JP2006058280A - Assay chip - Google Patents
Assay chip Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006058280A JP2006058280A JP2005071398A JP2005071398A JP2006058280A JP 2006058280 A JP2006058280 A JP 2006058280A JP 2005071398 A JP2005071398 A JP 2005071398A JP 2005071398 A JP2005071398 A JP 2005071398A JP 2006058280 A JP2006058280 A JP 2006058280A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pretreatment
- specimen
- analysis
- analysis chip
- layer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
Description
本発明は、血液、尿、体液、組織、細胞、食物、廃液、池水、河川水、海水、又は雨水などの検体中に含まれる一つ以上の成分を分析するための、一体化された分析チップ及び測定方法に関する。 The present invention provides an integrated analysis for analyzing one or more components contained in a sample such as blood, urine, body fluid, tissue, cell, food, waste liquid, pond water, river water, sea water, or rainwater. The present invention relates to a chip and a measuring method.
血液、尿等を検体として人の病気を診断する方法は、人体を損ねることなく簡便に診断できる方法として、従来から長く行われてきている。 A method for diagnosing a human disease using blood, urine or the like as a specimen has long been performed as a method that can be easily diagnosed without damaging the human body.
この方法の一つとして、ウェットケミストリー分析法がある。ウェットケミストリー分析法は、いわゆる溶液試薬を用いる方法であって、歴史も古く、多数の検査項目について検出試薬が開発されており、測定機も簡易小型機から大型全自動機まで各種のものがある。ウェットケミストリーに使用される検体は、血漿、血清、尿等であって、通常全血をそのまま検体として使用することはない。 One of the methods is a wet chemistry analysis method. Wet chemistry analysis is a method that uses so-called solution reagents, and has a long history, detection reagents have been developed for many test items, and there are various measuring instruments ranging from simple small machines to large fully automatic machines. . Specimens used for wet chemistry are plasma, serum, urine, etc., and whole blood is usually not used as it is.
ウェットケミストリー分析法では、保存期間中は試薬の安定性を考慮していくつかの群に分けておき、溶解、調製時に混合することもできるし、試薬添加の手順をいくつかのステップに分けることも可能である。更に、測定検体の数に応じて、適量の試薬を溶解、調製しておくことができるので、１回の測定当りの試薬コストも少なくて済む。ウェットケミストリー分析法では、多数の溶液の取扱を組み合わせて自動化することは複雑で厄介ではあるが、臨床検査機器の開発は歴史もあり、社会的な要請も高かったため、既に大・中・小いずれの処理能力を必要とする分野についても、効率良い自動機器が開発、実用化されている。しかしながら、ウェットケミストリー分析法では、開業医や、即時に診断結果を得ることが求められる救急病院などのニーズを満たせないことが多かった。 Wet chemistry analysis method is divided into several groups in consideration of the stability of the reagent during the storage period, and can be mixed at the time of dissolution and preparation, and the reagent addition procedure is divided into several steps. Is also possible. Furthermore, since an appropriate amount of reagent can be dissolved and prepared according to the number of samples to be measured, the reagent cost per measurement can be reduced. In wet chemistry analysis, it is complicated and cumbersome to automate the handling of a large number of solutions. However, the development of clinical laboratory equipment has a long history and high social demands. Efficient automatic equipment has also been developed and put to practical use in fields that require a high processing capacity. However, wet chemistry analysis methods often failed to meet the needs of medical practitioners and emergency hospitals that required immediate diagnosis.
また、近年、高齢化社会への急速な移行、高度治療の発達などを背景とした医療費の高騰への対応として、在宅ケアが提唱され、今後の医療制度の一つの核となるものとして実施の具体的方法が検討されている。 In recent years, home care has been advocated as a core of the future medical system in response to the rapid transition to an aging society and the rise in medical costs against the background of advanced treatment. A specific method is being studied.
在宅ケアの基本は、患者は各家庭に居ながらにして常に医師による適切な監視、指導、管理下にあり、必要に応じて適切な治療ができる点にある。例えば慢性患者や高齢者の場合には、急激な病態変化がなければ安定した生理的状態にあり、一定の治療を続けて、その治療効果を継続的に監視し続けていることが最も大切なこととなる。 The basic of home care is that the patient is always under proper monitoring, guidance, and management by a doctor while at home, and can be treated appropriately as needed. For example, in the case of chronic patients and the elderly, it is most important that the patient is in a stable physiological state if there is no sudden pathological change, and that the treatment is continuously monitored and the treatment effect is continuously monitored. It will be.
このような継続的な監視は、入院患者については容易であるけれども、各家庭に患者が分散した状態では実際上は極めて難しく、通常は体温、体重の測定の他は看護人による症状の監察記録、患者本人の痛みなどの訴えなど主観的な情報に止っている。 Although such continuous monitoring is easy for hospitalized patients, it is extremely difficult in practice when the patients are dispersed in each household, and usually records the monitoring of symptoms by nurses in addition to measuring body temperature and weight. It is only subjective information such as complaints about the patient's pain.
もし、血液検査情報が継続的に得られるならば、医師の日常管理も容易になり、治療もより迅速で、かつ適切なものとなるので、その利益は測り知れない。また、患者にとってみても、日常の病態が医師に報告され看られているという安心感は大きく、回復までの精神的サポートとなることは容易に理解される。 If blood test information can be obtained continuously, the daily management of the doctor will be easier, and the treatment will be faster and more appropriate, so the benefits are immeasurable. From the patient's perspective, it is easy to understand that everyday feelings are reported to and seen by doctors and that they provide mental support until recovery.
さらに、医師や看護婦自身が患者のところに出向くことなくその指示に従って患者の血液検査が自宅で実施できれば、より迅速で、かつ適切な治療が可能となる。このことは往診に要する時間を考えれば全ての家庭に通ずることであるが、特に交通の不便なところや、遠隔地、離島、未開発地では医療に対して大きな進歩、利益をもたらすものである。
また他にも、例えば、糖尿病の病院外来患者の場合、日常生活の中で幾度か血糖値を測定し、その結果を通院の際持参することができれば、治療に当たる医師が患者の状態をより正確に把握することができる。糖尿病患者用の血糖値測定装置としては、半定量のできる程度の装置が開発されており、家庭にも置けるようなものもあるが、精度が低いので上記の目的には合わない。
Furthermore, if a doctor or a nurse himself can perform a blood test on a patient at home according to the instructions without going to the patient, more prompt and appropriate treatment can be performed. This means that all homes can be taken into consideration in terms of the time required for home visits, but it will bring great progress and benefits to medical care, especially in inconvenient places, remote areas, remote islands, and undeveloped areas. .
In addition, for example, in the case of diabetic hospital outpatients, if the blood glucose level is measured several times in daily life and the results can be brought to the hospital during the visit, the treating doctor can more accurately determine the patient's condition. Can grasp. As a blood glucose level measurement device for diabetic patients, a device capable of semi-quantitative development has been developed and some devices can be placed at home. However, since the accuracy is low, the device does not meet the above purpose.
前述したような、在宅ケアシステムには、（１）小型で（２）簡便に（３）微量の血液を用いて（４）多項目を（５）迅速に（６）精度よく測定できる血液分析方法が望ましいのはいうまでもない。特に、高齢者（場合によっては小児）を対象とする場合、微量の血液の採取ですむ分析方法の開発が望まれている。 The home care system as described above includes (1) a small size, (2) simple, (3) a small amount of blood, (4) a large number of items, (5) a rapid (6) accurate blood analysis. It goes without saying that a method is desirable. In particular, in the case of targeting elderly people (sometimes children), it is desired to develop an analytical method that requires collection of a small amount of blood.
これに対して、ウェットケミストリー分析法を用いた一体型の家庭用分析装置が提案されており、血液を採取する手段と、血液からろ過して血漿を得るろ過する手段と、血液を分離して血清を得る分離する手段と、血液成分中のｐＨ値、酸素濃度、二酸化炭素濃度、ナトリウム濃度、カリウム濃度、カルシウム濃度、グルコース濃度、乳酸濃度を分析する手段を小型一体にまとめたヘルスケアデバイスが開示されている（特許文献１）。しかしながら、簡便さの点でも大きさの点でも満足できるものではなかった。 On the other hand, an integrated household analyzer using wet chemistry analysis method has been proposed, and means for collecting blood, means for filtering from blood to obtain plasma, and separating blood A health care device that combines the means for separating serum and the means for analyzing the pH value, oxygen concentration, carbon dioxide concentration, sodium concentration, potassium concentration, calcium concentration, glucose concentration, and lactic acid concentration in blood components in one small unit. (Patent Document 1). However, it was not satisfactory in terms of simplicity and size.
他方、特定成分の検出に必要な試薬類が乾燥状態で含有されているいわゆるドライケミストリー分析法も開発されている。ドライケミストリー分析法では、定性・定量分析に必要な全ての試薬は、試薬紙、使い捨て電極および磁性体のような分析要素（乾式分析要素）の中に組み込まれている。基本的には、１検体１項目の測定ができる使い捨て型であり、比較的微量の血液（約１０μｌ）で、簡便に迅速に血液分析を行うことを可能としている。ドライケミストリー分析法を用いた分析装置（ドライケミストリー分析装置）は多数開発・商品化されており、富士ドライケム（富士写真フイルム(株)製）、エクタケム（米国、イーストマンコダック社製）、ドライラボ（コニカ(株)製）、スポットケム（京都第一化学(株)製）、レフロトロン（独国、ベーリンガーマンハイム社製）、セラライザー（米国、マイルズラボラトリー社製）等が市販されている。 On the other hand, a so-called dry chemistry analysis method in which reagents necessary for detection of a specific component are contained in a dry state has been developed. In the dry chemistry analysis method, all reagents necessary for qualitative / quantitative analysis are incorporated in analysis elements (dry analysis elements) such as reagent paper, disposable electrodes, and magnetic materials. Basically, it is a single-use type capable of measuring one item per sample, and can perform blood analysis simply and quickly with a relatively small amount of blood (about 10 μl). Numerous analyzers (dry chemistry analyzers) using dry chemistry analysis methods have been developed and commercialized. Fuji Dry Chem (Fuji Photo Film Co., Ltd.), Ekta Chem (Eastman Kodak, USA), Dry Lab ( Konica Co., Ltd.), Spotchem (Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd.), Lefrotron (Germany, Boehringer Mannheim), Cellarizer (USA, Miles Laboratory, Inc.) and the like are commercially available.
このように、ドライケミストリー分析法は、小型で、迅速かつ簡便に検体中の成分を分析するという観点からは、従来のウェットケミストリー分析法より優れており、一定の成果をあげることに成功したが、幾つかの問題点もあった。 As described above, the dry chemistry analysis method is superior to the conventional wet chemistry analysis method from the viewpoint of small size, quick and simple analysis of the components in the sample, and has succeeded in achieving certain results. There were also some problems.
例えば、検体が全血であり、分析対象となる成分（被験成分）が血清中に含まれる成分、例えば乳酸デヒドロゲナーゼである場合、乳酸デヒドロゲナーゼを分析するための多層乾式分析要素が、特許文献２、特許文献３に開示されている。このとき該多層乾式分析要素に検体を直接供与するのではなく、事前に前処理（全血より血球成分を除去する処理）が必須となる。 For example, when the sample is whole blood and the component to be analyzed (test component) is a component contained in serum, such as lactate dehydrogenase, a multilayer dry analytical element for analyzing lactate dehydrogenase is disclosed in Patent Document 2, This is disclosed in Patent Document 3. At this time, a pretreatment (a treatment for removing blood cell components from whole blood) is indispensable instead of directly supplying the specimen to the multilayer dry analysis element.
このように、通常、検体が血液である場合、通常は全血を使用することはなく、血球成分を除去した後、ドライケミストリー分析法を使用して血漿または、血清の形で測定する。
血球成分を除去する方法として、遠心力やフィルターを使う方法があり、これらの方法を利用した多数の血球分離装置が開発されている。微量の血球分離装置は、例えば特許文献４、特許文献５に開示されている。
しかしながら、このように血球分離装置を必要とすることにより、装置を操作する作業が追加され、簡便性の低下を招き、さらに必要な血液量が増大してしまうという望ましくない状況が引き起こされている。
Thus, usually, when the specimen is blood, whole blood is not usually used, and after removing blood cell components, measurement is performed in the form of plasma or serum using dry chemistry analysis.
As a method for removing blood cell components, there are methods using centrifugal force and filters, and many blood cell separators using these methods have been developed. For example, Patent Document 4 and Patent Document 5 disclose a very small amount of blood cell separation device.
However, the necessity of the blood cell separation device in this way adds to the operation of the device, which leads to an undesired situation in which the convenience is reduced and the necessary blood volume increases. .
遠心分離装置と、乾式分析要素としてドライケミストリー分析法に用いる試薬をフィル
ム化した分析用多層フィルム（以下、この形態も含めて多層乾式分析要素と言う。）とを組み合わせることにより、事実上血球分離操作が不用となり、かつ多項目を同時に測定できるドライケミストリー分析装置を作ることができる。例えば、特許文献６および７には、多層乾式分析要素と流路が一体化された分析カートリッジが開示されている。この技術では、該カートリッジと遠心分離装置を組合せることにより、外部力により流路内で血球分離を行う。
しかしながら、これらの技術においても、必要となる血液の量を充分に少なくすることができず、迅速性の点でも満足できるものではなかった。
Separation of blood cells in effect by combining a centrifuge and a multilayer film for analysis in which a reagent used in dry chemistry analysis is formed as a dry analysis element (hereinafter referred to as a multilayer dry analysis element). It is possible to make a dry chemistry analyzer that does not require operation and can measure many items simultaneously. For example, Patent Documents 6 and 7 disclose an analysis cartridge in which a multilayer dry analysis element and a flow path are integrated. In this technique, blood cells are separated in the flow path by an external force by combining the cartridge and the centrifugal separator.
However, even in these techniques, the amount of blood required is not sufficiently reduced, and the speed is not satisfactory.
また、例えば、検体が全血であり、分析対象となる成分が、ヘモグロビンＡ１Ｃ等の様に、血球中に存在する成分を分析する場合は、血清中成分を測定する場合とは異なり、血球を破壊する必要がある。ヘモグロビンＡ１Ｃを分析するための多層乾式分析要素は、特許文献８に開示されている。このとき、該乾式分析要素に検体を直接供与するのではなく、事前に前処理（血球を破壊する操作）が必要となる。 In addition, for example, when the sample is whole blood, and the component to be analyzed is a component present in blood cells, such as hemoglobin A1C, the blood cells are different from the case of measuring serum components. It needs to be destroyed. A multilayer dry analytical element for analyzing hemoglobin A1C is disclosed in Patent Document 8. At this time, pretreatment (operation for destroying blood cells) is required in advance, instead of directly supplying the specimen to the dry analytical element.
さらにまた、例えば、いわゆる抗原抗体反応を用いるイムノアッセイにおいては、抗原抗体反応を速やかに進行させる目的から、検体（主に血漿）を希釈する必要がしばしばある。多層乾式免疫分析要素としては特許文献９〜１１に記載の方法があるが、これらの多層乾式免疫分析要素には検体を直接供与するのではなく、予め希釈する必要がしばしばある。 Furthermore, for example, in an immunoassay using a so-called antigen-antibody reaction, it is often necessary to dilute a specimen (mainly plasma) for the purpose of promptly proceeding with the antigen-antibody reaction. As the multilayer dry immunoassay element, there are methods described in Patent Documents 9 to 11, but these multilayer dry immunoassay elements often need to be diluted in advance instead of directly supplying a specimen.
また、例えば、糖化タンパク質（例えばグリコアルブミン、ヘモグロビンＡ１Ｃ等）のように、被分析物質が高分子量の物質である場合、あらかじめタンパク質分解酵素で分解処理したのち、分解生成物中の成分を分析することがある。 Further, for example, when the analyte is a high molecular weight substance such as glycated protein (for example, glycoalbumin, hemoglobin A1C, etc.), the components in the degradation product are analyzed after degradation with a proteolytic enzyme in advance. Sometimes.
上述したように、検体を乾式分析要素に供与する前に、何らかの前処理を必要とすることが多かった。このような前処理は測定操作を煩雑にし、測定精度を低下させるだけではなく、測定者が検体により汚染される可能性が高くなるという望ましくない状況を引き起こすことが多かった。 As mentioned above, some pre-treatment was often required before the specimen was provided to the dry analytical element. Such pre-processing not only complicates the measurement operation and lowers the measurement accuracy, but often causes an undesirable situation in which the measurer is likely to be contaminated by the specimen.
一方、近年微細加工技術を利用した微細加工チップが多数提案されてきている。例えば特許文献１２には、プラットフォームの回転から生じる向心力を利用して液搬送を行うシステムが開示されている。しかし、マイクロ流体系においては、搬送される流体が層流を形成するため検体と検出試薬の混合が困難であるという大きな欠点があった。
本発明の目的は、検体を採取した現場で、迅速かつ簡便に精度の高い分析データの取得
を可能とする分析チップを提供することである。本発明の別の目的は、分析者が採取した検体の前処理を実質的に行うことなく、検体により汚染される可能性が少なく安全に測定することが可能な分析チップを提供することである。
また本発明のもう一つ別の目的は、在宅ケアに用いることのできるような分析チップ（例えば血液分析チップ）、つまり測定装置を精度を落とさずに小型化し、微量の検体より、多種類の分析項目を迅速にかつ簡便に測定しうる分析チップを提供することにある。
An object of the present invention is to provide an analysis chip that enables quick and simple acquisition of highly accurate analysis data at a site where a sample is collected. Another object of the present invention is to provide an analysis chip that can be safely measured with little possibility of being contaminated by a sample without substantially pre-processing the sample collected by an analyst. .
Another object of the present invention is to reduce the size of an analysis chip (for example, a blood analysis chip) that can be used for home care, that is, a measurement device without degrading accuracy. An object of the present invention is to provide an analysis chip capable of measuring analysis items quickly and easily.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、検体の前処理要素（例えば、血球を分離する要素、溶血要素、希釈要素など）と多層乾式分析要素とを直接又は流路を介して連結して一体化することにより、上記課題を解決した分析チップを提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have directly or directly connected a specimen pretreatment element (for example, an element for separating blood cells, a hemolysis element, a dilution element, etc.) and a multilayer dry analysis element. It has been found that an analysis chip that solves the above-mentioned problems can be provided by connecting and integrating via a lead, and the present invention has been completed.
すなわち本発明によれば、以下の構成の分析チップ、分析方法が提供される。
＜１＞ 検体中の一つ以上の成分を分析するための一体化された分析チップであって、
少なくとも
（１）検体の前処理をする一つ以上の前処理要素、
（２）前処理後の検体中の一つ以上の成分を分析する、一つ以上の多層乾式分析要素、及び
（３）前記前処理要素と前記多層乾式分析要素とをつなぐ一つ以上の流路を含むことを特徴とする分析チップ。
＜２＞ 検体中の一つ以上の成分を分析するための一体化された分析チップであって、
少なくとも
（１）検体の前処理をする一つ以上の前処理要素、及び
（２）前処理後の検体中の一つ以上の成分を分析する、一つ以上の多層乾式分析要素を含み、前記前処理要素と前記多層乾式分析要素とが分析チップ内で連結している、分析チップ。
＜３＞ 前処理が、血球分離、溶血、検体の希釈、タンパク質の分解、タンパク質の変性、内因性物質の除去、及び抗原抗体反応から選ばれる少なくとも一つである、＜１＞又は＜２＞に記載の分析チップ。
＜４＞ 前処理要素が、血球分離要素であり、かつ該要素が、等価直径５μｍ以下でかつ長さが等価直径と等しいか或いはそれより長い非水溶性物質、または多孔質体を含有する、＜１＞又は＜２＞に記載の分析チップ。
＜５＞ 前処理要素が、血球分離要素であり、かつ該要素が、ガラス繊維またはガラス繊維濾紙のいずれかを含有する、＜１＞又は＜２＞に記載の分析チップ。
＜６＞ 前処理要素が、血球分離要素であり、かつ該要素が、ガラス繊維濾紙および微多孔性膜を含有する血液濾過ユニットを含む、＜１＞又は＜２＞に記載の分析チップ。
＜７＞ 血球分離要素が、遠心力を利用する要素である、＜４＞〜＜６＞のいずれかに記載の分析チップ。
＜８＞ 流路が、等価直径３ｍｍ以下のマイクロ流路である、＜１＞および＜３＞〜＜７＞のいずれかに記載の分析チップ。
＜９＞ 前処理要素、多層乾式分析要素、及び流路の３要素、または
前処理要素及び多層乾式分析要素の２要素
が、一つのカートリッジに含有されて一体化された、＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の分析チップ。
＜１０＞ 前処理要素、及び流路のいずれかまたは両方が、微細加工技術を用いて基板の上またはその中に作られており、多層乾式分析要素が流路に接合されて一体化された、＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の分析チップ。
＜１１＞ 検体を、＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の分析チップに含まれる、前処理要素、及び多層乾式分析要素の順に通過させる工程を含む、検体の分析方法。
That is, according to the present invention, an analysis chip and an analysis method having the following configurations are provided.
<1> An integrated analysis chip for analyzing one or more components in a specimen,
At least (1) one or more pretreatment elements for pretreatment of the specimen,
(2) one or more multi-layer dry analytical elements for analyzing one or more components in the sample after pre-treatment; and (3) one or more streams connecting the pre-treatment elements and the multi-layer dry analytical elements. An analysis chip comprising a road.
<2> An integrated analysis chip for analyzing one or more components in a specimen,
At least (1) one or more pretreatment elements for pretreatment of the specimen, and (2) one or more multilayer dry analysis elements for analyzing one or more components in the specimen after the pretreatment, An analysis chip in which a pretreatment element and the multilayer dry analysis element are connected in an analysis chip.
<3> The pretreatment is at least one selected from blood cell separation, hemolysis, sample dilution, protein degradation, protein denaturation, endogenous substance removal, and antigen-antibody reaction, <1> or <2> Analysis chip as described in.
<4> The pretreatment element is a blood cell separation element, and the element contains a water-insoluble substance or a porous body having an equivalent diameter of 5 μm or less and a length equal to or longer than the equivalent diameter. The analysis chip according to <1> or <2>.
<5> The analysis chip according to <1> or <2>, wherein the pretreatment element is a blood cell separation element, and the element contains either glass fiber or glass fiber filter paper.
<6> The analysis chip according to <1> or <2>, wherein the pretreatment element is a blood cell separation element, and the element includes a blood filtration unit containing glass fiber filter paper and a microporous membrane.
<7> The analysis chip according to any one of <4> to <6>, wherein the blood cell separation element is an element using centrifugal force.
<8> The analysis chip according to any one of <1> and <3> to <7>, wherein the channel is a microchannel having an equivalent diameter of 3 mm or less.
<9> Three elements of the pretreatment element, the multilayer dry analysis element, and the flow path, or two elements of the pretreatment element and the multilayer dry analysis element are contained in one cartridge and integrated, <1> to <1. The analysis chip according to any one of 8>.
<10> Either or both of the pretreatment element and the flow path are made on or in the substrate using a microfabrication technique, and the multilayer dry analytical element is joined to the flow path and integrated. <1>-<8> The analysis chip according to any one of <8>.
<11> A method for analyzing a sample, comprising a step of passing a sample in the order of a pretreatment element and a multilayer dry analysis element contained in the analysis chip according to any one of <1> to <10>.
本発明の分析チップによれば、微量の検体を用いて、該検体を実質的に前処理する操作を行うことなく、迅速、簡便かつ精度良く検体中の成分を分析することが可能である。
本発明によれば、煩雑な前処理操作を必要としない分析チップが提供される。
According to the analysis chip of the present invention, it is possible to analyze a component in a sample quickly, simply and with high accuracy without performing an operation of substantially pretreating the sample using a very small amount of sample.
According to the present invention, an analysis chip that does not require a complicated pretreatment operation is provided.
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
［一体化された分析チップ］
本発明は、検体中の一つ以上の成分を分析するための一体化された分析チップに関するものである。
第一の態様によれば、本発明の分析チップは、少なくとも（１）検体の前処理をする一つ以上の前処理要素、（２）前処理後の検体中の一つ以上の成分を分析する、一つ以上の多層乾式分析要素、及び（３）前記前処理要素と前記多層乾式分析要素とをつなぐ一つ以上の流路を含む。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
[Integrated analysis chip]
The present invention relates to an integrated analysis chip for analyzing one or more components in a specimen.
According to the first aspect, the analysis chip of the present invention analyzes at least (1) one or more pretreatment elements for pretreatment of the specimen, and (2) one or more components in the specimen after the pretreatment. One or more multi-layer dry analytical elements, and (3) one or more flow paths connecting the pretreatment element and the multi-layer dry analytical element.
第二の態様によれば、本発明の分析チップは、少なくとも（１）検体の前処理をする一つ以上の前処理要素、及び（２）前処理後の検体中の一つ以上の成分を分析する、一つ以上の多層乾式分析要素を含み、前記前処理要素と前記多層乾式分析要素とが分析チップ内で連結している。 According to the second aspect, the analysis chip of the present invention comprises at least (1) one or more pretreatment elements for pretreatment of the specimen, and (2) one or more components in the specimen after the pretreatment. One or more multilayer dry analytical elements to be analyzed are included, and the pretreatment element and the multilayer dry analytical element are connected in an analysis chip.
本発明の分析チップの別の態様として、全血中の成分を分析する場合には、（１）検体の前処理をする一つ以上の前処理要素、（２）前処理後の検体中の一つ以上の成分を分析する、一つ以上の多層乾式分析要素、及び（３）前記前処理要素と前記多層乾式分析要素とをつなぐ一つ以上の流路のほかに、着脱可能な採血要素を有していてもよい。 As another aspect of the analysis chip of the present invention, when analyzing components in whole blood, (1) one or more pretreatment elements for pretreatment of the specimen, (2) in the specimen after the pretreatment In addition to one or more multi-layer dry analysis elements for analyzing one or more components, and (3) one or more flow paths connecting the pretreatment elements and the multi-layer dry analysis elements, removable blood collection elements You may have.
また、本発明の分析チップの別の態様としては、（１）検体の前処理をする一つ以上の前処理要素、（２）前処理後の検体中の一つ以上の成分を分析する、一つ以上の多層乾式分析要素、及び（３）前記前処理要素と前記多層乾式分析要素とをつなぐ一つ以上の流路の他に、検体を注入（点着）する要素や、検体量を秤量する要素、多層乾式分析要素に導入する検体の量を秤量する要素、検体や反応液を混合する要素等の要素を有していてもよい。 Moreover, as another aspect of the analysis chip of the present invention, (1) one or more pretreatment elements for pretreatment of the specimen, (2) one or more components in the specimen after the pretreatment are analyzed, In addition to one or more multilayer dry analysis elements, and (3) one or more flow paths connecting the pretreatment element and the multilayer dry analysis element, elements for injecting (spotting) a specimen, You may have elements, such as an element to weigh, an element which weighs the quantity of the sample introduced into a multilayer dry analysis element, and an element which mixes a sample and a reaction liquid.
本発明において、「一体化」されているとは、上記分析チップに注入された検体中の成分が、該分析チップの外に出されることなく、全ての測定が完了できるということである。 In the present invention, “integrated” means that all the measurements can be completed without the components in the sample injected into the analysis chip being taken out of the analysis chip.
一体化された分析チップ（以下、一体化型分析チップとも言う。）としては、以下の（ｉ）または（ｉｉ）の形態が挙げられる。
（ｉ）上記（１）〜（３）の３つの要素（または、(１)、（２）の２つの要素）が、一つのカートリッジに含有されることによって一体化されている形態。
（ｉｉ）上記（１）または（３）のいずれか、または両方が、いわゆる微細加工技術を用いて、基板の上またはその中に作られており、必要に応じて（２）の多層乾式分析要素は、（３）の流路に接合されている形態。
Examples of the integrated analysis chip (hereinafter also referred to as an integrated analysis chip) include the following forms (i) or (ii).
(I) A form in which the three elements (1) to (3) (or the two elements (1) and (2)) are integrated by being contained in one cartridge.
(Ii) Either or both of the above (1) and (3) are made on or in a substrate using a so-called microfabrication technique, and if necessary, the multilayer dry analysis of (2) The element is joined to the flow path of (3).
上記（ｉ）において、カートリッジを構成する素材としては、ゴム、プラスチックなどの樹脂、シリコン含有物質が挙げられる。
樹脂としては、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリサイクリックオレフィン（ＰＣＯ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリジメ
チルシロキサン（ＰＤＭＳ）、天然ゴム、合成ゴム及びこれらの誘導体が挙げられる。シリコン含有物質としては、ガラス、石英、シリコンウエファー等のアモルファスシリコン、ポリメチルシロキサンなどのシリコーンが挙げられる。
上記の中でも、ＰＭＭＡ、ＰＣＯ、ＰＳ、ＰＣ、ガラス、シリコンウエファーが好ましい。これらは、透明素材であることから、後述する測光に用いる場合に特に好適である。この場合、カートリッジを構成する素材全てが透明である必要はなく、測光される多層乾式分析要素をカートリッジ外から確認することが可能であればよい。カートリッジに多層乾式分析要素を確認するための窓枠形状を設け、窓に当たる部分のみ上記透明素材としてもよい。
In (i) above, examples of the material constituting the cartridge include a resin such as rubber and plastic, and a silicon-containing substance.
Examples of the resin include polymethyl methacrylate (PMMA), polycyclic olefin (PCO), polycarbonate (PC), polystyrene (PS), polyethylene (PE), polyethylene terephthalate (PET), polypropylene (PP), and polydimethylsiloxane. (PDMS), natural rubber, synthetic rubber and derivatives thereof. Examples of the silicon-containing substance include amorphous silicon such as glass, quartz, and silicon wafer, and silicone such as polymethylsiloxane.
Among the above, PMMA, PCO, PS, PC, glass, and silicon wafer are preferable. Since these are transparent materials, they are particularly suitable when used for photometry described later. In this case, it is not necessary for all the materials constituting the cartridge to be transparent, and it is sufficient if the multilayer dry analytical element to be measured can be confirmed from outside the cartridge. A window frame shape for confirming the multilayer dry analysis element may be provided on the cartridge, and only the portion that hits the window may be the transparent material.
特に（３）の流路を微細加工技術を用いて作成する場合、金属、シリコン、テフロン（登録商標）、ガラスおよびセラミックスが、耐熱、耐圧、耐溶剤性および光透過性の観点からより好ましく、特に好ましくはガラスである。 In particular, when the flow path of (3) is created using a microfabrication technique, metal, silicon, Teflon (registered trademark), glass and ceramics are more preferable from the viewpoints of heat resistance, pressure resistance, solvent resistance and light transmittance, Particularly preferred is glass.
カートリッジの形、および大きさは、手で持ちやすい範囲であれば、いずれの形、大きさでもよい。具体的には、例えば、底面の一辺が１０〜５０ｍｍ位の長方形で、厚みが２〜１０ｍｍ位のものが好ましい形および大きさとして挙げられる。
（１）の前処理要素および（３）の流路はそれぞれ後述する構成を含有して構成されるが、これらのいずれかの作製に、下記（ｉｉ）に適用する微細加工技術を適用することもできる。
The shape and size of the cartridge may be any shape and size as long as it is easily held by hand. Specifically, for example, a shape having a rectangular shape with one side of the bottom surface of about 10 to 50 mm and a thickness of about 2 to 10 mm is preferable.
Each of the pretreatment element (1) and the flow path (3) is configured to contain a structure to be described later, and a microfabrication technique applied to (ii) below is applied to any one of these processes. You can also.
上記（ｉｉ）において、上記（１）および／または（３）は、基板上に微細加工技術により作成することができる。基板に使用される材料の例を挙げれば金属、シリコン、テフロン（登録商標）、ガラス、セラミックスまたはプラスチック、ゴムなどである。
プラスチックの例としては、ＰＣＯ、ＰＳ、ＰＣ、ＰＭＭＡ、ＰＥ、ＰＥＴ、ＰＰ等を挙げることができる。ゴムの例としては、天然ゴム、合成ゴム、シリコンゴム、ＰＤＭＳ等を挙げることができる。シリコン含有物質としては、ガラス、石英、シリコンウエファー等のアモルファスシリコン、ポリメチルシロキサンなどのシリコーンが挙げられる。
特に好ましい例としては、ＰＭＭＡ、ＰＣＯ、ＰＳ、ＰＣ、ＰＥＴ、ＰＤＭＳ、ガラス、シリコンウエファー等を挙げることができる。これらは、透明素材であることから、後述する測光に用いる場合に特に好適である。この場合、基板全てが透明である必要はなく、多層乾式分析要素が分析チップ外から確認可能であればよい。分析チップに多層乾式分析要素を確認するための窓枠形状を設け、窓に当たる部分のみ上記透明素材としてもよい。
基板の大きさは、特に限定されないが、手で持ちやすい範囲であれば、いずれの形、大きさでもよい。上記（ｉ）のカートリッジの形，大きさと同様、具体的には、例えば、底面の一辺が１０〜５０ｍｍ位の長方形で、厚みが２〜１０ｍｍ位のものが好ましい形および大きさとして挙げられる。
In the above (ii), the above (1) and / or (3) can be prepared on a substrate by a fine processing technique. Examples of the material used for the substrate include metal, silicon, Teflon (registered trademark), glass, ceramics or plastic, and rubber.
Examples of the plastic include PCO, PS, PC, PMMA, PE, PET, PP, and the like. Examples of rubber include natural rubber, synthetic rubber, silicon rubber, PDMS and the like. Examples of the silicon-containing substance include amorphous silicon such as glass, quartz, and silicon wafer, and silicone such as polymethylsiloxane.
Particularly preferable examples include PMMA, PCO, PS, PC, PET, PDMS, glass, and silicon wafer. Since these are transparent materials, they are particularly suitable when used for photometry described later. In this case, it is not necessary for all the substrates to be transparent, and it is sufficient that the multilayer dry analysis element can be confirmed from outside the analysis chip. A window frame shape for confirming the multilayer dry analysis element may be provided on the analysis chip, and only the portion that hits the window may be the transparent material.
The size of the substrate is not particularly limited, but may be any shape and size as long as it can be easily held by hand. Specific examples of the shape and size of the cartridge (i) above include a rectangular shape having a side of about 10 to 50 mm and a thickness of about 2 to 10 mm.
（１）および／または（３）を作成するための微細加工技術は、例えばマイクロリアクター −新時代の合成技術−（２００３年 シーエムシー刊 監修：吉田潤一 京都大学大学院 工学研究科教授）、微細加工技術 応用編−フォトニクス・エレクトロニクス・メカトロニクスへの応用−（２００３年 エヌ・ティー・エス刊 高分子学会行事委員会編）等に記載されている方法を挙げることができる。 The microfabrication technology for creating (1) and / or (3) is, for example, a microreactor -a new generation of synthesis technology- (supervised by CMMC, published by Junichi Yoshida, Professor, Graduate School of Engineering, Kyoto University) Technology Application-Application to photonics, electronics, and mechatronics-(2003, published by NTS, edited by the Society of Polymer Science, etc.) and the like.
代表的な方法を挙げれば、Ｘ線リソグラフィを用いるＬＩＧＡ技術、ＥＰＯＮ ＳＵ−８を用いた高アスペクト比フォトリソグラフィ法、マイクロ放電加工法（μ−ＥＤＭ）、Ｄｅｅｐ ＲＩＥによるシリコンの高アスペクト比加工法、Ｈｏｔ Ｅｍｂｏｓｓ加工法、光造形法、レーザー加工法、イオンビーム加工法、およびダイアモンドのような硬い材料で作られたマイクロ工具を用いる機械的マイクロ切削加工法などがある。これらの技術を単独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。好ましい微細加工技術は、Ｘ線リソグラフィを用いるＬＩＧＡ技術、ＥＰＯＮ ＳＵ−８を用いた高アスペクト比フォトリソグラフィ法、マイクロ放電加工法（μ−ＥＤＭ）、および機械的マイクロ切削加工法である。 Typical methods include LIGA technology using X-ray lithography, high aspect ratio photolithography method using EPON SU-8, micro electric discharge machining method (μ-EDM), and high aspect ratio silicon processing method using Deep RIE. , Hot Emboss processing method, stereolithography method, laser processing method, ion beam processing method, and mechanical micro cutting method using a micro tool made of a hard material such as diamond. These techniques may be used alone or in combination. Preferred microfabrication techniques are LIGA technology using X-ray lithography, high aspect ratio photolithography using EPON SU-8, micro electrical discharge machining (μ-EDM), and mechanical micro-cutting.
本発明における（１）および／または（３）は、シリコンウエファー上にフォトレジストを用いて形成したパターンを鋳型とし、これに樹脂を流し込み固化させること（モールディング法）によっても作成することができる。モールディング法には、ＰＤＭＳまたはその誘導体に代表されるシリコン樹脂を使用することができる。 (1) and / or (3) in the present invention can also be produced by using a pattern formed using a photoresist on a silicon wafer as a mold, and pouring a resin into the pattern (molding method). In the molding method, a silicon resin typified by PDMS or a derivative thereof can be used.
本発明の一体化型分析チップを組み立てる際、接合技術を用いることができる。通常の接合技術は大きく固相接合と液相接合に分けられ、一般的に用いられている接合方法は、固相接合として圧接や拡散接合、液相接合として溶接、共晶接合、はんだ付け、接着等が代表的な接合方法である。 A joining technique can be used when assembling the integrated analysis chip of the present invention. The usual bonding techniques are roughly divided into solid phase bonding and liquid phase bonding, and the commonly used bonding methods are pressure bonding and diffusion bonding as solid phase bonding, welding, eutectic bonding, soldering as liquid phase bonding, Adhesion or the like is a typical joining method.
更に、組立に際しては高温加熱による材料の変質や大変形による流路等の微小構造体の破壊を伴わない寸法精度を保った高度に精密な接合方法が望ましく、その技術としてはシリコン直接接合、陽極接合、表面活性化接合、水素結合を用いた直接接合、ＨＦ水溶液を用いた接合、Ａｕ−Ｓｉ共晶接合、ボイドフリー接着などが挙げられる。
また、超音波、レーザー等を用いる接合、接着剤、接着テープなども使用する接合を使用してもよいし、単に圧力だけで、接合していてもよい。
Furthermore, during assembly, a highly precise bonding method that maintains the dimensional accuracy without destructing the microstructure such as flow path due to material deterioration due to high temperature heating or large deformation is desirable. Examples include bonding, surface activation bonding, direct bonding using hydrogen bonding, bonding using an HF aqueous solution, Au—Si eutectic bonding, and void-free bonding.
Further, bonding using ultrasonic waves, laser, etc., bonding using an adhesive, an adhesive tape, or the like may be used, or bonding may be performed only by pressure.
流路と、多層乾式分析要素を接合する場合には、例えば、接着剤、両面テープ、超音波による溶着、光硬化剤の使用、表面処理剤の使用等、多数の一般的な方法が考えられる。また、其々の構成素材および形態により、単に圧力をかけ押しつけていればよい場合もある。いずれにせよ、血漿などの検体が漏れ出さないような方法であればどのような方法であってもよい。 When joining a flow path and a multilayer dry analytical element, for example, there are many general methods such as adhesive, double-sided tape, ultrasonic welding, use of a photo-curing agent, use of a surface treatment agent, etc. . Further, depending on the respective constituent materials and forms, there may be a case where pressure is simply applied and pressed. In any case, any method may be used as long as a sample such as plasma does not leak out.
［前処理要素］
次に前記（１）〜（３）の３つの要素のうち、（１）前処理要素について説明する。
本発明における前処理とは、採取した検体を乾式分析要素に供与する前に必要なすべての処理およびその一部分を指す。前処理要素は検体の前処理を行う要素のことをいう。前処理の例としては、血球分離、溶血、検体の希釈、タンパク質の分解、タンパク質の変性、内因性物質の除去、抗原抗体反応等をあげることができる。
前処理要素は、一つの前処理要素がこれら複数の前処理を行えるものであってもよく、各々異なる前処理を行う複数の前処理要素であってもよい。またこれら要素は流路によりつながっていても、または流路内に組込まれていてもよい。
[Pre-processing element]
Next, among the three elements (1) to (3), (1) the preprocessing element will be described.
The pretreatment in the present invention refers to all treatments required for supplying collected specimens to the dry analytical element and a part thereof. The pretreatment element refers to an element that performs pretreatment of the specimen. Examples of the pretreatment include blood cell separation, hemolysis, specimen dilution, protein degradation, protein denaturation, removal of endogenous substances, antigen-antibody reaction, and the like.
The preprocessing element may be one in which one preprocessing element can perform the plurality of preprocessing, or may be a plurality of preprocessing elements that perform different preprocessing. These elements may be connected by a flow path or may be incorporated in the flow path.
前処理要素は、通常は前処理要素を構成する部材と、必要に応じて前処理を行うための試薬を含んで構成されている。前処理要素を構成する部材は前述したカートリッジに含有されていてもいいし、基板の上またはその中につくられていてもいい。 The pretreatment element is usually configured to include a member constituting the pretreatment element and a reagent for performing pretreatment as necessary. The member constituting the pretreatment element may be contained in the above-described cartridge, or may be formed on or in the substrate.
前処理要素は、該要素自体が流路形状をしていてもよい。反応を速やかに進行させるという観点から、多孔質体であってもよい。多孔質体は、流路形状の前処理要素（または該前処理要素を構成する要素）中に配置しても、後記するように流路形状とは別の形状の前処理要素中に配置してもよく、また流路自体が多孔質体であってもよい。ここでいう多孔質体の例としては、濾紙、メンブラン、ガラス繊維、ガラス繊維濾紙、繊維、不織布等、及びその組み合わせを挙げることができる。 The pretreatment element may itself have a flow path shape. From the viewpoint of promptly proceeding the reaction, a porous material may be used. Even if the porous body is disposed in a pretreatment element having a flow path shape (or an element constituting the pretreatment element), it is disposed in a pretreatment element having a shape different from the flow path shape as described later. The flow path itself may be a porous body. Examples of the porous body mentioned here include filter paper, membrane, glass fiber, glass fiber filter paper, fiber, non-woven fabric, and the like, and combinations thereof.
また、前処理要素は、ビーズのような微粒子であってもよい。ここでいう微粒子の例と
しては、ガラスビーズ、シリコンビーズ、ポリマービーズ、ラテックスビーズ、ナノ粒子、磁性粒子、アモルファスシリコンビーズなど、及びその組み合わせを挙げることができる。このようなビーズの例としては、特開2004-61496号公報、特開平5-87812号公報に記載の技術が使用できる。
The pretreatment element may be fine particles such as beads. Examples of the fine particles herein include glass beads, silicon beads, polymer beads, latex beads, nanoparticles, magnetic particles, amorphous silicon beads, and combinations thereof. As examples of such beads, techniques described in JP-A-2004-61496 and JP-A-5-87812 can be used.
また、前処理要素は、固体基板上に前述したような微細加工技術により作成することもできる。この場合、前処理要素は、前述したような微細加工技術によって実質的に多孔質になっていてもよい。この場合、前処理要素はピラー状になっていることも好ましい。 The pretreatment element can also be produced on the solid substrate by the microfabrication technique as described above. In this case, the pretreatment element may be made substantially porous by the microfabrication technique as described above. In this case, it is also preferable that the pretreatment element has a pillar shape.
前処理要素が試薬を含む場合、前処理要素内に前処理用の試薬を保持していることが望ましい。試薬を前処理要素に導入する方法としては、前処理要素の構成に応じて適宜、スポット法、スクリーン印刷法、ナノコンタクトプリンティング法、インクジェット法等が利用でき、また、あらかじめ、ポリエチレンテレフタレートや、酢酸セルロース誘導体等で作られたベース上に塗布したのち、該前処理要素に接着してもよい。さらには、前述したような多孔質体に含有（または吸着、固定化、分散等）させたのち、該前処理要素に導入してもよい。 When the pretreatment element includes a reagent, it is desirable to hold the pretreatment reagent in the pretreatment element. As a method for introducing the reagent into the pretreatment element, a spot method, a screen printing method, a nanocontact printing method, an ink jet method, or the like can be used as appropriate according to the configuration of the pretreatment element. In addition, polyethylene terephthalate, acetic acid, or the like can be used. After coating on a base made of a cellulose derivative or the like, it may be adhered to the pretreatment element. Further, after being contained (or adsorbed, fixed, dispersed, etc.) in the porous body as described above, it may be introduced into the pretreatment element.
｛血球分離｝
本発明でいう前処理の具体例の一つとしては、血球分離をあげることができる。本発明における血球分離とは、全血より血球を分離し、血漿または血清を取り出す工程をいう。
本発明において、血球分離要素の形態は、全血から血球を分離して血漿または血清を得ることが可能ならばいずれの形でもよく、直線状、曲線状等、いずれの形態をとることも可能である。
また、本発明において、血球分離要素としては、従来公知の血球分離に用いられるいずれの要素も利用することができる。例えば、遠心力を利用する要素、濾過による要素等を挙げることができる。また、これらを組み合わせてもよい。
{Blood cell separation}
One specific example of the pretreatment referred to in the present invention is blood cell separation. Blood cell separation in the present invention refers to a step of separating blood cells from whole blood and taking out plasma or serum.
In the present invention, the form of the blood cell separation element may be any form as long as it can separate blood cells from whole blood to obtain plasma or serum, and can take any form such as a straight line or a curved line. It is.
In the present invention, any element used for blood cell separation known in the art can be used as the blood cell separation element. For example, an element using centrifugal force, an element by filtration, and the like can be given. Moreover, you may combine these.
遠心力を利用する要素の場合、分析チップに全血を注入し、遠心分離機によりチップを回転させ血球を分離し、得られた血漿を多層乾式分析要素に直接、または流路を介して多層乾式分析要素に導くことができる。遠心力を利用する要素としては、遠心分離機を利用することができる形態を持ち、かつ血球を分離し、得られた血漿を流路を通して多層乾式分析要素に導くことができればいずれの形態であってもよい。例えば、血球分離後、血球を含む固体成分を配置する凹部を有する形態を好ましい具体例としてあげることができる。 In the case of an element that uses centrifugal force, whole blood is injected into the analysis chip, the chip is rotated by a centrifuge to separate blood cells, and the resulting plasma is applied to the multilayer dry analysis element directly or via a flow path. Can lead to dry analytical elements. The element utilizing centrifugal force is in any form as long as it has a form in which a centrifuge can be used, blood cells can be separated, and the obtained plasma can be guided to a multilayer dry analytical element through a flow path. May be. For example, after separating blood cells, a form having a recess in which a solid component containing blood cells is arranged can be given as a preferred specific example.
本発明においては、血球分離要素として濾過部を有することが好ましい。濾過部に用いる濾材としては、従来公知のいずれの濾材も利用可能であるが、多孔質体であることが好ましく、該多孔質体としては、濾紙、メンブラン、ガラス繊維、ガラス繊維濾紙等があげられる。また、これらを組み合わせてもよい。また、例えば、特開平１１−６８２９号公報、特開平１１−３８００１号公報、特開平１１−３８００２号公報、特開平１１−３８００３号公報、特開平１１−２３７３７８号公報等の各公報に記載の方法を使用することもできる。 In this invention, it is preferable to have a filtration part as a blood cell separation element. Any conventionally known filter medium can be used as the filter medium for the filtration section, but is preferably a porous body, and examples of the porous body include filter paper, membrane, glass fiber, and glass fiber filter paper. It is done. Moreover, you may combine these. Further, for example, as described in JP-A-11-6829, JP-A-11-38001, JP-A-11-38002, JP-A-11-38003, JP-A-11-237378, and the like. A method can also be used.
また、濾過部は、等価直径５μｍ以下でかつ長さが等価直径と等しいか或いはそれより長い非水溶性物質であってもよい。
非水溶性物質としては、シリコン，ガラス，ポリスチレン（ＰＳ），ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ），ポリカーボネート（ＰＣ），ケブラーなどの商標で知られるポリイミド、およびガラス繊維，ガラス繊維濾紙、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）繊維、ポリイミド繊維などが挙げられる。
非水溶性物質としては、等価直径５μｍ以下でかつ長さが等価直径と等しいか或いはそ
れより長い非水溶性物質であれば、繊維に限定する必要はない。例えば、微細加工技術，またはμＴＡＳなどの加工技術を用いて、マイクロピラー・ナノピラーなどと一般的に呼ばれている柱状の形状に成型したものを配置して用いてもよい。マイクロピラー・ナノピラーの作り方にはさまざまな方法があるが、シリコンウエハを露光およびエッチングによって柱状にシリコンを残存させる方法でもよいし、凹んだ形状の鋳型を用いて樹脂に圧着して剥がし、樹脂の表面に柱状の突起を形成させるインプリンティング法を用いてもよい。
さらに、非水溶性物質をピラー状の形状に限定する必要はない。光硬化性樹脂などを用いて光造形技術で等価直径５μｍ以下でかつ長さが等価直径と等しいか或いはそれより長い構造体を作成すればよい。このときに、該構造体間にさらに架橋させる構造体を作成することで力学的な強度を付与し、濾過性能と力学強度の両方を満足する構造体を作ることができる。この構造体の形状としては、ピラー間を架橋する構造，繊維間を架橋する構造，井桁状・市松模様・ハニカム状のメッシュ構造およびその架橋体などが挙げられる。
Further, the filtration part may be a water-insoluble substance having an equivalent diameter of 5 μm or less and a length equal to or longer than the equivalent diameter.
Non-water-soluble substances include silicon, glass, polystyrene (PS), polyethylene terephthalate (PET), polycarbonate (PC), polyimides known by trademarks such as Kevlar, glass fiber, glass fiber filter paper, polyethylene terephthalate (PET) fiber And polyimide fiber.
The water-insoluble substance need not be limited to fibers as long as the water-insoluble substance has an equivalent diameter of 5 μm or less and a length equal to or longer than the equivalent diameter. For example, a columnar shape generally called a micro-pillar / nano-pillar or the like may be arranged and used by using a fine processing technique or a processing technique such as μTAS. There are various methods for making micro-pillars and nano-pillars, but silicon wafers can be left in the form of pillars by exposure and etching, or they can be pressed against the resin using a concave mold and peeled off. An imprinting method in which columnar protrusions are formed on the surface may be used.
Furthermore, it is not necessary to limit the water-insoluble substance to a pillar shape. A structure body having an equivalent diameter of 5 μm or less and a length equal to or longer than the equivalent diameter may be created by a photo-molding technique using a photocurable resin or the like. At this time, it is possible to create a structure that provides both mechanical performance and mechanical strength by creating a structure that is further crosslinked between the structures. Examples of the shape of the structure include a structure in which the pillars are cross-linked, a structure in which the fibers are cross-linked, a mesh structure having a grid pattern, checkered pattern, and honeycomb, and a cross-linked body thereof.
さらにまた、血球分離要素は、ガラス繊維濾紙および微多孔性膜を含有する血液濾過ユニットを含んでいてもよい。該血液濾過ユニットは、微量な血液であっても血漿や血清を効率よく分離でき、特に好ましい。
以下、該血液濾過ユニットについて述べる。
ガラス繊維濾紙は密度が０．０２〜０．３程度が好ましく、さらに好ましくは０．０２〜０．２程度、特に好ましくは０.０２〜０.１５程度で、保留粒子径が０．８〜９μｍ程度が好ましく、特に１〜５μｍ程度のものが好ましい。ガラス繊維の表面を、特開平２−２０８５６５号公報、同４−２０８８５６号公報に記載された様な方法で、親水性高分子で処理することによって濾過をより速やかに円滑に行なうことができる。また、ガラス繊維濾紙の中にレクチン、その他の反応性試薬や改質剤を添加しておいたり、また、ガラス繊維の表面をレクチンで処理することもできる。ガラス繊維濾紙に処理を施すことなく使用することもできる。ガラス繊維濾紙は複数枚を積層して用いることもできる。
Furthermore, the blood cell separation element may include a blood filtration unit containing glass fiber filter paper and a microporous membrane. The blood filtration unit is particularly preferable because it can efficiently separate plasma and serum even with a small amount of blood.
Hereinafter, the blood filtration unit will be described.
The density of the glass fiber filter paper is preferably about 0.02 to 0.3, more preferably about 0.02 to 0.2, particularly preferably about 0.02 to 0.15, and the retained particle diameter is about 0.8 to about It is preferably about 9 μm, particularly preferably about 1 to 5 μm. Filtration can be performed more quickly and smoothly by treating the surface of the glass fiber with a hydrophilic polymer by the method described in JP-A-2-208565 and JP-A-4-208856. Further, lectin, other reactive reagents and modifiers can be added to the glass fiber filter paper, and the surface of the glass fiber can be treated with lectin. It can also be used without processing the glass fiber filter paper. A plurality of glass fiber filter papers can be used by laminating.
また、必要に応じてガラス繊維の密度、その他の特性を組み合わせて調製積層することができる。 Moreover, it can be prepared and laminated by combining the density of the glass fiber and other characteristics as required.
微多孔性膜は、実質的に分析値に影響を与える程には溶血することなく、全血から血球と血漿を特異的に分離するものである。
この微多孔性膜は孔径がガラス繊維濾紙の保留粒子径より小さくかつ０．２μｍ以上であることが好ましく、さらに好ましくは０．３〜８μｍ、より好ましくは０．５〜４．５μｍ程度、特に好ましくは０．５〜３μｍである。
また、空隙率は高いものが好ましく、具体的には、空隙率が約４０％から約９５％が好ましく、より好ましくは約５０％から約９５％、さらに好ましくは約７０％から約９５％の範囲である。
微多孔性膜の例としては弗素含有ポリマー膜、ポリスルホン膜、セルロースアセテート膜、ニトロセルロース膜等が挙げられる。また表面を加水分解、親水性高分子、活性剤などで親水化処理したものも使用できる。
The microporous membrane specifically separates blood cells and plasma from whole blood without hemolysis to such an extent that the analysis value is substantially affected.
The microporous membrane preferably has a pore size smaller than the retained particle size of the glass fiber filter paper and 0.2 μm or more, more preferably 0.3 to 8 μm, more preferably about 0.5 to 4.5 μm, particularly Preferably it is 0.5-3 micrometers.
The porosity is preferably high, specifically, the porosity is preferably from about 40% to about 95%, more preferably from about 50% to about 95%, still more preferably from about 70% to about 95%. It is a range.
Examples of the microporous membrane include a fluorine-containing polymer membrane, a polysulfone membrane, a cellulose acetate membrane, and a nitrocellulose membrane. Further, the surface of which is hydrolyzed with a hydrophilic, hydrophilic polymer or activator can be used.
弗素含有ポリマーの微多孔性膜としては、特表昭６３−５０１５９４号公報（国際公開第８７／０２２６７号パンフレット）に記載のポリテトラフルオロエチレンのフィブリル（微細繊維）からなる微多孔性のマトリックス膜（微多孔性層）、Ｇｏｒｅ−Ｔｅｘ（Ｗ.Ｌ.Ｇｏｒｅ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社製）、Ｚｉｔｅｘ（Ｎｏｒｔｏｎ社製）、ポアフロン（住友電工社製）などが挙げられる。その他に、米国特許第３２６８８７２号明細書の実施例３及び４、米国特許第３２６０４１３号明細書の実施例３及び４、特開昭５３−９２１９５号公報（米国特許第４２０１５４８号明細書）等に記載のポリテトラフルオロエチレンの微多孔性膜、米国特許第３６４９５０５号明細書に記載のポリビニリデ
ンフルオリドの微多孔性膜なども使用できる。
As a microporous membrane of fluorine-containing polymer, a microporous matrix membrane comprising polytetrafluoroethylene fibrils (fine fibers) described in JP-A-63-501594 (International Publication No. 87/02267 pamphlet) (Microporous layer), Gore-Tex (manufactured by W.L. Gore and Associates), Zitex (manufactured by Norton), pore flon (manufactured by Sumitomo Electric), and the like. In addition, Examples 3 and 4 of US Pat. No. 3,268,872, Examples 3 and 4 of US Pat. No. 3,260,413, JP-A-53-92195 (US Pat. No. 4,201,548), etc. The microporous membrane of polytetrafluoroethylene described, the microporous membrane of polyvinylidene fluoride described in US Pat. No. 3,649,505, and the like can also be used.
構造としては、延伸しないもの、１軸延伸したもの、２軸延伸したもの、１層構成の非ラミネートタイプ、２層構成のラミネートタイプ、例えば繊維等の他の膜構造物にラミネートした膜等、いずれも使用できる。フィブリル構造であってもよい。 The structure is not stretched, uniaxially stretched, biaxially stretched, one-layer non-laminate type, two-layer laminate type, for example, a film laminated to other membrane structures such as fibers, etc. Either can be used. A fibril structure may also be used.
フィブリル構造又は一軸延伸もしくは二軸延伸した非ラミネートタイプの微多孔性膜は、延伸により、空隙率が大きくかつ濾過長の短い微多孔性膜を作ることができる。濾過長が短い微多孔性膜は、血液中の有形成分（主として赤血球）による目詰りが生じにくく、かつ血球と血漿の分離に要する時間が短いので、定量分析精度が高くなるため、好ましい。 A non-laminate type microporous membrane having a fibril structure or uniaxially stretched or biaxially stretched can produce a microporous membrane having a large porosity and a short filtration length by stretching. A microporous membrane with a short filtration length is preferable because clogging due to a formed component (mainly erythrocytes) in blood is unlikely to occur and the time required for separation of blood cells and plasma is short, so that quantitative analysis accuracy is high.
これらの弗素含有ポリマーの微多孔性膜の作成に当たっては、１種もしくは２種以上の弗素含有ポリマーを混合しても良いし、弗素を含まない１種もしくは２種以上のポリマーや繊維と混合し、製膜したものであっても良い。 In preparing these microporous membranes of fluorine-containing polymers, one or more fluorine-containing polymers may be mixed, or mixed with one or more polymers or fibers that do not contain fluorine. Alternatively, a film formed may be used.
弗素含有ポリマーの微多孔性膜は特開昭５７−６６３５９号公報（米国特許第４７８３３１５号明細書）に記載の物理的活性化処理（好ましくはグロー放電処理又はコロナ放電処理）を微多孔性膜の少なくとも片面に施すことにより微多孔性膜の表面を親水化して、隣接する微多孔性膜との部分接着に用いられる接着剤の接着力を強化することができる。 A microporous membrane of fluorine-containing polymer is obtained by subjecting a physical activation treatment (preferably glow discharge treatment or corona discharge treatment) described in JP-A-57-66359 (US Pat. No. 4,783,315) to a microporous membrane. By applying to at least one side of the surface, the surface of the microporous membrane can be made hydrophilic, and the adhesive force of the adhesive used for partial adhesion to the adjacent microporous membrane can be enhanced.
弗素含有ポリマーの微多孔性膜は、そのままでは、表面張力が低く濾材として用いようとしても、水性液体試料ははじかれてしまって、膜の表面や内部に拡散、浸透しずらい。これに対しては、弗素含有ポリマーの微多孔性膜に親水性を付与し親水性を高める手段として、弗素含有ポリマーの微多孔性膜の外部表面及び内部の空隙部分の表面を実質的に親水化するに充分な量の界面活性剤を弗素含有ポリマーの微多孔性膜に含浸させることにより、水性液体試料がはじかれる問題点を解決できる。 Even if a microporous membrane of a fluorine-containing polymer is used as it is, the surface tension is low, and even if it is used as a filter medium, the aqueous liquid sample is repelled, and it is difficult to diffuse and penetrate into the surface and inside of the membrane. For this, as a means of imparting hydrophilicity to the microporous film of fluorine-containing polymer and enhancing the hydrophilicity, the outer surface of the microporous film of fluorine-containing polymer and the surface of the void portion inside are substantially hydrophilic. By impregnating a microporous membrane of a fluorine-containing polymer with a sufficient amount of a surfactant, the problem of repelling an aqueous liquid sample can be solved.
水性液体試料がはじかれることなく膜の表面や内部に拡散、浸透、移送されるに充分な親水性を弗素含有ポリマーの微多孔性膜に付与するには、弗素含有ポリマーの微多孔性膜の空隙体積の、好ましくは約０．０１％から約１０％、より好ましくは約０．１％から約５．０％、更に好ましくは０．１％から１％の界面活性剤で微多孔性膜の空隙部分の表面を被覆する。例えば、厚さが５０μｍの弗素含有ポリマーの微多孔性膜の場合に、含浸される界面活性剤の量は、一般に０．０５ｇ／ｍ2から２．５ｇ／ｍ2の範囲であることが好ましい。弗素含有ポリマーの微多孔性膜に界面活性剤を含浸させる方法としては、界面活性剤を低沸点（沸点約５０℃から約１２０℃の範囲が好ましい）の有機溶媒（例、アルコール、エステル、ケトン）溶液にし、該溶液に弗素含有ポリマーの微多孔性膜を浸漬し、溶液を微多孔性膜の内部空隙に実質的に充分に行きわたらせた後、微多孔性膜を溶液から静かに引き上げ、風（温風が好ましい）を送り乾燥させる方法が挙げられる。 In order to impart sufficient hydrophilicity to the microporous membrane of the fluorine-containing polymer so that the aqueous liquid sample can be diffused, permeated and transferred to the surface and inside of the membrane without being repelled, the microporous membrane of the fluorine-containing polymer is A microporous membrane with a surfactant, preferably from about 0.01% to about 10%, more preferably from about 0.1% to about 5.0%, more preferably from 0.1% to 1% of the void volume The surface of the void portion is covered. For example, when the thickness of the microporous membrane of 50μm fluorine-containing polymer, the amount of surfactant to be impregnated is preferably generally in the range from 0.05 g / m 2 of 2.5 g / m 2 . As a method of impregnating a microporous membrane of a fluorine-containing polymer with a surfactant, an organic solvent (eg, alcohol, ester, ketone) having a low boiling point (preferably in the range of about 50 ° C. to about 120 ° C.) is used. ) Into a solution, immersing the microporous membrane of the fluorine-containing polymer in the solution, allowing the solution to reach substantially the interior voids of the microporous membrane, and then gently lifting the microporous membrane from the solution; A method of sending wind (preferably warm air) and drying is exemplified.
弗素含有ポリマーの微多孔性膜を親水化処理に用いられる界面活性剤としては、非イオン性（ノニオン性）、陰イオン性（アニオン性）、陽イオン性（カチオン性）、両性いずれの界面活性剤をも用いることができる。 Nonionic (nonionic), anionic (anionic), cationic (cationic), and amphoteric surfactants can be used as surfactants for hydrophilizing fluorine-containing polymer microporous membranes. Agents can also be used.
これらの界面活性剤のうちでは、ノニオン性界面活性剤が、赤血球を溶血させる作用が比較的低く、好ましい。ノニオン性界面活性剤としては、アルキルフェノキシポリエトキシエタノール、アルキルポリエーテルアルコール、ポリエチレングリコールモノエステル、ポリエチレングリコールジエステル、高級アルコールエチレンオキシド付加物（縮合物）、多価アルコールエステルエチレンオキシド付加物（縮合物）、高級脂肪酸アルカノールアミドなどが挙げられる。 Among these surfactants, nonionic surfactants are preferable because they have a relatively low effect of lysing red blood cells. Nonionic surfactants include alkylphenoxypolyethoxyethanol, alkyl polyether alcohol, polyethylene glycol monoester, polyethylene glycol diester, higher alcohol ethylene oxide adduct (condensate), polyhydric alcohol ester ethylene oxide adduct (condensate), And higher fatty acid alkanolamides.
ノニオン性界面活性剤の具体例として、次のものが挙げられる。アルキルフェノキシポリエトキシエタノールとしては、
イソオクチルフェノキシポリエトキシエタノール：
（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００：オキシエチレン単位平均９〜１０含有）、
（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４５：オキシエチレン単位平均５含有）、
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール：
(ＩＧＥＰＡＬ ＣＯ−６３０：オキシエチレン単位平均９含有）、
(ＩＧＥＰＡＬ ＣＯ−７１０：オキシエチレン単位平均１０〜１１含有）、
(ＬＥＮＥＸ６９８：オキシエチレン単位平均９含有）、
アルキルポリエーテルアルコールとしては、
高級アルコール ポリオキシエチレンエーテル：（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−６７：ＣＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ Ｎｏ．５９０３０−１５−８）が挙げられる。
Specific examples of the nonionic surfactant include the following. As alkylphenoxypolyethoxyethanol,
Isooctylphenoxy polyethoxyethanol:
(Triton X-100: Oxyethylene unit average 9-10 containing),
(Triton X-45: containing 5 average oxyethylene units),
Nonylphenoxy polyethoxyethanol:
(IGEPAL CO-630: containing 9 average oxyethylene units),
(IGEPAL CO-710: Oxyethylene unit average containing 10-11),
(LENEX 698: containing 9 average oxyethylene units),
As alkyl polyether alcohol,
Higher alcohol polyoxyethylene ether: (Triton X-67: CA Registry No. 59030-15-8).
弗素含有ポリマーの微多孔性膜は、その多孔性空隙に１種又は２種以上の水溶性高分子を水不溶化して設けることによって親水化したものであってもよい。水溶性高分子の例として、酸素を含む炭化水素にはポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、窒素を含むものにはポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、負電荷を有するものとしてポリアクリル酸、ポリメタアクリル酸、ポリスチレンスルホン酸などをあげることが出来る。不溶化は熱処理、アセタール化処理、エステル化処理、重クロム酸カリによる化学反応、電離性放射線による架橋反応等によって行えばよい。具体的には、特公昭５６−２０９４号公報及び特公昭５６−１６１８７号公報に開示されている方法が挙げられる。 The microporous membrane of the fluorine-containing polymer may be made hydrophilic by providing one or two or more water-soluble polymers in water insolubilized in the porous voids. Examples of water-soluble polymers include oxygen-containing hydrocarbons such as polyvinyl alcohol, polyethylene oxide, polyethylene glycol, methylcellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, and those containing nitrogen such as polyacrylamide, polyvinylpyrrolidone, polyvinylamine, Examples of polyethyleneimine and those having a negative charge include polyacrylic acid, polymethacrylic acid, and polystyrenesulfonic acid. Insolubilization may be performed by heat treatment, acetalization treatment, esterification treatment, chemical reaction with potassium dichromate, crosslinking reaction with ionizing radiation, or the like. Specific examples include the methods disclosed in Japanese Patent Publication No. 56-2094 and Japanese Patent Publication No. 56-16187.
ポリスルホンの微多孔性膜は、ポリスルホンをジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドンあるいはこれらの混合溶媒等に溶解して製膜原液を作製し、これを支持体上に、又は直接凝固液中に流延し洗浄、乾燥して行うことにより製造することができる。具体的には特開昭６２−２７００６号公報に開示されている方法が挙げられる。ポリスルホンの微多孔性膜としては、そのほか特開昭５６−１２６４０号公報、特開昭５６−８６９４１号公報、特開昭５６−１５４０５１号公報等に記載のものも使用することができる。ポリスルホンの微多孔性膜も弗素含有ポリマーと同様界面活性剤を含有させ、あるいは水不溶化した水溶性高分子を設けることによって親水化することができる。 A microporous membrane of polysulfone is prepared by dissolving polysulfone in dioxane, tetrahydrofuran, dimethylformamide, dimethylacetamide, N-methyl-2-pyrrolidone or a mixed solvent thereof to prepare a membrane forming stock solution on the support. Alternatively, it can be produced by casting directly in a coagulation liquid, washing and drying. Specific examples include the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 62-27006. As the microporous membrane of polysulfone, those described in JP-A Nos. 56-12640, 56-86941, 56-154051 and the like can also be used. The microporous membrane of polysulfone can be hydrophilized by containing a surfactant in the same manner as the fluorine-containing polymer or by providing a water-insoluble water-soluble polymer.
その他の非繊維微多孔性膜としては、特公昭５３−２１６７７号公報、米国特許１,４２１,３４１号明細書等に記載されたセルロースエステル類、例えば、セルロースアセテート、セルロースアセテート／ブチレート、硝酸セルロースからなるブラッシュポリマー膜が好ましいものとして挙げられる。６−ナイロン、６，６−ナイロン等のポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン等の微多孔性膜でもよい。その他、特公昭５３−２１６７７号、特開昭５５−９０８５９号等に記載された、ポリマー小粒子、ガラス粒子、けい藻土等が親水性または非吸水性ポリマーで結合された連続空隙をもつ多孔性膜も利用できる。 Other non-fiber microporous membranes include cellulose esters described in Japanese Patent Publication No. 53-21777, US Pat. No. 1,421,341, etc., for example, cellulose acetate, cellulose acetate / butyrate, cellulose nitrate A brush polymer film made of It may be a polyamide such as 6-nylon or 6,6-nylon, or a microporous membrane such as polyethylene or polypropylene. In addition, a porous material having continuous voids in which polymer small particles, glass particles, diatomaceous earth, and the like are bonded with a hydrophilic or non-absorbent polymer described in JP-B-53-21777, JP-A-55-90859, etc. Sex membranes can also be used.
非繊維微多孔性膜の有効孔径は０.２〜１０μｍ、好ましくは０.３〜５μｍ、特に有効なのは０．５〜３μｍである。本発明で非繊維微多孔性膜の有効孔径は、ＡＳＴＭ Ｆ３１６−７０に準拠した限界泡圧法(バブルポイント法)により測定した孔径で示す。非繊維微多孔性膜が相分離法により作られたいわゆるブラッシュ・ポリマーから成るメンブランフィルターである場合、一般に厚さ方向の液体通過経路は、膜の製造の際の自由表面側（即ち光沢面）で最も狭くなっており、液体通過経路の断面を円に近似したときの孔径は、自由表面の近くで最も小さくなっている。容積の通過経路における厚さ方向に関わる最小孔径は、さらにフィルターの面方向について分布を持っており、その最大値が粒子に対する濾過性能を決定する。通常、それは上記限界泡圧法で測定される。 The effective pore size of the non-fiber microporous membrane is 0.2 to 10 μm, preferably 0.3 to 5 μm, and particularly effective is 0.5 to 3 μm. In the present invention, the effective pore size of the non-fiber microporous membrane is shown by the pore size measured by the limiting bubble pressure method (bubble point method) based on ASTM F316-70. When the non-fibrous microporous membrane is a membrane filter made of a so-called brush polymer made by a phase separation method, the liquid passage in the thickness direction generally has a free surface side (ie, a glossy surface) when the membrane is manufactured. The hole diameter when the cross section of the liquid passage is approximated to a circle is the smallest near the free surface. The minimum pore diameter related to the thickness direction in the passage path of the volume further has a distribution in the surface direction of the filter, and the maximum value determines the filtration performance for the particles. Usually, it is measured by the above-mentioned limit bubble pressure method.
上に述べたように、相分離法により作られたいわゆるブラッシュ・ポリマーから成るメンブランフィルターでは、厚さ方向の液体通過経路は膜の製造の際の自由表面側（即ち光沢面）で最も狭くなっている。上記血液濾過ユニットに含有される濾材としてこの種の非繊維微多孔性膜を用いる場合には、出口側を、メンブランフィルターの光沢面とすることが好ましい。 As described above, in a membrane filter made of a so-called brush polymer made by a phase separation method, the liquid passage in the thickness direction is the narrowest on the free surface side (that is, the glossy surface) when the membrane is manufactured. ing. When this kind of non-fiber microporous membrane is used as the filter medium contained in the blood filtration unit, the outlet side is preferably a glossy surface of the membrane filter.
好ましい微多孔性膜はポリスルホン膜、セルロースアセテート膜等であり、特に好ましいのはポリスルホン膜である。濾過ユニットに用いる濾材はガラス繊維濾紙が血液供給側に配置され、微多孔性膜が出口側に配置される。 Preferred microporous membranes are polysulfone membranes, cellulose acetate membranes and the like, and particularly preferred are polysulfone membranes. As for the filter medium used for the filtration unit, a glass fiber filter paper is disposed on the blood supply side, and a microporous membrane is disposed on the outlet side.
上記血液濾過ユニットで使用される濾材には、ガラス繊維濾紙と微多孔性膜に加えて第３の濾材を追加することができる。この第３の濾材の例としては、濾紙、不織布、織物生地（例えば平織生地）、編物生地（例えば、トリコット編）等、繊維質多孔性層を挙げることができる。これらのうち織物、編物等が好ましい。織物等は特開昭５７−６６３５９号公報に記載されたようなグロー放電処理をしてもよい。この第３の濾材はガラス繊維濾紙と微多孔性膜の中間に配置することが好ましい。 In addition to the glass fiber filter paper and the microporous membrane, a third filter medium can be added to the filter medium used in the blood filtration unit. Examples of the third filter medium include fibrous porous layers such as filter paper, nonwoven fabric, woven fabric (for example, plain woven fabric), and knitted fabric (for example, tricot knitted fabric). Of these, woven fabric, knitted fabric and the like are preferable. The fabric or the like may be subjected to glow discharge treatment as described in JP-A-57-66359. This third filter medium is preferably disposed between the glass fiber filter paper and the microporous membrane.
上記血液濾過ユニットで使用される濾材では、その表面のみで血球をトラップする訳ではなく、ガラス繊維濾紙の厚さ方向に浸透するに従って、厚さ方向に全長にわたって血球を留め除去していく、いわゆる体積濾過作用によるものと理解される。 The filter medium used in the blood filtration unit does not trap blood cells only on the surface thereof, but permeates in the thickness direction of the glass fiber filter paper, so that the blood cells are retained and removed over the entire length in the thickness direction, so-called It is understood that this is due to volume filtration.
上記血液濾過ユニットで使用される濾材は特開昭６２−１３８７５６号公報、特開昭６２−１３８７５７号公報、特開昭６２−１３８７５８号公報、特開平２−１０５０４３号公報、特開平３−１６６５１号公報等に開示された方法に従って各層を部分的に配置された接着剤で接着して一体化することができる。 The filter media used in the above blood filtration unit are disclosed in JP-A-62-138756, JP-A-62-138757, JP-A-62-138758, JP-A-2-105043, JP-A-3-16651. Each layer can be bonded and integrated with a partially disposed adhesive in accordance with the method disclosed in Japanese Laid-Open Patent Publications.
以上に述べてきた、血球分離要素は、後述する検体（この場合は全血）を注入する要素と、多層乾式分析要素の間に配置されることが好ましいが、血球分離要素が全血を注入する要素を兼ねてもよい。血球分離要素以外の前処理要素の場合にも、同様に配置することができ、また、検体（全血である場合もある）を注入する要素を兼ねることもできる。 As described above, the blood cell separation element is preferably disposed between an element for injecting a specimen (in this case, whole blood) described later and a multilayer dry analysis element, but the blood cell separation element injects whole blood. It may also serve as an element. In the case of a pretreatment element other than the blood cell separation element, it can be arranged in the same manner, and can also serve as an element for injecting a specimen (which may be whole blood).
｛溶血｝
本発明でいう前処理の別の具体例としては、溶血を挙げることができる。検体が全血でありかつ、分析対象となる物質が血球中に含まれる成分の場合、前処理として血球の破壊つまり溶血が必要となる。例えば発明の測定対象がグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１）である場合、検体中の赤血球を十分溶血させて、赤血球中のヘモグロビンを溶液中に可溶化させる必要がある。グリコヘモグロビンを検出するための多層乾式分析要素としては、特開平９−１６６５９４号公報、特開平８−１２２３３５号公報等に記載されているようなグリコヘモグロビンに対する抗体と酵素との結合物（酵素標識抗体）を用いる技術がある。また、特開２０００−３１０６３８に記載されているような方法を用いて、糖化ヘモグロビンβ鎖のＮ末端グルコシル化ペプチドで標識された酵素及びグリコヘモグロビンに対する抗体を用いることによりグリコヘモグロビンを測定する技術もある。
これらの技術においても、該多層乾式分析要素に検体を供給する前に、血球を破壊し、溶血する必要があった。本発明においては、溶血を前処理要素で行なうことにより、分析チップを著しく性能改善することができる。
また、本発明の一体化された分析チップが上述した、グリコヘモグロビン検出するため
の多層乾式分析要素だけではなく、ヘモグロビンを検出するための多層乾式分析要素を同時に保有していてもよい。このような場合、１個の一体化された分析チップにより、ヘモグロビン量、グリコヘモグロビン量、ヘモグロビン中のグリコヘモグロビン割合（％）を測定することが可能となる。
{Hemolysis}
Another specific example of the pretreatment referred to in the present invention is hemolysis. When the sample is whole blood and the substance to be analyzed is a component contained in blood cells, blood cell destruction, that is, hemolysis is required as pretreatment. For example, when the measurement object of the invention is glycated hemoglobin (HbA1), it is necessary to sufficiently lyse erythrocytes in a specimen and solubilize hemoglobin in erythrocytes in a solution. As a multilayer dry analytical element for detecting glycated hemoglobin, a conjugate of an antibody and an enzyme against glycated hemoglobin as described in JP-A-9-166594, JP-A-8-122335, etc. (enzyme labeling) Antibody). Further, there is also a technique for measuring glycohemoglobin by using an enzyme labeled with an N-terminal glucosylated peptide of glycated hemoglobin β chain and an antibody against glycohemoglobin using a method as described in JP-A-2000-310638. is there.
Also in these techniques, it was necessary to destroy blood cells and hemolyze them before supplying the specimen to the multilayer dry analytical element. In the present invention, the performance of the analysis chip can be remarkably improved by performing hemolysis with the pretreatment element.
The integrated analysis chip of the present invention may have not only the multilayer dry analysis element for detecting glycohemoglobin described above but also a multilayer dry analysis element for detecting hemoglobin. In such a case, it is possible to measure the amount of hemoglobin, the amount of glycated hemoglobin, and the proportion (%) of glycated hemoglobin in hemoglobin with a single integrated analysis chip.
このような、溶血を行う要素（溶血要素）は、血球分離要素に前述した多孔質を有することが望ましい。また、流路内に溶血試薬を担持することにより、溶血要素としてもよい。溶血試薬は、乾燥させたものでも、溶液でもいずれでもよい。 Such an element for hemolysis (hemolysis element) desirably has the above-described porous property in the blood cell separation element. Further, a hemolytic element may be provided by carrying a hemolytic reagent in the flow path. The hemolysis reagent may be either a dried reagent or a solution.
溶血試薬としては、市販の溶血剤や界面活性剤（例えばTriton X-100）で溶血させる方法、非等張希釈液を使用して浸透圧ショックで溶血させる方法等を挙げることができる。また必要に応じ、超音波処理で赤血球膜を破壊してもよい。 Examples of the hemolytic reagent include a method of hemolyzing with a commercially available hemolytic agent and a surfactant (for example, Triton X-100), a method of hemolyzing with an osmotic shock using an isotonic diluent. If necessary, the erythrocyte membrane may be destroyed by sonication.
溶血試薬として使用できる界面活性剤としては、特開平6-11510号公報に記載された、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やジオクチルスルホ琥珀酸ナトリウム（ＤＯＮＳ）などのアニオン性界面活性剤、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＴＴＡＢ）やセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）などのカチオン性界面活性剤、カルボキシベタイン型などの両性界面活性剤などがある。また、ノニオン性界面活性剤としては、p-(1,1,3,3-テトラメチルブチル）フェノキシポリエトキシエタノール（オキシエチレン単位平均 9〜10含有 Triton X-100; オキシエチレン単位平均16含有 Triton X-165; オキシエチレン単位平均40含有 Triton X-405、いずれもChemical Abstract Registry No. 9002-93-1）のようなアルキルフェノールポリエチレンオキシド縮合物；p-ノニルフェノキシポリグリシドール（グリシドール単位平均10含有）のようなアルキルフェノールポリグリシドール縮合物；ラウリルアルコールポリエチレンオキシド縮合物（例えばBrij
35 、Chemical Abstract Registry No. 9002-92-0）；セチルアルコールポリエチレンオキシド縮合物（例えばBrij 58、Chemical Abstract Registry No. 9004-95-9）のような高級脂肪族アルコールのポリエチレンオキシド縮合物；ステアリン酸エステルポリエチレングリコール縮合物（例えばMyrj 52、 Myrj 59、いずれもChemical Abstract Registry No. 9004-99-3）のようなポリエチレングリコールの高級脂肪酸エステル縮合物；ソルビタンモノラウリン酸エステルのポリエチレングリコール縮合物（例えばTween 20、Chemical Abstract Registry No. 9005-64-5）のような高級脂肪酸ソルビタンエステルのポリエチレングリコール縮合物等がある。
Examples of surfactants that can be used as hemolytic reagents include anionic surfactants such as sodium dodecyl sulfate (SDS) and sodium dioctyl sulfosuccinate (DONS) described in JP-A-6-11510, tetradecyltrimethylammonium. There are cationic surfactants such as bromide (TTAB) and cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), and amphoteric surfactants such as carboxybetaine type. Nonionic surfactants include p- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenoxypolyethoxyethanol (triton X-100 containing oxyethylene units average 9 to 10; Triton containing oxyethylene units average 16) X-165; Containing 40 average oxyethylene units Triton X-405, both alkylphenol polyethylene oxide condensates such as Chemical Abstract Registry No. 9002-93-1); p-nonylphenoxypolyglycidol (containing 10 average glycidol units) Alkylphenol polyglycidol condensates such as: lauryl alcohol polyethylene oxide condensates (eg Brij
35, Chemical Abstract Registry No. 9002-92-0); polyethylene oxide condensates of higher aliphatic alcohols such as cetyl alcohol polyethylene oxide condensates (eg Brij 58, Chemical Abstract Registry No. 9004-95-9); stearin Higher fatty acid ester condensates of polyethylene glycols such as acid ester polyethylene glycol condensates (eg Myrj 52, Myrj 59, both Chemical Abstract Registry No. 9004-99-3); polyethylene glycol condensates of sorbitan monolaurate (eg There are polyethylene glycol condensates of higher fatty acid sorbitan esters such as Tween 20, Chemical Abstract Registry No. 9005-64-5).
本発明でいう前処理のさらに別の具体例としては、希釈を挙げることができる。検体中の成分を、免疫学的測定法、例えば酵素免疫測定法に基づいた多層乾式分析要素を用いて行う場合、予め検体を一定倍率で希釈する必要がしばしば生じる。酵素免疫測定法に基づいた多層乾式分析要素については、多層乾式酵素免疫法の技術が用いられ、例えば特開平５−２３２１１２号公報等に開示されている。これらの技術においても、検体が血清である場合、検体の希釈はしばしば必要である。 As still another specific example of the pretreatment referred to in the present invention, dilution can be mentioned. When a component in a specimen is used using a multilayer dry analytical element based on an immunological assay, for example, an enzyme immunoassay, it is often necessary to dilute the specimen in advance at a constant magnification. For the multilayer dry analytical element based on the enzyme immunoassay, the technique of the multilayer dry enzyme immunization is used, and is disclosed in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-232112. Even in these techniques, if the sample is serum, dilution of the sample is often necessary.
検体の希釈は、血清中の微量物質を測定するための免疫測定法において、共存蛋白質による免疫反応の阻害や、非特異的な吸着による測定データの信頼性の低下を防止する効果をもつ。また、酵素反応を利用するいわゆる酵素免疫測定法においては、定量的に測定できる濃度範囲（検量域）が広くないことが多い。このような場合、検体を希釈することにより、検体中に含まれる測定物質の濃度を検量域内におさめることができる。 In the immunoassay for measuring trace substances in serum, the dilution of the sample has an effect of preventing the immune reaction by the coexisting protein and the decrease in the reliability of the measurement data due to nonspecific adsorption. Also, in so-called enzyme immunoassay utilizing an enzyme reaction, the concentration range (calibration range) that can be quantitatively measured is often not wide. In such a case, by diluting the specimen, the concentration of the measurement substance contained in the specimen can be kept within the calibration range.
検体の希釈は、通常は検体と希釈液を混ぜることにより行われる。希釈液は、検出反応に適したｐＨの緩衝液を利用することが多い。また、塩濃度を調節するために塩化ナトリウム等の塩を添加してもよい。緩衝液としては、通常の生化学反応に使用される全ての緩衝液を利用することが可能であり、例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ
酸緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液等を挙げることができる。
The specimen is usually diluted by mixing the specimen and a diluent. As the diluent, a buffer solution having a pH suitable for the detection reaction is often used. Further, a salt such as sodium chloride may be added to adjust the salt concentration. As the buffer, all buffers used in normal biochemical reactions can be used. For example, phosphate buffer, acetate buffer, carbonate buffer, borate buffer, TRIS buffer, MES buffer, HEPES buffer, etc. can be mentioned.
｛検体の希釈｝
前処理要素が、検体を希釈する要素（希釈要素）であってもよい。すなわち、前処理要素自体に希釈液を含有させて希釈要素としてもよい。また、希釈液を保持する要素を前処理要素とは別に作り、希釈液を保持する要素と前処理要素を流路等で連結し、検体と該希釈液を、前処理要素内で混合してもいい。この場合、前処理要素は、検体と希釈液が混合しやすい形態をとっていることが好ましい。
{Sample dilution}
The pretreatment element may be an element for diluting the specimen (dilution element). In other words, the pretreatment element itself may contain a diluent and serve as a dilution element. In addition, the element for holding the diluent is made separately from the pretreatment element, the element for holding the diluent and the pretreatment element are connected by a flow path or the like, and the specimen and the diluent are mixed in the pretreatment element. Also good. In this case, it is preferable that the pretreatment element has a form in which the specimen and the diluent are easily mixed.
｛タンパク質の分解｝
本発明でいう前処理のさらに別の具体例としては、蛋白質の分解が挙げられる。分析されうる物質が蛋白質である場合、該蛋白質をあらかじめ蛋白質分解酵素により限定分解したのち分析要素に供給することがある。
前処理要素は、蛋白質を分解する要素（タンパク質分解要素）であってもよい。
{Protein degradation}
Another specific example of the pretreatment referred to in the present invention is protein degradation. When the substance that can be analyzed is a protein, the protein may be limitedly decomposed by a proteolytic enzyme before being supplied to the analysis element.
The pretreatment element may be an element that degrades protein (proteolysis element).
例えば、糖化タンパク質を検出する場合、検体中の対象となる糖化タンパク質を、プロテアーゼ等により分解したのち、プロテアーゼ処理物中の糖化アミノ酸を、糖化アミノ酸酸化酵素等により、生成した過酸化水素を検出することにより、該糖化タンパク質を検出することができる。この技術は、例えば特開２００１−５４３９８号公報、特開平１１−１５５５９６号公報に記載されている。検出されるタンパク質の例としては、糖化アルブミン、糖化グロブリン、糖化ヘモグロビン、糖化カゼイン等があげられる。また、検体としては、例えば、血液、血清、血漿、牛乳、醤油等があげられる。 For example, when detecting a glycated protein, the target glycated protein in the sample is decomposed with a protease, and then the glycated amino acid in the protease-treated product is detected with the glycated amino acid oxidase or the like to detect the generated hydrogen peroxide. Thus, the glycated protein can be detected. This technique is described in, for example, JP-A-2001-54398 and JP-A-11-155596. Examples of the protein to be detected include glycated albumin, glycated globulin, glycated hemoglobin, glycated casein and the like. Examples of the sample include blood, serum, plasma, milk, soy sauce and the like.
本発明においてタンパク質の分解に使用しうるプロテアーゼは、被検液に含まれるタンパク質に有効に作用するものであればいかなるものを用いてもよく、例えば動物、植物、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。具体的な例を以下に示すがこれらは１例に過ぎず、なんら限定されるものではない。 Any protease may be used as the protease that can be used for protein degradation in the present invention as long as it effectively acts on the protein contained in the test solution. Examples include proteases derived from animals, plants, and microorganisms. . Although a specific example is shown below, these are only examples and are not limited at all.
動物由来のプロテアーゼの例としては、エラスターゼ(Elastase)、トリプシン(Tripsin) 、キモトリプシン(Chymotripsin)、ペプシン(Pepsin)、牛膵臓プロテアーゼ、カテプシン(Cathepsin) 、カルパイン(Calpain) 、プロテアーゼタイプ-I、プロテアーゼタイプ-XX(以上シグマ社製）、アミノペプチダーゼＭ (AminopeptidaseM)、カルボキシペプチダーゼＡ(Carboxypeptidase Ａ)(以上ベーリンガー・マンハイム社製）、パンクレアチン(Pancreatin ：和光純薬製)等が挙げられる。 Examples of animal-derived proteases include elastase, trypsin, chymotripsin, pepsin, bovine pancreatic protease, cathepsin, calpain, protease type-I, protease type -XX (manufactured by Sigma), aminopeptidase M (Aminopeptidase M), carboxypeptidase A (Carboxypeptidase A) (manufactured by Boehringer Mannheim), pancreatin (Pancreatin: manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and the like.
植物由来のプロテアーゼの例としては、カリクレイン(Kallikrein)、フィシン(Ficin) 、パパイン(Papain)、キモパパイン(Chimopapain) 、ブロメライン(Bromelain)(以上シグマ社製)、パパインW-40、ブロメラインＦ（以上天野製薬社製）等が挙げられる。 Examples of plant-derived proteases include kallikrein, ficin, papain, chimopapain, bromelain (manufactured by Sigma), papain W-40, bromelain F (above Amano). And the like).
微生物由来のプロテアーゼの例としては、下記 (1)〜(14)が挙げられる。
(1) バチルス(Bacillus)属由来プロテアーゼ；ズブチリシン(Subtilisin)、プロテアーゼ−タイプ -VIII、-IX 、-X、-XV 、-XXIV 、-XXVII、−XXXI（以上、シグマ社製）、サーモリシン(thermolysin) 、ナガーゼ(Nagarse)(以上、和光純薬社製）、オリエンターゼ-90N、-10NL 、-22BF 、-Y、-5BL、ヌクレイシン（以上、阪急バイオインダストリー社製）、プロレザー、プロテアーゼ-N、-NL 、-S「アマノ」（以上、天野製薬社）、GODO-BNP、-BAP (以上、合同酒清社精製）、プロチン-A、-P、デスキン、デピレイス、ビオソーク、サモアーゼ（以上、大和化成社製）、トヨチームNEP(東洋紡績社製）、ニュートラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、デュラザイム、バイオフィードプロ、アルカラーゼ、NUE 、ピラーゼ、クリアーレンズプロ、エバラーゼ、ノボザイム-FM 、ノボラン（以上、ノボノルディスクバイオインダストリー社製）、エンチロン-NBS、-SA(以上、洛東化成工業社製）、アルカリプロテアーゼ GL440、オプティクリーン -M375プラス、-L1000、-ALP440(以上、協和発酵社製）、ビオプラーゼAPL-30、SP-4FG、XL-416F 、AL-15FG(以上、ナガセ生化学工業社製）、アロアーゼAP-10 、プロテアーゼＹ、（以上、ヤクルト薬品工業社製）、コロラーゼ-N、-7089 、ベロンＷ（以上、樋口商会社製）、キラザイム P-1(ロシュ社製)等。
Examples of the microorganism-derived protease include the following (1) to (14).
(1) Bacillus-derived protease; Subtilisin, protease-types -VIII, -IX, -X, -XV, -XXIV, -XXVII, -XXXI (above, manufactured by Sigma), thermolysin ), Nagase (above, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Orientase-90N, -10NL, -22BF, -Y, -5BL, Nucleicin (above, produced by Hankyu BioIndustry), Pro Leather, Protease-N , -NL, -S “Amano” (above, Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), GODO-BNP, -BAP (above, combined sake refined), Protin-A, -P, Deskin, Depilace, Biosoak, Samoaze (above, Daiwa Kasei Co., Ltd.), Toyoteam NEP (Toyobo Co., Ltd.), Neutase, Esperase, Sabinase, Durazyme, Biofeed Pro, Alcalase, NUE, Pyrase, Clear Lens Pro, Everase, Novozyme-FM, Novorane (above, Novonordisk Bio-Industry), Entilon-NBS, -SA (above, manufactured by Nitto Kasei Kogyo Co., Ltd.), Alkaline Protease GL440, Opticlean -M375 Plus, -L1000, -ALP440 (above, manufactured by Kyowa Hakko) Biolase APL-30, SP-4FG, XL-416F, AL-15FG (above, manufactured by Nagase Seikagaku Corporation), Aroase AP-10, Protease Y (above, produced by Yakult Pharmaceutical Co., Ltd.), Corolase-N,- 7089, Belon W (above, manufactured by Higuchi Trading Company), Kirazame P-1 (Roche).
(2) アスペルギルス(Aspergillus) 属由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプ−XIII, -XIX, -XXIII (以上、シグマ社製）、スミチーム -MP、-AP 、-LP 、-FP 、LPL, エンザイムP-3(以上、新日本化学工業株式会社製）、オリエンターゼ-20A、-ONS、-ON5、テトラーゼＳ（以上、阪急バイオインダストリー社製）、ニューラーゼＡ、プロテアーゼ-A、-P、-M「アマノ」（以上、天野製薬社）、IP酵素、モルシンＦ、AOプロテアーゼ（以上、キッコーマン社製）、プロチン-F、-FN 、-FA(以上、大和化成社製）、デナプシン２Ｐ、デナチーム -SA-7、-AP 、デナザイム AP(以上、ナガセ生化学工業社製）、プロテアーゼYP-SS 、パンチダーゼ -NP-2、-P (以上、ヤクルト社製）、サカナーゼ（科研ファルマ社製）、フレーバーザイム（ノボノルディスクバイオインダストリー社製）、ベロンＰＳ（樋口商会社製）等。 (2) Aspergillus-derived protease; Protease type -XIII, -XIX, -XXIII (above, manufactured by Sigma), Sumiteam -MP, -AP, -LP, -FP, LPL, Enzyme P-3 (above , Manufactured by Shin Nippon Chemical Industry Co., Ltd.), Orientase-20A, -ONS, -ON5, Tetolase S (above, manufactured by Hankyu Bioindustry), Newase A, Protease-A, -P, -M "Amano" ( Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), IP enzyme, Morsin F, AO protease (above, manufactured by Kikkoman Corp.), Protin-F, -FN, -FA (above, produced by Daiwa Kasei Co., Ltd.), Denapsin 2P, Denateam-SA-7, -AP, Denozyme AP (above, manufactured by Nagase Seikagaku Corporation), Protease YP-SS, Punchase-NP-2, -P (above, produced by Yakult), Sakanase (produced by Kaken Pharma), Flavorzyme (Novonor) Disk bio industry), Vero PS (Higuchi commerce company, Ltd.), and the like.
(3) リゾパス(Rhizopus)属由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプ XVIII (シグマ社製）、ペプチダーゼＲ、ニューラーゼＦ（以上、天野製薬社製）、XP-415(ナガセ生化学工業社製）等。
(4) ペニシリウム(Penicillium) 属由来プロテアーゼ；PD酵素（キッコーマン社製）等。(5) ストレプトマイセス(Streptomyces)属由来プロテアー；プロテアーゼ−タイプ XIV；別称 Pronase、-XXI (以上、シグマ社製）、アクチナーゼ -AS、-AF(以上、科研ファルマ社製)、タシナーゼ（協和発酵社製）、alkalofilicproteinase(東洋紡社製)等。
(3) Protease derived from genus Rhizopus; protease type XVIII (manufactured by Sigma), peptidase R, newase F (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), XP-415 (manufactured by Nagase Seikagaku Corporation), etc.
(4) Penicillium-derived protease; PD enzyme (Kikkoman) (5) Protears derived from the genus Streptomyces; Protease-type XIV; Also known as Pronase, -XXI (above, manufactured by Sigma), Actinase-AS, -AF (above, made by Kaken Pharma), Tasinase (Kyowa Hakko) Alkalofilic proteinase (manufactured by Toyobo).
(6) スタフィロコッカス(Staphylococcus)属由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプXVII
(シグマ社製）等。
(7) クロストリジウム(Clostridium) 属由来プロテアーゼ；クロストリパイン（Clostripain)、ノンスペシフィック ニュートラルプロテアーゼ（nonspesificproteinase) (以上、シグマ社製）等。
(8) リソバクター(Lysobacter)属由来プロテアーゼ；エンドプロテイナーゼLys-c(シグマ社製)等。
(6) Protease derived from the genus Staphylococcus; protease type XVII
(Manufactured by Sigma) etc.
(7) Proteases derived from the genus Clostridium; Clostripain, non-specific neutral protease (manufactured by Sigma), etc.
(8) Protease derived from genus Lysobacter; endoproteinase Lys-c (manufactured by Sigma), etc.
(9) グリフォラ(Grifola) 属由来プロテアーゼ；メタロエンドペプチダーゼ(Metalloendopeputidase; シグマ社製）等。
(10) 酵母(Yeast) 属由来プロテアーゼ；プロテイナーゼＡ(Proteinase Ａ；シグマ社製）、カルボキシペプチダーゼＹ(carboxypeptid aseＹ; ベーリンガー・マンハイム社製）等。
(11) トリチラチウム(Tritirachium)属由来プロテアー；プロテイナーゼＫ(Proteinase Ｋ；シグマ社製)等。
(9) Protease derived from the genus Grifola; Metalloendopeptidase (manufactured by Sigma), etc.
(10) Yeast genus-derived protease; proteinase A (Proteinase A; manufactured by Sigma), carboxypeptidase Y (carboxyleptidase Y; manufactured by Boehringer Mannheim), etc.
(11) Protears derived from the genus Tritirachium; Proteinase K (manufactured by Sigma) and the like.
(12) サーマス(Thermus) 属由来プロテアーゼ；アミノペプチダーゼＴ(Aminopeptidase Ｔ；ベーリンガー・マンハイム社製）等。
(13) シュードモナス(Pseudomonus) 属由来プロテアーゼ；エンドプロテイナーゼAsp-N(EndoproteinaseAsp-Ｎ；和光純薬社製)等。
(14) アクロモバクター(Achromobacter) 属由来プロテアーゼ；リジルエンドペプチダーゼ(LysylEndopeputidase) 、アクロモペプチダーゼ（以上和光純薬社製）等。
(12) Thermus-derived protease; aminopeptidase T (manufactured by Boehringer Mannheim) and the like.
(13) Pseudomonus genus-derived protease; endoproteinase Asp-N (EndoproteinaseAsp-N; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and the like.
(14) Proteases derived from the genus Achromobacter; Lysyl Endopeputidase, Achromopeptidase (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and the like.
他のタンパク質分解酵素としては、酵素の種類は特に制限されず、例えば、プロテアーゼＫ、ズブチリシン、トリプシン、アミノペプチダーゼ、糖化ペプチドプロテアーゼ等が
使用できる。
As another proteolytic enzyme, the kind of the enzyme is not particularly limited, and for example, protease K, subtilisin, trypsin, aminopeptidase, glycated peptide protease and the like can be used.
タンパク質分解に使用される酵素は、タンパク質分解要素に直接固定化されていてもいいし、また乾燥状態で含有されていてもよい。また、別の好ましい例としては、前述したような微粒子に担持した後にタンパク質分解要素内に含有させてもよい。 The enzyme used for proteolysis may be directly immobilized on the proteolytic element, or may be contained in a dry state. As another preferred example, the protein may be contained in the proteolytic element after being supported on the fine particles as described above.
酵素を分析チップ内の前処理要素へ固定するのは、特に限定なく、共有結合法、物理吸着法、イオン結合法等いずれによっても可能である。特に、本発明の分析チップが、マイクロチップの形態を取る場合、例えば特開２００４−１２５４０６号公報に記載した技術を利用することも好ましい。また、特開２００４−６１４９６号公報に記載されているように、ビーズや微粒子に担持することも好ましい。 Immobilization of the enzyme to the pretreatment element in the analysis chip is not particularly limited, and can be performed by any method such as a covalent bond method, a physical adsorption method, and an ion bond method. In particular, when the analysis chip of the present invention takes the form of a microchip, it is also preferable to use the technique described in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-125406. Further, as described in JP-A No. 2004-61496, it is preferable to support the beads or fine particles.
｛タンパク質の変性｝
本発明における前処理の別の具体例としては、蛋白質の変性をあげることができる。検体中の成分をイムノアッセイ等の抗原抗体の結合反応を利用する検出方法に基づいた多層乾式分析要素を用いて行う場合、検体中の標的蛋白質と抗体試薬とが結合することが必須である。しかし、該蛋白質中の抗体と結合する部分（エピトープ）が、蛋白質内部に存在するため、抗体試薬との反応が速やかに進行しないという問題がしばしば生じる。本発明の分析チップは、前処理要素として、蛋白質変性剤を保持する要素（タンパク質変性要素）を有してもよい。タンパク質変性要素に含有される蛋白質変性剤が、検体に添加され、蛋白質を変性せしめ、該エピトープを蛋白質表面に露出させ、抗原抗体反応を促進させることができる。蛋白質変性剤の例としては例えばカオトロピック試薬や界面活性剤、有機溶媒などをあげることができる。
{Protein denaturation}
Another specific example of the pretreatment in the present invention is protein denaturation. When a component in a sample is used using a multilayer dry analytical element based on a detection method that utilizes an antigen-antibody binding reaction such as an immunoassay, it is essential that the target protein in the sample binds to the antibody reagent. However, since a portion (epitope) that binds to the antibody in the protein is present inside the protein, there is often a problem that the reaction with the antibody reagent does not proceed rapidly. The analysis chip of the present invention may have an element for holding a protein denaturant (protein denaturing element) as a pretreatment element. A protein denaturing agent contained in the protein denaturing element can be added to the specimen to denature the protein, expose the epitope on the protein surface, and promote the antigen-antibody reaction. Examples of protein denaturing agents include chaotropic reagents, surfactants, organic solvents, and the like.
｛内因性物質の除去｝
本発明で言う前処理のさらに別の具体例としては、内因性物質の除去を挙げることができる。検体が例えば血清や、全血である場合、該検体中に含まれている成分（内因性物質）が目的とする成分の検出に影響を与えることがしばしばあり、分析要素に検体を供給する前に該内因性物質を除去したり、その活性を低下させる必要が生じる。
前処理要素は、内因性物質を除去する要素であってもよい。
{Removal of endogenous substances}
Another specific example of the pretreatment referred to in the present invention is removal of endogenous substances. When the sample is, for example, serum or whole blood, the component (endogenous substance) contained in the sample often affects the detection of the target component, and before supplying the sample to the analysis element Therefore, it is necessary to remove the endogenous substance or reduce its activity.
The pretreatment element may be an element that removes endogenous substances.
内因性物質が酵素である場合には、内因性物質を除去する要素は、該酵素に特異的に働く阻害剤を保持してもよい。該阻害剤により該酵素の活性を阻害することにより該酵素を除去したのと同じ効果がある。
例えば、酵素免疫測定法において、検出に利用する酵素（標識酵素）が検体内にも存在する場合、内因性の酵素が反応の検出を著しく阻害する場合がある。特開平１−２３７４５５号公報、特開平１−３２１３６０号公報、特開平１−３２１３６１号公報に記載されているような枯草菌のアミラーゼを標識酵素を使用する酵素免疫測定法の場合、血清中に存在するアミラーゼが検出の精度を低下させることがしばしばある。このような現象をふせぐため、血清中のアミラーゼに特異的な阻害剤を検体と反応させることにより、内因性のアミラーゼの影響を除去できる。
In the case where the endogenous substance is an enzyme, the element that removes the endogenous substance may hold an inhibitor that specifically acts on the enzyme. The inhibitor has the same effect as removing the enzyme by inhibiting the activity of the enzyme.
For example, in an enzyme immunoassay, when an enzyme (labeled enzyme) used for detection is also present in a sample, the endogenous enzyme may significantly inhibit the detection of the reaction. In the case of an enzyme immunoassay using a labeling enzyme for Bacillus subtilis amylase as described in JP-A-1-237455, JP-A-1-321360, and JP-A-1-321361, The amylase present often reduces the detection accuracy. In order to prevent such a phenomenon, the influence of endogenous amylase can be eliminated by reacting an inhibitor specific for amylase in serum with a sample.
また、内因性物質が酵素基質である場合には、内因性物質を除去する要素は、酵素を保持して酵素基質を該酵素により分解することができる。また、内因性物質を除去する要素は、抗体等の特異的吸着物質を保持して酵素基質を除去することができる。
例えば、血清中に存在するアスコルビン酸（及びその誘導体）は、分析要素の酸化還元発色系に著しく影響を与えることがある。このような場合、予め内因性のアスコルビン酸を除去する必要がある。アスコルビン酸の除去には、主にアスコルビン酸酸化酵素を使用するが、また、特開平9-089867号公報、特開平07-303497号公報、特開平11-309466号公報等に記載の方法が利用できる。
When the endogenous substance is an enzyme substrate, the element for removing the endogenous substance can hold the enzyme and decompose the enzyme substrate with the enzyme. The element that removes the endogenous substance can retain a specific adsorbent such as an antibody and remove the enzyme substrate.
For example, ascorbic acid (and its derivatives) present in serum can significantly affect the redox coloring system of the analytical element. In such a case, it is necessary to remove endogenous ascorbic acid in advance. For removal of ascorbic acid, ascorbate oxidase is mainly used, and the methods described in JP-A-9-089867, JP-A-07-303497, JP-A-11-309466, etc. are used. it can.
内因性物質を除去する要素は、該内因性物質そのものまたはその活性を、除去する試薬を含有している必要がある。このような試薬は、前処理要素に直接固定化されていてもいいし、また乾燥状態で含有されていてもよい。また、別の好ましい例としては、微粒子に担持した後に前処理要素内に含有させてもよい。 The element that removes the endogenous substance needs to contain a reagent that removes the intrinsic substance itself or its activity. Such a reagent may be directly fixed to the pretreatment element, or may be contained in a dry state. As another preferred example, after being supported on fine particles, the fine particles may be contained in the pretreatment element.
酵素を分析チップ内の前処理要素へ固定するのは、特に限定なく、公知の技術を用いることができる。例えば、｛タンパク質の分解｝の項において前記したのと同じに行うことができる。ビーズや微粒子に担持することも好ましい。 There is no particular limitation on fixing the enzyme to the pretreatment element in the analysis chip, and a known technique can be used. For example, it can be carried out in the same manner as described above in {Proteolysis}. It is also preferable to carry it on beads or fine particles.
[抗原抗体反応]
本発明で言う前処理の更に別の具体例として、抗原抗体反応を挙げることができる。検体中の成分を分析する際に、その成分が抗原抗体反応における抗原である場合、抗体である場合の各々に応じて分析手段が異なってくるが、どちらの場合であっても分析することができる。
検体中において、分析しようとする成分が抗原である場合、抗体を担持させた微粒子・メッシュ・ピラー・多孔質体などの物質を前処理要素に固定する、あるいは抗体を前処理要素部材に直接担持させるなどして、抗原を前処理要素内に捕捉して、捕捉できなかった抗原の量を分析する、あるいは後の工程で捕捉した抗原を前処理要素内から除去することで捕捉した抗原の量を分析することができる。また、前処理要素に抗体−酵素複合体を担持させて、検体中の抗原の量を酵素活性に変換して求める方法を用いてもよい。また、前処理要素に抗原あるいは抗原アナローグ（抗原類似物質）−酵素複合体を担持させて、抗原を含む液と検体を混合させたものを前処理要素に導入することにより、検体中の抗原の量を酵素活性に変換して求める方法を用いてもよい。
これとは逆に、検体中において、分析しようとする成分が抗体である場合、前述の抗原と抗体を逆にした前処理要素とすることで、検体中の抗体の量を求めることができる。
[Antigen-antibody reaction]
Still another specific example of the pretreatment referred to in the present invention is an antigen-antibody reaction. When analyzing a component in a specimen, if the component is an antigen in an antigen-antibody reaction, the analysis means will differ depending on the case of being an antibody. it can.
When the component to be analyzed in the sample is an antigen, the substance such as fine particles, mesh, pillars, and porous bodies carrying the antibody is fixed to the pretreatment element, or the antibody is directly carried on the pretreatment element member. The amount of the antigen captured by capturing the antigen in the pretreatment element and analyzing the amount of the antigen that could not be captured, or removing the antigen captured in a later step from the pretreatment element. Can be analyzed. Alternatively, a method may be used in which an antibody-enzyme complex is supported on the pretreatment element and the amount of the antigen in the specimen is converted into enzyme activity. In addition, the antigen or antigen analog (antigen-like substance) -enzyme complex is supported on the pretreatment element, and a mixture of the antigen-containing liquid and the specimen is introduced into the pretreatment element, so that the antigen in the specimen is mixed. You may use the method of converting and calculating | requiring quantity to enzyme activity.
On the contrary, when the component to be analyzed in the sample is an antibody, the amount of the antibody in the sample can be determined by using a pretreatment element in which the antigen and the antibody are reversed.
［多層乾式分析要素］
本発明では、一体化された分析チップの検出系に多層乾式分析要素を使用する。多層乾式分析要素は、検体中の成分を検出するための試薬を含む。乾式分析要素は、いわゆるドライケミストリーを使用した分析要素のことである。本発明では、一体化された分析チップの検出系に、多層乾式分析要素を使用することにより、試薬が乾燥状態で安定であること、検体の水分だけで反応が進行することによって、迅速に検出が可能となる。
[Multi-layer dry analysis element]
In the present invention, a multilayer dry analysis element is used for the detection system of the integrated analysis chip. The multilayer dry analytical element includes a reagent for detecting a component in the specimen. The dry analytical element is an analytical element using so-called dry chemistry. In the present invention, by using a multilayer dry analysis element in the detection system of the integrated analysis chip, the reagent is stable in the dry state, and the reaction proceeds only with the moisture of the specimen, so that the detection can be quickly performed. Is possible.
本発明でいう多層乾式分析要素とは、検体中の被測定成分の定性・定量分析に必要な全てのまたはその一部分の試薬を１層以上の層に組み込んだ乾式分析要素のことをいう。いわゆるドライケミストリーを使用した分析要素である。具体的には、このような多層乾式分析要素の例は、富士フイルム研究報告、第４０号（富士写真フイルム株式会 社、１９９５年発行）ｐ．８３や、臨床病理、臨時増刊、特集第１０６号、ドライケミストリー・簡易検査の新たなる展開（臨床病理刊行会、１９９７年発行） 等に記載されているものをあげることができる。 The multilayer dry analysis element referred to in the present invention refers to a dry analysis element in which all or a part of reagents necessary for qualitative / quantitative analysis of a component to be measured in a sample are incorporated in one or more layers. It is an analytical element using so-called dry chemistry. Specifically, an example of such a multilayer dry analytical element is described in Fuji Film Research Report, No. 40 (Fuji Photo Film Co., Ltd., 1995) p. 83, clinical pathology, extra edition, special feature No. 106, new development of dry chemistry / simplified test (Clinical Pathology Publication, published in 1997), and the like.
上記した多層乾式分析要素は、通常少なくとも一つの機能層を含む。機能層の数は一つ以上であれば特に限定されず、１層でもよいし、２層以上の複数の層とすることもできる。 The multilayer dry analytical element described above usually includes at least one functional layer. The number of functional layers is not particularly limited as long as it is one or more, and may be one layer or a plurality of layers of two or more layers.
機能層の具体例としては、展開層、展開層と展開層以外の機能層とを接着する接着層、液状試薬を吸水する吸水層、化学反応により生成した色素の拡散を防止する媒染層、ガスを選択的に透過させるガス透過層、層間での物質移動を抑制・促進させる中間層、反射測光を安定に行うための光遮蔽層、内因性色素の影響を抑制する色遮蔽層、分析対象物と反
応する試薬を含む試薬層、発色剤を含む発色層などが挙げられ、これらは必要に応じて適宜選択することができる。
Specific examples of the functional layer include a spreading layer, an adhesive layer that bonds the spreading layer and a functional layer other than the spreading layer, a water absorbing layer that absorbs liquid reagent, a mordant layer that prevents diffusion of a dye generated by a chemical reaction, a gas A gas permeable layer that selectively transmits light, an intermediate layer that suppresses and promotes mass transfer between layers, a light shielding layer for stably performing reflection photometry, a color shielding layer that suppresses the influence of endogenous dyes, and an analyte A reagent layer containing a reagent that reacts with the coloring agent, a coloring layer containing a coloring agent, and the like, and these can be appropriately selected as necessary.
多層乾式分析要素の一例としては、例えば、支持体の上には、場合によっては下塗層等の他の層を介して、機能層として親水性ポリマー層を設けることができる。親水性ポリマー層としては、例えば、無孔性、吸水性かつ水浸透性の層であり、基本的に親水性ポリマーのみなる吸水層、親水性ポリマーをバインダーとし発色反応に直接関与する発色試薬の一部又は全部を含む試薬層、及び親水性ポリマー中に発色色素を固定し不動にする成分（例：媒染剤）を含有する検出層などを設けることができる。 As an example of the multilayer dry analytical element, for example, a hydrophilic polymer layer can be provided on the support as a functional layer via another layer such as an undercoat layer in some cases. The hydrophilic polymer layer is, for example, a non-porous, water-absorbing and water-permeable layer, basically a water-absorbing layer consisting only of a hydrophilic polymer, or a coloring reagent that directly participates in a coloring reaction using a hydrophilic polymer as a binder. A reagent layer including a part or all of it, and a detection layer containing a component (for example, mordant) that fixes and immobilizes the coloring dye in the hydrophilic polymer can be provided.
（展開層）
多層乾式分析要素の展開層はその上側表面（支持体から遠い側の表面）に点着供給された水性液体試料（例、血液（全血、血漿、血清）、リンパ液、唾液、髄液、膣液、尿、飲料水、ジュース、酒類、川水、工場排水等) を水性液体試料中に含有されている成分を実質的に偏在させることなしに横方向に拡げ単位面積当りほぼ一定容量の割合で親水性ポリマーを含む吸水性の試薬層又は吸水層に供給する作用（展開作用、展延作用、又はメータリング作用といわれる）をする層である。
多孔性の展開層が好ましく、例えば、特開昭49-53888等に記載のメンブランフィルタに代表される非繊維性等方的微多孔質媒体層、特開昭55-90859等に記載のポリマーミクロビーズが水不膨潤性の接着剤で点接触状に接着されてなる連続空隙含有三次元格子粒状構造物層に代表される非繊維性多孔性展開層、特開昭55-164356、特開昭57-66359等に記載の織物布地からなる多孔性展開層、特開昭60-222769等に記載の編物布地からなる多孔性展開層等がある。
(Development layer)
The development layer of the multilayer dry analytical element is an aqueous liquid sample (eg, blood (whole blood, plasma, serum), lymph, saliva, spinal fluid, vagina, etc.) applied to the upper surface (surface far from the support). Liquid, urine, drinking water, juice, liquor, river water, factory effluent, etc.) in a lateral direction without substantially uneven distribution of the components contained in the aqueous liquid sample. It is a layer that has a function of supplying to a water-absorbing reagent layer or a water-absorbing layer containing a hydrophilic polymer (referred to as spreading action, spreading action, or metering action).
A porous spreading layer is preferable, for example, a non-fibrous isotropic microporous medium layer represented by a membrane filter described in JP-A-49-53888 or the like, and a polymer microscopic layer described in JP-A-55-90859 or the like. Non-fibrous porous spreading layer represented by a continuous void-containing three-dimensional lattice granular structure layer in which beads are bonded in a point contact manner with a water non-swellable adhesive, JP-A-55-164356, JP-A Examples thereof include a porous spreading layer made of a woven fabric described in 57-66359 and the like, and a porous spreading layer made of a knitted fabric described in JP-A-60-222769 and the like.
（試薬層）
試薬層は水性液体中の被検成分と反応して光学的に検出可能な変化を生じる試薬組成物の少なくとも一部が親水性ポリマーバインダー中に実質的に一様に分散されている吸水性で水浸透性の層である。この試薬層には指示薬層、発色層なども含まれる。
(Reagent layer)
The reagent layer is a water-absorbing material in which at least a portion of the reagent composition that reacts with a test component in an aqueous liquid to produce an optically detectable change is substantially uniformly dispersed in the hydrophilic polymer binder. It is a water-permeable layer. This reagent layer also includes an indicator layer, a coloring layer and the like.
試薬層のバインダーとして用いることができる親水性ポリマーは、一般には水吸収時の膨潤率が３０℃で約１５０％から約２０００％、好ましくは約２５０％から約１５００％の範囲の天然または合成親水性ポリマーである。そのような親水性ポリマーの例としては、特開昭６０−１０８７５３号公報等に開示されているゼラチン（例、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（例、フタル化ゼラチン、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等）、アガロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等をあげることができる。 Hydrophilic polymers that can be used as a binder in the reagent layer generally have natural or synthetic hydrophilic properties with a water swell ratio of from about 150% to about 2000%, preferably from about 250% to about 1500% at 30 ° C. Polymer. Examples of such hydrophilic polymers include gelatin (eg, acid-treated gelatin, deionized gelatin, etc.) and gelatin derivatives (eg, phthalated gelatin, hydroxyacrylate) disclosed in JP-A-60-108753 and the like. Graft gelatin, etc.), agarose, pullulan, pullulan derivatives, polyacrylamide, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone and the like.
試薬層は架橋剤を用いて適宜に架橋硬化された層とすることができる。架橋剤の例として、例えばゼラチンに対する１，２−ビス（ビニルスルホニルアセトアミド）エタン、ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル等の公知のビニルスルホン系架橋剤、アルデヒド等、メタリルアルコールコポリマーに対するアルデヒド、２個のグリシジル基含有エポキシ化合物等がある。 The reagent layer can be a layer that is appropriately crosslinked and cured using a crosslinking agent. Examples of crosslinking agents include, for example, known vinyl sulfone crosslinking agents such as 1,2-bis (vinylsulfonylacetamido) ethane and bis (vinylsulfonylmethyl) ether for gelatin, aldehydes, aldehydes for methallyl alcohol copolymers, 2 There are glycidyl group-containing epoxy compounds.
試薬層の乾燥時の厚さは約１μｍから約１００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは約３μｍから約３０μｍの範囲である。また試薬層は実質的に透明であることが好ましい。 The dry thickness of the reagent layer is preferably in the range of about 1 μm to about 100 μm, more preferably in the range of about 3 μm to about 30 μm. The reagent layer is preferably substantially transparent.
多層乾式分析要素の試薬層やその他の層に含める試薬としては、被験物質に応じてその検出に適した試薬を選択することができる。 As a reagent to be included in the reagent layer and other layers of the multilayer dry analytical element, a reagent suitable for the detection can be selected according to the test substance.
（光遮蔽層）
前記試薬層の上に必要に応じて光遮蔽層を設けることができる。光遮蔽層は、光吸収性または光反射性（これらを合わせて光遮蔽性という。）を有する微粒子が少量の被膜形成能を有する親水性ポリマーバインダーに分散保持されている水透過性または水浸透性の層である。光遮蔽層は試薬層にて発生した検出可能な変化（色変化、発色等）を光透過性を有する支持体側から反射測光する際に、展開層に点着供給された水性液体の色、特に試料が全血である場合のヘモグロビンの赤色等、を遮蔽するとともに光反射層または背景層としても機能する。
(Light shielding layer)
A light shielding layer can be provided on the reagent layer as necessary. The light shielding layer has water permeability or water penetration in which fine particles having a light absorbing property or light reflecting property (collectively referred to as light shielding property) are dispersed and held in a hydrophilic polymer binder having a small amount of film forming ability. Is a sex layer. The light shielding layer reflects the color of the aqueous liquid spotted and supplied to the spreading layer when the photometric measurement of a detectable change (color change, color development, etc.) generated in the reagent layer is reflected from the support side having light permeability. It shields the red color of hemoglobin when the sample is whole blood and functions as a light reflection layer or a background layer.
光反射性を有する微粒子の例としては、二酸化チタン微粒子（ルチル型、アナターゼ型またはブルカイト型の粒子径が約０．１μｍから約１．２μｍの微結晶粒子等）、硫酸バリウム微粒子、アルミニウム微粒子または微小フレーク等を挙げることができ、光吸収性微粒子の例としては、カーボンブラック、ガスブラック、カーボンミクロビーズ等を挙げることができ、これらのうちでは二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子が好ましい。特に好ましいのは、アナターゼ型二酸化チタン微粒子である。 Examples of the light-reflecting fine particles include titanium dioxide fine particles (rutile type, anatase type or brookite type fine crystal particles having a particle diameter of about 0.1 μm to about 1.2 μm, etc.), barium sulfate fine particles, aluminum fine particles or Examples of the light-absorbing fine particles include carbon black, gas black, and carbon micro beads. Among these, titanium dioxide fine particles and barium sulfate fine particles are preferable. Particularly preferred are anatase-type titanium dioxide fine particles.
被膜形成能を有する親水性ポリマーバインダーの例としては、前述の試薬層の製造に用いられる親水性ポリマーと同様の親水性ポリマーのほかに、弱親水性の再生セルロース、セルロースアセテート等を挙げることができ、これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい。なお、ゼラチン、ゼラチン誘導体は公知の硬化剤（架橋剤）を混合して用いることができる。 Examples of the hydrophilic polymer binder having a film-forming ability include weakly hydrophilic regenerated cellulose, cellulose acetate, etc. in addition to the hydrophilic polymer similar to the hydrophilic polymer used in the production of the reagent layer described above. Of these, gelatin, gelatin derivatives, polyacrylamide and the like are preferable. In addition, gelatin and a gelatin derivative can be used by mixing a known hardening agent (crosslinking agent).
光遮蔽層は、光遮蔽性微粒子と親水性ポリマーとの水性分散液を公知の方法により試薬層の上に塗布し乾燥することにより設けることができる。また光遮蔽層を設ける代りに、前述の展開層中に光遮蔽性微粒子を含有させてもよい。 The light shielding layer can be provided by applying an aqueous dispersion of light shielding fine particles and a hydrophilic polymer on the reagent layer by a known method and drying. Further, instead of providing the light shielding layer, light spreading fine particles may be contained in the above-described spreading layer.
（接着層）
試薬層の上に、場合によっては光遮蔽層等の層を介して、展開層を接着し積層するために接着層を設けてもよい。
(Adhesive layer)
An adhesive layer may be provided on the reagent layer in order to adhere and laminate the spreading layer, optionally via a layer such as a light shielding layer.
接着層は水で湿潤しているとき、または水を含んで膨潤しているときに展開層を接着することができ、これにより各層を一体化できるような親水性ポリマーからなることが好ましい。接着層の製造に用いることができる親水性ポリマーの例としては、試薬層の製造に用いられる親水性ポリマーと同様な親水性ポリマーがあげられる。これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい。
接着層の乾燥膜厚は一般に約０．５μｍから約２０μｍ、好ましくは約１μｍから約１０μｍの範囲である。
The adhesive layer is preferably made of a hydrophilic polymer that can adhere the spreading layer when wetted with water or when swollen with water, thereby allowing the layers to be integrated. Examples of the hydrophilic polymer that can be used for the production of the adhesive layer include hydrophilic polymers similar to the hydrophilic polymer used for the production of the reagent layer. Of these, gelatin, gelatin derivatives, polyacrylamide and the like are preferable.
The dry film thickness of the adhesive layer is generally in the range of about 0.5 μm to about 20 μm, preferably about 1 μm to about 10 μm.
なお、接着層は試薬層上以外にも、他の層間の接着力を向上させるため所望の層上に設けてもよい。接着層は親水性ポリマーと、必要によって加えられる界面活性剤等を含む水溶液を公知の方法で、支持体や試薬層等の上に塗布する方法などにより設けることができる。 In addition to the reagent layer, the adhesive layer may be provided on a desired layer in order to improve the adhesive strength between other layers. The adhesive layer can be provided by a known method, such as a method of applying an aqueous solution containing a hydrophilic polymer and a surfactant added as necessary onto a support or a reagent layer.
（吸水層）
多層乾式分析要素には、支持体と試薬層の間に吸水層を設けることができる。吸水層は水を吸収して膨潤する親水性ポリマーを主成分とする層で、吸水層の界面に到達または浸透した水性液体試料の水を吸収できる層であり、特に検体として全血試料を用いる場合には水性液体成分である血漿の試薬層への浸透を促進する作用を有する。吸水層に用いられる親水性ポリマーは前述の試薬層に使用されるもののなかから選択することができる。吸水層には一般的にはゼラチンまたはゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルア
ルコール、特に前述のゼラチン又は脱イオンゼラチンが好ましく、試薬層と同じ前述のゼラチンが最も好ましい。吸水層の乾燥時の厚さは約３μｍから約１００μｍ、好ましくは約５μｍから約３０μｍの範囲、被覆量では約３ｇ／ｍ2から約１００ｇ／ｍ2、好ましくは約５ｇ／ｍ2から約３０ｇ／ｍ2の範囲である。吸水層には後述するｐＨ緩衝剤、公知の塩基性ポリマー等を含有させて使用時（分析操作実施時）のｐＨを調節することができる。さらに吸水層には公知の媒染剤、ポリマー媒染剤等を含有させることができる。
(Water absorption layer)
The multilayer dry analytical element can be provided with a water absorbing layer between the support and the reagent layer. The water-absorbing layer is a layer mainly composed of a hydrophilic polymer that swells by absorbing water, and is a layer that can absorb water of an aqueous liquid sample that reaches or penetrates the interface of the water-absorbing layer. In particular, a whole blood sample is used as a specimen. In some cases, it has the effect of promoting the penetration of plasma, which is an aqueous liquid component, into the reagent layer. The hydrophilic polymer used for the water absorbing layer can be selected from those used for the reagent layer. In general, gelatin or a gelatin derivative, polyacrylamide, polyvinyl alcohol, particularly the aforementioned gelatin or deionized gelatin is preferred for the water-absorbing layer, and the aforementioned gelatin as the reagent layer is most preferred. The dry thickness of the water-absorbing layer is about 3 μm to about 100 μm, preferably about 5 μm to about 30 μm, and the coating amount is about 3 g / m 2 to about 100 g / m 2 , preferably about 5 g / m 2 to about 30 g. / M 2 range. The water-absorbing layer can contain a pH buffer, which will be described later, a known basic polymer, or the like to adjust the pH during use (when the analysis operation is performed). Further, the water-absorbing layer can contain a known mordant, polymer mordant and the like.
（検出層）
検出層は、一般に、被検成分の存在下で生成した色素等が拡散し、光透過性支持体を通して光学的に検出され得る層で、親水性ポリマーにより構成することができる。媒染剤、例えばアニオン性色素に対してカチオン性ポリマーを、含んでもよい。前述の吸水層は、一般に、被検成分の存在下で生成する色素が実質的に拡散しないような層を言い、この点で検出層とは区別される。
(Detection layer)
The detection layer is generally a layer in which a dye or the like produced in the presence of a test component diffuses and can be optically detected through a light-transmitting support, and can be composed of a hydrophilic polymer. A mordant may be included, for example, a cationic polymer relative to the anionic dye. The above-mentioned water-absorbing layer generally refers to a layer in which the dye produced in the presence of the test component does not substantially diffuse, and is distinguished from the detection layer in this respect.
多層乾式分析要素は、公知の方法により調製、作製することができ、一辺約1ｍｍから約３０ｍｍの正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断して用いることができるが、必要に応じてさらに小さくすることも可能である。 The multilayer dry analytical element can be prepared and produced by a known method, and can be used by cutting into small pieces such as a square having a side of about 1 mm to about 30 mm or a circle of almost the same size. It is also possible to make it smaller.
このような多層乾式分析要素はすでに多数開発・商品化されており、富士ドライケム（富士写真フィルム(株)製）などはその１例である。本発明においては、このような多層乾式分析要素そのものを使用する。またはその一部分を使用することもできる。 Many such multi-layer dry analytical elements have already been developed and commercialized, and Fuji Dry Chem (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.) is one example. In the present invention, such a multilayer dry analytical element itself is used. Alternatively, a part thereof can be used.
上記多層乾式分析要素は、（３）の流路の少なくとも一つに接触していれば、該多層乾式分析要素と流路とがつながっている形態でも、該多層乾式分析要素が流路内に組み込まれている形態でもよく、また多層乾式分析要素を複数用いる場合には、流路でつながれた１箇所にまとめても、各分析要素を別々に配列してもよい。
多層乾式分析要素は、その最上層に血液またはその成分を水平方向に展開するいわゆる展開層を有することが多い。しかし、本発明においては、このような展開層は必ずしも必要ではない。
If the multilayer dry analytical element is in contact with at least one of the flow paths in (3), the multilayer dry analytical element is in the flow path even if the multilayer dry analytical element is connected to the flow path. In the case where a plurality of multilayer dry analysis elements are used, they may be combined into one place connected by a flow path, or may be arranged separately.
The multilayer dry analytical element often has a so-called spreading layer that spreads blood or its components in the horizontal direction on the top layer. However, in the present invention, such a development layer is not always necessary.
［流路］
本発明の分析チップの第一の態様は、（２）多層乾式分析要素と（１）前処理要素をつなぐ（３）流路を含む。流路の幅は必要に応じて適宜広くすることも狭くすることもできる。検体量が少ない場合は、マイクロ流路であることが望ましい。マイクロ流路は、本明細書において、等価直径３ｍｍ以下の流路を言う。
本発明でいう等価直径（equivalent diameter）は、相当(直)径とも呼ばれ、機械工学の分野で一般的に用いられている用語である。任意断面形状の配管(本発明では流路に当たる。)に対し等価な円管を想定するとき、その等価円管の直径を等価直径といい、ｄｅｑ：等価直径は、Ａ:配管の断面積、ｐ:配管のぬれぶち長さ(周長)を用いて、ｄｅｑ＝４Ａ／ｐと定義される。円管に適用した場合、この等価直径は円管直径に一致する。等価直径は等価円管のデータを基に、その配管の流動あるいは熱伝達特性を推定するのに用いられ、現象の空間的スケール（代表的長さ）を表す。等価直径は、一辺ａの正四角形管ではｄｅｑ＝４ａ2／４ａ＝ａ、路高さｈの平行平板間の流れではｄｅｑ＝２ｈとなる。これらの詳細は「機械工学事典」（（社）日本機械学会編１９９７年、丸善（株））に記載されている。
[Flow path]
The first embodiment of the analysis chip of the present invention includes (2) a multilayer dry analysis element and (1) a flow path connecting the pretreatment element. The width of the flow path can be appropriately increased or decreased as necessary. When the amount of specimen is small, it is desirable to use a microchannel. In the present specification, the micro channel refers to a channel having an equivalent diameter of 3 mm or less.
The equivalent diameter referred to in the present invention is also called an equivalent diameter and is a term generally used in the field of mechanical engineering. When an equivalent circular pipe is assumed for a pipe having an arbitrary cross-sectional shape (which corresponds to a flow path in the present invention), the diameter of the equivalent circular pipe is referred to as an equivalent diameter, deg: equivalent diameter is A: cross-sectional area of the pipe, p: Def = 4 A / p is defined using the wetted length (peripheral length) of the pipe. When applied to a circular tube, this equivalent diameter corresponds to the circular tube diameter. The equivalent diameter is used to estimate the flow or heat transfer characteristics of the pipe based on the data of the equivalent circular pipe, and represents the spatial scale (typical length) of the phenomenon. The equivalent diameter is deq = 4a 2 / 4a = a for a regular square tube with one side a, and deq = 2h for a flow between parallel flat plates with a path height h. These details are described in “Mechanical Engineering Encyclopedia” (edited by the Japan Society of Mechanical Engineers, 1997, Maruzen Co., Ltd.).
本発明に用いられるマイクロ流路の等価直径は３ｍｍ以下であるが、好ましくは１０〜1000μｍであり、特に好ましくは２０〜500μｍである。 The equivalent diameter of the microchannel used in the present invention is 3 mm or less, preferably 10 to 1000 μm, and particularly preferably 20 to 500 μm.
また流路の長さには特に制限はないが、好ましくは１ｍｍ〜１００００ｍｍであり、特
に好ましくは５ｍｍ〜１００ｍｍである。
The length of the flow path is not particularly limited, but is preferably 1 mm to 10000 mm, and particularly preferably 5 mm to 100 mm.
本発明に用いられる流路の幅は、１〜３０００μｍであることが好ましく、より好ましくは１０〜２０００μｍであり、さらに好ましくは５０〜１０００μｍ である。流路の幅が上記範囲であると、血液などの検体が、流路の壁から抵抗を受けて流動性が低下することが少なく、かつ、検体の量を少量にとどめることが できるため、好ましい。 The width of the channel used in the present invention is preferably 1 to 3000 μm, more preferably 10 to 2000 μm, and still more preferably 50 to 1000 μm. When the width of the flow channel is in the above range, a specimen such as blood is less likely to receive resistance from the wall of the flow path and the fluidity is reduced, and the amount of the specimen can be kept small. .
流路は一体型分析チップに配置する要素の数に合わせて、一つのみでも、二つ以上に分岐していてもいずれでもよい。また、直線状、曲線状など、いずれの形態をとることも可能であるが、直線状であることが好ましい。 The flow path may be either one or may be branched into two or more according to the number of elements arranged on the integrated analysis chip. Moreover, although it can take any form, such as linear form and curvilinear form, it is preferable that it is linear form.
検体は流路から多層乾式分析要素まで移動する。流路内の検体、すなわち流体を扱う方式として、連続流動方式、液滴（液体プラグ）方式、駆動方式等、あるいは毛細管現象の利用、圧力の利用の方式を用いることが好ましい。 The specimen moves from the flow path to the multilayer dry analytical element. It is preferable to use a continuous flow method, a droplet (liquid plug) method, a drive method, or the like, a method using a capillary phenomenon, or a method using pressure as a method for handling a specimen in a flow path, that is, a fluid.
［その他の要素］
本発明における分析チップは、前述のとおり、全血などの検体を注入する要素を有していてもよい。また、この要素は、前処理要素や、流路とつながっていても、また組込まれていてもよい。
全血を注入する要素とは、上記分析チップに全血を注入することができるような導入路のことであり、全血を注入することが可能であれば、どのような形態でもよい。全血を注入する要素は、着脱可能な採血要素を有していてもよく、該要素は針の形状であってもよい。上記導入路と該採血針とが一体化していてもよい。
導入路と採血針の接合方法は、分析チップを組み立てる際に使用できる接合技術としてあげたのと同じ方法を使用できる。
本発明でいう採血針とは、血管より血液を採取し、本発明の分析チップに導入するものである。例えば、通常の注射針のようなものであってもよいが、微量採血という点からみて小型のものであってもよい。また、針の先端を細くすることにより、採血時の痛みを軽減するのも好ましい。また、前述の微細加工技術を利用して針を作成することもできる。
採血針を構成する素材は、通常は金属であり、ステンレス類、ニッケル−チタン合金、タングステン類等のようないわゆる注射針として使用されるような素材を挙げることができる。また、カートリッジを構成する素材として前述したプラスチック類などの樹脂を使用することも可能である。具体的には、ＰＣＯ、ＰＳ、ＰＣ、ＰＭＭＡ、ＰＥ、ＰＥＴ、ＰＰ、ＰＤＭＳ等が挙げられる。
[Other elements]
As described above, the analysis chip in the present invention may have an element for injecting a specimen such as whole blood. Moreover, this element may be connected to the pretreatment element or the flow path, or may be incorporated.
The element for injecting whole blood is an introduction path through which whole blood can be injected into the analysis chip, and may take any form as long as it can inject whole blood. The element for injecting whole blood may comprise a removable blood collection element, which may be in the form of a needle. The introduction path and the blood collection needle may be integrated.
As the method of joining the introduction path and the blood collection needle, the same method as mentioned as the joining technique that can be used when assembling the analysis chip can be used.
The blood collection needle referred to in the present invention collects blood from a blood vessel and introduces it into the analysis chip of the present invention. For example, it may be a normal injection needle, but may be a small one in terms of micro blood sampling. It is also preferable to reduce pain during blood collection by narrowing the tip of the needle. The needle can also be created using the above-described microfabrication technology.
The material constituting the blood collection needle is usually a metal, and examples thereof include materials used as so-called injection needles such as stainless steels, nickel-titanium alloys, and tungsten. It is also possible to use a resin such as the above-mentioned plastics as a material constituting the cartridge. Specific examples include PCO, PS, PC, PMMA, PE, PET, PP, and PDMS.
本発明の分析チップの前処理要素、多層乾式分析要素及び流路の配置は、例えば、図４に示す前処理要素として血球分離要素を用いた概念図で説明することができるが、これに限らない。
また、本発明の分析チップの断面は、例えば、図５に示す模式図のようになるが、これに限定されるものではない。
The arrangement of the pretreatment element, the multilayer dry analysis element and the flow path of the analysis chip of the present invention can be explained by a conceptual diagram using a blood cell separation element as the pretreatment element shown in FIG. Absent.
The cross section of the analysis chip of the present invention is, for example, a schematic diagram shown in FIG. 5, but is not limited thereto.
［検体］
本発明の分析チップが対象とする被検物質は特に限定されず、任意の液体試料（例えば、全血、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、髄液、膣液などの体液；あるいは飲料水、酒類、河川水、工場廃水等）中の特定成分を分析することができる。例えば、アルブミン（ＡＬＢ）、グルコース、尿素、ピリルビン、コレステロール、タンパク質、酵素（例えば、乳酸脱水素酵素、ＣＰＫ（クレアチンキナーゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、ＡＳＴ（アスパルテートアミノトランスフェラーゼ）、ＧＧＴ（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）等の血中酵素）などを分析することができる。
[Sample]
The test substance targeted by the analysis chip of the present invention is not particularly limited, and any liquid sample (for example, body fluid such as whole blood, plasma, serum, lymph fluid, urine, saliva, spinal fluid, vaginal fluid; or drinking water) , Alcohol, river water, factory waste water, etc.) can be analyzed. For example, albumin (ALB), glucose, urea, pyrilbin, cholesterol, protein, enzyme (for example, lactate dehydrogenase, CPK (creatine kinase), ALT (alanine aminotransferase), AST (aspartate aminotransferase), GGT (γ -Blood enzymes such as glutamyl transpeptidase) can be analyzed.
本発明の分析チップには、例えば０．１μｌ〜３０μｌ、好ましくは１〜１０μｌの範囲の検体である、水性液体試料液を、注入又は点着する。検体は、前処理要素、多層乾式分析要素の順に、又は流路を設けた場合には、前処理要素、流路、多層乾式分析要素の順に、通過させ、検体に含まれる余分の液体残渣は、必要に応じて多層乾式分析要素に設けられた吸水層に吸収される。検体の移動は、前記［流路］の項において記載した方式が利用される。各要素の通過は、それぞれ別の方式を用いても一つの方式によってもよい。通過後、分析チップを約２０℃〜約４５℃の範囲の一定温度で、好ましくは約３０℃〜約４０℃の範囲内の一定温度で１〜１０分間インキュベーションする。多層乾式分析要素内の発色又は変色を光透過性支持体側から反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の原理により検体中の被験物質の量を求めることができる。また必要に応じて透過測光することも可能である。 The analysis chip of the present invention is injected or spotted with an aqueous liquid sample solution, for example, a specimen in the range of 0.1 μl to 30 μl, preferably 1 to 10 μl. The sample is passed in the order of the pretreatment element, the multilayer dry analytical element, or if a flow path is provided, the pretreatment element, the flow path, and the multilayer dry analytical element are passed in this order, and the excess liquid residue contained in the specimen is removed. If necessary, it is absorbed by the water absorption layer provided in the multilayer dry analytical element. For the movement of the specimen, the method described in the section [Flow path] is used. The passage of each element may use a different method or a single method. After passage, the assay chip is incubated at a constant temperature in the range of about 20 ° C. to about 45 ° C., preferably at a constant temperature in the range of about 30 ° C. to about 40 ° C. for 1-10 minutes. Color development or discoloration in the multilayer dry analytical element is reflected and photometrically measured from the side of the light-transmitting support, and the amount of the test substance in the sample can be determined based on the principle of the colorimetric measurement method using a calibration curve prepared in advance. In addition, transmission photometry can be performed as necessary.
［測光］
本発明の分析チップはエリアセンサによっても測定できる。
以下、図６を用いて、エリアセンサを用いた場合の測定装置の概略構成を示す。
測定装置１００は、測定対象となる検体を設置する分析チップ設置部１１と、検体に光を照射するハロゲンランプ等の発光素子を用いた光源１２と、光源１２から照射される光の強度を変化させる光可変部１３と、光源１２から照射される光の波長を変化させる波長可変部１４と、光源１２から照射される光を平行化及び集光するレンズ１５ａ及び５ｂと、検体からの反射光を集光するレンズ１５ｃと、レンズ１５ｃで集光された反射光を受光する受光素子としてのエリアセンサ１６と、各部を制御すると共に光可変部１３の状態とエリアセンサ１６で受光した光の光量とに応じた測定結果を求めてディスプレイ等に出力するコンピュータ１７とを備える。尚、ここでは、コンピュータ１７が各部を制御する構成としているが、各部を統括制御するコンピュータを別に用意しておいても良い。
[Metering]
The analysis chip of the present invention can also be measured by an area sensor.
Hereinafter, a schematic configuration of the measuring apparatus using the area sensor will be described with reference to FIG.
The measuring apparatus 100 changes the intensity of light emitted from the light source 12, an analysis chip placement unit 11 for placing a sample to be measured, a light source 12 using a light emitting element such as a halogen lamp that irradiates the sample with light. A variable light portion 13 for changing light, a wavelength variable portion 14 for changing the wavelength of light emitted from the light source 12, lenses 15a and 5b for collimating and collecting light emitted from the light source 12, and reflected light from the specimen. 15c for condensing light, an area sensor 16 as a light receiving element for receiving reflected light collected by the lens 15c, the state of the light variable section 13 while controlling each part, and the amount of light received by the area sensor 16 And a computer 17 for obtaining a measurement result according to the above and outputting it to a display or the like. Here, the computer 17 is configured to control each unit, but a computer that performs overall control of each unit may be prepared separately.
分析チップ設置部１１には、分析チップが設置される。実際に測定に供するのは、、分析チップの中の、検体と反応した、多層乾式分析要素である。 An analysis chip is installed in the analysis chip installation unit 11. What is actually used for the measurement is a multilayer dry analysis element that has reacted with the specimen in the analysis chip.
光可変部１３は、穴の開いたステンレス等の金属メッシュの板材及びＮＤフィルタ等の減光フィルタを、光源１２と検体との間に機械的に出し入れすることで、光源１２から検体に照射される光の強度を変化させるものである。初期設定では、この減光フィルタが、光源１２と検体との間に挿入された状態となっている。尚、以下では、金属メッシュをステンレスメッシュとする。又、穴の開いたステンレスメッシュの板材及びＮＤフィルタ等の減光フィルタを、手動で出し入れできるようにしても良い。 The light variable portion 13 is irradiated from the light source 12 to the specimen by mechanically inserting and removing a metal mesh plate material such as stainless steel with a hole and a neutral density filter such as an ND filter between the light source 12 and the specimen. It changes the intensity of light. In the initial setting, the neutral density filter is inserted between the light source 12 and the specimen. In the following description, the metal mesh is a stainless steel mesh. Moreover, a stainless steel mesh plate with a hole and a neutral density filter such as an ND filter may be manually inserted and removed.
波長可変部１４は、複数種類の干渉フィルタのいずれかを、光源１２と検体との間に機械的に出し入れすることで、光源１２から検体に照射される光の波長を変化させるものである。尚、本実施形態では、波長可変部１４を光可変部１３と分析チップ設置部１１との間に設置しているが、光源１２と光可変部１３との間に設置しても良い。又、複数種類の干渉フィルタを手動で出し入れできるようにしても良い。 The wavelength variable unit 14 changes the wavelength of light emitted from the light source 12 to the specimen by mechanically inserting or removing one of a plurality of types of interference filters between the light source 12 and the specimen. In this embodiment, the wavelength variable unit 14 is installed between the light variable unit 13 and the analysis chip installation unit 11, but may be installed between the light source 12 and the light variable unit 13. Further, a plurality of types of interference filters may be manually inserted and removed.
エリアセンサ１６は、ＣＣＤ等の固体撮像素子であり、分析チップ設置部１１に設置された多層乾式分析要素中の試薬と血液等の検体とが反応した際に光源１２から照射される光によって反射する光を受光し、受光した光を電気信号に変換してコンピュータ１７に出力するものである。エリアセンサ１６は、多層乾式分析要素から反射する光を面単位で受光可能である。このため、各試薬のエリアを同時に、すなわち複数項目について測定が可能である。 The area sensor 16 is a solid-state imaging device such as a CCD, and is reflected by light emitted from the light source 12 when a reagent in the multilayer dry analysis element installed in the analysis chip installation unit 11 reacts with a sample such as blood. Receiving light, converting the received light into an electrical signal and outputting it to the computer 17. The area sensor 16 can receive light reflected from the multilayer dry analysis element in units of planes. Therefore, it is possible to measure each reagent area simultaneously, that is, for a plurality of items.
コンピュータ１７は、エリアセンサ１６から出力された受光量に応じた電気信号を、予め内蔵するメモリ等に記憶している検量線のデータに基づいて光学濃度値に変換し、その
光学濃度値から検体に含まれる各種成分の含有量等を求め、ディスプレイ等に出力するものである。複数項目を測定する場合、コンピュータ１７は、エリアセンサ１６から出力された受光量に応じた電気信号を、多層乾式分析要素の複数エリア毎に抽出し、検体に含まれる成分の含有量を複数エリア毎に求める。又、コンピュータ１７は、エリアセンサ１６で受光した検体からの反射光量や検体と反応させる試薬の種類に応じて、光可変部１３と波長可変部１４を制御し、光源１２からの光の光量を変化させたり、その波長を変化させたりする。
The computer 17 converts an electrical signal corresponding to the amount of received light output from the area sensor 16 into an optical density value based on calibration curve data stored in a built-in memory or the like. The content of various components contained in the product is obtained and output to a display or the like. When measuring a plurality of items, the computer 17 extracts an electrical signal corresponding to the amount of received light output from the area sensor 16 for each of the plurality of areas of the multilayer dry analysis element, and calculates the content of the component contained in the sample in the plurality of areas. Ask every time. Further, the computer 17 controls the light variable unit 13 and the wavelength variable unit 14 according to the amount of reflected light from the sample received by the area sensor 16 and the type of reagent to be reacted with the sample, and controls the amount of light from the light source 12. Change the wavelength or change its wavelength.
以上のような構成の測定装置１００では、検体からの反射光量が、エリアセンサ１６のダイナミックレンジ内に入らない程少ない場合に、光可変部１３が、光源１２と検体との間からステンレスメッシュの板材又はＮＤフィルタを取り外し、光源１２から照射される光の強度を強くする。これにより、検体からの反射光量が多くなり、その反射光量がエリアセンサ１６のダイナミックレンジ内に入るようになる。このため、エリアセンサ１６のダイナミックレンジが狭くても、反射光を精度良く受光することができ、検体に含まれる成分の含有量の測定精度が向上する。 In the measuring apparatus 100 configured as described above, when the amount of reflected light from the specimen is so small that it does not fall within the dynamic range of the area sensor 16, the light variable section 13 is made of stainless steel mesh between the light source 12 and the specimen. The plate material or the ND filter is removed, and the intensity of light emitted from the light source 12 is increased. As a result, the amount of reflected light from the specimen increases, and the amount of reflected light falls within the dynamic range of the area sensor 16. For this reason, even if the dynamic range of the area sensor 16 is narrow, the reflected light can be received with high accuracy, and the measurement accuracy of the content of the component contained in the specimen is improved.
又、例えばＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄという４種類の試薬を含んだ多層乾式分析要素を用いる場合、測定装置１００では、Ａ〜Ｄの試薬を含んだ各エリアからの反射光量を求め、その反射光量のいずれかがエリアセンサ１６のダイナミックレンジ内に入らない場合、光可変部１３が、ステンレスメッシュの板材又はＮＤフィルタの挿入及び取り出しを一定時間おきに行う。又、各エリアから反射する光の波長はそれぞれ異なるため、波長可変部１４がその波長に合わせて複数の干渉フィルタを切替える。 For example, when using a multilayer dry analysis element containing four types of reagents A, B, C, and D, the measuring apparatus 100 obtains the amount of reflected light from each area containing the reagents A to D and reflects the reflected light. When any of the light amounts does not fall within the dynamic range of the area sensor 16, the light variable unit 13 inserts and removes a stainless mesh plate or ND filter at regular intervals. Further, since the wavelengths of light reflected from each area are different, the wavelength variable unit 14 switches a plurality of interference filters according to the wavelength.
例えば、ＡとＢを含んだエリアからの反射光量がエリアセンサ１６のダイナミックレンジ内に入らない程少なく、ＣとＤを含んだエリアからの反射光量がエリアセンサ１６のダイナミックレンジ内に入り、Ａ〜Ｄの試薬が血液と反応した際に発光する光の波長がそれぞれ異なる場合について説明する。 For example, the amount of reflected light from the area including A and B is so small that it does not fall within the dynamic range of the area sensor 16, and the amount of reflected light from the area including C and D falls within the dynamic range of the area sensor 16. A case will be described in which the wavelengths of light emitted when the reagents of -D react with blood differ.
この場合、測定装置１００では、光源１２が多層乾式分析要素に光を照射し、スライドの各エリアからの反射光をエリアセンサ１６で受光し、各エリアからの反射光量がエリアセンサ１６のダイナミックレンジ内に入っているかどうかをコンピュータ１７により判定する。ここではＡとＢを含んだエリアからの反射光量がエリアセンサ１６のダイナミックレンジ内に入らない程少ないため、光源１２から一定時間光が照射された後、コンピュータ１７は光可変部１３を制御し、光源１２と検体との間からＮＤフィルタを取り外させる。この状態で一定時間光を照射した後、コンピュータ１７は光可変部１３を制御し、光源１２と検体との間にＮＤフィルタを挿入させる。この動作を繰り返すことで、複数種類の測定成分を一つの多項目測定乾式分析要素で精度良く測定することができる。 In this case, in the measuring apparatus 100, the light source 12 irradiates the multilayer dry analytical element with light, the reflected light from each area of the slide is received by the area sensor 16, and the reflected light amount from each area is the dynamic range of the area sensor 16. It is determined by the computer 17 whether it is inside. Here, since the amount of reflected light from the area including A and B is so small that it does not fall within the dynamic range of the area sensor 16, the computer 17 controls the light variable unit 13 after the light source 12 emits light for a certain period of time. The ND filter is removed from between the light source 12 and the specimen. After irradiating light for a certain time in this state, the computer 17 controls the light variable unit 13 to insert an ND filter between the light source 12 and the specimen. By repeating this operation, a plurality of types of measurement components can be accurately measured with one multi-item measurement dry analysis element.
コンピュータ１７は、光可変部１３の制御を行う一方で、Ａ〜Ｄの試薬の種類に応じて波長可変部１４を制御し、４種類の干渉フィルタを順番に切替えさせる。波長可変部１４は、光可変部１３がＮＤフィルタを取り外している間に、試薬Ａに対応する干渉フィルタと試薬Ｂに対応する干渉フィルタとを交互に切替え、光可変部１３がＮＤフィルタを挿入している間に、試薬Ｃに対応する干渉フィルタと試薬Ｄに対応する干渉フィルタとを交互に切替えるように動作する。これにより、検体に含まれる複数種類の成分から発光される光の波長がそれぞれ異なる場合でも、検体に含まれる複数種類の測定成分の含有量を一つの多項目測定乾式分析要素で測定することができる。 The computer 17 controls the optical variable unit 13, while controlling the wavelength variable unit 14 according to the types of reagents A to D, and sequentially switches the four types of interference filters. The wavelength variable unit 14 alternately switches between the interference filter corresponding to the reagent A and the interference filter corresponding to the reagent B while the optical variable unit 13 removes the ND filter, and the optical variable unit 13 inserts the ND filter. During the operation, the interference filter corresponding to the reagent C and the interference filter corresponding to the reagent D are switched alternately. As a result, even when the wavelengths of light emitted from a plurality of types of components contained in the specimen are different from each other, the content of the plurality of types of measurement components contained in the specimen can be measured with one multi-item measurement dry analytical element. it can.
測定装置１００は、光源１２からの光の強度を変えることで、ダイナミックレンジの狭いＣＣＤであっても高精度な測定が可能となっているが、光の強度を変えずに、コンピュータ１７の制御によってＣＣＤにおける露光時間（反射光の受光時間）を変化させること
でも、上記と同様に高精度な測定が可能である。
The measuring apparatus 100 can measure with high accuracy even with a CCD having a narrow dynamic range by changing the intensity of light from the light source 12, but the control of the computer 17 without changing the intensity of light. By changing the exposure time (received time of reflected light) in the CCD, it is possible to perform highly accurate measurement as described above.
尚、本実施形態では、光源１２から検体に光を照射し、その反射光から検体に含まれる成分の含有量を求めているが、検体を透過した透過光から検体に含まれる成分の含有量を求めても良い。 In this embodiment, the sample is irradiated with light from the light source 12 and the content of the component contained in the sample is obtained from the reflected light. However, the content of the component contained in the sample from the transmitted light that has passed through the sample. You may ask for.
又、本実施形態では、検体からの反射光をＣＣＤ等のエリアセンサを用いて受光しているが、エリアセンサに限らず、ラインセンサを用いても構わない。 In this embodiment, reflected light from the specimen is received using an area sensor such as a CCD. However, the present invention is not limited to the area sensor, and a line sensor may be used.
又、本実施形態で使用するＣＣＤとしては、フォトダイオード等の受光部が半導体基板上に縦横に所定間隔で配置され、隣接する各受光部列に含まれる受光部が、互いに、受光部列内での受光部同士のピッチの約１／２列方向にずれて配置された、いわゆるハニカム型のＣＣＤを用いることが望ましい。 In the CCD used in this embodiment, light receiving portions such as photodiodes are arranged vertically and horizontally on a semiconductor substrate at predetermined intervals, and the light receiving portions included in adjacent light receiving portion rows are mutually within the light receiving portion row. It is desirable to use a so-called honeycomb type CCD that is shifted in the direction of about ½ row of the pitch between the light receiving portions in FIG.
上記の説明では、測定装置１００が、検体からの反射光量に応じてリアルタイムに光の強度を変化させているが、検体に含まれる測定成分に応じて予め設定されたシーケンスで、その測定成分の含有量の測定を行うようにしても良い。この場合の動作を以下に説明する。 In the above description, the measurement apparatus 100 changes the light intensity in real time according to the amount of reflected light from the specimen. However, in the sequence set in advance according to the measurement component included in the specimen, the measurement component 100 The content may be measured. The operation in this case will be described below.
測定装置１００は、分析チップ設置部１１に分析チップが設置され、測定項目がセットされると、その測定項目に応じたパターンで測定を開始する。まず、コンピュータ１７が、測定に利用する光の強度を複数種類の強度の中から選択し、選択した強度の光を検体に照射させる。エリアセンサ１６が、検体から反射した反射光を受光すると、コンピュータ１７は、エリアセンサ１６で受光された反射光の光量と上記選択した光の強度とに応じた測定結果を出力する。この一連の動作により、検体に含まれる測定成分の測定を精度良く行うことが可能である。 When the analysis chip is installed in the analysis chip installation unit 11 and the measurement item is set, the measurement apparatus 100 starts measurement with a pattern corresponding to the measurement item. First, the computer 17 selects the intensity of light used for measurement from a plurality of types of intensity, and irradiates the specimen with light of the selected intensity. When the area sensor 16 receives the reflected light reflected from the specimen, the computer 17 outputs a measurement result corresponding to the amount of the reflected light received by the area sensor 16 and the intensity of the selected light. By this series of operations, it is possible to accurately measure the measurement component contained in the specimen.
光の強度を変えずにＣＣＤの露光時間を変化させる場合、測定装置１００は、分析チップ設置部１１に分析チップが設置され、測定項目がセットされると、その測定項目に応じたパターンで測定を開始する。まず、コンピュータ１７が、検体に光を照射させる。そして、エリアセンサ１６が、複数種類の露光時間の中からコンピュータ１７によって選択された露光時間で、検体から反射した反射光を受光する。最後に、コンピュータ１７は、エリアセンサ１６で受光された反射光の光量と該選択した露光時間とに応じた測定結果を出力する。この一連の動作により、検体に含まれる測定成分の測定を精度良く行うことが可能である。 When changing the exposure time of the CCD without changing the light intensity, the measurement apparatus 100 measures the pattern according to the measurement item when the analysis chip is set in the analysis chip setting unit 11 and the measurement item is set. To start. First, the computer 17 irradiates the specimen with light. Then, the area sensor 16 receives the reflected light reflected from the specimen for the exposure time selected by the computer 17 from among a plurality of types of exposure time. Finally, the computer 17 outputs a measurement result corresponding to the amount of reflected light received by the area sensor 16 and the selected exposure time. By this series of operations, it is possible to accurately measure the measurement component contained in the specimen.
測定装置１００は、以上に述べてきた光源１２から分析チップの多層乾式分析要素に光を照射して、その反射光あるいは透過光から検体に含まれる成分の含有量を求めることに限定することはなく、光源１２から多層乾式分析要素に光を照射したときに多層乾式分析要素から発する蛍光などの光を検出することによって検体に含まれる成分の含有量を求めてもよく、光可変部１３で光源１２の光を完全に遮断する、あるいは光源１２を用いないことで多層乾式分析要素に全く光が当たらない状態にして多層乾式分析要素から発する化学発光などの発光による光を検出することによって検体に含まれる成分の含有量を求めてもよい。 The measurement apparatus 100 is limited to obtaining light from the light source 12 described above to the multilayer dry analysis element of the analysis chip and obtaining the content of the component contained in the specimen from the reflected light or transmitted light. Alternatively, the content of the component contained in the specimen may be obtained by detecting light such as fluorescence emitted from the multilayer dry analysis element when light is emitted from the light source 12 to the multilayer dry analysis element. By completely blocking the light from the light source 12 or by not using the light source 12 so that the multilayer dry analytical element is not exposed to light at all, the specimen is detected by detecting light emitted from the multilayer dry analytical element such as chemiluminescence. You may obtain | require content of the component contained in.
測定操作は特開昭６０−１２５５４３号公報、特開昭６０−２２０８６２号公報、特開昭６１−２９４３６７号公報、特開昭５８−１６１８６７号公報（対応米国特許４，４２４，１９１）などに記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施できる。なお、目的や必要精度によっては目視により発色の度合いを判定して、半定量的な測定を行ってもよい。 The measuring operation is disclosed in JP-A-60-125543, JP-A-60-220862, JP-A-61-294367, JP-A-58-161867 (corresponding to US Pat. No. 4,424,191). With the described chemical analyzer, highly accurate quantitative analysis can be performed with extremely easy operation. Depending on the purpose and required accuracy, semi-quantitative measurement may be performed by visually judging the degree of color development.
本発明の分析チップは、分析を行うまでは乾燥状態で貯蔵・保管される。本発明の分析チップは、試薬を用時調製する必要がなく、また一般に乾燥状態の方が試薬の安定性が高いことから、試薬溶液を用時調製しなければならないいわゆる湿式法より簡便性、迅速性に優れている。また、微量の液体試料で、精度の高い検査を迅速に行うことができる検査方法としても優れている。さらに本発明の分析チップは、煩雑な前処理を必要としない。 The analysis chip of the present invention is stored and stored in a dry state until analysis is performed. The analysis chip of the present invention does not require the reagent to be prepared at the time of use, and since the reagent stability is generally higher in the dry state, it is simpler than the so-called wet method in which the reagent solution must be prepared at the time of use, Excellent speediness. Moreover, it is also excellent as an inspection method capable of quickly performing a high-accuracy inspection with a small amount of liquid sample. Furthermore, the analysis chip of the present invention does not require complicated pretreatment.
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。 The following examples further illustrate the present invention, but the present invention is not limited to the examples.
作製例１：ＰＤＭＳ凹型作成
シリコンウエファー上に厚膜フォトレジストのＳＵ−８をスピンコートして膜厚１００μｍとした。９０℃で１時間予備加熱した後、図１に相応する流路パターン（１）を描いてあるマスクを通してＵＶ光を照射し、９０℃１時間で光照射部分を硬化させた。未硬化部分をプロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート（ＰＧＭＥＡ）により溶解除去、水洗したのち乾燥し、シリコンウエファー／ＳＵ８凸型として使用した。
Fabrication Example 1: PDMS concave mold fabrication A thick photoresist SU-8 was spin coated on a silicon wafer to a thickness of 100 μm. After preheating at 90 ° C. for 1 hour, UV light was irradiated through a mask on which a flow path pattern (1) corresponding to FIG. 1 was drawn, and the light irradiated portion was cured at 90 ° C. for 1 hour. The uncured portion was dissolved and removed with propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA), washed with water and dried, and used as a silicon wafer / SU8 convex shape.
この、シリコンウエファー凸型上に、ＰＤＭＳ（デュポンＳｙｌｇａｒｄ／硬化液＝１０／１ 混合液）を流し込み、８０℃で２時間硬化させた後シリコンウエファー凸型より静かに剥がしとり、図１に示すＰＤＭＳ凹型パターン（１）を作成した。さらに、生研トレパン（カイインダストリー製）により、検体注入口３１及び空気抜き３５を（直径１ｍｍ）を、作成した（パターン（３））。 PDMS (DuPont Sylgard / curing liquid = 10/1 mixed liquid) was poured onto the silicon wafer convex mold, cured at 80 ° C. for 2 hours, and then gently peeled off from the silicon wafer convex mold, and the PDMS shown in FIG. A concave pattern (1) was created. Furthermore, the specimen inlet 31 and the air vent 35 (diameter 1 mm) were created (pattern (3)) by using a Seken trepan (manufactured by Ky Industries).
次に、シリコンウエファー上に厚さ０．５ｍｍのＰＥＴベースを瞬間接着剤ではりつけ図１に相応する流路パターン（２）の凸型を作成した。前述した方法で、ＰＤＭＳを流しこみ、ＰＤＭＳ凹型パターン（２）を作成した。 Next, a PET base having a thickness of 0.5 mm was pasted on the silicon wafer with an instantaneous adhesive to create a convex shape of the flow path pattern (2) corresponding to FIG. PDMS was poured by the method described above to create a PDMS concave pattern (2).
調製例２：α−アミラーゼ／抗ＨｂＡ１ＣＦab'の調整
（Ａ）ＧＭＢ化アミラーゼの調製
α−アミラーゼに以下のようにしてマレイミド基を導入した。
５mg/mLの枯草菌α−アミラーゼ溶液（0.1 mol/L グリセロリン酸緩衝，pH 7.0) の１mLに、ＧＭＢＳ（ N-(γ-maleimidobutyryloxy)succinimide; 同仁化学製）の100mg/mL 溶液(DMF) 100μL を加えて、室温で１時間反応させた。この反応液をセファデックスＧ−２５のカラムでゲル濾過にかけ、0.1 mol/L グリセロ燐酸緩衝液（pH 7.0）で溶出し、素通り分画を分取、Ｎ-(γ-マレイミドブチリロキシ）アミド化アミラーゼ（ＧＭＢ化アミラーゼ）を得た。得られたＧＭＢ化アミラーゼ溶液の濃度は1.35 mg/mLであった。
Preparation Example 2: Preparation of α-amylase / anti-HbA1CFab ′ (A) Preparation of GMB amylase A maleimide group was introduced into α-amylase as follows.
1 mL of 5 mg / mL Bacillus subtilis α-amylase solution (0.1 mol / L glycerophosphate buffer, pH 7.0) and 100 mg / mL solution (DMF) of GMBS (N- (γ-maleimidobutyryloxy) succinimide) And reacted at room temperature for 1 hour. This reaction solution was subjected to gel filtration with a Sephadex G-25 column and eluted with 0.1 mol / L glycerophosphate buffer (pH 7.0). The flow-through fraction was collected and N- (γ-maleimidobutyryloxy) amidated. Amylase (GMB amylase) was obtained. The concentration of the obtained GMB amylase solution was 1.35 mg / mL.
（Ｂ）抗ヒトＨｂＡ1Cモノクローナル抗体の調製
ヒトＨｂＡ1Cに対するモノクローナル抗体IgＧは、マウスに免疫して得られた免疫細胞（脾臓細胞）をマウスミエローマ細胞と融合し、クローニング後得られた抗体であり、常法により得たものである。すなわち、1mmol/L ＫＣＮ（pH7.45）に溶解した７μgの天然ヒトヘモグロビンＡ1Cと、143μLのＲＰＭＩ−１６４０培地（1g/L 炭酸ナトリウム, 600mg/L L-グルタミン、 10mmol/L ＨＥＰＥＳを含有: pH6.8）及び200μLのフロイント完全アジュバントを混合し、これをマウスに皮下注射により免疫した。２週間ごとに追加免疫を行い、最後にマウス脾臓からＢリンパ球を採取して、これをマウスミエローマ細胞と融合し、クローン化した。得られたクローンからヒトＨｂＡ1Cと特異的に反応し、他のヘモグロビン・サブクラスと実質的にまったく交差反応しない抗体を産生する細胞系を選別した。得られた抗体産生細胞を培養し、抗体精製によりヒトＨｂＡ1Cに対するモノクローナル特異抗体、すなわち抗ヒトＨｂＡ1c・マウスIgＧを得た。
(B) Preparation of anti-human HbA1C monoclonal antibody The monoclonal antibody IgG against human HbA1C is an antibody obtained by fusing immune cells (spleen cells) obtained by immunizing mice with mouse myeloma cells and cloning. It was obtained by law. That is, 7 μg of natural human hemoglobin A1C dissolved in 1 mmol / L KCN (pH 7.45) and 143 μL of RPMI-1640 medium (containing 1 g / L sodium carbonate, 600 mg / L L-glutamine, 10 mmol / L HEPES: pH 6 .8) and 200 μL of Freund's complete adjuvant were mixed, and the mice were immunized by subcutaneous injection. Booster immunizations were performed every two weeks, and finally B lymphocytes were collected from the mouse spleen and fused with mouse myeloma cells and cloned. From the resulting clones, cell lines were selected that produced antibodies that reacted specifically with human HbA1C and did not substantially cross-react with other hemoglobin subclasses. The obtained antibody-producing cells were cultured, and a monoclonal specific antibody against human HbA1C, that is, anti-human HbA1c · mouse IgG was obtained by antibody purification.
（Ｃ）抗ヒトＨｂＡ1c・IgＧ Ｆab' の調製
得られた抗ヒトＨｂＡ1CマウスIgＧ 20mg を、10 mLの0.1 mol/L 酢酸緩衝液(pH5.5) に溶解し、これに活性化パパイン600μgを加え37℃で２時間攪拌した。この反応液を、予め0.1 mol/L 燐酸緩衝液(pH 6.0; 1 mmol/L EDTA含有）で平衡化したスーパーデックス−200 ゲルカラムにアプライし、同燐酸緩衝液で溶出した。分子量10万付近に溶出したピーク部分を分取し、抗ヒトＨｂＡ1C・マウスIgＧ Ｆ(ab')2を得た。得られた抗ヒトＨｂＡ1C・IgＧ Ｆ(ab')2 10 mg を含む0.1 mol/L 燐酸緩衝液(pH 6.0)２mLに、10 mg/mLの２−メルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液を200μL加え、37℃で90分間攪拌した。この反応液を予め0.1 mol/L 燐酸緩衝液(pH 6.0）で平衡化したセファデックスＧ−２５でゲル濾過し素通り分画を分取して、抗ヒトＨｂＡ1C・IgＧ Ｆab'（以下単にＦab'という）を得た。
(C) Preparation of anti-human HbA1c • IgG Fab ′ 20 mg of the obtained anti-human HbA1C mouse IgG was dissolved in 10 mL of 0.1 mol / L acetate buffer (pH 5.5), and 600 μg of activated papain was added thereto. The mixture was stirred at 37 ° C for 2 hours. This reaction solution was applied to a Superdex-200 gel column previously equilibrated with 0.1 mol / L phosphate buffer (pH 6.0; containing 1 mmol / L EDTA) and eluted with the same phosphate buffer. The peak portion eluted at a molecular weight of around 100,000 was collected to obtain anti-human HbA1C / mouse IgGF (ab ') 2. 200 μL of 10 mg / mL 2-mercaptoethylamine hydrochloride aqueous solution was added to 2 mL of 0.1 mol / L phosphate buffer (pH 6.0) containing 10 mg of the obtained anti-human HbA1C • IgGF (ab ′) 2 at 37 ° C. For 90 minutes. This reaction solution was subjected to gel filtration with Sephadex G-25 previously equilibrated with 0.1 mol / L phosphate buffer (pH 6.0), and the fraction passed through, and anti-human HbA1C • IgG Fab ′ (hereinafter simply referred to as Fab ′). I got).
（Ｄ）α−アミラーゼ／Ｆab' 結合物の調製
上記（Ｃ）で得た抗ＨｂＡ1C・IgＧ Ｆab'（Ｆab'）の1.5 mg/mL 溶液6.5 mL に、（Ａ）で調製したＧＭＢ化アミラーゼ２mgを加えて４℃で一晩反応させた。この反応液を、予め20 mmol/L グリセロ燐酸（pH7.0; 10 mmol/L CaCl2含有）で平衡化したスーパーデックス-200にゲル濾過して分子量30万以上の分画を集め、目的の酵素標識抗体（α−アミラーゼ／Ｆab'結合物）を得た。
(D) Preparation of α-amylase / Fab ′ conjugate The anti-HbA1C • IgG Fab ′ (Fab ′) obtained in (C) above was added to 6.5 mL of a 1.5 mg / mL solution, and 2 mg of GMB amylase prepared in (A). And reacted at 4 ° C. overnight. This reaction solution was subjected to gel filtration on Superdex-200 previously equilibrated with 20 mmol / L glycerophosphoric acid (pH 7.0; containing 10 mmol / L CaCl2), and fractions having a molecular weight of 300,000 or more were collected. A labeled antibody (α-amylase / Fab ′ conjugate) was obtained.
作製例２：ＨｂＡ1C定量分析用乾式分析要素の作成
ゼラチン下塗層が設けられている厚さ180μｍの無色透明ポリエチレンテレフタレート（PET）シート（支持体）上に下記の被覆量になるように架橋剤含有試薬溶液を塗布し、乾燥して試薬層を設けた。
Production Example 2: Preparation of dry analytical element for quantitative analysis of HbA1C Crosslinking agent on a colorless transparent polyethylene terephthalate (PET) sheet (support) having a thickness of 180 μm provided with a gelatin subbing layer so as to have the following coating amount The reagent solution was applied and dried to provide a reagent layer.
（架橋剤含有試薬溶液）
アルカリ処理ゼラチン 14.5 g/m2
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール 0.2 g/m2
（オキシエチレン単位平均 9〜10含有）
グルコースオキシダーゼ 5000 IU/m2
ペルオキシダーゼ 15000 IU/m2
グルコアミラーゼ 5000 IU/m2
2-(4-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシフェニル-4-[4-(ジメチルアミノ)
フェニル]-5-フェネチルイミダゾール（ロイコ色素）酢酸塩 0.38 g/m2
ビス[(ビニルスルホニルメチルカルボニル）アミノ］メタン 0.1 g/m2
(Crosslinker-containing reagent solution)
Alkali-treated gelatin 14.5 g / m 2
Nonylphenoxypolyethoxyethanol 0.2 g / m 2
(Oxyethylene unit average 9-10 content)
Glucose oxidase 5000 IU / m 2
Peroxidase 15000 IU / m 2
Glucoamylase 5000 IU / m 2
2- (4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl-4- [4- (dimethylamino)
Phenyl] -5-phenethylimidazole (leuco dye) acetate 0.38 g / m 2
Bis [(vinylsulfonylmethylcarbonyl) amino] methane 0.1 g / m 2
この試薬層の上に下記の被覆量になるように接着層水溶液を塗布、これを乾燥して接着層を設けた。 An adhesive layer aqueous solution was applied onto the reagent layer so as to have the following coating amount, and this was dried to provide an adhesive layer.
（接着層水溶液）
アルカリ処理ゼラチン 14.5 g/m2
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール 0.2 g/m2
（オキシエチレン単位平均 9〜10含有）
(Adhesive layer aqueous solution)
Alkali-treated gelatin 14.5 g / m 2
Nonylphenoxypolyethoxyethanol 0.2 g / m 2
(Oxyethylene unit average 9-10 content)
次いで、接着層の表面に下記の被覆量になるように下記試薬含有水溶液を塗布し、ゼラチン層を膨潤させ、その上に50デニール相当のPET 紡績糸36ゲージ編みした厚さ約250 μｍのトリコット編物布地をほぼ一様に軽く圧力をかけてラミネートして多孔性展開層（編物布地層）を設けた。 Next, the following reagent-containing aqueous solution is applied to the surface of the adhesive layer so that the following coating amount is obtained, the gelatin layer is swollen, and a PET spun yarn equivalent to 50 denier is knitted on a 36 gauge tricot having a thickness of about 250 μm. The knitted fabric was laminated almost uniformly with light pressure to provide a porous spreading layer (knitted fabric layer).
（試薬含有水溶液）
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール 0.2 g/m2
（オキシエチレン単位平均 9〜10含有）
ビス[(ビニルスルホニルメチル カルボニル)アミノ]メタン 0.1 g/m2
(Reagent-containing aqueous solution)
Nonylphenoxypolyethoxyethanol 0.2 g / m 2
(Oxyethylene unit average 9-10 content)
Bis [(vinylsulfonylmethylcarbonyl) amino] methane 0.1 g / m 2
次に、多孔性展開層の上から下記の被覆量になるように基質含有水溶液を塗布し、これを乾燥することにより、多孔性展開層（編物布地層）を基質層兼展開層とした。 Next, the substrate-containing aqueous solution was applied from above the porous spreading layer so as to have the following coating amount, and dried to make the porous spreading layer (knitted fabric layer) as the substrate layer / developing layer.
（基質含有水溶液）
メガファックＦ１４２Ｄ（大日本インキ製) 0.1 g/m2
(フッ素界面活性剤）
（オキシエチレン単位平均10含有）
カルボキシメチル化澱粉 5 g/m2
マンニトール 2 g/m2
アミラーゼ阻害剤 100万 U/m2
（富士レビオ製アミラーゼ阻害剤"I-1001C"）
(Substrate-containing aqueous solution)
Mega Fuck F142D (Dainippon Ink) 0.1 g / m 2
(Fluorine surfactant)
(Contains an average of 10 oxyethylene units)
Carboxymethylated starch 5 g / m 2
Mannitol 2 g / m 2
Amylase inhibitor 1 million U / m 2
(Fujirebio amylase inhibitor "I-1001C")
次ぎに、その基質層兼展開層に、さらに調製例１で調製した酵素標識抗体（α−アミラーゼ／Ｆab' 結合物）を3mg/m2の被覆量となるようにしてエタノール溶液を塗布し含浸させ乾燥させて ＨｂＡ1C分析用多層乾式分析要素（１）を作成した。
なおここで使用したアミラーゼ阻害剤"I-1001C"は、検体中に含まれることがある同種のアミラーゼに対する阻害剤であって、標識酵素として使用している枯草菌α−アミラーゼの酵素活性は阻害しないものである（特開平05-122112号公報参照）。
Next, the substrate layer / development layer is further impregnated with the enzyme-labeled antibody (α-amylase / Fab ′ conjugate) prepared in Preparation Example 1 by applying an ethanol solution in a coating amount of 3 mg / m 2. And dried to prepare a multilayer dry analytical element (1) for HbA1C analysis.
The amylase inhibitor “I-1001C” used here is an inhibitor against the same kind of amylase that may be contained in a sample, and inhibits the enzyme activity of Bacillus subtilis α-amylase used as a labeling enzyme. (See JP 05-122112 A).
実施例1：ＨｂＡ1C定量用一体化分析チップの作成（図２） Example 1: Preparation of integrated analysis chip for HbA1C quantification (Figure 2)
作製例２で作製した多層乾式分析要素（１）は、５ｍｍ×５ｍｍに裁断し、
作製例１で作成したＰＤＭＳ凹型パターン（２）に組込んだ。このＰＤＭＳ凹型と、作製例１で作成したＰＤＭＳ凹型パターン（３）（注入口穴つき）を貼り付け一体型分析チップの大枠を作成した。
The multilayer dry analytical element (1) produced in Production Example 2 is cut into 5 mm × 5 mm,
The PDMS concave pattern (2) prepared in Preparation Example 1 was incorporated. The PDMS concave mold and the PDMS concave pattern (3) (with injection hole) created in Production Example 1 were attached to create a large frame of the integrated analysis chip.
次ぎに、注入口３１より、前処理液（０．１ｖ／ｖ％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および２ｖ／ｖ％ ２−ブタノールを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５溶液）５μｌを静かに注入し、一体型分析チップ１とした。前処理要素と、分析要素をつなぐ流路は細くかつ疎水的なので溶血試薬は分析要素内には入り込まない。（図２参照） Next, 5 μl of pretreatment solution (10 mmol / L Tris-HCl buffer solution pH 7.5 containing 0.1 v / v% Triton X-100 and 2 v / v% 2-butanol) is gently injected from the injection port 31. The integrated analysis chip 1 was obtained. Since the flow path connecting the pretreatment element and the analysis element is thin and hydrophobic, the hemolysis reagent does not enter the analysis element. (See Figure 2)
性能評価実験１：一体型分析チップ１によるＨｂＡ１Ｃの測定（本発明の測定例）
（１）検量線の作成：
ＨｂＡ1C溶液（13 mg/mL PBS; Exocell社製）２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５緩衝液で希釈して、ＨｂＡ1C濃度1200 mg/dL〜75mg/dlの範囲で２倍づつ希釈した溶液を調製した。該希釈液0.2μｌを一体型分析チップ１の注入口３１より勢い良く注入し、前処理要素内の溶液を、分析要素上に供給し、37℃に保ちながら分光放射輝度計MCPD-2000（大塚電子株式会社）により６５０ｎｍの反射濃度を測定し、２分後と１０分後の反射ODの差（△ＯＤ２−１０）を求めて検量線を作成した（図３）。
Performance evaluation experiment 1: Measurement of HbA1C by the integrated analysis chip 1 (measurement example of the present invention)
(1) Creating a calibration curve:
HbA1C solution (13 mg / mL PBS; manufactured by Exocell) was diluted with 20 mmol / L Tris-HCl pH 7.5 buffer solution to prepare a solution diluted 2 times in the HbA1C concentration range of 1200 mg / dL to 75 mg / dl. . The diluted solution 0.2 μl was injected vigorously from the inlet 31 of the integrated analysis chip 1, and the solution in the pretreatment element was supplied onto the analysis element and kept at 37 ° C. while maintaining the spectral radiance meter MCPD-2000 (Otsuka Electronics Corporation) measured the reflection density at 650 nm, and determined the difference in reflection OD (ΔOD2-10) after 2 minutes and after 10 minutes to create a calibration curve (FIG. 3).
（２）全血よりＨｂＡ１Ｃの測定：
人全血0.2μｌ（検体１）を一体型分析チップ１の注入口３１より勢い良く注入し、前処理要素内の溶血液を、分析要素上に供給し、37℃に保ちながら分光放射輝度計MCPD-2000（大塚電子株式会社）により６５０ｎｍの反射濃度を測定した、２分後と１０分後の反射ODの差（△ＯＤ２−１０）を求め、上記（１）で得られた検量線より、ＨｂＡ１Ｃの濃度を算出したところ、７２０ｍｇ/ｄｌであった。
(2) Measurement of HbA1C from whole blood:
Spectral radiance meter while injecting 0.2μl of human whole blood (specimen 1) vigorously through the injection port 31 of the integrated analysis chip 1 and supplying the hemolyzed blood in the pretreatment element onto the analysis element and keeping it at 37 ° C. When the reflection density at 650 nm was measured by MCPD-2000 (Otsuka Electronics Co., Ltd.), the difference in reflection OD after 2 minutes and after 10 minutes (ΔOD2-10) was obtained, and from the calibration curve obtained in (1) above. The HbA1C concentration was calculated to be 720 mg / dl.
（３） 上記（２）の実験を６回行い、その再現性をもとめたところ、ＣＶ（変動係数）は３.５％であった。 (3) When the experiment (2) was repeated 6 times and the reproducibility was determined, the CV (coefficient of variation) was 3.5%.
性能評価実験２：多層乾式分析要素によるＨｂＡ１Ｃの測定（比較例）
（１）検量線の作成：
作製例２の多層乾式分析要素１を１５ｍｍ四方のチップに裁断し、特開昭57-63452号公報に記載のスライドの枠に収めて、比較例のＨｂＡ１Ｃ定量分析スライド（比較例のスライド１）とした。性能評価実験１の（１）と同様に、ＨｂＡ１Ｃ溶液（１３ ｍｇ/ｍＬ ＰＢＳ; Ｅｘｏｃｅｌｌ社製）２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５緩衝液で希釈して、ＨｂＡ１Ｃ濃度1200 mg/dL〜75mg/dlの範囲で２倍づつ希釈した溶液を調製した。この希釈液0.4μｌを、10μｌの０．１ｖ／ｖ％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および２％
２−ブタノールを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５溶液と混合したのち、全量を比較例のスライド１に点着したのち、点着から２分後および１０分後の反射光学濃度の差（ΔＯＤ２−１０）を求めて、検量線を作成した。
Performance evaluation experiment 2: Measurement of HbA1C using a multilayer dry analytical element (comparative example)
(1) Creating a calibration curve:
The multilayer dry analytical element 1 of Preparation Example 2 was cut into a 15 mm square chip and placed in a slide frame described in JP-A-57-63452, and a HbA1C quantitative analysis slide of Comparative Example (Slide 1 of Comparative Example) It was. As in (1) of the performance evaluation experiment 1, the HbA1C solution (13 mg / mL PBS; manufactured by Exocell) was diluted with 20 mmol / L Tris-HCl pH 7.5 buffer, and the HbA1C concentration was 1200 mg / dL to 75 mg / dl. A solution diluted 2 times in the above range was prepared. 0.4 μl of this dilution was added to 10 μl of 0.1 v / v% Triton X-100 and 2%
After mixing with 10 mmol / L Tris-HCl buffer pH 7.5 solution containing 2-butanol, the entire amount was spotted on slide 1 of the comparative example, and the reflection optical density after 2 minutes and 10 minutes after spotting was measured. A difference curve (ΔOD2-10) was obtained and a calibration curve was prepared.
（２）全血よりＨｂＡ１Ｃの測定
さらに、性能評価実験１で使用したものと同じ全血０.４μｌ（検体１：性能評価実験１と同じ）を、10μｌの０．１ｖ／ｖ％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および２ｖ／ｖ％２−ブタノールを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．５溶液と混合したのち、全量を比較例のスライド１に点着したのち、点着から２分後および１０分後の反射光学濃度の差（ΔＯＤ２−１０）を求め、上記（１）で得られた検量線よりＨｂＡ１Ｃの濃度を算出したところ７１５ ｍｇ/ｄｌであった。
(2) Measurement of HbA1C from whole blood Further, 0.4 μl of whole blood same as that used in the performance evaluation experiment 1 (specimen 1: same as the performance evaluation experiment 1) was added to 10 μl of 0.1 v / v% Triton X-100. After mixing with 10 mmol / L Tris-HCl buffer solution pH 7.5 containing 2 v / v% 2-butanol, the whole amount was spotted on slide 1 of the comparative example, and then two and ten minutes after spotting. The difference in reflection optical density (ΔOD2-10) was calculated, and the concentration of HbA1C calculated from the calibration curve obtained in (1) above was 715 mg / dl.
（３）上記（２）の実験を６回繰り返しその再現性をもとめたところ ＣＶは４.５％であった。 (3) The experiment of the above (2) was repeated 6 times and the reproducibility was determined. The CV was 4.5%.
（性能評価実験１及び２の比較）
上記した性能評価実験１の結果より明らかなように、本発明の一体型分析チップは、実質的な前処理をすることなく、ＨｂＡ１Ｃの測定が可能である。また、上記した性能評価実験１及び２の結果の比較から明らかなように、本発明の一体型分析チップを用いた場合は、同時再現性も良好であり、本発明の一体型分析チップの性能が良好であることが実証された。
(Comparison of performance evaluation experiments 1 and 2)
As is clear from the results of the performance evaluation experiment 1 described above, the integrated analysis chip of the present invention can measure HbA1C without substantial pretreatment. Further, as is clear from the comparison of the results of the performance evaluation experiments 1 and 2 described above, when the integrated analysis chip of the present invention is used, the simultaneous reproducibility is good, and the performance of the integrated analysis chip of the present invention is good. Proved to be good.
装置例１：測定装置の構成
図６に示す光学配置の測光系を用意した。各部材としては具体的に以下のとおり用意した。
光学系；倒立の実体顕微鏡。
ＣＣＤ受光部での倍率は以下の２通りを用意。
０．３３倍； ＣＣＤ部分で３３μｍ／ピクセル
１倍； ＣＣＤ部分で１０μｍ／ピクセル
光源１２；林時計工業株式会社製のルミナーエース ＬＡ−１５０ＵＸ
干渉フィルタ１４；６２５ｎｍ，５４０ｎｍ，５０５ｎｍで各々単色化
減光フィルタ１３；ＨＯＹＡ株式会社製のガラスフィルタ ＮＤ−２５
およびステンレス板に孔をあけた自家製フィルタ
ＣＣＤ１６；ＳＯＮＹ株式会社製の８ビット白黒カメラモジュール ＸＣ−７５００
データ処理（画像処理）１７；株式会社ニレコ製の画像処理装置 ＬＵＺＥＸ−ＳＥ。
反射光学濃度を校正するための手段；富士機器工業株式会社製の標準濃度板（セラミック仕様）を以下の６種類用意。
標準濃度板；Ａ００（反射光学濃度〜０．０５）、
Ａ０５（同０．５）、
Ａ１０（同１．０）、
Ａ１５（同１．５）、
Ａ２０（同２．０）、
Ａ３０（同３．０）。
Apparatus Example 1: Configuration of Measuring Apparatus A photometric system having an optical arrangement shown in FIG. 6 was prepared. Specifically, each member was prepared as follows.
Optical system: inverted stereo microscope.
The following two magnifications are available at the CCD light receiver.
0.33 times; 33μm / pixel at CCD
1 ×; 10 μm / pixel in the CCD portion Light source 12; Luminer Ace LA-150UX manufactured by Hayashi Clock Industry Co., Ltd.
Interference filter 14; monochromatic at 625 nm, 540 nm, and 505 nm, respectively, neutral density filter 13; glass filter manufactured by HOYA ND-25
And a self-made filter with a hole in a stainless steel plate CCD16; 8-bit monochrome camera module XC-7500 manufactured by SONY Corporation
Data processing (image processing) 17; Image processing apparatus LUZEX-SE manufactured by Nireco Corporation.
Means for calibrating the reflection optical density: The following six types of standard density plates (ceramic specifications) manufactured by Fuji Kikai Kogyo Co., Ltd. are prepared.
Standard density plate; A00 (reflection optical density to 0.05),
A05 (0.5)
A10 (1.0),
A15 (1.5),
A20 (2.0),
A30 (3.0).
実施例２
図７に示すポリスチレン樹脂（ＰＳ）製の約２４ｍｍ×２８ｍｍのマイクロチップ４０を用意し、このマイクロチップの下材４７の幅２ｍｍ・長さ１０ｍｍ・深さ２ｍｍの流路４４に赤血球捕捉・血漿抽出用のガラス繊維濾紙（ワットマン社製；ＧＦ／Ｄ）４２ａおよびポリスルホン多孔質膜（富士写真フイルム社製ＰＳＦ）４２ｂをポリスルホン多孔質膜が多層乾式分析要素４３側となるように装填し、多層乾式分析要素４３は、その配置部が幅５ｍｍ・長さ５ｍｍ・深さ２ｍｍであり、多層乾式分析要素４３としての富士ドライケム マウントスライドＧＬＵ−Ｐ及びＴＢＩＬ−Ｐ（富士写真フイルム社製）を各々幅２ｍｍ・長さ４ｍｍにカットしてＧＬＵ−Ｐが上に、ＴＢＩＬ−Ｐが下になるように装填し、下材４７と上材４６を両面テープを用いて接着して気密・水密を保つようにした。
次に上材のガラス繊維濾紙４２ａ側の筒４１にプレーン採血した全血を１００μＬ挿入し、１０〜２０秒静置して全血をガラス繊維濾紙に展開させた後に、上材のガラス繊維濾紙側とは反対側の筒４５にテルモシリンジを装着して僅かに吸引した。濾過により抽出された血漿がポリスルホン多孔質膜４２ｂから漏れ、ドライケム マウントスライドに滴下され、ドライケム マウントスライドＧＬＵ−ＰおよびＴＢＩＬ−Ｐ（以下、ＧＬＵ−ＰおよびＴＢＩＬ−Ｐスライドとも言う。）が徐々に発色を開始した（図８〜図１０）。プレーン採血した全血が注入されてから血漿を抽出してマウントスライドに滴下するまでに要した時間は３０秒であった。
このように、本発明の分析チップは、小型で、微量の全血から複数の分析項目について、簡便に、迅速に分析することができた。ここでは、多層乾式分析要素として、２項目分のドライケミストリー用試薬を使用したが、項目数を増加することができる。また、ここでは、発色から分析した。続いて、測光による分析を行った。
Example 2
A microchip 40 of about 24 mm × 28 mm made of polystyrene resin (PS) shown in FIG. 7 is prepared, and red blood cell capture / plasma is placed in a flow path 44 having a width 2 mm, a length 10 mm, and a depth 2 mm of a lower material 47 of the microchip. Glass fiber filter paper for extraction (manufactured by Whatman; GF / D) 42a and polysulfone porous membrane (PSF made by Fuji Photo Film) 42b were loaded so that the polysulfone porous membrane was on the multilayer dry analytical element 43 side. The dry analysis element 43 has a 5 mm width, 5 mm length, and 2 mm depth, and is equipped with Fuji Drychem mount slides GLU-P and TBIL-P (manufactured by Fuji Photo Film Co., Ltd.) as the multilayer dry analysis element 43. Cut to a width of 2 mm and a length of 4 mm and load with the GLU-P on top and TBIL-P on the bottom. It was to keep the airtight, watertight and bonded using a flop.
Next, 100 μL of whole blood collected in a plain manner is inserted into the tube 41 on the upper glass fiber filter paper 42a side, left to stand for 10 to 20 seconds to spread the whole blood on the glass fiber filter paper, and then the upper glass fiber filter paper. A Terumo syringe was attached to the cylinder 45 on the opposite side to the side, and suction was performed slightly. Plasma extracted by filtration leaks from the polysulfone porous membrane 42b and is dropped onto the dry chem mount slide, and the dry chem mount slides GLU-P and TBIL-P (hereinafter also referred to as GLU-P and TBIL-P slides) gradually. Color development was started (FIGS. 8 to 10). It took 30 seconds to extract plasma and drop it onto the mount slide after the plain whole blood was injected.
As described above, the analysis chip of the present invention was small and could easily and quickly analyze a plurality of analysis items from a small amount of whole blood. Here, although the dry chemistry reagent for 2 items was used as a multilayer dry analysis element, the number of items can be increased. Here, the analysis was performed from the color development. Subsequently, photometric analysis was performed.
ＧＬＵ−ＰおよびＴＢＩＬ−Ｐスライドの発色の様子を［装置例１］の光学系を用いて同時にＣＣＤカメラで撮像し、ＬＵＺＥＸ−ＳＥを用いて得られた画像を処理し、ＧＬＵ−ＰおよびＴＢＩＬ−Ｐスライドの画像の中心の平均受光量を求めて光学濃度に換算し、検体中のグルコース及び総ビリルビン濃度を求めた。ＣＣＤカメラを用いて測定した結果が正しいかどうか比較するために、日立製作所製の自動臨床検査装置７１７０を用いて検体中のグルコース及び総ビリルビン濃度を求めた。結果を表１に示す。このとき、ＧＬＵ−ＰおよびＴＢＩＬ−Ｐスライドでは測定波長が異なるため、表２に示すように干渉フィルターの波長を５秒ごとに逐次変えて測光した。このように、本発明の分析チップは、測光による分析を行うこともできた。 The color development of the GLU-P and TBIL-P slides was simultaneously imaged with a CCD camera using the optical system of [Example 1], the image obtained using LUZEX-SE was processed, and GLU-P and TBIL The average amount of light received at the center of the image of the -P slide was calculated and converted to optical density, and the glucose and total bilirubin concentrations in the specimen were determined. In order to compare whether the results measured using a CCD camera are correct, the glucose and total bilirubin concentrations in the specimen were determined using an automatic clinical test apparatus 7170 manufactured by Hitachi, Ltd. The results are shown in Table 1. At this time, since the measurement wavelength differs between the GLU-P and TBIL-P slides, photometry was performed by sequentially changing the wavelength of the interference filter every 5 seconds as shown in Table 2. Thus, the analysis chip of the present invention was able to perform analysis by photometry.
１００ 測定装置
１１ 分析チップ設置部
１２ 光源
１３ 光可変部（減光フィルタ）
１４ 波長可変部（干渉フィルタ）
１５ａ、１５ｂ、１５ｃ レンズ
１６ エリアセンサ（ＣＣＤ）
１７ コンピュータ（画像処理装置）
100 Measuring Device 11 Analysis Chip Installation Unit 12 Light Source 13 Light Variable Unit (Neutral Filter)
14 Wavelength tuning unit (interference filter)
15a, 15b, 15c Lens 16 Area sensor (CCD)
17 Computer (image processing device)
１ 全血を注入する要素
２ 血球分離要素（前処理要素）（１）
３ 血漿中の一つ以上の成分を分析することのできる一つ以上の多層乾式分析要素（２）
４ 前記（１）と（２）をつなぐ一つ以上の流路（３）
1 Element for injecting whole blood 2 Blood cell separation element (pretreatment element) (1)
3 One or more multi-layer dry analytical elements that can analyze one or more components in plasma (2)
4 One or more flow paths (3) connecting (1) and (2)
３１ 検体注入口
３２ 溶血試薬
３３ 多層乾式分析要素
３４ 流路
３５ 空気抜き
31 Specimen Inlet 32 Hemolysis Reagent 33 Multilayer Dry Analysis Element 34 Channel 35 Air Vent
４０ マイクロチップ（分析チップ）
４１ 筒（注入口）
４２ａ ガラス繊維濾紙
４２ｂ ポリスルホン多孔質膜
４３ 多層乾式分析要素
４４ 流路
４５ 筒
４６ 上材
４７ 下材
40 microchip (analysis chip)
41 tube (inlet)
42a Glass fiber filter paper 42b Polysulfone porous membrane 43 Multi-layer dry analytical element 44 Channel 45 Tube 46 Upper material 47 Lower material
Claims (11)
少なくとも
（１）検体の前処理をする一つ以上の前処理要素、
（２）前処理後の検体中の一つ以上の成分を分析する、一つ以上の多層乾式分析要素、及び
（３）前記前処理要素と前記多層乾式分析要素とをつなぐ一つ以上の流路を含むことを特徴とする分析チップ。 An integrated analysis chip for analyzing one or more components in a specimen,
At least (1) one or more pretreatment elements for pretreatment of the specimen,
(2) one or more multi-layer dry analytical elements for analyzing one or more components in the sample after pre-treatment; and (3) one or more streams connecting the pre-treatment elements and the multi-layer dry analytical elements. An analysis chip comprising a road.
少なくとも
（１）検体の前処理をする一つ以上の前処理要素、及び
（２）前処理後の検体中の一つ以上の成分を分析する、一つ以上の多層乾式分析要素を含み、前記前処理要素と前記多層乾式分析要素とが分析チップ内で連結している、分析チップ。 An integrated analysis chip for analyzing one or more components in a specimen,
At least (1) one or more pretreatment elements for pretreatment of the specimen, and (2) one or more multilayer dry analysis elements for analyzing one or more components in the specimen after the pretreatment, An analysis chip in which a pretreatment element and the multilayer dry analysis element are connected in an analysis chip.
前処理要素及び多層乾式分析要素の２要素
が、一つのカートリッジに含有されて一体化された、請求項１〜８のいずれかに記載の分析チップ。 The pretreatment element, the multilayer dry analysis element, and the three elements of the flow path, or the two elements of the pretreatment element and the multilayer dry analysis element are contained in one cartridge and integrated. Analysis chip as described in.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005071398A JP2006058280A (en) | 2004-03-16 | 2005-03-14 | Assay chip |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2004073965 | 2004-03-16 | ||
| JP2004215302 | 2004-07-23 | ||
| JP2005071398A JP2006058280A (en) | 2004-03-16 | 2005-03-14 | Assay chip |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006058280A true JP2006058280A (en) | 2006-03-02 |
Family
ID=36105837
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2005071398A Pending JP2006058280A (en) | 2004-03-16 | 2005-03-14 | Assay chip |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2006058280A (en) |
Cited By (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006130306A (en) * | 2004-10-05 | 2006-05-25 | Nikkiso Co Ltd | Biological component measuring unit, biological component measuring unit bag, medical care assistance equipment kit, and medical care assistance equipment kit bag |
| JP2006242872A (en) * | 2005-03-04 | 2006-09-14 | Kyocera Corp | Separation device and measuring apparatus with the same |
| WO2007039946A1 (en) * | 2005-10-05 | 2007-04-12 | Nikkiso Co., Ltd. | Biological component measuring unit, biological component measuring unit package, medical support device kit and medical support device kit package |
| JP2007259762A (en) * | 2006-03-28 | 2007-10-11 | Univ Of Tsukuba | Microprobe analysis device and method for analyzing microsample |
| WO2007136057A1 (en) | 2006-05-24 | 2007-11-29 | Kyoto University | Microchannel for separating blood plasma |
| WO2010016372A1 (en) * | 2008-08-06 | 2010-02-11 | コニカミノルタオプト株式会社 | Microchip |
| JP2011220768A (en) * | 2010-04-07 | 2011-11-04 | Sharp Corp | Analyzer and analysis method |
| WO2012081361A1 (en) * | 2010-12-13 | 2012-06-21 | シャープ株式会社 | Analysis apparatus and analysis method |
| JP2012211870A (en) * | 2011-03-31 | 2012-11-01 | Shimadzu Corp | Microchip and method for manufacturing the same |
| WO2014131490A1 (en) * | 2013-02-08 | 2014-09-04 | Infineon Technologies Ag | Microfluidic device and method |
| JP2015194354A (en) * | 2014-03-31 | 2015-11-05 | ブラザー工業株式会社 | inspection chip |
| JP2017507335A (en) * | 2014-03-05 | 2017-03-16 | セラノス， インコーポレイテッドＴｈｅｒａｎｏｓ， Ｉｎｃ． | Sample collection and sample separation methods and equipment |
| WO2017068929A1 (en) * | 2015-10-22 | 2017-04-27 | テルモ株式会社 | Testing instrument and component measurement device set |
| JP2017223532A (en) * | 2016-06-15 | 2017-12-21 | ウシオ電機株式会社 | Microchannel chip and analyte concentration measurement device |
| JP2017223533A (en) * | 2016-06-15 | 2017-12-21 | ウシオ電機株式会社 | Microchannel chip |
| US10173182B2 (en) | 2013-08-08 | 2019-01-08 | Panasonic Corporation | Nucleic acid amplification device, nucleic acid amplification apparatus, and nucleic acid amplification method for transporting reaction solution including target nucleic acid via capillary force to amplify target nucleic acid |
| JP2019086450A (en) * | 2017-11-09 | 2019-06-06 | 国立大学法人弘前大学 | Analysis device for whole blood albumin, and analysis method for whole blood albumin |
| JP2020016659A (en) * | 2013-05-22 | 2020-01-30 | アイメック・ヴェーゼットウェーＩｍｅｃ Ｖｚｗ | Compact fluid analysis device and manufacturing method |
| JP2022516800A (en) * | 2019-01-11 | 2022-03-02 | 広州万孚生物技術股▲ふん▼有限公司 | A plate for sample addition and an immunochromatographic detection device including this plate for sample addition |
| CN114196539A (en) * | 2021-12-15 | 2022-03-18 | 中国科学院大连化学物理研究所 | In-vitro pump-free tissue culture chip based on microfluidic technology |
-
2005
- 2005-03-14 JP JP2005071398A patent/JP2006058280A/en active Pending
Cited By (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006130306A (en) * | 2004-10-05 | 2006-05-25 | Nikkiso Co Ltd | Biological component measuring unit, biological component measuring unit bag, medical care assistance equipment kit, and medical care assistance equipment kit bag |
| JP2006242872A (en) * | 2005-03-04 | 2006-09-14 | Kyocera Corp | Separation device and measuring apparatus with the same |
| WO2007039946A1 (en) * | 2005-10-05 | 2007-04-12 | Nikkiso Co., Ltd. | Biological component measuring unit, biological component measuring unit package, medical support device kit and medical support device kit package |
| US9687185B2 (en) | 2005-10-05 | 2017-06-27 | Nikkiso Co., Ltd. | Biological component-measuring unit |
| JP4660768B2 (en) * | 2006-03-28 | 2011-03-30 | 国立大学法人 筑波大学 | Microanalyzer and method for analyzing microsample |
| JP2007259762A (en) * | 2006-03-28 | 2007-10-11 | Univ Of Tsukuba | Microprobe analysis device and method for analyzing microsample |
| US8003062B2 (en) | 2006-05-24 | 2011-08-23 | Kyoto University | Microchannel for separating blood plasma |
| WO2007136057A1 (en) | 2006-05-24 | 2007-11-29 | Kyoto University | Microchannel for separating blood plasma |
| EP2312322A1 (en) * | 2008-08-06 | 2011-04-20 | Konica Minolta Opto, Inc. | Microchip |
| WO2010016372A1 (en) * | 2008-08-06 | 2010-02-11 | コニカミノルタオプト株式会社 | Microchip |
| EP2312322A4 (en) * | 2008-08-06 | 2014-08-13 | Konica Minolta Opto Inc | Microchip |
| JP2011220768A (en) * | 2010-04-07 | 2011-11-04 | Sharp Corp | Analyzer and analysis method |
| WO2012081361A1 (en) * | 2010-12-13 | 2012-06-21 | シャープ株式会社 | Analysis apparatus and analysis method |
| JP2012127696A (en) * | 2010-12-13 | 2012-07-05 | Sharp Corp | Analyzer and analyzing method |
| JP2012211870A (en) * | 2011-03-31 | 2012-11-01 | Shimadzu Corp | Microchip and method for manufacturing the same |
| WO2014131490A1 (en) * | 2013-02-08 | 2014-09-04 | Infineon Technologies Ag | Microfluidic device and method |
| US10086370B2 (en) | 2013-02-08 | 2018-10-02 | Infineon Technologies Ag | Microfluidic device and method |
| JP2020016659A (en) * | 2013-05-22 | 2020-01-30 | アイメック・ヴェーゼットウェーＩｍｅｃ Ｖｚｗ | Compact fluid analysis device and manufacturing method |
| US10173182B2 (en) | 2013-08-08 | 2019-01-08 | Panasonic Corporation | Nucleic acid amplification device, nucleic acid amplification apparatus, and nucleic acid amplification method for transporting reaction solution including target nucleic acid via capillary force to amplify target nucleic acid |
| JP2017507335A (en) * | 2014-03-05 | 2017-03-16 | セラノス， インコーポレイテッドＴｈｅｒａｎｏｓ， Ｉｎｃ． | Sample collection and sample separation methods and equipment |
| JP2015194354A (en) * | 2014-03-31 | 2015-11-05 | ブラザー工業株式会社 | inspection chip |
| JPWO2017068929A1 (en) * | 2015-10-22 | 2018-04-05 | テルモ株式会社 | Test tool and component measuring device set |
| WO2017068929A1 (en) * | 2015-10-22 | 2017-04-27 | テルモ株式会社 | Testing instrument and component measurement device set |
| CN107525765B (en) * | 2016-06-15 | 2021-09-07 | 优志旺电机株式会社 | Microchannel chip and sample concentration measuring device |
| JP2017223533A (en) * | 2016-06-15 | 2017-12-21 | ウシオ電機株式会社 | Microchannel chip |
| CN107525765A (en) * | 2016-06-15 | 2017-12-29 | 优志旺电机株式会社 | Microfluidic circuit chip and corpse or other object for laboratory examination and chemical testing concentration measurement apparatus |
| JP2017223532A (en) * | 2016-06-15 | 2017-12-21 | ウシオ電機株式会社 | Microchannel chip and analyte concentration measurement device |
| JP2019086450A (en) * | 2017-11-09 | 2019-06-06 | 国立大学法人弘前大学 | Analysis device for whole blood albumin, and analysis method for whole blood albumin |
| JP7015521B2 (en) | 2017-11-09 | 2022-02-03 | 国立大学法人弘前大学 | Whole blood albumin analyzer and whole blood albumin analysis method |
| JP2022516800A (en) * | 2019-01-11 | 2022-03-02 | 広州万孚生物技術股▲ふん▼有限公司 | A plate for sample addition and an immunochromatographic detection device including this plate for sample addition |
| JP7186302B2 (en) | 2019-01-11 | 2022-12-08 | 広州万孚生物技術股▲ふん▼有限公司 | Sample addition plate and immunochromatographic detection device including this sample addition plate |
| CN114196539A (en) * | 2021-12-15 | 2022-03-18 | 中国科学院大连化学物理研究所 | In-vitro pump-free tissue culture chip based on microfluidic technology |
| CN114196539B (en) * | 2021-12-15 | 2023-11-28 | 中国科学院大连化学物理研究所 | In-vitro pump-free culture chip based on microfluidic technology |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2006058280A (en) | Assay chip | |
| US20070178521A1 (en) | Assay chip | |
| US9212994B2 (en) | Fluorescence detector, filter device and related methods | |
| JP4627395B2 (en) | Analytical cartridge and liquid feeding control device | |
| JP2007071711A (en) | Analytic chip | |
| Gervais et al. | Toward one-step point-of-care immunodiagnostics using capillary-driven microfluidics and PDMS substrates | |
| CA1310566C (en) | Element and method for performing biological assays accurately, rapidlyand simply | |
| CN103792354B (en) | A kind of micro-fluidic paper substrate chip detecting antibody of HCV and preparation method thereof | |
| JP2004069397A (en) | Analysis chip and analytical apparatus | |
| KR20060130657A (en) | Analysis element for use in method of testing specimen | |
| JP6199527B1 (en) | Lateral flow assay device with filtered flow control | |
| EP1717585B1 (en) | Microchip and analysis method using the same | |
| WO2009136476A1 (en) | Biosensor manufacturing method and biosensor | |
| JP2005300528A (en) | Analysis element used for inspection method of specimen | |
| JP5125680B2 (en) | Separation chip and separation method | |
| CN1193106A (en) | Liquid-sample collection device | |
| Lin et al. | An integrated microfluidic system for the determination of microalbuminuria by measuring the albumin-to-creatinine ratio | |
| JP6687937B2 (en) | Analytical substrate manufacturing method | |
| CN110531065B (en) | Micro-whole blood separation and plasma detection integrated micro-fluidic chip based on hydrogel | |
| JP2011092125A (en) | Collection implement | |
| JPH0526875A (en) | One-piece type multilayer analysis element | |
| JP6190472B2 (en) | Novel PoC inspection system and method | |
| JP2006317250A (en) | Inspection device and uniform mixing and diluting method using it | |
| JP7062285B2 (en) | Assay program and assay equipment | |
| Moonen | Design, fabrication and testing of a point-of-care microfluidic chip |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20060328 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Effective date: 20061127 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Effective date: 20070219 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20071108 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20071115 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20071122 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Effective date: 20090219 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20090225 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Effective date: 20090729 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 |