JP2005513108A

JP2005513108A - ポリペプチド、及びドキソルビシンとドキソルビシンに基づく薬剤とを含有するポリペプチドの接合体

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Publication number: JP2005513108A
Application number: JP2003554214A
Authority: JP
Inventors: セルゲエヴィッチセヴェリン，イヴゲニー; エヴゲニエヴィッチセヴェリン，セルゲイ; ヴィクトラヴィッチルツェンコ，セルゲイ
Original assignee: ザクリトエアクツィオネルナエオブシェストヴァ《ルスキエビオテフノロギ》
Priority date: 2001-12-21
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2005-05-12
Also published as: US20050070465A1; CA2451993A1; AU2002362210B9; EP1466614A4; US7368431B2; RU2196604C1; HK1076601A1; EP1466614B1; WO2003053457A1; EA200301295A1; AU2002362210A1; AU2002362210B2; WO2003053457A8; EP1466614A1; NZ533849A; ATE411051T1; CN1281270C; EA005865B1; AU2002362210B8; CN1606450A

Abstract

新規なポリペプチドは、腫瘍細胞に対して抗癌剤の直接的な供給のためのベクターとして表皮成長因子のレセプターと効果的に結合することが可能で、２１乃至３１のアミノ酸の表皮成長因子と同様な断片の形態で具体化される。上記ポリペプチドの新規な接合体はドキソルビシンを含み、癌腫瘍に対する選択的な作用を有し、抗癌剤に関する腫瘍細胞の耐性を実質的に減少することができ、上記抗癌剤の接合された部分は、酸性の加水分解に関して不安定な化学結合の支援によって結合している。新規の薬剤は、効果的な量の接合体と、静脈内注入に適したキャリアとからなる。本発明は、癌患者を処置するための治療において使用できる。

Description

本発明は、薬物学及び医学的な天然化合物の化学に関し、癌患者の処置のための医療において使用することができる。

癌細胞に対する主要で獲得された耐性及び抗癌剤の低い選択性は、抗癌性の化学療法の効果を制限する主な要因である。そのような薬物の選択性は、キャリアなどの様々なタンパク質ベクターを使用することによって、癌細胞への目標とされた直接的な伝達を介して高めることができる。この場合、薬物は、ベクタータンパク質が薬物と共有結合でリンクした接合体のレセプターを媒介としたエンドサイトーシスの機能により、目標細胞に浸入する。前述の接合体の選択性は、ベクターのタンパク質若しくは抗体によって“認識可能な”癌細胞の壁に対して特異的なレセプターの存在又は非形質転換細胞と比較して癌の壁のベクタータンパク質のレセプターのより高いレベルのいずれかによって達成される。ベクター分子としての表皮成長因子（ＥＧＦ）の推定された効能は、組換えタンパク質としてのその高い安定と有効性、及び健康な細胞と比較して癌細胞壁での高レベルのＥＧＦレセプターに由来する。

ドキソルビシン（ＤＲ）や他の抗癌剤とＥＧＦの異なる接合体を記載する製造方法や薬剤の様々な研究及び特許文献が周知である（例えば、特許文献１、２、３、４、５、６、７及び８参照）。

ドキソルビシンは、抗癌性の抗生薬物として周知であり、臨床において幅広く使用されているが、薬物の反復した静脈注射に続いて癌細胞の耐性の迅速な進展を誘発し、高い心臓毒性などの多数の実際的な欠点を有する。接合した形態のＤＲの使用は、その治療特質の相当な改良に帰着するかもしれない。

短鎖のＥＧＦペプチド断片は、癌細胞に対するＤＲや他の抗癌剤の目標とする伝達のために使用されるベクター分子として特に関心がある。それら断片の製造の方法が比較的単純で、経済的であり、生物源の任意の開始物質を使用することを必要としないので、それら断片からの接合体は標準化することが容易である。

異なるＥＧＦペプチド断片とＤＲ（及び他の抗癌剤）の混合（薬剤）は、癌の化学療法での使用において周知である（例えば、特許文献９参照）。特許文献９は、ＥＧＦやその有効な断片によって生じた増殖効力によるＤＲに対する癌細胞の高い感受性によって、特許文献９の薬物の強められた抗癌性効能について説明している。しかしながら、接合体でのＤＲとＥＧＦやその断片との間のリンクが共有結合ではないので、癌細胞に対する薬物の目標とした伝達は保証できず、薬物の非特異的な毒性の高まりを導く。

さらに、３２から４８のアミノ酸のＥＧＦ断片のアミノ酸配列に類似のアミノ酸配列を有する生物学的に活性で環状のポリペプチドが癌の治療で使用されることが周知である（例えば、特許文献１０参照。）。特許文献１０では、ペプチド断片がＤＲなどの化学剤と接合できるが、接合体も、接合体の製造方法も、接合体の生物学的特質もかかる特許文献１０で請求されていない。

さらに、下記の式

の２１乃至３１のアミノ酸のＥＧＦ断片であるポリペプチドが周知であり、ＥＧＦレセプターに効果的に結合可能で、細胞増殖を引き起こし、ＤＲとそのポリペプチドとの接合体のＤＲとポリペプチドの比率は１：１であり、接合された部分は、架橋剤としてのグルタルアルデヒドを使用する結果として酸不安定性（ａｃｉｄｌａｂｉｌｅ）アゾメチンリンケージと共にリンクされる（例えば、非特許文献１参照）。効果的な濃度でのＤＲとＥＧＦとの接合体と静脈投与に適切な薬物学的なキャリアとを含む薬剤がある（例えば、特許文献２、３及び７参照。）。
米国特許第５，８２４，８０５号明細書米国特許第５，３４９，０６６号明細書米国特許第５，０８７，６１６号明細書米国特許第５，３９３，７３７号明細書米国特許第５，５０５，９３１号明細書米国特許第５，６２２，９２９号明細書米国特許第５，１２２，３６８号明細書米国特許第５，７７６，４５８号明細書米国特許第４，８６３，９０２号明細書米国特許第５，１８３，８０５号明細書ＴｈｅＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆＤｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎｂｙｉｔｓＴａｒｇｅｔｅｄＤｅｌｉｖｅｒｙｔｏＣａｎｃｅｒＣｅｌｌｓｖｉａＰｒｏｔｅｉｎＶｅｃｔｏｒｓ，ＲｕｓｓｉａｎＯｎｃｏｌｏｇｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，Ｎｏ．３，２００１，ｐｐ．３３−３７．

本発明の目的は、処方された目的のための薬剤の選択の幅を広げ、それら薬剤の効能を高めることである。

本目的は、提案される２１から３１のアミノ酸からの表皮成長因子の断片に類似の新規の合成ポリペプチドによって達成され、そのペプチドは表皮成長因子のレセプターに効果的に結合することができ、細胞増殖を引き起こすことができ、癌細胞への抗癌剤の目標とされた伝達のためのベクターとしての役割をすることができる。ペプチドは、下記の式

を有する。

ポリペプチド（Ｉ）と違って、提案されたポリペプチドは、マウスのＥＧＦの結合部位を形成するアミノ酸の一つであるＳｅｒが置換されたヒトＥＧＦのレセプター結合断片の活性の中心がアミノ酸Ｌｙｓを有する。代わって、ＥＧＦレセプターへの提案されたポリペプチドの結合の禁止を防ぐ、レセプターと結合する断片の活性の中心でのリジンのε−アミノ基で、ＬｙｓのＳｅｒへの置換が望ましくない接合体を排除することは偶然に確立された。

提案されたポリペプチドの効能が既知の抗生物質ドキソルビシンと接合体との形態で実証されるが、ビンクリスチン、シスプラチン、ダウノマイシン、メトトレキセートなどの他の抗癌性の抗生物質並びに毒素（ジフテリア又はヒマ属など）、シクロホスファミド、及び別の薬剤などの他の抗癌剤がさらに使用できる。

さらに、ドキソルビシンと上記のポリペプチドとの接合体が提案され、ドキソルビシンは酸不安定性アゾメチンリンケージによりポリペプチドと共有結合でリンクされ、ＭＹＩＥＡＬＤＳＹＡＣのポリペプチドはポリペプチドとして使用される。接合体は、腫瘍に選択的に作用し、抗癌剤に対する癌細胞の耐性を実質的に減少するかもしれない。

グルタルアルデヒド又は任意の他の二元機能型薬剤は、アミノ基でポリペプチドとドキソルビシンをリンクするための架橋剤として使用できる。結果として、酸不安定性リンケージを備える接合体が得られる。

さらに、薬剤が提案され、その薬剤は、細胞障害活性を示し、効果的な濃度（０．０５乃至０．１％）でドキソルビシンと表皮成長因子のレセプター結合断片との提案された接合体と、静脈内投与に適するキャリアとを含む。

生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、又は鎮痛剤の製剤は、キャリアとして使用できる。薬剤は、追加的に、癌患者の治療のために使用された殺菌薬、抗ウイルス性薬及び駆虫性薬、並びに他の医薬を薬剤の全重量の多くとも５０％の量で含んでよい。

下記の記載は、本発明を例証し、記載した目的のための表皮成長因子の提案されたレセプター結合断片と、接合体と、及び接合体に基づく薬剤を使用する可能性を証明する実施例である。

実施例１。ポリペプチドの生成。

ポリペプチドは、合成のＦｍｏｃストラテジーを使用して固体状態のペプチド化学の方法によって得られた。洗浄レジンは、ポリマーキャリアとして選択された。洗浄レジンは、ポリマーキャリアとして選択された。ＨＯＢｔ及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミドは、ペプチド濃縮の各段階でヒドロキシベンゾトリアゾールのエステルへの変換によってＦｍｏｃアミノ酸のカルボキシル基を活性するために使用された。Ｆｍｏｃアミノ酸、ＨＯＢｔ及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミドは、ポリマーのアミノ基と比較して１０倍のモル量を超過して得られた。化学反応の過程は、アミノ基に対して１／１０００（モル）の比率でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）での溶液として反応器に添加されたブロモフェノールブルーの変色によって制御された。反応は、１．５乃至２時間行われた。濃縮が終了した後、レジンはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で４回洗浄され、ＤＭＦ中の５０％ピペリジン溶液によって処理された。ポリペプチドは、トリフロロ酢酸９５％と水２．５％と１，２−エタンジチオール２．５％の混合物を使用してポリマーキャリアから除去された。レジンが濾過された後、ペプチドはジエチルエーテルによって溶液から沈殿された。沈殿は遠心分離によって分離されて、真空乾燥されて、ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＬｕｎａＣ１８２５０^＊３カラムで逆相ＨＰＬＣによって分析された。カラムからのポリペプチドの勾配溶出は、アセトニトリルと０．１％トリフロロ酢酸／水の溶媒のシステムで実行された。セミプレパラティブ（Ｓｅｍｉｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）逆相ＨＰＬＣは、ＮｕｃｌｅｏｓｉｌＣ１８２５０^＊８カラムでの同じ状況下で導かれた。クロマトグラフィーの分離で得られたポリペプチドの純度は、９６％よりも高かった。

得られたポリペプチドは、マススペクトロメトリーの方法によって特徴とされた（分子イオン−１２６５）。ポリペプチドの構造は、表１に与えられた。

表１．既知及び提案されたポリペプチドの構造

実施例２。ＤＲとポリペプチドの接合体の製造。

ポリペプチドは、５ｍｌの０．０５Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７）（濃度１ｍｇ／ｍｌ）で溶解され、５ｍｌの蒸留水（ｐＨ５．５）（濃度１．２ｍｇ／ｍｌ）に予め溶解されたドキソルビシンが添加された。合成はスキーム１によって成された。

０．０５Ｍのリン酸バッファーのグルタルアルデヒド（ＧＡ）（ｐＨ７．２）（濃度０．５ｍｇ／ｍｌ）は、反応混合物に滴下して添加された。ＧＡの添加量は３ｍｌであった。その後、混合物は、５０℃で１時間インキュベートされた。得られた接合体は、ＰＤ−１０ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（ファルマシア、スウェーデン）のカラムを使用して開始物質から分離された。接合体は、ＮｕｃｌｅｏｓｉｌＣ１８２５０^＊４．６カラムでの逆相ＨＰＬＣによって分析された。カラムからのポリペプチドの勾配溶出は、アセトニトリルと０．１％トリフロロ酢酸／水の溶媒のシステムで実行された。

接合体のポリペプチドの濃度は、スペクトロフォトメトリー（λ＝２８０ｎｍ）によって決定された。接合体のＤＲ濃度は、スペクトロフォトメトリー（λ＝４９５ｎｍ）によって決定された。接合体のポリペプチドとＤＲのモル比は、１：１である。

結局のところ、方法は架橋剤としてグルタルアルデヒドの使用で提案されたポリペプチドとドキソルビシンの化学接合体で展開された。ポリペプチドとＤＲの接合体が得られ、接合された部分の比率は１：１である。

実施例３。ポリペプチドの生物活性の実証。

ポリペプチドの増殖活性は、ＮＩＨ３Ｔ３系のマウスの線維形成性細胞で試験された。ＤＮＡ生合成の割合は、酸に可溶性の細胞の断片に組み込まれた^３Ｈチミジンの量から判断された。

ＮＩＨ３Ｔ３系のマウスの線維形成性細胞は、３７℃で５％ＣＯ_２の湿潤環境で１０％の牛の胎児の血清（Ｓｉｇｍａ）と、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含んだＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ）のプラスチックフラスコで培養された。同調培養されたＮＩＨ３Ｔ３系の線維形成性細胞の増殖は、異なる濃度（０．１乃至１０００ｎｇ／ｍｌ）で提案されたポリペプチドを細胞の懸濁に加えることによって誘発された。線維形成性細胞は、２００μｌの培地を含有する各ウェルに２００乃至８００細胞である完全な培地の９６穴プレートで培養された。インキュベーションの終了２時間前に、^３Ｈチミジン（１μＣｉ／ウェル、４０μＣｉ／ｍｏｌ）が添加された。放射活性が、トルエンベースのシンチレーション液ＺｈＳ−８を使用して、シンチレーションカウンター（Ｒａｃｋｂｅｔａ、ＬＫＢ）によって測定された。ＤＮＡ生合成の割合は、式：Ｉ＝Ｎ／ＮｏＸ１００％（式中、Ｉは刺激指数、ＮはＥＧＦで刺激された細胞の数、Ｎｏはコントロール細胞の数）によって計算された刺激指数（刺激された細胞とコントロール細胞との比率）として表わされた。

図１は、提案されたポリペプチドとマウスの線維形成性細胞系ＮＩＨ３Ｔ３の既知のポリペプチドＩ（ＥＧＦ断片）との増殖効果を比較するデータを表わす。提案されたポリペプチドが、この細胞系に、レセプターへの提案されたポリペプチドのより高い類似を示すかもしれない既知のポリペプチドよりも明白な線量依存の増殖効果があることをデータは示す。癌細胞壁のＥＧＦレセプターの発現が非形質転換細胞での発現よりも数オーダー高いので、上記の発見は、癌細胞に対する抗癌剤の目標とされた伝達のためのより効果的なベクター分子として、提案されたポリペプチドを使用する可能性を支持する。

実施例４。生存率によって評価された、異なる癌細胞株に対する提案されたポリペプチドとＤＲの接合体の効能。

接合体の効能は、下記の細胞系：ヒト***カルチノーマ細胞系ＭＣＦ−７^ｗｔと耐性のヒト***カルチノーマ細胞系ＭＣＦ−７^ＡｄｒＲ、ヒト卵巣カルチノーマ細胞系ＳＫＯＶ３と耐性のヒト卵巣カルチノーマ細胞系ＳＫＶＬＢ、及びマウスメラノーマ細胞系Ｂ１６で研究された。

試験のプロトコールはすべての試験において共通であった。３７℃で５％ＣＯ_２の湿潤環境で１０％の牛の胎児の血清（Ｓｉｇｍａ）と、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含んだＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ）のプラスチックフラスコ（Ｃｏｓｔａｒ）で培養された細胞は、９６穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ）で各ウェルに１００００で培養されて、試験された薬物は異なる濃度で添加された。その後、細胞は７２時間インキュベートされた。インキュベーションの終了２乃至４時間前に、培養培地の５０μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）のＭＩＴ溶液（３−〔４，５−ジメチルチアゾール−２イル〕−２，５−ジフェニルテトラゾールブロミド、Ｓｉｇｍａ）は各ウェルに添加された。変色変化の後、培地は除去され、ホルマザンクリスタル（ｆｏｒｍａｚａｎｃｒｙｓｔａｌｓ）は１５０μｌのジメチルスルホキシドに溶解され、吸光度は５４０ｎｍのスペクトロフォトメトリーによって測定された。単独で接合されたＤＲに暴露された細胞の生存率は、１００％としてのコントロールの生存率に相関するパーセントで決定された。

単独のドキソルビシンと、提案されたポリペプチド又はＥＧＦ断片のいずれかと接合したドキソルビシンに対する細胞の生存率が表２に与えられる。

ドキソルビシンとポリペプチドの提案された接合体は、ドキソルビシンに感受性であるヒト癌細胞系ＭＣＦ−７^ｗｔとＳＫＯＶ３及びマウスメラノーマ細胞系Ｂ１６で、単独のＤＲ又はＥＧＦ断片と単独のＤＲとの接合体（プロトタイプ）よりも多大な毒性効果を有することが示されたデータから分かる。さらに、ドキソルビシンとポリペプチドの提案された接合体は、アンスラサイクリン抗生物質に耐性である細胞系ＭＣＦ−７^ＡｄｒＲとＳＫＶＬＢに対して高い細胞障害活性を示す。

結論として、提案されたポリペプチドと接合した抗癌剤（ドキソルビシン）は、癌細胞に対してドキソルビシンに感受性で耐性の癌細胞に明白な毒性効果（事実は生体外で抗癌剤の目標とした伝達のためのベクター分子として提案されたポリペプチドの効能を証明する）を有することが示される。

実施例５。注入のための薬剤は、ｐＨを約７．４に調節した生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水で接合体を溶解することによって得られる。溶液中の接合体の濃度は、０．０５乃至０．１％である。

実施例６。マウスの移植された腫瘍モデルで実証された生理学的溶液（実施例５に記載）でのポリペプチドとＤＲの接合体の薬剤の細胞障害活性。

固体の腫瘍に対してポリペプチドとＤＲの接合体の細胞障害活性を実証するために、実施例５に記載の薬剤は、Ｂ１６癌細胞系を皮下に移植されたマウスに静脈内投与した。得られた結果は、図１及び２に与えられる。医療は、癌移植後の３日目から開始して合計で３回注入のドキソルビシンの０．２ｍｇ／ｋｇの服用量で４日ごとに投与された。

単独のＤＲとは違って、ＤＲの接合体は腫瘍の攻撃の相当な遅れを引き起こし、それら腫瘍の成長が遅れたことが図１から分かる。腫瘍成長の阻害率は５８％であった。

試験動物の平均生存期間（ＡＤＬ）の高まりから推測するに、静脈内に与えられた場合、提案された接合体が治療効果を有することが表３から分かる。単独のドキソルビシンとは違って、ドキソルビシンの接合体の投与は、ＡＤＬの４６％の増加が達成することを可能にした。

表３．薬剤を含むＤＲで静脈内処理した動物の平均生存期間の増加。

平均生存期間の増加と高い腫瘍成長の阻害率は、生体内での提案された薬剤での抗癌剤の目的とする伝達の治療効果を支援する。

アンスラサイクリン抗生物質ドキソルビシンと提案されたポリペプチド（ポリペプチドとＤＲ）の接合体は、静脈内に与えられる場合に固体の腫瘍に治療行為を及ぼすことが示される（図４、６）。

提案されたポリペプチドとマウスの線維形成性細胞系ＮＩＨ３Ｔ３の既知のポリペプチド（Ｉ）との増殖効果を比較するためのデータを示す図である。マウスの移植された腫瘍モデルでＤＲを含む薬剤の投与の結果として、腫瘍の攻撃やそれら腫瘍の成長妨害の遅れを実証するデータを示す図である。提案されたポリペプチドのアミノ酸配列を示す図である。

Claims

表皮成長因子のレセプターに結合可能で、細胞増殖を引き起こし、癌細胞に対する抗癌剤の目標とする伝達のためのベクター分子として作用することを特徴とするアミノ酸化学式ＭＹＩＥＡＬＤＳＹＡＣの生物学的に活性なポリペプチド。
ドキソルビシンが酸不安定性アゾメチンリンケージによりポリペプチドと共有結合でリンクして、アミノ酸化学式ＭＹＩＥＡＬＤＳＹＡＣのポリペプチドがポリペプチドとして使用されることを特徴とするドキソルビシンとポリペプチドの接合体。
前記ドキソルビシンは、架橋剤としてグルタルアルデヒドを使用する結果、前記ポリペプチドと共有結合でリンクすることを特徴とする請求項２に記載のドキソルビシンとポリペプチドの接合体。
ドキソルビシンの接合体としてアミノ酸化学式ＭＹＩＥＡＬＤＳＹＡＣのポリペプチドと接合したドキソルビシンを含むことによって識別され、効果的な濃度のベクター分子と接合したドキソルビシンと静脈内投与に適する薬学的なキャリアとを含むことを特徴とする抗癌効果を有する薬剤。