JP2005068057A - グリア瘢痕形成抑制剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】
ヘパリン又はヘパリン誘導体を有効成分とする本発明抑制剤を用いることにより、アストロサイトから分泌されるFGF-2等のアストロサイトの形態変化作用を有する物質の同作用を抑制し、あるいはアストロサイトの活性化を抑制することにより、形態変化を起こして細くなったグリア細胞同士が細胞間架橋により接着し、集合体を形成することによるグリア瘢痕形成を有効に抑制する。
【選択図】なし
Description
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
ヘパリン又はヘパリン誘導体を有効成分として含有するグリア瘢痕形成抑制剤。
<ヘパリン又はヘパリン誘導体>
本発明で用いることができるヘパリンの由来は特に限定されず、ブタ、ウシ等の哺乳動物の臓器(腸、肺、肝、腎、血管等)から抽出、精製されたヘパリンを用いることができる。
また、本発明で用いられるヘパリン誘導体は、特には限定されないが、例えば、ヘパリンを低分子化したヘパリンオリゴ糖、ヘパリンの水酸基に結合した硫酸基を脱硫酸化した脱硫酸化ヘパリン、低分子化したヘパリンを同様に脱硫酸化した脱硫酸化ヘパリンオリゴ糖などが挙げられる。
また、ヘパリン又はヘパリンオリゴ糖のウロン酸残基の2位のヒドロキシル基に結合した硫酸基の脱硫酸化方法としては、ウロン酸残基の2位のヒドロキシル基に結合した硫酸基を選択的又は特異的に脱硫酸化することができる方法であれば、特に限定されない。
本発明のアストロサイトの形態変化作用を有する物質の該作用抑制剤(以下、「本発明抑制剤1」という)について説明する。
本発明のアストロサイト活性化抑制剤(以下、「本発明抑制剤2」という)について説明する。
ここで、アストロサイト活性化とは、FGF-2等の成長因子に代表される、グリア細胞により自己分泌されたアストロサイト形態変化作用物質により、アストロサイトが活性化して形態変化(トランスフォーム)を起こすこと意味するものである。
本発明のグリア瘢痕形成抑制剤(以下、「本発明抑制剤3」という)について説明する。
ここで、グリア瘢痕形成とは、FGF-2等のグリア細胞により自己分泌されたアストロサイト形態変化作用物質により、アストロサイトが活性化して形態変化を起こし、細胞面積が減少して細くなったアストロサイト同士が、細胞間架橋により接着して集合体を形成することを意味する。
また、以上の本発明抑制剤を生体に投与して、投与された生体の中枢神経疾患において、アストロサイトが成長因子等によって形態変化することを防いだり、アストロサイトが活性化することを防いだり、グリア瘢痕の形成を抑制することにより、同疾患の治療、予防、進展抑制を行うための医療用の薬剤として使用することができる。投与する際の剤型および投与経路は、対象となる疾患の性質や重篤度に応じて適宜選択することができる。例えば、それらをそのまま、または他の薬理学的に許容され得る担体、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤等と共に製剤化し、例えば、散剤、顆粒剤、細粒剤、ドライシロップ剤、液剤、錠剤、カプセル剤、注射剤、座剤、膣剤、軟膏剤、ゲル剤、スプレー剤等経口的または非経口的に安全に投与することができる。特に、座剤、膣剤、軟膏剤、ゲル剤、スプレー剤として非経口的に投与することが好ましい。
すなわち、本発明抑制剤は、生体に投与する薬剤としてだけでなく、再生医療、神経科学の研究等、各種の用途に使用することができる。
〈試験例1〉
DMEMハイグルコース培地の調製
DMEMハイグルコース培地は以下のように調製した。
アストロサイトの細胞培養
生後1〜2日のラットより脳を取り出し、冷却滅菌PBS中で小脳、中脳、髄膜を取り除き大脳皮質を得た。10匹分の大脳皮質を60 mmのデッシュ上で外科用メスで縦横に細切し、10 mlリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を二回加えて大脳皮質切片を50 mlのファルコンチューブに回収した。500 rpmで1分の遠心分離をしてPBS上清を除いた。細胞沈差に対し12 unit/ml パパイン(Papain)溶液を5〜6 ml添加した後、37℃にて10 min保温し酵素消化した。このパパイン消化処理を再度繰り返した後、パパイン溶液を除去した。次いで、DMEMハイグルコース培地を添加・細胞自然沈降・上清除去の工程を3回繰り返して細胞を精製した。さらに、レンズペーパーを敷いた漏斗で細胞懸濁液を濾過し、新しいDMEMハイグルコース培地を5〜6 ml添加することによりレンズペーパーに残存する細胞をも洗い出した。こうして得た濾液を500 rpmにて80〜90分遠心分離し、上清を除去した。この工程を3回繰り返した。この後、DMEMハイグルコース培地を3 ml添加し、やさしくピペッティングすることにより培地中の細胞を均一とした。細胞濃度を設定する前提として、トリパンブルー染色した後、血球計測版を用いて細胞数を計測した。この計測値を基に、細胞濃度を1 x 105 cells/ml2に設定し、3日間, 37℃, 5 %CO2で培養した。この際、コンフルエントに到達した場合には継代することとし、2回継代を行った細胞をアッセイに用いた。
後述の実施例に使用したヘパリンオリゴ糖(4、6、8、10糖)は、以下の方法により調製した。
100 mgのヘパリンに対し、公知の方法(Guo, Y. and Conrad, H. E. (1989)Anal. Biochem., 176, 96-104)により調整した10 mLの亜硝酸溶液(pH 1.5)を添加・撹拌した。反応混液を室温にて3分間加温して亜硝酸分解反応を部分的に進行させた。反応は、1 N Na2CO3を添加することにより停止させ、反応混液を濃縮した。ヘパリンオリゴ糖を含むこの反応混液をCellulofine GCL-25カラム(φ3.3 x 30 cm;生化学工業(株)販売)にアプライして脱塩した後、オリゴ糖画分につき BioGel P-6カラム(φ2.0 x 100 cm)にアプライしてサイズフラクショネーションした。こうしてヘパリンオリゴ糖(4, 6, 8, 10糖)をそれぞれ 10〜20 mg 調製した。
後述の実施例に使用した脱硫酸化ヘパリン(2DSH、6DSHおよびNDSH)及び脱硫酸化ヘパリンオリゴ糖(18糖の2DSHオリゴ及び6DSHオリゴ)は、以下の公知の方法により調製した。
アストロサイトに形態変化を起こさせるFGF-2濃度の検討
FGF-2単独でアストロサイトが形態変化を起こす濃度を検討した。
アッセイの一日目には、24穴マイクロタイタープレートにカバーグラス(円形)を入れ、ポリエチレンイミンでコーティングした。次いで、トリプシン(Trypsin)で剥がした細胞をカバーグラス上に1 x 104 cells/cm2の濃度にて播種した。DMEMハイグルコース培地を適量添加して37℃, 5 %CO2で培養した。アッセイの二日目には、培地をDMEMハイグルコース培地から 血清を含まない(serum-free) DMEM培地に交換し、FGF-2及び検体のヘパリンを様々な濃度で添加した。アッセイの三日目には、4 % paraformaldehydeを用いて固定し、0.2 %エオシン溶液で細胞質を染色した後、光学顕微鏡観察を行い写真撮影した。なお、細胞の画面から観察される面積を計算するために、専用ソフト(Winroof)を用いた。その結果、アストロサイトの顕微鏡観察下の一次元的面積を指標として、アストロサイトの面積の変化を測定した。その結果、FGF-2濃度が1 ng/mlで顕著な細胞面積の減少がみられ、それ以上にFGF-2濃度を上げても、あまり変化がなかった。そこで、以下のアッセイに用いるFGF-2濃度を1 ng/mlに固定することとした。
アストロサイト形態変化に及ぼすヘパリン濃度の検討
実施例1の方法に従い、ヘパリン(SPL社製、ブタ小腸由来精製品)のFGF-2によるアストロサイト形態変化を促進する濃度について検討した。その結果、FGF-2の1 ng/mlに対してヘパリン 1 μg/mlで最も細胞面積の減少がみられた。これ以上のヘパリン濃度では、細胞が細くなりすぎて、培地を抜いた時に剥がれてしまい計測不可能であった。そこで、以下のアッセイに用いるヘパリン濃度を 1 μg/mlに固定した。すなわち、FGF-2の1 ng/mlに対して、ヘパリン1μg/mlを用いることとした。
FGF-2によるアストロサイト形態変化に対するヘパリンオリゴ糖の影響
4糖から10糖の4種類ヘパリンオリゴ糖について、実施例1の方法に従い、FGF-2によるアストロサイト形態変化に及ぼす影響を検討した。FGF-2単独投与時のアストロサイトの細胞面積に対する、4、6、8、10糖のヘパリンオリゴ糖のアストロサイトの細胞面積減少の抑制率を計算した。表1に示す。
FGF-2によるアストロサイト形態変化に対する脱硫酸化ヘパリンの影響
2DSH、6DSHおよびNDSHの各種脱硫酸化ヘパリンについて、実施例1の方法に従い、FGF-2によるアストロサイト形態変化に及ぼす影響を検討した。FGF-2単独投与時のアストロサイトの細胞面積に対する、2DSH、6DSH、NDSH、18糖の2DSHオリゴ及び6DSHオリゴのアストロサイトの細胞面積減少の抑制率を計算した。表2に示す。
Claims (3)
- ヘパリン又はヘパリン誘導体を有効成分として含有する、アストロサイトの形態変化促進作用を有する物質の該作用抑制剤。
- ヘパリン又はヘパリン誘導体を有効成分として含有するアストロサイト活性化抑制剤。
- ヘパリン又はヘパリン誘導体を有効成分として含有するグリア瘢痕形成抑制剤。
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