薬中での濃度は５ｍＭ以上、好ましくは３５ｍＭ以上で効果が期待できる。 The Km value maintaining agent as referred to in the present invention is not limited in the addition position in the measuring reagent, but is particularly effective when coexisting with α-amylase. The reagent used in the electrolyte measurement method is not limited in its configuration, but it is usually preferable that the reagent can be applied to an automatic analyzer, and it is more preferable that the reagent is composed of two reagents. When the method used for the electrolyte measurement method is a two-reagent system and α-amylase is added to the second reagent, the concentration of the Km value maintenance agent in the second reagent is 5 mM or more, preferably 35 mM or more. Can be expected.
上述したように（グルコース）nの非還元末端に結合する単糖はグルコース以外の単糖が好ましいが、それは（グルコース）n+1−Ｙを基質とした場合、α−アミラーゼ以外の検体由来の酵素の基質にもなりうるために、α−アミラーゼ以外の酵素の作用により基質から遊離した発色基の吸光度がα−アミラーゼの作用により遊離した発色基の吸光度に上乗せされてしまうため、電解質濃度を正確に測定できなくなるためである。したがって検体由来の酵素の基質となりえないように（グルコース）nの非還元末端に結合する単糖はそれらの酵素のブロック剤として作用するグルコース以外の単糖が好ましい。ブロック剤とは、Ｘ−（グルコース）n−Ｙを基質としうる酵素の作用を抑制するための糖残基と定義する。Ｘ−（グルコース）n−Ｙを基質としうる酵素としては、例えばα−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ、β−グルコシダーゼなどであるがこれらに限定されるものではない。 Although monosaccharides that bind to the non-reducing end of as described above (glucose) n is preferably monosaccharides other than glucose, it is (glucose) when the n + 1 -Y a substrate, other than the α- amylase specimen derived from Since it can also be an enzyme substrate, the absorbance of the chromophore released from the substrate by the action of an enzyme other than α-amylase is added to the absorbance of the chromophore released by the action of α-amylase. This is because accurate measurement cannot be performed. Therefore, monosaccharides other than glucose that act as a blocking agent for these enzymes are preferred as monosaccharides that bind to the non-reducing ends of (glucose) n so that they cannot be substrates for enzymes derived from the specimen. The blocking agent is defined as a sugar residue for suppressing the action of an enzyme that can use X- (glucose) n -Y as a substrate. Examples of the enzyme that can use X- (glucose) n -Y as a substrate include, but are not limited to, α-glucosidase, glucoamylase, β-glucosidase, and the like.
上記例において基質としてＧａｌＧ２−ＣＮＰ、Ｋｍ値維持剤としてガラクトシルマルトース（ＧａｌＧ２）を用いた場合、α−アミラーゼがＧａｌＧ２によりいわゆる生成物阻害を受け、α−アミラーゼの基質に対するＫｍ値を見かけ上大きくすることができると考えられる。 In the above example, when GalG2-CNP is used as the substrate and galactosyl maltose (GalG2) is used as the Km value maintenance agent, α-amylase is subjected to so-called product inhibition by GalG2, and apparently increases the Km value for the α-amylase substrate. It is considered possible.
本発明においてＫｍ値維持の対象となるα−アミラーゼとは、微生物、植物、または動物の、いずれの起源のものも用いることが可能であるが、好ましくは動物起源のものであり、例えばブタ膵臓、ヒト膵臓、ヒト唾液由来のα−アミラーゼが例示される。また、これらをコードする遺伝子を微生物に組換え導入し、製造したα−アミラーゼも含まれる。本発明に用いられるα−アミラーゼは、脱塩処理などによって不活性化型とされている必要がある。そして、実際に測定に関与する不活性型α−アミラーゼは、上述のように試料中のカルシウムまたは塩素イオン等の電解質を得て活性化型α−アミラーゼとなり、α−アミラーゼの基質と反応する、電解質により可逆的に再活性化するものである必要がある。該脱塩処理は、例えば、透析、限外ろ過、イオン交換、カラム除去、電気膜透析などの方法により行われるのが好ましい。電解質により可逆的に再活性化する不活性型α−アミラーゼの試薬組成中の濃度は好ましくは反応液中に０．１〜１０００ＩＵ／ｍＬの範囲で用いられる。 In the present invention, the α-amylase that is the target of maintaining the Km value can be any source of microorganisms, plants, or animals, but preferably is of animal origin, for example, porcine pancreas And α-amylase derived from human pancreas and human saliva. Also included are α-amylases produced by recombination of genes encoding these into microorganisms. The α-amylase used in the present invention needs to be inactivated by desalting. Then, the inactive α-amylase actually involved in the measurement obtains an electrolyte such as calcium or chloride ion in the sample as described above to become an activated α-amylase, which reacts with the substrate of α-amylase. It must be reversibly reactivated by the electrolyte. The desalting treatment is preferably performed by a method such as dialysis, ultrafiltration, ion exchange, column removal, or electromembrane dialysis. The concentration in the reagent composition of the inactive α-amylase that is reversibly reactivated by the electrolyte is preferably in the range of 0.1 to 1000 IU / mL in the reaction solution.
また、本願発明はこのような電解質測定系において、上記Ｋｍ値維持剤を含むことを特徴とする、α−アミラーゼの基質に対する見かけのＫｍ値を一定に維持する方法、あるいは、測定の精密性を向上する方法である。 In addition, the present invention provides a method for maintaining a constant apparent Km value for an α-amylase substrate, or a measurement accuracy, characterized by including the Km value maintaining agent in such an electrolyte measurement system. It is a way to improve.
また、本願発明は、上記Ｋｍ値維持剤を含む電解質測定のための組成物も含む。本発明の組成物には、基質、補酵素など反応に必須なものの他、緩衝能の維持、安定化、防腐、定量域の確保などを目的にして色源体、防腐剤、界面活性剤、安定化剤、キレート剤等種々の物質をさらに添加することができる。金属塩等も使用できるが、測定系に影響を及ぼさないように条件を設定することが必要である。 The present invention also includes a composition for measuring an electrolyte containing the Km value maintaining agent. In the composition of the present invention, in addition to those essential for the reaction such as a substrate and a coenzyme, a color source, a preservative, a surfactant, etc. for the purpose of maintaining buffer capacity, stabilizing, preserving, securing a quantitative range, etc. Various substances such as a stabilizer and a chelating agent can be further added. Metal salts and the like can be used, but it is necessary to set conditions so as not to affect the measurement system.
また、本願発明は、上記Ｋｍ値維持剤を含むことを特徴とする、電解質測定系におけるα−アミラーゼの基質に対する見かけのＫｍ値が一定に維持された電解質測定試薬を製造する方法、あるいは、電解質測定系における測定の精密性が向上した電解質測定試薬を製造する方法である。 The present invention also includes a method for producing an electrolyte measurement reagent in which an apparent Km value for an α-amylase substrate in an electrolyte measurement system is maintained constant, or an electrolyte, comprising the Km value maintenance agent. This is a method for producing an electrolyte measurement reagent with improved measurement precision in a measurement system.
本発明に使用される緩衝剤としては特に限定されないが、トリス緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、ほう酸ホウ砂緩衝剤、ＧＯＯＤ緩衝剤などが挙げられる。中でもトリス緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、ほう酸ホウ砂緩衝剤は濃度、温度によってｐＨが変動しやすいが、安価であるという利点がある。また、ＧＯＯＤ緩衝剤にはＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳなどが例示される。これらのうち、例えばリン酸緩衝剤ではリン酸１水素２Ｋ塩とリン酸２水素Ｋ塩との混合、トリス緩衝液では塩酸塩との混合、ＧＯＯＤ緩衝剤ではＮａ塩との混合比率を変えて調整されうる。 Although it does not specifically limit as a buffering agent used for this invention, A tris buffer, a citrate buffer, a phosphate buffer, a borate borax buffer, a GOOD buffer, etc. are mentioned. Among them, Tris buffer, citrate buffer, phosphate buffer, and borate borax buffer have the advantage of being inexpensive, although the pH tends to fluctuate depending on the concentration and temperature. Examples of the GOOD buffer include MES, Bis-Tris, ADA, ACES, BES, PIPES, MOPS, TES, HEPES, Tricine, Bicine, POPSO, TAPS, CHES, and CAPS. Of these, for example, the phosphate buffer is mixed with 2K phosphate and 2K phosphate, the Tris buffer is mixed with hydrochloride, and the GOOD buffer is mixed with Na salt. Can be adjusted.
本発明に使用される緩衝剤の濃度は特に限定されないが、好ましくは１０−５００ｍＭ、より好ましくは５０−３００ｍＭの濃度で用いられる。また、緩衝剤のｐＨはα−アミラーゼの安定性至適ｐＨが６乃至８の中性付近であることから、本発明の試薬組成物はｐＨ６乃至８の範囲で調整するのが好ましいと考えられるが、試薬構成および組成成分の安定性により必ずしもこの範囲内に収まらなくても、反応時のｐＨがα−アミラーゼの至適ｐＨとなるように調整すれば問題ない。 The concentration of the buffer used in the present invention is not particularly limited, but it is preferably 10-500 mM, more preferably 50-300 mM. In addition, since the pH of the buffering agent is in the vicinity of neutrality where the optimum pH of α-amylase is 6 to 8, it is considered that the reagent composition of the present invention is preferably adjusted in the range of pH 6 to 8. However, there is no problem if the pH during the reaction is adjusted to the optimum pH of α-amylase even if it does not necessarily fall within this range due to the reagent composition and the stability of the composition components.
本発明に用いられる防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤等が挙げられる。抗生物質としてはα−アミラーゼの安定性に対する影響の少ないセフェム系、ペニシリン系、アミノグリコシド系、キノロン系等が公的に用いられる。抗菌剤としてはＭＩＴ、ＨＰＯ、ＣＡＡ、ＩＺＵ、ＢＮＤ等が挙げられる。これらは単独でも組み合わせても使用することができる。 Examples of the preservative used in the present invention include azides, chelating agents, antibiotics and antibacterial agents. As the antibiotic, cephem, penicillin, aminoglycoside, quinolone and the like that have little influence on the stability of α-amylase are publicly used. Antibacterial agents include MIT, HPO, CAA, IZU, BND and the like. These can be used alone or in combination.
本発明に用いられる界面活性剤としては、特に限定されないが、非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤が挙げられる。非イオン界面活性剤としては、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコアミドプロピル）コラミド、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグリコシド、ＭＥＧＡ−８、ＭＥＧＡ−９、ＭＥＧＡ−１０、シュークロースモノカプレート、ポリオキシエチレンラウリルエーテル等が挙げられる。陽イオン界面活性剤としてはＳＤＳが挙げられる。陰イオン界面活性剤としては、コール酸ナトリウム、両性イオン界面活性剤としてはＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯが挙げられる。これらは単独でも組み合わせても使用することができる。 The surfactant used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include nonionic surfactants, cationic surfactants, anionic surfactants, and zwitterionic surfactants. Nonionic surfactants include N, N-bis (3-D-glucoamidopropyl) colamide, n-heptyl-β-D-thioglucoside, n-octyl-β-D-thioglycoside, MEGA-8, MEGA-9, MEGA-10, sucrose monocaprate, polyoxyethylene lauryl ether and the like. SDS is an example of a cationic surfactant. Examples of the anionic surfactant include sodium cholate, and examples of the zwitterionic surfactant include CHAPS and CHAPSO. These can be used alone or in combination.
本発明に用いられる安定化剤としては、特に限定されないが、チオール化合物、フラビン含有化合物、糖類、アルブミン、キレート剤等の公知の各安定化剤が挙げられる。 Although it does not specifically limit as a stabilizer used for this invention, Each well-known stabilizer, such as a thiol compound, a flavin containing compound, saccharides, albumin, a chelating agent, is mentioned.
本発明に用いられるキレート剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、１，２−ビス−（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸ならびにこれらの塩等が挙げられる。中でもα−アミラーゼの至適ｐＨである中性付近での金属選択性の点から、１，２−ビス−（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸が特に好ましい。該キレート剤の電解質測定用試薬組成物中での役割は、ブランク反応を抑える、拮抗阻害剤として定量性を調節する、または測定対象外の類似共雑イオンをマスキングするなどが挙げられる。該キレート剤の添加濃度は特に限定されないが、好ましくは０．０１乃至１０ｍＭ、より好ましくは０．１乃至１ｍＭの範囲で用いるのが良い。また、蒸気に示されるキレート剤を複数組み合わせても良い。 Examples of the chelating agent used in the present invention include ethylenediaminetetraacetic acid, glycol etherdiaminetetraacetic acid, 1,2-bis- (o-aminophenoxy) ethanetetraacetic acid, trans-1,2-diaminocyclohexanetetraacetic acid, and these Examples include salts. Of these, 1,2-bis- (o-aminophenoxy) ethanetetraacetic acid is particularly preferred from the viewpoint of metal selectivity in the vicinity of neutrality, which is the optimum pH of α-amylase. The role of the chelating agent in the reagent composition for electrolyte measurement includes suppressing the blank reaction, adjusting the quantification as a competitive inhibitor, or masking similar contaminant ions other than the measurement target. The concentration of the chelating agent to be added is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 10 mM, more preferably 0.1 to 1 mM. Moreover, you may combine multiple chelating agents shown by vapor | steam.
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。なお、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The present invention is not limited to these examples.
実施例１および２
α−アミラーゼとガラクトシルマルトースを共存させた下記組成からなるカルシウム測定試薬を調整し、市販の管理血清２種の３０回繰り返し測定を実施し、再現性を評価した。過酷な条件での再現性を評価するために第二試薬添加後、攪拌を行わない場合の再現性も併せて評価した。
Examples 1 and 2
A calcium measurement reagent having the following composition coexisting with α-amylase and galactosyl maltose was prepared, and repeated measurement of two commercially available controlled sera was performed 30 times to evaluate reproducibility. In order to evaluate the reproducibility under harsh conditions, the reproducibility when stirring was not performed after the addition of the second reagent was also evaluated.
（１）第一試薬組成
グッド緩衝液（ｐＨ７．１）５０ｍＭ
１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸 ０．８ｍＭ
ＮａＣｌ ２００ｍＭ
マルトース一水和物 ５０ｍＭ
２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド ０．９ｍＭ
(1) First reagent composition Good buffer (pH 7.1) 50 mM
1,2-bis (o-aminophenoxy) ethanetetraacetic acid 0.8 mM
Maltose monohydrate 50 mM
2-Chloro-4-nitrophenyl-4-o-β-D-galactopyranosyl-α-maltoside 0.9 mM
（２）第二試薬組成
グッド緩衝液（ｐＨ6.4）３００ｍＭ
ＮａＣｌ ２００ｍＭ
ガラクトシルマルトース 実施例１；１０ｍＭ、実施例２；３５ｍＭ
不活性型α−アミラーゼ（ヒト唾液由来） ２６ＩＵ／ｍＬ
(2) Second reagent composition Good buffer (pH 6.4) 300 mM
Galactosyl maltose Example 1; 10 mM, Example 2; 35 mM
Inactive α-amylase (derived from human saliva) 26 IU / mL
カルシウム量の測定方法
試料量５．２μＬに第一試薬１８０μＬ加え、５分間予備加温した後、さらに第二試薬６０μＬを加えて反応を開始させ、該試薬添加後２分後からの３分間における１分あたりの吸光度変化を求め、精製水およびカルシウム１０ｍｇ／ｄＬ標準液での２点検量線に基づき、試料中のカルシウム量を求めた。尚、測定装置は日立７１７０形自動分析装置を使用し、測定波長は主波長４０５ｎｍ、副波長５４６ｎｍとし、測定温度は３７℃で実施した。
Method for measuring calcium amount After adding 180 μL of the first reagent to 5.2 μL of the sample amount and pre-warming for 5 minutes, 60 μL of the second reagent is further added to start the reaction, and in 3 minutes from 2 minutes after the addition of the reagent. The change in absorbance per minute was determined, and the amount of calcium in the sample was determined on the basis of two inspection dose lines with purified water and a 10 mg / dL standard solution of calcium. In addition, Hitachi 7170 type automatic analyzer was used for the measuring device, the measurement wavelength was 405 nm, the subwavelength was 546 nm, and the measurement temperature was 37 ° C.
比較例１
下記組成からなるカルシウム測定試薬を調整し、市販の管理血清の３０回繰り返し測定を実施し、再現性を評価した。過酷な条件での再現性を評価するために第二試薬添加後、攪拌を行わない場合の再現性も併せて評価した。
Comparative Example 1
A calcium measuring reagent having the following composition was prepared, and measurement of commercially available control serum was repeated 30 times to evaluate reproducibility. In order to evaluate the reproducibility under harsh conditions, the reproducibility when stirring was not performed after the addition of the second reagent was also evaluated.
（１）第一試薬組成
グッド緩衝液（ｐＨ７．１）５０ｍＭ
１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン四酢酸 ０．８ｍＭ
ＮａＣｌ ２００ｍＭ
ガラクトシルマルトース １８ｍＭ
２−クロロ−４−ニトロフェニル−４−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシド ０．９ｍＭ
(1) First reagent composition Good buffer (pH 7.1) 50 mM
1,2-bis (o-aminophenoxy) ethanetetraacetic acid 0.8 mM
Galactosyl maltose 18mM
2-Chloro-4-nitrophenyl-4-o-β-D-galactopyranosyl-α-maltoside 0.9 mM
（２）第二試薬組成
グッド緩衝液（ｐＨ６．４）３００ｍＭ
ＮａＣｌ ２００ｍＭ
マルトース一水和物 １５０ｍＭ
不活性型α−アミラーゼ（ヒト唾液由来） ２６ＩＵ／ｍＬ
(2) Second reagent composition Good buffer (pH 6.4) 300 mM
Maltose monohydrate 150 mM
Inactive α-amylase (derived from human saliva) 26 IU / mL
上記表１は第二試薬添加後の攪拌を実施した場合の再現性評価結果である。この場合、再現性の性能は比較例１と比較して実施例１、２とも差が見られない。 Table 1 above shows reproducibility evaluation results when stirring after the second reagent was added. In this case, there is no difference in reproducibility performance between the first and second embodiments as compared with the first comparative example.
上記表２は第二試薬添加後の攪拌を未実施の場合の再現性評価結果である。この場合、再現性の性能は比較例１で同時再現性CVが１．６８％であるのに対し、実施例１では１.２３％、実施例２では０．７７％と再現性が良好であることが確認された。測定平均値についても比較例１では表１と表２の差が１．０ｍｇ／ｄｌであるのに対し、実施例１では０．６ｍｇ／ｄｌ、実施例２では０.３ｍｇ／ｄｌと攪拌動作がない場合の測定値が攪拌動作があるときと近似することを確認した。 Table 2 above shows reproducibility evaluation results when stirring after the addition of the second reagent is not performed. In this case, the reproducibility performance was good at 1.2% in Example 1 and 0.77% in Example 2 while the reproducibility performance was 1.68% in Comparative Example 1. It was confirmed that there was. Regarding the measured average value, the difference between Table 1 and Table 2 in Comparative Example 1 is 1.0 mg / dl, whereas in Example 1, 0.6 mg / dl in Example 1, and 0.3 mg / dl in Example 2, the stirring operation It was confirmed that the measured value in the absence of sapphire approximated that when there was a stirring operation.
攪拌動作がない場合の同時再現性ＣＶおよび表１、表２間の測定値差が小さいということは過酷な条件下でも測定値が一定である、つまり再活性化α−アミラーゼのＫｍ値が一定に保たれやすいことを示している。 The simultaneous reproducibility CV when there is no stirring operation and the difference in the measured value between Tables 1 and 2 is small, the measured value is constant even under severe conditions, that is, the Km value of the reactivated α-amylase is constant. It is easy to be kept.
本発明は、体外診断用医薬品（電解質測定用試薬など）などの用途分野に利用することができ、産業界に寄与することが大である。 The present invention can be used in fields of application such as in-vitro diagnostic pharmaceuticals (electrolyte measuring reagents and the like), and greatly contributes to the industry.
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