JP2005516613A - バチルス・クラウジにおける分泌、転写、及び胞子形成遺伝子 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書において言及される全ての特許及び公報、それらの開示される全ての配列は、引用によって取り込まれる。本明細書中で別に定義しない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者に共通して理解されているのと同じ意味を有する。(例えば、Singletonら、DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY、第2版、John Wiley and Sons、ニューヨーク、1994年;及び、Hale及びMarham、THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY、Harper Perennial、ニューヨーク、1991年を参照。これらは、本明細書において用いられる用語の多くを収録する一般的な辞書である)。本明細書に説明されるものと同様の又は等価な任意の方法及び材料を、本発明の実施及び試験において用いることができるが、ここでは、好ましい方法及び材料について説明する。数値範囲には、当該範囲を定める数値が含まれる。特に指示のない限り、核酸は、左から右に、5’から3’の方向に記載される。アミノ酸配列は、左から右に、アミノからカルボキシの方向に記載される。本明細書における表題は、明細書全体を参照することによりなされる本発明の種々の側面又は実施態様を限定するものではない。従って、以下に定義される用語は、明細書全体を参照することによってより完全に定義される。
本発明は、発現タンパク質を生産する能力が遺伝子操作によって改変された細胞に関する。特に、本発明は、外因性の核酸配列を導入されたグラム陽性微生物、及びそのような宿主細胞(例えば、バチルス属のもの)においてタンパク質を生産する方法に関する。より詳細には、本発明は、対象ポリペプチドの発現、生産、及び分泌に関し、及び、発現タンパク質を生産する能力が遺伝子操作によって改変された細胞に関する。特に、本発明は、微生物による所定のポリペプチドの発現の向上を提供する。
本発明の開発の間、極限環境から多数の菌株を捕集した。16S RNA遺伝子配列に基づき、偏性好アルカリ性バチルスをバチルスクラウジと同定した。当該菌株は、指定番号“PB92”が与えられた。菌株PB92は、米国菌培養収集所のATCC31408として寄託され、デルフト工科大学の微生物学研究室にOP60として寄託され、日本国の工業技術院微生物工業技術研究所にFERM−P 3304として寄託された。
B.クラウジPB92のゲノムのショットガンライブラリーを、当該技術分野において公知の標準的な方法によって配列決定した。個々の配列の集合体により、4,345,345塩基対の全長を有する450の非重複コンティグが得られた。Orpheusソフトウェアを用いて、遺伝子予測を自動で行った(Frishmanら、Nuc.Acids.Res.、26巻、2941−7頁、1998年)。予測されたオープンリーディングフレーム(ORF)境界は、外因的証拠に基づいて手動で精密化した。ゲノムの遺伝子間領域、及び非重複タンパク質データではマッチが発見できなかったORFを、BLASTXを用いて再度評価した。更なる遺伝因子(tRNA、rRNA、scRNA、転移因子)も考慮した。公知の遺伝要素中にあり又はそれと重複するORFは、修正し又はデータから除去した。遺伝子産物の自動及び手動解釈のための所要な媒体は、Pedant−Pro(商標)配列分析パッケージソフト(Frishmanら、Bioinformatics、17巻、44−57頁、2001年)であった。抽出したタンパク質について、網羅的バイオインフォマティクス分析(例えば、類似性検索、タンパク質のモチーフ同定、及びタンパク質の二次構造)、及び特性予測(例えば、高感度構造認識(sensitive fold recognition))を行った。各ORFにおいて、MIPS Function Catalogue(Mewesら、Nature、387巻、7−65頁、1997年)に従って、機能カテゴリーを手動で決定した。
種々の調節関連又は分泌関連タンパク質の配列を、図1乃至20及び25乃至32に示す。図1は、B.クラウジのSpoIIEについての推定アミノ酸配列(配列番号1)を示すものである。図2は、B.クラウジのSpoIIEについてのDNA配列(配列番号2)を示すものである。望ましい特性は、生産株の胞子形成が不足していることである。従って、本発明の開発の間に同定されたB.クラウジの胞子形成特性を評価するために実験を行った。
(2)野生型DegU遺伝子の残基、例えば、H17X、T103X、E112X、V136X等に1以上の変異を導入すること(ここで、“X”は任意のアミノ酸を意味する)、及び/又は、
(3)野生型DegS遺伝子の残基、例えば、V238Xに1以上の変異を導入すること(ここで、“X”は任意のアミノ酸を意味する);これにより、B.クラウジの野生型遺伝子を置換するために用いられる1以上の当該変異を保因する変異遺伝子が得られる。さらに、本発明は、リン酸化反応を増大させる任意のdegS及び/又はdegU変異を包含する。及び、
(4)多コピープラスミドに保因され、又はより高い水準の遺伝子発現を得るための強力なプロモータによって転写された、自身のdegS及び/又はdegU遺伝子によってB.クラウジを形質転換すること;特定の実施態様では、当該遺伝子は野生型であり、別の実施態様では変異体である。
本発明の1の実施態様では、タンパク質は、新生タンパク質が正しく折り畳まれ又は細胞内から細胞外環境への転移されるのを援助する場合には、“分泌関連タンパク質”である。本発明の1の実施態様では、当該分泌関連タンパク質は、野生型タンパク質の変異体であって、これは、図5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、又は27のいずれか1のアミノ酸配列に対して、全体として、約40%より高い、好ましくは約60%より高い、より好ましくは約75%より高い、より好ましくは約80%より高い、更に好ましくは約85%より高い、及び最も好ましくは約90%より高い相同性を有する。特定の実施態様では、相同性は、約93乃至95%であり、特に好ましい実施態様では98%である。
本発明は、また、ハイブリッド分泌因子をコード化する核酸、及び当該ハイブリッド分泌因子を含むアミノ酸を提供する。これらの実施態様では、当該ハイブリッド分泌関連因子は、B.クラウジの分泌関連因子に対応する機能を保持する。特定の実施態様では、本発明は、B.クラウジとその他の種類(例えば、枯草菌、ただしこれに限定されるものではない)とのハイブリッドを提供する。従って、特定の実施態様では、微生物は、B.クラウジの配列及びその他の生物(例えば、枯草菌)からの配列を含む。
本発明は、細胞内及び/又は細胞外におけるタンパク質生産を増大させるために特に有用である。特定の実施態様では、当該タンパク質は同種であり、別の実施態様では異種である。本発明は、種々のタンパク質の生産、例えば、ホルモン、酵素、増殖因子、サイトカイン、抗体等の生産において有用である(ただし、これらに限定されるものではない)。本発明は、酵素の生産、例えば、プロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、フェノールオキシダーゼ、パーミアーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、セルラーゼ、グルコースイソメラーゼ、ラッカーゼ、及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのような加水分解酵素等の生産において特に有用である(ただし、これらに限定されるものではない)。しかしながら、本発明は、また、ホルモンの生産、例えば、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ソマトスタチン、性腺刺激ホルモン、バソプレシン、オキシトシン、エリスロポエチン、インスリン等の生産においても有用である(ただし、これらに限定されるものではない)。
本発明は、グラム陽性微生物(例えば、バチルス属のもの)における所望のタンパク質の発現、生産、及び分泌のための宿主微生物及び発現手段を提供する。
本発明は、宿主微生物における所望の同種又は異種タンパク質の生産及び分泌を増大させる発現系を提供する。DNA構築物における種々の構成要素は、任意の適切な方法(例えば、PCR及び/又はライゲーション)によって構築することができる。注目すべきは、当該DNA構築物が所望の最終構造を有する限り、任意の技術をもちいることができることである。好ましい実施態様では、当該DNA構築物は、組込み単一コピーベクター、組込み増幅ベクター、又は多コピーベクター等のベクター中に取り込まれる(ただし、これらに限定されるものではない)。
上述のように、プロモーターは、誘導性又は構成性のいずれかであることができる。本発明において好ましいプロモーターは、B.クラウジ分泌因子に対応する宿主細胞に由来するプロモーターである。或いは、通常は分泌因子に関連するB.クラウジのプロモーターを用いることができる。別の実施態様では、当該プロモーターは、宿主細胞において機能することができ、かつB.クラウジの分泌因子についての野生型プロモーターではない任意のプロモーターであることができる。
本発明の好ましい実施態様では、ベクターは、グラム陽性微生物分泌因子をコード化する核酸の少なくとも1のコピーを含む(好ましくは、複数のコピーを含む)。当該ベクターは、宿主細胞ゲノム中に(好ましくは、単一コピーとして)組み込まれる配列(例えば、B.クラウジ配列)を含む。更なる実施態様では、宿主細胞は、両方の遺伝子(すなわち、野生型配列及び導入された配列)を保因する。更なる実施態様では、本発明は野生型の対象遺伝子を有するベクターを提供するが、別の実施態様では、当該ベクターはハイブリッド配列を有する。従って、本発明では、入力配列、ハイブリッド、及び野生型配列が任意の適切な組合せで存在する、複数の実施態様が提供される。
特定の実施態様では、少なくとも1の対象ポリペプチドをコード化する核酸が、宿主細胞内で複製し得る発現ベクターを経て、宿主細胞に導入される。バチルスに対する複製及び組込みプラスミドは、当該技術分野において公知である(例えば、Harwood及びCutting編集、「Molecular Biological Methods for Bacillus」、John Wiley&Sons、1990年、特に第3章を参照されたい;枯草菌に対する適切な複製プラスミドが、92頁に記載されている)。技術的な障壁は存在するが、当該技術分野における当業者は、バチルスにおけるDNAの直接クローニングのためのいくつかの戦略が存在するという知識を得ているであろう。
細胞における対象タンパク質の発現、生産、及び/又は分泌では、異種及び/又は同種タンパク質をコード化する核酸の少なくとも1のコピーを含む(好ましくは、複数のコピーを含む)発現ベクターが、当該タンパク質の発現に適切な条件下で細胞に導入される。特に好ましい実施態様では、対象タンパク質をコード化する配列は、(ベクターに含まれるその他の配列と同様に)宿主細胞のゲノム中に組込まれる。一方、別の実施態様では、当該プラスミドは、自律性染色体外因子(autonomous extra−chromosomal element)として細胞内に残る。従って、本発明は、宿主細胞ゲノム中に組込まれた入力配列及び染色体外因子の両方を提供する。
マーカー遺伝子の発現の有無によって対象遺伝子の存在も示唆されるのではあるが、その存在及び発現を確認すべきである。例えば、分泌関連タンパク質をコード化する核酸がマーカー遺伝子配列中に挿入される実施態様では、当該挿入物を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子の機能の不存在によって同定される。或いは、マーカー遺伝子は、分泌因子をコード化する核酸と共に、単一のプロモーターの制御下に置かれる。導入又は分泌に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常、分泌因子の発現をも示唆する。
分泌されたポリペプチドの活性を検出し測定するための種々の方法が、当該技術分野において公知である。特に、プロテアーゼについて、カゼイン又はヘモグロビンからの酸に可溶性(acid−soluble)のペプチドの放出を、280nmにおける吸収として測定すること又はフォリン法で比色分析すること基づくアッセイが存在する(Bergmeyerら、「Methods of Enzymatic Analysis」、第5巻、“Peptidases,Proteinases,and their Inhibitors”、Verlag Chemie、Weinheim、1984年、を参照)。当該技術分野において公知のその他の方法には、発色基質の可溶化が含まれる(Ward、「Microbial Enzymes and Biotechnology(Fogarty編)」、251−317頁、Applied Science、ロンドン、1983年)。
好ましい実施態様では、異種又は同種タンパク質をコード化し又は内因的に当該タンパク質を有しているポリヌクレオチド配列で形質転換した細胞は、細胞培養液からのコード化タンパク質の発現及び回収に適切な条件化において培養される。別の実施態様では、その他の組換え構築物は、異種又は同種ポリヌクレオチド配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコード化するヌクレオチド配列(例えば、種々の標識)に連結する(Krollら、DNA Cell.Biol.、12巻、441−53頁、1993年)。
Claims (44)
- バチルス・クラウジの分泌因子を含むヌクレオチド配列であって、当該分泌因子が、SecA、SEcD、SecE、SecF、SecG、SecY、Ffh、FtsY、SipS、SipT、SipV、及びSipWよりなる群から選択される、当該ヌクレオチド配列。
- 前記ヌクレオチド配列が、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号8、配列番号6、配列番号22、配列番号24、配列番号26、及び配列番号28よりなる群から選択される、請求項1に記載のヌクレオチド配列。
- 低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、及び高ストリンジェンシーのストリンジェントな条件下で、請求項2に記載のヌクレオチド配列とハイブリッド形成を維持する、ハイブリッド可能なヌクレオチド配列。
- 請求項2に記載のヌクレオチドの少なくとも一部を含むベクター。
- 少なくとも1の対象ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を更に含む、請求項4に記載のベクター。
- 請求項4に記載のベクターを含む、発現カセット。
- 請求項5に記載のベクターを含む、発現カセット。
- 請求項6に記載の発現カセットを含むバチルス属の宿主細胞。
- 請求項7に記載の発現カセットを含むバチルス属の宿主細胞。
- 前記細胞が、SecA、SEcD、SecE、SecF、SecG、SecY、Ffh、FtsY、SipS、SipT、SipV、及びSipWよりなる群から選択される少なくとも1のB.クラウジ分泌因子を分泌する、請求項9に記載の宿主細胞。
- 前記分泌因子が、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号7、配列番号5、配列番号21、配列番号23、配列番号25、及び配列番号27よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項10に記載の分泌因子。
- 前記アミノ酸が、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号7、配列番号5、配列番号21、配列番号23、配列番号25、及び配列番号27よりなる群から選択されるアミノ酸配列の断片を含む、請求項11に記載の分泌因子。
- 前記アミノ酸が、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号7、配列番号5、配列番号21、配列番号23、配列番号25、及び配列番号27よりなる群から選択されるアミノ酸配列の変異体を含む、請求項11に記載の分泌因子。
- バチルス・クラウジの転写因子を含むヌクレオチド配列であって、当該転写因子が、DegS、DegU、及びBcl2627よりなる群から選択される、当該ヌクレオチド配列。
- 前記ヌクレオチド配列が、配列番号4、配列番号30、及び配列番号32よりなる群から選択される、請求項14に記載のヌクレオチド配列。
- 低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、及び高ストリンジェンシーのストリンジェントな条件下で、請求項15に記載のヌクレオチド配列とハイブリッド形成を維持する、ハイブリッド可能なヌクレオチド配列。
- 請求項15に記載のヌクレオチドの少なくとも一部を含むベクター。
- 少なくとも1の対象ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を更に含む、請求項17に記載のベクター。
- 請求項17に記載のベクターを含む、発現カセット。
- 請求項18に記載のベクターを含む、発現カセット。
- 請求項19に記載の発現カセットを含むバチルス属の宿主細胞。
- 請求項20に記載の発現カセットを含むバチルス属の宿主細胞。
- 前記細胞が少なくとも1のB.クラウジ転写因子を分泌する、請求項22に記載の宿主細胞。
- 前記転写因子が、配列番号3、配列番号29、及び配列番号31よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項23に記載の転写因子。
- 前記アミノ酸が、配列番号3、配列番号29、及び配列番号31よりなる群から選択されるアミノ酸配列の断片を含む、請求項24に記載の転写因子。
- 前記アミノ酸が、配列番号3、配列番号29、及び配列番号31よりなる群から選択されるアミノ酸配列の変異体を含む、請求項24に記載の転写因子。
- バチルス・クラウジの胞子形成因子SpoIIEタンパク質を含むヌクレオチド配列。
- 前記配列が配列番号2を含む、請求項27に記載のヌクレオチド配列。
- 低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、及び高ストリンジェンシーのストリンジェントな条件下で、請求項28に記載のヌクレオチド配列とハイブリッド形成を維持する、ハイブリッド可能なヌクレオチド配列。
- 請求項28に記載のヌクレオチドの少なくとも一部を含むベクター。
- 少なくとも1の対象ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を更に含む、請求項30に記載のベクター。
- 請求項30に記載のベクターを含む、発現カセット。
- 請求項31に記載のベクターを含む、発現カセット。
- 請求項32に記載の発現カセットを含むバチルス属の宿主細胞。
- 請求項33に記載の発現カセットを含むバチルス属の宿主細胞。
- 前記細胞が少なくとも1のB.クラウジ胞子形成因子を分泌する、請求項35に記載の宿主細胞。
- 前記胞子形成因子が、配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項36に記載の転写因子。
- 前記アミノ酸が、配列番号1のアミノ酸配列の断片を含む、請求項37に記載の転写因子。
- 前記アミノ酸が、配列番号1のアミノ酸配列の変異体を含む、請求項37に記載の転写因子。
- 対象タンパク質を生産する方法であって、
(a)適切な条件下でバチルス宿主細胞を培養する工程であって、ここで、当該バチルス宿主細胞は、対象タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含み、及び、当該宿主細胞は、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコード化するヌクレオチド配列によって形質転換されたものである、当該工程;及び、
(b)対象タンパク質を発現させる工程、
を含む当該方法。 - 前記アミノ酸配列が、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質の配列と少なくとも85%同一である、請求項40に記載の方法。
- 前記アミノ酸配列が、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31よりなる群から選択されるアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列を含む、請求項41に記載の方法。
- 前記アミノ酸配列が、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31よりなる群から選択されるアミノ酸配列の断片であるアミノ酸配列を含む、請求項41に記載の方法。
- 前記アミノ酸配列がハイブリッドB.クラウジ配列を含む、請求項41に記載の方法。
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