CN110746490B - 一种基于点击反应阻断免疫检查点的多肽组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于点击反应阻断免疫检查点的多肽组合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于点击反应阻断免疫检查点的多肽组合物及其制备方法和应用。所述多肽组合包括靶向单元和组装单元；所述靶向单元包括靶向片段和含炔基的疏水分子，所述靶向片段与含炔基的疏水分子通过酰胺键连接；所述组装单元为叠氮化的组装片段，所述组装片段为具有自组装能力的多肽序列。本发明提供的多肽组合物的靶向单元，可深入到深层肿瘤组织，精准定位癌细胞，多肽组合物的组装单元可以与靶向单元发生高效点击反应而偶联，同时组装单元在肿瘤组织原位自组装构筑多肽纳米纤维，实现免疫检查点的长效阻断，减少免疫逃逸，达到长效的免疫治疗效果。

Description

一种基于点击反应阻断免疫检查点的多肽组合物及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种基于点击反应阻断免疫检查点的多肽组合物及其制备方法和应用。
背景技术
免疫***具有识别、清除体内恶变细胞，抵御肿瘤发生发展的免疫监视功能。但是肿瘤细胞可通过多种机制，例如抗原表达受损、在肿瘤微环境中分泌免疫抑制因子、下调自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK)活性、调节免疫检查点(Immune checkpoints)通路抑制T细胞活性等逃避机体免疫监视。
免疫治疗是继手术、放疗、化疗和分子靶向药物又一能够延长肺癌患者生存的方法。传统意义上的免疫治疗主要通过诱导产生或强化抗肿瘤免疫反应进行治疗，但由于免疫检查点等抑制性免疫调节作用的存在，往往不能产生持久有效的抗肿瘤免疫效应。
免疫检查点在维持自我耐受以及调节T细胞方面起着至关重要的作用。免疫检查点阻断(Immune Checkpoint Blockade Therapy,ICB)是通过分子抑制剂抑制受体表达，触发免疫抑制信号通路，该方式可消除患者的部分肿瘤，改善生存期。目前，免疫检查点阻断方法在治疗各种类型的肿瘤(包括乳腺癌，非小细胞肺癌，黑色素瘤等)中已取得了显著成功。
抗程序性死亡蛋白1(Programmed death 1,PD-1)抗体是目前研究最多，临床发展最快的一种免疫疗法。PD-1起作用在免疫反应的效应阶段，其表达于活化的T细胞，B细胞及髓系细胞，其有两个配体，即程序性死亡分子配体-1(Programmed death ligand 1,PD-L1)和PD-L2。在肿瘤细胞中过表达的PD-L1是一种重要的免疫抑制分子，PD-1与PD-L1的结合介导T细胞活化的共抑制信号，抑制T细胞的杀伤功能，对人体免疫应答起到负调节作用。华裔科学家陈列平实验室首先发现PD-L1在肿瘤组织高表达，而且调节肿瘤浸润CD8+T细胞的功能。阻断PD-1/PD-L1之间的相互作用可避免免疫逃逸地发生，使T细胞攻击肿瘤，从而导致肿瘤细胞死亡。因此，以PD-1/PD-L1为靶点的免疫调节对抗肿瘤有重要的意义。
CN109985238A公开了一种基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物及其应用，并阐明其在肿瘤治疗过程中的生物学机制。所述基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物包含免疫检查点抑制剂和巨噬细胞反应阻断物。其中PD-L1抑制剂为Atezolizumab、Durvalumab或Avelumab，该药物组合物抗癌效果良好；由于免疫检查点抑制剂和巨噬细胞反应阻断物分别清除了两个不同的促肿瘤因素，两者联合用药产生了协同作用，可更有效抑制肿瘤生长。
目前应用于临床的免疫检查点抑制剂还包括纳武单抗、派姆单抗、匹利珠单抗、伊匹单抗和曲美莫单抗等，这些单克隆抗体能够有效阻断PD-1/PD-L1、CTLA-4等免疫检查点的抑制性免疫调节作用，从而间接强化抗肿瘤免疫反应。然而以上免疫检查点抑制剂存在分子量较大、肿瘤渗透性差、PD-L1占有率低以及抑制时间短等问题，使其难以实现有效地肿瘤治疗。
因此，如何实现提高药物的肿瘤渗透性、实现深层穿透，同时长效阻断免疫检查点是免疫治疗中亟待解决的问题。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于点击反应(ClickReaction)阻断免疫检查点的多肽组合物及其制备方法和应用。本发明提供的多肽组合物，以通过点击反应在癌细胞膜上构建自组装纳米纤维，不仅增强了其渗透性，而且延长了免疫检查点的阻断时间，实现高性能的免疫治疗效果。为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种基于点击反应阻断免疫检查点的多肽组合物，所述多肽组合包括靶向单元和组装单元；所述靶向单元包括靶向片段和含炔基的疏水分子，所述靶向片段与含炔基的疏水分子通过酰胺键连接；所述组装单元为叠氮化的组装片段，所述组装片段为具有自组装能力的多肽序列。
本发明提供的多肽组合物包括靶向单元和组装单元，靶向单元具有靶向免疫检查点的功能，组装单元具有组装功能，而且靶向单元中含炔基的疏水分子可以与组装单元上的叠氮基团发生高效点击反应。靶向单元和组装单元在使用时间隔给药，靶向单元特异性识别肿瘤细胞并结合到免疫检查点上，随后组装单元与靶向单元通过点击反应进行偶联，同时组装单元在原位自组装形成纳米纤维。最终，原位形成的纳米纤维可更好地阻断免疫检查点，避免免疫逃逸的发生，达到长效的免疫治疗效果。
作为本发明一种优选的技术方案，所述靶向单元的受体为免疫检查点。
优选地，所述免疫检查点为细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(Cytotoxic T Lymphocyteantigen4,CTLA-4)、程序性死亡受体1(Programmed death-1,PD-1)、程序性死亡因子配体-1(programmed death-1Ligand,PD-L1)、淋巴细胞活化基因-3(Lymphocyteactivationgene-3,LAG-3)或淋巴细胞免疫球蛋白-3(T cell immunoglobulin-3,TIM-3)中任意一种，优选为PD-L1。
作为本发明一种优选的技术方案，所述靶向片段为多肽序列SCFPNWSLRPMNQM。
优选地，所述多肽序列SCFPNWSLRPMNQM对应的靶向受体为PD-L1。
优选地，所述组装片段包括多肽序列KLVFFAE、KLVFF、FF或YFF中的任意一种。
优选地，所述组装片段为多肽序列MDEKAQKGPAKLVFFACEKG。
优选地，所述组装单元为MDEKAQKGPAKLVFFACEK(N3)G。
作为本发明一种优选的技术方案，所述含炔基的疏水分子包括含氮杂环。
优选地，所述含氮杂环为
Figure BDA0002261537000000041
本发明中，含炔基的疏水分子为
Figure BDA0002261537000000042
通过加成反应连接在与起始端丝氨酸相邻的半胱氨酸上。
优选地，所述多肽组合物的给药方式为静脉给药、皮下给药或腹腔给药中的任意一种或至少两种的组合，优选为静脉给药。
优选地，所述给药浓度小于100μM，优选为10-50μM，例如可以是10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM或50μM等。
优选地，所述给药顺序为先进行靶向片段给药，再进行组装片段给药。
优选地，所述靶向片段和组装片段的给药时间间隔为10-30min，例如可以是10min、15min、18min、20min、22min、25min、28min或30min等，优选为20-25min。
若靶向片段和组装片段的给药时间间隔过短，在靶向片段靶向至肿瘤细胞之前，两者可能在会血液中发生组装，不在肿瘤处发生组装，从而无法阻断免疫检查点，影响治疗效果。
作为本发明一种优选的技术方案，所述靶向单元具有如式I所示的结构：
Figure BDA0002261537000000051
优选地，所述组装单元具有如式II所示的结构：
Figure BDA0002261537000000052
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的多肽组合物的制备方法，所述制备方法为：
以氨基酸为原料通过多肽固相合成法合成靶向片段，再连接含炔基的疏水分子得到靶向单元；以氨基酸和叠氮化的氨基酸为原料通过多肽固相合成法合成组装单元。
以多肽序列SCFPNWSLRPMNQM为例，利用多肽固相合成法合成的步骤如下：
(1)将第一个氨基酸(丝氨酸，Ser)的C端固定于树脂上，N端利用Fmoc进行保护；
(2)脱去步骤(1)中第一个氨基酸的N端保护，而后连接下一个氨基酸进行反应；最终将所有氨基酸连接成固定于树脂的多肽。
优选地，步骤(1)中所述树脂为0.35mM修饰密度的Wang树脂。
优选地，步骤(2)中脱去N端保护的试剂为在二甲基甲酰胺(DMF)中体积分数为20％的六氢吡啶。
优选地，步骤(2)中脱保护检测试剂为茚三酮。
优选地，步骤(2)中连接氨基酸制备得到多肽所用的方法为：将要连接上的氨基酸与苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)混合，用N-甲基吗啉(NMM)和DMF溶解，加入到脱去保护的树脂中反应，而后依次连接氨基酸得到多肽。
本发明中所述式II的合成步骤与式I的区别在于，在连接含有叠氮分子的氨基酸时，需要以叠氮化的氨基酸为原料。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的多肽组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
作为本发明一种优选的技术方案，所述肿瘤为实体瘤。
优选地，所述实体瘤为乳腺癌、肾癌、膀胱癌、***癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、***、神经胶质细胞瘤或黑色素瘤中任意一种。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明提供的多肽组合物通过特异性靶向单元，可深入到深层肿瘤组织，精准定位癌细胞，符合当下“精准医疗”的理念；
(2)本发明提供的多肽组合物通过组装单元与靶向单元发生高效点击反应共价偶联，组装单元在肿瘤组织原位自组装构筑多肽纳米纤维，实现免疫检查点地长效阻断，减少免疫逃逸；
(3)本发明提供的多肽组合物形成的多肽纳米纤维不会在体内产生毒副作用，因此，本发明提供的基于点击反应的阻断免疫检查点的多肽组合物，对于实现免疫检查点地长效阻断，减少免疫检查点抗体***毒性，提高药物局部阻断效果提供了新的方法和思路。
附图说明
图1(a)为多肽组合物的设计原理图；图1(b)为多肽组合物深层穿透后实现原位组装功能的原理图。
图2为实施例2中三种溶液不同时间段的吸光度-时间曲线图。
图3为实施例2中CRICB的结构示意图。
图4(a)为实施例2中第5min时多肽组合物形貌图(标尺100nm)；图4(b)为实施例2中第30min时多肽组合物形貌图(标尺100nm)；图4(c)为实施例2中第2h时多肽组合物形貌及局部放大图(标尺100nm)。
图5为实施例3中各实验组在细胞水平不同时间段的富集荧光信号图(标尺10μm)。
图6为实施例4中各实验组在动物水平不同时间段的富集荧光信号图。
图7为实施例4中小鼠皮下瘤模型的离体肿瘤和多种器官的富集荧光信号图。
图8为实施例5中各实验组在细胞团上的穿透效果图(标尺100μm)。
图9为实施例6中各实验组在动物水平的治疗效果曲线图。
下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
以下实施例中，利用多肽固相合成法合成多肽序列，合成时所需的实验材料包括：二甲基甲酰胺(DMF)，哌啶，Wang树脂，二氯甲烷(DCM)，茚三酮反应试剂(茚三酮，维生素C和苯酚)，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，六氢吡啶，三异丙基硅烷(TIS)，乙二硫醇(EDT)，无水***，三氟乙酸(TFA)，N-甲基吗啉(NMM)，N-芴甲氧羰基-6-氨基己酸(Fmoc-e-Acp-OH)，甲醇，氨基酸，含有叠氮分子的赖氨酸和多肽固相合成管等。
以下实施例中，使用多肽固相合成法时需配制如下溶液：脱保护液——将六氢吡啶与DMF的按照体积比1:4进行混合；反应液——将NMM与DMF的体积比1:24进行混合；裂解液——将TFA、TIS和EDT混合，混合后各溶液的体积分数为：92.5％TFA、2.5％TIS和2.5％EDT；茚三酮测试液——茚三酮、维生素C和苯酚各一滴；荧光偶联溶剂——将吡啶、DMF与DCM混合，吡啶、DMF与DCM的体积比为12:7:5。
以多肽序列SCFPNWSLRPMNQM为例，利用多肽固相合成法合成时包括如下步骤：
(1)Fmoc(芴甲氧羰酰基)脱保护：称量0.1g Wang树脂并投入到多肽固相合成管中，加入DMF溶胀30min。抽掉DMF，用脱保护液进行Fmoc去保护反应，于摇床上放置10min。抽掉脱保护液，用DMF、DCM洗涤3次，从多肽固相合成管中取10mg Wang树脂于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测呈深蓝色即为阳性结果后，准备接入第一个氨基酸(丝氨酸，Ser)，进入氨基酸缩合反应。
(2)氨基酸缩合：分别按照多肽的氨基酸序列顺序取10倍当量的氨基酸和HBTU，用7mL反应液溶解，投入到多肽固相合成管中，搅拌反应。1h后，从多肽固相合成管中取10mgWang树脂于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测未变色即为阴性结果后证明缩合反应成功。抽掉多肽固相合成管中的液体，用DMF、DCM各洗涤2次，得到第一个氨基酸缩合后的肽树脂；
对所得肽树脂重复进行以上“Fmoc脱保护-氨基酸缩合”反应步骤，至最后一个氨基酸(甲硫氨酸，Met)反应完毕，得到目标序列。
(3)反应完毕后，DMF、DCM各洗涤树脂3次，甲醇洗2次，继续抽干20min。多肽固相合成管中取出合成的肽树脂，在室温下于裂解液中裂解2h，裂解液先冰浴20min。将树脂过滤后，于旋蒸仪蒸干，冰浴条件下用无水***洗3次。粗肽使用制备型反相HPLC纯化，使用HPLC检测纯度>90％，所得到的纯肽使用质谱进行鉴定，所测量得到的分子量结果与目标分子量相同，即所得序列为多肽序列SCFPNWSLRPMNQM。
以下实施例中，多肽序列MDEKAQKGPAKLVFFACEKG通过相同的方法合成得到，区别在于合成与末端甘氨酸相连的赖氨酸时，需要使用含有叠氮分子的赖氨酸。
实施例1
本实施例提供一种多肽组合物及其制备方法，所述多肽组合物包括：
(1)靶向单元，记为TA，TA能够靶向识别PD-L1，其结构可由式I表示，TA中的含炔基的疏水分子为
Figure BDA0002261537000000091
TA中的靶向片段为多肽序列SCFPNWSLRPMNQM，该序列使用多肽固相合成法合成，随后将含炔基的疏水分子与靶向片段的第二氨基酸半胱氨酸(Cys,C)通过加成反应相连。
(2)组装单元，记为SA，其结构可由式II表示，其序列可表示为MDEKAQKGPAKLVFFACEK(N3)G，该序列使用多肽固相合成法合成，KLVFF具有自组装功能。其中，在组装片段中与末端甘氨酸(Gly,G)相连的赖氨酸(Lys,K)时使用含有叠氮分子的赖氨酸，得到叠氮化的组装单元。
TA与SA的设计原理如图1(a)所示，TA具有靶向PD-L1的功能，SA包含组装单元并具有组装驱动功能，两段多肽能在体内发生点击反应。同时，TA与SA的功能效果如图1(b)所示，基于多肽的穿透能力，TA与SA可在深层实体瘤自组装形成纳米纤维，阻断肿瘤细胞与CD+8T细胞的PD-1/PD-L1通路，避免免疫逃逸的发生，实现高性能的免疫治疗效果。
为了标记和观察TA在细胞水平和动物水平的聚集情况，本实施例中还使用荧光分子菁染料Cy分别与靶向单元反应和组装单元反应，制备了具有荧光标记的TA和SA分子，记为TA-Cy和SA-Cy。
实施例2
本实施例利用实施例1提供的多肽组合物TA与SA进行点击反应。
实验步骤如下：将TA溶于PBS中得溶液1，SA溶于PBS中得溶液2，TA与SA以摩尔比1:1混合后溶于PBS中得到溶液3，利用紫外分光光度计检测三种溶液不同时间段的吸光度(检测波长为500nm)，并绘制吸光度-时间曲线。如图2所示，TA与SA混合后溶液吸光度明显上升，且前20min时上升速度较快，而单一多肽的吸光度基本无变化，说明TA与SA混合后能够迅速发生点击反应，而单一多肽溶液均无反应发生。同时，将TA与SA发生点击反应后生成的分子记为CRICB，CRICB的结构示意图如图3所示。
利用透射电镜(六硼化镧透射电子显微镜，Tecnai G2 20S-TWIN(T-20)，美国FEI公司)对多肽组合物进行形貌观察，在5分钟时，如图4(a)所示，由于点击反应的高效性，可见TA与SA迅速聚集，形成比表面积较小的球形，之后进行组装，在30分钟时如图4(b)所示，可观察到多肽组合物发生自组装，在2小时如图4(c)所示，图中左上角为自组装纳米纤维的局部放大图，由此可知多肽组合物结合后组装形成了纳米纤维。
实施例3
本实施例使用实施例1提供的多肽组合物进行细胞水平实验，实验所选细胞为高表达PD-L1的小鼠乳腺癌细胞系4T1。
用多肽TA-Cy处理两组4T1细胞，孵育10分钟后用PBS清洗1遍去除溶液中游离的靶向单元，第一组为单独靶向组，不加SA，第二组为靶向与自组装组，加入SA并孵育5分钟，用PBS清洗1次换上新的培养基培养。分别在15分钟、90分钟、12小时取出，用PBS清洗3遍后，在共聚焦显微镜(多光束激光共聚焦成像***，UltraVIEW VoX(U-Vox)，珀金埃尔默仪器(上海)有限公司)下对4T1细胞进行荧光观察。
实验结果如图5所示，第一组在90分钟和12小时分别在肿瘤细胞膜表面没有观察到荧光信号，而第二组在90分钟和12小时分别在肿瘤细胞膜表面可以观察到明显的荧光信号，证实了通过高效点击反应，形成的纳米纤维可延长PD-L1的阻断时间。
本实施例证明靶向单元特异性识别后可以与组装单元发生点击反应，并且在细胞水平实现长效阻断免疫检查点的功能。
实施例4
本实施例使用实施例1提供的多肽组合物进行动物水平实验，实验所选动物为小鼠，小鼠皮下瘤模型的建立方法为：用乳腺癌细胞进行小鼠皮下移植瘤的建立，取1×106个肿瘤细胞注射到小鼠右腿皮下，2周后肿瘤成型。
将小鼠皮下瘤模型分为三组，每组3只(n＝3)，进行用小鼠尾静脉注射，组1单独使用TA-Cy进行注射，注射浓度为10.68mg/kg，组2先注射TA-Cy(注射浓度10.68mg/kg)，间隔20分钟后注射SA-Cy(注射浓度7.18mg/kg)，组3先注射低浓度TA-Cy(注射浓度5.34mg/kg)，间隔20分钟后注射低浓度SA-Cy(注射浓度7.18mg/kg)，用IVIS小动物成像仪(小动物光学3D活体成像***，IVIS Spectrum珀金埃尔默公司)分别在第4小时、第12小时、第1天、第2天、第3天及第5天时进行成像，结果如图6显示，组2与组3中TA-Cy的肿瘤滞留能力强于组1。
取小鼠皮下瘤模型(n＝6)注射TA-Cy，间隔20分钟后注射SA-Cy，随后分别在第10分钟、4小时、12小时、24小时、36小时和48小时将小鼠处死，取肿瘤组织和器官进行离体成像，结果如图7所示，TA与SA反应生成CRICB后，由于体内代谢，荧光信号在肾脏、肺和肝脏逐渐降低，但在肿瘤部位通过点击反应后自组装形成纳米纤维，实现长效阻断。
本实施例证明了TA与SA能够特异性的靶向肿瘤细胞，生成CRICB后可以实现肿瘤细胞免疫检查点的长效阻断。
实施例5
本实施例用于验证实施例1提供的多肽组合物的穿透效果。
在培养基底部铺2％的琼脂糖无血清培养基，待培养基凝固后将1×104个4T1细胞铺在培养基上培养24h，形成细胞团，通过细胞团实验验证多肽材料的穿透效果，如图8所示，TA-Cy，SA-Cy与细胞团孵育5分钟时，可在细胞团深处观察到荧光信号，在1小时观察更为明显，但是与抗体(Anti-PD-L1 antibody,Biolegend)孵育1小时也只能在细胞膜表面观察到荧光信号，没有穿透效果。
本实施例说明相对于抗体类大分子药物，实施例1提供的TA与SA都能够深层穿透细胞组织。
实施例6
本实施例用于检验实施例1提供的多肽组合物对荷瘤小鼠的免疫治疗效果。
构建小鼠皮下瘤模型，并将小鼠模型分为四组，每组6只小鼠(n＝6)。
其中，组1：单独注射PBS；组2：TA单独给药(注射浓度为10.68mg/kg)；组3：低剂量的TA与SA两者间隔20min给药(TA注射浓度为5.34mg/kg，SA注射浓度为7.18mg/kg)；组4：TA与SA两者间隔20min给药(TA注射浓度为10.68mg/kg，SA注射浓度为14.36mg/kg)。
实验结果如图9所示，发现组3与组4的动物肿瘤生长速度明显较缓，与其他组对比有统计学意义，组3中肿瘤生长速度与组4基本一致，说明多肽组合物形成CRICB之后可以实现长效阻断，即使CRICB的剂量较低，也能够达到同样的治疗效果。本实施例说明表明多肽组合物能够明显减缓肿瘤的生长速度。
综合以上实施例可知，本发明提供的多肽组合物相比于抗体类大分子药物具有良好的穿透性，可以特异性地靶向肿瘤细胞，在肿瘤细胞表面聚集同时发生高效点击反应，并在原位自组装形成纳米纤维，长效阻断免疫检查点，避免免疫逃逸的发生。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (11)

1.一种基于点击反应阻断免疫检查点的多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合包括靶向单元和组装单元；
所述靶向单元由靶向片段和含炔基的疏水分子组成，所述靶向片段与含炔基的疏水分子通过酰胺键连接；
所述靶向片段为多肽序列SCFPNWSLRPMNQM，其靶向受体为PD-L1；
所述含炔基的疏水分子为含氮杂环
Figure FDA0003154194610000011
所述靶向单元为式I所示的结构：
Figure FDA0003154194610000012
所述组装单元为MDEKAQKGPAKLVFFACEK(N3)G，所述组装单元的结构如式II所示：
Figure FDA0003154194610000013
2.根据权利要求1所述的多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物的给药方式为静脉给药、皮下给药或腹腔给药中的任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1所述的多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物的给药方式为静脉给药。
4.根据权利要求1所述的多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物的给药浓度小于100μM。
5.根据权利要求4所述的多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物的给药浓度为10-50μM。
6.根据权利要求1所述的多肽组合物，其特征在于，所述多肽组合物的给药顺序为先进行靶向单元给药，再进行组装单元给药。
7.根据权利要求6所述的多肽组合物，其特征在于，所述靶向单元和组装单元的给药时间间隔为10-30min。
8.根据权利要求7所述的多肽组合物，其特征在于，所述靶向单元和组装单元的给药时间间隔为20-25min。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的多肽组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：
以氨基酸为原料通过多肽固相合成法合成靶向片段，再连接含炔基的疏水分子得到靶向单元；以氨基酸和叠氮化的氨基酸为原料通过多肽固相合成法合成组装单元。
10.如权利要求1-8任一项所述的多肽组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为实体瘤。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述实体瘤为乳腺癌、肾癌、膀胱癌、***癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、***、神经胶质细胞瘤或黑色素瘤中任意一种。
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