JP2005035895A

JP2005035895A - 高カルシウム血症および骨疾患治療剤

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Publication number: JP2005035895A
Application number: JP2003197229A
Authority: JP
Inventors: Hiroyuki Osada; 裕之長田; Kiyotaka Machida; 清隆町田; Takeshi Shimizu; 猛清水; Tadashi Nakada; 忠中田; Toshimasa Araki; 敏正新木; Seitai U; 済泰禹; Kazuo Nagai; 和夫永井
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research; Chubu University
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research; Chubu University
Priority date: 2003-07-15
Filing date: 2003-07-15
Publication date: 2005-02-10
Also published as: EP1650210A4; EP1650210A1; WO2005005433A1; US20060173069A1

Abstract

【課題】新規な高カルシウム血症および骨疾患治療剤、該治療剤の有効成分として用いられ得る化合物の提供を課題とする。
【解決手段】下記一般式（Ｉ）
【化１】

（式中、Ｒは酸性条件下で脱離し得る水酸基の保護基を示す。）
で表されるリベロマイシンＡ誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする高カルシウム血症または骨疾患治療剤。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な高カルシウム血症および骨疾患治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
骨の量と機能は、骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収（骨破壊）のバランスによって維持されている。高齢化社会の中で患者数が急速に増加しつつある骨粗鬆症は、活性化した成熟破骨細胞による過剰な骨吸収により骨代謝のバランスが破綻し、骨量が減少する疾患である。
【０００３】
骨粗鬆症の治療薬としての骨吸収抑制剤としては、現在のところ女性ホルモンであるエストロジェンなどがあり、治療方法としてはこれを直接投与する方法があるが、この方法は重篤な副作用を引き起こすことが欠点である。また、エストロジェンは甲状腺ホルモンであるカルシトニンの分泌を促進することにより骨吸収を抑制すると考えられており、カルシトニンなどのペプチドホルモン製剤なども骨吸収抑制剤として使用されている。しかしながら、ペプチドホルモン製剤は、その骨吸収抑制効果の持続性が短いことや、アレルギーなどの過敏性体質の患者には使用しにくいなどの欠点がある。従って、これらに代わる新たな骨疾患治療剤の開発が望まれている。
【０００４】
骨吸収の要因である破骨細胞の働きを直接抑制できる非ホルモン系の薬剤は、副作用の少ない臨床薬として期待できる。非ホルモン系の骨疾患治療剤としては、リベロマイシン類を有効成分とする骨疾患治療剤が知られている（特許文献１を参照）。しかしながら、さらなる骨疾患治療剤の開発が望まれている。
【０００５】
上述のとおり、生体内において、骨密度が減少する骨疾患の原因は破骨細胞による過剰の骨吸収による。生体内において、例えば、副甲状腺ホルモン（ＰａｒａｔｈｙｒｏｉｄＨｏｒｍｏｎｅ：ＰＴＨ）は、破骨細胞の分化を促進するとともに成熟破骨細胞の活性化を誘導する。従って、副甲状腺ホルモンが作用する破骨細胞に作用する薬剤、例えば、骨吸収の働きを担う破骨細胞の形成を抑制する薬剤、あるいは破骨細胞の機能を阻害する薬剤などの開発は、骨粗鬆症などの骨疾患の治療剤、またさらに高カルシウム血症などの治療剤としての臨床応用が大いに期待される。
【０００６】
【特許文献１】
特開平７−２２３９４５号
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記の希求に応えるものであり、新規な高カルシウム血症および骨疾患治療剤、該治療剤の有効成分として用いられ得る新規化合物の提供を課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題の解決のために鋭意検討した結果、天然化合物リベロマイシンＡの特定の誘導体、およびリベロマイシンＡを基に新たに開発されたリベロマイシンＡ誘導体が、成熟破骨細胞に選択的な細胞死を誘導することによって骨吸収作用を抑制する事実を新たに見いだした。また、これらのリベロマイシンＡ誘導体が、生体内において最も重要な骨吸収システムである副甲状腺ホルモン依存的骨吸収を効果的に抑制できる事実を新たに見いだした。このような知見から、これらのリベロマイシンＡ誘導体を高カルシウム血症および骨疾患治療剤として使用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）下記一般式（Ｉ）
【０００９】
【化３】

【００１０】
（式中、Ｒは酸性条件下で脱離し得る水酸基の保護基を示す。）
で表されるリベロマイシンＡ誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする高カルシウム血症または骨疾患治療剤。
（２）一般式（Ｉ）において、Ｒがｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である（１）に記載の治療剤。
（３）下記一般式（ＩＩ）
【００１１】
【化４】

【００１２】
で示されるリベロマイシンＡ誘導体またはその薬学的に許容される塩。
（４）（３）に記載のリベロマイシンＡ誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする高カルシウム血症または骨疾患治療剤。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明の治療剤に用いられるリベロマイシンＡ誘導体
本発明の治療剤に用いられるリベロマイシンＡ誘導体は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物およびその薬学的に許容される塩である。
【００１４】
【化５】

【００１５】
式中、Ｒは酸性条件下で脱離し得る水酸基の保護基を示す。
本発明において「水酸基の保護基」とは、水酸基を一時的に種々の反応から保護することができる原子団であれば特に限定されない。
また、本発明において「酸性条件下で脱離し得る」とは、保護基が酸性条件下で脱離可能であって、中性条件下においては酸性条件下における場合と比較してより脱離しにくいことを意味する。好ましくは、「酸性条件下で脱離し得る」とは、成熟破骨細胞などにより作り出される酸性環境下において保護基が脱離可能であって、通常の細胞が存在する中性環境下においては保護基がより脱離しにくいことを意味する。なお、「中性条件下において保護基がより脱離しにくい」とは、好ましくは中性条件下において保護基が安定でほとんど脱離しないことを意味する。具体的には、「酸性条件下で脱離し得る」とは、例えばｐＨ４．０以下の酸性条件下において保護基が脱離し、ｐＨ７．０の中性条件下において保護基がほとんど脱離しないことを意味する。本発明に用いることができる「酸性条件下で脱離し得る」保護基は、例えば次のような方法で選択することができる。試験する保護基で５位の水酸基を保護したリベロマイシンＡ誘導体を、成熟破骨細胞などの酸性環境を作り出す細胞、および破骨細胞前駆細胞などの中性環境下に存在する細胞に投与し、生存細胞数の計測またはＭＴＴ法などにより細胞死誘導活性を測定し、酸性環境を作り出す細胞に対し、中性環境に存在する細胞よりもより高い細胞死誘導活性を示す誘導体を選択する。
【００１６】
Ｒとしては、アシル基、アルキル基またはシリル基などを用いることができ、好ましくはアシル基またはシリル基を用いることができる。より具体的には、アシル基としてはホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ヘキサノイル基などのアルキルカルボニル基など、アルキル基としてはメチル基、エチル基などのアルキル基；テトラヒドロピラニル基；エトキシエチル基、メトキシメチル基などのアルコキシアルキル基；ベンジル基などのアリールアルキル（アラルキル）基；メチルチオメチル基などのアルキルチオアルキル基など、シリル基としてはｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジメチルエチルシリル基などを用いることができるが、これらに限定されることはない。
【００１７】
本発明の治療剤に用いられるリベロマイシンＡ誘導体の好ましい一形態は、一般式（Ｉ）において、Ｒがｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基であるリベロマイシンＡ誘導体である。
本発明の治療剤に用いられるリベロマイシンＡ誘導体の別の好ましい一形態は、一般式（Ｉ）において、Ｒがアセチル基である新規リベロマイシンＡ誘導体である。
【００１８】
本発明の治療剤においてはリベロマイシンＡ誘導体の薬学的に許容される塩も用いることができる。薬学的に許容される塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；又はｐ−トルエンスルホン酸塩などの有機酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などの金属塩；アンモニウム塩；メチルアンモニウム塩などの有機アンモニウム塩；グリシン塩などのアミノ酸塩などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００１９】
一般式（Ｉ）で表されるリベロマイシンＡ誘導体は複数の不斉炭素を有しており、また置換基の種類によりさらに１個以上の不斉炭素を有する場合がある。これらの不斉炭素に基づく光学異性体またはジアステレオマーなどの立体異性体が存在するが、本発明においては純粋な形態の立体異性体のほか、任意の立体異性体の混合物またはラセミ体などを用いることができる。また、リベロマイシンＡ誘導体にはオレフィン性の二重結合を有する場合も存在し、二重結合に基づく幾何異性体が存在するが、純粋な形態の幾何異性体のほか、任意の幾何異性体の混合物も本発明に用いることができる。本発明に用いられるリベロマイシンＡ誘導体は任意の結晶形として存在することができ、水和物または溶媒和物として存在する場合もある。これらの物質についても本発明に用いることができる。
【００２０】
リベロマイシンＡについては公知方法及びそれに準ずる方法、例えば特公平６−３３２７１号公報、及びジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓＶｏｌ．４５，Ｎｏ．９，ｐｐ１４０９−１４１３（１９９２））に記載されているリベロマイシンＡ生産菌を培養し、リベロマイシンＡを採取する方法により製造することができる。
【００２１】
リベロマイシンＡ誘導体については、本発明により本発明の治療剤として有効な活性を有する特定のリベロマイシンＡ誘導体の構造が明らかにされたため、公知方法、例えばバイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＬｅｔｔｅｒｓＶｏｌ．１２，ｐｐ３３６３−３３６６（２００２））などに記載されているリベロマイシンＡ誘導体の製造方法および通常の有機合成手法により製造することができる。なお、本発明の実施例には、本発明の治療剤として用いられる化合物の合成手法の具体例が記載されており、これらの合成手法も参照することができる。
【００２２】
（２）本発明の高カルシウム血症および骨疾患治療剤
本発明の治療剤は、特定のリベロマイシンＡ誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする薬剤であり、高カルシウム血症ならびに骨疾患の治療および／または予防のために使用することができる。骨疾患としては、骨量減少等の内因性骨疾患、及び物理的骨折等の外因性骨疾患の両方を含み、本発明の薬剤は上記骨疾患の治療及び／又は予防、あるいは上記骨疾患の治療期間の短縮のために使用することができる。内因性骨疾患としては、生体内での破骨細胞の過剰な形成及び／又は過剰な機能を伴う全ての疾患が包含される。骨疾患の具体例としては、骨粗鬆症、骨疾患関連性高カルシウム血症、骨ページェット病、破骨細胞腫、骨肉腫、関節症、慢性関節リウマチ、変形性骨炎、原発性甲状腺機能亢進症、骨減少症、骨多孔症、骨軟化症、外傷性骨折、疲労骨折、又は栄養障害、悪性腫瘍など他の疾病が原因による骨組織の脆弱化及び骨折などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。本発明の治療剤は、ビタミンＤ_３、ＩＬ−１または副甲状腺ホルモンにより誘導される高カルシウム血症および骨疾患の治療および／または予防のために好適に用いられる。
【００２３】
本発明の治療剤は、その使用目的にあわせて通常の薬学的手法に準じて投与方法、剤型、投与量を適宜決定することが可能である。例えば治療あるいは予防を目的としてヒトなどの動物に投与する場合は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、溶剤等として経口的に、または注射剤、坐剤、経皮吸収剤、吸入剤等として非経口的に投与することができる。また、本発明の治療剤に用いられるリベロマイシンＡ誘導体の有効量は通常の薬学的手法に準じてその剤型に適した賦形剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、滑沢剤等の医薬用添加剤を必要に応じて混合し、医薬製剤とすることができる。注射剤の場合には、適当な担体とともに滅菌処理を行って製剤とする。投与量は疾患の状態、投与ルート、患者の年齢、または体重によっても異なり、最終的には医師の判断に委ねられるが、有効成分量として成人に経口で投与する場合、通常２０〜５００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは５０〜３００ｍｇ／ｋｇ／日、非経口で投与する場合、通常１０〜３００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは２０〜２００ｍｇ／ｋｇ／日を投与する。これを１回あるいは数回に分割して投与すればよい。
【００２４】
本発明において、種々のリベロマイシンＡ誘導体を化学合成して、天然型リベロマイシンＡに比べ、より特異的に細胞培養系における成熟破骨細胞の増殖を抑制できる化合物の開発を試みた。その結果、一般式（Ｉ）で表される特定のリベロマイシンＡ誘導体、特に一般式（Ｉ）におけるＲがｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である誘導体およびＲがアセチル基である誘導体が、成熟破骨細胞に対して、天然型リベロマイシンＡに比べ、さらに選択的な破骨細胞増殖抑制効果を示すことを新たに見いだした。すなわち、リベロマイシンＡの５位の水酸基を適当な保護基で保護した誘導体は、中性ｐＨでは殺細胞活性が微弱であるが、酸性環境を作り出す成熟破骨細胞に対しては強力なアポトーシス誘導活性を有するプロドラッグとして働く。これらの誘導体は、成熟破骨細胞以外の細胞に対するアポトーシス誘導活性がより低いといった優れた選択的破骨細胞アポトーシス誘導効果を示す。活性化した成熟破骨細胞に対する選択性が高いことから、これらのリベロマイシンＡ誘導体の副作用は軽微であると考えられる。
【００２５】
また、甲状腺副甲状腺を摘出後、副甲状腺ホルモンを投与することにより高カルシウム血症を呈するラットに対して特定のリベロマイシンＡ誘導体の投与を行った結果、これらのリベロマイシンＡ誘導体は、副甲状腺ホルモンにより誘発される骨吸収作用を効果的に抑制できることが新たに判明した。また、これらのリベロマイシンＡ誘導体の骨吸収抑制効果は、従来のカルシトニンによるものに比べ持続時間の長いものであった。
【００２６】
すなわち、本発明において、骨吸収を担う成熟破骨細胞に対して選択的細胞死を誘導できるリベロマイシンＡ誘導体が見出された。これらのリベロマイシンＡ誘導体は、副甲状腺ホルモンに起因する骨吸収を効果的に抑制でき、さらにその効果はカルシトニンなどに比べ持続性が向上していたことから、破骨細胞の過剰な活性化などにより誘発される骨疾患および高カルシウム血症などの効果的な治療剤として期待できる。
【００２７】
【実施例】
以下に製造例および実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
種々のリベロマイシンＡ誘導体をバイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙＬｅｔｔｅｒｓＶｏｌ．１２，ｐｐ３３６３−３３６６（２００２））および以下の製造例に記載の方法により合成した。なお、リベロマイシンＡを特公平６−３３２７１号公報に記載の方法により製造した。合成した２９種類のリベロマイシンＡ誘導体を以下の表１および２に示す。なお、表１および２においてＡｃはアセチル基、ａｌｌｙｌはアリル基、Ｅｔはエチル基、ＴＢＳはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、Ｍｅはメチル基、ＭＴＭはメチルチオメチル基を示す。
【００２８】
【表１】

【００２９】
【表２】

【００３０】
以下に、化合物２および２７の製造例を示す。
＜製造例１＞化合物２（Ｃ５−シリルエーテル体）の合成
Ｃ５−シリルエーテル体（化合物２）の合成
窒素雰囲気下、リベロマイシンＡ（６．６ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）（３００ μｌ）溶液に、室温でイミダゾール（１３．６ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）およびＴＢＳＣｌ（ｔ−ブチルジメチルシリルクロライド）（１８．０ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）を加えて一昼夜攪拌した。ＡｃＯＥｔ（酢酸エチル）で希釈し、０ ℃で有機層を１ＮＨＣｌ、飽和食塩水で順次洗浄した。溶媒を留去後残渣にＭｅＯＨ（メタノール）：ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）：Ｈ_２Ｏ＝３：２：１（６００ μｌ）およびＫ_２ＣＯ_３（５ｍｇ）を加え室温にて１時間攪拌した。溶媒を留去後、残渣をＳｉＯ_２カラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝１：１；１％酢酸）にて精製して、５−シリルエーテル（化合物２）（無色油状物：５．０ｍｇ，７１％）を得た。
【００３１】
^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ） δ ＝０．０６（ｓ，３Ｈ），０．１０（ｓ，３Ｈ），０．８５（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），０．８９（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），０．９５（ｓ，９Ｈ），１．０９（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），１．７９（ｓ，３Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ），２．６３（ｍ，４Ｈ），３．４７（ｄｄｄ，Ｊ＝１０．０，５．０，５．０Ｈｚ，１Ｈ），４．２６（ｄｄ，Ｊ＝６．９，５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．６５（ｂｒｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），５．５４（ｄｄ，Ｊ＝１５．６，６．９Ｈｚ，１Ｈ），５．６３（ｄｄ，Ｊ＝７．３，７．３Ｈｚ，１Ｈ），５．８２（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．９２（ｂｒｓ，１Ｈ），６．２７（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），６．４６（ｍ，２Ｈ），７．０３（ｄｄ，Ｊ＝１５．６，７．３Ｈｚ，１Ｈ）．
^１３ＣＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ_３ＯＤ） δ ＝１４．２，１４．４，１４．９，１８．１，１９．１，２３．９，２５．１，２５．５，２６．４，２８．６，２９．９，３１．１，３２．８，３３．３，３５．３，３６．９，４４．９，７６．２，７８．１，７９．９，８４．３，９７．０，１２１．５，１２２．３，１２８．６，１２９．４，１３４．１，１３５．６，１３７．３，１３９．３，１５２．６，１５３．５，１７０．２，１７０．２，１７３．４，１７５．９．
【００３２】
＜製造例２＞化合物２７（Ｃ５−アセテート体）の合成
トリアリルエステルの合成
リベロマイシンＡ（６６．１ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ）、アリルアルコール（７００ μｌ）、ＥＤＣＩ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（１７８．２ｍｇ，０．６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン）（１．２ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）を２ｍｌのテフロン（デュポン社登録商標）製容器に入れ、さらに無水ＣＨ_２Ｃｌ_２で容器を満たし、室温１．５ＧＰａで２日間加圧した。反応液をＥｔ_２Ｏ（ジエチルエーテル）で希釈し、２ＮＮａ_２ＣＯ_３ａｑ．、飽和食塩水で順次洗浄後、ＭｇＳＯ_４で乾燥し、溶媒を留去した．残渣をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：Ｅｔ_２Ｏ＝２：１）にて精製しトリアリルエステル（２８．１ｍｇ，３６％）を得た。
【００３３】
^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３） δ ＝０．７６（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），０．８２（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．０９（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．７２（ｓ，３Ｈ），２．２５（ｂｒｓ，３Ｈ），２．６６（ｍ，４Ｈ），３．４１（ｄｄｄ，Ｊ＝９．９，４．８，４．８Ｈｚ，１Ｈ），４．１１（ｄｄ，Ｊ＝７．３，５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．６１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．６２（ｍ，６Ｈ），５．２４（ｄｄ，Ｊ＝１０．４，１．４Ｈｚ，２Ｈ），５．２４（ｄｄ，Ｊ＝１０．４，１．４Ｈｚ，１Ｈ），５．３２（ｄｄｄ，Ｊ＝１７．２，１．４，１．４Ｈｚ，１Ｈ），５．３４（ｄｄｄ，Ｊ＝１７．２，１．４，１．４Ｈｚ，１Ｈ），５．３５（ｄｄｄ，Ｊ＝１７．２，１．４，１．４Ｈｚ，１Ｈ），５．５１（ｄｄ，Ｊ＝１５．６，７．３Ｈｚ，１Ｈ），５．５４（ｂｒｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），５．８６（ｂｒｓ，１Ｈ），５．９０（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），５．９６（ｍ，３Ｈ），６．２２（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），６．３４（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），６．３８（ｄｄ，Ｊ＝１５．６，８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０４（ｄｄ，Ｊ＝１６．０，７．５Ｈｚ，１Ｈ）．
^１３ＣＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３） δ ＝１２．６，１４．１，１４．４，１４．７，１７．７，２２．９，２９．４，３０．２，３３．９，３４．２，３６．０，４２．７，６４．８，６５．１，６５．５，７４．９，７６．１，７８．２，８３．１，９５．８，１１８．１，１１８．１，１１８．３，１１９．７，１２１．４，１２６．０，１２９．４，１３２．０，１３２．３，１３２．３，１３３．２，１３３．８，１３７．４，１３７．７，１５０．９，１５１．９，１６６．１，１６６．４，１７１．２，１７１．８．
【００３４】
５−アセトキシ体の合成
窒素雰囲気下、トリアリルエステル（８．５ｍｇ，１０．９ μｍｏｌ）のＣＨ_２Ｃｌ_２溶液（１ｍｌ）にピリジン（４．４ μｌ，５４．４ μｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１ｐｉｅｃｅ）、Ａｃ_２Ｏ（無水酢酸）（２．１ μｌ，２１．８ μｍｏｌ）を順次加え０℃で３時間攪拌した。溶媒を留去後、残渣をカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：ＡｃＯＥｔ＝３：１）にて精製して、５−アセトキシトリアリルエステル（無色油状物：６．８ｍｇ，７６％）を得た。
【００３５】
^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３） δ ＝０．７４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），０．８３（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．０８（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．７０（ｂｓ，３Ｈ），２．０７（ｓ，３Ｈ），２．２８（ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ，３Ｈ），２．６７（ｍ，４Ｈ），２．７７（ｍ，４Ｈ），３．４３（ｄｔ，Ｊ＝１０．１，３．７Ｈｚ，１Ｈ），４．６０（ｄｄｄ，Ｊ＝６．０，１．４，１．４Ｈｚ，２Ｈ），４．６２（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），４．６４（ｄｄｄ，Ｊ＝６．０，１．４，１．４Ｈｚ，２Ｈ），４．６５（ｄｄｄ，Ｊ＝６．０，１．４，１．４Ｈｚ，２Ｈ），５．２４（ｄｄｔ，Ｊ＝１０．５，１．４，１．４Ｈｚ，１Ｈ），５．２５（ｄｄｔ，Ｊ＝１０．５，１．４，１．４Ｈｚ，１Ｈ），５．２５（ｄｄｔ，Ｊ＝１０．５，１．４，１．４Ｈｚ，１Ｈ），５．２７（ｄｄ，Ｊ＝８．３，５．５Ｈｚ，１Ｈ），５．３２（ｄｄｔ，Ｊ＝１７．２，１．４，１．４Ｈｚ，１Ｈ），５．３４（ｄｄｔ，Ｊ＝１７．２，１．４，１．４Ｈｚ，１Ｈ），５．３４（ｄｄｔ，Ｊ＝１７．２，１．４，１．４Ｈｚ，１Ｈ），５．３８（ｄｄ，Ｊ＝１５．６，８．３Ｈｚ，１Ｈ），５．６４（ｂｒｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），５．８６（ｂｒｓ，１Ｈ），５．８７（ｄｄ，Ｊ＝１５．６，０．９Ｈｚ，１Ｈ），６．３０（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），６．３３（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），６．３８（ｄｄ，Ｊ＝１５．６，８．７Ｈｚ，１Ｈ），６．９９（ｄｄ，Ｊ＝１５．６，７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．０３（ｄｄ，Ｊ＝１５．６，７．３Ｈｚ，１Ｈ）．
^１３ＣＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３） δ ＝１２．７，１４．０，１４．４，１５．１，１７．７，２１．４，２２．８，２９．３，３０．２，３５．８，４０．６，６４．８，６５．２，６５．５，７４．５，７７．６，７８．２，８３．２，９５．９，１１８．２，１１８．３，１１８．５，１２０．０，１２１．０，１２１．９，１３０．０，１３２．１，１３２．３，１３２．５，１３３．３，１３３．９，１３７．８，１３９．８，１４９．６，１５１．８，１６６．２，１６６．６，１７０．２，１７１．４，１７２．０．
【００３６】
窒素雰囲気下、５−アセトキシトリアリルエステル（５．８ｍｇ，０．０７ μｍｏｌ）のＣＨ_２Ｃｌ_２（１ｍｌ）溶液に０℃でＰｄ（Ｐｈ_３Ｐ）_４（テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム）（０．４１ｍｇ，０．３５ μｍｏｌ）、Ｐｈ_３Ｐ（トリフェニルホスフィン）（０．１９ｍｇ，０．７ μｍｏｌ）、ピロリジン（７．３ μｌ，０．０８６ｍｍｏｌ）を順次加えた後、３時間攪拌した。反応溶液をＥｔＯＡｃで希釈し、２ＮＮａ_２ＣＯ_３で抽出し、水層を２ＮＨＣｌで中性にしてＥｔＯＡｃで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、ＭｇＳＯ_４で乾燥し溶媒を留去して、５−アセトキシ体（４．２ｍｇ，８５％）を得た。
【００３７】
^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３） δ ＝０．８３（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ），０．８９（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．１３（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．７８（ｂｒｓ，３Ｈ），２．１１（ｓ，１Ｈ），２．３０（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，３Ｈ），２．６３（ｍ，４Ｈ），３．４９（ｄｔ，Ｊ＝１０．１，５．５Ｈｚ，１Ｈ），４．６６（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），５．３２（ｄｄ，Ｊ＝７．３，６．０Ｈｚ，１Ｈ），５．５１（ｄｄ，Ｊ＝１５．６，７．８Ｈｚ，１Ｈ），５．６９（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），５．８８（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．９２（ｂｒｓ，１Ｈ），６．３３（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），６．４６（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），６．４８（ｄｄ，Ｊ＝１５．６，６．９Ｈｚ，１Ｈ），６．９５（ｄｄ，Ｊ＝１５．６，７．３Ｈｚ，１Ｈ）．
^１３ＣＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３） δ ＝１２．８，１４．２，１４．７，１５．２，１８．０，２３．８，２５．１，２５．５，２８．７，２９．９，３１．１，３２．８，３２．９，３４．７，３５．２，３６．９，４１．８，７６．２，７８．８，７９．８，８４．３，９７．１，１２１．６，１２２．９，１２３．４，１３０．９，１３４．１，１３５．３，１３９．３，１４０．３，１５１．０，１５２．５，１７０．２，１７０．２，１７３．４，１７６．０．
【００３８】
＜実施例１＞リベロマイシンＡおよびリベロマイシンＡ誘導体の成熟破骨細胞に対する細胞死誘導活性の検討
骨吸収の要因である成熟破骨細胞の増殖に対するリベロマイシンＡおよびその誘導体の阻害効果を検討した。
上記のようにして合成した２９種類のリベロマイシンＡ誘導体を用いて、成熟破骨細胞、及びマウス由来未分化マクロファージ様細胞（ＲＡＷ２６４細胞）に対する細胞死誘導活性の試験を行った。マウスマクロファージ系細胞株であるＲＡＷ２６４細胞を１０％ＦＢＳ−αＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）に懸濁し、９６穴プレートに１２０００細胞／１００ μｌ播種し、１時間培養後、ＲＡＮＫＬ（１００ μｇ／ｍｌ）、ＰＤ９８０５９（４０ μＭ）を含む培地を１００ μｌ加え（終濃度ＲＡＮＫＬ５０ μｇ／ｍｌ、ＰＤ９８０５９２０ μＭ）、４日間培養して成熟破骨細胞へ分化させた（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７７，ｐｐ４７３６６−４７３７２（２００２））。なお、培養２日目に培地を半量交換した。成熟破骨細胞へ分化させたプレートから培地を１００ μｌ／ウェルずつ除去し、２倍濃度のリベロマイシンＡ誘導体を含む培地を１００ μｌ加えて２４時間培養後、ＴＲＡＰ（ｔａｒｔａｒａｔｅｒｅｓｉｓｔａｎｔａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：酒石酸耐性酸フォスファターゼ）染色を行い、残存する多核の破骨細胞の数を計測し、細胞死（アポトーシス）誘導活性（ＥＤ_５０値）を計算した。アポトーシス誘導活性は、１０ μＭＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８で１０分間染色し核の凝集を観察確認した。
【００３９】
未分化ＲＡＷ２６４細胞に対する細胞死誘導活性はＭＴＴ法（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．６５，ｐｐ５５−６３（１９８３））により検討した。ＲＡＷ２６４細胞を９６穴プレートに４００００細胞／１００ μｌ播種し、２４時間培養後、３倍濃度の薬物を含む培地５０ μｌを加え、２４時間培養して細胞死誘導活性を検討した。細胞死誘導活性を測定する２時間前に０．５％ＭＴＴ−ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）１５ μｌを加えて培養した後、培養液を除去した残渣をＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）１００ μｌに溶解し、５７０ｎｍ（レファレンス波長６３０ｎｍ）の吸光度を測定し、細胞死誘導活性のＥＤ_５０値を計算した。
【００４０】
試験の結果、表３に示すように、リベロマイシンＡによる成熟破骨細胞に対する細胞死誘導活性のＥＤ_５０は０．１８ μＭであるのに対してＲＡＷ２６４細胞に対する細胞死誘導活性のＥＤ_５０は２４ μＭであり、成熟破骨細胞に高い選択性を持って作用する。これに対し、リベロマイシンＡ誘導体（化合物２および化合物２７）は、破骨細胞の前駆細胞ＲＡＷ２６４に対しては比較的高濃度においても増殖阻害作用を示さず、成熟破骨細胞に対して選択的なアポトーシス誘導効果を示した。リベロマイシンＡ誘導体２（Ｃ５−シリルエーテル体）、２７（Ｃ５−アセテート体）は５位の水酸基の修飾体であるが、成熟破骨細胞に対して選択的に細胞死を誘導した。成熟破骨細胞によるプロトン分泌によってその周辺は酸性環境になるが、酸性環境では加水分解により修飾基が脱離して水酸基に戻ったために活性を示した可能性がある。リベロマイシンＡ誘導体（化合物２および化合物２７）は、未分化ＲＡＷ２６４細胞に対しては比較的高濃度においても増殖阻害作用を示さず、成熟破骨細胞に対して選択的なアポトーシス誘導効果を示すことから、プロドラッグとして有望であることが示された。
【００４１】
【表３】

【００４２】
＜実施例２＞マウス長管骨からの^４５Ｃａ遊離抑制効果の検討
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）による骨吸収促進に対するリベロマイシンＡ誘導体の効果を測定した。
１９日目の妊娠ラットに［^４５Ｃａ］ＣａＣｌ_２を皮下注射し、胎児の骨を標識した。２４時間後、前肢長管骨を摘出した。摘出した長管骨は１５％加熱非活性化ウマ血清と１００Ｕ／ｍｌペニシリンを含んだＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）を培地として使用し、骨吸収因子（ＰＴＨ１０^−８Ｍ，ＩＬ−１０．３ｎｇ／ｍｌ、ビタミンＤ_３１０^−８Ｍ）及びリベロマイシンＡ誘導体と共に７２時間培養した。培養後、０．１ＮＨＣｌにより骨のカルシウムを溶かし出した溶液と培養液の^４５Ｃａ放射活性を液体シンチレーションカウンターで計測した。全カルシウム量に対する培養液中に放出されたカルシウム量の比（骨吸収活性（％））を指標としたＰＴＨによる骨吸収促進に対するリベロマイシンＡ誘導体の効果を検討した。
【００４３】
【数１】

【００４４】
リベロマイシンＡ誘導体（化合物２、および化合物２７）は、１０^−８Ｍ、１０^−７Ｍ及び１０^−６ＭでＰＴＨにより誘発された骨吸収を濃度依存的に抑制した。また、ビタミンＤ_３やＩＬ−１による骨吸収をも抑制できた。
【００４５】
＜実施例３＞リベロマイシンＡ誘導体の副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）による骨吸収阻害効果の検討
生体内で最も重要な骨吸収因子として機能している副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）による骨吸収に対するリベロマイシンＡ誘導体の効果を検討した。
【００４６】
リベロマイシンＡ誘導体の骨吸収阻害効果は、骨吸収作用により血中に放出される血清カルシウムの濃度測定により検定した。ＳＤ系のラットに甲状腺副甲状腺摘出手術（ＴＰＴＸ）を施し、翌日血清カルシウムの低下を確認した後、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を持続注入して、骨吸収の亢進により高カルシウム血症を呈するラットを作製した。
ＰＴＨ注入開始後１２時間にリベロマイシンＡ誘導体（１０ｍｇ／５０ μｌＥｔＯＨ（エタノール），１００ｇｂｗ）またはリベロマイシンＡ誘導体のナトリウム塩（１０ｍｇ／１００ μｌ０．０５ＮＮａＯＨ，１００ｇｂｗ）を投与して経時的に２４時間まで血清カルシウムの測定を行った。
【００４７】
ＳＤラットにＴＰＴＸを施行すると血清カルシウム濃度が著しく低下した。ＴＰＴＸラットにＰＴＨを持続注入すると血清カルシウム濃度が上昇した。一方、リベロマイシンＡ誘導体（化合物２、および化合物２７）（８０ｍｇ／Ｋｇ）を投与した個体においては、ＰＴＨによる血中カルシウム濃度の上昇は、有意に抑制された。リベロマイシンＡ誘導体は、ＰＴＨによる骨吸収を有意に抑制することが明らかとなった。また、リベロマイシンＡ誘導体をＥｔＯＨに溶解後投与した個体では、投与時に死亡する個体が見られたが、リベロマイシンＡ誘導体をナトリウム塩として投与することにより死亡する個体は認められず、有効な骨吸収抑制作用が発揮された。
【００４８】
一方、骨吸収抑制因子として臨床応用されているカルシトニンの骨吸収抑制作用についても検討して、リベロマイシンＡ誘導体との相異について調べた。その結果、カルシトニンは骨吸収抑制作用が短いのに対して、リベロマイシンＡ誘導体（化合物２、および化合物２７）による骨吸収抑制作用は長時間維持された。
【００４９】
【発明の効果】
本発明により、新規な高カルシウム血症および骨疾患治療剤、該治療剤の有効成分として用いられ得る新規化合物が提供される。

Claims

下記一般式（Ｉ）

（式中、Ｒは酸性条件下で脱離し得る水酸基の保護基を示す。）
で表されるリベロマイシンＡ誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする高カルシウム血症または骨疾患治療剤。
一般式（Ｉ）において、Ｒがｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である請求項１に記載の治療剤。
下記一般式（ＩＩ）

で示されるリベロマイシンＡ誘導体またはその薬学的に許容される塩。
請求項３に記載のリベロマイシンＡ誘導体またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする高カルシウム血症または骨疾患治療剤。