JP2005523702A - リュードコッカス・エリトロポリスからのadh - Google Patents
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Abstract
Description
a)配列番号1で示された配列を有する核酸配列、
b)ストリンジェントな条件下で、配列番号1による核酸配列またはこれと相補的な配列と一緒にハイブリダイズする核酸配列、
c)配列番号1と少なくとも91%の相同性を有する核酸配列、
d)配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも84%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸配列、その際、配列番号2のポリペプチドと比較して、ポリペプチドの活性および/または選択性および/または安定性について本質的に減少することはないものであって、
e)配列番号2のポリペプチドと比較して改善された活性および/または選択性および/または安定性を有するポリペプチドをコードする核酸配列
を得ることが可能であり、この場合、これらは、
i)配列番号1を突然変異させ、
ii)適したベクター中で、i)から得られた核酸配列をクローニングし、その後に適した発現系に移し、
iii)改善された活性および/または選択性および/または安定性を有するクリティカルなポリペプチドを検出することによって製造されたものであり、好ましい場合には、適した量で、かつ組み換え技術を用いて製造され、この場合、酵素は、エナンチオマー濃縮化合物を製造するための酵素的工業プロセスに関して必要とされる。核酸配列を用いた場合には、急速に成長したホスト微生物から高い収率でポリペプチドを得ることが可能である。通常ではない広い範囲の基質スペクトルに加えて、本発明によるポリペプチドは予測とは対照的に熱耐性である。
a)本発明による核酸配列によってコードされたポリペプチド、
b)配列番号2による配列を含有するポリペプチド、
c)配列番号2のポリペプチドに対して>82%の相同性を有するポリペプチド、その際、ポリペプチドの活性および/または選択性および/または安定性が、配列番号2のポリペプチドと比較した場合に本質的に減少していることはない。
本発明による核酸を含有する遺伝子コンストラクトを包含するプラスミドを、極めて好ましい方法でホスト微生物中でクローニングすることができるプラスミドは、以下のものである。pUC18(Roche Biochemicals)、pKK−177−3H(Roche Biochemicals)、pBTac2(Roche Biochemicals)、pKK223−3(Amersham Pharmacia Biotech)、pKK−233−3(Stratagene)またはpET(Novagen)、またはpKA1(図1)である。
a)核酸配列を突然変異させ、
b)a)により得られた核酸配列を適したベクター中でクローニングし、その後に、これを適した発現系に移し、かつ、
c)改善された活性および/または選択性および/または安定性を有するポリペプチドの形成を検出し、かつ単離する。
適用に関して、包含されるポリペプチドは、均一に精製された化合物または組換えにより製造された酵素としての遊離系の形で使用することができる。さらに、ポリペプチドは構成成分として、昆虫寄生微生物または消化され、かつ任意に高度に精製された、ホスト微生物からのすべての細胞材料との組合せで使用することができる。固定化された形で酵素を使用することも可能である(Sharma B.P.; Bailey L. F. and Messing R. A. (1982), Immobilisierte Biometerialien- Techniken und Anwendungen, Agew. Chem. 94, 836-852)。有利には、固定化は凍結乾燥によって達成される。
アルコールデヒドロゲナーゼの精製および得られる部分的配列データ
R.エリトロポリスを、DSM65培地(1l当たりグルコース4g、イーストエクストラクト4g、マルトエクストラクト 10g;pH7.2)中で、3日間に亘って30℃で好気性条件下で培養した。細胞をハーベストした後に、これらをバッファー(細胞1g当たりトリス−HClバッファーpH7.4 1.5mlを添加したもの)を用いて懸濁し、ガラスビーズで粉砕することによって分解した。固体構成成分および細胞フラグメントを遠心分離によって除去し、かつ細胞不含の上清液体をさらなる精製のための粗抽出物として使用した。
遺伝子配列の決定
データベースサーチは、アルコールデヒドロゲナーゼの群に属する酵素が、特徴的な保存領域を有することを示した。これらの領域は、たとえば:
a)RE−ADH遺伝子(野生型)のベクターpKK223−3中でのクローニング
RE−ADH遺伝子の発現のために、プラスミドpKK223−3を最初に選択した(Amersham Pharmacia Biotech).
ADH遺伝子を以下の条件下で、PCRを用いて増幅させた:
DNAの変性のために、これを94℃で3分に亘ってインキュベートした。その後に、以下を30サイクルに亘っておこなった。
変性: 45秒;94℃
アニーリング: 30秒;64℃
伸長: 110秒;68℃
終結工程(concluding step): 10分;68℃
冷却:6℃
反応容量は50μlであった。
AdvanTaqDNAポリメラーゼ(CLONTECH)を反応のためのポリメラーゼとして使用した。
b)RE−ADH遺伝子(突然変異体)のベクターpKA1中でのクローニング
E.Coli中の良好な発現割合を達成するために、コドン中位置8においてアミノ酸であるアルギニンをコードするコドンが、さらにアルギニンをコードするCGTに変更された突然変異を導入した(「マイナーコドン」への置換(Chen, G.T., Inouye, M., Nucleic Acids Res. Vol. 18 (1990), 1465; Chen, G. T., Inouye, M., Genes Dev. Vol. 8 (1994), 2641))。
遺伝子を、PCRを用いて増幅させ、その際、以下のPCR条件を使用した:
DNAを変性させるために、これを94℃で3分に亘ってインキュベートした。その後に以下のような30サイクルをおこなった:
変性: 45秒;94℃
アニーリング: 30秒;64℃
伸長:110秒;68℃
終結工程:10分;68℃
冷却:6℃
反応溶液は50μlであった。
このプラスミドをプラスミドベクターpET11a、複製源ColE1(Novagen)および中程度のコピー数を有するプラスミドベクターpACYC184、複製源p15A(Biolabs)から構築した。pET11aは、選択マーカー、アンピシリン(Amp)−耐性遺伝子を選択マーカーとして、クロラムフェニコール(Cam)−耐性およびテトラサイクリン(Tet)−耐性のための遺伝子を含有している。
組換え細胞を、培地LBcam中で37℃で増殖させた。OD600で0.5であり、発現を25μM IPTGで導入し、その後に細胞を12時間に亘って30℃で増殖させた。細胞を5000rpmで15分に亘って遠心分離した後にハーベストし、沈殿を100mM Kpiバッファー(細胞1gあたり1.5ml)中で再懸濁し、かつ超音波を用いて分解した。
R.エリトロポリスからのアルコールデヒドロゲナーゼと、コリネバクテリウム種からのアルコールデヒドロゲナーゼとの生物化学的比較
R.エリトロポリスからのADHのための遺伝子配列を、データベースにおける遺伝子配列と比較した場合に、RE−ADHが、コリネバクテリウム種からのアルデヒドレダクターゼとの高い程度の相同性を有することが示された。アルデヒドレダクターゼに関する刊行物において、この酵素の多くの生物化学的性質が記載されている(Itoh, N. R. Morihama, J. Wang, K. Okada and N. Mizuguchi (1997), Purification and characterisation of phenylacetaldehyde reductase from a styrene- assimilating Corynebacterium strain, St-10, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3783-378)。刊行物において記載されている(アルデヒド)基質のいくつかはRE−ADHを用いて変換され、かつレダクターゼの相対的活性を使用して比較された。第6表は、アルデヒドを含むこれらの結果を示し、さらにアセトフェノンとの反応に対する2個の酵素の活性を示した。刊行されたデータ材料を用いての2個の酵素の他の比較は意味のあることではなく、それというのもコリネバクテリウムからの酵素は、基質としてのフェニルアセトアルデヒドと一緒に排他的に試験されるが、しかしながら、従来p−Cl−アセトフェノンを用いて特徴付けられていない。
コリネバクテリウム種からのアルデヒドレダクターゼを含むRE−ADHと、アセトフェノン還元およびいくつかのアルデヒドに関する活性に対する比較
コリネバクテリウムからの酵素データを、Itohら(前記参照)による刊行物から得て、RE−ADH上のデータは我々の尺度であった(相同性=極めて純粋な相同的な酵素)。相対的活性を用いての比較に関しては、2個の酵素の活性が、フェニルアルデヒドに関して=100%を示した。
R.エリトロポリスからのアルコールデヒドロゲナーゼの生物化学的特徴
a)基質スペクトル
第7表:ケトンおよびケトエステルに関するR.エリトロポリスからの新規ADHの基質特異性
第7表は以下に、R.エリトロポリスからのアルコールデヒドロゲナーゼが、多くのケトンおよびケトエステルを受容し、これによって芳香族および脂肪族の第2アルコールの製造に適している。この場合において、相対的活性は、アセトフェノンに関して測定された活性に対するものである。
還元反応に関して、RE−ADHは、基質p−Cl−アセトフェノンに対して0.5mMおよび補酵素NADHに対して0.025mMのKm値を示す。酸化反応に関しては、(S)−p−Cl−フェニルエタノールのための値は0.28mMであり、かつNADに関する値は0.082mMである。
c)活性および安定性に関するpH最適値
RE−ADHに関するpH最適値は、還元反応に関してpH6.0である(p−Cl−アセトフェノンを用いて測定した)。
R.エリトロポリスからのADHの製造方法
酵素の製造ポテンシャルは、いくつかのケト−化合物を反応させることによって示されてもよい。
a)還元反応
還元は、補酵素NADHに関する再生反応と一緒に結合させなければならず、たとえばホルメートデヒドロゲナーゼおよびホルメートとの反応である。しかしながら、すべての他のNADH−製造反応もさらに使用されてよい。生成物は、ガスクロマトグラフィーを用いて分析し、その際、固定相はGCカラム中で、エナンチオマーのアルコールを分離する能力を有し、これによって、酵素的に製造された生成物のee値の情報を得ることができる。
10mM ケト−化合物
0.5mM NAD
100mM Na ホルメート
1U/ml ホルメートデヒドロゲナーゼ
0.5U/ml アルコールデヒドロゲナーゼ(イオン交換クロマトグラフィーによって部分的に精製されたもの;単位はp−Cl−アセトフェノンおよびNADHを用いての標準試験で光学的に測定された)
0分、5分および10分の時点で、試料(100μl)を取り出し、クロロホルム100μlで抽出し、かつクロロホルム相をガスクロマトグラフィーを用いて分析した。
GC分析:
カラム:CP−Chirasil−DEX CB 長さ:25m、直径:25μm(Chrompack)。温度プログラム:60℃で5分、その後に190℃まで5℃/分(ヘキサノン/ヘキサノールに関して:30分に亘って60℃、その後に10℃/分で195℃まで)。カラム流は1.3ml/分;ガス:ヘリウム。
p−Cl−アセトフェノン、アセトフェノン、エチル2−オキソブチレート、2−ヘキサノンおよび2−ヘプタノン。第8表は、生成物純度上でのデータを示す。すべての化合物は十分に10分後に変換され;ガスクロマトグラフィーによる分析は、1個のエナンチオマーのみがそれぞれの反応体と一緒に形成されたことを示す。したがって酵素は、ケト−化合物を高くエナンチオ選択的な方法で還元した。
アルコールのエナンチオ選択的酸化によって、たとえばエナンチオマー濃縮またはエナンチオマー的に純粋なアルコールは、ラセミ体から得ることができる。たとえば、これは、(R)−フェニルエタノールの製造をおこなった:
以下のものを使用した:10mM(R,S)−フェニルエタノール、0.5mM NADH、2mM DTTを含む50mM トリス−HClバッファーpH7.5、R.エリトロポリスからの1U ADHおよび2U NADHオキシダーゼ(DE10140088によるLactobacillus brevis DSM20054からのもの)
試料は0、1および2時間後に取り出し、かつガスクロマトグラフィーにより分離した(カラム:CP−Chirasil−DEX CB 長さ:25m、直径:25μm(Chrompack))、温度プログラム:5分60℃、その後に5℃/分で190℃まで上昇;カラム流速1.3ml/分;ガス:ヘリウムであった。この場合において、双方のアセトフェノンピーク(生成物;保持時間=16.9分)、更にはフェニルエタノールのエナンチオマー(反応体;保持時間 R−フェニルエタノール=20.8分およびS−フェニルエタノール=21.1分)が記録された。
酵素の固定化
RE−ADHは、種々の結合方法および支持材料を用いて固定化することができる。たとえば、酵素は、支持材料、たとえばEupergit(R)と、共有結合を介して結合させることができる。
a)Eupergit(R)上の固定化(商標;Roehm/Desussa)
Eupergit C(R)およびEupergit C250L(R)を、平衡バッチで使用し、この場合、これらは部分的に精製されたRE−ADHで充填したものである(Literature reference relationg to Eupergit immobilisation: E. Katchalski-Katzie, D. M. Kraemer, J. Mol. Catal. B: Enzym. 2000, 10, 157)。以下のものを試験のために使用した。
0.5mM NAD
30mg 固定化物
1U/ml ホルメートデヒドロゲナーゼ(FDH)
これらの試験材料を30℃でインキュベートし、試料(100μl)をそれぞれの混合物から0、5、10および15分後に取り出し、これをクロロホルム100μlで抽出し、かつクロロホルム相をガスクロマトグラフィーを用いて、形成された任意のフェニルエタノールに関して分析した。固定化された酵素活性は、フェニルエタノール形成のキネティックスより算定され、かつEupergit C(R)に関しては11.8U/gおよびEupergitC250L(R)に関しては8U/gの値が得られた。使用された酵素量に対して、これは、1%(EupergitC(R))および0.8%の結合収率(EupergitC250L(R))に相当する。
b)Ni−NTA上の固定化
Ni−NTA上の固定化のために、酵素をHis−Tag(ヘキサ−ヒスチジン)と一緒にC−末端に提供し、遺伝子工学的技術を用いておこなった。
−RE−ADH遺伝子の改質化:
以下のヌクレオチドプライマーは、ヘキサ−ヒスチジン基をC−末端で製造するために構築した:
組換え体 E.Coli JM105/pRE−ADH5細胞を、イミダゾール含有バッファー(50mM NaH2PO4;300mM NaCl;10mMイミダゾール、
pH8.0)中で粉砕し、かつ粗抽出物を、従来記載された方法中で製造した。固定化のために、酵素溶液1ml(13U/ml RE−ADH、カルチャーE.Coli JM105/pRE−ADH5からの粗抽出物;タンパク質8mg/ml)を、Ni−NTA担体300mgに添加し(Quiagen)、かつ、0℃で10分に亘ってインキュベートした(氷浴)。懸濁液を遠心分離した後に、3U/mlは、なおも残留活性として、上清中に非結合酵素として検出することができた。固定化物をp−Cl−アセトフェノンと一緒に反応させ、結合活性を検出した。
30mg 固定化物
3mM p−Cl−アセトフェノン(基質;100mM Na ホルメート、50mM Kpiバッファー pH6.0)
0.5mM NAD
1U ホルメート デヒドロゲナーゼ
試験バッチを同様の方法で、前記に示したようにしてインキュベートし(Eupergit (R)上での固定化)、試料を取り出し、かつこれらをガスクロマトグラフィーを用いて分析した。図2は、反応のカイネティクスを示し;p−Cl−フェニルエタノールの形成のカイネティクスに基づいて、0.21Uの活性を算定した。この試験が30mgの固定化物を用いておこなわれ、かつ10U RE−ADHが担体300mgに結合するといった事実に考慮して、1Uを、30mgの試験バッチ中に導入した。0.21Uの活性が報告されてはいるが、21%の固定化収率が得られた。固定化物で形成されたアルコールのエナンチオマーの純度(ee値)は>99%であった。
Claims (17)
- アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、単離された核酸配列が、
a)配列番号1の配列を有する核酸配列、
b)配列番号1による核酸配列またはそれと相補的な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、
c)配列番号1と少なくとも91%の相同性を有する核酸配列、
d)アミノ酸レベルで、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも84%の相同性を有するポリペプチドをコードする核酸配列、この場合、これらの配列は、配列番号2のポリペプチドと比較した場合に、ポリペプチドの活性および/または選択性および/または安定性を本質的に減少させるものではなく、
e)配列番号2のポリペプチドと比較した場合に、改善された活性および/または選択性および/または安定性を有するポリペプチドをコードする核酸配列
から成る群から選択され、この場合、これらの配列が、
i)配列番号1の突然変異
ii)i)で得られた核酸配列を適したベクター中でをクローニングし、その後に適した発現系中に形質転換させ、かつ
iii)改善された活性および/または選択性および/または安定性を有するクリティカルなポリペプチドを検出することによって製造されることを特徴とする、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列。 - a)請求項1に記載の核酸配列によってコードされるポリペプチド、
b)配列番号2による配列を有するポリペプチド、
c)配列番号2のポリペプチドと少なくとも84%の相同性を有するポリペプチド、この場合、これらのポリペプチドは、配列番号2のポリペプチドと比較した場合に、ポリペプチドの活性および/または選択性および/または安定性を本質的に減少させるものではない、の群から選択されたポリペプチド。 - 請求項1に記載の1種またはそれ以上の核酸を有する、プラスミド、ベクター、微生物。
- PCRによって請求項1に記載の核酸配列を製造するためのプライマー。
- 請求項1に記載の核酸配列から出発して、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する改善されたrec−ポリペプチドを製造するための方法において、
a)核酸配列に突然変異を生じさせ、
b)a)から得ることが可能な核酸配列を、適したベクター中にクローニングし、かつこれらを適した発現系に移し、かつ、
c)改善された活性および/または選択性および/または安定性を有する形成されたポリペプチドを検出し、かつ単離することを特徴とする、請求項1に記載の核酸配列から出発して、アルコールデヒドロゲナーゼを有する改善されたrec−ポリペプチドを製造するための方法。 - 請求項5によって得ることが可能な、rec−ポリぺチドまたはこれらをコードする核酸配列。
- キラルのエナンチオマー濃縮された有機化合物、たとえばアミノ酸またはアルコールを製造するための、請求項2または6に記載のポリペプチドの使用。
- 全細胞触媒を製造するための、請求項1から6までのいずれか1項に記載の核酸配列の使用。
- NADH依存型アルコールデヒドロゲナーゼのためのクローニングされた遺伝子およびホルメートデヒドロゲナーゼまたはNADHオキシダーゼのためのクローニングされた遺伝子を有する、全細胞触媒。
- R.エリトロポリス、特にDSM43297からのアルコールデヒドロゲナーゼである、請求項9に記載の全細胞触媒。
- ホルメートデヒドロゲナーゼが、カンジダ ボイジニイからのホルメートデヒドロゲナーゼから誘導され、かつNADHオキシダーゼが、ラクトバチルス ブレビスからのNADHオキシダーゼから誘導される、請求項9に記載の全細胞触媒。
- 請求項2または6に記載のポリペプチドでの有機化合物の補因子依存型酵素的変換および補因子の酵素的再生を有する、組み合わされた酵素反応系。
- 酵素的再生を、カンジダ ボイジニイからのホルメートデヒドロゲナーゼから誘導されたホルメートデヒドロゲナーゼ、またはラクトバチルス ブレビスからのNADHオキシダーゼから誘導されたNADHオキシダーゼを用いて実施する、請求項12に記載の反応系。
- ケトンの不斉還元のための方法における、請求項9に記載の全細胞触媒の使用。
- ベクターpKA1。
- 封入体を形成しうる組換えタンパク質を製造するための、「高いコピー数」ベクター(A)および「中程度のコピー数」ベクター(B)から製造されるベクターの使用において、少なくとも複製源がベクター(B)から取り出され、かつ少なくともクローニングエレメントおよび発現エレメントがベクター(A)から取り出されることを特徴とする、ベクターの使用。
- pET11aをベクター(A)として、かつpACYC184をベクター(B)として使用する、請求項16に記載の使用。
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