JP2005218349A - 新規r体特異的アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子、及び、これを利用した光学活性アルコールの製造方法 - Google Patents
新規r体特異的アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子、及び、これを利用した光学活性アルコールの製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005218349A JP2005218349A JP2004029114A JP2004029114A JP2005218349A JP 2005218349 A JP2005218349 A JP 2005218349A JP 2004029114 A JP2004029114 A JP 2004029114A JP 2004029114 A JP2004029114 A JP 2004029114A JP 2005218349 A JP2005218349 A JP 2005218349A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- optically active
- alcohol
- butanediol
- coenzyme
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【解決手段】 該ポリヌクレオチドは、R体特異的アルコール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドまたはそのホモログである。(1)作用:β−NADHを補酵素として、ケトンを還元し、光学活性アルコールを生成する。β−NADを補酵素としてアルコールを酸化し、対応するケトンもしくはアルデヒドを生成する。(2)基質特異性:(i)還元反応の補酵素としてβ−NADHを、酸化反応の補酵素とβ−NADを利用する。(ii)(R)−1,3−ブタンジオールを酸化して4−ヒドロキシ−2−ブタノンを生成する。
【選択図】 なし
Description
Agri. Biol. Chem., 52, 1951-1956 (1988) J. Biosci. Bioeng., 88, 148-152 (1999)
まず、ピキア・オフナエンシスをメタノールをC源として含有する適当な培地で培養し、集菌して菌体を得た。菌体を破砕し、得られた無細胞抽出液からジヒドロキシアセトンを還元する酵素を電気泳動的に単一なバンドになるまで精製した。得られた精製酵素を用いて、N末端アミノ酸配列及びV8プロテアーゼによる部分消化後、内部配列の一部を解析した。
コア配列の5’−及び3’−周辺領域の塩基配列は、染色体DNAを制限酵素により消化し、LA PCR in vitro Cloning Kit (タカラバイオ製) を用いて解析した。得られた配列をコア領域の配列とアッセンブルし、R体特異的アルコール脱水素酵素の全塩基配列を決定した。得られた配列を元に、本酵素のオープンリーディングフレーム(ORF)のみを特異的に増幅可能なプライマーを合成し、大腸菌における発現ベクターpSE420D (特開2000-189170号公報)に挿入することにより、本酵素遺伝子の発現プラスミドpSE-HOD1を構築した。本単独発現プラスミドを含む大腸菌を適当な培地で培養し、イソプロピルチオガラクトピラノシド(IPTG)やラクトースなどにより誘導発現することにより、本酵素を効率的に発現できた。
〔1〕 下記(1)から(3)に記載のR体特異的アルコール脱水素酵素をコードする、下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチド;
(1)作用
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、ケトンを還元し、光学活性アルコールを生成する。酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素としてアルコールを酸化し、対応するケトンもしくはアルデヒドを生成する。
(2)基質特異性
(i)還元反応の補酵素として還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを、酸化反応の補酵素と酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを利用する。
(ii)(R)−1,3−ブタンジオールを酸化して4−ヒドロキシ−2−ブタノンを生成する。
(iii)(R)−1,3−ブタンジオールに対する活性が、(S)−1,3−ブタンジオールに対する活性よりも20倍以上高い。
(3)分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約38,000。
(a)配列番号:1に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(b)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(d)配列番号:1に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
(e)配列番号:2に記載のアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
〔2〕 〔1〕に記載のポリヌクレオチドが挿入された組換えベクターを発現可能に保持した形質転換体。
〔3〕 〔2〕に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、下記(1)から(3)に記載のR体特異的アルコール脱水素酵素の製造方法。
(1)作用
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、ケトンを還元し、光学活性アルコールを生成する。酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素としてアルコールを酸化し、対応するケトンもしくはアルデヒドを生成する。
(2)基質特異性
(i)還元反応の補酵素として還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを、酸化反応の補酵素と酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを利用する。
(ii)(R)−1,3−ブタンジオールを酸化して4−ヒドロキシ−2−ブタノンを生成する。
(iii)(R)−1,3−ブタンジオールに対する活性が、(S)−1,3−ブタンジオールに対する活性よりも20倍以上高い。
(3)分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約38,000。
〔4〕 〔2〕に記載の形質転換体もしくはその処理物をケトンに作用させ、光学活性アルコールを製造する方法。
〔5〕 〔4〕に記載のケトンが4−ヒドロキシ−2−ブタノンであり、生成する光学活性アルコールが(R)−1,3−ブタンジオールであることを特徴とする、〔4〕に記載の光学活性アルコールの製造方法。
〔6〕 〔4〕に記載のケトンが4−クロロアセト酢酸エチルエステルであり、生成する光学活性アルコールが(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシ酪酸エチルであることを特徴とする、〔4〕に記載の光学活性アルコールの製造方法。
〔7〕 〔2〕に記載の形質転換体もしくはその処理物をラセミ体アルコールに作用させ、光学活性アルコールを製造する方法。
〔8〕 〔7〕に記載のラセミ体アルコールが(RS)−1,3−ブタンジオールであり、生成する光学活性アルコールが(S)−1,3−ブタンジオールであることを特徴とする、〔7〕に記載の光学活性アルコールの製造方法。
本発明に利用するR体特異的アルコール脱水素酵素は、下記の(1)−(3)の性質により特徴づけられる。
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、ケトンを還元し、光学活性アルコールを生成する。酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素としてアルコールを酸化し、対応するケトンもしくはアルデヒドを生成する。
(2)基質特異性
(i)還元反応の補酵素として還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを、酸化反応の補酵素と酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを利用する。
(ii)(R)−1,3−ブタンジオールを酸化して4−ヒドロキシ−2−ブタノンを生成する。
(iii)(R)−1,3−ブタンジオールに対する活性が、(S)−1,3−ブタンジオールに対する活性よりも20倍以上高い。
(3)分子量
ドデシル硫酸ナトリウム −ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約38,000である。
ジヒドロキシアセトンに対する還元活性測定法(活性測定方法−1):
167mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)、0.2mM NADH、100mM ジヒドロキシアセトンおよび酵素を含む反応液中25℃で反応させ、NADHの減少にともなう340 nmの吸光度の減少を測定する。1Uは、1分間に1μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とした。
100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)、0.2mM NADH、100mM ジヒドロキシアセトンおよび酵素を含む反応液中30℃で反応させ、NADHの減少にともなう340 nmの吸光度の減少を測定する。1Uは、1分間に1μmolのNADHの減少を触媒する酵素量とした。
100mMリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)、50mM (R)−1,3−ブタンジオール、2.5mM 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(以下、NAD+と略す)および酵素を含む反応液中30℃で反応させ、NADHの増加にともなう340 nmの吸光度の減少を測定する。1Uは、1分間に1μmolのNADHの生成を触媒する酵素量とした。活性測定方法−3を用いて測定した活性値は、活性測定方法−2で測定した数値の約4.2倍になる。
また、本発明の酵素の分子量は、通常のSDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動)で測定できる。測定値は泳動条件等により若干変化し得るが、34,000〜42,000の範囲で確認することができる。
本発明は、R体特異的アルコール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそのホモログに関する。
配列番号:1に記載の塩基配列を元にPCR用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体DNAもしくは、cDNAライブラリーを鋳型としてPCRを行うことにより本発明のDNAを得ることができる。
なお本発明のポリヌクレオチドには、以上のような方法によってクローニングされたゲノムDNA、あるいはcDNAの他、合成によって得られたDNAが含まれる。
このようにして単離された、本発明によるR体特異的アルコール脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、R体特異的アルコール脱水素酵素発現ベクターが提供される。
また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明のR体特異的アルコール脱水素酵素を組換え体から得ることができる。
・バチルス(Bacillus)属
・シュードモナス(Pseudomonas)属
・セラチア(Serratia)属
・ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属
・コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属
・ストレプトコッカス(Streptococcus)属
・ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌
・ロドコッカス(Rhodococcus)属
・ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌
・サッカロマイセス(Saccharomyces)属
・クライベロマイセス(Kluyveromyces)属
・シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属
・チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属
・ヤロウイア(Yarrowia)属
・トリコスポロン(Trichosporon)属
・ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属
・ピキア(Pichia)属
・キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母
・ノイロスポラ(Neurospora)属
・アスペルギルス(Aspergillus)属
・セファロスポリウム(Cephalosporium)属
・トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換された形質転換体を培養する工程、発現産物を回収する工程を含む本発明のR体特異的アルコール脱水素活性を有するタンパク質の製造方法に関する。
また本発明は、前記R体特異的アルコール脱水素酵素を利用したケトンの還元による光学活性なアルコールの製造方法であり、たとえば好ましくは光学活性ジオール、光学活性β−ヒドロキシエステルなどの製造方法、さらに好ましくは(R)−1,3−ブタンジオール、(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシ酪酸エチルの製造方法に関する。
光学純度=(R−S/R+S)または(S−R/R+S)×100(%)
(R、Sはそれぞれ試料中にしめる右形および左形鏡像体の割合を示す。)
ピキア・オフナエンシスIFO 10709 を1%グルコースを含む基本培地A−5mLに植菌し、30℃で対数中期まで培養した。得られた菌を1%メタノールを含む基本培地A−5Lに植菌し、30℃で対数後期まで培養した。培養液を遠心分離し、酵素精製用菌体として利用した。
実施例1により調製した菌体を緩衝液A(10mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)及び1mMジチオスレイトール(以下、DTTと略す))に懸濁し、Bead-Beater(Biospec社製)により破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清として無細胞抽出液を得た。
無細胞抽出液を予め緩衝液Aで平衡化したDEAE−セルロース(4.0x3.0cm、和光純薬製)に吸着させ、緩衝液A:緩衝液B(100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)及び1mM DTT)=7:3の液、3:7の液、最後に緩衝液Bのみで溶出した。本酵素は緩衝液A:Bが3:7の時に溶出した。得られた活性画分を回収し、緩衝液Aに対して透析した。ピキア・オフナエンシスには、ジヒドロキシアセトン還元活性を有するタンパク質が少なくとも3種類存在するが、本発明の酵素とは異なる2種類の酵素はそれぞれ、緩衝液A:Bが7:3の液、緩衝液Bに更に0.2M塩化カリウムを加えた溶液で溶出し、本発明の酵素とは分離された。
得られた精製酵素は12.5% ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)においてほぼ単一バンドを示した。
精製酵素の比活性は30.0U/mg(活性測定方法−1)であった。精製の要約を表1に示した。
実施例1で得られた酵素のサブユニットの分子量をSDS-PAGEにより求めた結果、約38,000であった。
実施例1で得られた酵素を用いて、プロテインシーケンサー(476型プロテインシーケンサー、アプライド・バイオシステムズ社製)によりN末端アミノ酸配列を解析した結果、配列番号:3に記載のアミノ酸配列が得られた。尚、後記したDNA配列から予想されるアミノ酸配列では、配列番号:3の6位LysはCysであった。
MMKALKYLG(配列番号:3)
IPYADQSLYKAPENV(配列番号:4)
VGVVLGNVKGGKTVAKVGL(配列番号:5)
ピキア・オフナエンシスIFO 10709を1%メタノールを含む基本培地Aで培養した。染色体DNAの精製は、Meth. Cell Biol,. 29, 39-44 (1975) に記載の方法により行った。
実施例3で得られたアミノ酸配列を元に、プライマー1(配列番号:6)及びプライマー2(配列番号:7)を合成した。
プライマー1(配列番号:6)
ATHCCCCNTAYGCNGAYCA
プライマー2(配列番号:7)
TCNCCYTTYTTNACRTT
コア領域の塩基配列(配列番号:8)
ATCCCGTATGCCGACCAGTCTTTGTATAAAGCACCTGAAAATGTTCCGATCGAGTCATTGTTGATGCTTAGCGACATTCTTCCAACGGCCTACGAGGTCGGAGTGGTTTCCGGTAACGTCAAGAAGGGT
実施例5で得られたR体特異的アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子コア領域の5'-隣接領域のクローニングをTAKARA LA PCR in vitro Cloning Kit (タカラバイオ製)を用いて行った。
プライマーS1(配列番号:9)
GCGGAGACAAGACCTGTTGAAATAG
プライマーS2(配列番号:10)
CGACCTCGTAGGCCGTTGGAA
実施例5で得られたR体特異的アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子コア領域の3'-隣接領域のクローニングを5’−隣接領域と同様に、TAKARA LA PCR in vitro Cloning Kit (タカラバイオ製)を用いて行った。
プライマーS3(配列番号:11)
GCACCTGAAAATGTTCCGATCGAGTCATTG
プライマーS4(配列番号:12)
ATTCTTCCAACGGCCTACGAGGTCGG
実施例6及び7で得られた塩基配列と実施例5で得られたコア領域の塩基配列をアッセンブルした結果、R体特異的アルコール脱水素酵素の全オープンリーディングフレーム(ORF)が明らかになった。
得られた塩基配列から予想されるアミノ酸配列を配列番号:2に示す。
R体特異的アルコール脱水素酵素遺伝子の大腸菌における発現プラスミドpSE-HOD4の構築を行った。
PCRプライマーとして、HOD-ATGATG1(配列番号:13)及びHOD-TAA1(配列番号:14)を合成し、以下の条件でPCRを行った。染色体DNA50ng、各プライマー50pmol、dNTP各10nmol、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene製)2U、Pfu用緩衝液を含む50μLの反応液を用い、95℃30秒、50℃1分、75℃5分を30サイクル行った。得られた増幅DNA断片を制限酵素BspHI及びXbaIで二重消化し、制限酵素NcoI及びXbaIで二重消化したpSE420DとライゲーションしてpSE-HOD4を構築した。プラスミド構築の過程を図1に示した。
プライマー HOD-ATGATG1(配列番号:13)
TGCTCATGATGAAGGCCTTGTGCTACCT
プライマー HOD-TAA1(配列番号:14)
CAGTCTAGATCATTCGTCACAGGTGATCA
R体特異的アルコール脱水素酵素遺伝子とバチルス・サブチリス由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を共発現するプラスミドpSG-HOD1の構築を行った。
実施例8で得られた増幅DNA断片をバチルス・サブチリス由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を含むpSE-BSG1(特願2000-374593)のNcoI-XbaI間に挿入して、pSG-HOD1を構築した。プラスミド構築の過程を図2に示した。
R体特異的アルコール脱水素酵素遺伝子をマイコバクテリウム・バッカエ由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を共発現する共発現プラスミドpSF-HOD1の構築を行った。
得られたそれぞれのPCR増幅産物を一端pUC118のHincIIサイトに挿入して塩基配列の確認を行った後、プライマーHOD-ATG2及びHOD-XhoRから得られたDNAを制限酵素EcoRI及びXhoIで二重消化し、プライマーHOD-XhoF及びHOD-TAA2から得られたDNAを制限酵素XhoI及びHindIIIで二重消化し、pSE-MF26 (特開 2003-199595)のEcoRI, HindIII消化物とライゲーションしてpSF-HOD1を構築した。プラスミド構築の過程を図3に示した。
プライマー HOD-ATG2(配列番号:15)
GTCGAATTCTATCATGATGAAAGCATTATGTTACCTCGGATC
プライマー HOD-XhoR(配列番号:16)
GACCTCGAGACGAGAATCG
プライマー HOD-XhoF(配列番号:17)
CGTCTCGAGGTAGCACGTCGTCTCGGTGCGCACGAAACC
プライマー HOD-TAA2(配列番号:18)
CTGAAGCTTCTAGATTATTCATCACAAGTGATCACCATC
pSE-HOD4, pSG-HOD1及びpSF-HOD1をそれぞれ含有する大腸菌HB101株をアンピシリンを含むLB培地で培養し、0.1 mM IPTGにより誘導を4時間行い、遠心分離により集菌菌体を得た。
pSG-HOD1を含む大腸菌由来の無細胞抽出液を用いてジヒドロキシアセトン還元活性(活性測定方法−2)を測定した結果、0.570 U/mg であり、(R)−1,3−ブタンジオール酸化活性は2.38 U/mg であった。同様に、pSE-HOD4 及び pSF-HOD1 を含む大腸菌由来の無細胞抽出液の(R)−1,3−ブタンジオール酸化活性はそれぞれ 1.41 U/mg, 1.06 U/mgであった。尚、宿主のみでは、(R)−1,3−ブタンジオール酸化活性は検出できなかった。
100mM D−グルコース、2.5mM NAD+、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5)及び酵素を含む反応液中で30℃で反応を行い、NADHの生成に伴う340nmの吸光度の上昇を測定した。1Uは、1分間に1μモルのNADHの生成を触媒する酵素量とした。
また、pSF-HOD1を含む大腸菌HB101株のギ酸脱水素酵素活性を測定した結果、0.192 U/mg であった。
100mM ギ酸ナトリウム、2.5mM NAD+、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)及び酵素を含む反応液中で30℃で反応を行い、NADHの生成に伴う340nmの吸光度の上昇を測定した。1Uは、1分間に1μモルのNADHの生成を触媒する酵素量とした。
実施例11で得られたpSG-HOD1を含む大腸菌HB101株より調製した無細胞抽出液を用いて、酸化反応の基質特異性を調べた。
活性測定は、活性測定方法−3の条件で基質を替えて行った。
実施例11で得られたpSG-HOD1を含む大腸菌HB101株より調製した無細胞抽出液を用いて、還元酸化反応の基質特異性を調べた。
活性測定は、活性測定方法−2の条件で基質を替えて行った。
pSE-HOD1を含む大腸菌HB101株を2xYT培地で培養し、遠心分離により菌体を集菌し、凍結乾燥により乾燥菌体を調製した。100mM 2−ペンタノン、200mMグルコース、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)及び凍結乾燥菌体300mgを含む反応液20mLを500mLのフラスコ中、30℃で反応させた。反応2時間後に収率88%で>99%eeの(R)−2−ペンタノールが生成した。
2−ペンタノン、(R)−2−ペンタノール、(S)−2−ペンタノールの定量は以下のガスクロによる方法により行った。
カラム:Chirasil-DEX CB (Chrompack, Middelburg, Netherlands)
キャリアーガス:He
インジェクション温度:250℃
検出温度:275℃
カラム温度:イニシャル60℃を3min、その後、1℃/minで80℃まで昇温。
これらの条件下、2−ペンタノン、(R)−2−ペンタノール、(S)−2−ペンタノールはそれぞれ、2.2分、4.5分、4.7分に溶出する。
実施例14により調製したpSE-HOD1を含む大腸菌HB101株の凍結乾燥菌体を生体触媒として利用した。100mM ラセミ体2−ペンタノール、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)及び凍結乾燥菌体300mgを含む反応液20mLを500mLのフラスコ中、30℃で反応させた。反応2時間後にラセミ体を100%として収率44%で98%eeの(S)−2−ペンタノールが生成した。
Claims (8)
- 下記(1)から(3)に記載のR体特異的アルコール脱水素酵素をコードする、下記(a)から(e)のいずれかに記載のポリヌクレオチド;
(1)作用
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、ケトンを還元し、光学活性アルコールを生成する。酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素としてアルコールを酸化し、対応するケトンもしくはアルデヒドを生成する。
(2)基質特異性
(i)還元反応の補酵素として還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを、酸化反応の補酵素と酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを利用する。
(ii)(R)−1,3−ブタンジオールを酸化して4−ヒドロキシ−2−ブタノンを生成する。
(iii)(R)−1,3−ブタンジオールに対する活性が、(S)−1,3−ブタンジオールに対する活性よりも20倍以上高い。
(3)分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約38,000。
(a)配列番号:1に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
(b)配列番号:2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(c)配列番号:2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(d)配列番号:1に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
(e)配列番号:2に記載のアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。 - 請求項1に記載のポリヌクレオチドが挿入された組換えベクターを発現可能に保持した形質転換体。
- 請求項2に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、下記(1)から(3)に記載のR体特異的アルコール脱水素酵素の製造方法。
(1)作用
還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素として、ケトンを還元し、光学活性アルコールを生成する。酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを補酵素としてアルコールを酸化し、対応するケトンもしくはアルデヒドを生成する。
(2)基質特異性
(i)還元反応の補酵素として還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを、酸化反応の補酵素と酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを利用する。
(ii)(R)−1,3−ブタンジオールを酸化して4−ヒドロキシ−2−ブタノンを生成する。
(iii)(R)−1,3−ブタンジオールに対する活性が、(S)−1,3−ブタンジオールに対する活性よりも20倍以上高い。
(3)分子量
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量が約38,000。 - 請求項2に記載の形質転換体もしくはその処理物をケトンに作用させ、光学活性アルコールを製造する方法。
- 請求項4に記載のケトンが4−ヒドロキシ−2−ブタノンであり、生成する光学活性アルコールが(R)−1,3−ブタンジオールであることを特徴とする、請求項4に記載の光学活性アルコールの製造方法。
- 請求項4に記載のケトンが4−クロロアセト酢酸エチルエステルであり、生成する光学活性アルコールが(S)−4−クロロ−3−ヒドロキシ酪酸エチルであることを特徴とする、請求項4に記載の光学活性アルコールの製造方法。
- 請求項2に記載の形質転換体もしくはその処理物をラセミ体アルコールに作用させ、光学活性アルコールを製造する方法。
- 請求項7に記載のラセミ体アルコールが(RS)−1,3−ブタンジオールであり、生成する光学活性アルコールが(S)−1,3−ブタンジオールであることを特徴とする、請求項7に記載の光学活性アルコールの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004029114A JP4396972B2 (ja) | 2004-02-05 | 2004-02-05 | 新規r体特異的アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子、及び、これを利用した光学活性アルコールの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004029114A JP4396972B2 (ja) | 2004-02-05 | 2004-02-05 | 新規r体特異的アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子、及び、これを利用した光学活性アルコールの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005218349A true JP2005218349A (ja) | 2005-08-18 |
JP4396972B2 JP4396972B2 (ja) | 2010-01-13 |
Family
ID=34994488
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004029114A Expired - Fee Related JP4396972B2 (ja) | 2004-02-05 | 2004-02-05 | 新規r体特異的アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子、及び、これを利用した光学活性アルコールの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4396972B2 (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007129466A1 (ja) | 2006-05-09 | 2007-11-15 | Mitsui Chemicals, Inc. | 補酵素再生によるヒドロキシカルボン酸類の生産方法 |
WO2008041385A1 (fr) * | 2006-09-29 | 2008-04-10 | National University Corporation NARA Institute of Science and Technology | Nouvelle alcane polyol déshydrogénase |
CN102154133A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-08-17 | 浙江工业大学 | 不对称还原制备(r)-1,3-丁二醇的方法及菌株 |
JP4954985B2 (ja) * | 2006-05-09 | 2012-06-20 | 三井化学株式会社 | 補酵素合成強化によるグリコール酸の生産方法 |
CN114350583A (zh) * | 2021-12-17 | 2022-04-15 | 清华大学 | 一种发酵生产1,2-丁二醇的方法、重组微生物及其应用 |
-
2004
- 2004-02-05 JP JP2004029114A patent/JP4396972B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007129466A1 (ja) | 2006-05-09 | 2007-11-15 | Mitsui Chemicals, Inc. | 補酵素再生によるヒドロキシカルボン酸類の生産方法 |
JP4886775B2 (ja) * | 2006-05-09 | 2012-02-29 | 三井化学株式会社 | 補酵素再生によるグリコール酸の生産方法 |
JP4954985B2 (ja) * | 2006-05-09 | 2012-06-20 | 三井化学株式会社 | 補酵素合成強化によるグリコール酸の生産方法 |
US8748157B2 (en) | 2006-05-09 | 2014-06-10 | Mitsui Chemicals, Inc. | Method for producing hydroxycarboxylic acid by regenerating coenzyme |
US9133444B2 (en) | 2006-05-09 | 2015-09-15 | Mitsui Chemicals, Inc. | Method for producing hydroxycarboxylic acid by enhancing synthesis of coenzyme |
WO2008041385A1 (fr) * | 2006-09-29 | 2008-04-10 | National University Corporation NARA Institute of Science and Technology | Nouvelle alcane polyol déshydrogénase |
US7771977B2 (en) | 2006-09-29 | 2010-08-10 | National University Corporation NARA Institute of Science and Technology | Alkane polyol dehydrogenase |
JP5030067B2 (ja) * | 2006-09-29 | 2012-09-19 | 国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 | 新規アルカンポリオール脱水素酵素 |
CN102154133A (zh) * | 2011-01-27 | 2011-08-17 | 浙江工业大学 | 不对称还原制备(r)-1,3-丁二醇的方法及菌株 |
CN102154133B (zh) * | 2011-01-27 | 2012-07-25 | 浙江工业大学 | 不对称还原制备(r)-1,3-丁二醇的方法及菌株 |
CN114350583A (zh) * | 2021-12-17 | 2022-04-15 | 清华大学 | 一种发酵生产1,2-丁二醇的方法、重组微生物及其应用 |
CN114350583B (zh) * | 2021-12-17 | 2023-07-25 | 清华大学 | 一种发酵生产1,2-丁二醇的方法、重组微生物及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4396972B2 (ja) | 2010-01-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4630486B2 (ja) | 新規な(r)−2,3−ブタンジオール脱水素酵素、その製造方法、及びこれを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
JP4651896B2 (ja) | (r)−2−オクタノール脱水素酵素、該酵素の製造方法、該酵素をコードするdnaおよびこれを利用したアルコールの製造方法 | |
US6312933B1 (en) | Carbonyl reductase, method for producing said enzyme, DNA encoding said enzyme, and method for producing alcohol using said enzyme | |
JP5787360B2 (ja) | 1,3−ブタンジオール生産機能を付与された遺伝子組換え微生物及びその利用 | |
JP4213524B2 (ja) | 新規なカルボニル還元酵素、その酵素をコードするdnaを含むポリヌクレオチド、その製造方法、およびこれを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
JP4012257B2 (ja) | 新規カルボニル還元酵素、およびこれをコードする遺伝子、ならびにこれらの利用方法 | |
JP4294382B2 (ja) | (2s,3s)−2,3−ブタンジオール脱水素酵素 | |
JP5308163B2 (ja) | 新規アルコール脱水素酵素、その遺伝子、ベクター、形質転換体、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
JP4396972B2 (ja) | 新規r体特異的アルコール脱水素酵素をコードする遺伝子、及び、これを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
US7250278B2 (en) | α-keto acid reductase, method for producing the same, and method for producing optically active α-hydroxy acids using the same | |
JP4753335B2 (ja) | エノン還元酵素 | |
JP4688313B2 (ja) | 新規なエノン還元酵素、その製造方法、およびこれを利用したα,β−不飽和ケトンの炭素−炭素2重結合を選択的に還元する方法 | |
JP5030067B2 (ja) | 新規アルカンポリオール脱水素酵素 | |
JP2005218348A (ja) | 光学活性α−ヒドロキシアミドの製造方法 | |
JP4587348B2 (ja) | 新規な(r)−2,3−ブタンジオール脱水素酵素 | |
JP4884996B2 (ja) | 新規な(s)−n−ベンジル−3−ピロリジノール脱水素酵素、その製造方法、及びこれを利用したアルコールの製造方法 | |
JP4603171B2 (ja) | (s)−4−ハロ−3−ヒドロキシ酪酸エステルの製造に有用な酵素をコードする遺伝子、その取得方法、およびこれを利用した光学活性アルコールの製造方法 | |
JP2007274901A (ja) | 光学活性プロパルギルアルコールの製造方法 | |
JP2004065049A (ja) | D−マンデル酸脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド、及びその用途 | |
JP2013070675A (ja) | アルキルジオールを産生する組換え菌の培養方法 | |
JP2010279272A (ja) | 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、ベクター、形質転換体、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060912 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20060920 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090706 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090901 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091014 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20091016 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121030 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121030 Year of fee payment: 3 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121030 Year of fee payment: 3 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121030 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131030 Year of fee payment: 4 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |