JP2016192939A - Probe for detecting cyp2c19*2 and probe for detecting cyp2c19*3 - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To perform discrimination of homo and hetero and discrimination of a wild-type allele highly accurately to each of variant-type allele CYP2C19*2 and CYP2C19*3 in a CYP2C19 gene.SOLUTION: A probe includes an oligonucleotide having a base length of 13 to 23 which consists of a sequence: 5'- TTTCCCRGGAACC-3' or a sequence in which 1 to 5 bases are added to both ends of the sequence, or an oligonucleotide having the entire base length of 15 to 25 which consists of a sequence: 5'-CCCCCTGRATCCAGG-3' or a sequence in which 1 to 5 bases are added to both ends of the sequence.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、薬物代謝酵素に関与するチトクロームP450 2C19（CYP2C19）遺伝子に存在する変異型アレル：CYP2C19*2を判定するためのCYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3を判定するためのCYP2C19*3検出用プローブに関する。   The present invention relates to a mutant allele present in a cytochrome P450 2C19 (CYP2C19) gene involved in a drug-metabolizing enzyme: a CYP2C19 * 2 detection probe for determining CYP2C19 * 2, and a CYP2C19 * 3 for determining CYP2C19 * 3 The present invention relates to a detection probe.

チトクロームP450（CYP）は、薬物代謝に関与する酵素である。チトクロームP450には20種以上の分子種が報告されており、“CYP”に続けて、ファミリーを示すアラビア数字、サブファミリーを示すアルファベット及び分子種番号を示すアラビア数字の組合せで表記される。中でも、CYP2C19は、オメプラゾール及びランソプラゾールといった胃酸抑制薬、催眠鎮痛薬であるジアゼパム、抗てんかん薬であるフェニトイン、抗うつ薬であるイミプラミン、マラリア治療薬であるプログアニル等の多くの薬剤の代謝に関与することが知られている。   Cytochrome P450 (CYP) is an enzyme involved in drug metabolism. More than 20 molecular species have been reported for cytochrome P450, followed by “CYP” followed by an Arabic numeral indicating a family, an alphabet indicating a subfamily, and an Arabic numeral indicating a molecular species number. Among them, CYP2C19 is involved in the metabolism of many drugs such as gastric acid inhibitors such as omeprazole and lansoprazole, diazepam as a hypnotic analgesic, phenytoin as an antiepileptic, imipramine as an antidepressant, and proguanil as a malaria treatment. It is known to do.

また、CYP2C19遺伝子の変異解析により、上記薬物の代謝活性低下に関与する遺伝子変異が同定されている。具体的には、エクソン５に座位する681番目のグアニンがアデニンに変異する多型（G681A）が知られている。この一塩基多型に付与されているrs番号はrs4244285であり、当該多型における変異アレルをCYP2C19*2と表記し、野生型アレルをCYP2C19*1と表記している。エクソン４に座位する636番目のグアニンがアデニンに変異する多型（G636A）も知られており、この一塩基多型に付与されているrs番号はrs4986893であり、当該多型における変異アレルをCYP2C19*3と表記している。   In addition, mutations in the CYP2C19 gene have identified gene mutations that are associated with a decrease in the metabolic activity of the drug. Specifically, a polymorphism (G681A) in which the 681st guanine located at exon 5 is mutated to adenine is known. The rs number assigned to this single nucleotide polymorphism is rs4244285, the mutant allele in the polymorphism is denoted as CYP2C19 * 2, and the wild type allele is denoted as CYP2C19 * 1. A polymorphism (G636A) in which the 636th guanine located in exon 4 is mutated to adenine is also known. The rs number assigned to this single nucleotide polymorphism is rs4986893, and the mutant allele in the polymorphism is CYP2C19. * 3.

変異型アレルCYP2C19*2及びCYP2C19*3のいずれも、酵素活性を欠失する変異であることが知られており、野生型アレルをホモで有する個体と比較して、CYP2C19*2をホモで有する個体、CYP2C19*3をホモで有する個体、CYP2C19*2及びCYP2C19*3を有する個体は、上記薬剤の代謝速度が遅延する。なお、CYP2C19*2及びCYP2C19*3のいずれか一方をヘテロで有する個体については、野生型アレルをホモで有する個体と、CYP2C19*2をホモで有する個体、CYP2C19*3をホモで有する個体、CYP2C19*2及びCYP2C19*3を有する個体との中間の代謝速度となる。   Mutant alleles CYP2C19 * 2 and CYP2C19 * 3 are both known to be mutants that lack enzyme activity, and have CYP2C19 * 2 homozygous compared to individuals that have wild type alleles homozygously. Individuals, individuals having CYP2C19 * 3 homozygous, and individuals having CYP2C19 * 2 and CYP2C19 * 3 have a delayed metabolic rate of the drug. In addition, for individuals having either one of CYP2C19 * 2 and CYP2C19 * 3 heterozygous, individuals having wild type alleles, individuals having CYP2C19 * 2 homozygous, individuals having CYP2C19 * 3 homozygous, CYP2C19 * 2 and intermediate metabolic rate with individuals with CYP2C19 * 3.

このように、CYP2C195が代謝に関与する薬剤については、薬物投与対象者におけるCYP2C19遺伝子の一塩基多型を調べることで、適切な薬物投与量を決定することができる。   As described above, for drugs in which CYP2C195 is involved in metabolism, an appropriate drug dosage can be determined by examining a single nucleotide polymorphism of the CYP2C19 gene in the drug administration subject.

例えば、特許文献１には、CYP2C19*2及びCYP2C19*3を含むCYP2C19遺伝子の多型をタイピングし、これに基づいて抗血小板（特にクロピドグレル）に対する応答性を評価する技術が開示されている。しかし、特許文献１には、これらCYP2C19*2及びCYP2C19*3を検出するためのプローブ等については開示されていない。   For example, Patent Document 1 discloses a technique for typing CYP2C19 gene polymorphisms including CYP2C19 * 2 and CYP2C19 * 3 and evaluating responsiveness to antiplatelets (particularly clopidogrel) based on this. However, Patent Document 1 does not disclose a probe or the like for detecting these CYP2C19 * 2 and CYP2C19 * 3.

また、特許文献２には、CYP2C19*2及びCYP2C19*3を含むCYP2C19遺伝子や、他の遺伝子に含まれる多型に基づいて、患者に対する薬物(例えば、向精神薬)を選択する方法が開示されている。しかし、特許文献２には、これらCYP2C19*2及びCYP2C19*3を検出するためのプローブ等については開示されていない。   Patent Document 2 discloses a method for selecting a drug (for example, a psychotropic drug) for a patient based on CYP2C19 genes including CYP2C19 * 2 and CYP2C19 * 3 and polymorphisms included in other genes. ing. However, Patent Document 2 does not disclose probes for detecting these CYP2C19 * 2 and CYP2C19 * 3.

特表2011-512788公報Special table 2011-512788 特表2007-525154公報Special Table 2007-525154

しかしながら、従来、CYP2C19遺伝子における変異型アレルCYP2C19*2及びCYP2C19*3について、ホモ及びヘテロの判別、並びに野生型アレルの判別を高精度に行える技術は知られていなかった。   However, conventionally, no technology has been known that can perform homozygous and heterozygous discrimination and wild-type allele discrimination with high accuracy for the CYP2C19 gene mutant alleles CYP2C19 * 2 and CYP2C19 * 3.

そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、CYP2C19遺伝子における変異型アレルCYP2C19*2及びCYP2C19*3それぞれについてホモ及びヘテロの判別並びに野生型アレルの判別を高精度に行うことができるCYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3検出用プローブ、並びにこれら用いた薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法を提供することを目的とする。   Therefore, in view of the above-described circumstances, the present invention provides CYP2C19 * 2 detection capable of performing homozygous and heterozygous discrimination and wild-type allele discrimination with high accuracy for the CYP2C19 gene mutant alleles CYP2C19 * 2 and CYP2C19 * 3, respectively It is an object to provide a probe for detection, a probe for CYP2C19 * 3 detection, and a data acquisition method for predicting drug metabolizing ability.

本発明者らは、上述した目的を達成するために鋭意検討した結果、CYP2C19遺伝子における変異型アレルCYP2C19*2及びCYP2C19*3を検出することができる適切な塩基配列を見いだし、本発明を完成するに至った。なお、多型の遺伝子型を判定するためのプローブは、遺伝子多型の場所さえ解明すれば任意に製造できるものではなく、当該多型の変異ごとに適当な塩基配列を有するプローブを見出す必要がある。   As a result of intensive studies to achieve the above-mentioned object, the present inventors have found an appropriate base sequence capable of detecting the mutant alleles CYP2C19 * 2 and CYP2C19 * 3 in the CYP2C19 gene, thereby completing the present invention. It came to. In addition, the probe for determining the genotype of the polymorphism cannot be produced arbitrarily as long as the location of the gene polymorphism is elucidated, and it is necessary to find a probe having an appropriate base sequence for each mutation of the polymorphism. is there.

（１）配列：5’- TTTCCCRGGAACC-3’（配列番号１、RはA又はG）若しくは当該配列に対して相補的配列からなる、又は当該配列若しくは当該相補的配列の両端に１〜５の塩基が付加した配列からなる、全体が１３〜２３塩基長であるオリゴヌクレオチドを含む、CYP2C19*2検出用プローブ。
（２）上記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１に示す塩基配列の5’末端にA、5’-TA-3’、5’-TTA-3’、5’-ATTA-3’及び5’-GATTA-3’のいずれかが付加され、上記配列の3’末端にC、5’-CA-3’、5’-CAT-3’、5’-CATA-3’及び5’-CATAA-3’のいずれかが付加された塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的配列であることを特徴とする（１）記載のCYP2C19*2検出用プローブ。
（３）上記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２〜６のいずれかの塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的配列であることを特徴とする（１）記載のCYP2C19*2検出用プローブ。
ATTTCCCRGGAACCC（配列番号２）
TATTTCCCRGGAACCCA（配列番号３）
TTATTTCCCRGGAACCCAT（配列番号４）
ATTATTTCCCRGGAACCCATA（配列番号５）
GATTATTTCCCRGGAACCCATAA（配列番号６）
（４）配列：5’-CCCCCTGRATCCAGG-3’（配列番号７、RはA又はG）若しくは当該配列に対して相補的配列からなる、又は当該配列若しくは当該相補的配列の両端に１〜５の塩基が付加した配列からなる、全体が１５〜２５塩基長であるオリゴヌクレオチドを含む、CYP2C19*3検出用プローブ。
（５）上記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号７に示す塩基配列の5’末端にA、5’- CA -3’、5’-GCA-3’、5’-AGCA-3’及び5’-AAGCA-3’のいずれかが付加され、上記配列の3’末端にT、5’-TA-3’、5’-TAA-3’、5’-TAAG-3’及び5’-TAAGG-3’のいずれかが付加された塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的配列であることを特徴とする（４）記載のCYP2C19*3検出用プローブ。
（６）上記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号８〜１３のいずれかの塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的配列であることを特徴とする（４）記載のCYP2C19*3検出用プローブ。
ACCCCCTGRATCCAGGT（配列番号８）
CACCCCCTGRATCCAGGTA（配列番号９）
CACCCCCTGRATCCAGGTAA（配列番号１０）
GCACCCCCTGRATCCAGGTAA（配列番号１１）
AGCACCCCCTGRATCCAGGTAAG（配列番号１２）
AAGCACCCCCTGRATCCAGGTAAGG（配列番号１３）
（７）上記（１）乃至（３）いずれか記載のCYP2C19*2検出用プローブ及び/又は上記（４）乃至（６）いずれか記載のCYP2C19*3検出用プローブを有するマイクロアレイ。
（８）被験者由来のゲノムを鋳型としてCYP2C19遺伝子におけるrs4244285で特定される多型部位を含む核酸断片を増幅する工程と、
得られた核酸断片と上記（１）乃至（３）いずれか記載のCYP2C19*2検出用プローブとを接触させる工程と、
得られた核酸断片と上記CYP2C19*2検出用プローブとのハイブリダイズを検出する工程とを含み、
rs4244285の遺伝子型を判定する、薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
（９）上記rs4244285の遺伝子型が変異型アレルCYP2C19*2のホモ又はヘテロである場合に薬剤代謝能が低いと判定することを特徴とする（８）記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
（１０）上記CYP2C19*2検出用プローブとして、rs4244285で特定される多型における野生型アレルに対応するオリゴヌクレオチドと、変異型アレルに対応するオリゴヌクレオチドとを使用することを特徴とする（８）記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
（１１）rs4244285で特定される多型における野生型アレルに対応する上記オリゴヌクレオチドと、変異型アレルに対応する上記オリゴヌクレオチドとは、長さが同じである又は２塩基以内の差であることを特徴とする（８）記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
（１２）被験者由来のゲノムを鋳型としてCYP2C19遺伝子におけるrs4986893で特定される多型部位を含む核酸断片を増幅する工程と、
得られた核酸断片と上記（４）乃至（６）いずれか記載のCYP2C19*3検出用プローブとを接触させる工程と、
得られた核酸断片と上記CYP2C19*3検出用プローブとのハイブリダイズを検出する工程とを含み、
rs4986893の遺伝子型を判定する、薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
（１３）上記rs4986893の遺伝子型が変異型アレルCYP2C19*3のホモ又はヘテロである場合に薬剤代謝能が低いと判定することを特徴とする（１２）記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
（１４）上記CYP2C19*3検出用プローブとして、rs4986893で特定される多型における野生型アレルに対応するオリゴヌクレオチドと、変異型アレルに対応するオリゴヌクレオチドとを使用することを特徴とする（１２）記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
（１５）rs4986893で特定される多型における野生型アレルに対応する上記オリゴヌクレオチドと、変異型アレルに対応する上記オリゴヌクレオチドとは、長さが同じである又は２塩基以内の差であることを特徴とする（１２）記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
（１６）上記（７）記載のマイクロアレイを使用することを特徴とする（８）又は（１２）記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
（１７）上記核酸断片を増幅する工程で得られた核酸断片は蛍光標識を有し、上記ハイブリダイズを検出する工程では当該蛍光標識の蛍光強度値を測定することを特徴とする（８）又は（１２）記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
（１８）上記薬物はオメプラゾール及び/又はランソプラゾールであることを特徴とする（８）又は（１２）記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。 (1) Sequence: 5′-TTTCCCRGGAACC-3 ′ (SEQ ID NO: 1, R is A or G) or a sequence complementary to the sequence, or 1 to 5 at both ends of the sequence or the complementary sequence A CYP2C19 * 2 detection probe comprising an oligonucleotide consisting of a sequence to which a base is added and having a total length of 13 to 23 bases.
(2) The base sequence of the oligonucleotide is A, 5′-TA-3 ′, 5′-TTA-3 ′, 5′-ATTA-3 ′ and 5 at the 5 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. One of '-GATTA-3' is added, and C, 5'-CA-3 ', 5'-CAT-3', 5'-CATA-3 'and 5'-CATAA are added to the 3' end of the above sequence. The probe for CYP2C19 * 2 detection according to (1), which is a base sequence to which any of -3 ′ is added or a complementary sequence to the base sequence.
(3) The CYP2C19 * 2 detection probe according to (1), wherein the base sequence of the oligonucleotide is any one of SEQ ID NOs: 2 to 6 or a complementary sequence to the base sequence .
ATTTCCCRGGAACCC (SEQ ID NO: 2)
TATTTCCCRGGAACCCA (SEQ ID NO: 3)
TTATTTCCCRGGAACCCAT (SEQ ID NO: 4)
ATTATTTCCCRGGAACCCATA (SEQ ID NO: 5)
GATTATTTCCCRGGAACCCATAA (SEQ ID NO: 6)
(4) Sequence: 5′-CCCCCTGRATCCAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 7, R is A or G) or a sequence complementary to the sequence, or 1 to 5 at both ends of the sequence or the complementary sequence A CYP2C19 * 3 detection probe comprising an oligonucleotide consisting of a sequence to which a base is added and having a total length of 15 to 25 bases.
(5) The base sequence of the above oligonucleotide has A, 5′-CA-3 ′, 5′-GCA-3 ′, 5′-AGCA-3 ′ and 5 at the 5 ′ end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7. Any of '-AAGCA-3' is added, and T, 5'-TA-3 ', 5'-TAA-3', 5'-TAAG-3 'and 5'-TAAGG are added to the 3' end of the above sequence. The probe for CYP2C19 * 3 detection according to (4), which is a base sequence to which any of -3 ′ is added or a complementary sequence to the base sequence.
(6) The CYP2C19 * 3 detection probe according to (4), wherein the base sequence of the oligonucleotide is any one of SEQ ID NOs: 8 to 13 or a complementary sequence to the base sequence .
ACCCCCTGRATCCAGGT (SEQ ID NO: 8)
CACCCCCTGRATCCAGGTA (SEQ ID NO: 9)
CACCCCCTGRATCCAGGTAA (SEQ ID NO: 10)
GCACCCCCTGRATCCAGGTAA (SEQ ID NO: 11)
AGCACCCCCTGRATCCAGGTAAG (SEQ ID NO: 12)
AAGCACCCCCTGRATCCAGGTAAGG (SEQ ID NO: 13)
(7) A microarray having the CYP2C19 * 2 detection probe according to any one of (1) to (3) above and / or the CYP2C19 * 3 detection probe according to any one of (4) to (6) above.
(8) amplifying a nucleic acid fragment containing a polymorphic site specified by rs4244285 in the CYP2C19 gene using a subject-derived genome as a template;
Contacting the obtained nucleic acid fragment with the CYP2C19 * 2 detection probe according to any one of (1) to (3) above,
A step of detecting hybridization of the obtained nucleic acid fragment and the CYP2C19 * 2 detection probe,
A data acquisition method for predicting drug metabolizing ability to determine the genotype of rs4244285.
(9) The data for predicting drug metabolizing ability according to (8), wherein the drug metabolizing ability is determined to be low when the genotype of rs4244285 is homo or heterozygous of the mutant allele CYP2C19 * 2 Acquisition method.
(10) As the CYP2C19 * 2 detection probe, an oligonucleotide corresponding to a wild-type allele in the polymorphism specified by rs4244285 and an oligonucleotide corresponding to a mutant-type allele are used (8) A data acquisition method for predicting the described drug metabolic ability.
(11) The oligonucleotide corresponding to the wild-type allele in the polymorphism specified by rs4244285 and the oligonucleotide corresponding to the mutant-type allele have the same length or a difference of 2 bases or less. A data acquisition method for predicting drug metabolizing ability as described in (8).
(12) amplifying a nucleic acid fragment containing a polymorphic site specified by rs4986893 in the CYP2C19 gene using a subject-derived genome as a template;
Contacting the obtained nucleic acid fragment with the CYP2C19 * 3 detection probe according to any one of (4) to (6) above,
A step of detecting hybridization of the obtained nucleic acid fragment and the CYP2C19 * 3 detection probe,
Data acquisition method for predicting drug metabolizing ability to determine genotype of rs4986893.
(13) The data for predicting drug metabolizing ability according to (12), wherein the drug metabolizing ability is determined to be low when the genotype of rs4986893 is homo or heterozygous of the mutant allele CYP2C19 * 3 Acquisition method.
(14) As the CYP2C19 * 3 detection probe, an oligonucleotide corresponding to a wild-type allele in the polymorphism specified by rs4986893 and an oligonucleotide corresponding to a mutant-type allele are used (12) A data acquisition method for predicting the described drug metabolic ability.
(15) The oligonucleotide corresponding to the wild-type allele in the polymorphism specified by rs4986893 and the oligonucleotide corresponding to the mutant-type allele have the same length or a difference of 2 bases or less. A data acquisition method for predicting drug metabolizing ability described in (12).
(16) A data acquisition method for predicting drug metabolizing ability according to (8) or (12), wherein the microarray according to (7) is used.
(17) The nucleic acid fragment obtained in the step of amplifying the nucleic acid fragment has a fluorescent label, and in the step of detecting the hybridization, the fluorescence intensity value of the fluorescent label is measured (8) or (12) A data acquisition method for predicting drug metabolizing ability.
(18) The data acquisition method for predicting drug metabolizing ability according to (8) or (12), wherein the drug is omeprazole and / or lansoprazole.

本発明に係るCYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3検出用プローブは、CYP2C19遺伝子におけるrs4244285を含む領域を増幅した核酸断片及びCYP2C19遺伝子におけるrs4986893を含む領域を増幅した核酸断片に対して、rs4244285の遺伝子型及びrs4986893の遺伝子型に応じてそれぞれ特異的にハイブリダイズすることができる。したがって、本発明に係るCYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3検出用プローブを利用することによって、rs4244285の遺伝子型及びrs4986893の遺伝子型をハイブリダイズといった簡便な処理によって高精度に判定することができる。   The CYP2C19 * 2 detection probe and the CYP2C19 * 3 detection probe according to the present invention are a nucleic acid fragment obtained by amplifying a region containing rs4244285 in the CYP2C19 gene and a nucleic acid fragment obtained by amplifying a region containing rs4986893 in the CYP2C19 gene. It can hybridize specifically depending on the genotype and the genotype of rs4986893. Therefore, by using the CYP2C19 * 2 detection probe and the CYP2C19 * 3 detection probe according to the present invention, the genotype of rs4244285 and the genotype of rs4986893 can be determined with high accuracy by a simple process such as hybridization. .

また、本発明に係るDNAチップは、上記CYP2C19*2検出用プローブ及び/又はCYP2C19*3検出用プローブを備えるため、rs4244285の遺伝子型及び/又はrs4986893の遺伝子型を判定する際に利用することができる。すなわち、本発明に係るDNAチップを利用することで、rs4244285の遺伝子型及び/又はrs4986893の遺伝子型を簡便な処理によって高精度に判定することができる。   In addition, since the DNA chip according to the present invention includes the above-mentioned CYP2C19 * 2 detection probe and / or CYP2C19 * 3 detection probe, it can be used when determining the genotype of rs4244285 and / or the genotype of rs4986893. it can. That is, by using the DNA chip according to the present invention, the genotype of rs4244285 and / or the genotype of rs4986893 can be determined with high accuracy by simple processing.

さらに、本発明に係る薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法は、上記CYP2C19*2検出用プローブ及び/又はCYP2C19*3検出用プローブを利用し、被験者のゲノムにおけるrs4244285の遺伝子型及び/又はrs4986893の遺伝子型を簡便に且つ高精度に判定した結果を利用している。したがって、本発明に係る薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法によれば、簡便な処理によって当該データを得ることができる。   Furthermore, the data acquisition method for predicting drug metabolizing ability according to the present invention uses the above-mentioned CYP2C19 * 2 detection probe and / or CYP2C19 * 3 detection probe, and the genotype and / or rs4244285 in the subject's genome. The result of determining the genotype of rs4986893 simply and with high accuracy is used. Therefore, according to the data acquisition method for predicting drug metabolism ability according to the present invention, the data can be obtained by a simple process.

本発明に係るCYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3検出用プローブは、それぞれrs4244285の遺伝子型及び/又はrs4986893の遺伝子型を検出するものである。   The CYP2C19 * 2 detection probe and the CYP2C19 * 3 detection probe according to the present invention detect the genotype of rs4244285 and / or the genotype of rs4986893, respectively.

CYP2C19*2検出用プローブは、rs4244285で特定される一塩基多型を含む所定の領域に対応する配列：5’-TTTCCCRGGAACC-3’（配列番号１、RはA又はG）若しくは当該配列に対して相補的配列からなる、又は当該配列若しくは当該相補的配列の両端に１〜５の塩基が付加した配列からなる、全体が１３〜２３塩基長であるオリゴヌクレオチドを含むものである。   The CYP2C19 * 2 detection probe is a sequence corresponding to a predetermined region containing a single nucleotide polymorphism specified by rs4244285: 5′-TTTCCCRGGAACC-3 ′ (SEQ ID NO: 1, R is A or G) or the sequence. And an oligonucleotide having a total length of 13 to 23 bases consisting of a complementary sequence, or consisting of the sequence or a sequence in which 1 to 5 bases are added to both ends of the complementary sequence.

言い換えると、本発明に係るCYP2C19*2検出用プローブは、配列：TTTCCCRGGAACCからなるオリゴヌクレオチドであっても良いし、配列：TTTCCCRGGAACCの3’末端及び/又は5’末端に１〜５の塩基が付加した配列からなるオリゴヌクレオチドであっても良い。ここで、配列：TTTCCCRGGAACCの5’末端に付加してもよい１〜５の塩基とは、具体的にA、5’-TA-3’、5’-TTA-3’、5’-ATTA-3’及び5’-GATTA-3’である。また、配列：TTTCCCRGGAACCの3’末端に付加しても良い１〜５の塩基とは、具体的にC、5’-CA-3’、5’-CAT-3’、5’-CATA-3’及び5’-CATAA-3’である。   In other words, the CYP2C19 * 2 detection probe according to the present invention may be an oligonucleotide consisting of the sequence: TTTCCCRGGAACC, or 1-5 bases are added to the 3 ′ end and / or the 5 ′ end of the sequence: TTTCCCRGGAACC. It may be an oligonucleotide having the sequence described above. Here, the bases 1 to 5 that may be added to the 5 ′ end of the sequence: TTTCCCRGGAACC are specifically A, 5′-TA-3 ′, 5′-TTA-3 ′, 5′-ATTA- 3 'and 5'-GATTA-3'. The bases 1 to 5 that may be added to the 3 ′ end of the sequence: TTTCCCRGGAACC are specifically C, 5′-CA-3 ′, 5′-CAT-3 ′, and 5′-CATA-3. 'And 5'-CATAA-3'.

或いは、本発明に係るCYP2C19*2検出用プローブは、配列：TTTCCCRGGAACCの相補的配列からなるオリゴヌクレオチドであっても良いし、配列：TTTCCCRGGAACCの相補的配列の3’末端及び/又は5’末端に１〜５の塩基が付加した配列からなるオリゴヌクレオチドであっても良い。ここで、配列：TTTCCCRGGAACCの相補的配列の5’末端に付加してもよい１〜５の塩基とは、具体的にA、5’-TA-3’、5’-TTA-3’、5’-ATTA-3’及び5’-GATTA-3’の相補鎖である。また、配列：TTTCCCRGGAACCの相補的配列の3’末端に付加しても良い１〜５の塩基とは、具体的にC、5’-CA-3’、5’-CAT-3’、5’-CATA-3’及び5’-CATAA-3’の相補鎖である。   Alternatively, the CYP2C19 * 2 detection probe according to the present invention may be an oligonucleotide composed of a complementary sequence of the sequence: TTTCCCRGGAACC, or at the 3 ′ end and / or the 5 ′ end of the complementary sequence of the sequence: TTTCCCRGGAACC. It may be an oligonucleotide having a sequence to which 1 to 5 bases are added. Here, the bases 1 to 5 that may be added to the 5 ′ end of the sequence: TTTCCCRGGAACC are specifically A, 5′-TA-3 ′, 5′-TTA-3 ′, 5 It is the complementary strand of '-ATTA-3' and 5'-GATTA-3 '. The bases 1 to 5 that may be added to the 3 ′ end of the complementary sequence of the sequence: TTTCCCRGGAACC are specifically C, 5′-CA-3 ′, 5′-CAT-3 ′, 5 ′. -The complementary strand of CATA-3 'and 5'-CATAA-3'.

より具体的に、本発明に係るCYP2C19*2検出用プローブとしては、配列番号１〜６のいずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとすることが好ましい。
5’-TTTCCCRGGAACC-3’（配列番号１）
5’-ATTTCCCRGGAACCC-3’（配列番号２）
5’-TATTTCCCRGGAACCCA-3’（配列番号３）
5’-TTATTTCCCRGGAACCCAT-3’（配列番号４）
5’-ATTATTTCCCRGGAACCCATA-3’（配列番号５）
5’-GATTATTTCCCRGGAACCCATAA-3’（配列番号６） More specifically, the CYP2C19 * 2 detection probe according to the present invention is preferably an oligonucleotide having any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 6.
5'-TTTCCCRGGAACC-3 '(SEQ ID NO: 1)
5'-ATTTCCCRGGAACCC-3 '(SEQ ID NO: 2)
5'-TATTTCCCRGGAACCCA-3 '(SEQ ID NO: 3)
5'-TTATTTCCCRGGAACCCAT-3 '(SEQ ID NO: 4)
5'-ATTATTTCCCRGGAACCCATA-3 '(SEQ ID NO: 5)
5'-GATTATTTCCCRGGAACCCATAA-3 '(SEQ ID NO: 6)

rs4244285は、CYP2C19遺伝子のエクソン５に座位する一塩基多型であり、野生型は681番目のグアニン（G）であり野生型アレル：CYP2C19*1と表記され、変異型はアデニン（A）であり変異型アレル：CYP2C19*2と表記される。変異型アレル：CYP2C19*2は、薬物の代謝能を遅延させる変異として知られている。よって、変異型アレル：CYP2C19*2をホモ又はヘテロで有する個体は、野生型アレルをホモで有する個体と比較して薬物代謝が遅延することが知られている。   rs4244285 is a single nucleotide polymorphism located at exon 5 of the CYP2C19 gene, the wild type is the 681st guanine (G), the wild type allele: CYP2C19 * 1, and the mutant type is adenine (A). Mutant allele: expressed as CYP2C19 * 2. Mutant allele: CYP2C19 * 2 is known as a mutation that delays the metabolic ability of drugs. Therefore, it is known that an individual having a mutant allele: CYP2C19 * 2 homo or hetero is delayed in drug metabolism as compared to an individual having a wild type allele.

一方、CYP2C19*3検出用プローブは、rs4986893で特定される一塩基多型を含む所定の領域に対応する配列：5’-CCCCCTGRATCCAGG-3’（配列番号７、RはA又はG）若しくは当該配列に対して相補的配列からなる、又は当該配列若しくは当該相補的配列の両端に１〜５の塩基が付加した配列からなる、全体が１５〜２５塩基長であるオリゴヌクレオチドを含むものである。   On the other hand, the CYP2C19 * 3 detection probe is a sequence corresponding to a predetermined region containing a single nucleotide polymorphism specified by rs4986893: 5′-CCCCCTGRATCCAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 7, R is A or G) or the sequence It comprises an oligonucleotide having a total length of 15 to 25 bases consisting of a complementary sequence or consisting of the sequence or a sequence in which 1 to 5 bases are added to both ends of the complementary sequence.

言い換えると、本発明に係るCYP2C19*3検出用プローブは、配列：CCCCCTGRATCCAGGからなるオリゴヌクレオチドであっても良いし、配列：CCCCCTGRATCCAGGの3’末端及び/又は5’末端に１〜５の塩基が付加した配列からなるオリゴヌクレオチドであっても良い。ここで、配列：CCCCCTGRATCCAGGの5’末端に付加してもよい１〜５の塩基とは、具体的にA、5’- CA -3’、5’-GCA-3’、5’-AGCA-3’及び5’-AAGCA-3’である。また、配列：CCCCCTGRATCCAGGの3’末端に付加してもよい１〜３の塩基とは、具体的にT、5’-TA-3’、5’-TAA-3’、5’-TAAG-3’及び5’-TAAGG-3’である。   In other words, the CYP2C19 * 3 detection probe according to the present invention may be an oligonucleotide consisting of the sequence: CCCCCTGRATCCAGG, or 1-5 bases are added to the 3 ′ end and / or the 5 ′ end of the sequence: CCCCCTGRATCCAGG. It may be an oligonucleotide having the sequence described above. Here, the bases 1 to 5 that may be added to the 5 ′ end of the sequence: CCCCCTGRATCCAGG are specifically A, 5′-CA-3 ′, 5′-GCA-3 ′, 5′-AGCA- 3 ′ and 5′-AAGCA-3 ′. The bases 1 to 3 that may be added to the 3 ′ end of the sequence: CCCCCTGRATCCAGG are specifically T, 5′-TA-3 ′, 5′-TAA-3 ′, and 5′-TAAG-3. 'And 5'-TAAGG-3'.

或いは、本発明に係るCYP2C19*3検出用プローブは、配列：CCCCCTGRATCCAGGの相補的配列からなるオリゴヌクレオチドであっても良いし、配列：CCCCCTGRATCCAGGの相補的配列の3’末端及び/又は5’末端に１〜５の塩基が付加した配列からなるオリゴヌクレオチドであっても良い。ここで、配列：CCCCCTGRATCCAGGの相補的配列の5’末端に付加してもよい１〜５の塩基とは、具体的にA、5’- CA -3’、5’-GCA-3’、5’-AGCA-3’及び5’-AAGCA-3’の相補鎖である。また、配列：CCCCCTGRATCCAGGの相補的配列の3’末端に付加しても良い１〜５の塩基とは、具体的にT、5’-TA-3’、5’-TAA-3’、5’-TAAG-3’及び5’-TAAGG-3’の相補鎖である。   Alternatively, the CYP2C19 * 3 detection probe according to the present invention may be an oligonucleotide consisting of a complementary sequence of the sequence: CCCCCTGRATCCAGG, or at the 3 ′ end and / or the 5 ′ end of the complementary sequence of the sequence: CCCCCTGRATCCAGG. It may be an oligonucleotide having a sequence to which 1 to 5 bases are added. Here, the bases 1 to 5 that may be added to the 5 ′ end of the complementary sequence of the sequence: CCCCCTGRATCCAGG are specifically A, 5′-CA-3 ′, 5′-GCA-3 ′, 5 It is the complementary strand of '-AGCA-3' and 5'-AAGCA-3 '. The bases 1 to 5 that may be added to the 3 ′ end of the complementary sequence of the sequence: CCCCCTGRATCCAGG are specifically T, 5′-TA-3 ′, 5′-TAA-3 ′, 5 ′. Complementary strands of -TAAG-3 'and 5'-TAAGG-3'.

より具体的に、本発明に係るCYP2C19*3検出用プローブとしては、配列番号７〜１３のいずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとすることが好ましい。
5’-CCCCCTGRATCCAGG-3’（配列番号７）
5’-ACCCCCTGRATCCAGGT-3’（配列番号８）
5’-CACCCCCTGRATCCAGGTA-3’（配列番号９）
5’-CACCCCCTGRATCCAGGTAA-3’（配列番号１０）
5’-GCACCCCCTGRATCCAGGTAA-3’（配列番号１１）
5’-AGCACCCCCTGRATCCAGGTAAG-3’（配列番号１２）
5’-AAGCACCCCCTGRATCCAGGTAAGG-3’（配列番号１３） More specifically, the CYP2C19 * 3 detection probe according to the present invention is preferably an oligonucleotide having any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 7 to 13.
5'-CCCCCTGRATCCAGG-3 '(SEQ ID NO: 7)
5'-ACCCCCTGRATCCAGGT-3 '(SEQ ID NO: 8)
5'-CACCCCCTGRATCCAGGTA-3 '(SEQ ID NO: 9)
5'-CACCCCCTGRATCCAGGTAA-3 '(SEQ ID NO: 10)
5'-GCACCCCCTGRATCCAGGTAA-3 '(SEQ ID NO: 11)
5'-AGCACCCCCTGRATCCAGGTAAG-3 '(SEQ ID NO: 12)
5'-AAGCACCCCCTGRATCCAGGTAAGG-3 '(SEQ ID NO: 13)

rs4986893は、CYP2C19遺伝子のエクソン４に座位するに座位する一塩基多型であり、野生型は636番目がグアニン（G）であり野生型アレル：CYP2C19*1と表記され、変異型はアデニン（A）であり変異型アレル：CYP2C19*3と表記される。変異型アレル：CYP2C19*3をホモ又はヘテロで有する個体は、野生型アレルをホモで有する個体と比較して薬物代謝が遅延することが知られている。   rs4986893 is a single nucleotide polymorphism located at exon 4 of the CYP2C19 gene. The wild type 636 is guanine (G), the wild type allele: CYP2C19 * 1, and the mutant type is adenine (A ) And the mutant allele: CYP2C19 * 3. Mutant alleles: It is known that individuals who have homozygous or heterozygous CYP2C19 * 3 have delayed drug metabolism compared to individuals that have wild-type alleles.

ここで、CYP2C19が代謝に関与する薬剤としては、オメプラゾール及びランソプラゾールといった胃酸抑制薬、催眠鎮痛薬であるジアゼパム、抗てんかん薬であるフェニトイン、抗うつ薬であるイミプラミン、モクロベミド及びクロミプラミン、マラリア治療薬であるプログアニル、筋弛緩薬であるカリソプロドール、）抗真菌薬であるボリコナゾール等を挙げることができる。   Here, drugs that are involved in metabolism of CYP2C19 include gastric acid suppressants such as omeprazole and lansoprazole, diazepam as a hypnotic analgesic, phenytoin as an antiepileptic, imipramine as an antidepressant, moclobemide and clomipramine, and drugs for malaria. A certain proguanil, carisoprodol which is a muscle relaxant, voriconazole which is an antifungal agent, etc. can be mentioned.

本発明に係るCYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3検出用プローブは、好ましくは核酸であり、より好ましくはDNAである。DNAには二本鎖も一本鎖も含まれるが、本発明に係るCYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3検出用プローブは好ましくは一本鎖DNAである。   The CYP2C19 * 2 detection probe and the CYP2C19 * 3 detection probe according to the present invention are preferably nucleic acids, more preferably DNA. The DNA includes both double strands and single strands, but the CYP2C19 * 2 detection probe and CYP2C19 * 3 detection probe according to the present invention are preferably single-stranded DNA.

本発明に係るCYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3検出用プローブは、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することができる。核酸合成装置としては、DNAシンセサイザー、全自動核酸合成装置、核酸自動合成装置等と呼ばれる装置を使用することができる。   The CYP2C19 * 2 detection probe and the CYP2C19 * 3 detection probe according to the present invention can be obtained by, for example, chemically synthesizing with a nucleic acid synthesizer. As the nucleic acid synthesizer, an apparatus called a DNA synthesizer, a fully automatic nucleic acid synthesizer, an automatic nucleic acid synthesizer or the like can be used.

本発明に係るCYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3検出用プローブは、その5’末端を担体上に固定化することにより、マイクロアレイ（例えばDNAチップ）の形態で用いるのが好ましい。このとき、マイクロアレイは、rs4244285における遺伝子型のうち野生型アレルであるグアニンに対応する配列のオリゴヌクレオチドと、変異型アレルであるアデニンに対応する配列のオリゴヌクレオチドとからなる一対のCYP2C19*2検出用プローブと、rs4986893における遺伝子型のうち野生型アレルであるグアニンに対応する配列のオリゴヌクレオチドと、変異型アレルであるアデニンに対応する配列のオリゴヌクレオチドとからなる一対のCYP2C19*3検出用プローブとを有することが好ましい。   The CYP2C19 * 2 detection probe and CYP2C19 * 3 detection probe according to the present invention are preferably used in the form of a microarray (for example, a DNA chip) by immobilizing the 5 'end on a carrier. At this time, the microarray is for detecting a pair of CYP2C19 * 2 consisting of an oligonucleotide having a sequence corresponding to guanine which is a wild type allele of rs4244285 and an oligonucleotide having a sequence corresponding to adenine which is a mutant allele. A pair of CYP2C19 * 3 detection probes consisting of a probe, an oligonucleotide having a sequence corresponding to guanine, which is a wild-type allele of rs4986893, and an oligonucleotide having a sequence corresponding to adenine, which is a mutant allele. It is preferable to have.

CYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3検出用プローブそれぞれについて、野生型と変異型に対応する一対のプローブを利用することによって、rs4244285がアデニンのホモ接合型であるか、グアニンのホモ接合型であるか、アデニンとグアニンのヘテロ接合型であるか、更にrs4986893がアデニンのホモ接合型であるか、グアニンのホモ接合型であるか、アデニンとグアニンのヘテロ接合型であるかを正確に同定することができる。   For each of the CYP2C19 * 2 detection probe and the CYP2C19 * 3 detection probe, rs4244285 is adenine homozygous or guanine homozygous by using a pair of probes corresponding to the wild type and the mutant type. Accurately identify whether it is, adenine and guanine heterozygous, and whether rs4986893 is adenine homozygous, guanine homozygous or adenine and guanine heterozygous be able to.

ここで、rs4244285における遺伝子型のうち野生型アレルであるグアニンに対応する配列のオリゴヌクレオチドと、変異型アレルであるアデニンに対応する配列のオリゴヌクレオチドとは、長さが２塩基以内の差であることが好ましく、長さが同じであることがより好ましい。同様に、rs4986893における遺伝子型のうち野生型アレルであるグアニンに対応する配列のオリゴヌクレオチドと、変異型アレルであるアデニンに対応する配列のオリゴヌクレオチドとは、長さが２塩基以内の差であることが好ましく、長さが同じであることがより好ましい。   Here, among the genotypes of rs4244285, the length of the oligonucleotide corresponding to the wild-type allele guanine and the sequence corresponding to the mutant allele adenine are within 2 bases in length. Preferably, the lengths are the same. Similarly, in the rs4986893 genotype, an oligonucleotide having a sequence corresponding to the wild-type allele guanine and an oligonucleotide having a sequence corresponding to the mutant allele adenine are within 2 bases in length. Preferably, the lengths are the same.

また、マイクロアレイは、rs4244285における遺伝子型のうち変異型であるアデニンに対応する配列のオリゴヌクレオチドのみをCYP2C19*2検出用プローブとして有するものであってもよい。rs4244285の少なくとも一方のアレルがアデニンであるとき、すなわちrs4244285の遺伝子型がA/A（アデニンのホモ接合型）又はA/G（アデニンとグアニンのヘテロ接合型）である場合、薬物代謝が遅延していると判断できるためである。   In addition, the microarray may have only an oligonucleotide having a sequence corresponding to adenine which is a mutant of the rs4244285 genotype as a CYP2C19 * 2 detection probe. Drug metabolism is delayed when at least one allele of rs4244285 is adenine, that is, when the genotype of rs4244285 is A / A (adenine homozygous) or A / G (adenine and guanine heterozygous) It is because it can be judged that it is.

さらに、同様に、マイクロアレイは、rs4986893における遺伝子型のうち変異型であるアデニンに対応する配列のオリゴヌクレオチドのみをCYP2C19*3検出用プローブとして有するものであってもよい。rs4986893の少なくとも一方のアレルがアデニンであるとき、すなわちrs4986893の遺伝子型がA/A（アデニンのホモ接合型）又はA/G（アデニンとグアニンのヘテロ接合型）である場合、薬物代謝が遅延していると判断できるためである。   Furthermore, similarly, the microarray may have only an oligonucleotide having a sequence corresponding to adenine, which is a mutant of the rs4986893 genotype, as a CYP2C19 * 3 detection probe. Drug metabolism is delayed when at least one allele of rs4986893 is adenine, that is, when rs4986893 is genotype A / A (adenine homozygous) or A / G (adenine and guanine heterozygous) It is because it can be judged that it is.

担体の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化合物などの貴金属、およびグラファイト、カ−ボンファイバ−に代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表されるシリコン材料、SOI（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれらシリコン材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。担体の形状も特に制限されないが、好ましくは平板状である。   As the material for the carrier, those known in the art can be used and are not particularly limited. For example, noble metals such as platinum, platinum black, gold, palladium, rhodium, silver, mercury, tungsten and their compounds, and conductor materials such as graphite and carbon typified by carbon fiber; single crystal silicon, amorphous Silicon materials represented by silicon, silicon carbide, silicon oxide, silicon nitride, etc., composite materials of these silicon materials represented by SOI (silicon on insulator), etc .; glass, quartz glass, alumina, sapphire, ceramics, Inorganic materials such as stellite and photosensitive glass; polyethylene, ethylene, polypropylene, cyclic polyolefin, polyisobutylene, polyethylene terephthalate, unsaturated polyester, fluorine-containing resin, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl acetate, polyvinyl alcohol , Polyvinyl acetal, acrylic resin, polyacrylonitrile, polystyrene, acetal resin, polycarbonate, polyamide, phenol resin, urea resin, epoxy resin, melamine resin, styrene / acrylonitrile copolymer, acrylonitrile / butadiene styrene copolymer, polyphenylene oxide And organic materials such as polysulfone. The shape of the carrier is not particularly limited, but is preferably a flat plate shape.

本発明においては、担体として、好ましくは表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体を用いる。表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体には、基板の表面にカーボン層と化学修飾基とを有するもの、およびカーボン層からなる基板の表面に化学修飾基を有するものが包含される。基板の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されず、上述の担体材料として挙げたものと同様のものを使用できる。   In the present invention, a carrier having a carbon layer and a chemical modification group on the surface is preferably used as the carrier. Carriers having a carbon layer and a chemical modification group on the surface include those having a carbon layer and a chemical modification group on the surface of the substrate, and those having a chemical modification group on the surface of the substrate made of the carbon layer. As the material for the substrate, those known in the art can be used, and there is no particular limitation, and the same materials as those mentioned above as the carrier material can be used.

本発明に係るマイクロアレイにおいては、微細な平板状の構造を有する担体が好適に用いられる。形状は、長方形、正方形および丸形など限定されないが、通常、1〜75mm四方のもの、好ましくは1〜10mm四方のもの、より好ましくは3〜5mm四方のものを用いる。微細な平板状の構造の担体を製造しやすいことから、シリコン材料や樹脂材料からなる基板を用いるのが好ましく、特に単結晶シリコンからなる基板の表面にカーボン層および化学修飾基を有する担体がより好ましい。単結晶シリコンには、部分部分でごくわずかに結晶軸の向きが変わっているものや（モザイク結晶と称される場合もある）、原子的尺度での乱れ(格子欠陥)が含まれているものも包含される。   In the microarray according to the present invention, a carrier having a fine flat plate structure is preferably used. The shape is not limited to a rectangle, a square, or a round shape, but a shape of 1 to 75 mm square, preferably 1 to 10 mm square, more preferably 3 to 5 mm square is usually used. Since it is easy to produce a carrier having a fine flat plate structure, it is preferable to use a substrate made of a silicon material or a resin material. In particular, a carrier having a carbon layer and a chemical modification group on the surface of a substrate made of single crystal silicon is more preferable. preferable. Single crystal silicon has a slightly different orientation of the crystal axis in some parts (sometimes called a mosaic crystal), or includes atomic scale disturbances (lattice defects) Are also included.

本発明において基板上に形成させるカーボン層としては、特に制限されないが、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、またはそれらを積層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（DLC：Diamond Like Carbon）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾基の導入や分析対象物質との結合における反応に耐えることができる点、分析対象物質と静電結合によって結合するためその結合が柔軟性を持っている点、UV吸収がないため検出系UVに対して透明性である点、およびエレクトロブロッティングの際に通電可能な点において有利である。また、分析対象物質との結合反応において、非特異的吸着が少ない点においても有利である。前記のとおり基板自体がカーボン層からなる担体を用いてもよい。   In the present invention, the carbon layer formed on the substrate is not particularly limited, but synthetic diamond, high-pressure synthetic diamond, natural diamond, soft diamond (for example, diamond-like carbon), amorphous carbon, carbon-based material (for example, graphite, fullerene) , Carbon nanotubes), a mixture thereof, or a laminate of them is preferably used. Further, carbides such as hafnium carbide, niobium carbide, silicon carbide, tantalum carbide, thorium carbide, titanium carbide, uranium carbide, tungsten carbide, zirconium carbide, molybdenum carbide, chromium carbide, and vanadium carbide may be used. Here, the soft diamond is a generic term for an incomplete diamond structure that is a mixture of diamond and carbon, such as so-called diamond-like carbon (DLC), and the mixing ratio is not particularly limited. The carbon layer has excellent chemical stability, can withstand subsequent reactions in the introduction of chemical modification groups and binding to the analyte, and the binding is flexible because of the electrostatic binding to the analyte. It is advantageous in that it has the property of being transparent, it is transparent to the detection system UV because there is no UV absorption, and it can be energized during electroblotting. Further, it is advantageous in that nonspecific adsorption is small in the binding reaction with the analyte. As described above, a carrier whose substrate itself is made of a carbon layer may be used.

本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマCVD(Chemical vapor deposit）法、ECRCVD(Electric cyclotron resonance chemical vapor deposit）法、ICP(Inductive coupled plasma）法、直流スパッタリング法、ECR(Electric cyclotron resonance)スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、EB(Electron beam)蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。   In the present invention, the carbon layer can be formed by a known method. For example, microwave plasma CVD (Chemical vapor deposit) method, ECRCVD (Electric cyclotron resonance chemical vapor deposit) method, ICP (Inductive coupled plasma) method, DC sputtering method, ECR (Electric cyclotron resonance) sputtering method, ionization deposition method, arc Examples thereof include a vapor deposition method, a laser vapor deposition method, an EB (Electron beam) vapor deposition method, and a resistance heating vapor deposition method.

高周波プラズマCVD法では、高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス（メタン）を分解し、基板上にカーボン層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス1〜99体積％と残りメタンガス99〜1体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりカーボン層を形成してもよい。   In the high-frequency plasma CVD method, a raw material gas (methane) is decomposed by glow discharge generated between electrodes by high frequency, and a carbon layer is synthesized on a substrate. In the ionization vapor deposition method, the source gas (benzene) is decomposed and ionized using thermoelectrons generated by a tungsten filament, and a carbon layer is formed on the substrate by a bias voltage. The carbon layer may be formed by ionized vapor deposition in a mixed gas composed of 1 to 99% by volume of hydrogen gas and 99 to 1% by volume of the remaining methane gas.

アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。   In the arc evaporation method, an arc discharge is generated in a vacuum by applying a DC voltage between a solid graphite material (cathode evaporation source) and a vacuum vessel (anode), and a plasma of carbon atoms is generated from the cathode to generate an evaporation source. Further, by applying a negative bias voltage to the substrate, carbon ions in the plasma can be accelerated toward the substrate to form a carbon layer.

レーザ蒸着法では、例えばNd:YAGレーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。   In the laser vapor deposition method, for example, a carbon layer can be formed by irradiating a graphite target plate with Nd: YAG laser (pulse oscillation) light and melting it, and depositing carbon atoms on a glass substrate.

基板の表面にカーボン層を形成する場合、カーボン層の厚さは、通常、単分子層〜100μm程度であり、薄すぎると下地基板の表面が局部的に露出する可能性があり、逆に厚くなると生産性が悪くなるので、好ましくは2nm〜1μm、より好ましくは5nm〜500nmである。   When the carbon layer is formed on the surface of the substrate, the thickness of the carbon layer is usually a monomolecular layer to about 100 μm. If it is too thin, the surface of the base substrate may be locally exposed, and conversely thick. In this case, the productivity is deteriorated, so that the thickness is preferably 2 nm to 1 μm, more preferably 5 nm to 500 nm.

カーボン層が形成された基板の表面に化学修飾基を導入することにより、オリゴヌクレオチドプローブを担体に強固に固定化できる。導入する化学修飾基は、当業者であれば適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基および活性エステル基が挙げられる。   By introducing a chemical modification group on the surface of the substrate on which the carbon layer is formed, the oligonucleotide probe can be firmly immobilized on the carrier. The chemical modification group to be introduced can be appropriately selected by those skilled in the art and is not particularly limited, and examples thereof include an amino group, a carboxyl group, an epoxy group, a formyl group, a hydroxyl group, and an active ester group.

アミノ基の導入は、例えば、カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射することによりまたはプラズマ処理することにより実施できる。または、カーボン層を塩素ガス中で紫外線を照射して塩素化し、さらにアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。または、メチレンジアミン、エチレンジアミンで等の多価アミン類ガス中を、塩素化したカーボン層と反応させることによって実施することもできる。   An amino group can be introduced, for example, by irradiating the carbon layer with ultraviolet light in ammonia gas or by plasma treatment. Alternatively, the carbon layer can be chlorinated by irradiation with ultraviolet rays in chlorine gas, and further irradiated with ultraviolet rays in ammonia gas. Alternatively, it can also be carried out by reacting a polyvalent amine gas such as methylenediamine or ethylenediamine with a chlorinated carbon layer.

カルボキシル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な化合物を反応させることにより実施できる。カルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：X-R1-COOH（式中、Xはハロゲン原子、R1は炭素数10〜12の2価の炭化水素基を表す）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、2-クロロプロピオン酸、3-クロロプロピオン酸、3-クロロアクリル酸、4-クロロ安息香酸；式：HOOC-R2-COOH（式中、R2は単結合または炭素数1〜12の2価の炭化水素基を表す）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：R3-CO-R4-COOH（式中、R3は水素原子または炭素数1〜12の2価の炭化水素基、R4は炭素数1〜12の2価の炭化水素基を表す）で示されるケト酸またはアルデヒド酸；式：X-OC-R5-COOH（式中、Xはハロゲン原子、R5は単結合または炭素数1〜12の2価の炭化水素基を表す）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。   The introduction of the carboxyl group can be carried out, for example, by reacting an appropriate compound with the carbon layer aminated as described above. As a compound used for introducing a carboxyl group, for example, represented by the formula: X-R1-COOH (wherein X represents a halogen atom and R1 represents a divalent hydrocarbon group having 10 to 12 carbon atoms) Halocarboxylic acids such as chloroacetic acid, fluoroacetic acid, bromoacetic acid, iodoacetic acid, 2-chloropropionic acid, 3-chloropropionic acid, 3-chloroacrylic acid, 4-chlorobenzoic acid; formula: HOOC-R2-COOH (formula R2 represents a single bond or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms), such as oxalic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, phthalic acid; polyacrylic acid Polycarboxylic acid such as polymethacrylic acid, trimellitic acid, butanetetracarboxylic acid; Formula: R3-CO-R4-COOH (wherein R3 is a hydrogen atom or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms) , R4 represents a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms) A dicarboxylic acid represented by the formula: X-OC-R5-COOH (wherein X represents a halogen atom, R5 represents a single bond or a divalent hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms) Monohalides, such as succinic acid monochloride, malonic acid monochloride; acid anhydrides such as phthalic anhydride, succinic anhydride, oxalic anhydride, maleic anhydride, and butanetetracarboxylic anhydride.

エポキシ基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価エポキシ化合物を反応させることによって実施できる。あるいは、カーボン層が含有する炭素＝炭素２重結合に有機過酸を反応させることにより得ることができる。有機過酸としては、過酢酸、過安息香酸、ジペルオキシフタル酸、過ギ酸、トリフルオロ過酢酸などが挙げられる。   Introduction of an epoxy group can be carried out, for example, by reacting a suitable polyvalent epoxy compound with the carbon layer aminated as described above. Or it can obtain by making an organic peracid react with the carbon = carbon double bond which a carbon layer contains. Examples of the organic peracid include peracetic acid, perbenzoic acid, diperoxyphthalic acid, performic acid, and trifluoroperacetic acid.

ホルミル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に、グルタルアルデヒドを反応させることにより実施できる。   Introduction of the formyl group can be carried out, for example, by reacting glutaraldehyde with the carbon layer aminated as described above.

ヒドロキシル基の導入は、例えば、前記のように塩素化したカーボン層に、水を反応させることにより実施できる。   Introduction of hydroxyl groups can be carried out, for example, by reacting water with the carbon layer chlorinated as described above.

活性エステル基は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味する。エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、N-ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。より具体的には、活性エステル基としては、たとえばp-ニトロフェニル基、N-ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられ、特に、N-ヒドロキシスクシンイミド基が好ましく用いられる。   The active ester group means an ester group having an electron-withdrawing group having high acidity on the alcohol side of the ester group and activating the nucleophilic reaction, that is, an ester group having high reaction activity. The ester group has an electron-withdrawing group on the alcohol side of the ester group and is activated more than the alkyl ester. The active ester group has reactivity with groups such as amino group, thiol group, and hydroxyl group. More specifically, an active ester group in which phenol esters, thiophenol esters, N-hydroxyamine esters, cyanomethyl esters, esters of heterocyclic hydroxy compounds, etc. have much higher activity than alkyl esters etc. Known as. More specifically, examples of the active ester group include a p-nitrophenyl group, an N-hydroxysuccinimide group, a succinimide group, a phthalimide group, and a 5-norbornene-2,3-dicarboximide group. In particular, an N-hydroxysuccinimide group is preferably used.

活性エステル基の導入は、例えば、前記のように導入したカルボキシル基を、シアナミドやカルボジイミド（例えば、1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミド)などの脱水縮合剤とN-ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化することにより実施できる。この処理により、アミド結合を介して炭化水素基の末端に、N-ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基が結合した基を形成することができる（特開2001-139532）。   The introduction of the active ester group is performed, for example, by converting the carboxyl group introduced as described above into a dehydrating condensing agent such as cyanamide or carbodiimide (for example, 1- [3- (dimethylamino) propyl] -3-ethylcarbodiimide) and N- It can be carried out by active esterification with a compound such as hydroxysuccinimide. By this treatment, a group in which an active ester group such as an N-hydroxysuccinimide group is bonded to the terminal of the hydrocarbon group via an amide bond can be formed (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-139532).

本発明に係る検出用プローブを、スポッティング用バッファーに溶解してスポッティング用溶液を調製し、これを96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注し、分注した溶液をスポッター装置等によって担体上にスポッティングすることにより、多型検出用プローブが担体に固定化されたマイクロアレイを製造することができる。または、スポッティング溶液をマイクロピペッターにて手動でスポッティングしてもよい。   The detection probe according to the present invention is dissolved in a spotting buffer to prepare a spotting solution, which is dispensed into a 96-well or 384-well plastic plate, and the dispensed solution is placed on a carrier by a spotter device or the like. By spotting, a microarray in which the polymorphism detection probe is immobilized on a carrier can be produced. Alternatively, the spotting solution may be spotted manually with a micropipette.

スポッティング後、検出用プローブが担体に結合する反応を進行させるため、インキュベーションを行うことが好ましい。インキュベーションは、通常−20〜100℃、好ましくは0〜90℃の温度で、通常0.5〜16時間、好ましくは1〜2時間にわたって行う。インキュベーションは、高湿度の雰囲気下、例えば、湿度50〜90％の条件で行うのが望ましい。インキュベーションに続き、担体に結合していないDNAを除去するため、洗浄液（例えば、50mM TBS/0.05% Tween20、2×SSC/0.2%SDS溶液、超純水など）を用いて洗浄を行うことが好ましい。   Incubation is preferably performed after spotting in order to advance the reaction of the detection probe binding to the carrier. Incubation is usually performed at a temperature of −20 to 100 ° C., preferably 0 to 90 ° C., usually for 0.5 to 16 hours, preferably 1 to 2 hours. Incubation is preferably performed under a high humidity atmosphere, for example, under conditions of a humidity of 50 to 90%. Following the incubation, it is preferable to perform washing using a washing solution (for example, 50 mM TBS / 0.05% Tween20, 2 × SSC / 0.2% SDS solution, ultrapure water, etc.) to remove DNA not bound to the carrier. .

また、上記CYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3検出用プローブ又はマイクロアレイを用いることで、被検者（薬物投与対象者）における、rs4244285で特定される一塩基多型の遺伝子型及びrs4986893で特定される一塩基多型の遺伝子型を判定することができる。   Also, by using the above CYP2C19 * 2 detection probe and CYP2C19 * 3 detection probe or microarray, the single nucleotide polymorphism genotype specified by rs4244285 and the rs4986893 specified by the subject (drug recipient) The single nucleotide polymorphism genotype to be determined can be determined.

ただし、上記CYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3検出用プローブのいずれか一方を用いることで、被検者（薬物投与対象者）における、rs4244285で特定される一塩基多型の遺伝子型及びrs4986893で特定される一塩基多型の遺伝子型のうちいずれか一方を判定してもよい。   However, the use of either the CYP2C19 * 2 detection probe or the CYP2C19 * 3 detection probe allows the single nucleotide polymorphism genotype and rs4986893 specified in rs4244285 in the subject (drug administration subject). Either one of the genotypes of the single nucleotide polymorphism specified in the above may be determined.

特に、rs4244285で特定される一塩基多型の遺伝子型を判定する際には、被検者由来の試料からDNAを抽出する工程と、抽出したDNAを鋳型とし、rs4244285を含む領域を増幅する工程と、上記CYP2C19*2検出用プローブ又はマイクロアレイを用いて、増幅された核酸に含まれるrs4244285で特定される一塩基多型の遺伝子型を同定する工程とを含む。   In particular, when determining the genotype of a single nucleotide polymorphism identified by rs4244285, a step of extracting DNA from a sample derived from a subject, and a step of amplifying a region containing rs4244285 using the extracted DNA as a template And a step of identifying the genotype of the single nucleotide polymorphism identified by rs4244285 contained in the amplified nucleic acid using the CYP2C19 * 2 detection probe or microarray.

同様に、rs4986893で特定される一塩基多型の遺伝子型を判定する際には、被検者由来の試料からDNAを抽出する工程と、抽出したDNAを鋳型とし、rs4986893を含む領域を増幅する工程と、上記CYP2C19*3検出用プローブ又はマイクロアレイを用いて、増幅された核酸に含まれるrs4986893で特定される一塩基多型の遺伝子型を同定する工程とを含む。   Similarly, when determining the genotype of a single nucleotide polymorphism specified by rs4986893, a step of extracting DNA from a sample derived from a subject, and amplifying a region containing rs4986893 using the extracted DNA as a template And a step of identifying a genotype of a single nucleotide polymorphism identified by rs4986893 contained in the amplified nucleic acid using the CYP2C19 * 3 detection probe or microarray.

なお、rs4244285で特定される一塩基多型の遺伝子型及びrs4986893で特定される一塩基多型の遺伝子型をともに判定する際には、被検者由来の試料からDNAを抽出する工程と、抽出したDNAを鋳型とし、rs4244285を含む領域とrs4986893を含む領域とをそれぞれ増幅する工程と、上記CYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3検出用プローブ又はマイクロアレイを用いて、増幅された核酸に含まれるrs4244285で特定される一塩基多型の遺伝子型及びrs4986893で特定される一塩基多型の遺伝子型をそれぞれ同定する工程とを含む。また、このとき、抽出したDNAを鋳型とし、rs4244285及びrs4986893を含む領域とを増幅し、上記CYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3検出用プローブ又はマイクロアレイを用いて、増幅された核酸に含まれるrs4244285で特定される一塩基多型の遺伝子型及びrs4986893で特定される一塩基多型の遺伝子型をそれぞれ同定してもよい。   When determining both the genotype of the single nucleotide polymorphism specified by rs4244285 and the genotype of the single nucleotide polymorphism specified by rs4986893, a step of extracting DNA from the sample derived from the subject, and extraction Amplifying a region containing rs4244285 and a region containing rs4986893 using the prepared DNA as a template, and the nucleic acid amplified by using the CYP2C19 * 2 detection probe and CYP2C19 * 3 detection probe or microarray. identifying the genotype of the single nucleotide polymorphism specified by rs4244285 and the genotype of the single nucleotide polymorphism specified by rs4986893, respectively. At this time, using the extracted DNA as a template, the region containing rs4244285 and rs4986893 is amplified and contained in the nucleic acid amplified using the CYP2C19 * 2 detection probe and the CYP2C19 * 3 detection probe or microarray. You may identify the genotype of the single nucleotide polymorphism specified by rs4244285 and the genotype of the single nucleotide polymorphism specified by rs4986893, respectively.

被検者は通常ヒトであり、人種等には特に限定されないが、特に、黄色人種、好適には東アジア人種、特に好適には日本人とする。被検者由来の試料は特に制限されない。例えば、血液関連試料（血液、血清、血漿など）、リンパ液、糞便、がん細胞、組織または臓器の破砕物および抽出物などが挙げられる。   The subject is usually a human and is not particularly limited to the race or the like, but is particularly a yellow race, preferably an East Asian race, particularly preferably a Japanese. The sample derived from the subject is not particularly limited. For example, blood-related samples (blood, serum, plasma, etc.), lymph fluid, feces, cancer cells, tissue or organ crushed materials and extracts can be mentioned.

まず、被検者から採取した試料からDNAを抽出する。抽出手段としては、特に限定されない。例えばフェノール／クロロホルム、エタノール、水酸化ナトリウム、CTABなどを用いたDNA抽出法を用いることができる。   First, DNA is extracted from a sample collected from a subject. The extraction means is not particularly limited. For example, a DNA extraction method using phenol / chloroform, ethanol, sodium hydroxide, CTAB or the like can be used.

次に、得られたDNAを鋳型として用いて増幅反応を行い、rs4244285を含む領域やrs4986893を含む領域、好ましくはDNAを増幅させる。増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）、ICAN（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法等を適用することができる。増幅反応においては、増幅後の領域を識別できるように標識を付加することが望ましい。このとき、増幅された核酸を標識する方法としては、特に限定されないが、例えば増幅反応に使用するプライマーをあらかじめ標識しておく方法を使用してもよいし、増幅反応に標識ヌクレオチドを基質として使用する方法を使用してもよい。標識物質としては、特に限定されないが、放射性同位元素や蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン（DIG）やビオチンなどの有機化合物などを使用することができる。   Next, an amplification reaction is performed using the obtained DNA as a template to amplify a region containing rs4244285 or a region containing rs4986893, preferably DNA. As the amplification reaction, polymerase chain reaction (PCR), LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification), ICAN (Isothermal and Chimeric Primer-Initiated Amplification of Nucleic Acids) method or the like can be applied. In the amplification reaction, it is desirable to add a label so that the amplified region can be identified. At this time, the method for labeling the amplified nucleic acid is not particularly limited. For example, a method in which a primer used in the amplification reaction is labeled in advance may be used, or a labeled nucleotide is used as a substrate in the amplification reaction. You may use the method to do. The labeling substance is not particularly limited, and radioisotopes, fluorescent dyes, or organic compounds such as digoxigenin (DIG) and biotin can be used.

またこの反応系は、核酸増幅・標識に必要な緩衝剤、耐熱性DNAポリメラーゼ、増幅領域に特異的なプライマー、標識ヌクレオチド三リン酸（具体的には蛍光標識等を付加したヌクレオチド三リン酸）、ヌクレオチド三リン酸および塩化マグネシウム等を含む反応系である。   This reaction system consists of a buffer necessary for nucleic acid amplification and labeling, a heat-resistant DNA polymerase, a primer specific to the amplification region, and a labeled nucleotide triphosphate (specifically, a nucleotide triphosphate added with a fluorescent label, etc.) , A reaction system containing nucleotide triphosphate and magnesium chloride.

rs4244285を含む領域の増幅反応に用いるプライマーは、rs4244285を含む領域を特異的に増幅できるものであれば特に制限されず、当業者であれば適宜設計できる。例えば、
プライマー１：5'- GAACGTGTGATTGGCAGAAA-3'（配列番号１４）及び
プライマー２：5'- TCGAAAACATGGAGTTGCAG -3'（配列番号１５）
からなるプライマーのセットが挙げられる。 The primer used for the amplification reaction of the region containing rs4244285 is not particularly limited as long as it can specifically amplify the region containing rs4244285, and can be appropriately designed by those skilled in the art. For example,
Primer 1: 5′-GAACGTGTGATTGGCAGAAA-3 ′ (SEQ ID NO: 14) and Primer 2: 5′-TCGAAAACATGGAGTTGCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 15)
A set of primers consisting of

rs4986893を含む領域増幅反応に用いるプライマーは、rs4986893を含む領域を特異的に増幅できるものであれば特に制限されず、当業者であれば適宜設計できる。例えば、
プライマー１：5'- CCCACGTATGTACCACCCA-3'（配列番号１６）及び
プライマー２：5'- TGTACGACACACAGCAACCT -3'（配列番号１７）
からなるプライマーのセットが挙げられる。 The primer used for the region amplification reaction containing rs4986893 is not particularly limited as long as it can specifically amplify the region containing rs4986893, and can be appropriately designed by those skilled in the art. For example,
Primer 1: 5′-CCCACGTATGTACCACCCA-3 ′ (SEQ ID NO: 16) and Primer 2: 5′-TGTACGACACACAGCAACCT -3 ′ (SEQ ID NO: 17)
A set of primers consisting of

また、プライマーにより増幅される核酸断片は、目的とする多型（rs4244285及び/又はrs4986893）を含んでいれば特に限定されず、例えば1kbp以下が好ましく、800bp以下がより好ましくは、400bp以下が更に好ましく、200bp以下が特に好ましい。   The nucleic acid fragment amplified by the primer is not particularly limited as long as it contains the target polymorphism (rs4244285 and / or rs4986893). For example, it is preferably 1 kbp or less, more preferably 800 bp or less, and even more preferably 400 bp or less. Preferably, 200 bp or less is particularly preferable.

上記のようにして得られた増幅核酸と本発明に係るCYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3検出用プローブとのハイブリダイゼーション反応を行い、CYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3検出用プローブにハイブリダイズした核酸の量を、例えば標識を検出することにより測定できる。標識からのシグナルは、例えば、蛍光標識を用いた場合は、蛍光スキャナを用いて蛍光シグナル検出し、これを画像解析ソフトによって解析することによりシグナル強度を数値化することができる。また、CYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3検出用プローブにハイブリダイズした増幅核酸は、例えば、既知量のDNAを含む試料を用いて検量線を作成することにより、定量することもできる。ハイブリダイゼーション反応は、好ましくはストリンジェントな条件下で実施する。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、50℃で16時間ハイブリダイズ反応させた後、2×SSC/0.2% SDS、25℃、10分および2×SSC、25℃、5分の条件で洗浄する条件をさす。或いは、ハイブリダイズする温度としては、塩濃度が0.5×SSCのとき、45〜60℃とすることができ、CYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3検出用プローブの鎖長が短い場合にはハイブリダイズ温度をこれより低くすることがより好ましく、CYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3検出用プローブの鎖長が長い場合にはハイブリダイズ温度をこれより高くとすることがより好ましい。塩濃度が高くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は高くなり、逆に塩濃度が低くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は低くなることはいうまでもない。   A hybridization reaction between the amplified nucleic acid obtained as described above and the CYP2C19 * 2 detection probe and CYP2C19 * 3 detection probe according to the present invention was performed, and the CYP2C19 * 2 detection probe and the CYP2C19 * 3 detection probe were used. The amount of hybridized nucleic acid can be measured, for example, by detecting the label. For example, when a fluorescent label is used, the signal intensity from the label can be quantified by detecting the fluorescent signal using a fluorescent scanner and analyzing the detected signal with image analysis software. The amplified nucleic acid hybridized to the CYP2C19 * 2 detection probe and the CYP2C19 * 3 detection probe can also be quantified, for example, by preparing a calibration curve using a sample containing a known amount of DNA. The hybridization reaction is preferably carried out under stringent conditions. Stringent conditions refer to conditions in which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.For example, after hybridization at 50 ° C. for 16 hours, 2 × SSC / 0.2% SDS, 25 This refers to the conditions for washing at 5 ° C for 10 minutes and 2 x SSC at 25 ° C. Alternatively, the hybridization temperature can be 45 to 60 ° C. when the salt concentration is 0.5 × SSC, and the hybridization is performed when the CYP2C19 * 2 detection probe and the CYP2C19 * 3 detection probe have short chain lengths. It is more preferable to lower the soybean temperature, and when the chain length of the CYP2C19 * 2 detection probe and the CYP2C19 * 3 detection probe is long, the hybridization temperature is more preferably higher. It goes without saying that the hybridization temperature having specificity increases as the salt concentration increases, whereas the hybridization temperature having specificity decreases as the salt concentration decreases.

上記ハイブリダイゼーション反応においては、本発明に係るCYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3検出用プローブが担体上に固定化されたマイクロアレイを用い、該マイクロアレイに増幅核酸を含む溶液を作用する方法が好ましい。   In the above hybridization reaction, it is preferable to use a microarray in which the CYP2C19 * 2 detection probe and the CYP2C19 * 3 detection probe according to the present invention are immobilized on a carrier, and a solution containing an amplified nucleic acid acts on the microarray. .

本発明に係る薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法は、本発明に係るCYP2C19*2検出用プローブ及びCYP2C19*3検出用プローブにハイブリダイズした上記増幅核酸の量に基づいて、被験者のゲノムにおけるrs4244285の遺伝子型及び/又はrs4986893の遺伝子型が、変異型アレルをホモで有するかヘテロで有するか特定する。   The data acquisition method for predicting drug metabolizing ability according to the present invention is based on the amount of the amplified nucleic acid hybridized to the CYP2C19 * 2 detection probe and the CYP2C19 * 3 detection probe according to the present invention. The rs4244285 genotype and / or rs4986893 genotype in FIG. 5 specifies whether the mutant allele is homozygous or heterozygous.

そして、rs4244285の遺伝子型が変異型アレル：CYP2C19*2をホモ又はヘテロで有する場合に当該被験者について、薬物代謝速度が遅いと判断できる。このため、変異型アレル：CYP2C19*2をホモで有する個体及びヘテロで有する個体は、野生型アレルをホモで有する個体と比較して、上述した薬物の投与量を少量とすることができる。   And when the genotype of rs4244285 has a mutant allele: CYP2C19 * 2 in homo or hetero, it can be determined that the subject has a slow drug metabolism rate. For this reason, the individual having the mutant allele CYP2C19 * 2 and the individual having the heterozygous allele can reduce the dose of the drug described above compared to the individual having the wild-type allele.

特に、変異型アレル：CYP2C19*2をホモで有する個体と、変異型アレル：CYP2C19*2をヘテロで有する個体とを比較した場合には、変異型アレル：CYP2C19*2をホモで有する個体における薬物代謝速度がより遅いと判断できる。よって、変異型アレル：CYP2C19*2をホモで有する個体に対する薬物投与量は、変異型アレル：CYP2C19*2をヘテロで有する個体に対する薬物投与量よりもより少量とすることができる。   In particular, when comparing individuals with mutant alleles: CYP2C19 * 2 and individuals with mutant alleles: CYP2C19 * 2 heterozygous, drugs in individuals with mutant alleles: CYP2C19 * 2 homozygous It can be judged that the metabolic rate is slower. Therefore, the drug dose for an individual who has a mutant allele: CYP2C19 * 2 homozygously can be made smaller than the drug dose for an individual who has a mutant allele: CYP2C19 * 2 hetero.

一方、rs4986893の遺伝子型についても同様に、変異型アレル：CYP2C19*3をホモ又はヘテロで有する場合に、被験者について薬物代謝速度が遅いと判断できる。このため、変異型アレル：CYP2C19*3をホモで有する個体及びヘテロで有する個体は、野生型アレルをホモで有する個体と比較して、上述した薬物の投与量を少量とすることができる。また、変異型アレル：CYP2C19*3をホモで有する個体と、変異型アレル：CYP2C19*3をヘテロで有する個体とを比較した場合には、変異型アレル：CYP2C19*3をホモで有する個体における薬物代謝速度がより遅いと判断できる。よって、変異型アレル：CYP2C19*3をホモで有する個体に対する薬物投与量は、変異型アレル：CYP2C19*3をヘテロで有する個体に対する薬物投与量よりもより少量とすることができる。   On the other hand, for the genotype of rs4986893, when the mutant allele CYP2C19 * 3 is homo- or hetero-like, it can be determined that the drug metabolism rate is slow for the subject. For this reason, an individual having a mutant allele: CYP2C19 * 3 as a homozygote and an individual having a heterozygote as a heterozygote can reduce the dose of the above-mentioned drug compared to an individual having a wild-type allele as a homozygote. In addition, when comparing individuals with mutant allele: CYP2C19 * 3 homozygous and individuals with mutant allele: CYP2C19 * 3 heterozygous, drugs in individuals with mutant allele: CYP2C19 * 3 homozygous It can be judged that the metabolic rate is slower. Therefore, the drug dosage for an individual who has a mutant allele: CYP2C19 * 3 as a homozygous can be made smaller than the drug dosage for an individual who has a mutant allele: CYP2C19 * 3 as a heterozygous.

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが本発明の技術的範囲は、以下の実施例に限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, the technical scope of this invention is not limited to a following example.

〔実施例１〕
本実施例では、rs4244285の遺伝子型を判別するための一対のCYP2C19*2検出用プローブを有するDNAチップを作製した。DNAチップに搭載した核酸プローブの一覧を表１に示した。 [Example 1]
In this example, a DNA chip having a pair of CYP2C19 * 2 detection probes for discriminating the genotype of rs4244285 was produced. A list of nucleic acid probes mounted on the DNA chip is shown in Table 1.

本実施例では、PCR法により、蛍光標識を有する、rs4244285を含む核酸断片を増幅し、得られた核酸断片を以上のように作製したDNAチップに対して作用させ、核酸断片と多型検出用プローブとのハイブリダイズを蛍光強度にて検出した。   In this example, a nucleic acid fragment containing rs4244285 having a fluorescent label is amplified by PCR, and the resulting nucleic acid fragment is allowed to act on the DNA chip prepared as described above to detect nucleic acid fragments and polymorphisms. Hybridization with the probe was detected by fluorescence intensity.

蛍光標識プライマーの作製は、5’末端をアミノ基で標識した表２に示すオリゴヌクレオチドC2C192-R（ライフテクノロジーズジャパン製）と、IC5-OSu（同仁化学研究所製）をりん酸緩衝液（pH8.0）中で4℃にて１昼夜反応させた後、MicroSpin G-25 Columns（GEヘルスケア製）を用いて精製することにより作製した。得られた精製物の260nm及び640nmの吸光度を測定することにより、プライマーの濃度及び蛍光色素の濃度を算出した。   The fluorescently labeled primer was prepared by using oligonucleotide C2C192-R (Life Technologies Japan) shown in Table 2 labeled with an amino group at the 5 ′ end and IC5-OSu (Dojindo Laboratories) in phosphate buffer (pH 8). .0), the mixture was reacted at 4 ° C. for 1 day and then purified using MicroSpin G-25 Columns (manufactured by GE Healthcare). By measuring the absorbance at 260 nm and 640 nm of the purified product, the concentration of the primer and the concentration of the fluorescent dye were calculated.

得られた蛍光標識プライマーに蛍光未標識プライマー（C2C192-F）を加え、表２の濃度のプライマーを等量ずつ混合し、プライマーミックスを調整した。表３に示す条件にてPCRを行った。具体的にPCRは、表４に示す組成で反応液を調整し、これに野生型検体として2pg/μLに調製した野生型配列をもつプラスミドDNA、変異型配列を持つプラスミドDNA及びヘテロ相当として調整したプラスミドDNAを5μLずつ反応チューブにそれぞれ加えた後、PCRをサーマルサイクラー（ABI製）を用いて行った。   A fluorescent unlabeled primer (C2C192-F) was added to the obtained fluorescently labeled primer, and primers of the concentrations shown in Table 2 were mixed in equal amounts to prepare a primer mix. PCR was performed under the conditions shown in Table 3. Specifically, PCR was prepared by preparing a reaction solution with the composition shown in Table 4 and preparing a plasmid DNA having a wild type sequence, a plasmid DNA having a mutant type sequence, and a hetero equivalent prepared as 2 pg / μL as a wild type specimen. The plasmid DNA was added to each reaction tube in an amount of 5 μL, and PCR was performed using a thermal cycler (manufactured by ABI).

以上のようにして得られた増幅産物をDNAチップにハイブリダイズさせる際には、先ず、規定温度（４５、５０、５５、６０℃のいずれか）に設定したチャンバー内に湿箱を載置し、チャンバー及び室箱をあらかじめ十分予熱しておいた。新しいサンプルチューブにハイブリダイズ緩衝液（2.25×SSC/0.23%SDS）を1.5μLと増幅産物を3μL入れ、混合した。この混合液のうち3μLをDNAチップ上に滴下し、カバーをかけ、十分に予熱しておいた湿箱に入れ、湿箱をチャンバー内に載置した。その後、規定温度で１時間DNAチップと増幅産物を反応させた。   When hybridizing the amplification product obtained as described above to a DNA chip, first, a wet box is placed in a chamber set at a specified temperature (any one of 45, 50, 55, and 60 ° C.). The chamber and the box were pre-heated sufficiently. In a new sample tube, 1.5 μL of hybridization buffer (2.25 × SSC / 0.23% SDS) and 3 μL of amplification product were added and mixed. 3 μL of this mixture was dropped onto the DNA chip, covered, placed in a fully preheated wet box, and the wet box was placed in the chamber. Thereafter, the DNA chip and the amplification product were reacted at a specified temperature for 1 hour.

その後、直ちにカバーを外し、1×SSC/0.1%SDS溶液に５分間静置した後、検出するまで室温の1×SSC溶液に静置した。ハイブリダイズの検出には、BIOSHOT（東洋鋼鈑製）を使用した。このとき、露光時間を５秒に設定した。また、各スポット径内の画素の数値から、中央値を求めた。同じプローブスポットは中央値の平均を求め、各スポットの出力値とした。   Thereafter, the cover was immediately removed, and the plate was left in a 1 × SSC / 0.1% SDS solution for 5 minutes, and then left in a 1 × SSC solution at room temperature until detection. BIOSHOT (manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd.) was used for detection of hybridization. At this time, the exposure time was set to 5 seconds. Further, the median value was obtained from the numerical values of the pixels within each spot diameter. For the same probe spot, the average of the median values was obtained and used as the output value of each spot.

特異性の評価に当たっては、各スポットの蛍光強度値を以下の判定式に代入して得られる判定値を指標とした。   In the evaluation of specificity, a determination value obtained by substituting the fluorescence intensity value of each spot into the following determination formula was used as an index.

本実施例のうち、ハイブリダイズ温度を変化させて得られた判定値を表５に示した。また、野生型アレル及び変異型アレルに対応する一対のCYP2C19*2検出用プローブを異なる塩基長のものを使用したときに得られた判定値を表６に示した。   Table 5 shows the determination values obtained by changing the hybridization temperature in this example. Table 6 shows the determination values obtained when a pair of CYP2C19 * 2 detection probes corresponding to the wild-type allele and the mutant-type allele have different base lengths.

表５から分かるように、本実施例で設計した13〜23塩基のCYP2C19*2検出用プローブであれば、45〜60℃のハイブリダイズ反応温度で、各遺伝子型から得られる判定値に0.2以上の差が見られ、遺伝子型判別が可能であることが明らかとなった。また、表６に示すように、本実施例で設計した13〜23塩基のCYP2C19*2検出用プローブであれば、塩基長が2塩基異なる場合であっても特異性を有していることが確認された。   As can be seen from Table 5, in the case of the 13-23 base CYP2C19 * 2 detection probe designed in this example, the determination value obtained from each genotype is 0.2 or more at a hybridization reaction temperature of 45-60 ° C. It was revealed that genotyping was possible. In addition, as shown in Table 6, the 13 to 23 base CYP2C19 * 2 detection probe designed in this example has specificity even when the base length is different by 2 bases. confirmed.

〔実施例２〕
本実施例では、rs4986893の遺伝子型を判別するための一対のCYP2C19*3検出用プローブを有するDNAチップを作製した。DNAチップに搭載した核酸プローブの一覧を表７に示した。 [Example 2]
In this example, a DNA chip having a pair of CYP2C19 * 3 detection probes for discriminating the genotype of rs4986893 was prepared. Table 7 shows a list of nucleic acid probes mounted on the DNA chip.

本実施例では、PCR法により、蛍光標識を有する、rs4986893を含む核酸断片を増幅し、得られた核酸断片を以上のように作製したDNAチップに対して作用させ、核酸断片と多型検出用プローブとのハイブリダイズを蛍光強度にて検出した。   In this example, a nucleic acid fragment containing rs4986893 having a fluorescent label is amplified by PCR, and the resulting nucleic acid fragment is allowed to act on the DNA chip prepared as described above to detect nucleic acid fragments and polymorphisms. Hybridization with the probe was detected by fluorescence intensity.

蛍光標識プライマーの作製は、5’末端をアミノ基で標識した表８に示すオリゴヌクレオチドC2C193-R（ライフテクノロジーズジャパン製）と、IC5-OSu（同仁化学研究所製）をりん酸緩衝液（pH8.0）中で4℃にて１昼夜反応させた後、MicroSpin G-25 Columns（GEヘルスケア製）を用いて精製することにより作製した。得られた精製物の260nm及び640nmの吸光度を測定することにより、プライマーの濃度及び蛍光色素の濃度を算出した。   The fluorescently labeled primer was prepared by using oligonucleotide C2C193-R (Life Technologies Japan) shown in Table 8 labeled with an amino group at the 5 ′ end and IC5-OSu (Dojindo Laboratories) in phosphate buffer (pH 8). .0), the mixture was reacted at 4 ° C. for 1 day and then purified using MicroSpin G-25 Columns (manufactured by GE Healthcare). By measuring the absorbance at 260 nm and 640 nm of the purified product, the concentration of the primer and the concentration of the fluorescent dye were calculated.

得られた蛍光標識プライマーに蛍光未標識プライマー（C2C193-F）を加え、表８の濃度のプライマーを等量ずつ混合し、プライマーミックスを調整した。表９に示す条件にてPCRを行った。具体的にPCRは、表１０に示す組成で反応液を調整し、これに野生型検体として2pg/μLに調製した野生型配列をもつプラスミドDNA、変異型配列を持つプラスミドDNA及びヘテロ相当として調整したプラスミドDNAを5μLずつ反応チューブにそれぞれ加えた後、PCRをサーマルサイクラー（ABI製）を用いて行った。   Fluorescent unlabeled primer (C2C193-F) was added to the resulting fluorescent labeled primer, and primers of the concentrations shown in Table 8 were mixed in equal amounts to prepare a primer mix. PCR was performed under the conditions shown in Table 9. Specifically, PCR was prepared by preparing a reaction solution with the composition shown in Table 10, and preparing a plasmid DNA having a wild type sequence, a plasmid DNA having a mutant type sequence, and a hetero equivalent prepared as 2 pg / μL as a wild type specimen. The plasmid DNA was added to each reaction tube in an amount of 5 μL, and PCR was performed using a thermal cycler (manufactured by ABI).

以上のようにして得られた増幅産物をDNAチップにハイブリダイズさせる際には、先ず、規定温度（４５、５０、５５、６０℃のいずれか）に設定したチャンバー内に湿箱を載置し、チャンバー及び室箱をあらかじめ十分予熱しておいた。新しいサンプルチューブにハイブリダイズ緩衝液（2.25×SSC/0.23%SDS）を1.5μLと増幅産物を3μL入れ、混合した。この混合液のうち3μLをDNAチップ上に滴下し、カバーをかけ、十分に予熱しておいた湿箱に入れ、湿箱をチャンバー内に載置した。その後、規定温度で１時間DNAチップと増幅産物を反応させた。   When hybridizing the amplification product obtained as described above to a DNA chip, first, a wet box is placed in a chamber set at a specified temperature (any one of 45, 50, 55, and 60 ° C.). The chamber and the box were pre-heated sufficiently. In a new sample tube, 1.5 μL of hybridization buffer (2.25 × SSC / 0.23% SDS) and 3 μL of amplification product were added and mixed. 3 μL of this mixture was dropped onto the DNA chip, covered, placed in a fully preheated wet box, and the wet box was placed in the chamber. Thereafter, the DNA chip and the amplification product were reacted at a specified temperature for 1 hour.

その後、直ちにカバーを外し、1×SSC/0.1%SDS溶液に５分間静置した後、検出するまで室温の1×SSC溶液に静置した。ハイブリダイズの検出には、BIOSHOT（東洋鋼鈑製）を使用した。このとき、露光時間を５秒に設定した。また、各スポット径内の画素の数値から、中央値を求めた。同じプローブスポットは中央値の平均を求め、各スポットの出力値とした。   Thereafter, the cover was immediately removed, and the plate was left in a 1 × SSC / 0.1% SDS solution for 5 minutes, and then left in a 1 × SSC solution at room temperature until detection. BIOSHOT (manufactured by Toyo Kohan Co., Ltd.) was used for detection of hybridization. At this time, the exposure time was set to 5 seconds. Further, the median value was obtained from the numerical values of the pixels within each spot diameter. For the same probe spot, the average of the median values was obtained and used as the output value of each spot.

特異性の評価に当たっては、各スポットの蛍光強度値を以下の判定式に代入して得られる判定値を指標とした。   In the evaluation of specificity, a determination value obtained by substituting the fluorescence intensity value of each spot into the following determination formula was used as an index.

本実施例のうち、ハイブリダイズ温度を変化させて得られた判定値を表１１に示した。また、野生型アレル及び変異型アレルに対応する一対のCYP2C19*3検出用プローブを異なる塩基長のものを使用したときに得られた判定値を表１２に示した。   Table 11 shows the judgment values obtained by changing the hybridization temperature in this example. Table 12 shows the determination values obtained when a pair of CYP2C19 * 3 detection probes corresponding to the wild-type allele and the mutant-type allele have different base lengths.

表１１から分かるように、本実施例で設計した15〜25塩基のCYP2C19*3検出用プローブであれば、45〜60℃のハイブリダイズ反応温度で、各遺伝子型から得られる判定値に0.2以上の差が見られ、遺伝子型判別が可能であることが明らかとなった。また、表１２に示すように、本実施例で設計した15〜25塩基のCYP2C19*3検出用プローブであれば、塩基長が2塩基異なる場合であっても特異性を有していることが確認された。   As can be seen from Table 11, in the case of the 15-25 base CYP2C19 * 3 detection probe designed in this example, the determination value obtained from each genotype is 0.2 or more at a hybridization reaction temperature of 45-60 ° C. It was revealed that genotyping was possible. Moreover, as shown in Table 12, the CYP2C19 * 3 detection probe of 15 to 25 bases designed in this example has specificity even when the base length is different by 2 bases. confirmed.

Claims (18)

配列：5’- TTTCCCRGGAACC-3’（配列番号１、RはA又はG）若しくは当該配列に対して相補的配列からなる、又は当該配列若しくは当該相補的配列の両端に１〜５の塩基が付加した配列からなる、全体が１３〜２３塩基長であるオリゴヌクレオチドを含む、CYP2C19*2検出用プローブ。   Sequence: 5'-TTTCCCRGGAACC-3 '(SEQ ID NO: 1, R is A or G) or a sequence complementary to the sequence, or 1 to 5 bases added to both ends of the sequence or the complementary sequence A CYP2C19 * 2 detection probe comprising an oligonucleotide consisting of the above sequence and having a total length of 13 to 23 bases. 上記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１に示す塩基配列の5’末端にA、5’-TA-3’、5’-TTA-3’、5’-ATTA-3’及び5’-GATTA-3’のいずれかが付加され、上記配列の3’末端にC、5’-CA-3’、5’-CAT-3’、5’-CATA-3’及び5’-CATAA-3’のいずれかが付加された塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的配列であることを特徴とする請求項１記載のCYP2C19*2検出用プローブ。   The base sequence of the oligonucleotide is A, 5'-TA-3 ', 5'-TTA-3', 5'-ATTA-3 'and 5'-GATTA at the 5' end of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. -3 ′ is added, and C, 5′-CA-3 ′, 5′-CAT-3 ′, 5′-CATA-3 ′ and 5′-CATAA-3 ′ are added to the 3 ′ end of the above sequence. The CYP2C19 * 2 detection probe according to claim 1, wherein the probe is a base sequence to which any of the above is added or a complementary sequence to the base sequence. 上記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２〜６のいずれかの塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的配列であることを特徴とする請求項１記載のCYP2C19*2検出用プローブ。
ATTTCCCRGGAACCC（配列番号２）
TATTTCCCRGGAACCCA（配列番号３）
TTATTTCCCRGGAACCCAT（配列番号４）
ATTATTTCCCRGGAACCCATA（配列番号５）
GATTATTTCCCRGGAACCCATAA（配列番号６） The CYP2C19 * 2 detection probe according to claim 1, wherein the base sequence of the oligonucleotide is any one of SEQ ID NOs: 2 to 6 or a complementary sequence to the base sequence.
ATTTCCCRGGAACCC (SEQ ID NO: 2)
TATTTCCCRGGAACCCA (SEQ ID NO: 3)
TTATTTCCCRGGAACCCAT (SEQ ID NO: 4)
ATTATTTCCCRGGAACCCATA (SEQ ID NO: 5)
GATTATTTCCCRGGAACCCATAA (SEQ ID NO: 6) 配列：5’-CCCCCTGRATCCAGG-3’（配列番号７、RはA又はG）若しくは当該配列に対して相補的配列からなる、又は当該配列若しくは当該相補的配列の両端に１〜５の塩基が付加した配列からなる、全体が１５〜２５塩基長であるオリゴヌクレオチドを含む、CYP2C19*3検出用プローブ。   Sequence: 5′-CCCCCTGRATCCAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 7, R is A or G) or a sequence complementary to the sequence, or 1 to 5 bases added to both ends of the sequence or the complementary sequence A probe for CYP2C19 * 3 detection, comprising an oligonucleotide consisting of a sequence of 15 to 25 bases in length. 上記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号７に示す塩基配列の5’末端にA、5’- CA -3’、5’-GCA-3’、5’-AGCA-3’及び5’-AAGCA-3’のいずれかが付加され、上記配列の3’末端にT、5’-TA-3’、5’-TAA-3’、5’-TAAG-3’及び5’-TAAGG-3’のいずれかが付加された塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的配列であることを特徴とする請求項４記載のCYP2C19*3検出用プローブ。   The nucleotide sequence of the above oligonucleotide has A, 5′-CA-3 ′, 5′-GCA-3 ′, 5′-AGCA-3 ′ and 5′-AAGCA at the 5 ′ end of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7. -3 ′ is added, and T, 5′-TA-3 ′, 5′-TAA-3 ′, 5′-TAAG-3 ′ and 5′-TAAGG-3 ′ are added to the 3 ′ end of the above sequence. The CYP2C19 * 3 detection probe according to claim 4, wherein the probe is a base sequence to which any of the above is added or a complementary sequence to the base sequence. 上記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号８〜１３のいずれかの塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的配列であることを特徴とする請求項４記載のCYP2C19*3検出用プローブ。
ACCCCCTGRATCCAGGT（配列番号８）
CACCCCCTGRATCCAGGTA（配列番号９）
CACCCCCTGRATCCAGGTAA（配列番号１０）
GCACCCCCTGRATCCAGGTAA（配列番号１１）
AGCACCCCCTGRATCCAGGTAAG（配列番号１２）
AAGCACCCCCTGRATCCAGGTAAGG（配列番号１３） The CYP2C19 * 3 detection probe according to claim 4, wherein the base sequence of the oligonucleotide is any one of SEQ ID NOS: 8 to 13 or a complementary sequence to the base sequence.
ACCCCCTGRATCCAGGT (SEQ ID NO: 8)
CACCCCCTGRATCCAGGTA (SEQ ID NO: 9)
CACCCCCTGRATCCAGGTAA (SEQ ID NO: 10)
GCACCCCCTGRATCCAGGTAA (SEQ ID NO: 11)
AGCACCCCCTGRATCCAGGTAAG (SEQ ID NO: 12)
AAGCACCCCCTGRATCCAGGTAAGG (SEQ ID NO: 13) 請求項１乃至３いずれか一項記載のCYP2C19*2検出用プローブ及び/又は請求項４乃至６いずれか一項記載のCYP2C19*3検出用プローブを有するマイクロアレイ。   A microarray having the CYP2C19 * 2 detection probe according to any one of claims 1 to 3 and / or the CYP2C19 * 3 detection probe according to any one of claims 4 to 6. 被験者由来のゲノムを鋳型としてCYP2C19遺伝子におけるrs4244285で特定される多型部位を含む核酸断片を増幅する工程と、
得られた核酸断片と請求項１乃至３いずれか一項記載のCYP2C19*2検出用プローブとを接触させる工程と、
得られた核酸断片と上記CYP2C19*2検出用プローブとのハイブリダイズを検出する工程とを含み、
rs4244285の遺伝子型を判定する、薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。 Amplifying a nucleic acid fragment containing a polymorphic site specified by rs4244285 in the CYP2C19 gene using a subject-derived genome as a template;
Contacting the obtained nucleic acid fragment with the CYP2C19 * 2 detection probe according to any one of claims 1 to 3,
A step of detecting hybridization of the obtained nucleic acid fragment and the CYP2C19 * 2 detection probe,
A data acquisition method for predicting drug metabolizing ability to determine the genotype of rs4244285. 上記rs4244285の遺伝子型が変異型アレルCYP2C19*2のホモ又はヘテロである場合に薬剤代謝能が低いと判定することを特徴とする請求項８記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。   9. The data acquisition method for predicting drug metabolizing ability according to claim 8, wherein when the genotype of the rs4244285 is homo or heterozygous of the mutant allele CYP2C19 * 2, it is determined that the drug metabolizing ability is low. 上記CYP2C19*2検出用プローブとして、rs4244285で特定される多型における野生型アレルに対応するオリゴヌクレオチドと、変異型アレルに対応するオリゴヌクレオチドとを使用することを特徴とする請求項８記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。   The drug according to claim 8, wherein an oligonucleotide corresponding to a wild-type allele in a polymorphism specified by rs4244285 and an oligonucleotide corresponding to a mutant-type allele are used as the CYP2C19 * 2 detection probe. Data acquisition method for predicting metabolic capacity. rs4244285で特定される多型における野生型アレルに対応する上記オリゴヌクレオチドと、変異型アレルに対応する上記オリゴヌクレオチドとは、長さが同じである又は２塩基以内の差であることを特徴とする請求項８記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。   The oligonucleotide corresponding to the wild-type allele in the polymorphism specified by rs4244285 and the oligonucleotide corresponding to the mutant-type allele have the same length or a difference within 2 bases The data acquisition method for predicting the drug metabolic capacity of Claim 8. 被験者由来のゲノムを鋳型としてCYP2C19遺伝子におけるrs4986893で特定される多型部位を含む核酸断片を増幅する工程と、
得られた核酸断片と請求項４乃至６いずれか一項記載のCYP2C19*3検出用プローブとを接触させる工程と、
得られた核酸断片と上記CYP2C19*3検出用プローブとのハイブリダイズを検出する工程とを含み、
rs4986893の遺伝子型を判定する、薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。 Amplifying a nucleic acid fragment containing a polymorphic site specified by rs4986893 in the CYP2C19 gene using a subject-derived genome as a template;
Contacting the obtained nucleic acid fragment with the CYP2C19 * 3 detection probe according to any one of claims 4 to 6;
A step of detecting hybridization of the obtained nucleic acid fragment and the CYP2C19 * 3 detection probe,
Data acquisition method for predicting drug metabolizing ability to determine genotype of rs4986893. 上記rs4986893の遺伝子型が変異型アレルCYP2C19*3のホモ又はヘテロである場合に薬剤代謝能が低いと判定することを特徴とする請求項１２記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。   13. The method for obtaining data for predicting drug metabolizing ability according to claim 12, wherein the drug metabolizing ability is determined to be low when the genotype of the rs4986893 is homo or heterozygous of the mutant allele CYP2C19 * 3. 上記CYP2C19*3検出用プローブとして、rs4986893で特定される多型における野生型アレルに対応するオリゴヌクレオチドと、変異型アレルに対応するオリゴヌクレオチドとを使用することを特徴とする請求項１２記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。   The drug according to claim 12, wherein the CYP2C19 * 3 detection probe uses an oligonucleotide corresponding to a wild-type allele in the polymorphism specified by rs4986893 and an oligonucleotide corresponding to a mutant-type allele. Data acquisition method for predicting metabolic capacity. rs4986893で特定される多型における野生型アレルに対応する上記オリゴヌクレオチドと、変異型アレルに対応する上記オリゴヌクレオチドとは、長さが同じである又は２塩基以内の差であることを特徴とする請求項１２記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。   The oligonucleotide corresponding to the wild-type allele in the polymorphism specified by rs4986893 and the oligonucleotide corresponding to the mutant-type allele have the same length or a difference within 2 bases The data acquisition method for predicting the drug metabolic ability according to claim 12. 請求項７記載のマイクロアレイを使用することを特徴とする請求項８又は１２記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。   The data acquisition method for predicting drug metabolizing ability according to claim 8 or 12, wherein the microarray according to claim 7 is used. 上記核酸断片を増幅する工程で得られた核酸断片は蛍光標識を有し、上記ハイブリダイズを検出する工程では当該蛍光標識の蛍光強度値を測定することを特徴とする請求項８又は１２記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。   The nucleic acid fragment obtained in the step of amplifying the nucleic acid fragment has a fluorescent label, and in the step of detecting hybridization, a fluorescence intensity value of the fluorescent label is measured. Data acquisition method for predicting drug metabolic capacity. 上記薬物はオメプラゾール及び/又はランソプラゾールであることを特徴とする請求項８又は１２記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。   The data acquisition method for predicting drug metabolizing ability according to claim 8 or 12, wherein the drug is omeprazole and / or lansoprazole.