JP2005218310A - 遺伝子検出電界効果デバイスおよびこれを用いた遺伝子多型解析方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 絶縁膜体(2)、半導体基板(3)および参照電極(4)が備えられている遺伝子解析電界効果デバイスであって、以下の構成:
(a)絶縁膜体(2)は、その一方の面側に核酸プローブ(5)が固定化されているとともに、少なくとも1種類の検出解析の目的遺伝子(601)が含まれる試料溶液(6)に接触されていること;
(b)半導体基板(3)は、前記絶縁膜体(2)の他方の面側に当接設置されていること;および
(c)参照電極(4)は、前記試料溶液(6)中に備えられていること;
を含んでなることを特徴とする。
【選択図】図6
Description
に基づく二本鎖DNAの検出を基本原理としており、反応の選択性があまり高くないため、
遺伝子多型解析の精度に問題があった。特に医療の分野では、テーラーメイド医療の実現には、遺伝子多型、もしくは、一塩基多型(Single Nucleotide Polymorphism, SNP;以
下、SNPと略記することがある)を高精度に、かつ、簡便に検出する必要がある。したが
って、簡便性と高精度化の両方を満足させる技術が求められている。
端を金属電極上に固定化し、他端に核酸プローブを結合させ、目的遺伝子とのハイブリダイゼーションに基づく酸化・還元標識と金属電極の電子の授受を電流変化として検出して、目的遺伝子を検出する方式が開発されている(非特許文献1および非特許文献2)。
、金属電極における酸化・還元電流を計測することにより、ハイブリダイゼーションを検出する方式が開発されている(非特許文献3)。さらに、電流検出方式DNAチップを用い
て、C型肝炎の薬効検査システムが開発されている(非特許文献4)。この方式では、高
価なレーザや複雑な光学系システム等を必要としないため、簡単で小型のシステムを構築することができる。
みも報告されている(非特許文献5)。これは、DNA分子が溶液中で負電荷を有しているこ
とを利用し、電界効果を利用してハイブリダイゼーションによる電荷変化を検出するものである。しかしながら、基板上に形成されるDNAプローブはもともと負電荷を有している
ため、目的遺伝子のハイブリダイゼーションによる電荷の変化分は小さく、非特異的な吸着との区別ができないなど遺伝子検査のためには高感度化、精度向上が課題であった。また、一塩基多型(SNP)のように2つの遺伝子間における、わずかの違い(一塩基の違い
)を検出するには、感度および精度(選択性)が共に悪く、困難であった。
Nature Biotechnology, vol. 16, p27-31, 1998 Nature Biotechnology, vol. 16, p40-44, 1998 Anal. Chem., 72, p1334-1341, 2000 Intervirology, 43, p124-127, 2000 J. Phys. Chem. B., 101, p2980-2985, 1997
(1) 絶縁膜体、半導体基板および参照電極が備えられている遺伝子解析電界効果デバイスであって、以下の構成:
(a)絶縁膜体は、その一方の面側に核酸プローブが固定化されているとともに、少なくとも1種類の目的遺伝子が含まれる試料溶液に接触されていること;
(b)半導体基板は、前記絶縁膜体の他方の面側に当接設置されていること;および
(c)参照電極は、前記試料溶液中に備えられていること;
を含んでなることを特徴とする遺伝子検出電界効果デバイス;
(2) 上記(1)記載の遺伝子検出電界効果デバイスが、少なくとも2つ以上備えられており
、かつ、これら遺伝子検出電界効果デバイスそれぞれの絶縁膜体上には目的遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列を有する野生型(正常型)核酸プローブと、目的遺伝子の塩基配列と非相補的な塩基配列を有する変異型核酸プローブの少なくとも2種類以上の核酸プローブが固定化されてなることを特徴とする遺伝子検出電界効果デバイス;
(3) 変異型核酸プローブは、核酸プローブが絶縁膜体上に固定化されていない端部である非固定化端部における塩基が、野生型核酸プローブの非固定化端部における塩基と異なっている(2)記載の遺伝子検出電界効果デバイス;
(4) 核酸プローブは、オリゴヌクレオチド、相補的DNA(cDNA)およびペプチド核酸(PNA)からなる群より少なくとも1種類以上が選択される(1)から(3)いずれか記載の遺伝子検出電界効果デバイス;
(5) 核酸プローブは、金属電極を介して固定化されている(1)から(4)いずれか記載の遺伝子検出電界効果デバイス;
(6) 金属電極は、白金、金、銀、パラジウム、チタンおよびクロムからなる群より少なくとも1種類以上が選択される(5)記載の遺伝子検出電界効果デバイス;
(7) ヒーターおよび温度センサが、さらに集積化されている(1)から(6)いずれか記載の遺伝子検出電界効果デバイス
(8) 上記(1)から(7)いずれか記載の遺伝子検出電界効果デバイスを用いて、遺伝子多型を解析する方法であって、以下のステップ:
(a)絶縁膜体に固定化されている核酸プローブと少なくとも目的遺伝子が含まれている試料溶液とを接触させることにより、絶縁膜体上で前記核酸プローブと前記目的遺伝子とをハイブリダイズさせるステップ;
(b)洗浄液を絶縁膜体上に導入して、未反応の前記目的遺伝子を除去するステップ;
(c)伸長反応における酵素であるタックDNAポリメラーゼ(Taq DNA polymerase)およ
び基質となるデオキシアデノシン三リン酸(dATP)、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、デオキシシチジン三リン酸(dCTP)、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)を絶縁膜体上に導入して伸長反応を行うステップ;
(d)洗浄液を絶縁膜体上に導入して、未反応の酵素および基質を除去するステップ;および
(e)緩衝液を絶縁膜体上に導入して、遺伝子検出電界効果デバイスの出力値を測定するステップ;
を含むことを特徴とする遺伝子多型解析方法;および
(9) ステップ(e)の出力値の測定は、野生型核酸プローブが固定化されている第1の遺伝子検出電界効果デバイスと絶縁膜体上に核酸プローブが固定化されていない第3の遺伝子検出電界効果デバイスとの差動出力値V1を測定し、また、変異型核酸プローブが固定化されている第2の遺伝子検出電界効果デバイスと前記第3の遺伝子検出電界効果デバイスとの差動出力値V2を測定し、V1がV2より大きいパターン(V1>V2)、V1とV2とが同程度で
あるパターン(V1≒V2)およびV1がV2より小さいパターン(V1<V2)の3種類のパターン
に分類して表示する(8)記載の遺伝子多型解析方法。
1から図13に沿って、この出願の発明の遺伝子検出電界効果デバイスとこれを用いた高精度なSNP解析の方法を説明する。
きる。
ることが好ましく、特に天然または人工オリゴヌクレオチドを使用する場合は、80個以下の塩基からなる核酸断片であることがより好ましい。
る。たとえば、アミノ基で化学修飾した核酸プローブ(5)を用いる場合は、絶縁膜体(2)の表面をアミノプロピルエトキシシラン、ポリリジン等で化学修飾して、絶縁膜体(2)表面にアミノ基を導入し、グルタルアルデヒドやフェニレンジイソシアネート(PDC
)と反応させ、前記のアミノ基で化学修飾した核酸プローブ(5)を絶縁膜体(2)表面に固定化する。
(1A)に加熱操作および/または冷却操作等の温度コントロールを施すことにより、前記目的遺伝子と核酸プローブ(5)とがハイブリダイズして形成された二本鎖サンプルのみを効率よく伸長反応させることができる。つまり、試料溶液(6)中に含まれる目的遺
伝子ではない遺伝子とは、固定化された核酸プローブ(5)とはハイブリダイズして二本鎖を形成することができないため、当然に伸長反応は促進されることはない。
ができる。
、測定される全キャパシタンスーCCは、絶縁膜体の容量と半導体基板表面の空乏層容量との和となるため、図中の符号Aに示した特性となる。半導体基板のシリコン中のエネルギ
ーバンドがフラットになる電圧をフラットバンド電圧といい、キャパシタンスー電圧特性を特徴付ける指標になる。そして、符号Aで示しているキャパシタンスー電圧特性のフラ
ットバンド電圧をVF1とする。絶縁膜体表面で核酸プローブと目的遺伝子がハイブリダイ
ズして二本鎖を形成すると、表面の負電荷密度が増大するので、キャパシタンスー電圧特性は電圧軸に沿って正方向にシフトし、図中の符号Bに示した特性となる。この時のフラ
ットバンド電圧をVF2とすると、フラットバンド電圧のシフト量ΔVF=VF2−VF1(矢印D)
は、絶縁膜体表面の電荷密度変化に依存するので、ΔVFを測定することにより、ハイブリダイゼーションを評価することができる。
面の負電荷がさらに増大する。つまり、キャパシタンスー電圧特性はさらに正方向にシフトし、図中の符号Cに示した特性になる。そして、この時のフラットバンド電圧をVF3とすると、フラットバンド電圧のシフト量ΔVF=VF3−VF1(矢印E)は、伸長反応による電荷密度変化の指標になり、ハイブリダイゼーションのみの時のシフト量よりも大きいため、高感度測定が可能になる。
スn型領域(9)、ドレインn型領域(10)を設けて、遺伝子検出電界効果トランジスタ
(1B)を構成した遺伝子検出電界効果デバイス(1A)を模式的に例示した断面図である。なお、遺伝子検出電界効果トランジスタ(1B)を単に遺伝子検出電界効果デバイス(1A)と表記することがある。
インn型領域(10)間の電流IDをドレイン電流計(12)で測定する。核酸プローブ(
5)は、ソースn型領域(9)、ドレインn型領域(10)間の絶縁膜体(2)表面(以後、この領域を「ゲート絶縁膜体領域(201)」と記すことがある)に固定化する。試料溶液(6)中に検出解析すべき目的遺伝子が含まれ、遺伝子検出電界効果トランジスタ(1B)のゲート絶縁膜体領域(201)上に目的遺伝子と相補的な塩基配列を有する核酸プローブ(5)が固定化されていると、目的遺伝子と核酸プローブ(5)が、ハイブリダイズして二本鎖を形成する。
アである正孔が蓄積する。一方、ソース、ドレインは、n型領域であるので、ソース、ド
レイン間電圧VDを印加すると、ソース、ドレインのどちらかに必ずpn接合の逆方向電圧が印加されるため、ドレイン電流IDは流れない(無視できるほど小さい)。
、半導体基板表面に誘起された電子の層で接続され、高い導電性を示してドレイン電流IDが流れ出すこととなる。ドレイン電流IDが流れ出すときのゲート電圧VGを閾値電圧VTといい、VG−ID特性を特徴づける指標となる。さらに、ゲート電圧VGを正の方向に印加していくと、半導体基板表面の電子密度が増加して、ドレイン電流IDは増加する。したがって、図4中の符号A'に示した特性となり、この時の閾値電圧をVT1とする。ゲート絶縁膜体表
面で、核酸プローブと目的遺伝子がハイブリダイズして二本鎖を形成すると、表面の負電荷密度が増大するので、VG−ID特性は電圧軸に沿って、正方向にシフトし、図4中の符号B'に示した特性となる。この時の閾値電圧をVT2とすると、閾値電圧のシフト量ΔVT=VT2
−VT1(矢印D')は、ゲート絶縁膜体領域表面の電荷密度変化に依存するので、ΔVTを測
定することにより、ハイブリダイゼーションを評価することができる。さらに、ゲート絶縁膜体領域表面でDNAの伸長反応を行わせると、二本鎖の長さが長くなるため表面の負電
荷がさらに増大する。したがって、VG−ID特性はさらに正方向にシフトし、図4中の符号C'に示した特性になる。この時の閾値電圧をVT3とすると、閾値電圧のシフト量ΔVT=VT3
−VT1は伸長反応による電荷密度変化の指標になり、ハイブリダイゼーションのみの時の
シフト量よりも大きいため、高感度な測定、すなわち検出が可能になる。
に相補的な塩基配列を有する核酸プローブ(野生型)を固定化させた状態、(B)は目的
遺伝子の塩基配列とは一塩基だけ異なる核酸プローブ(変異型)を固定化させた状態示し
ている。
の解析を高感度に、また、高精度に行うことができる。
02)の非固定化端部(504)における塩基は「G」であり、この箇所に対応する目的
遺伝子の塩基は「T」となっているため、結合は途中で停止し、二本鎖を形成することが
できない。一方、野生型核酸プローブ(501)の非固定化端部(504)における塩基は「A」であり、この箇所に対応する目的遺伝子の塩基「T」とは相補的な関係にあり、結合して二本鎖を形成することができる。
ともに、基質となるデオキシアデノシン三リン酸(dATP)、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、デオキシシチジン三リン酸(dCTP)、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)を用いて、DNAの伸長反応、あるいは、インターカレーター分子との反応等の分子生物学的反
応工程を絶縁膜体(2)表面上で引き続き行わせ、未反応の酵素や基質を洗浄する。その結果、DNA伸長反応等で生ずる表面電荷密度の変化を電界効果を利用して、半導体基板(
3)表面に静電的に誘起する電子(8)密度の変化を検出する。
それぞれの遺伝子検出電界効果デバイス(1A)の出力を比較することにより解析の対象となる目的遺伝子(601)の遺伝子型(つまり、SNP)を解析することができる。
)と変異型に対応する変異型核酸プローブ(502)とを別々に固定化させて、1種類の
試料溶液(6)に対して、同時にハイブリダイゼーションを行わせ、伸長反応を行わせることにより、一塩基多型(SNP)を高精度に測定することができる。
る。
を促進させるための温度コントロール手段として、ヒーター(15)をヒーター用n型領域として形成させ、また、温度センサ(16)は温度センサ用pn接合として形成させている。この時、一つの半導体基板(3)に複数個のpウェル(17)を形成させて、前記ヒ
ーター(15)および温度センサ(16)を集積化させている。遺伝子検出電界効果トランジスタ(1B)のゲート絶縁膜体領域(201)上には、野生型核酸プローブ(501)、変異型核酸プローブ(502)それぞれが固定化され、試料溶液(6)中の目的遺伝子(601)とハイブリダイゼーションおよび伸長反応を促進させて、高精度なSNP解析
を行うことができる。その際、ヒーター(15)および温度センサ(16)とを作動させて、半導体基板(3)近傍の試料温度を、ハイブリダイゼーション時には45℃、伸長反応時には62℃に設定し制御した。このように遺伝子検出電界効果トランジスタ(1B)に、温度コントロール手段として、ヒーター(15)および温度センサ(16)を集積化することにより、ハイブリダイゼーションおよび伸長反応時の温度を最適な値に設定することができ、より高精度の測定を行うことができる。
構造としたものを模式的に例示した断面図である。
システムを構築することができる。
)によりバルブ(30)中に分注し、フローセル(24)に導入して、遺伝子検出電界効果デバイス(1A)(遺伝子検出用電界効果トランジスタ)と反応させることができる。
検出電界効果デバイス(1A)(遺伝子検出用電界効果トランジスタ)と電気的に接続する。そして、反応後の遺伝子検出電界効果デバイス(1A)(遺伝子検出用電界効果トランジスタ)の出力は、信号処理回路(37)により処理/演算される。
際は、図13に例示したとおりの以下のステップで行われる。すなわち:
(1)洗浄液をフローセル中に導入;
(2)緩衝液をフローセル中に導入(洗浄液を置換);
(3)電界効果デバイスの温度を核酸プローブの最適温度に設定;
(4)各遺伝子検出用電界効果デバイスの出力値を測定、差の演算;
(5)試料をバルブに分注して、ハイブリダイゼーション液でフローセルに導入;
(6)フローセル中でハイブリダイゼーション;
(7)緩衝液をフローセルに導入して、未反応の試料を除去;
(8)各遺伝子検出用電界効果デバイスの出力値を測定、差の演算;
(9)酵素タックポリメラーゼ(Taq polymerase)、および基質となるdATP、dGTP、dCTP、dTTPの混合液をフローセルに導入し伸長反応;
(10)緩衝液を導入して未反応の酵素・基質を除去;
(11)各遺伝子検出用電界効果デバイスの出力値を測定、差の演算;
(12)フローセル中の試料温度を95℃に設定;
(13)洗浄液を導入して、フローセル中を洗浄;および
(14)(1)に戻る。
血液凝固遺伝子の一つであるFactorVII遺伝子には複数の一塩基多型(SNP)が存在することが知られている。そのうちの一つである-122部位のSNPは、野生型(正常)がチミン
(T)、変異型がシトシン(C)であることが知られている。このFactorVII遺伝子-122部
位のSNPを検出するために、野生型および変異型それぞれに対応する11塩基からなる2種類の核酸プローブを合成した。それらの塩基配列は以下のとおりであり、配列番号1は野生型核酸プローブを、配列番号2は変異型核酸プローブを示している。
野生型核酸プローブ:5'-CGTCCTCTGAA-3’(配列番号1)
変異型核酸プローブ:5'-CGTCCTCTGAG-3'(配列番号2)
本実施例においては、上記核酸プローブの3'末端側にSNP部位の塩基がくるように合成
した。すなわち、野生型核酸プローブでは3'末端の塩基がアデニン(A)であり、変異型
核酸プローブではグアニン(G)となっている。その他の塩基配列は野生型、変異型とも
にすべて同じであり、検出対象のFactorVII遺伝子にハイブリダイゼーションさせること
が
できる。一方、上記核酸プローブの5'末端側にはアミノ基を修飾して、ゲート絶縁膜体領域表面に固定化した。
と反応させ、シッフ塩基による結合を形成することにより、核酸プローブを窒化半導体基板表面に固定化させた。
を増幅した後、野生型核酸プローブ、変異型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタに導入して、45℃で8時間、ハイブリダイゼーションを行なった。ハイ
ブリダイゼーション後、緩衝液により洗浄して未反応の試料を除去した。
生型核酸プローブと変異型核酸プローブとで塩基配列が異なっているため、両者の解離温度(Tm)が異なり、ハイブリダイゼーション温度を制御することにより、二本鎖形成の選択性を高めることができた。
伸長反応を行った。前記図6に例示したとおり、野生型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタでは、野生型(正常型)の目的遺伝子を含む試料の導入により末端を含めて完全相補鎖の二本鎖を形成するため、伸長反応により二本鎖が合成された。この伸長反応により野生型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタの出力が20mV変化した。一方、変異型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタでは、3’末端の塩基が結合せず開いた形のため、伸長反応が起こらない。
したがって、変異型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタの出力は、ほとんど変化しなかった(およそ、1mVの変化)。
含む試料を導入した場合は、両方の遺伝子検出電界効果トランジスタの出力が変化し、野生型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタの出力は12mVの変化を示し、変異型核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタの出力は10mVの変化を示した。
らに、野生型と変異型の核酸プローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタの出力変化の大きさを比較することにより、野生型のホモザイゴート(homozygote)、野生型と変異型のヘテロザイゴート(heterozygote)、変異型のホモザイゴートを識別することができ、遺伝子型(genotype)を検出することができることが確認された。
実施例2:FactorVII遺伝子におけるSNP検出において、ペプチド核酸(Peptide Nucleotide Acid, PNA)を用いた場合
上記の実施例1において、遺伝子検出電界効果トランジスタのゲート絶縁膜体領域上に固定化される核酸プローブとして、ペプチド核酸(Peptide Nucleotide Acid, PNA)を用いると、より安定性の高い二本鎖核酸が形成される。
ブを固定化したトランジスタの出力は23mV変化したのに対して、変異型PNAプローブを固
定化したトランジスタの出力は4mVの変化であった。また、野生型と変異型のヘテロザイ
ゴート(heterozygote)試料の場合、野生型、変異型PNAプローブが固定化された遺伝子
検出電界効果トランジスタの出力は、それぞれ15mV、13mVであり、野生型、変異型ともに検出することができた。
子検出電界効果トランジスタの出力は、2mVとほとんど変化を示さなかったのに対して、
変異型PNAプローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタの出力は、19mVの変
化であった。
野生型と変異型との混合ヘテロザイゴート、変異型ホモザイゴートを識別することができ、目的遺伝子の遺伝子型(genotype)を検出することができることが確認された。
おらず中性のため、核酸プローブと目的遺伝子との間の静電反発が無く、ゲート絶縁膜体上で、強固な二本鎖核酸を形成することができる。また、核酸プローブを形成した遺伝子検出用電界効果デバイスと核酸プローブを形成しない参照用の遺伝子検出用電界効果デバイスを用いて差動測定を行う場合、電荷が中性のPNAを用いると遺伝子検出用と参照用の
電界効果デバイスの間でフラットバンド電圧や閾値電圧の変化が無く、高精度の差動測定を行うことができ、特に電荷検出型の遺伝子検出用電界効果デバイスには有効であることを意味する。
検出およびジェノタイピング(genotyping)では、ゲート絶縁膜体上への試料導入、ハイブリダイゼーション、伸長反応の各プロセスの進行中、常時電位計測を行い反応の進行を
モニタリングすることができる。
ジェノタイピングを行うことができる。また、本実施例では伸長反応に伴う塩基の合成を電荷の増加量として検出するため、核酸プローブと試料核酸の塩基長および伸長合成される塩基長を最適化することにより高感度に核酸を検出することができる。
実施例3:アルコールデヒドロギナーゼ関連遺伝子のSNP検出
アルコールデヒドロギナーゼ関連遺伝子には、一塩基多型(SNP)が存在することが知
られている。そのSNP部位が、3'末端の塩基となるように核酸プローブを設計した。野生
型はSNP部位の塩基がチミン(T)、変異型はシトシン(C)であり、それぞれに対応する
核酸プローブの塩基配列を以下に示した。なお、本実施例における野生型核酸プローブは配列番号3に示し、変異型核酸プローブ配列番号4に示した。
野生型核酸プローブ:5'-CATACACTA-3'(配列番号3)
変異型核酸プローブ:5'-CATACACTG-3'(配列番号4)
なお、本実施例は、基本的な構成や実験手順は、上記実施例1および実施例2と略同様である。
ーブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタおよび(B)に示した変異型核酸プ
ローブが固定化された遺伝子検出電界効果トランジスタを用いた。本実施例では、遺伝子検出電界効果トランジスタのゲート絶縁膜体には金属電極を形成させ、上記核酸プローブの5'末端をチオール基で修飾し、直接金属電極と結合を形成させることにより、核酸プローブをゲート絶縁膜体領域表面に固定化させた。本実施例において、金属電極として、クロム薄膜の上に金を積層した構造を用いた。
ーション後、緩衝液で洗浄して未反応の試料を除去した。
。
)。
電荷としての性質を利用した。本実施例では、インターカレーターとして、Hoechst33258を用いた。
別する遺伝子型の検出を行うことができる。
1B、1B’ 遺伝子検出電界効果トランジスタ
1C 遺伝子検出電界効果トランジスタアレイ
2 絶縁膜体
201 ゲート絶縁膜体領域
3 半導体基板
4 参照電極
5 核酸プローブ
501 野生型核酸プローブ
502 変異型核酸プローブ
503 固定化端部
504 非固定化端部
6 試料溶液
601 目的遺伝子
7 ゲート電極
8 電子
9 ソースn型領域
10 ドレインn型領域
11 ドレイン電極
12 ドレイン電流計
13 金属電極
14 インターカレーター
15 ヒーター
16 温度センサ
17 pウェル
18 シリコン基板
19 絶縁膜体
20 熱伝導性物質
21 開口部
22 銅板
23 ペルチエ素子
24 フローセル
25 流路
26 試料
27 試薬
28 緩衝液
29 洗浄液
30 バルブ
31 ポンプ
32 分注器
33 廃液ボトル
34 参照電極
35 3M KCl溶液
36 液−液接合
37 信号処理回路
38 プリント基板
39 ワイヤー
40 ピン
41 保護キャップ
Claims (9)
- 絶縁膜体、半導体基板および参照電極が備えられている遺伝子解析電界効果デバイスであって、以下の構成:
(a)絶縁膜体は、その一方の面側に核酸プローブが固定化されているとともに、少なくとも1種類の目的遺伝子が含まれる試料溶液に接触されていること;
(b)半導体基板は、前記絶縁膜体の他方の面側に当接設置されていること;および
(c)参照電極は、前記試料溶液中に備えられていること;
を含んでなることを特徴とする遺伝子検出電界効果デバイス。 - 請求項1記載の遺伝子検出電界効果デバイスが、少なくとも2つ以上備えられており、かつ、これら遺伝子検出電界効果デバイスそれぞれの絶縁膜体上には目的遺伝子の塩基配列と相補的な塩基配列を有する野生型(正常型)核酸プローブと、目的遺伝子の塩基配列と非相補的な塩基配列を有する変異型核酸プローブの少なくとも2種類以上の核酸プローブが固定化されてなることを特徴とする遺伝子検出電界効果デバイス。
- 変異型核酸プローブは、核酸プローブが絶縁膜体上に固定化されていない端部である非固定化端部における塩基が、野生型核酸プローブの非固定化端部における塩基と異なっている請求項2記載の遺伝子検出電界効果デバイス。
- 核酸プローブは、オリゴヌクレオチド、相補的DNA(cDNA)およびペプチド核酸(PNA)からなる群より少なくとも1種類以上が選択される請求項1から3いずれか記載の遺伝子検出電界効果デバイス。
- 核酸プローブは、金属電極を介して固定化されている請求項1から4いずれか記載の遺伝子検出電界効果デバイス。
- 金属電極は、白金、金、銀、パラジウム、チタンおよびクロムからなる群より少なくとも1種類以上が選択される請求項5記載の遺伝子検出電界効果デバイス。
- ヒーターおよび温度センサが、さらに集積化されている請求項1から6いずれか記載の遺伝子検出電界効果デバイス。
- 請求項1から7いずれか記載の遺伝子検出電界効果デバイスを用いて、遺伝子多型を解析する方法であって、以下のステップ:
(a)絶縁膜体に固定化されている核酸プローブと少なくとも目的遺伝子が含まれている試料溶液とを接触させることにより、絶縁膜体上で前記核酸プローブと前記目的遺伝子とをハイブリダイズさせるステップ;
(b)洗浄液を絶縁膜体上に導入して、未反応の前記目的遺伝子を除去するステップ;
(c)伸長反応における酵素であるタックDNAポリメラーゼ(Taq DNA polymerase)およ
び基質となるデオキシアデノシン三リン酸(dATP)、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、デオキシシチジン三リン酸(dCTP)、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)を絶縁膜体上に導入して伸長反応を行うステップ;
(d)洗浄液を絶縁膜体上に導入して、未反応の酵素および基質を除去するステップ;および
(e)緩衝液を絶縁膜体上に導入して、遺伝子検出電界効果デバイスの出力値を測定するステップ;
を含むことを特徴とする遺伝子多型解析方法。 - ステップ(e)の出力値の測定は、野生型核酸プローブが固定化されている第1の遺伝
子検出電界効果デバイスと絶縁膜体上に核酸プローブが固定化されていない第3の遺伝子検出電界効果デバイスとの差動出力値V1を測定し、また、変異型核酸プローブが固定化されている第2の遺伝子検出電界効果デバイスと前記第3の遺伝子検出電界効果デバイスとの差動出力値V2を測定し、V1がV2より大きいパターン(V1>V2)、V1とV2とが同程度であ
るパターン(V1≒V2)およびV1がV2より小さいパターン(V1<V2)の3種類のパターンに
分類して表示する請求項8記載の遺伝子多型解析方法。
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