CN109839732B - 一种笼式结构激光扫描共聚焦显微成像***及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种笼式结构激光扫描共聚焦显微成像***及方法，主要包括：三维精密样品台、显微物镜、荧光显微镜筒、笼式结构光机组件、激光器、单模光纤、光纤分束器、二向色镜、滤光片、成像CCD、单光子探测器、脉冲计数器、符合仪等。显微***主体采用稳定的笼式结构，由易安装的笼式结构光机组件组装而成，可对不同波长的激发激光和荧光做出优化；使用单模光纤进行空间滤波；使用单光子探测器和脉冲计数器对单光子水平的微弱荧光信号进行探测；使用符合仪对荧光光源进行单光子性质分析。本发明具有集成度高、占用体积小、易于安装与调试、操作和维护简便等优点，可以用于微弱荧光信号的高精度成像、单光子源的高效率收集与信号分析。

Description

一种笼式结构激光扫描共聚焦显微成像***及方法

技术领域

本发明涉及一种光学显微成像领域，尤其涉及一种笼式结构激光扫描共聚焦显微成像***及方法。

背景技术

激光共聚焦显微镜是一种研究荧光成像以及微弱荧光信号收集、探测和信号分析的常用科研设备，也在生物医学和工业检测等领域具有广泛的应用。针对一些微弱荧光信号的探测和分析，收集效率和探测效率至关重要。

目前商用的激光共聚焦显微镜一般结构比较复杂，占用空间体积较大，光学元件过多从而降低了荧光信号的收集效率和探测效率。本发明提供的一种基于笼式结构的激光扫描共聚焦显微成像***旨在最大程度上减少如反射镜和透镜之类的光学元件的使用，简化显微镜的结构设计，从而较大幅度提高荧光的收集效率和探测效率，同时减小设备的空间占用体积。本发明采用易于组装和拆卸的笼式结构光机组件，可以方便快捷地针对不同波长的扫描激光和荧光做出优化调整。本发明使用单模光纤进行空间滤波，提高荧光显微成像的信噪比，荧光通过单模光纤耦合进单光子探测器进行荧光成像，或者耦合进入光栅光谱仪进行光谱分析，或者耦合进用户自定义的光学***或光电***做进一步的分析和使用。本发明所描述的一种笼式结构激光扫描共聚焦显微成像***能同时满足高荧光收集效率和通用性的要求。

发明内容

本发明的技术解决问题：克服现有技术的不足，提供一种笼式结构激光扫描共聚焦显微成像***及方法，使用三维压电陶瓷位移台自动扫描样品，荧光成像精度高；使用单模光纤或者微型针孔进行空间滤波，滤掉杂散光和部分背景光，提高荧光显微成像的信噪比；本发明采用易于组装和拆卸的笼式结构部件，可以方便快捷地针对不同波长的扫描激光和荧光做出优化调整。

本发明是通过如下方式实现的：

一种笼式结构激光扫描共聚焦显微成像***，包括：三维精密样品台、显微物镜、荧光显微镜筒、笼式结构光机组件、激光器、单模光纤、光纤分束器、二向色镜、滤光片、成像CCD、单光子探测器、脉冲计数器和符合仪；其中，

三维精密样品台：实现对样品的电控三维高精度扫描；用螺栓固定在光学平台或者封装底座上，位于笼式结构激光扫描共聚焦显微成像***的底部；

显微物镜：实现对用于激发样品的入射扫描激光的聚焦，同时也实现了对样品辐射荧光的收集；位于三维精密样品台上侧，固定在笼式结构显微镜筒下侧；

荧光显微镜筒：实现将入射激光聚焦到样品上，并对荧光信号的收集并耦合进单模光纤；位于显微物镜上侧，用安装架固定在光学平板或者封装底座上；

笼式结构光机组件：实现对光学元件的固定和连接；

激光器：实现对样品的光学激发，通过入射模块的单模光纤将激光器发出的激光耦合进入该***的激光入射模块；位于光学平板或者封装底座上；

单模光纤：实现将入射激光耦合进该成像***以及耦合收集端的荧光信号进入光纤分束器；在激光入射模块尾端和荧光收集模块尾端各有一根单模光纤；

光纤分束器：实现对荧光信号的分束；与荧光收集端口的单模光纤尾端通过光纤法兰连接，固定在光学平台或者封装底座上；

二向色镜：实现对入射激光的反射，将入射激光反射到显微物镜的尾端，用于对样品荧光的激发，同时也实现了对样品辐射荧光的透射，目的在于过滤掉入射激光；位于显微物镜上侧；

滤光片：实现进一步地过滤激光信号，增强荧光信号的信噪比；位于二向色镜上侧；

成像CCD：实现对样品表面形貌的成像，用于观察和定位样品表面的结构单元和研究区域；位于荧光显微镜筒的左侧，固定在显微镜悬臂上侧；

单光子探测器：实现对单光子水平的微弱荧光信号的光子计数；两个单光子探测器分别与光纤分束器的两个尾端连接，固定在光学平台或者安装底座上；

脉冲计数器：实现对单光子探测器信号的读出；脉冲计数器与其中一个单光子探测器连接，位于光学平台上或者控制器机箱内；

符合仪：实现对两路单光子探测器信号的符合测量，用于分析荧光光源的单光子性质；位于光学平台上或者控制器机箱内。

所述激光扫描共聚焦显微***主体采用稳定的笼式结构，由笼式结构光机组件组装而成，可方便快捷地针对不同波长的扫描激光和荧光做出优化调整。

所述三维精密样品台由一个行程为15毫米的大行程的稳定的三维机械位移台和一个精度为1纳米的高精度的三维压电陶瓷位移台组成，三维机械位移台用螺栓固定在工作平台或封装底座上，压电陶瓷位移台用螺栓固定在机械位移台上，样品安装平板固定在压电陶瓷位移台上，该组合式的三维精密样品台兼具稳定性高、行程大、精度高的优点。

所述三维压电陶瓷位移台与压电陶瓷驱动器连接，驱动器与计算机连接，用计算机精确地控制样品台扫描范围、步距和速率。

所述荧光显微镜筒由水平方向的激光入射模块和竖直方向的荧光收集模块组成，二者相互垂直，独立调节；激光器发射的激光由单模光纤耦合到激光入射模块，经二向色镜反射到显微物镜尾端，入射激光经显微物镜聚焦到样品上；样品辐射的荧光信号通过同一个显微物镜形成***行光，出射荧光透过二向色镜和滤光片，最后通过荧光收集模块耦合进单模光纤。

所述激光入射模块和荧光收集模块分别由光纤转接板、非球面透镜、XY二维平移调节架、Z轴平移安装座、二维光学调整架、笼式装配支杆、笼式结构转接件等装配而成；水平方向的激光入射模块和竖直方向的荧光收集模块相互垂直，独立调节；入射激光的入射方向、空间位置，以及束腰位置和大小通过激光入射模块方便地调节；荧光收集模块通过调节XY二维平移调节架和Z轴平移安装座来优化和提高耦合效率。

所述荧光收集模块顶部有光纤转接板，光纤转接板与单模光纤连接，将荧光信号耦合进单模光纤，以便后续荧光强度探测、光谱分析、单光子源性质分析以及单光子源的应用。

所述荧光收集模块顶部的单模光纤对荧光进行空间滤波，滤除杂散光和部分背景信号，以提高荧光信号的信噪比；同时，单模光纤耦合输出更加方便于后续荧光强度探测、光谱分析、单光子源性质分析以及单光子源的应用。

所述荧光收集模块顶部的单模光纤与光纤分束器相连接，光纤分束器的两个输出端口分别与两个单光子探测器连接，其中一个单光子探测器的信号输出端口与脉冲计数器信号输入端口通过BNC连接线连接，脉冲计数器通过USB与计算机连接，用于实时探测和显示荧光强度。

所述两个单光子探测器的信号输出端口分别与符合仪的两个信号输入端口通过BNC连接线相连接，符合仪通过USB与计算机连接，用于测量和分析单光子源的性质。

本发明的一种笼式结构激光扫描共聚焦显微方法，实现步骤如下：

激光器发射的激光通过激光入射模块尾端的单模光纤耦合到共聚焦显微***，通过调节水平方向的激光入射模块中的XY二维平移调节架和二维光学调整架来控制入射激光的入射方向和空间位置，通过调节Z轴平移安装座来控制入射激光的束腰位置和大小；激光经过左侧的二向色镜后反射到下侧的显微物镜尾端，最后激光束被显微物镜聚焦到固定在三维精密样品台上的样品表面；样品辐射的荧光经过同一个显微物镜收集并转换成***行光，然后透过二向色镜，荧光方向为竖直向上的方向；如果需要表征样品表面的形貌或者定位研究区域，则***成像CCD右侧的反射镜，手动调整三维位移台中的机械位移台来大范围，即15毫米移动样品，通过成像CCD和计算机实时成像样品表面形貌，如果需要收集荧光并做后续的信号分析，则拔出成像CCD右侧的反射镜；荧光信号经过滤光片进一步过滤掉激光和杂散光之后进入竖直方向的荧光收集模块，通过调节二维光学调整架、Z轴平移安装座、XY二维平移调节架等光机组件来快速地优化荧光信号耦合进单模光纤的耦合效率；荧光收集模块上的单模光纤另一端与光纤分束器通过光纤法兰对接，光束被一分为二，光纤分束器的两个输出端分别连接到两个单光子探测上，其中一个单光探测器的信号输出端口与脉冲计数器连接，脉冲计数器与计算机连接，通过计算机可以实时显示和分析样品辐射的荧光强度信号，并可以记录和存储荧光强度的变化；通过计算机对三维位移台上的三维压电陶瓷位移台的控制来精细扫描样品，再配合脉冲计数器实时记录每个光斑下的荧光在积分时间内的荧光强度，从而实现对样品表面荧光的二维高精度成像；两个单光子探测器分别与符合仪的两个信号输入端口连接，符合仪与计算机连接，通过符合仪和计算机分析荧光光源的单光子性质；荧光收集模块尾端的单模光纤将收集到的荧光耦合到用户的光谱仪进行光谱分析，也可以耦合到用户自定义的光学或光电***进行使用和分析。

本发明与现有技术相比的优点在于：

本发明最大程度上减少如反射镜和透镜之类的光学元件的使用，简化了显微镜的结构设计，从而较大幅度提高荧光的收集效率和探测效率，同时减小设备的空间占用体积。本发明采用易于组装和拆卸的笼式结构光机组件，可以方便快捷地针对不同波长的扫描激光和荧光做出优化调整。本发明具有集成度高、占用体积小、易于安装与调试、操作和维护简便等突出优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见，下面描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。

图1为本发明一实施例提供的是装置结构示意图；

图2为本发明一实施例提供的是荧光信号分析流程图。

具体实施方式

下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。

根据附图1-2所示，对本发明进一步说明：

图1为本发明一实施例提供的装置结构示意图。如图1所示，

所述显微物镜上侧是笼式结构的荧光显微镜筒，该显微镜筒由水平方向的激光入射模块和竖直方向的荧光收集模块组成，二者相互垂直，可独立调节；激光器发射的激光由单模光纤1耦合到激光入射模块，经二向色镜10反射到显微物镜15尾端，入射激光8经显微物镜15聚焦到样品上；样品辐射的荧光信号21通过同一个显微物镜15形成***行光，出射荧光透过二向色镜10和滤光片24，最后通过荧光收集模块耦合进单模光纤28；

所述激光入射模块由单模光纤1、光纤转接件2、XY二维平移调节架3、非球面透镜4、Z轴平移安装座5、笼式装配支杆6、二维光学调整架7、笼式结构转接件等装配而成；单模光纤1与光纤转接件2相连接，光纤转接件2固定在XY二维平移调节架3上，非球面透镜4固定在Z轴平移安装座5上；入射激光8的入射方向和空间位置可通过XY二维平移调节架3和二维光学调整架7进行调节，入射激光8的束腰位置和大小可以通过Z轴平移安装座5进行调节；XY二维平移调节架3、Z轴平移安装座5、二维光学调整架7通过笼式装配支杆6连接和固定；

所述激光入射模块固定在笼式立方体9的右侧；

所述二向色镜10固定在笼式立方体9的内部；

所述笼式立方体9通过安装架11固定在显微镜悬臂12上侧；

所述显微镜悬臂12用螺栓固定在支撑杆13上，支撑杆13固定在工作台或封装底座上；

所述笼式立方体9和二向色镜10的下侧是固定在笼式结构光机组件14上的显微物镜15，显微物镜15用于聚焦激发样品的激光束8，同时也用于收集样品辐射的荧光信号21；

所述显微物镜15下侧是三维精密样品台，三维精密样品台由一个大行程的稳定的三维机械位移台18和一个高精度的三维压电陶瓷位移台17组成，三维机械位移台用螺栓固定在工作平台或封装底座上，压电陶瓷位移台17用螺栓固定在机械位移台18上，样品安装平板16固定在压电陶瓷位移台17上，该组合式的三维精密样品台兼具稳定性高、行程大、精度高等优点；

所述笼式立方体9和二向色镜10的左上侧是样品成像CCD 19，成像CCD 19用于样品表面形貌成像，以便观察和定位样品表面的结构单元和研究区域；成像CCD 19通过支杆固定在显微镜悬臂12上侧；

所述成像CCD 19的右侧是可选的45°反射镜20，需要观测样品表面形貌或者观察和定位样品表面结构单元时将反射镜20***显微镜筒，当需要荧光成像和收集时拔出反射镜20；

所述笼式立方体9和45°反射镜20上侧是荧光收集模块；

所述荧光收集模块由单模光纤28、光纤转接件27、XY二维平移调节架26、消色差非球面透镜22、Z轴平移安装座25、笼式装配支杆、二维光学调整架23、笼式结构转接件等装配而成；单模光纤28与光纤转接件27相连接，光纤转接件27固定在XY二维平移调节架26上，消色差非球面透镜22固定在Z轴平移安装座25上；通过调节二维光学调整架23、Z轴平移安装座25、XY二维平移调节架26可以快速地优化荧光信号21耦合进单模光纤28的耦合效率；

所述二维光学调整架23上侧是滤光片24，用于滤除激光信号；

进一步的，滤光片24可以使用长通滤光片、带通滤光片和短通滤光片进行组合，滤出感兴趣的波长范围内的荧光信号；

图2为本发明一实施例提供的是荧光信号分析流程图。如图2所示，

所述三维压电陶瓷位移台201与压电陶瓷驱动器202连接，驱动器202与计算机203连接，用计算机203精确地控制三维压电陶瓷位移台201的扫描范围、步距和速率；

所述荧光收集模块顶部的单模光纤与光纤分束器204连接，光纤分束器204的两个输出端口分别与单光子探测器205和单光子探测器206相连接；

所述单光子探测器205的信号输出端口与脉冲计数器207信号输入端口连接，脉冲计数器207通过USB与计算机203连接，用于实时探测和显示荧光强度；

所述单光子探测器205和单光子探测器206的信号输出端口分别与符合仪208的两个信号输入端口相连接，符合仪208与计算机203连接，用于测量和分析单光子源的性质。

Claims (10)

1.一种笼式结构激光扫描共聚焦显微成像***，其特征在于，所述激光扫描共聚焦显微***主体采用笼式结构；

所述***，包括：三维精密样品台、显微物镜、荧光显微镜筒、光机组件、激光器、单模光纤、光纤分束器、二向色镜、滤光片、成像CCD、单光子探测器、脉冲计数器和符合仪；其中，

三维精密样品台：对样品的电控三维高精度扫描；用螺栓固定在光学平台或者封装底座上，位于笼式结构激光扫描共聚焦显微成像***的底部；

显微物镜：对用于激发样品的入射扫描激光的聚焦，同时也对样品辐射荧光的收集；位于三维精密样品台上侧，固定在笼式结构显微镜筒下侧；

荧光显微镜筒：将入射激光聚焦到样品上，并对荧光信号的收集并耦合进单模光纤；位于显微物镜上侧，用安装架固定在光学平板或者封装底座上；

光机组件：对光学元件的固定和连接；

激光器：实现对样品的光学激发，通过入射模块的单模光纤将激光器发出的激光耦合进入该***的激光入射模块；位于光学平板或者封装底座上；

单模光纤：实现将入射激光耦合进该成像***以及耦合收集端的荧光信号进入光纤分束器；在激光入射模块尾端和荧光收集模块尾端各有一根单模光纤；

光纤分束器：对荧光信号的分束；与荧光收集端口的单模光纤尾端通过光纤法兰连接，固定在光学平台或者封装底座上；

二向色镜：对入射激光的反射，将入射激光反射到显微物镜的尾端，用于对样品荧光的激发，同时也实现了对样品辐射荧光的透射，目的在于过滤掉入射激光；位于显微物镜上侧；

滤光片：过滤激光信号，增强荧光信号的信噪比；位于二向色镜上侧；

成像CCD：实现对样品表面形貌的成像，用于观察和定位样品表面的结构单元和研究区域；位于荧光显微镜筒的左侧，固定在显微镜悬臂上侧；

单光子探测器：对单光子水平的微弱荧光信号的光子计数；两个单光子探测器分别与光纤分束器的两个尾端连接，固定在光学平台或者安装底座上；

脉冲计数器：对单光子探测器信号的读出；脉冲计数器与其中一个单光子探测器连接，位于光学平台上或者控制器机箱内；

符合仪：对两路单光子探测器信号的符合测量，用于分析荧光光源的单光子性质；位于光学平台上或者控制器机箱内。

2.根据权利要求1所述的一种笼式结构激光扫描共聚焦显微***，其特征在于：所述三维精密样品台由一个行程为15毫米的大行程的稳定的三维机械位移台和一个精度为1纳米的高精度的三维压电陶瓷位移台组成，三维机械位移台用螺栓固定在工作平台或封装底座上，压电陶瓷位移台用螺栓固定在机械位移台上，样品安装平板固定在压电陶瓷位移台上。

3.根据权利要求2所述的一种笼式结构激光扫描共聚焦显微***，其特征在于：所述三维压电陶瓷位移台与压电陶瓷驱动器连接，驱动器与计算机连接，用计算机精确地控制样品台扫描范围、步距和速率。

4.根据权利要求1所述的一种笼式结构激光扫描共聚焦显微***，其特征在于：所述荧光显微镜筒由水平方向的激光入射模块和竖直方向的荧光收集模块组成，二者相互垂直，独立调节；激光器发射的激光由单模光纤耦合到激光入射模块，经二向色镜反射到显微物镜尾端，入射激光经显微物镜聚焦到样品上；样品辐射的荧光信号通过同一个显微物镜形成***行光，出射荧光透过二向色镜和滤光片，最后通过荧光收集模块耦合进单模光纤。

5.根据权利要求4所述的一种笼式结构激光扫描共聚焦显微***，其特征在于：所述激光入射模块和荧光收集模块分别由光纤转接板、非球面透镜、XY二维平移调节架、Z轴平移安装座、二维光学调整架、笼式装配支杆、笼式结构转接件等装配而成；水平方向的激光入射模块和竖直方向的荧光收集模块相互垂直，独立调节；入射激光的入射方向、空间位置，以及束腰位置和大小通过激光入射模块方便地调节；荧光收集模块通过调节XY二维平移调节架和Z轴平移安装座来优化和提高耦合效率。

6.根据权利要求4所述的一种笼式结构激光扫描共聚焦显微***，其特征在于：所述荧光收集模块顶部有光纤转接板，光纤转接板与单模光纤连接，将荧光信号耦合进单模光纤，以便后续荧光强度探测、光谱分析、单光子源性质分析以及单光子源的应用。

7.根据权利要求4 所述的一种笼式结构激光扫描共聚焦显微***，其特征在于：所述荧光收集模块顶部的单模光纤对荧光进行空间滤波，滤除杂散光和部分背景信号，以提高荧光信号的信噪比；同时，单模光纤耦合输出更加方便于后续荧光强度探测、光谱分析、单光子源性质分析以及单光子源的应用。

8.根据权利要求4所述的一种笼式结构激光扫描共聚焦显微***，其特征在于：所述荧光收集模块顶部的单模光纤与光纤分束器相连接，光纤分束器的两个输出端口分别与两个单光子探测器连接，其中一个单光子探测器的信号输出端口与脉冲计数器信号输入端口通过BNC连接线连接，脉冲计数器通过USB与计算机连接，用于实时探测和显示荧光强度。

9.根据权利要求1所述的一种笼式结构激光扫描共聚焦显微***，其特征在于：所述两个单光子探测器的信号输出端口分别与符合仪的两个信号输入端口通过BNC连接线相连接，符合仪通过USB与计算机连接，用于测量和分析单光子源的性质。

10.一种笼式结构激光扫描共聚焦显微方法，其特征在于，实现如下：

激光器发射的激光通过激光入射模块尾端的单模光纤耦合到共聚焦显微***，通过调节水平方向的激光入射模块中的XY二维平移调节架和二维光学调整架来控制入射激光的入射方向和空间位置，通过调节Z轴平移安装座来控制入射激光的束腰位置和大小；激光经过左侧的二向色镜后反射到下侧的显微物镜尾端，最后激光束被显微物镜聚焦到固定在三维精密样品台上的样品表面；样品辐射的荧光经过同一个显微物镜收集并转换成***行光，然后透过二向色镜，荧光方向为竖直向上的方向；如果需要表征样品表面的形貌或者定位研究区域，则***成像CCD右侧的反射镜，手动调整三维位移台中的机械位移台来大范围，即15毫米移动样品，通过CCD和计算机实时成像样品表面形貌，如果需要收集荧光并做后续的信号分析，则拔出成像CCD右侧的反射镜；荧光信号经过滤光片进一步过滤掉激光和杂散光之后进入竖直方向的荧光收集模块，通过调节二维光学调整架、Z轴平移安装座、XY二维平移调节架等光机组件来快速地优化荧光信号耦合进单模光纤的耦合效率；荧光收集模块上的单模光纤另一端与光纤分束器通过光纤法兰对接，光束被一分为二，光纤分束器的两个输出端分别连接到两个单光子探测上，其中一个单光探测器的信号输出端口与脉冲计数器连接，脉冲计数器与计算机连接，通过计算机可以实时显示和分析样品辐射的荧光强度信号，并可以记录和存储荧光强度的变化；通过计算机对三维位移台上的三维压电陶瓷位移台的控制来精细扫描样品，再配合脉冲计数器实时记录每个光斑下的荧光在积分时间内的荧光强度，从而实现对样品表面荧光的二维高精度成像；两个单光子探测器分别与符合仪的两个信号输入端口连接，符合仪与计算机连接，通过符合仪和计算机分析荧光光源的单光子性质；荧光收集模块尾端的单模光纤将收集到的荧光耦合到用户的光谱仪进行光谱分析，也可以耦合到用户自定义的光学或光电***进行使用和分析。