JPH0414311B2 - - Google Patents
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N33/721—Haemoglobin
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、血中の赤血球で生成されるヘモグロ
ビンに結合したグルコースの量を吸光度測定を利
用して求める方法に関するものであり、糖尿病に
係わる血糖値管理に有効な方法である。Detailed Description of the Invention (Field of Industrial Application) The present invention relates to a method for determining the amount of glucose bound to hemoglobin produced by red blood cells in blood using absorbance measurement, and is related to diabetes. This is an effective method for controlling blood sugar levels.
（従来技術）
赤血球で生成されるヘモグロビンには初期には
グルコースが結合されていないが、赤血球の寿命
である約４ケ月の間に血中のグルコースと反応し
てシツフ塩基様の結合をしてアルジミンに変わ
る。この反応は可逆的であるが、次にケトンの一
種であるケトアミンに変化すると、もとのアルジ
ミンに戻らず、安定な化合物となる。この反応は
非酵素的で緩慢であり、赤血球の循環過程を通じ
てゆつくり進行するものであるから、その生成量
は過去の血中の糖濃度を反映し、血糖値が高い
程、またその期間が長い程大きくなる。即ち、グ
ルコースが結合されたヘモグロビン（これは、グ
リコシル化ヘモグロビンあるいはHbA1とも称さ
れ、主成分であるHbAから区別される微小成分
であるところのHbA1a、HbA1b、HbA1cの総称
である）の濃度を知れば、採血時よりさかのぼる
過去数ケ月間の血糖レベルを集積的に知ることが
できる訳で、値が変動しやすい血糖そのものの測
定値よりも糖尿病診断上有効な指標となりうる。
また、血糖そのものの測定値と併用することによ
り、糖尿病治療の上でも極めて有用であり、近年
注目をあびている。(Prior art) Glucose is not bound to hemoglobin produced by red blood cells at the beginning, but during the lifespan of red blood cells, which is approximately 4 months, it reacts with glucose in the blood and forms Schiff base-like bonds. converted to aldimine. This reaction is reversible, but when it is converted into a ketoamine, which is a type of ketone, it does not return to the original aldimine and becomes a stable compound. Since this reaction is non-enzymatic and slow, and progresses slowly through the circulation of red blood cells, the amount produced reflects the past blood sugar concentration, and the higher the blood sugar level and the longer the period. The longer it gets, the bigger it gets. In other words, hemoglobin with glucose attached (this is also called glycosylated hemoglobin or HbA 1 , and is a general term for HbA 1 a, HbA 1 b, and HbA 1 c, which are minute components that are distinguished from the main component HbA. By knowing the concentration of blood sugar (which is 20%), it is possible to cumulatively know the blood sugar level over the past several months dating back to the time of blood collection, and it is a more effective indicator for diabetes diagnosis than the blood sugar itself, which tends to fluctuate in value. sell.
In addition, when used in conjunction with the measured value of blood sugar itself, it is extremely useful in the treatment of diabetes, and has attracted attention in recent years.
このようなHbA1を測定する方法として最も一
般的に普及している方法は、小さな陽イオン交換
カラムを用いた簡易カラム法（以下カラム法と称
す）である。このカラム法は、陽イオン交換カラ
ムに溶血血液を滴下し、所定の塩濃度、PHに調整
された溶離液を加えると、HbA1がHbAよりも速
やかに溶出し、分離することができるので、この
HbA1を含む液の吸光度と、後で溶出されるHbA
を含む液の吸光度を求めてHbA1の量とトータル
のヘモグロビンの量との比をとることにより、
HbA1の濃度を求める方法である。HbA1a＋
HbA1bとHbA1cを別々に溶出させてそれぞれの
吸光度を求める場合もある。 The most widely used method for measuring HbA 1 is a simple column method (hereinafter referred to as column method) using a small cation exchange column. In this column method, when hemolyzed blood is dropped onto a cation exchange column and an eluent adjusted to a predetermined salt concentration and pH is added, HbA 1 can be eluted and separated more quickly than HbA. this
Absorbance of solution containing HbA 1 and later eluted HbA
By determining the absorbance of the liquid containing HbA 1 and taking the ratio between the amount of HbA 1 and the total amount of hemoglobin,
This is a method to determine the concentration of HbA 1 . HbA 1 a＋
In some cases, HbA 1 b and HbA 1 c are eluted separately and their respective absorbances are determined.
しかしながら、このカラム法は、カラムを用い
たHbA1、HbAの溶出操作と、吸光度測定とを必
要とするので、手間がかかり、測定を自動化する
ことができないという問題点がある。また、この
方法は精度が低く、特に温度による測定値の変動
が大きいという問題点がある。 However, this column method requires elution of HbA 1 and HbA using a column and absorbance measurement, which is time-consuming and has the problem that the measurement cannot be automated. Additionally, this method has the problem of low accuracy and, in particular, large fluctuations in measured values due to temperature.
また、従来方法にTBA比色法があるが、この
方法は、溶血血液を弱酸酸性下にて100℃で数時
間加熱することにより、ヘモグロビンに結合して
いるグルコースを、５−ヒドロキシメチルフルフ
ラールとして切り離し、TBA（２−チオバルビツ
ール酸）を加えることにより着色させ、吸光度を
求める方法である。 Another conventional method is the TBA colorimetric method, which converts glucose bound to hemoglobin into 5-hydroxymethylfurfural by heating hemolyzed blood at 100°C for several hours under weakly acidic conditions. In this method, the sample is separated, colored by adding TBA (2-thiobarbituric acid), and the absorbance is determined.
しかしこのTBAを用いる方法は、前記のよう
に100℃、数時間の加熱処理が必要であるから、
非能率的であり、前記方法と同様に自動化するこ
とはできない。 However, this method using TBA requires heat treatment at 100℃ for several hours as mentioned above.
It is inefficient and cannot be automated like the previous method.
自動化が可能となる従来方法として、フイチン
酸を用いる方法がある。この方法は、ヘモグロビ
ンにすでにグルコースが結合している場合にはフ
イチン酸がヘモグロビンのＮ末端に結合せず、グ
ルコースが結合していない場合にのみフイチン酸
がヘモグロビンに結合して波長の変化に対する吸
光度の変化を示す曲線が変化し、ある波長におけ
る吸光度の変化量から結合されているグルコース
の濃度を測定する方法である。 A conventional method that can be automated is a method using phytic acid. In this method, phytic acid does not bind to the N-terminus of hemoglobin when glucose is already bound to hemoglobin, and phytic acid binds to hemoglobin only when glucose is not bound, and the absorbance changes with respect to wavelength. In this method, the concentration of bound glucose is measured from the amount of change in absorbance at a certain wavelength.
しかしながら、この方法は、血糖値測定を行な
う場合に、ほとんどの場合に血中に凝固防止と糖
分解酵素活性抑制の目的で添加されているフツ化
ソーダ等が妨害物質として作用する欠点がある。
このフイチン酸を用いる方法の場合、妨害物質と
して作用しないEDTAを凝固防止剤として用い
ることが考えられるが、この場合、血糖測定用検
体としては、等分解酵素活性抑制という点で不十
分なことが多く、従つて同一検体から血糖と
HbA1を同時測定するという目的には適さない。
同様に、凝固防止剤としてのペパリンなどもフイ
チン酸法に対する妨害物質であつて使用できず、
このようなことがフイチン酸法の臨床応用を著し
く妨げているのが現状である。またこの方法は、
正常なヘモグロビンを測定してグリコシル化ヘモ
グロビンの量を逆算により求める方法であるた
め、精度が悪いという欠点がある。 However, this method has the disadvantage that, in most cases, sodium fluoride and the like, which are added to the blood for the purpose of preventing coagulation and suppressing the activity of glycolytic enzymes, act as interfering substances when measuring blood sugar levels.
In the case of this method using phytic acid, it is possible to use EDTA, which does not act as an interfering substance, as an anticoagulant, but in this case, it may be insufficient in terms of inhibiting isolytic enzyme activity as a sample for blood glucose measurement. Therefore, blood sugar and blood sugar from the same sample
Not suitable for simultaneous measurement of HbA 1 .
Similarly, anti-caking agents such as pepperin interfere with the phytic acid method and cannot be used.
At present, this situation significantly hinders the clinical application of the phytic acid method. Also, this method
Since this method measures normal hemoglobin and calculates the amount of glycosylated hemoglobin by back calculation, it has the disadvantage of poor accuracy.
一方、血漿中の蛋白（プロテイン）もまたグリ
コシル化ヘモグロビンの生成と同じ機じよにより
グリコシル化され（グリコシル化プロテイン）、
これもグリコシル化ヘモグロビンと同様の臨床指
標として有用であることが知られている。このグ
リコシル化プロテインを測定する方法として、
NBT（nitoroblue tetorazolium）がプロテイン
に結合したフラクトサミンにより還元されて
NBTが無色ないし黄色から青色に変色すること
を利用し、NBTを含むPH10.8の炭酸緩衝液に血
清を加えて混合した後、10ないし15分経過時の
530nｍにおける吸光度の変化を測定し、同じ手
順でDMF（１−deoxy、１−
morpholinofructose）をアルブミンに加えたも
のの吸光度の変化と比較し、血糖値管理上で新規
な手法が得られたという報告がなされている
（Roger N.Johnson et al.Fructosamine：ａ
new approach to the estimation of serum
glycosylprotein.An index of diabetic control.
Elsevier Biomedical Press.1983.87−95）。 On the other hand, proteins in plasma are also glycosylated (glycosylated proteins) by the same mechanism that produces glycosylated hemoglobin.
This is also known to be useful as a clinical indicator similar to glycosylated hemoglobin. As a method to measure this glycosylated protein,
NBT (nitoroblue tetorazolium) is reduced by fructosamine bound to protein.
Taking advantage of the fact that NBT changes color from colorless or yellow to blue, after 10 to 15 minutes have elapsed after serum is added to a carbonate buffer containing NBT with a pH of 10.8 and mixed.
The change in absorbance at 530 nm was measured, and DMF (1-deoxy, 1-deoxy,
It has been reported that a new method for controlling blood sugar levels has been obtained by comparing the change in absorbance when morpholinofructose (morpholinofructose) is added to albumin (Roger N. Johnson et al.
new approach to the estimation of serum
glycosylprotein.An index of diabetic control.
Elsevier Biomedical Press.1983.87−95).
しかしながら、このNBTを用いる方法をグリ
コシル化ヘモグロビンの測定に適用しようとする
と、反応中にヘモグロビンの凝集が起こつて濁り
を生じる上、グルコースによつてNBTが還元さ
れた時の吸光波長である約500〜600nｍの波長に
おいては、ヘモグロビンの特異吸収があり、この
部分の吸光度が反応中に変化を受けて不安定とな
るため、実質的には不可能である。 However, when this method using NBT is applied to the measurement of glycosylated hemoglobin, aggregation of hemoglobin occurs during the reaction, resulting in turbidity. At a wavelength of ~600 nm, there is a specific absorption of hemoglobin, and the absorbance of this portion changes during the reaction and becomes unstable, so it is practically impossible.
（発明の目的）
本発明は、前記NBTを用いて、ヘモグロビン
に結合されたグルコースの量を精度良く測定で
き、しかも測定の自動化も行なえる測定方法を提
供することを目的とする。(Object of the Invention) An object of the present invention is to provide a measurement method that can accurately measure the amount of glucose bound to hemoglobin using the NBT, and can also automate the measurement.
（発明の構成）
本発明によるヘモグロビンに結合されたグルコ
ースの測定方法は、NBTと溶血血液とを、４量
体でなるヘモグロビンを単量体化しうる液組成に
て混合することにより、フラクトサミンとしてヘ
モグロビンに結合されたグルコースにより前記
NBTを還元すると共に、ヘモグロビンによる500
〜600nｍにおける特異吸収を減少ないしは無く
した状態として吸光度の測定を行ない、該吸光度
からグルコース濃度を示す指標値を求めるように
したことを特徴とする。(Structure of the Invention) The method for measuring glucose bound to hemoglobin according to the present invention is to mix NBT and hemolysed blood in a liquid composition that can monomerize hemoglobin consisting of tetramers, thereby converting hemoglobin into fructosamine. said by glucose bound to
500 by hemoglobin as well as reducing NBT.
The present invention is characterized in that absorbance is measured in a state where specific absorption at ~600 nm is reduced or eliminated, and an index value indicating glucose concentration is determined from the absorbance.
即ち、ヘモグロビンは通常はα鎖が２個、β鎖
が２個からなる４量体であるが、ある緩衝液を用
いた場合、PHを12以上にすれば、単量体ずつに分
離する。即ち各α、β鎖に分離することが知られ
ている。また、一般的に蛋白質の会合を抑制する
手段として、溶液のPHや塩濃度の調整あるいは界
面活性剤やチオール化合物の使用などが有効であ
ることが知られている（安藤鋭郎他著；『タンパ
ク質化学．3.高次構造』共立出版株式会社昭和51
年９月20日発行）。本発明者らは、ヘモグロビン
は界面活性剤の如き解離促進剤の存在のもとで
は、PHが12以下（例えば11.0）でも４量体の解離
に伴なつて500〜600nｍにある前記ヘモグロビン
の特異吸収が無くなると共に、ヘモグロビンの凝
集性もなくなり、これを利用すれば、NBTがケ
トン化されたグルコースに特異的に還元されるこ
とを見いだし、このことから、ヘモグロビンを単
量体化して前記特異吸収を無くした状態で、ヘモ
グロビンに結合されたグルコースにより還元され
たNBTの量を吸光度測定によつて求めることで、
血糖管理のための新しい指標を求めるようにした
ものである。 That is, hemoglobin is normally a tetramer consisting of two α chains and two β chains, but when a certain buffer is used and the pH is raised to 12 or higher, it is separated into monomers. That is, it is known that it separates into α and β chains. In addition, it is generally known that adjusting the pH and salt concentration of the solution, or using surfactants or thiol compounds are effective ways to suppress protein association (Eishiro Ando et al., Protein Chemistry. 3. Higher Order Structure” Kyoritsu Publishing Co., Ltd. 1977
Published on September 20th). The present inventors have discovered that in the presence of a dissociation promoter such as a surfactant, hemoglobin has a specific characteristic of hemoglobin in the range of 500 to 600 nm as the tetramer dissociates even at a pH of 12 or less (for example, 11.0). As absorption disappears, the aggregation property of hemoglobin also disappears, and by utilizing this, NBT was found to be specifically reduced to ketonized glucose.From this, hemoglobin was monomerized and the aggregation property of hemoglobin was also eliminated. By measuring the amount of NBT reduced by glucose bound to hemoglobin in the absence of hemoglobin,
The aim was to find new indicators for blood sugar management.
（実施例）
第１図は本発明のバツクグラウンドとなる吸光
度曲線であり、１は炭酸緩衝液0.1M（0.03M
NaHCO3＋0.07M Na2CO3）により、PHが10.8ま
たは12.5に調整されたNBT（半井化学薬品社製、
No.24720）試薬５ｍＭ溶液の吸光度曲線であり、
該曲線１からわかるように、NBTは400nｍ以下
の非可視域に吸収域があり、ほとんど透明ないし
は薄い黄色をなす。(Example) Figure 1 is an absorbance curve that forms the background of the present invention.
NBT (manufactured by Hanui Chemical Co., Ltd., whose pH was adjusted to 10.8 or 12.5 with NaHCO 3 + 0.07M Na 2 CO 3 )
No.24720) Absorbance curve of 5mM solution of reagent,
As can be seen from Curve 1, NBT has an absorption region in the invisible region below 400 nm, and is almost transparent or pale yellow in color.
曲線２Ａは凝固防止剤EDTAを含む全血を２
倍量の生理食塩水で３回洗浄して赤血球を得、こ
れに水を加えて撹拌することにより溶血させ（以
下これを溶血試料と称す）、その100μをとつて
これに１mlの水を加えて薄めた試料の吸光度曲線
であり、炭酸緩衝液によりPHを11.5以下に調整し
た場合には、PHの高低にかかわりなく曲線２Ａの
ようになり、540nｍおよび580nｍ付近に山のあ
る特異吸収がある。曲線２Ｂは同じ濃度の溶血試
料において、PHのみを12.0に上げた場合のもので
あり、図からわかるように、特異吸収領域におけ
る山の高さが半減している。曲線２Ｃは同じ濃度
の溶血試料において、PHのみを12.5に上げた場合
のものであり、図からわかるように、特異吸収領
域における山が無くなつている。このことは、PH
が12以上になるとヘモグロビンは４量体から単量
体に変化するという報告と符合している。 Curve 2A shows whole blood containing the anticoagulant EDTA.
Red blood cells were obtained by washing three times with twice the amount of physiological saline, and then hemolyzed by adding water and stirring (hereinafter referred to as the hemolyzed sample). Take 100μ of this and add 1ml of water to it. This is an absorbance curve of a sample diluted with a carbonate buffer.If the pH is adjusted to 11.5 or less with a carbonate buffer, it will look like curve 2A regardless of the high or low pH, and there will be a specific absorption with peaks around 540nm and 580nm. . Curve 2B is a hemolyzed sample with the same concentration, but when only the pH is raised to 12.0, and as can be seen from the figure, the height of the peak in the specific absorption region is halved. Curve 2C is a hemolyzed sample with the same concentration, but when only the pH is raised to 12.5, and as can be seen from the figure, the peak in the specific absorption region has disappeared. This means that PH
This is consistent with the report that hemoglobin changes from a tetramer to a monomer when it becomes 12 or more.
また、第２図の曲線４は、単に水により溶血試
料を稀釈した場合の吸光度曲線、曲線５，６は、
溶血試料をそれぞれ、ヘモグロビンの解離を促進
する目的で添加した非イオン界面活性剤アルキル
−フエノキシポリエトキシ−エタノール（Rohm
and Haas社製 Triton Ｘ−100）３％を含む炭
酸緩衝液でPH11.0、PH11.5以上にそれぞれ調整し
たものにおける吸光度曲線であり、前記界面活性
剤を加えず、単にPHを11.0に調整した時には第１
図の曲線２Ａにも示したように、ヘモグロビンの
解離は不十分であつたが、前記界面活性剤を加え
た場合には、単量体化が十分に進行することが曲
線５，６から理解できる。 Curve 4 in Figure 2 is the absorbance curve when the hemolyzed sample is simply diluted with water, and curves 5 and 6 are
Each hemolyzed sample was treated with a nonionic surfactant alkyl-phenoxypolyethoxy-ethanol (Rohm) added to promote hemoglobin dissociation.
These are absorbance curves obtained by adjusting the pH to 11.0 and 11.5 or above using a carbonate buffer containing 3% Triton When you do, the first
As shown in curve 2A in the figure, dissociation of hemoglobin was insufficient, but it can be seen from curves 5 and 6 that monomerization progresses sufficiently when the surfactant is added. can.
曲線３Ａは、前記溶血試料を100μとつてこ
れに500μの水を加えると共に、0.5ｍＭの濃度
を有し炭酸緩衝液によりPHを10.8に調整した
NBT溶液を500μ加えて37℃で30分間反応させ
た試料の吸光度曲線であり、このPH10.8において
は、液に濁りがあり、吸光度は波長の長い領域で
も大である。曲線３Ｂは曲線３Ａの溶液のPHのみ
を12.0に変化させたものであり、この場合には、
溶液に若干の濁りがあるが濁りは少なくなり、吸
光度は減少している。曲線３Ｃは曲線３Ａの溶液
に前記界面活性剤Triton Ｘ−100をその濃度が
３％にのるように加えると共に、PHを11.0に変化
させた場合のものであり、この溶液は濁りはな
く、これに伴なつて吸光度も曲線３Ｂの溶液に比
較して若干減少する。 For curve 3A, 100μ of the hemolyzed sample was taken, 500μ of water was added to it, and the pH was adjusted to 10.8 with a carbonate buffer having a concentration of 0.5mM.
This is an absorbance curve of a sample obtained by adding 500μ of NBT solution and reacting at 37°C for 30 minutes.At pH 10.8, the liquid is cloudy and the absorbance is large even in the long wavelength region. Curve 3B is obtained by changing only the pH of the solution of curve 3A to 12.0, and in this case,
There is some turbidity in the solution, but the turbidity has decreased and the absorbance has decreased. Curve 3C is the result when the above-mentioned surfactant Triton Along with this, the absorbance also decreases slightly compared to the solution of curve 3B.
第１図において、ａまたはｂに示す線の長さ分
の吸光度がNBTの還元に伴なう吸光度の変化で
あり、３％Triton Ｘ−100存在下でPHが11以上
であればヘモグロビンの特異吸収分も少なくなる
と共に、濁りもなくなるので、実用可能なデータ
を得ることができる。なお、Triton Ｘ−100の
反応系への干渉は特に問題なく、また、その濃度
を必ずしも３％に固定する必要はないが、濃度が
低ければ効果は得られない。 In Figure 1, the absorbance over the length of the line a or b is the change in absorbance due to the reduction of NBT, and if the pH is 11 or higher in the presence of 3% Triton Since the amount of absorption is reduced and the turbidity is also eliminated, practical data can be obtained. Note that there is no particular problem with Triton X-100 interfering with the reaction system, and the concentration does not necessarily need to be fixed at 3%; however, if the concentration is low, no effect will be obtained.
次に、本発明において、ヘモグロビンに結合さ
れたグルコースの量の指標となる値を実際に求め
る場合の手法を具体例により説明する。 Next, a method for actually obtaining a value that is an index of the amount of glucose bound to hemoglobin in the present invention will be explained using a specific example.
例 １
前記溶血試料を100μとつてこれに１mlの
Triton Ｘ−100の３％水溶液を加え、540nｍに
おける吸光度を測定した（この吸光度はヘモグロ
ビンの濃度に相当する吸光度であり、これをA0
とする）。一方、前記溶血試料を100μとり、
Triton Ｘ−100を３％含むPH11.5の炭酸緩衝液の
500μと、0.5ｍＭの濃度のNBT溶液（３％
Triton Ｘ−100含有）を500μ加えて37℃で30
分間反応させた後、540nｍにおける吸光度を測
定した（この吸光度をA1とする）。そして、これ
らの値から(1)式により指標値X1を求めた。Example 1 Take 100μ of the hemolyzed sample and add 1ml to it.
A 3% aqueous solution of Triton X-100 was added and the absorbance at 540 nm was measured (this absorbance corresponds to the concentration of hemoglobin,
). On the other hand, take 100μ of the hemolyzed sample,
carbonate buffer with pH 11.5 containing 3% Triton X-100.
500μ and NBT solution (3%) at a concentration of 0.5mM.
Add 500μ of Triton X-100) and incubate at 37℃ for 30
After reacting for a minute, the absorbance at 540 nm was measured (this absorbance is designated as A 1 ). Then, the index value X 1 was determined from these values using equation (1).
X1＝（A1−A0）／A0 ……(1)
ここで、A1−A0（＝ΔA）はケトン化されたグ
ルコースに還元されたNBTの濃度に対応する。
この方法の場合、第１図において、ΔAは線ｃの
長さ（即ちNBTを加えた液の吸光度ｄからヘモ
グロビン濃度に相当する吸光度ｅを減じたもの）
に相当するから、ケトン化されたグルコースの濃
度が小さい場合には誤差が大きくなるが一応の指
標は与えられる。この方法による測定データと、
従来のカラム法による測定データを突合わせたと
ころ、第３図に示すように、ほぼ一次式で表現さ
れる関係が成立し、実用しうることがわかつた。 X 1 =(A 1 −A 0 )/A 0 (1) Here, A 1 −A 0 (=ΔA) corresponds to the concentration of NBT reduced to ketonized glucose.
In the case of this method, in Fig. 1, ΔA is the length of line c (i.e., the absorbance d of the liquid containing NBT minus the absorbance e corresponding to the hemoglobin concentration).
Therefore, if the concentration of ketonized glucose is small, the error will be large, but it can provide a tentative indication. Measurement data obtained by this method,
When the data measured by the conventional column method was compared, a relationship expressed by an almost linear equation was established, as shown in FIG. 3, and it was found that this could be put to practical use.
例 ２
前記溶血試料を100μとつてこれに１mlの３
％Triton Ｘ−100水溶液を加え、540nｍにおけ
る吸光度を測定した（この吸光度はヘモグロビン
の濃度に対応した吸光度であり、その値をA2と
する）。一方前記溶血試料を前記とは別に100μ
をとり、これに、３％のTriton Ｘ−100を含む
PH11.5の炭酸緩衝液を500μ加えて15分間常温で
反応させ、540nｍにおける吸光度を測定した
（この吸光度をA3とする）。次にこの炭酸緩衝液
を加えた溶液に0.5ｍＭの濃度のNBT溶液（３％
Triton Ｘ−100を含む）を500μ加えて37℃で
30分間反応させた後、540nｍにおける吸光度を
測定した（この吸光度をA4とする）。そして、こ
れらの値から(2)式により指標値X2を求めた。Example 2 Take 100μ of the hemolyzed sample and add 1ml of 3
% Triton Meanwhile, separate the hemolyzed sample to 100μ
and contains 3% Triton X-100.
500μ of a carbonate buffer with pH 11.5 was added and reacted for 15 minutes at room temperature, and the absorbance at 540 nm was measured (this absorbance is designated as A3 ). Next, to the solution to which this carbonate buffer was added was a 0.5mM NBT solution (3%
Add 500μ of Triton X-100) and heat at 37℃.
After reacting for 30 minutes, the absorbance at 540 nm was measured (this absorbance is designated as A4 ). Then, the index value X 2 was determined from these values using equation (2).
X2＝｛A4−（６／11）A3｝／A2 ……(2)
なお、(2)式において、A3の係数として、（６／
11）を乗じているのは、この溶液ではヘモグロビ
ン濃度が最終の溶液のそれよりも11/6倍だけ濃い
ためである。この方法の場合は、A4−（６／11）
A3は、第１図の線ｂ（＝ｄ−ｆ）に相当する吸光
度を示すことになるので、例１の方法に比較して
より正確な値が得られることになる。 X 2 = {A 4 − (6/11) A 3 }/A 2 ...(2) In equation (2), as the coefficient of A 3 , (6/
11) because the hemoglobin concentration in this solution is 11/6 times higher than that in the final solution. In this case, A 4 - (6/11)
Since A 3 will show an absorbance corresponding to the line b (=df) in FIG. 1, a more accurate value will be obtained compared to the method of Example 1.
なお、この方法を実施する場合は、炭酸緩衝液
の液量とNBT液の量の割合も種々に変更しうる。
前記例１の方法が２種の吸光度測定を並行して同
時に行なえ、いわば１ステツプ法と呼べるに比較
し、この方法はいわば２ステツプ法と呼べる方法
である。 Note that when carrying out this method, the ratio of the amount of carbonate buffer to the amount of NBT solution can also be varied.
In contrast to the method of Example 1, which allows two types of absorbance measurements to be carried out simultaneously and can be called a one-step method, this method can be called a two-step method.
例 ３
次に、同じ容器に対し、水、炭酸緩衝液、
NBT液を順次加えて各吸光度を測定し、その結
果から演算により指標値を求めるいわば３ステツ
プ法と呼べる方法の一例を述べる。前記溶血試料
を100μとつてこれに500μの３％Triton Ｘ−
100水溶液を加え、540nｍにおける吸光度を測定
する（この吸光度がヘモグロビンの濃度に相当
し、これをA5とする）。次に、この溶液に、３％
のTriton Ｘ−100を含むPH11.5の炭酸緩衝液（前
記例１、２の場合の２倍濃度の液）を250μ加
えて15分間常温で反応させ、540nｍにおける吸
光度を測定した（この吸光度をA6とする）。次に
この溶液に１ｍＭの濃度のNBT溶液（３％の
Triton Ｘ−100含有）を250μ加えて37℃で30
分間反応させた後、540nｍにおける吸光度を測
定した（この吸光度をA7とする）。そして、これ
らの値から(3)式により指標値X3を求めた。Example 3 Next, in the same container, water, carbonate buffer,
An example of a so-called three-step method will be described in which the NBT solution is sequentially added, each absorbance is measured, and an index value is calculated from the results. Take 100μ of the hemolyzed sample and add 500μ of 3% Triton X-
100 aqueous solution is added and the absorbance at 540 nm is measured (this absorbance corresponds to the concentration of hemoglobin and is referred to as A5 ). Next, add 3% to this solution.
250μ of a carbonate buffer solution (double the concentration in Examples 1 and 2 above) containing Triton A 6 ). Next, add this solution to a 1mM concentration of NBT solution (3%
Add 250μ of Triton X-100 and incubate at 37℃ for 30
After reacting for a minute, the absorbance at 540 nm was measured (this absorbance is designated as A7 ). Then, the index value X 3 was determined from these values using equation (3).
X3＝｛A7−（8.5／11）A6｝
／｛（６／11）A5｝ ……(3)
この例３の方法は、１つのセルに各試薬を順次
加えていく方法であるから、最も自動化が容易な
方法である。この例３の場合も、液濃度や量も
種々に選択できる。 X 3 = {A 7 − (8.5/11) A 6 } / {(6/11) A 5 } ...(3) The method of Example 3 is a method of sequentially adding each reagent to one cell. Because of this, it is the easiest method to automate. In the case of Example 3 as well, the concentration and amount of the liquid can be variously selected.
なお、前記各例において、ヘモグロビンの濃度
を求める場合は、415nｍ付近の主吸収領域にお
ける吸光度を測定して求めることも可能である。 In each of the above examples, when determining the concentration of hemoglobin, it is also possible to determine it by measuring the absorbance in the main absorption region around 415 nm.
〔ヘモグロビンの濃度による測定結果の変動に
ついて〕
次にヘモグロビンの濃度が前記指標値X1等に
及ぼす影響について試験した結果について述べ
る。第４図は前記例１、例２において、同一の検
体において、検体の稀釈度を変化させ（即ちヘモ
グロビンの濃度を変化させ）、他の炭酸緩衝液、
NBT液の濃度を同一にして前記指標値X1、また
はX2を求めた結果を示す。図中、線７，８は糖
尿病患者から採取した同じ検体についての測定結
果であり、線７は前記例２による測定結果、８は
前記例１による測定結果である。９は例２の(2)式
において、ヘモグロビン濃度に相当する吸光度
A2の変わりに（６／11）・A3を用い、X2＝｛A4−
（６／11）A3｝／｛（６／11）・A3｝として求めた
場合の結果である。 [Regarding fluctuations in measurement results due to hemoglobin concentration] Next, the results of testing on the effect of hemoglobin concentration on the index value X1 , etc. will be described. FIG. 4 shows that in Examples 1 and 2, the dilution of the sample was changed (that is, the concentration of hemoglobin was changed), and other carbonate buffers were used.
The results of determining the index value X 1 or X 2 with the same concentration of NBT liquid are shown. In the figure, lines 7 and 8 are the measurement results for the same sample taken from a diabetic patient, line 7 is the measurement result according to Example 2, and line 8 is the measurement result according to Example 1. 9 is the absorbance corresponding to the hemoglobin concentration in equation (2) of Example 2.
Using (6/11)・A 3 instead of A 2 , X 2 = {A 4 −
This is the result when calculated as (6/11)A 3 }/{(6/11)・A 3 }.
第４図からわかるように、ヘモグロビン濃度が
大となる程指標値X1、X2が小さくなる傾向にあ
るが、人の実際のヘモグロビン濃度のばらつきの
範囲はこの測定範囲よりも一般にははるかに狭い
ため、ヘモグロビン濃度が測定結果に与える影響
は小さいと考えてよい。 As can be seen from Figure 4, the higher the hemoglobin concentration, the smaller the index values X 1 and Because the area is narrow, it can be considered that the effect of hemoglobin concentration on the measurement results is small.
本発明による測定を行なう場合、検体中に含ま
れると思われる物質について、その過剰量をそれ
ぞれ加えて前記例２の方法を用いて測定し、測定
結果に与える影響について考察した。
When performing measurements according to the present invention, excess amounts of substances thought to be contained in the specimen were added and measured using the method of Example 2 above, and the effects on the measurement results were discussed.
〔その１−抗凝固剤〕
血液の抗凝固剤として用いられているフツ化ソ
ーダ、ペパリン、EDTAについて、各濃度を通
常の添加量よりも多く加えて測定を行なつた所、
第５図に示すように、実質上これらが測定結果に
影響を与えないことがわかつた。[Part 1 - Anticoagulants] When measuring the concentrations of sodium fluoride, pepperin, and EDTA, which are used as blood anticoagulants, by adding each concentration in higher amounts than usual,
As shown in FIG. 5, it was found that these did not substantially affect the measurement results.
〔その２−血中の還元性物質〕
フルクトース、ビタミンＣ、グルタチオンにつ
いての結果を第６図に示す。この場合も実質上影
響がないことがわかる。[Part 2 - Reducing Substances in Blood] Figure 6 shows the results for fructose, vitamin C, and glutathione. It can be seen that there is virtually no effect in this case as well.
一方、ヘモグロビンに結合されていない遊離の
グルコースは血糖として血液中に普遍的に存在す
るもので、重症糖尿病患者では極めて高濃度（正
常者の数倍）となることが予想される。そこで、
遊離のグルコースの妨害作用について、PH濃度、
Triton Ｘ−100濃度の組合わせ条件を変えてみ
た結果が第７図である。第７図にも示すように、
TritonX−100を使用せずに単量体化が可能なPH
12.5では、遊離グルコースの干渉が若干認められ
た。これに対し、Triton Ｘ−100を３％添加し、
PHを11.5にまで下げた場合には遊離グルコースの
干渉は全くなく、NBT反応も良好であつた。 On the other hand, free glucose that is not bound to hemoglobin is ubiquitous in the blood as blood sugar, and is expected to be at an extremely high concentration in patients with severe diabetes (several times higher than in normal people). Therefore,
Regarding the interference effect of free glucose, PH concentration,
Figure 7 shows the results of changing the combination conditions of Triton X-100 concentration. As shown in Figure 7,
PH that allows monomerization without using TritonX−100
12.5, some interference from free glucose was observed. To this, 3% Triton X-100 was added,
When the pH was lowered to 11.5, there was no interference from free glucose and the NBT reaction was good.
〔その３−赤血球中の糖代謝関連物質〕
赤血球内に含まれる解糖系中間産物の中から乳
酸、ピルビン酸、２，３−グリセロ二りん酸、３
−グリセロりん酸について第８図Ａに示し、同じ
く２−グリセロりん酸、グルコース−６−りん
酸、フルクトース−６−りん酸、フルクトース−
１，６−二りん酸についての結果を第８図Ｂに示
すが、これらの場合も実質上影響がないことがわ
かる。[Part 3 - Substances related to sugar metabolism in red blood cells] Among the glycolytic intermediates contained in red blood cells, lactic acid, pyruvic acid, 2,3-glycerodiphosphate, 3
-Glycerophosphate is shown in Figure 8A, and also 2-glycerophosphate, glucose-6-phosphate, fructose-6-phosphate, fructose-
The results for 1,6-diphosphoric acid are shown in FIG. 8B, and it can be seen that there is virtually no effect in these cases as well.
分離、洗浄赤血球を用いることは、血漿成分を
除去してヘモグロビンに結合されたグルコースの
みを測定できる利点はあるが、臨床検査としての
簡便性からは大きな不利益がある。全血検体を用
いた場合には、ヘモグロビンに結合したグルコー
スの他に、R.N.Jhonson等の示すプロテインに結
合したグルコースもNBT反応によつて測定され、
得られた結果はグリコシル化ヘモグロビンとグリ
コシル化プロテインの和を反映したものと理解さ
れる。従来はこのような測定法は実用化されてい
なかつたもので、本発明は新しい指標を提供する
ものである。
Although the use of separated and washed red blood cells has the advantage of removing plasma components and measuring only glucose bound to hemoglobin, it has a major disadvantage in terms of simplicity as a clinical test. When whole blood samples are used, in addition to glucose bound to hemoglobin, glucose bound to proteins as shown by RNJhonson et al. is also measured by NBT reaction.
It is understood that the results obtained reflect the sum of glycosylated hemoglobin and glycosylated protein. Conventionally, such a measurement method has not been put to practical use, and the present invention provides a new indicator.
第９図は、EDTAを含む全血50μに水１mlを
加えてその100μを前記例２の方法と同様に測
定した結果をカラム法によるHbA1値と比較して
示したものである。このように、本実施例におけ
る吸光度変化量X2は、HbA1値とよく相関し、臨
床指標として高い有用性が認められた。 FIG. 9 shows the results of adding 1 ml of water to 50 µ of whole blood containing EDTA and measuring 100 µ of the same in the same manner as in Example 2 above, in comparison with the HbA 1 value determined by the column method. Thus, the amount of change in absorbance X 2 in this example correlated well with the HbA 1 value, and was recognized to be highly useful as a clinical index.
（発明の効果）
以上述べたように、本発明は、従来のカラム法
のようなヘモグロビンの溶出操作を必要とせず、
また、TBA法のような100℃という高温における
数時間という長時間の加熱作業を必要とせず、試
薬の混合と吸光度測定によつて指標値を求めるこ
とができるので、測定の自動化が容易であり、能
率良く測定作業を行なうことが可能となる。ま
た、本発明を実施する場合、フツ化ソーダその他
検体中に存在すると思われる物質による妨害作用
がなく、実用化が容易である。また本発明は、い
わゆるグリコシル化ヘモグロビンHbA1ではな
く、ヘモグロビンに複数個結合して安定型である
ケトン型となつたグルコースそのものの濃度を測
定するようにしたので、被検出物質の量が多く、
このため、測定精度が向上する。(Effects of the Invention) As described above, the present invention does not require a hemoglobin elution operation unlike the conventional column method, and
In addition, the index value can be determined by mixing reagents and measuring absorbance, without requiring long heating work at a high temperature of 100°C for several hours as in the TBA method, making it easy to automate measurements. , it becomes possible to carry out measurement work efficiently. Further, when carrying out the present invention, there is no interfering effect due to sodium fluoride or other substances thought to be present in the sample, and it is easy to put it into practical use. In addition, the present invention measures the concentration of glucose itself, which has become a stable ketone form by binding multiple units to hemoglobin, rather than so-called glycosylated hemoglobin HbA 1 , so the amount of the substance to be detected is large.
Therefore, measurement accuracy is improved.
第１図は本発明の前提となるヘモグロビン、
NBT、還元後のNBT吸光度曲線、第２図は同じ
く本発明において、界面活性剤とPHとの組合わせ
条件を変化させた場合の吸光度曲線、第３図は本
発明を実施した場合の測定結果と従来のカラム法
による結果を突合わせて示す図、第４図は本発明
におけるヘモグロビン濃度の影響を示す図、第５
図、第６図、第７図、第８図はそれぞれ血液抗凝
固剤、血中の還元性物質、血中の遊離グルコー
ス、赤血球中の糖代謝関連物質の妨害作用を調べ
た結果を示す図、第９図は本発明を全血検体につ
いて実施した場合の測定結果と従来のカラム法に
よる結果を突合わせて示す図である。
１……NBTの吸光度曲線、２Ａ……溶血試料
の吸光度曲線（PH11.5以下）、２Ｂ……溶血試料
の吸光度曲線（PH12.0）、２Ｃ……溶血試料の吸
光度曲線（PH12.5）、３Ａ……溶血試料＋NBTの
吸光度曲線（PH10.8）、３Ｂ……溶血試料＋NBT
の吸光度曲線（PH12.0）、３Ｃ……溶血試料＋
NBTの吸光度曲線（PH12.5）、４……溶血試料を
水稀釈した場合の吸光度曲線、５，６……溶血試
料に界面活性剤を加えた場合のそれぞれPH11.0、
PH11.5における吸光度曲線。
Figure 1 shows hemoglobin, which is the premise of the present invention.
NBT, NBT absorbance curve after reduction, Figure 2 is the absorbance curve when the combination conditions of surfactant and PH are changed in the present invention, Figure 3 is the measurement results when the present invention is implemented. Figure 4 is a diagram showing the influence of hemoglobin concentration in the present invention, Figure 5 is a diagram showing the influence of hemoglobin concentration in the present invention,
Figures 6, 7, and 8 show the results of investigating the interfering effects of blood anticoagulants, reducing substances in the blood, free glucose in the blood, and sugar metabolism-related substances in red blood cells, respectively. FIG. 9 is a diagram showing a comparison of the measurement results obtained when the present invention was applied to a whole blood sample and the results obtained using the conventional column method. 1...Absorbance curve of NBT, 2A...Absorbance curve of hemolyzed sample (PH11.5 or less), 2B...Absorbance curve of hemolyzed sample (PH12.0), 2C...Absorbance curve of hemolyzed sample (PH12.5) , 3A... Absorbance curve of hemolyzed sample + NBT (PH10.8), 3B... Hemolyzed sample + NBT
Absorbance curve (PH12.0), 3C...hemolyzed sample +
Absorbance curve of NBT (PH12.5), 4...Absorbance curve when hemolyzed sample is diluted with water, 5, 6...PH11.0 when surfactant is added to hemolyzed sample, respectively.
Absorbance curve at PH11.5.
Claims (1)
をポリエチレングリコール−ｐ−イソオクチルフ
エニルエーテルを含んだPH11.0〜12.0の緩衝液に
混合して反応させ、４量体でなるヘモグロビンを
単量体化してヘモグロビンによる500〜600nｍに
おける特異吸収を無くしてヘモグロビンに結合し
たグルコースであるフルクトサミンの濃度を測定
する方法。1. Tetrazolium salt, which is an oxidizing agent, and hemolyzed blood are mixed and reacted in a buffer solution containing polyethylene glycol-p-isooctylphenyl ether with a pH of 11.0 to 12.0, and the hemoglobin consisting of a tetramer is converted into a monomer. A method of measuring the concentration of fructosamine, which is glucose bound to hemoglobin, by eliminating the specific absorption at 500 to 600 nm by hemoglobin.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8321084A JPS60227171A (en) | 1984-04-25 | 1984-04-25 | Measuring method of glucose conjugated to hemoglobin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8321084A JPS60227171A (en) | 1984-04-25 | 1984-04-25 | Measuring method of glucose conjugated to hemoglobin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60227171A JPS60227171A (en) | 1985-11-12 |
| JPH0414311B2 true JPH0414311B2 (en) | 1992-03-12 |
Family
ID=13795959
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8321084A Granted JPS60227171A (en) | 1984-04-25 | 1984-04-25 | Measuring method of glucose conjugated to hemoglobin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60227171A (en) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3743405A1 (en) * | 1987-05-14 | 1988-11-24 | Boehringer Mannheim Gmbh | METHOD FOR DETERMINING FRUCTOSAMINE |
| US5110745A (en) * | 1989-06-01 | 1992-05-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods of detecting glycated proteins |
| AU2001290300A1 (en) | 2000-09-28 | 2002-04-08 | Arkray, Inc. | Method of quantifying hemoglobin and method of measuring glycation ratio of hemoglobin |
| CN105527234A (en) * | 2015-12-25 | 2016-04-27 | 天津市傲景农业科技发展有限公司 | Method for detecting content of vitamin C in fruits and vegetables |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPS4961327A (en) * | 1972-06-09 | 1974-06-14 | ||
| JPS56120951A (en) * | 1980-02-28 | 1981-09-22 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Measuring method for blood hemoglobin |
| JPS5780560A (en) * | 1980-10-01 | 1982-05-20 | Technicon Instr | Removal of turbidity from biological sample liquid and reagent therefor |
| JPS58154660A (en) * | 1981-12-23 | 1983-09-14 | ジヨン・リチヤ−ド・ベイカ− | Method of measuring concentration of serum glucose in blood sample |
-
1984
- 1984-04-25 JP JP8321084A patent/JPS60227171A/en active Granted
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60227171A (en) | 1985-11-12 |
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