JP2006042677A - Method for detecting microbial cell - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、主に食品、化成品、飲料水、製造用水、環境試料、その他試料の微生物細胞の検出、測定方法に関するものである。本発明は、詳しくは、微生物細胞を核酸染色により検出する迅速検査法において、核酸染色試薬に別の発色団を付加し、二つの発色を比較することによって、目的の微生物細胞を検出することを特徴とする微生物細胞の検出方法に関するものである。 The present invention mainly relates to a method for detecting and measuring microbial cells in foods, chemical products, drinking water, water for production, environmental samples, and other samples. More specifically, the present invention relates to a rapid test method for detecting microbial cells by nucleic acid staining, by adding another chromophore to the nucleic acid staining reagent and comparing the two color developments to detect the target microbial cells. The present invention relates to a method for detecting a characteristic microbial cell.
従来、微生物細胞の検出には、平板寒天培地や、液体培地を用いて培養することにより検出する手法が知られている。しかしながら、培養による手法は検出するまでに１から数日間の時間を要し、衛生管理リスクの低減化、在庫管理の効率化を図るために、迅速検査法が開発され、様々な手法が取り入れられている（例えば、特許文献１参照）。 Conventionally, a method of detecting microbial cells by culturing using a plate agar medium or a liquid medium is known. However, the culture method takes 1 to several days to detect, and a rapid inspection method has been developed and various methods have been adopted in order to reduce hygiene management risks and increase the efficiency of inventory management. (For example, refer to Patent Document 1).
以下、その迅速検査法について、図７および図８を参照しながら説明する。 Hereinafter, the rapid inspection method will be described with reference to FIGS.
図に示すように、蛍光顕微鏡部１０１は、光源部１０２と検出部１０３、励起光選択ユニット１０８、対物レンズ１０９からなり、ＸＹステージスキャナー１０４を備えることにより、ステージ上に該微生物試料を標識化し、捕集したメンブレンフィルター１１０を連続的に観察することで、計数することができる。
As shown in the figure, the
また、迅速検査法について、メンブレンフィルター上で、細胞内活性物質量を可視化することにより、より活性の高い微生物を検出、計数する手法が用いられている。 As a rapid inspection method, a technique of detecting and counting microorganisms having higher activity by visualizing the amount of intracellular active substance on a membrane filter is used.
図９に示されるように、メンブレンフィルター１１１を用いて微生物細胞を捕集し、平板培地１１２上にて、短時間培養される。これにより、細胞内活性物質の量を増加させる。更に図１０において、メンブレンフィルター１１１の上部より、該活性物質と反応する試薬１１３をミスト状に添加し、それによる発光を、透過膜１１４を介して、フィルム１１５上に感光し、その発光点を計数するというものである。
これらの迅速検査法では、標識化した微生物細胞を計数する上で、自動化、高速化を図ることが可能である。しかしながら、一般的に使用されている核酸結合型染色色素では、選択性が十分でなく、混在する夾雑物への非特異的な反応により、測定誤差を生じるという課題があり、インターカレーションの発色を選択的に検出する手法の開発が要求されている。 These rapid inspection methods can be automated and speeded up when counting labeled microbial cells. However, the commonly used nucleic acid-binding dyes are not sufficiently selective and have the problem of causing measurement errors due to non-specific reactions to mixed contaminants. There is a demand for the development of a method for selectively detecting the.
また、このような発色において、微生物細胞のような大きさの粒子を、比較的簡便な検出器で検出するためには、蛍光発光のような十分なシグナル強度が得られる発色であることが要求される。また、このとき別の標識においても、十分なシグナル強度を得るために、蛍光発光を利用することが必要とされる。 Further, in such color development, in order to detect particles as large as microbial cells with a relatively simple detector, it is necessary that the color development is such that sufficient signal intensity such as fluorescence is obtained. Is done. At this time, in order to obtain a sufficient signal intensity with another label, it is necessary to use fluorescence.
一方、非特異的な吸着に対して、より簡便な検出系とするために、非特異的な反応による発色を大幅に強度を低下させ、微生物細胞のシグナルの検出を容易にすることが要求される。 On the other hand, in order to make a simpler detection system for non-specific adsorption, it is required to greatly reduce the intensity of color development due to non-specific reaction and facilitate detection of microbial cell signals. The
これらの微生物細胞検出方法において、全ての微生物細胞種、また生細胞、死細胞にかかわらず、安定して標識するためには、標識に用いる核酸染色試薬の細胞膜浸透性が高いものを使用することが必要である。なお、このとき細胞を検出した結果は、陰陽性のみならず、細胞数として記録されることが要求されている。 In these microbial cell detection methods, in order to stably label all microbial cell types, whether living cells or dead cells, use a nucleic acid staining reagent with high cell membrane permeability used for labeling. is required. It should be noted that the result of detecting cells at this time is required to be recorded not only as a negative positive but also as the number of cells.
また、微生物細胞検査において、より高度な衛生管理体制とするために、総細胞数のみならず、生細胞、更には死細胞の検出が求められる。そのためには、死細胞を検出する核酸染色試薬を用いることが必要である。なお、このとき細胞を検出した結果は、陰陽性のみならず、細胞数として記録されることが要求されている。 Further, in the microbial cell inspection, detection of not only the total number of cells but also living cells and further dead cells is required in order to achieve a more advanced hygiene management system. For this purpose, it is necessary to use a nucleic acid staining reagent for detecting dead cells. It should be noted that the result of detecting cells at this time is required to be recorded not only as a negative positive but also as the number of cells.
また、微生物細胞検査では生細胞数を求めることが必要であるが、単独の核酸染色試薬では、直接生細胞数を得ることができない。そのため膜透過性の異なる核酸染色試薬を複数併用して、生細胞を検出し、計数することが要求される。 In addition, it is necessary to determine the number of living cells in the microbial cell test, but the number of living cells cannot be obtained directly with a single nucleic acid staining reagent. Therefore, it is required to detect and count living cells using a plurality of nucleic acid staining reagents having different membrane permeability.
また、ある単一細胞に対して、細胞の生死を識別、検出する場合には、膜透過性の異なる核酸染色試薬を同一サンプルに対して作用させる必要があり、これらの核酸染色試薬が異なる波長の発色を示し、検出系においてそれぞれ別々に検出されることが要求される。 In addition, when identifying and detecting cell viability for a single cell, it is necessary to apply nucleic acid staining reagents with different membrane permeability to the same sample, and these nucleic acid staining reagents have different wavelengths. It is required to be detected separately in the detection system.
一方、このような微生物細胞検査において、細胞の産生する酵素の活性を指標とした検出を行うことが要求されているが、核酸染色試薬を併用することで、より確実に微生物細胞を検出することが必要である。 On the other hand, in such a microbial cell test, it is required to perform detection using the activity of the enzyme produced by the cell as an index. By using a nucleic acid staining reagent in combination, it is possible to detect microbial cells more reliably. is required.
一方、微生物細胞を検出し、計数する上で、試料溶液から微生物細胞を単一状態に分離し、検出器によって計数しやすい状態にサンプリングし、簡便に標識化を行えることが必要である。メンブレンフィルターなどにより、微生物細胞を２次元平面状に捕捉することで、操作しやすくすることが要求される。 On the other hand, when detecting and counting microbial cells, it is necessary to separate the microbial cells from the sample solution into a single state, sample them in a state that can be easily counted by a detector, and perform labeling easily. It is required to facilitate operation by capturing microbial cells in a two-dimensional plane with a membrane filter or the like.
また、微生物細胞を溶液の状態で検出することで、消耗部品を減らし、コストを削減することが要求されている。 In addition, there is a demand for reducing consumable parts and reducing costs by detecting microbial cells in a solution state.
また、微生物細胞検出において、試料中に存在する微生物細胞の総数を求める一般生菌管理と、特定の種類の微生物細胞を検出する管理とが必要である。このような特定の微生物細胞を検出するために、その微生物を標識することのできる、標識抗体、特定塩基配列、また、微生物の産生する特定の酵素を検出する蛍光指示薬を併用し、特定の微生物細胞をより確実に検出することが必要とされる。 Further, in microbial cell detection, it is necessary to perform general viable cell management for determining the total number of microbial cells present in a sample and management for detecting a specific type of microbial cell. In order to detect such specific microbial cells, a specific microorganism can be used in combination with a labeled antibody capable of labeling the microorganism, a specific base sequence, and a fluorescent indicator for detecting a specific enzyme produced by the microorganism. There is a need to more reliably detect cells.
また、細胞内活性物質であるＡＴＰを化学発光によって検出することで、夾雑物による影響を軽減させる手法があるが、これは短時間の培養を必要とし、菌種ごとに培養条件の最適化が必要となるため、環境試料のような未知試料においては測定精度が低下するという課題があり、十分な精度を得るためには、培養時間を長く取り、高感度な光学機器を用いて極微弱光を検出することが必要となる。 In addition, there is a method to reduce the influence of contaminants by detecting ATP, which is an intracellular active substance, by chemiluminescence, but this requires short-term culture, and the culture conditions are optimized for each bacterial species. Therefore, unknown samples such as environmental samples have a problem that the measurement accuracy decreases, and in order to obtain sufficient accuracy, it takes a long incubation time and uses extremely sensitive optical equipment. Need to be detected.
インターカレーターと呼ばれる核酸染色試薬は、微生物細胞の検出のための標識試薬として、主に蛍光発光するものが知られている。これらは、高密度に集積された会合体を形成することにより、蛍光増感を示すことが知られている。しかしながら、これらの核酸染色試薬は、核酸以外の夾雑物に対しても、吸着し、時には蛍光増感を示すことがあり、混在する夾雑物が多いと、微生物細胞を検出する上で測定精度が低下するという課題がある。 Nucleic acid staining reagents called intercalators are known which mainly emit fluorescence as a labeling reagent for detecting microbial cells. These are known to exhibit fluorescence sensitization by forming aggregates accumulated at high density. However, these nucleic acid staining reagents also adsorb to impurities other than nucleic acids and sometimes show fluorescence sensitization. When there are many impurities present in the mixture, the measurement accuracy is high in detecting microbial cells. There is a problem of lowering.
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、混在する夾雑物への非特異的反応による発色の中から、微生物細胞による発色を効率的に識別することができ、また、２つの色素を１分子にすることにより、標識化する操作を簡便に行うことができ、また短時間で行うことを可能とする、迅速な微生物細胞検出方法を提供することを目的としている。 The present invention solves such a conventional problem, and can efficiently identify the coloration caused by microbial cells from the coloration caused by non-specific reaction to the mixed impurities. It is an object of the present invention to provide a rapid method for detecting a microbial cell, in which the operation of labeling can be easily performed by using one dye as one molecule, and can be performed in a short time.
本発明の微生物細胞検出方法は、上記目的を達成するために、核酸染色色素に対して異なる発色を示す発色団を付加し、核酸染色色素による発色と、付加した発色団による発色とを比較することによって、核酸染色色素による増感と、非特異的な反応による発光とを標識量によって識別したものである。これにより核酸染色試薬の発色の中から、インターカレーションによる発色を選択的に検出することができるものである。 In order to achieve the above object, the microbial cell detection method of the present invention adds a chromophore that exhibits different color development to a nucleic acid staining dye, and compares the color development by the nucleic acid staining dye with the color development by the added chromophore. Thus, sensitization by a nucleic acid staining dye and luminescence by a non-specific reaction are distinguished by a labeling amount. As a result, the color developed by the intercalation can be selectively detected from the color developed by the nucleic acid staining reagent.
また、このような発色において、微生物細胞のような大きさの粒子を、比較的簡便な検出器で検出するために、蛍光標識により、高感度での検出が可能となる。また、このとき別の標識においても、蛍光発光を利用することで高感度化できる。 Further, in such color development, since a particle having a size such as a microbial cell is detected by a relatively simple detector, detection with high sensitivity is possible by using a fluorescent label. At this time, even with another label, the sensitivity can be increased by using fluorescence.
一方、非特異的な吸着に対して、より簡便な検出系とするために、非特異的な反応による発色を大幅に強度を低下させるために、インターカレーションする構造を有する化学物質に対して、リンカーを介して消光剤を結合し、非特異的な反応による発色を低下させ、微生物細胞のシグナルを容易に検出することができる。 On the other hand, in order to make a simpler detection system for non-specific adsorption, in order to greatly reduce the intensity of color development due to non-specific reaction, for chemical substances having an intercalating structure By linking a quencher via a linker, color development due to a non-specific reaction is reduced, and a signal of a microbial cell can be easily detected.
また、これらの微生物細胞検出方法において、細胞膜浸透性の高い核酸染色試薬を用いることで、全ての微生物細胞種、また生細胞、死細胞にかかわらず、安定して標識することができ、このとき適当な検出器を用いて、陰陽性のみならず、細胞数として記録することができる。 In addition, in these microbial cell detection methods, by using a nucleic acid staining reagent with high cell membrane permeability, it is possible to stably label all microbial cell types, whether living cells or dead cells. Using an appropriate detector, it can be recorded as the number of cells as well as a negative positive.
また、細胞膜透過性の低い核酸染色試薬を使用することで、死細胞を検出することができ、このとき適当な検出器を用いて、陰陽性のみならず、細胞数として記録することができる。 Moreover, dead cells can be detected by using a nucleic acid staining reagent having low cell membrane permeability, and at this time, not only a negative positive but also the number of cells can be recorded using an appropriate detector.
また、微生物細胞検査では生細胞数を求めることが必要であるため、膜透過性の高い核酸染色試薬で総細胞数を求め、膜透過性の低い核酸染色試薬で死細胞数を求め、差し引くことで、生細胞数を求めることができる。 In addition, since it is necessary to determine the number of living cells in the microbial cell test, the total number of cells is determined with a nucleic acid staining reagent with high membrane permeability, and the number of dead cells is determined with a nucleic acid staining reagent with low membrane permeability. Thus, the number of living cells can be obtained.
また、ある単一細胞に対して、細胞の生死を識別、検出する場合には、膜透過性の異なる核酸染色試薬を同一サンプルに対して作用させる必要があり、異なる波長の発色を示す核酸染色試薬を用いて、異なるカラーチャンネルで検出して、目的の細胞の生死を判別することができる。 In addition, in order to identify and detect cell viability for a single cell, it is necessary to apply nucleic acid staining reagents with different membrane permeability to the same sample, and nucleic acid staining that shows color development at different wavelengths. Reagents can be used to detect in different color channels to determine whether a target cell is alive or dead.
一方、細胞の産生する酵素の活性に対する蛍光指示薬を併用することで、活性の高い微生物細胞を、夾雑物の影響による測定誤差を軽減して検出することができる。 On the other hand, by using together a fluorescent indicator for the activity of the enzyme produced by the cells, highly active microbial cells can be detected while reducing measurement errors due to the influence of impurities.
一方、微生物細胞を検出し、計数する上で、試料溶液から微生物細胞を単一状態に分離し、検出器によって計数しやすい状態にサンプリングし、簡便に標識化を行ために、メンブレンフィルターを使用して、微生物細胞を２次元平面状に捕捉し、標識化し、適当な検出器を使用して細胞の計数を行うことができる。 On the other hand, when detecting and counting microbial cells, the microbial cells are separated from the sample solution into a single state, sampled by a detector for easy counting, and a membrane filter is used for easy labeling. Thus, microbial cells can be captured in a two-dimensional plane, labeled, and counted using an appropriate detector.
また、微生物細胞を溶液の状態で検出するために、フローセルにより検出、計数を行うことで消耗部品を減らし、ランニングコストを削減することができる。 In addition, in order to detect microbial cells in the state of a solution, consumable parts can be reduced and running costs can be reduced by detecting and counting with a flow cell.
また、微生物細胞検出において、試料中に存在する微生物細胞の総数を求める一般生菌管理と、特定の種類の微生物細胞を検出する管理とが必要である。このような特定の微生物細胞を検出するために、その微生物を標識することのできる、標識抗体、特定塩基配列、また、微生物の産生する特定の酵素を検出する蛍光指示薬を併用することで、夾雑物の影響を軽減し、特定の微生物細胞を検出することができる。 Further, in microbial cell detection, it is necessary to perform general viable cell management for determining the total number of microbial cells present in a sample and management for detecting a specific type of microbial cell. In order to detect such specific microbial cells, it is possible to label the microorganism by using a labeled antibody, a specific base sequence, and a fluorescent indicator that detects a specific enzyme produced by the microorganism. The effect of an object can be reduced and a specific microbial cell can be detected.
この手段により、非特異的な反応を含めた核酸染色色素による発色の中から、微生物細胞に由来するものを効率的に検出することができる。また２つの色素を化学結合により１分子とすることで、簡便に、また短時間で標識化可能な微生物細胞検出方法とすることができる。 By this means, it is possible to efficiently detect those derived from microbial cells from among the color developed by nucleic acid staining dyes including non-specific reactions. Moreover, by making two dyes into one molecule by chemical bonding, a microbial cell detection method capable of labeling simply and in a short time can be obtained.
本発明によれば、混在する夾雑物の中から微生物細胞を検出するために、高度な分離精製操作や、電子顕微鏡などの装置による非検査物中の粒子形状の検証を要せず、測定誤差を軽減させ、選択的に微生物細胞を特定できるという効果があり、これを用いた迅速微生物検査装置を、簡易的な光学系で提供することができる。 According to the present invention, in order to detect microbial cells from mixed contaminants, it is not necessary to perform advanced separation and purification operations or verification of particle shapes in non-inspected objects by an apparatus such as an electron microscope, and measurement errors. Can be reduced, and microbial cells can be selectively identified, and a rapid microbiological examination apparatus using this can be provided with a simple optical system.
また衛生管理以外でも、微生物を扱う発酵工程や、廃水処理などの工程管理においても微生物細胞の検出を効率的に行うことができるという効果のある、微生物細胞評価方法を提供できる。 In addition to hygiene management, it is possible to provide a microbial cell evaluation method that is effective in efficiently detecting microbial cells in fermentation processes that handle microorganisms and process management such as wastewater treatment.
本発明の請求項１記載の発明は、核酸にインターカレーションする構造を有する化学物質に、インターカレーションによる発色とは異なる発色をもたらす発色団を、リンカーを介して化学結合した核酸染色試薬を、微生物細胞に接触させたとき、発色団による発色に対して、核酸染色試薬の発色が強く起こった対象を微生物細胞と判断することを特徴とする微生物細胞検出方法である。核酸にインターカレーションすることによる発色と併せて、もう一つの発色団による発色を検出することにより、夾雑物に対する非特異的な反応の中から微生物細胞の発色を効率的に検出するという作用を有する。 According to the first aspect of the present invention, there is provided a nucleic acid staining reagent in which a chromophore that produces color development different from color development by intercalation is chemically bound to a chemical substance having a structure that intercalates with nucleic acid via a linker. A method for detecting a microbial cell, characterized in that, when brought into contact with a microbial cell, a target in which the color development of the nucleic acid staining reagent occurs strongly with respect to the color developed by the chromophore is determined as a microbial cell. In addition to the coloration caused by intercalation with nucleic acid, the coloration of another chromophore is detected, thereby effectively detecting the coloration of microbial cells from non-specific reactions to contaminants. Have.
また、化学物質が蛍光発光を示すことにより、４００倍程度の比較的低倍率でも高感度に微生物細胞を検出できるという作用を有する。 In addition, since the chemical substance emits fluorescence, it has an effect that microbial cells can be detected with high sensitivity even at a relatively low magnification of about 400 times.
また、同様に発色団が蛍光発光を示すことで、４００倍程度の比較的低倍率でも高感度に微生物細胞を検出できるという作用を有する。 Similarly, since the chromophore exhibits fluorescence, it has an effect that microbial cells can be detected with high sensitivity even at a relatively low magnification of about 400 times.
一方、インターカレーションする構造を有する化学物質に、消光剤を結合させることにより、非特異的な反応による発色を減少させることができ、光学系をより簡略化することができるという作用を有する。 On the other hand, by combining a quencher with a chemical substance having an intercalating structure, color development due to a non-specific reaction can be reduced and the optical system can be further simplified.
また、これらの核酸染色試薬が、細胞膜透過性を有することを特徴とすると、生細胞、死細胞に関わらず、細胞内に核酸染色試薬を浸透させることができ、全ての細胞を検出することができるという作用を有する。 In addition, if these nucleic acid staining reagents are characterized by having cell membrane permeability, the nucleic acid staining reagent can penetrate into cells regardless of whether they are living cells or dead cells, and all cells can be detected. Has the effect of being able to.
そのため、これにより検出された微生物細胞の陰陽性を判別できるだけでなく、総細胞数として計数することを特徴とするという作用をもつ。 For this reason, not only the negative positive of the detected microbial cells can be discriminated, but also the operation is characterized by counting the total number of cells.
一方、核酸染色試薬が、細胞膜不透過性を有することを特徴とすると、生細胞への浸透は行われず、イオン透過性の上昇した死細胞のみが染色されるため、全ての細胞の中から死細胞を検出することができるという作用を有する。 On the other hand, if the nucleic acid staining reagent is characterized by being impermeable to the cell membrane, it does not penetrate into living cells, and only dead cells with increased ion permeability are stained. It has the effect | action that a cell can be detected.
そのとき、この核酸染色試薬により、死細胞の陰陽性の判断だけでなく、検出された微生物細胞を、死細胞数として計数することを特徴とするという作用をもつ。 At this time, the nucleic acid staining reagent not only determines whether the dead cells are negatively positive, but also has an effect of counting the detected microbial cells as the number of dead cells.
また、請求項５から８記載の、このような膜透過性の異なる２種類の核酸染色試薬を用い、総細胞数から死細胞数を差し引いて生細胞数とすることを特徴とすることにより、生細胞数と死細胞数を計数することができるという作用を有する。
Moreover, by using two types of nucleic acid staining reagents having different membrane permeability according to
また、２種類の核酸染色試薬を構成する化学物質と、発色団の示す波長がそれぞれ異なり、かつ化学物質の示す発色が、２種類の核酸染色試薬において異なることを特徴とすることで、一つのサンプル内でそれぞれの発色を識別でき、同時に生細胞数と死細胞数を計数することができるという作用を有する。 In addition, the chemical substances constituting the two types of nucleic acid staining reagents and the wavelengths indicated by the chromophores are different from each other, and the colorings indicated by the chemical substances are different in the two types of nucleic acid staining reagents. Each color can be distinguished in the sample, and at the same time, the number of living cells and dead cells can be counted.
また、核酸染色試薬と異なる発色をもつ少なくとも１種類以上の細胞内活性指示薬を併用し、計数を行うことで、核酸の有無、細胞膜透過性以外にも、細胞内活性を同時にモニタリングすることができ、被検査物中の微生物細胞の状態を更に詳細に計測することができるという作用を有する。 In addition to the presence or absence of nucleic acid and cell membrane permeability, intracellular activity can be monitored simultaneously by using and counting together with at least one intracellular activity indicator that has a different color from the nucleic acid staining reagent. It has the effect that the state of the microbial cell in the test object can be measured in more detail.
また、これらをメンブレンフィルター上で微生物細胞の捕集および染色を行うことで、非検査物からの微生物細胞の分離と、染色を安定化することができ、高精度化することができるという作用を有する。 In addition, by collecting and staining microbial cells on a membrane filter, it is possible to stabilize microbial cells from non-inspected objects, stabilize the staining, and increase the accuracy. Have.
また、フローセル内で計数することで、短時間でかつ安価に計測することができるようになり、同時に、発色の異なるものごとに分離するセルソーターへと接続することも可能になり、分離したサンプルを別の実験系に適用することができるという作用を有する。 In addition, by counting in the flow cell, it becomes possible to measure in a short time and at a low cost, and at the same time, it is possible to connect to a cell sorter that separates differently colored ones. It has the effect that it can be applied to another experimental system.
一方、異なる発色を示す標識を付加した、特定の種類の微生物に反応する抗体を併用すると、全ての細胞の中から、特定の抗原を持つ細胞数を計数することができるという作用を有する。 On the other hand, when an antibody that reacts with a specific type of microorganism, to which a label showing different color development is added, the number of cells having a specific antigen can be counted from all cells.
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
（実施の形態１）
図１に示すように、核酸染色試薬は、核酸にインターカレーションする構造を有する化学物質Ａがリンカーを介して発色団Ｂと化学結合された構造をとる。
(Embodiment 1)
As shown in FIG. 1, the nucleic acid staining reagent has a structure in which a chemical substance A having a structure that intercalates with nucleic acid is chemically bonded to a chromophore B through a linker.
化学物質Ａは、核酸にインターカレーションする構造を有する蛍光色素であるが、好ましくは蛍光増感の大きい化合物であることがよく、このような化合物は、エチジウムブロマイドや、オキサゾールイエロー、チアゾールオレンジなどのシアニン系色素を基本骨格に持つものが知られている。またこれらを結合した２量体である、エチジウムダイマーや、ＹＯＹＯ、ＴＯＴＯなども同様に知られている。 The chemical substance A is a fluorescent dye having a structure that intercalates with a nucleic acid, but is preferably a compound having high fluorescence sensitization, such as ethidium bromide, oxazole yellow, thiazole orange, etc. Those having a cyanine dye of the basic skeleton are known. In addition, ethidium dimer, YOYO, TOTO and the like, which are dimers obtained by combining these, are also known.
一方、発色団Ｂは、化学物質と異なる発色を示す化合物であるが、インターカレーションとは独立して蛍光発光を行うことが望ましい。また、細胞膜透過性、不透過性を調節する機能も発色団に付与することが有効である。細胞膜透過性を持たせる場合には、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲなどの化合物があるが、これに限定されるものではない。一方、細胞膜不透過性を持たせる場合には、フルオレセイン、ＮＢＤ、オレゴングリーンなどが知られているが、これに限定されるものではない。 On the other hand, the chromophore B is a compound that exhibits a color development different from that of a chemical substance, but it is desirable to emit fluorescence independently of intercalation. It is also effective to give the chromophore a function for regulating cell membrane permeability and impermeability. In the case of imparting cell membrane permeability, there are compounds such as Texas Red, Tetramethylrhodamine, BODIPY, BODIPY FL, BODIPY TR, but are not limited thereto. On the other hand, in order to impart cell membrane impermeability, fluorescein, NBD, Oregon green and the like are known, but are not limited thereto.
これらの化学物質Ａ、発色団Ｂの発色部位とは関係しない部位の側鎖に、あらかじめアミン基、チオール基、水酸基、ハロゲンなどの反応性置換基、またその反応性置換基を認識する官能基として、スクシンイミジルエステル基、マレイミド基などを導入したものを合成し、それらを反応させて使用することができる。 A reactive group such as an amine group, a thiol group, a hydroxyl group, or a halogen, or a functional group that recognizes the reactive substituent in advance on the side chain of the chemical substance A or the chromophore B that is not related to the coloring site. As described above, those having a succinimidyl ester group, a maleimide group or the like introduced therein can be synthesized and reacted for use.
なお、核酸にインターカレーションする構造を有する化学物質に標識するものとして、消光剤であるが、これは、ダブシル基、ＢＨＱなどが知られているが、これに限定されるものではない。 In addition, although it is a quencher as what labels a chemical substance which has a structure which intercalates with a nucleic acid, this has a dabsyl group, BHQ, etc., However It is not limited to this.
なお、化学物質Ａと発色団Ｂを結合するリンカーであるが、直鎖低級アルカンのほかに、不飽和結合を有するアルケン、アルキン、芳香環などが使用できる。化学物質と発色団との共役状態を持たないよう、立体障害を与えるために、不飽和結合、芳香環を有する方が好ましい。これらは細胞膜への浸透性の妨げにならないよう、低分子で、かつ極性の低いものが好ましい。 In addition, although it is a linker which couple | bonds the chemical substance A and the chromophore B, the alkene, alkyne, aromatic ring, etc. which have an unsaturated bond other than a linear lower alkane can be used. In order to give steric hindrance so as not to have a conjugated state between the chemical substance and the chromophore, it is preferable to have an unsaturated bond and an aromatic ring. These are preferably low molecular weight and low polarity so as not to impede permeability to the cell membrane.
これらの核酸染色試薬を用いた標識方法を図４に示すが、メンブレンフィルター（５）上に捕捉した微生物細胞に対して、試薬（１０）の溶液を滴下し、反応させて染色する。過剰な試薬は、メンブレンフィルターの下部より、マニホールド（１１）を介して吸引除去する。 A labeling method using these nucleic acid staining reagents is shown in FIG. 4, and the reagent (10) solution is dropped onto the microbial cells captured on the membrane filter (5), reacted, and stained. Excess reagent is removed by suction through the manifold (11) from the lower part of the membrane filter.
標識化した微生物細胞の蛍光発光を検出するための励起光源ユニット（１２）の光源として、水銀ランプ、ハロゲンランプ、ＬＥＤ、固体、ガスなどの各種レーザーなどがあるが、これに限定されるものではない。また、これにより励起された微生物細胞の蛍光を、バンドパスフィルター（１３）、適当な倍率に拡大、補正するための対物レンズ（１４）を介して、検出器（１５）に取り込む。 Examples of the light source of the excitation light source unit (12) for detecting the fluorescence emission of the labeled microbial cells include various lasers such as mercury lamp, halogen lamp, LED, solid and gas, but are not limited thereto. Absent. Further, the fluorescence of the microorganism cells excited thereby is taken into the detector (15) through the bandpass filter (13) and the objective lens (14) for enlarging and correcting the magnification.
検出器として、２次元状に存在する微生物細胞をＣＣＤ、Ｃ−ＭＯＳなどの光・電流変換素子によって、空間情報を損なわないよう、適当な露光時間において画像を取得すると、微生物細胞が発光点となる画像が得られる。この発光点の強度、面積を、適当な画像処理ソフトによって解析し、発光点数を求め、測定面積、処理量から算出することにより、試料中に含まれていた微生物数を得ることができる。 When an image is acquired at an appropriate exposure time so that the spatial information is not impaired by a light / current conversion element such as a CCD or C-MOS, the microbial cell is detected as a light emitting point. An image is obtained. The intensity and area of the light emission point are analyzed by appropriate image processing software, the number of light emission points is obtained, and the number of microorganisms contained in the sample can be obtained by calculating from the measurement area and the processing amount.
また、このとき、総細胞数だけでなく、異なる波長、膜透過性をもつ核酸染色試薬を用いて、二重染色を行い、異なる波長の励起光、バンドパスフィルターを使用することで、死細胞数を得ることができる。総細胞数から、死細胞数を差し引いて算出することにより、生細胞数を求めることができる。 At this time, not only the total number of cells, but also double staining using nucleic acid staining reagents with different wavelengths and membrane permeability, and using dead light and bandpass filters, dead cells You can get a number. The number of living cells can be determined by subtracting the number of dead cells from the total number of cells.
（実施の形態２）
実施の形態１で示されたような、核酸染色試薬のうち、同じ蛍光波長を持ち、異なる膜透過性をもつ２種類の試薬を用いて、微生物細胞を含む液体試料の測定を行う（図６）。液体試料を等量ずつ均一に二つに分取するような分岐ユニット（１６）によって分け、それぞれ膜透過性の異なる核酸染色試薬１種類ずつ、試薬染色部（１７）において混合され、染色反応が行われる。反応後の液をバルブ（１８）を切り替えながら、それぞれの試料をフローセル（１９）内に導入し、光源（２０）で励起させながら、蛍光と散乱光をそれぞれ検出する（２１、２２）。核酸染色試薬の蛍光を同一にすることで、励起光は単一で行うことができ、測定器を簡略化することができる。
(Embodiment 2)
Among the nucleic acid staining reagents shown in
また受光側は、インターカレーションによる蛍光発光の波長と発色団による蛍光発光の波長の、２種類の波長の蛍光を検出できることが好ましい。また、側方散乱光、前方散乱光のチャンネルを持つことで、散乱光によるものと、発色団による蛍光発光との２重の検出により、夾雑物の影響を排除しやすくなる。 Moreover, it is preferable that the light-receiving side can detect two types of fluorescence, that is, the fluorescence emission wavelength by intercalation and the fluorescence emission wavelength by the chromophore. In addition, by having a side scattered light channel and a forward scattered light channel, the influence of impurities can be easily eliminated by double detection of the scattered light and the fluorescence emission by the chromophore.
膜透過性の高い核酸染色試薬で染色し、計数された値を総細胞数の半分の値、また膜透過性の低い核酸染色試薬で染色し、計数された値を死細胞数の半分の値として、もとの試料に含まれる生細胞数、死細胞数を算出し、求めることができる。 Stained with nucleic acid staining reagent with high membrane permeability, counted value is half the total number of cells, and stained with nucleic acid staining reagent with low membrane permeability, the counted value is half the number of dead cells As described above, the number of living cells and the number of dead cells contained in the original sample can be calculated and obtained.
（実施の形態３）
実施の形態１に記載されているような、核酸染色試薬のうち、膜透過性の高い試薬を用い、同時に細胞活性指示薬を用いることで、夾雑物の影響を軽減しつつ、総細胞数の中から、活性の高い微生物細胞数を求めることができる。
(Embodiment 3)
Among the nucleic acid staining reagents described in
例えば、細胞内活性を示す指標として、エステラーゼ活性が知られている。これを測定する蛍光指示薬として、５（６）-ＣＦＤＡ、カルセインＡＭ、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ、ＣＭＦＤＡ、オレゴングリーンＡＭ（インビトロジェン社製）などが知られているが、これに限定されるものではない。一方、その他に細胞内活性を示す指標として呼吸活性が知られている。これを測定する蛍光試薬として、細胞内酸化還元によって蛍光テトラゾリウム塩を生成するＣＴＣなどが知られている。 For example, esterase activity is known as an indicator of intracellular activity. As fluorescent indicators for measuring this, 5 (6) -CFDA, calcein AM, BCECF-AM, CMFDA, Oregon Green AM (manufactured by Invitrogen) and the like are known, but are not limited thereto. On the other hand, respiratory activity is known as another indicator of intracellular activity. As a fluorescent reagent for measuring this, CTC that generates a fluorescent tetrazolium salt by intracellular redox is known.
これらのいずれかの活性指示薬をＤＭＳＯなどの適当な溶媒に希釈してストック液とし、これを、微生物細胞を含む液体試料に添加する。もしくは、適当な緩衝液に希釈して、メンブレンフィルター上の捕捉された微生物細胞に滴下、もしくは下部から浸漬し、一定時間反応させ、微生物細胞を染色する。反応後、メンブレンフィルター上にて吸引ろ過し、ここに更に活性指示薬とは異なる蛍光波長をもつ核酸染色試薬を用いて染色し、実施の形態１で示されているような検出装置を用いて、夾雑物の影響を軽減しつつ、総細胞数の中の高い細胞活性を維持する細胞数を求めることができる。
Any one of these activity indicators is diluted in a suitable solvent such as DMSO to obtain a stock solution, which is added to a liquid sample containing microbial cells. Alternatively, it is diluted with an appropriate buffer solution, dropped into a captured microbial cell on a membrane filter, or immersed from below, and allowed to react for a certain period of time to stain the microbial cell. After the reaction, it is suction filtered on a membrane filter, further stained with a nucleic acid staining reagent having a fluorescence wavelength different from that of the active indicator, and using a detection apparatus as shown in
（実施の形態４）
実施の形態１に記載されているような、核酸染色試薬のうち、膜透過性の高い試薬を用い、同時に、特定の種類の微生物細胞種を検出できるような試薬を用いて、夾雑物の影響を軽減しつつ、総細胞数の中から、目的の種類の微生物細胞を検出することができる。
(Embodiment 4)
Of the nucleic acid staining reagents described in
例えば、蛍光抗体を用いた手法として、Ｅ.ｃｏｌｉ Ｏ１５７株を検出するための抗体として、マウス由来抗Ｏ１５７：Ｈ７モノクローナル抗体などが知られている。また、２次抗体としてＩｇＧを抗原としたモノクローナル抗体やポリクローナル抗体に、蛍光標識である、テキサスレッド、ＴＭＲ、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミンなどを標識した抗体が使用できる。（例えば、テキサスレッド標識ヤギ由来抗マウスＩｇＧ：Ｈ＋Ｌ抗体）が知られている。これらの２次抗体の蛍光標識は、核酸染色試薬による蛍光発光の波長とは異なることが望ましい。メンブレンフィルター上に捕捉した微生物細胞に対して、緩衝液によって適当な濃度に調製したカゼイン、ＢＳＡなどにより、適当な条件下でブロッキング処理、洗浄処理を行い、１次抗体、２次抗体を標識する。その後、核酸染色試薬で染色し、実施の形態１で示されたような検出装置を用いて、核酸染色試薬による蛍光発光を示す細胞と、蛍光抗体により標識された目的の微生物細胞をそれぞれ検出、計数することができる。
For example, as a technique using a fluorescent antibody, a mouse-derived anti-O157: H7 monoclonal antibody or the like is known as an antibody for detecting the E. coli O157 strain. Further, antibodies labeled with fluorescent labels such as Texas Red, TMR, FITC, RITC, Cy2, Cy3, Cy5, rhodamine and the like can be used for monoclonal antibodies and polyclonal antibodies using IgG as an antigen as a secondary antibody. (For example, Texas Red-labeled goat-derived anti-mouse IgG: H + L antibody) is known. The fluorescent labels of these secondary antibodies are preferably different from the wavelength of fluorescence emitted by the nucleic acid staining reagent. The microbial cells captured on the membrane filter are subjected to blocking treatment and washing treatment under appropriate conditions with casein, BSA, etc., prepared to an appropriate concentration with a buffer solution, and the primary antibody and the secondary antibody are labeled. . Thereafter, the cells are stained with a nucleic acid staining reagent, and using the detection apparatus as shown in
なお、目的の種類の微生物細胞を検出する手法として、核酸染色試薬と異なる蛍光発光の波長を示す蛍光発光団により標識された、特定の塩基配列をもつオリゴヌクレオチドを用いることができる。 In addition, as a technique for detecting a target type of microbial cell, an oligonucleotide having a specific base sequence labeled with a fluorophore having a fluorescence emission wavelength different from that of the nucleic acid staining reagent can be used.
ＦＩＳＨ法と呼ばれるこの手法は、例えば、目的の微生物細胞種のもつ特定の配列のプローブとなるよう設計されたオリゴヌクレオチドに、ＴＲＩＴＣ、ＦＩＴＣ、ＴＭＲ、Ｃｙ３、ローダミンなどの蛍光標識を作製し、メンブレンフィルター上に捕捉された微生物細胞に対して、ホルムアルデヒド、ＳＤＳなどの界面活性剤、プロテアーゼなどの変性剤を用いて細胞膜透過性を上昇させ、メンブレンフィルター下部より吸引除去する。洗浄後、ここに適当な緩衝液で調製された上記蛍光プローブ溶液を滴下し、適当な条件下でハイブリダイゼーションを行う。反応後、洗浄、吸引除去などを行い、蛍光プローブの蛍光波長とは異なる波長をもつ核酸染色試薬によって、染色を行い、実施の形態１で示されているような検出装置を用いて、夾雑物の影響を軽減しつつ、総細胞数に含まれる、特定の微生物細胞数を得ることができる。
This technique, called the FISH method, is used to produce fluorescent labels such as TRITC, FITC, TMR, Cy3, rhodamine, etc. on an oligonucleotide designed to be a probe of a specific sequence possessed by a target microorganism cell type, for example. The microbial cells trapped on the filter are increased in cell membrane permeability using a surfactant such as formaldehyde and SDS, and a denaturing agent such as protease, and removed by suction from the lower part of the membrane filter. After washing, the above-mentioned fluorescent probe solution prepared with an appropriate buffer is added dropwise, and hybridization is performed under appropriate conditions. After the reaction, washing, suction removal, etc. are performed, staining is performed with a nucleic acid staining reagent having a wavelength different from the fluorescence wavelength of the fluorescent probe, and a contaminant such as that shown in
なお、特定の塩基配列をもつオリゴヌクレオチドを用いた手法として、ｉｎ ｓｉ ｔｕＰＣＲや、ｉｎ ｓｉｔｕ ＬＡＭＰなどの遺伝子増幅法も有効であ る。 In addition, gene amplification methods such as in situ PCR and in situ LAMP are also effective as methods using oligonucleotides having a specific base sequence.
なお、特定の酵素を産生する微生物細胞を検出する手段として、該酵素により反応して、細胞内、表面に、蛍光色素が蓄積されるという指示薬を用いた手法がある。大腸菌群と呼ばれる微生物種の一群は、細胞内にβガラクトシダーゼを産生することが知られており、ガラクトピラノシドに蛍光色素を結合させた指示薬を用いて、蛍光色素が遊離して蛍光発光を示すようになった試料を、大腸菌群陽性として、検出するものである。このような指示薬として、４−ＭＵＧ、ＣＭＦＤＧ、ＰＦＢ−ＦＤＧなどの試薬が知られている。 As a means for detecting microbial cells that produce a specific enzyme, there is a technique using an indicator that reacts with the enzyme and accumulates a fluorescent dye in the cell or on the surface. A group of microbial species called coliforms is known to produce β-galactosidase in the cell, and the fluorescent dye is released using an indicator with a fluorescent dye bound to galactopyranoside. The sample which came to show is detected as a coliform group positive. As such an indicator, reagents such as 4-MUG, CMFDG, and PFB-FDG are known.
このうち、ＰＦＢ−ＦＤＧは、蛍光色素が遊離後、細胞膜表面に吸着する指示薬である。メンブレンフィルター上に捕捉した微生物細胞に対して、誘導剤であるＩＰＴＧを適当な条件下で作用させ、メンブレンフィルター下部より吸引除去する。その後、適当な溶媒に希釈したＰＦＢ−ＦＤＧ溶液を、適当な条件下で反応させる。この後、緑色蛍光以外の、例えば赤色蛍光を示す、実施の形態１で示されたような核酸染色試薬を用いて染色反応を行い、それぞれの蛍光発光の波長を検出することで、夾雑物の影響を軽減して、総細胞数の中から、大腸菌群数を求めることができる。
Among them, PFB-FDG is an indicator that is adsorbed on the cell membrane surface after the fluorescent dye is liberated. IPTG, which is an inducer, is allowed to act on the microorganism cells trapped on the membrane filter under appropriate conditions, and is removed by suction from the lower part of the membrane filter. Thereafter, the PFB-FDG solution diluted in a suitable solvent is reacted under suitable conditions. Thereafter, a staining reaction is performed using a nucleic acid staining reagent other than green fluorescence, for example, red fluorescence, as shown in
図１の核酸染色試薬を実現するために、これら化学物質及び発色団を、リンカーを介して化学結合するためには、蛍光色素分子の構造のうち、発色団とは直接関与しない部位に、反応性置換基をもっている必要があり、この条件を満たすものとして、例えば化学物質にはＳＹＢＲ １０１ ＳＥ、ＳＹＢＲ １０２ ＳＥ、ＳＹＢＲ１０３ ＳＥ、発色団には、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ｃａｄａｖｅｒｉｎｅなどの化合物がある。これらは、化学物質には、アミン基で置換反応を行うスクシンイミジルエステル基を持ち、また発色団に、リンカーとして炭素数５の低級アルキルが既に結合されているため、これらを混合することで容易に化学結合を形成させ、核酸染色試薬を得ることができる。
In order to realize the nucleic acid staining reagent of FIG. 1, these chemical substances and chromophores are chemically bonded to each other through a linker at a site that is not directly involved with the chromophore in the structure of the fluorescent dye molecule. For example, chemical substances such as
なお、化学物質として知られるＳＹＢＲ１０１などの化合物は、全て緑色蛍光を示すことから、発色団には緑色以外の赤色蛍光などの化合物が好ましい。 In addition, since compounds, such as SYBR101 known as a chemical substance, all exhibit green fluorescence, compounds such as red fluorescence other than green are preferable for the chromophore.
化学物質Ａとして、ＳＹＢＲ１０１ ＳＥ、発色団Ｂおよびリンカーとして、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ ｃａｄａｖｅｒｉｎｅを用いた。これらはともに細胞膜透過性を有するため、反応後の核酸染色試薬は総菌数の計数が行えると考えられた。これらをｐＨ８．５のホウ酸緩衝液中で、Ａ、Ｂの終濃度が数百マイクロモル／Ｌとなるように混合し、２５℃で３時間反応させた後、反応液を１００倍希釈になるように、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２株と、夾雑物として球状シリカゲル粒子の懸濁液（ＰＢＳ）に希釈し、１０分間染色した。検出装置について図２に示すが、ポアサイズが０．４マイクロメートルのメンブレンフィルター（５）にろ過し、キセノン水銀ランプを励起光源（６）として、目的の励起波長をダイクロイックミラー（７）を介して、対物レンズ（８）により照射、表面を蛍光顕微鏡で観察し、画像を冷却ＣＣＤカメラ（９）にて画像を撮像した。図３は、蛍光画像を画像処理ソフトウェアにて２値化後、エッジを検出して発光物を抽出したものである。チャンネルＡはＢ夾帯域励起（図３、ａ）、チャンネルＢは夾帯域Ｇ励起（図３、ｂ）、チャンネルＣは広帯域Ｕ励起の蛍光画像（図３、ｃ）の処理後画像を示す。チャンネルＡに見られる発光点は、チャンネルＢでは殆ど見ることができない。一方、チャンネルＢで見られる発光物は、チャンネルＡでは殆ど検出されない。チャンネルＡで強く蛍光を示している発光物は主にＥ．ｃｏｌｉであることが認められ、緑色蛍光が優先して発光しており、微生物細胞のシグナルが、非特異的な夾雑物の中から、選択的に検出されていることが示された。また、参考としてチャンネルＢではシリカゲルの赤色蛍光像の処理後画像、チャンネルＣでは両方すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉとシリカゲルの蛍光像の処理後画像を示すものである。 As chemical substance A, SYBR101 SE, chromophore B, and BODIPY TR cadaverine as linker were used. Since both of these have cell membrane permeability, it was considered that the nucleic acid staining reagent after the reaction can count the total number of bacteria. These were mixed in a borate buffer solution of pH 8.5 so that the final concentrations of A and B would be several hundred micromol / L and reacted at 25 ° C. for 3 hours, and then the reaction solution was diluted 100 times. E. E. coli K-12 strain and spherical silica gel particle suspension (PBS) as a contaminant were diluted and stained for 10 minutes. The detection apparatus is shown in FIG. 2, and filtered through a membrane filter (5) having a pore size of 0.4 micrometers, using a xenon mercury lamp as an excitation light source (6), and a target excitation wavelength via a dichroic mirror (7). The sample was irradiated with an objective lens (8), the surface was observed with a fluorescence microscope, and the image was taken with a cooled CCD camera (9). FIG. 3 shows an image obtained by binarizing a fluorescent image using image processing software, extracting edges, and detecting a luminescent material. Channel A shows a post-process image of a fluorescence image (FIG. 3, c) of B-band excitation (FIG. 3, a), channel B, a narrow-band G excitation (FIG. 3, b), and channel C, a broadband U excitation. The light emitting point seen in channel A is hardly visible in channel B. On the other hand, the luminescent material seen in channel B is hardly detected in channel A. The luminescent material that shows strong fluorescence in channel A is mainly E. coli. As a result, the green fluorescence was preferentially emitted, indicating that the microbial cell signal was selectively detected from non-specific contaminants. For reference, the processed image of the red fluorescent image of silica gel is used for channel B, and both are used for channel C. The image after the process of the fluorescence image of E. coli and silica gel is shown.
核酸にインターカレーションする構造を有する化学物質に新たに付加した発色団の発色をインターカレーションによる発色とを比較することにより、微生物細胞を容易に標識化することができ、混在する夾雑物の中から、定性的に微生物細胞を特定することができる。同じくインターカレーションする化合物を用いて蛍光発光で核酸の検出を行うＤＮＡマイクロアレイや、遺伝子増幅技術の検出用試薬として、非特異的な反応に由来するバックグラウンドノイズを軽減でき、高感度な装置の開発などの用途にも適用できる可能性をもつ。 By comparing the coloration of the chromophore newly added to the chemical substance having a structure that intercalates with nucleic acid with the coloration by intercalation, microbial cells can be easily labeled, From the inside, microbial cells can be identified qualitatively. Similarly, DNA microarrays that detect nucleic acids by fluorescence emission using intercalating compounds and detection reagents for gene amplification technology can reduce background noise resulting from non-specific reactions, and are highly sensitive devices. It has the potential to be applied to uses such as development.
また、微生物細胞以外にも、動物細胞、植物細胞などの細胞の計測技術においても、夾雑物の混在により計測誤差をもつ可能性がある場合には、適用できる可能性をもつ。 In addition to microbial cells, measurement techniques for cells such as animal cells and plant cells may also be applicable if there is a possibility of measurement errors due to the mixing of impurities.
１ 化学物質Ａ（インターカレーター）
２ 発色団Ｂ
３ リンカー
４ 核酸染色試薬
５ メンブレンフィルター
６ 励起光源
７ ダイクロイックミラー
８ 対物レンズ
９ ＣＣＤカメラ
１０ 試薬
１１ マニホールド
１２ 励起光源ユニット
１３ バンドパスフィルター
１４ 対物レンズ
１５ 検出器
１６ 分岐ユニット
１７ 試薬染色部
１８ バルブ
１９ フローセル
２０ 光源
２１ 蛍光検出部
２２ 散乱光検出部
１０１ 蛍光顕微鏡部
１０２ 光源部
１０３ 検出部
１０４ ＸＹステージスキャナー
１０５ ドライバ
１０６ フィルタユニット
１０７ ＰＣ
１０８ 励起光選択ユニット
１０９ 対物レンズ
１１０ メンブレンフィルター
１１１ メンブレンフィルター
１１２ 平板培地
１１３ 試薬
１１４ 透過膜
１１５ フィルム
1 Chemical Substance A (Intercalator)
2 Chromophore B
3
108 Excitation
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