JP2005281146A - リポソームからなる遺伝子導入用キャリア - Google Patents
リポソームからなる遺伝子導入用キャリア Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005281146A JP2005281146A JP2004093524A JP2004093524A JP2005281146A JP 2005281146 A JP2005281146 A JP 2005281146A JP 2004093524 A JP2004093524 A JP 2004093524A JP 2004093524 A JP2004093524 A JP 2004093524A JP 2005281146 A JP2005281146 A JP 2005281146A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- liposome
- mel
- gene
- liposomes
- lipid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000002502 liposome Substances 0.000 title claims abstract description 116
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 58
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title abstract description 16
- -1 mannosylerythritol lipid Chemical class 0.000 claims abstract description 29
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 14
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 4
- UJEADPSEBDCWPS-SGJODSJKSA-N (2R,3R)-1-[(3S,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]butane-1,2,3,4-tetrol Chemical class C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)C([C@H](O)[C@H](O)CO)O UJEADPSEBDCWPS-SGJODSJKSA-N 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- 239000002479 lipoplex Substances 0.000 description 14
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 12
- JVXZRNYCRFIEGV-UHFFFAOYSA-M dilC18(3) dye Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.CC1(C)C2=CC=CC=C2N(CCCCCCCCCCCCCCCCCC)C1=CC=CC1=[N+](CCCCCCCCCCCCCCCCCC)C2=CC=CC=C2C1(C)C JVXZRNYCRFIEGV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- ISXSJGHXHUZXNF-LXZPIJOJSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl] n-[2-(dimethylamino)ethyl]carbamate;hydrochloride Chemical compound Cl.C1C=C2C[C@@H](OC(=O)NCCN(C)C)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 ISXSJGHXHUZXNF-LXZPIJOJSA-N 0.000 description 7
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 3
- 150000001841 cholesterols Chemical class 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 3
- JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 1-hexadecanoyl-2-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- OWYYESROIDWURG-OAHLLOKOSA-N (2R)-2-(dodecylamino)pentanedioyl dichloride Chemical compound C(CCCCCCCCCCC)N[C@H](CCC(=O)Cl)C(=O)Cl OWYYESROIDWURG-OAHLLOKOSA-N 0.000 description 1
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 0 *C(OC(C(C(CO*)OC1OC[C@]([C@](CO)O)O)O)C1OC(*)=O)=O Chemical compound *C(OC(C(C(CO*)OC1OC[C@]([C@](CO)O)O)O)C1OC(*)=O)=O 0.000 description 1
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 1
- MWRBNPKJOOWZPW-NYVOMTAGSA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine zwitterion Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-NYVOMTAGSA-N 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100297347 Caenorhabditis elegans pgl-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N Octadecylamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl] n-[2-(dimethylamino)ethyl]carbamate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OC(=O)NCCN(C)C)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N 0.000 description 1
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 1
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L disodium [3-[2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propoxy-oxidophosphoryl]oxy-2-hydroxypropyl] 2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COP([O-])(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002338 electrophoretic light scattering Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 125000001183 hydrocarbyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940099578 hydrogenated soybean lecithin Drugs 0.000 description 1
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000000865 mononuclear phagocyte system Anatomy 0.000 description 1
- 229940042880 natural phospholipid Drugs 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 229940083466 soybean lecithin Drugs 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
【解決手段】マンノシルエリスリトールリピッド及びリン脂質を含み、粒径が100nm以下であるリポソーム。
【選択図】図1
Description
1. マンノシルエリスリトールリピッドおよびリン脂質をエタノールに溶解し、エタノールを減圧除去することを特徴とするマンノシルエリスリトールリピッドを含有するリポソームの調製方法。
2. マンノシルエリスリトールリピッド、リン脂質及びカチオン性コレステロールをエタノールに溶解し、エタノールを減圧除去することを特徴とする項1に記載の方法。
3. リポソームの粒径が100nm以下である項1または2に記載の方法。
4. マンノシルエリスリトールリピッド及びリン脂質を含み、粒径が100nm以下であるリポソーム。
5. カチオン性脂質をさらに含む、項4に記載のリポソーム。
6. カチオン性脂質がコレステリル−3β−カルボキサミドエチレン−N−ヒドロキシエチルアミン(HO−Chol)である項5に記載のリポソーム。
7. 項4〜6のいずれかに記載のリポソームを含む遺伝子導入用キット。
8. 項4〜6のいずれかに記載のリポソーム及び遺伝子を含む遺伝子導入剤。
9. 項4〜6のいずれかに記載のリポソーム及び遺伝子を含む遺伝子治療剤。
以下、本発明をより詳細に説明する。
MEL−B;R1=アセチル、R2=H
MEL−C;R1=H,R2=アセチル
(MEL−A、MEL−B及びMEL−Cに関し、R3,R4は炭素数7〜11の直鎖アルキル基である)
リン脂質としては、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DOPE)の他、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン等の天然リン脂質、或いはこれらを定法により水素添加したもの(例えば水素添加大豆レシチン等)等が挙げられる。これらのリン脂質は、単独でまたは2種以上を混合して用いることができる。好ましいリン脂質は、DOPEである。
ルバモイル]コレステロール(以下「DC−コレステロール」と記す。)、コレステリル−3β−カルボキサミドエチレン−N−ヒドロキシエチルアミン(HO−Chol)等のカチオン性コレステロール、ステアリルアミン、N−(α−トリメチルアンモニオアセチル)ドデシル−D−グルタメートクロリド、N−[1−(2,3−オレオイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロリド、2,3−ジオレオイルオキシ−N−[2−(スペルミンカルボキシアミド)エチル]−N,N−ジメチル−1−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート等が挙げられる。中でも、DC−コレステロールとHO−Cholが好ましく、特にHO−Cholが好ましい。カチオン性脂質は、単独でまたは2種以上を混合して用いることができる。
MELリポソームはエタノール注入法により調製した。すなわち、3β[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロール (DC-Chol) (シグマ社):L- ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン (DOPE) (アバンチボーラーリピッド社):マンノシルエリスッリトールリピッド(MEL)= 3/ 2/ 2 (モル比) = 10.0/ 9.2/ 8.4(mg) で各種成分を量りとり、エタノール適当量に溶解し、70℃前後の水浴中、エタノールが約2mLとなるまでロータリーエバポレーター(N-1000S. S-W型、東京理化機器株式会社)で留去した。そこへ、あらかじめ70℃前後に温めておいた水4mLを加え、軽く振り混ぜた後、残存しているエタノールをロータリーエバポレーターで留去した。これを水浴型超音波装置(W-220R、本多電子株式会社)を用い約5分間ソニケーションした後、滅菌水で4mlにメスアップし、0.1μmのフィルターを通した。得られたリポソームの粒径は約50nmであった。Modified ethanol injection法により調製したMELリポソームの平均粒子径は43.4±2.8nmであった。コントロールリポソーム(MEL未添加)の平均粒子径は156.4±2.4nmであった(表1)。リポソームの粒径の測定は、電気泳動光散乱光度計ELS−800(大塚電子)により行った。
リポプレックスの作製は電荷比DC-Chol (+) / DNA (-) =3/1で行った。まず、滅菌水に溶解したルシフェラーゼ遺伝子pCMV-luc (pGL3 enhanced Plasmid) (Promega社) 1μgに対し、1.9μLのMELリポソームを十分に混合し、室温で15分間インキュべートすることにより、複合体を調製した。
実施例2で調製した複合体を無血清培地をDNA 2μg/無血清細胞培地mLとなるように加え混合し、培地を除去したヒト子宮頸癌由来HeLa細胞 (富山医科薬科大学医学部ウイルス学教室から供与)あるいはヒト肝癌由来Hep-G2細胞 (理化学研究所細胞開発銀行)の培養細胞に加え、1時間放置した。その後、同量の血清含有培地を加えた。HeLa細胞はMEM培地(FBS 5%)(GIBCO)、Hep-G2細胞はRPMI培地(FBS10%)(GIBCO)を用いた。
実施例2で作成した複合体をpCMV-luc 2μg/細胞培地mLとなるように加えた血清含有培地に混合し、培地を除去した培養細胞に加え4時間放置した。その後、新しい血清含有培地に交換した。
MELリポソームとFITC標識オリゴDNA (FITC-ODN) (30mer, ランダマイズシークエンス) (シグマ ジェノシス ジャパン)とのリポプレックス(+/- =3/1)を用いて、そのHeLa細胞内への取り込みを、共焦点レーザー顕微鏡により観察した(図2)。なお、比較対照として市販品Tfx20を用いた。FITC-ODNと各リポソームのリポプレックスを血清非存在下で添加し(DNA 2μg/mL)24時間放置した。また、その後、細胞培地を取り除き、細胞PBSで2回洗浄した後、10%ホルマリン溶液で細胞を固定した。さらに、核染色のためにpropidium iodide(PI)(VECTASHIELD) を用いて核染色を行った。これを共焦点レーザー顕微鏡(Radiance 2100, Bio Rad, CA, USA)を用いて観察した。また、DiI標識したMELリポソームも調製し、MELリポソームのHeLa細胞への取り込みも同様の方法で確認した。
MELリポソームのHeLa細胞への取り込み率をFACS(FACS Calibur flow cytometer, Becton Dickinson, USA)を用いて確認した。まず、DiI標識MELリポソームを用いてFITC-ODNとのリポプレックスを調製し、血清存在下HeLa細胞に添加した。24時間放置後、トリプシン-EDTAを用いて細胞を剥離し、PBSで洗浄し、0.1%BSA, 1mM EDTAを含むPBS溶液に懸濁させた。また、コントロールはリポプレックスの添加を行っていないものをサンプルとして用いた。
FITC-ODN細胞内取り込みの経時的測定においては、各リポプレックスを添加後0.5, 1, 2, 3, 4時間放置した。その後、実施例6に記したようにサンプルを調製した。また、コントロールはリポプレックスの添加を行っていないものを用いた。
MELリポソームを用いた導入遺伝子の発現率の測定においては、グリーンプロテイン遺伝子:pEGFP-C1 (Clontech社)とMELリポソームを用いてリポプレックスを調製し、血清存在下にて添加した。24時間後 GFPの発現率をFACSにより測定した。
MELリポソームを用いた導入遺伝子の活性を評価するためピッカジーン(東洋インキ株式会社)を用いて ルシフェラーゼ活性を測定した。また、対照としてコントロールリポソームとTfx20を用いた。
MELリポプレックスの体内動態を調べるため、ルシフェラーゼ遺伝子:pAAV CMV-luc (横浜市立大学病院から供与)とMELリポソームとのリポプレックスをBalb/c系雌マウス 8週齢に尾静脈内投与し、24時間後の各臓器のルシフェラーゼ活性を比較した。すなわち、MELリポソームまたはコントロールリポソームとpAAV CMV-luc (50μg)とのリポプレックスを作製した。また、プラスミドDNA(pDNA)単独投与においては、pDNA 50μgをPBSで溶解しリポプレックス溶液と同量にして用いた。リポプレックスあるいはプラスミドのみ (いずれも150μL)を尾静注し、24時間後、頚椎脱臼し、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺を摘出した。これら5臓器に溶解バッファー(Luciferase Cell Culture Lysis 1× Reagent, Promega)を加えホモジナイズし、遠心分離後、この上清を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
Claims (9)
- マンノシルエリスリトールリピッドおよびリン脂質をエタノールに溶解し、エタノールを減圧除去することを特徴とするマンノシルエリスリトールリピッドを含有するリポソームの調製方法。
- マンノシルエリスリトールリピッド、リン脂質及びカチオン性コレステロールをエタノールに溶解し、エタノールを減圧除去することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- リポソームの粒径が100nm以下である請求項1または2に記載の方法。
- マンノシルエリスリトールリピッド及びリン脂質を含み、粒径が100nm以下であるリポソーム。
- カチオン性脂質をさらに含む、請求項4に記載のリポソーム。
- カチオン性脂質がコレステリル−3β−カルボキサミドエチレン−N−ヒドロキシエチルアミン(HO−Chol)である請求項5に記載のリポソーム。
- 請求項4〜6のいずれかに記載のリポソームを含む遺伝子導入用キット。
- 請求項4〜6のいずれかに記載のリポソーム及び遺伝子を含む遺伝子導入剤。
- 請求項4〜6のいずれかに記載のリポソーム及び遺伝子を含む遺伝子治療剤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004093524A JP4450656B2 (ja) | 2004-03-26 | 2004-03-26 | リポソームからなる遺伝子導入用キャリア |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004093524A JP4450656B2 (ja) | 2004-03-26 | 2004-03-26 | リポソームからなる遺伝子導入用キャリア |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005281146A true JP2005281146A (ja) | 2005-10-13 |
JP4450656B2 JP4450656B2 (ja) | 2010-04-14 |
Family
ID=35179925
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004093524A Expired - Lifetime JP4450656B2 (ja) | 2004-03-26 | 2004-03-26 | リポソームからなる遺伝子導入用キャリア |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4450656B2 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008079600A (ja) * | 2006-08-29 | 2008-04-10 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法 |
JP2009154121A (ja) * | 2007-12-27 | 2009-07-16 | Toyobo Co Ltd | マンノシルエリスリトールリピッドを用いたベシクル、乳化組成物及びその利用 |
JP2018024639A (ja) * | 2016-07-27 | 2018-02-15 | 日本精化株式会社 | マンノシルエリスリトールリピッドを含有する化粧料用組成物 |
-
2004
- 2004-03-26 JP JP2004093524A patent/JP4450656B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008079600A (ja) * | 2006-08-29 | 2008-04-10 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法 |
JP2009154121A (ja) * | 2007-12-27 | 2009-07-16 | Toyobo Co Ltd | マンノシルエリスリトールリピッドを用いたベシクル、乳化組成物及びその利用 |
JP2018024639A (ja) * | 2016-07-27 | 2018-02-15 | 日本精化株式会社 | マンノシルエリスリトールリピッドを含有する化粧料用組成物 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4450656B2 (ja) | 2010-04-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US9278067B2 (en) | Encapsulation of plasmid DNA (lipogenes™) and therapeutic agents with nuclear localization signal/fusogenic peptide conjugates into targeted liposome complexes | |
AU2001275423B2 (en) | Encapsulation of polynucleotides and drugs into targeted liposomes | |
Ferreira et al. | pH-sensitive liposomes for drug delivery in cancer treatment | |
US5908635A (en) | Method for the liposomal delivery of nucleic acids | |
CA2263705C (en) | Novel sandwich liposome complexes comprising a biologically active agent | |
US6770291B2 (en) | Liposome complexes for increased systemic delivery | |
US20060204566A1 (en) | Novel liposome complexes for increased systemic delivery | |
AU2003205049B2 (en) | Efficient nucleic acid encapsulation into medium sized liposomes | |
AU2001275423A1 (en) | Encapsulation of polynucleotides and drugs into targeted liposomes | |
JP2001511440A (ja) | 層状構造の、中性あるいは陰性グローバル電荷を持つ安定粒状複合体 | |
Sun et al. | Optimization of DOTAP/chol cationic lipid nanoparticles for mRNA, pDNA, and oligonucleotide delivery | |
US20150297749A1 (en) | Low-density lipoprotein analogue nanoparticles, and composition comprising same for targeted diagnosis and treatment of liver | |
JP3910646B2 (ja) | 「細胞への遺伝子導入用組成物」 | |
JPWO2007132790A1 (ja) | 細菌菌体成分を含む脂質膜を有するリポソーム | |
US20040062797A1 (en) | Release of therapeutic agents in a vessel or tissue | |
WO2014030601A1 (ja) | アニオン性を有する新規ナノバブルポリ-リポ・プレックスの製造方法 | |
US11793756B2 (en) | Anionic nanocomplexes for nucleic acid delivery | |
JP4450656B2 (ja) | リポソームからなる遺伝子導入用キャリア | |
JP2008031142A (ja) | 脂肪組織標的化ペプチド及び該ペプチドを有するリポソーム | |
JP3943845B2 (ja) | リポソームベクター | |
KR101916941B1 (ko) | 플라스미드 디엔에이 전달용 고분자 나노입자 조성물 및 그의 제조방법 | |
JP3908776B2 (ja) | 細胞への遺伝子導入用組成物 | |
JP2007166946A (ja) | 標的遺伝子の発現を抑制するための組成物 | |
KR101671864B1 (ko) | 요오드화 오일을 함유하는 양이온성 에멀젼 및 바이러스 벡터의 유전자 전달 증진을 위한 이의 용도 | |
JP2014114267A (ja) | 脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および/または増強するペプチド、肝臓血管内皮細胞への移行能を有するまたは肝臓血管内皮細胞への移行能が増強された脂質膜構造体、ならびに脂質膜構造体に対して肝臓血管内皮細胞への移行能を付与および/または増強する剤 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20061023 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20090812 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090826 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091022 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100106 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100126 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4450656 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130205 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140205 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |