JP2006113463A - 格子照明顕微鏡装置 - Google Patents

Abstract

【課題】
標本中における焦点位置以外の部分からの光が撮像素子に結像されることを防ぎ、顕微鏡画像のコントラストを低下させない格子照明顕微鏡装置の提供。
【解決手段】
照明光を出射する照明光源１と、標本を載置するための標本台１０と、所定の透過率分布を有し、該透過率分布に対応した強度分布を有する格子模様の透過光を出射する格子部材３及び標本台１０上の標本に格子模様の照明を行う照明レンズ群６，８を含み、該照明レンズ群が格子部材３と標本とが共役関係になるように配置される照明光学系と、照明光学系のうちの標本から格子部材３に至るまでの構成を共通して含み、標本から出射される観察光を受けて標本像を結像する結像光学系と、標本像を撮影する撮像素子１２とを備えて構成している。
【選択図】 図１

Description

本発明は、標本に格子像を照明し、格子像が照明された標本から出射される観察光を受けて撮像素子に結像する格子照明顕微鏡装置に関するものである。

安価に標本の三次元画像が得られる小型の顕微鏡として格子照明顕微鏡がある（例えば、特許文献１）。格子照明顕微鏡は、標本に照明されて散乱される照明光において、焦点ずれに対して０次光の信号強度はほとんど変化しないのに対し、０次光以外の光は焦点ずれによって急速に信号強度を失っていくことに着目しており、標本を格子状に照明してわざと散乱光の主成分が０次光以外となるようにするとともに、残った０次光を物理的もしくは画像間演算によって除去することにより、焦点ずれに対して敏感に構成したものである。このため、光軸方向に標本を移動させながら標本中における合焦面のみからの信号を求めることによって標本の三次元像を得ることができる。

また、標本の三次元画像が得られる共焦点顕微鏡が波長一定の単色光を光源として構成される一方、格子照明顕微鏡は単色光のみならず複数の波長成分を有する光、例えば白色光を光源として構成できる。このため、格子照明顕微鏡は、得られる画像における色彩の違いが重要とされる分野、例えば医学系分野、生物学系分野等で有益とされる。

この格子照明顕微鏡の原理を簡単に説明する。標本の照明パターンとして正弦波状の強度分布を持ったものを利用すると、得られる画像の主成分は、この正弦波パターンの周期に逆比例する周波数成分を持った１次光成分、即ち焦点ずれに敏感な画像となる。この画像を照明パターンの正弦波の１周期を３等分した３つの位相（0，2π/3，4π/3）に対してそれぞれ取得し、３つの位相の画像（I₁，I₂，I₃）とする。

それらの間で、下記式(1)を用いて画像間演算を行うと、通信工学におけるSquare-Lawと同様に、あたかも均一な照明を行ったかのような画像で、しかも０次光の成分が除去された画像を得ることができる。さらに、このときの画像の明るさは、合焦時に最も明るく、焦点ずれに対して暗くなる振る舞いを示し、光軸方向の分解能を有することとなる。

特開２００２−３１１３３５号公報

特許文献１に示されるように上記原理に従って装置構成される従来の格子照明顕微鏡を図２に例示している。図示する格子照明顕微鏡装置Ｍ´において、光源５１から出射した照明光は、コリメートレンズ５２で平行光とされて格子５３を均一に照明する。格子５３は透過率が周期的に変化しており、一般に正弦波状の透過率分布を持つものが用いられる。格子５３から出射する照明光は、回折により一部が＋１次光として図示上方へ、一部が−１次光として図示下方へ向かう。これらの光は、焦点が格子５３上にある照明レンズ５６を透過し、ハーフミラー５７により反射され、照明レンズ５６と瞳位置を共有する対物レンズ５８を透過して標本台６０の標本載置面６０ａに載置した標本上に向けて照射される。これにより、標本上に格子５３の像が生成され、また、格子５３は正弦波状に透過率分布を持つことから標本に正弦波状の強度分布を持った照明がなされることとなる。このように格子模様（縞模様）の光による照明がなされた標本の像を対物レンズ５８、リレーレンズ６１でＣＣＤカメラ６２に結像し、その信号を制御用コンピュータ６３に取り込んで標本の像が得られる。

次いで、制御用コンピュータ６３から信号を出し、圧電素子ドライバ５５を介して圧電素子５４を僅かに伸縮させ、格子５３を格子並び方向（図示矢印Ａ方向）に移動させる。このときの圧電素子５４の伸縮長さを格子５３のピッチの１／３となるようにしておく。すると、標本に照明される格子模様の位相は１／３ずれることとなり、このときの標本の像をＣＣＤカメラ６２で撮像しておく。さらに、同様にして圧電素子５４を伸縮させて標本に照明される格子模様を２／３位相ずらしたときの標本の像をＣＣＤカメラ６２で撮像しておく。以上の３つの画像を式(1)のI₁，I₂，I₃としてI_pを計算することにより、標本中における焦点の合っている高さのみの画像を得ることができる。

なお、図２に例示する格子照明顕微鏡装置Ｍ´は反射型の顕微鏡システムとして構成しているが、標本から対物レンズ５８、ハーフミラー５７、リレーレンズ６１を介してＣＣＤカメラ６２に至る結像光学系をそのままとし、光源５１からコリメートレンズ５２、格子５３、照明レンズ５６、ハーフミラー５７、対物レンズ５８を介して標本に至る照明光学系を標本下側に設ける等により、透過型の顕微鏡システムとして構成することもできる。

このように格子照明顕微鏡は、標本中における焦点位置に生成される格子の像を再びＣＣＤ等の撮像素子に結像することで焦点位置のみの情報を得るものとしている。しかしながら、実際には標本中における焦点位置以外の部分にも光が照射されているため、式(1)のI₁，I₂，I₃には焦点位置からの有効な信号とともに、顕微鏡画像全体でほぼ均一で大きなバックグラウンドが混入することとなり、信号処理後に生成される焦点位置の顕微鏡画像のコントラストを低下させる原因となっている。特に、厚い蛍光標本等のように焦点位置以外の部分からの蛍光が強く発せられるような標本に対しては、このようなバックグラウンドが極めて大きく、著しく顕微鏡画像の画質を悪化させている。

本発明はこのような問題に鑑みたもので、標本中における焦点位置以外の部分からの光が撮像素子に結像されることを防ぎ、顕微鏡画像のコントラストを低下させない格子照明顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上記目的達成のため、本発明に係る格子照明顕微鏡装置は、照明光を出射する照明光源と、標本を載置するための標本台と、所定の透過率分布を有し、該透過率分布に対応した強度分布を有する格子模様の透過光を出射する格子部材及び標本台上の標本に格子模様の照明を行う照明レンズ群を含み、該照明レンズ群は格子部材と標本とが共役関係になるように配置される照明光学系と、照明光学系のうちの標本から格子部材に至るまでの構成を共通して含み、標本から出射される観察光を受けて標本像を結像する結像光学系と、標本像を撮影する撮像素子とを備えて構成している。

また、照明光源と格子部材との間に半透過鏡を配置し、照明光が半透過鏡を透過して格子部材に入射し、観察光が格子部材を通過した後、半透過鏡で反射することにより撮像素子に入射するように構成することが好ましい。

また、所定の透過率分布は、格子部材を透過した光が再度格子部材を透過したとき、その光の強度分布が正弦波状の分布となるように設定されていることが好ましい。

また、格子部材における少なくとも照明光が入射する側の面が、照明光に対して黒色であることが好ましい。

なお、照明光学系において照明光をＰまたはＳのいずれか一方の偏光として半透過鏡に入射させ、結像光学系において観察光を他方の偏光として半透過鏡に入射させるように構成し、半透過鏡を上記一方の偏光に対する透過率を高く設定し、且つ上記他方の偏光に対する反射率を高く設定して構成された偏光ビームスプリッタとして構成してもよい。

また、標本から格子部材に至るまでの構成中にλ／４板を備えて構成することが好ましい。

なお、λ／４板を複屈折材料から構成してもよい。また、λ／４板をフレネルロム波長板で構成してもよい。

本発明の格子照明顕微鏡装置によれば、結像光学系における観察光の光路は、観察光の光路が照明レンズ群に対する格子部材の位置が標本台の位置と共役関係に設定される照明光学系の光路と共有するように構成されているため、標本の像がいったん格子部材に結像することとなるが、標本中における格子模様が結像する位置以外、即ち標本中における焦点位置以外の部分から出射する観察光は格子部材において焦点が結ばれず、格子部材をほとんど通過できないようになっている。従って、格子部材を通過して撮像素子に結像する観察光は、バックグラウンドがほとんど排除され、所望の焦点位置から出射される光で占められることとなる。これにより、式(1)におけるI₁，I₂，I₃の信号コントラストが高まり、顕微鏡画像の画質悪化を防ぐことができる。

以下、図面を参照して本発明の好ましい実施形態について説明する。本発明の実施形態に係る格子照明顕微鏡装置Ｍの構成を図１に示している。格子照明顕微鏡装置Ｍは、図２に示す従来の装置構成と同様に、白色の照明光を照射する白色光源１と、図１に示す矢印Ａ方向に変化する略正弦波状の透過率分布を有した一次元格子３とを備えて構成されている。

格子照明顕微鏡装置Ｍの白色光源１から出射した照明光は、コリメートレンズ２でほぼ平行光束とされ、偏光板２１に入射し、紙面内に電場の振動方向のある直線偏光（Ｐ偏光）とされ、偏光ビームスプリッタ２２に入射するようになっている。

偏光ビームスプリッタ２２は、一般的とされるものと同様、Ｐ偏光に対しての透過率を高く、Ｓ偏光に対しての反射率を高く設定して構成されている。このため、偏光板２１に入射してＰ偏光とされた照明光は、偏光ビームスプリッタ２２を透過して一次元格子３を均一に照明する。このように、偏光ビームスプリッタ２２が白色光源１と一次元格子３との間に設けられているとともに、偏光板２１が白色光源１と偏光ビームスプリッタ２２との間に設けられており、白色光源１から出射して光強度が一次元方向に略正弦波状に変化する一次元格子模様（縞模様）の照明光が一次元格子３を通過して出射するようになっている。また、一次元格子３における照明光が入射する側の面、即ち、光源側の面においては、照明光の反射が認められる。

格子照明顕微鏡装置Ｍを構成する格子部材として一次元格子３を用いているが、これにより装置構成が最も簡単となり、三次元観察が最も容易となる。なお、本実施例の一次元格子３の透過率分布は下記の式(2)で表される。ここで、式(2)において、k：格子の波数，x：格子上の位置である。式(2)に示すように、本実施例の透過率分布は、２乗することによって正弦波状の透過率分布を表すように設定されている。

また、一次元格子３は、圧電素子４によって支持されている。この圧電素子４は、制御用コンピュータ１３からの制御信号を受ける圧電素子ドライバ５により作動されて僅かに伸縮し、これにより一次元格子３を矢印Ａ方向に移動させることを可能としている。

一次元格子３から出射したＰ偏光たる照明光は、照明レンズ６を透過し、例えば水晶、方解石、雲母、ホタル石等の複屈折材料からなるλ／４板２３に入射して円偏光とされて出射し、ミラー７により反射され、対物レンズ８を透過して標本台１０の上面に向けて照射されるようになっている。標本台１０の上面には標本載置面１０ａが形成されており、標本載置面１０ａに標本が載置される。なお、標本台１０は、標本台移動機構１４により図示上下方向、即ち光軸方向に移動可能に構成されている。

このように、白色光源１から照射される照明光を、コリメートレンズ２、偏光板２１、偏光ビームスプリッタ２２、照明レンズ６、λ／４板２３、ミラー７、および対物レンズ８を介して標本に向けて照明する照明光学系において、照明レンズ６及び対物レンズ８は一次元格子３と標本載置面１０ａとが共役関係になるように配置されており、標本台１０の標本載置面１０ａに一次元格子３の格子像が生成される。このようにして標本載置面１０ａに載置された標本には、式(2)で表されるように一次元的に略正弦波状に変化する強度分布を有する照明光による照明がなされることとなる。

一次元格子模様の照明を受けた標本からは反射光（以下、観察光と称する）が出射しており、この観察光を受けて標本の像を結像光学系によって結像する。観察光は、その光路を照明光学系における照明光の光路と共有しており、対物レンズ８を透過し、ミラー７により反射され、λ／４板２３に円偏光として入射する。ここで、λ／４板２３に入射した観察光は紙面に垂直な電場方向を持つ直線偏光（Ｓ偏光）とされて出射し、照明レンズ６を透過し、一次元格子３を照明するようになっている。

このようにして結像光学系は、標本から一次元格子３に至るまでの照明光学系の構成を共有し、照明レンズ６及び対物レンズ８は一次元格子３と標本載置面１０ａとが共役関係となるように設定していることから、一次元格子３において結像可能な観察光は標本中における焦点位置から反射する光のみであり、このような観察光のみが格子を通過できるようになっている。換言すると、標本中における焦点位置以外の部分から反射する光は、一次元格子３で結像できず、一次元格子３を通過することができないようになっている。

一次元格子３を通過した観察光は、白色光源１から出射してから２度一次元格子３を通過したこととなり、式(2)で表される透過率分布を２乗することにより求められる強度分布、即ち、正弦波状の強度分布を有して偏光ビームスプリッタ２２に入射する。

照明光が一次元格子３に入射する際に一次元格子３の光源側の面における照明光の反射が認められるため、一次元格子３の側から偏光ビームスプリッタ２２に入射する光は、一次元格子３を通過した標本からの観察光と、一次元格子３の光源側の面からの反射光とが混入した状態となっている。ここで、偏光ビームスプリッタ２２は、Ｓ偏光に対しての反射率を高く設定して構成されていることから、偏光ビームスプリッタ２２を反射する光は、λ／４板２３を通してＳ偏光とされた標本からの観察光が支配的となる。このようにして、強度分布が式(2)で表される透過率分布の２乗で表されて標本中において焦点位置から反射する光のみが偏光ビームスプリッタ２２により反射される。また、この反射により観察光の光路は、照明光との共有光路から分離されることとなる。光路が分離された観察光は、リレーレンズ１１を透過し、ＣＣＤカメラ１２に入射する。結像光学系において、リレーレンズ１１に対する一次元格子３の位置とＣＣＤカメラ１２の位置とは共役な関係に設定されており、ＣＣＤカメラ１２には一次元格子３を通過した観察光が結像し、標本の像が結像するようになっている。

このように、一次元格子模様の照明光で照明された標本からの観察光を、対物レンズ８、λ／４板２３、一次元格子３、偏光ビームスプリッタ２２、リレーレンズ１１を有してなる結像光学系を通して集光してＣＣＤカメラ１２に入射させ、ＣＣＤカメラ１２に結像した標本の像を撮影し、その信号を制御用コンピュータ１３に取り込み記憶しておく。

次に、制御用コンピュータ１３から圧電素子ドライバ５に制御信号を出力し、圧電素子ドライバ５により圧電素子４を僅かに伸縮させ、この圧電素子４に繋がる一次元格子３を格子並び方向（矢印Ａ方向）に移動させる。このとき圧電素子４の伸縮長さを、一次元格子３の格子ピッチの１／３となるようにしておく。すると、標本載置面１０ａ上の標本に照明される格子模様（縞模様）はその位相が１／３だけずれた模様となる。そして、このときの標本像を上記同様にＣＣＤカメラ１２により撮像しておく。

さらに、同様にして圧電素子４により、一次元格子３を格子ピッチの２／３だけ移動させて標本を照明し、このときの標本像もＣＣＤカメラ１２により撮像しておく。

以上のようにして撮像されたときの各画像を、上記式(1)におけるI₁，I₂，I₃として式(1)によりI_pを計算すれば、標本中において合焦する高さにおける画像のみを得ることができる。そして、標本台移動機構１４による移動情報を制御用コンピュータ１３に入力させ、移動情報と上述のようにして得られた画像とを組み合わせて画像処理することにより、標本載置面１０ａの上に載置された標本の三次元画像を得ることができる。

このように、本発明に係る格子照明顕微鏡装置Ｍによれば、結像光学系において、観察光の光路を照明光の光路と共有させ、照明レンズ６及び対物レンズ８は一次元格子３と標本台１０の位置とが共役関係となるように配置されているため、標本の像がいったん一次元格子３に結像することとなるが、標本中における一次元格子模様が結像する位置以外、即ち標本中における焦点位置以外の部分から出射する観察光は一次元格子３において焦点が結ばれず、一次元格子３をほとんど通過できないようになっている。従って、一次元格子３を通過してＣＣＤカメラ１２に結像する観察光は、バックグラウンドがほとんど排除され、所望の焦点位置から出射される光で占められることとなる。これにより、式(1)のI₁，I₂，I₃の信号コントラストを高めることができ、良好な画質の顕微鏡画像を得ることができる。

また、本実施例の格子照明顕微鏡装置Ｍによれば、白色光源１から出射した光を２度一次元格子３に通過させるために、照明光学系における照明光の光路と、結像光学系における観察光の光路とを、標本台１０から一次元格子３に至って共有光路として構成しているが、偏光ビームスプリッタ２２を白色光源１と一次元格子３との間に設けることによって観察光の光路をこの共有光路から分離させることができ、ＣＣＤカメラ１２により観察光を受けて標本の像の撮影を行うとする装置の構成を簡易に行うことができる。

また、本実施例においては、一次元格子３の透過率分布を２乗することにより正弦波状の強度分布を示すように設定している。このため、一次元格子３を２度透過させることにより２次成分がＣＣＤカメラ１２に到達する本実施例において、ＣＣＤカメラ１２に到達する標本の像の強度分布は、式(2)で表される透過率分布の２乗、即ち従来と同様の正弦波状の強度分布となる。従って、一次元格子３を２度通過させる構成の装置であっても、制御コンピュータ１３における信号処理内容を複雑化させる必要なく装置を構成できる。

また、本発明に係る格子照明顕微鏡装置Ｍによれば、一次元格子３の正逆両面から透過させるように構成しており、一次元格子の光源側の面からの反射光と、標本からの観察光とが混入した状態で、半透過鏡である偏光ビームスプリッタ２２に入射するようになっている。ここで、本実施例においては、照明レンズの位置における観察光をＳ偏光とすべく、偏光板２１およびλ／４板２３を配設しているとともに、偏光ビームスプリッタ２２をＳ偏光の反射率を高く設定して構成している。このため、混入した状態の光のうち、Ｓ偏光とされた標本からの観察光を支配的としてＣＣＤカメラ１２方向に反射させ、一次元格子３の光源側の面からの反射光がＣＣＤカメラ１２に結像することを抑制することができる。

以上、本発明の実施例について説明したが、適宜その構成を変更しても本発明を実施することができる。上記実施例においては、照明光をＰ偏光として偏光ビームスプリッタ２２に入射させるべく白色光源１と偏光ビームスプリッタ２２との間に偏光板２１を設けて構成したが、白色光源１がＰ偏光を持つ照明光を出射するように構成してもよい。

また、観察光をＳ偏光とするために設けられるλ／４板２３を上記のような複屈折材料からなるものとしたが、必ずしもこのようなものに限らず、観察光をＳ偏光として偏光ビームスプリッタ２２に入射できればよく、また、照明光として白色光が用いられることから波長依存性が少ないことが好ましいと言え、例えば、色消し波長板、フレネルロム波長板等を用いて構成しても同様に実施可能であり、同様の効果を得ることができる。

また、偏光ビームスプリッタ２２をＰ偏光に対する透過率を高く設定し且つＳ偏光に対する反射率を高く設定して構成し、照明光をＰ偏光として入射させ、観察光をＳ偏光として入射させるように構成したが、偏光ビームスプリッタ２２をＳ偏光に対する透過率を高く設定し且つＰ偏光に対する反射率を高く設定して構成し、照明光をＳ偏光として入射させ、観察光をＰ偏光として入射させるように構成してもよい。

なお、上記実施例においては、偏光板２１およびλ／４板２３の偏光光学素子を用いて一次元格子３の光源側の面からの反射光のＣＣＤカメラ１２への結像を防いだが、偏光ビームスプリッタ２２を通常のハーフミラーとし、偏光板２１およびλ／４板２３を省略し、一次元格子３の少なくとも光源側の面を照明光の波長に対して黒色とすることによっても、一次元格子３の当該面における照明光の反射が抑制され、同様の効果を得ることができる。ここで、一次元格子３を黒色とする手段としては、例えば、黒色塗料の塗布、黒色Ｃｒメッキ処理、アルミニウムのアルマイト処理等、様々な手段が挙げられる。なお、上記実施例のように、偏光板２１、偏光ビームスプリッタ２２、およびλ／４板２３を用いて構成したうえで、一次元格子３の光源側の面を黒色とする処理を施すことにより、一次元格子３の光源側の面からの反射光のＣＣＤカメラ１２への結像をより効果的に抑制できるようになる。

なお、本発明に係る上記各構成形態においては、照明光が透過する格子と、反射光が透過する格子とを同一の格子部材を用いることによって格子照明顕微鏡装置Ｍを構成しているが、図２に示すような従来の格子照明顕微鏡装置Ｍ´において、ハーフミラー５７とリレーレンズ６１との間における光路中Ｂに格子５３と同一の透過率分布を持つ格子を設けることにより、標本中における焦点位置以外の部分からの反射光をＣＣＤカメラ６２に結像させることを防ぐことも可能である。ただし、上記形態のように同一の格子部材を用いる構成とするほうが、装置を簡易に構成することができる。

本発明に係る格子照明顕微鏡装置の構成を説明する概略図である。 従来の格子照明顕微鏡装置の構成を説明する概略図である。

符号の説明

Ｍ，Ｍ´ 格子照明顕微鏡装置
１ 白色光源（照明光源）
３ 一次元格子（格子部材）
６ 照明レンズ（照明レンズ群）
８ 対物レンズ（照明レンズ群）
１１ リレーレンズ（結像レンズ群）
１２ ＣＣＤカメラ（撮像素子）
２１ 偏光板
２２ 偏光ビームスプリッタ（半透過鏡）
２３ λ／４板

Claims (8)

1. 照明光を出射する照明光源と、
   標本を載置するための標本台と、
   所定の透過率分布を有し、該透過率分布に対応した強度分布を有する格子模様の透過光を出射する格子部材及び前記標本台上の標本に前記格子模様の照明を行う照明レンズ群を含み、該照明レンズ群は前記格子部材と前記標本とが共役関係になるように配置されている照明光学系と、
   前記照明光学系のうちの前記標本から前記格子部材に至るまでの構成を共通して含み、前記標本から出射される観察光を受けて標本像を結像する結像光学系と、
   前記標本像を撮影する撮像素子とを備えたことを特徴とする格子照明顕微鏡装置。
2. 前記照明光源と前記格子部材との間に半透過鏡が配置されており、
   前記照明光は前記半透過鏡を透過して前記格子部材に入射し、
   前記観察光は前記格子部材を通過した後、前記半透過鏡で反射することにより前記撮像素子に入射することを特徴とする請求項１記載の格子照明顕微鏡装置。
3. 前記所定の透過率分布は、前記格子部材を透過した光が再度前記格子部材を透過したとき、その光の強度分布が正弦波状の分布となるように設定されていることを特徴とする請求項１又は２記載の格子照明顕微鏡装置。
4. 前記格子部材における少なくとも前記照明光が入射する側の面が、前記照明光に対して黒色であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の格子照明顕微鏡装置。
5. 前記照明光学系において前記照明光はＰまたはＳのいずれか一方の偏光とされて前記半透過鏡に入射し、
   前記結像光学系において前記観察光は他方の偏光とされて前記半透過鏡に入射するように構成され、
   前記半透過鏡が前記一方の偏光に対する透過率を高く設定し且つ前記他方の偏光に対する反射率を高く設定して構成された偏光ビームスプリッタであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の格子照明顕微鏡装置。
6. 前記標本から前記格子部材に至るまでの構成中にλ／４板を備えていることを特徴とする請求項５記載の格子照明顕微鏡装置。
7. 前記λ／４板が複屈折材料からなることを特徴とする請求項６記載の格子照明顕微鏡装置。
8. 前記λ／４板がフレネルロム波長板であることを特徴とする請求項６記載の格子照明顕微鏡装置。
   

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