JP2004534049A - 条件細胞培養培地とその用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は３次元培養により成長させられた細胞により馴化された細胞培養培地を含んでなる組成物に関する。培地を馴化するために使用される細胞には、培地中の成長因子及び抗酸化剤の濃度を変更するために遺伝子改変が施されてもよい。条件細胞培地（馴化培地）はとりわけ化粧品用途、医薬部外品用途、及び製薬用途の少なくとも一つに使用することができる。 本発明はまた細胞侵入を亢進する異種配列を含んでなるタンパク質にも関する。本発明はまたそのようなタンパク質をコードしているＤＮＡを含む細胞に関する。本発明の化合物を調製する方法もまた提供される。
Description
【発明の開示】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、あらゆる目的のためにその全体を出典明示によりここに取り込む２００１年６月７日出願の米国仮特許出願第６０／２９７１７７号の優先権を主張する。この出願はあらゆる目的のためにその全体を出典明示によりここに取り込む１９９９年５月１４日出願の米国特許出願第０９／３１３５３８号に関する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は３次元培養において成長させた細胞により馴化された細胞培養培地を含む組成物に関する。培地を馴化するために使用される細胞は、培地中の成長因子及び抗酸化剤の濃度を変更するために遺伝子的に改変されうる。条件細胞培地（馴化培地）は、なかでも化粧品への応用、医薬部外品への(cosmeceutical)応用及び製薬への応用に有用である。本発明はまた細胞進入を亢進するペプチド配列を含む蛋白質、そのような蛋白質をコードするＤＮＡ、及びそのようなＤＮＡを含む細胞を含む。本発明の化合物を調製する方法もまた提供される。
【０００３】
（発明の概要）
本発明は３次元細胞培養を使用して生成される条件細胞培養培地又はその抽出物及び適切な担体を含んでなる組成物に関する。本発明はまたそのような組成物を調製するための方法に関する。ある実施態様では、３次元培養は真核細胞又はヒト細胞、特に真皮の線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、及び筋細胞を含む。ある実施態様では、適切な担体は製薬的に許容可能な担体、化粧品的に許容可能な担体、又は医薬部外品的(cosmeceutically)に許容可能な担体である。ある実施態様では、条件細胞培養培地は無血清又は動物産物を含まない馴化前培地を使用して産生される。
【０００４】
ある実施態様では、条件培地は少なくとも一の遺伝子組換型成長因子又は少なくとも一の遺伝子組換型抗酸化剤を含む。ある実施態様では、本発明の組成物は、少なくとも一の遺伝子組換型成長因子、少なくとも一の遺伝子組換型抗酸化剤、少なくとも一の遺伝子組換型細胞外マトリックス成分、又はその組合せを含む。ある実施態様では、少なくとも一の遺伝子組換型成長因子、少なくとも一の遺伝子組換型抗酸化剤、又は少なくとも一の遺伝子組換型細胞外マトリックス成分は、少なくとも一の輸送増強成長因子、輸送増強抗酸化剤、又は輸送増強細胞外マトリックス成分を含む。ある実施態様では、輸送増強成長因子、輸送増強抗酸化剤、又は輸送増強細胞外マトリックス成分は表１のアミノ酸配列（配列番号：１−配列番号：１９）の一つを更に含む。
【０００５】
ある実施態様では、細胞進入を亢進する異種ペプチド配列を含んでなる成長因子が提供される。ある実施態様では、細胞進入を亢進する異種ペプチド配列を含んでなる成長因子をコードするＤＮＡを含んでなる細胞が提供される。
【０００６】
ある実施態様では、細胞進入を亢進する異種ペプチド配列を含んでなる抗酸化剤が提供される。ある実施態様では、細胞進入を亢進する異種ペプチド配列を含んでなる抗酸化剤をコードするＤＮＡを含んでなる細胞が提供される。
【０００７】
ある実施態様では、細胞進入を亢進する異種ペプチド配列を含んでなる細胞外マトリックス成分が提供される。ある実施態様では、細胞進入を亢進する異種ペプチド配列を含んでなる細胞外マトリックス成分をコードするＤＮＡを含んでなる細胞が提供される。
【０００８】
ある実施態様では、本発明の組成物は、ローション、クリーム、ヒドロゲルを含むゲル、パウダー、セラム、軟膏、ファンデーション、フェイシャルマスク、リップケア製品、サンスクリーン、ヘアケア製品、例えばシャンプー、ディープコンディショナーを含むコンディショナー、ヘアケアトリートメント、ホットオイルトリートメント等、スキンクレンザー、落屑剤、コンパクト製剤等を含む。
【０００９】
ある実施態様では、条件培地は、少なくとも一の培養誘導成長因子であって、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、インターロイキン-３（ＩＬ-３）、ＩＬ-６、又はＩＬ-８の少なくとも一を含んでなる少なくとも一の成長因子と；少なくとも一の培養誘導抗酸化剤であって、グルタチオン、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ、グルタチオンジスルフィド、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アルファ-トコフェロール、ガンマ-トコフェロール、ユビキノール-９、ユビキノン-９、アスコルビン酸、システイン、及びシスチンの少なくとも一を含んでなる少なくとも一の抗酸化剤とを含有する。ある実施態様では、組成物は、少なくとも一の細胞外マトリックス成分、例えば可溶性コラーゲン、例えば限定するものではないがＩ型コラーゲン又はＩＩＩ型コラーゲンを更に含有する。
【００１０】
ある実施態様では、本方法は、適切な条件下で３次元培養物と馴化前培地を組み合わせて、少なくとも一の培養誘導成長因子であって血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、インターロイキン-３（ＩＬ-３）、ＩＬ-６、又はＩＬ-８の少なくとも一を含んでなる少なくとも一の成長因子と；少なくとも一の培養誘導抗酸化剤であって、グルタチオン、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ、グルタチオンジスルフィド、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アルファ-トコフェロール、ガンマ-トコフェロール、ユビキノール-９、ユビキノン-９、アスコルビン酸、システイン、又はシスチンの少なくとも一を含んでなる少なくとも一の抗酸化剤とを含有する条件培地を生成することを含む。本発明に係る方法では、条件培地又はその抽出物は許容可能な担体と組み合わされて組成物が生成される。ある実施態様では、組成物は医薬部外品組成物であり、許容可能な担体は医薬部外品的に許容可能な担体である。ある実施態様では、３次元培養は真核細胞、特にヒト真皮線維芽細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞、平滑筋細胞等々を含む。
【００１１】
（例示的な実施態様の詳細な説明）
この出願において、特に他の定義をしない限り、単数の使用は複数を含む。この出願では、特に他の定義をしない限り、「又は」の使用は「及び／又は」を意味する。更に、「含んでいる(including)」、並びに他の形態、例えば「含む(includes)」及び「含んだ（included）」という用語の使用は限定しているものではない。また、「エレメント」又は「成分」のような用語は、特に他の定義をしない限り、一つのユニットを含む要素及び成分と、一つより多いサブユニットを含む要素及び成分の双方を包含する。
【００１２】
ここで使用されるセクションの見出しは構成の目的だけのものであり、記載される主題事項を限定するものではない。この明細書において引用される全ての文献はあらゆる目的のためにその全体が出典明示によりここに取り込まれる。
【００１３】
ここで使用される「培養誘導(culture-derived)」なる用語は、細胞を培養し細胞に栄養を与えるために使用される最初の細胞培養培地には存在していないが、培養された細胞によって生成され培地に入る条件細胞培地の成分を意味する。例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）はヒト線維芽細胞の３次元培養から得られる条件細胞培養培地中に存在する一方、ＶＥＧＦは馴化前の元々の馴化前の細胞培養培地（「馴化前培地(pre-conditioned media)」）中には典型的には存在していない。よって、ＶＥＧＦは細胞によって培地中に分泌される。また培養誘導という用語に含まれるものは、馴化前培地中に最初から存在しているがその濃度が培養過程中に増大する化合物である。例えば、限定するものではないが、元々の馴化前培地が１ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを含み、馴化後の同じ培地が５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを含む場合、条件培地は培養誘導ＶＥＧＦを含む。
【００１４】
ここで使用される「成長因子」という用語は、細胞によって産生され、それ自身及び／又は様々な他の隣接した又は離れた細胞に効果をもたらし得る蛋白質、ポリペプチド又はサイトカインを含むポリペプチドの複合体を意味する。典型的には、成長因子は、発生的にか又は多数の生理学的又は環境上の刺激に応答して、特定の型の細胞の成長及び／又は分化に影響を及ぼす。全てではないがある成長因子はホルモンである。成長因子の例はインスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子、ＶＥＧＦ、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）を含む線維芽細胞成長因子（ＦＧＦｓ）、ＰＤＧＦ-ＡＡ及びＰＤＧＦ-ＡＢを含む血小板由来成長因子（ＰＤＧＦｓ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦα）、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３を含むトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）、インターロイキン-６（ＩＬ-６）、ＩＬ-８等々である。成長因子はなかでもMolecular Cell Biology, Scientific American Books, Darnell等編, 1986; The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair, Clark, Plenum Press, 1996;及びPrinciples of Tissue Engineering, 第２版, Lanza等編, Academic Press, 2000において議論されている。当業者であれば、ここに記載した条件培地中の任意のまたあらゆる培養誘導成長因子が本発明の範囲に入ることが分かるであろう。
【００１５】
抗酸化剤という用語はここでは広義に使用され、酸化又はフリーラジカルの生成を遅延させ又は防止するあらゆる物質を包含する。よって、抗酸化剤には、限定するものではないが皮膚のような組織中にとりわけ紫外線及び環境汚染物によって生成されるフリーラジカルの損傷付与効果を少なくとも部分的に防止することが可能な酵素及び他の化合物が含まれる。例えば、皮膚の抗酸化剤防御系には、抗酸化剤酵素及び一群の低分子量抗酸化剤（ＬＭＷＡ）が含まれる。ＬＭＷＡは直接的であれ又は間接的であれラジカル酸素種と相互作用することにより少なくとも部分的に酸化的損傷を防止することが実証されている。例示的な抗酸化剤はシステイン、グルタチオン、グルタチオンジスルフィド、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ、カタラーゼ、アルファ-トコフェロールとガンマ-トコフェロールを含むビタミンＥ、アスコルビン酸、ユビキノール９、ユビキノン９等々である。抗酸化剤の議論はなかでもKohen等, Toxicology 148: 149-157 (2000); Kohen, Biomed. Pharmacother. 53: 181-192 (1999); Kohen等, Methods of Enzymol. 300: 285-90, Academic Press (1999); Miyachi, Dermatol. Sci. 9:79-86 (1995);及びStohs, J. Basic Clin. Physio. Pharmacol. 6:206-228 (1995)において見出されうる。当業者であれば、ここに記載された条件培地中の任意のあらゆる培養誘導抗酸化剤が本発明の範囲に入るものと理解するであろう。
【００１６】
当業者であれば、「ＫＧＦの発現を増強するのに充分な量のＩＬ-１αで処理」又は「ＶＥＧＦの発現を増強するのに充分な量のＰＤＧＦで処理」のような語句が意味するものを即座に理解できるであろう。また、当業者であれば、適切なアッセイを実施することによって特定の成長因子の発現が誘導され又は増強されたかどうかを決定することができるであろう。例示的なアッセイには、適切なマーカー、標準(standards)、及び／又は市販のキットを必要に応じて使用するエライザ、ウェスタンブロット、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ等が含まれる。例えば、ＶＥＧＦ、ＫＧＦ又は様々な他の成長因子の定量のためのエライザキットはミネソタ州ミネアポリスのＲ＆Ｄシステムズ社から市販されている。
【００１７】
細胞外マトリックス（「ＥＣＭ」）という用語は細胞の外側に固定されている本質的に全ての分泌分子を包含する。インビボにおいて、ＥＣＭは細胞外空間に秩序を与え、分化された組織及び器官を樹立し、分離し、維持することに関連した機能を提供する。ＥＣＭは例えば結合組織と基底板(basal lamina)とも呼ばれる基底膜(basement membranes)に見出される複合構造体である。結合組織は典型的には細胞によって自然に分泌されるＥＣＭに囲まれる孤立細胞を含む。ＥＣＭの成分は成長及び分化因子、サイトカイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）、メタロプロテアーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰｓ）、及び細胞増殖、遊走、及び分化を調節する他の可溶性因子と相互作用し、及び／又はこれに結合することが実証されている。ＥＣＭとその成分の説明はとりわけGuidebook to the Extracellular Matrix, Anchor, and Adhesion Proteins, 第２版, Kreis及びVale編, Oxford University Press, 1999(「Kreis等」); Geiger等, Nature Reviews Molecular Cell Biology 2:793-803,2001; Iozzo, Annual Review of Biochemistry, 1998, Annual Reviews, Palo Alto, CA; Boudreau及びJones, Biochem. J. 339:481-88, 1999; Extracellular Matrix Protocols, Streuli及びGrant編, Humana Press 2000; Metzier, Biochemistry the Chemical Reactions of Living Cells, 第２版, vol.1, 2001, Academic Press, San Diego, 特に第８章; 及びLanza等, 特に第４章及び第２０章に見出されうる。
【００１８】
ある実施態様はＥＣＭの少なくとも一の成分を含む。ある実施態様では、細胞外マトリックス成分は、少なくとも一の蛋白質、少なくとも一の糖蛋白質、少なくとも一のプロテオグリカン、及び少なくとも一のグリコサミノグリカンの少なくとも一つを含む。例示的な糖蛋白質、プロテオグリカン、及びグリコサミノグリカンには、限定されるものではないが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、ＶＩＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン、ＸＩＩ型コラーゲン、ＸＩＩＩ型コラーゲン、ＸＩＶ型コラーゲン、ＸＶ型コラーゲン、ＸＶＩ型コラーゲン、ＸＶＩＩ型コラーゲン、ＸＶＩＩＩ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、特にラミニン-１、ラミニン-２、ラミニン-４、及びラミニン-５、ルミカン、テネイシン、バーシカン(versican)、パールカン(perlecan)、トロンボスポンジン、特にトロンボスポンジン-２及びトロンボスポンジン-４、又はラミニン、特にラミニン-１、-２、-４、及び-５、アグリン、ナイドジェン、バマカン(bamacan)、デコリン、バイグリカン(biglycan)、フィブロモジュリン、エラスチン、フィブリリン、ヒアルロナン、ビトロネクチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、及びケラタン硫酸が含まれる。
【００１９】
条件細胞培養培地に関して使用される場合、「抽出物(extract)」という用語は、透析、分画、蒸留、相分離、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、中空ファイバー濾過、沈降、濃縮等々によって得られるかどうかにかかわらず、条件培地のフラクションの任意のサブコンポーネントを意味する。
【００２０】
フェノールレッド、「ウシ由来の成分」又は「非ヒト動物産物」に関して使用される場合の「実質的に含まない」と言う用語は、フェノールレッドがほとんどないかそれを含まないか、ウシ由来の成分がほとんどないかそれを含まないか、あるいは非ヒト動物産物あるいはそれらの組合せがほとんどないかそれを含まない、条件培地又は抽出物を意味する。ある実施態様では、条件細胞培養培地は４９．９９９％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、０．５％、０．０５％未満のフェノールレッドを含むか、あるいはフェノールレッドを含まない（０％）。ある実施態様では、条件細胞培養培地は４９．９９９％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、０．５％、０．０５％未満のウシ由来の成分を含むか、あるいはウシ由来の成分を含まない（０％）。ウシ由来の培地成分の例にはウシ胎児血清、仔ウシ血清、ウシ血清、ウシコラーゲン、ウシインスリン、ウシトランスフェリン等々が含まれる。ある実施態様では、条件細胞培養培地は４９．９９９％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、０．５％、０．０５％未満の非ヒト動物産物を含むか、あるいは非ヒト動物産物を含まない（０％）。上に列挙したウシ由来の成分の例に加えて、非ヒト動物産物には、ヒト由来ではない任意の動物産物、例えばブタ由来の組織培養成分及び産物が含まれる。当業者であれば、「無血清」培地及び動物産物を含まない培地が細胞培養培地の幾つかの製造メーカーから市販されていることを知っているであろう。同様に、フェノールレッドを含まない培地はまた市販され又は調製することができる。
【００２１】
医薬部外品的という用語は、製品の使用者に効果を有する少なくとも一の生物学的に活性な成分と少なくとも一の医薬部外品的に許容可能な担体を含有する製剤又は組成物を意味する。医薬部外品は、ある応用と適切な条件下では医薬又は薬物のような恩恵をもたらしうる化粧品とみることができる。例えばある応用では、医薬部外品は皮膚の支持構造に影響を及ぼし、シワの深さを減少させ、あるいは皮膚に対する光酸化又は加齢の影響を覆し又は軽減しうる。医薬部外品は皮膚ケア製品、ヘアケア製品、及びサンケア製品として特に有用でありうる。ある実施態様では、医薬部外品組成物はリポソーム、シクロデキストリン、ポリマー系、又はヒアルロン酸又は関連化合物の少なくとも一つを含む送達系を含む。医薬部外品組成物は医薬部外品的に許容可能な担体を含む。当業者であれば、局所適用に適した製薬的に許容可能な担体又は製剤はまた典型的には医薬部外品的に許容可能な担体又は製剤であることを理解するであろう。
【００２２】
典型的な化粧品又は医薬部外品用軟膏、ローション、又はゲル組成物は、典型的には、化粧品的に許容可能な担体又は医薬部外品的に許容可能な担体、例えば製薬的クリーム基剤、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、ゲル等中に、約１から９９％、約５から９５％、約２０から７５％、又は約５から２０％の、条件培地又はその抽出物を含んでなる活性成分濃度を含む。局所使用用の様々な化粧品用及び医薬部外品用組成物には、条件培地又は抽出物と適切な担体を含むドロップ、チンキ(tinctures)、ローション、クリーム、膏薬(salves)、セラム、溶液、及び軟膏(ointments)が含まれる。各組成物中の条件培地又は抽出物の最適なパーセントは組成物の処方と望まれる治療効果に応じて変わる。
【００２３】
製剤分野の当業者であれば、本発明の組成物が、製品タイプ、組成物の性質、組成物の使用部位、所望される効果等々に応じて、多くの化粧品的、医薬部外品的又は製薬的に許容可能な処方の任意のものを含みうることを理解するであろう。専売製剤が製剤分野で一般的であるが、通常の熟練度の製剤技術者であれば、過度の実験を行わないでも特定の用途に適した処方を決定し又は容易に選択することができるであろう。
【００２４】
当業者であれば、本発明の組成物の適切な担体が、化粧品及び医薬部外品の分野で典型的に見出されるもののような成分：油、ロウ又は他の標準的な脂肪物質、又は一般的なゲル化剤及び／又は増粘剤；乳化剤；保湿剤；エモリエント剤；サンスクリーン剤；親水性又は親油性活性剤、例えばセラミド；フリーラジカルに抗するための薬剤；殺菌薬；金属イオン封鎖剤；保存料；塩基性化又は酸性化剤；香料；界面活性剤；フィラー；天然物質又は天然物質抽出物、例えばアロエ又は緑茶エキス；ビタミン；又は着色物質を含むことを理解するであろう。これらの様々な成分の量は組成物の用途及び所望される化粧品的又は医薬部外品的効果に応じて変わる。
【００２５】
化粧品的及び医薬部外品的に許容可能な成分及び製剤の議論は、とりわけ、FDA Cosmetics Handbook, U.S. Food and Drug Administration; Handbook of Cosmetic and Personal Care Additives, Ash及びAsh編纂, 1994, Chemical Publishing, New York, NY; Bennett's Cosmetic Formulary, 1993, Chemical Publishing Co.; Harry's Cosmeticology, 7版, Wilkinson & Moore, 1982及び8版, Rieger, 2000, Chemical Publishing; Cosmetic Bench Reference-2001, Allerud Publishing Corp.; CTFA Compendium of Cosmetic Ingredient Composition, Nikitakis及びMcEwen編, 1990, Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Washington, D.C., Surfactant Encyclopedia, 改訂2版, Rieger, 1996, Allured Publishing; The Chemistry and Manufacture of Cosmetics, 2版, De Navarre, Van Nostrand, Princeton, N.J.; Encyclopedia of Common Natural Ingredients Used in Food, Drugs, and Cosmetics, Leung, 1996, John Wiley; A Consumer's Dictionary of Cosmetic Ingredients, 5版, Winter, 1999, Three Rivers Press, New York, NY; Cosmeceuticals: Active Skin Treatment, 1998, Allured Publishing; Handbook of Cosmetic Science and Technology, Knowlton及びPearce, 1993, Elsevier Advanced Technology, Oxford, UK; Personal-Care Formulas, 1997, Allured Publishing; Beginning Cosmetic Chemistry, Scheuller及びRomanowski, 1999, Allured Publishing;及びSkin Permeation: Fundamentals and Application, Zatz, 1993, Allured Publishingに見出すことができる。製薬的に許容可能な成分及び製剤の検討はとりわけRemington's Pharmaceutical Sciences, 18版, Gennaro編, 1990, Mack Publishingに見出すことができる。
【００２６】
ある実施態様では、条件培地は無血清又は無動物産物の馴化前培地を用いて製造される。無血清又は無動物産物（しばしば無蛋白と言う）培地は、他にも製造者はあるが、Life Technologies-GibcoBRL, Rockville, MD; Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO;又はBioWhittaker, Walkersville, MDから商業的に入手できる。無血清培地の例には、BioWhittakerのUltraCULTURETM, UltraDOMATM及びUltraCHOTM;Sigma-Aldrichの無血清ハイブリドーマ培地、ＣＨＯ無血清培地、及びＭＤＣＫ無血清培地;及びLife Technologiesのケラチノサイト-SFM (KSFM), AIM V(登録商標)培地, StemPro(登録商標)-34 SFM, ヒト内皮-SFM, マクロファージ-SFM, 及びHepatoZYME-SFMが含まれる。無蛋白培地の例には、BioWhittakerのUltraDOMA-PFTM;Sigma-Aldrichの無動物成分ハイブリドーマ培地、無血清及び無蛋白ハイブリドーマ培地Hybri-Max(登録商標)、ＣＨＯ無蛋白培地、化学的限定ＣＨＯ培地、及びＭＤＣＫ無蛋白培地;及びLife Technologiesの限定ケラチノサイト-SFMが含まれる。当業者は、哺乳動物細胞培養のための無血清培地の使用は充分に確立され、とりわけ、Cold Spring Harbor Conferences on Cell Proliferation, Vol.9, Sato等編, (1982) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Barnes等, Anal. Biochem. 102, 255(1980); BioWhittaker 1999/2000カタログ, pp.42-51; Barnes, Serum-Free Animal Cell Culture, BioTechniques 5(6):534-42; 及びFreshney, Culture of Animal Cells, ３版, Wiley-Liss, New York, NY, 1994に記載されていることを評価するであろう。
【００２７】
ある実施態様では、３次元細胞培養はスキャフォールド(足場)又はフレームワークを含む。３次元細胞培養フレームワークは、とりわけ、米国特許第４９６３４８９号；第５４６０９３９号；及び米国特許出願第０９／１３７５６７号に記載されている；またPachence及びKohn, Biodegradable Polymers, pp.263-77, Principles of Tissue Engineering, 2版, Lanza等編, Academic Press, 2000(適切な材料と選択培地を記載)を参照のこと。他の実施態様では、３次元細胞培養は、収縮コラーゲンゲルを含むコラーゲン基質；ゼラチン基質；又はゲル基質を含む。ある実施態様では、コラーゲン基質はヒトコラーゲンを含む。ある実施態様では、コラーゲン基質はウシコラーゲン、ブタコラーゲン、ラットコラーゲン、あるいはそれらの組合せを含む。ヒドロゲルスキャフォールドとして使用されるコラーゲンゲルは、とりわけ、Pachence及びKohn, Biodegradable Polymers, pp.263-77, Principles of Tissue Engineering, 2版, Lanza等編, Academic Press, 2000；及びParenteau, The First Tissue-Engineered Products, Scientific American 280:83-84, 1999に記載されている。一般には、Principles of Tissue Engineering, Lanza等編, R.G. Landes Co. 及びAcademic Press, 1997；及びPrinciples of Tissue Engineering, 2版, Lanza等編, Academic Press, 2000を参照のこと。
【００２８】
ある実施態様では、条件培地は少なくとも一の遺伝子組換型成長因子、少なくとも一の遺伝子組換型抗酸化剤、及び／又は少なくとも一の遺伝子組換型細胞外マトリックス成分を含み、少なくとも一の成長因子又は抗酸化剤は、蛋白トランスダクションとも呼ばれる細胞進入を増強可能な異種ペプチド配列を含む。異種ペプチド配列は天然に生じる成長因子又は抗酸化剤に見いだせないアミノ酸連続列である。むしろ、異種ペプチドは、遺伝子工学のような一般的な分子生物学の方法を使用して、天然に生じる成長因子又は抗酸化剤の、典型的にはアミノ末端又はカルボキシ末端に又はその近くに導入した。そのような「輸送増強」成長因子、抗酸化剤、又は細胞外マトリックス成分は、適切な条件下で、その天然に生じる対応物よりも簡単に又は速やかに細胞に進入しうる。細胞膜進入又は輸送を増強させることが知られている異種ペプチドの例を以下の表１に示す。
【表１】
【００２９】
当業者であれば、表１に示された輸送ペプチドは典型的にはＬ-アミノ酸を含んでいるが、Ｄ４３-５８のようなＤ-アミノ酸を全体に又は部分的に含んでいる輸送ペプチド(Derossi等)もまた本発明の範囲に入ることは分かるであろう。そのようなペプチドはより安定であるという効果を有しており、例えばＬ-鏡像異性体よりも蛋白質分解を受けにくい。当業者であれば、成長因子、抗酸化剤、又は細胞外マトリックス成分をコードしている核酸配列に作用可能に結合した、限定はしないが例えば表１に示されたペプチド（Ｄ-アミノ酸残基を含むか含まない）の一つのような輸送ペプチドをコードしている核酸配列を含んでなる遺伝子組換型コンストラクトはコンストラクトに応じて誘導的にか又は構成的に輸送増強成長因子、輸送増強抗酸化剤、又は輸送増強細胞外マトリックス成分を産生することが分かる。適切な調節配列、例えば一又は複数のプロモーター、一又は複数のエンハンサー、polyＡコード配列、及び終止配列に作用可能に結合した場合、そのような遺伝子組換型コンストラクトは、当該分野で知られている方法を使用して、適切な条件下で、限定しないがヒト細胞を含む真核細胞を安定に形質転換するために使用されうる。これらの安定に形質転換された細胞は３次元フレームワーク、コラーゲンゲル等々に播種するのに使用でき、ついで一般的な方法を用いて増殖させて３次元培養を産生する。これらの培養からの条件培地は、適切な条件下で、輸送増強成長因子、輸送増強抗酸化剤、及び／又は輸送増強細胞外マトリックス成分を含むであろう。
【００３０】
輸送増強ペプチドの例と輸送増強分子の遺伝子組換方法は、とりわけ、Stephens等, Proc. Natl. Acad. Sci., 印刷中(2001)(www.pnas.org.cgi/doi/pnas.081065198); Schwarze等, Trends in Cell Biology, 10:290-95(2000); Falwell等, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:664-68 (1994); Pooga等, FASEB J. 12:67-77(1998); Vives等, J. Biol. Chem. 272:16010-17(1997); Derossi等, J. Biol. Chem. 271:18188-93(1996); Kwon等, FEBS Letters 485:163-67 (2000); Barka等, J. Histochem. Cytochem. 48:1453-60 (2000); Steffen, Methods in Mol. Biol. 161:141-148 (2001); 及びFutaki等, J. Biol. Chem. 276:5836-40 (2001)に見出すことができる。
【００３１】
一般的な分子生物学の技術とプロトコールの説明は、とりわけ、Ausbel等, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc (1995, 2001年6月7日の補遺版含む)(「Ausbel等」); Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2版, Cold Spring Harbor Press (1989)(「Sambrook等」); Sambrook及びRussell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3版, Cold Spring Harbor Press (2001)(「Sambrook及びRussell」)に見出すことができる。
【００３２】
ここで使用される「輸送増強成長因子」、「輸送増強抗酸化剤」、又は「輸送増強細胞外マトリックス成分」という用語は、対応する天然に生じる成長因子、抗酸化剤、又は細胞外マトリックス成分のように、細胞進入又は輸送以外の、それぞれ成長因子、抗酸化剤、又は細胞外マトリックス成分の性質を持つあらゆる蛋白質又はポリペプチドを意味する。例えば、限定するものではないが、輸送増強ＶＥＧＦと天然に生じるＶＥＧＦである。特定の輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤は（１）輸送ペプチドをコードする遺伝子断片に融合した特定の成長因子又は特定の抗酸化剤をコードする遺伝子断片によりコードされたアミノ酸配列、及びそれから誘導される生物学的に活性なペプチド又はポリペプチド断片、（２）対応する天然に生じる成長因子又は抗酸化剤と比較して一又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を生じる遺伝子断片の天然に生じるアレル変異体及び／又は（３）化学修飾誘導体並びにここで提供されるそれらの核酸及び／又はアミノ酸配列変異体を意味する。
【００３３】
ここで使用される場合、「輸送増強成長因子断片」又は「輸送増強抗酸化剤断片」という用語は、天然に生じる輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤の全長アミノ酸配列より少ない配列を含むが、輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤と実質的に同じ生物学的活性を有するペプチド又はポリペプチドを意味する。そのような断片はアミノ末端、カルボキシ末端が、及び／又は内部が切断されていてもよく、また化学的に修飾されていてもよい。
【００３４】
ここで使用される場合、「輸送増強成長因子誘導体」又は「輸送増強成長因子変異体」という用語は、輸送増強成長因子、又は１）例えば一又は複数のポリエチレングリコール分子、糖類、リン酸塩、又は天然に生じる成長因子に天然には結合していない他のそのような分子の添加によって化学的に修飾され、及び／又は２）天然に生じる成長因子と比較して一又は複数の核酸又はアミノ酸配列の置換、欠失、及び／又は挿入を含む断片を意味する。ここで使用される場合、「輸送増強成抗酸化剤誘導体」又は「輸送増強抗酸化剤変異体」という用語は、輸送増強抗酸化剤、又は１）例えば一又は複数のポリエチレングリコール分子、糖類、リン酸塩、又は対応する天然に生じる抗酸化剤に天然には結合していない他のそのような分子の添加によって化学的に修飾され、及び／又は２）天然に生じる抗酸化剤と比較して一又は複数の核酸又はアミノ酸配列の置換、欠失、及び／又は挿入を含む断片を意味する。
【００３５】
配列パーセント同一性は、二つのポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較するために通常使用されている標準的な方法によって決定することができる。例を挙げると、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡのようなコンピュータプログラムを用いて、配列パーセント同一性が決定される二つのポリペプチドを、その各アミノ酸を最適に一致させるためにアラインさせる（「一致したスパン」は、一方又は両方の配列の全長、あるいは一方又は両方の配列の予め決まった部分を含みうる）。各コンピュータプログラムは「デフォルト」オープニングペナルティ及び「デフォルト」ギャップペナルティ、及びＰＡＭ２５０のようなスコアマトリックスを提供する。標準的なスコアマトリックス（Dayhoff等, Atlas of Protein Sequence and Structure, vol.5,補遺 3(1978)を参照）をコンピュータプログラムに関連して用いることができる。ついで、パーセント同一性はＦＡＳＴＡ：＃＃ＥＱＵ１＃＃のようなプログラムに含まれるアルゴリズムを用いてパーセント同一性を決定することによって計算することができる。
【００３６】
少なくとも７０パーセント同一であるポリペプチドは、対応する天然に生じる成長因子又は抗酸化剤と比較して典型的には一又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有する。通常、置換は蛋白質の全体の真の電荷、極性又は疎水性に対する影響が少ないか影響がないように保存的であるが、場合によっては輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤の活性を増大させるかもしれない。保存的置換を以下の表２にまとめる。
【表２】
【００３７】
ここで使用される場合、「有効量」、「治療的に有効量」、及び「医薬部外品的に有効量」という用語は所望の製薬的又は医薬部外品的効果を生じせしめるのに必要な条件培地又は抽出物の量を意味する。
本発明を実施するのに使用される輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤は、天然に生じる全長ポリペプチド、又は切断されたポリペプチド又はペプチド（すなわち「断片」）でありうる。以下に記載されるように、ポリペプチド又は断片は化学的に修飾されていてもよく、つまりグリコシル化、リン酸化、及び／又はポリマーに結合されていてもよい。また、ポリペプチド又は断片は対応する天然に生じる成長因子又は抗酸化剤の変異体でありうる（つまり、天然に生じる成長因子又は抗酸化剤と比較して一又は複数のアミノ酸の欠失、挿入、及び／又は置換を含みうる）。
【００３８】
全長輸送増強成長因子又はその断片又は全長輸送増強抗酸化剤又はその断片はよく知られたＤＮＡ組換テクノロジーの方法を使用して調製することができる。別法としては、輸送増強成長因子又は断片、あるいは輸送増強抗酸化剤又は断片をコードする遺伝子断片は、Engels等(Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734(1989))によって記載されたもののような、当業者によく知られた方法を使用して化学合成によって調製することができる。これらの方法には、とりわけ、核酸合成のためのリン酸トリエステル、ホスホラミダイト(phosphoramidite)、及びＨ-ホスホナート法が含まれる。そのような化学合成の好適な方法は標準的なホスホラミダイト化学を使用するポリマー支援合成法である。典型的には、輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤をコードするＤＮＡは数百ヌクレオチド長であろう。約１００ヌクレオチドより大きい核酸はこれらの方法を用いて数個の断片として合成することができる。ついで、断片を一緒に結合させて、輸送増強抗酸化剤の全長輸送増強成長因子を形成することができる。ある実施態様では、ポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡ断片は、メチオニン残基をコードするＡＴＧを有している。このメチオニンは輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤の成熟型に存在しているか又は存在していない。
【００３９】
ある場合には、天然に生じる成長因子又は抗酸化剤の核酸及び／又はアミノ酸変異体を調製することが望ましい。核酸変異体（ここで一又は複数のヌクレオチドは野生型又は天然に生じる成長因子又は抗酸化剤とは異なるように設計されている）は、プライマー(群)が所望の点突然変異を有する部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ増幅（突然変異誘発の技術の説明についてはSambrook等、Sambrook及びRussell、及びAusubel等を参照）を用いて製造されうる。上掲のEngels等によって記載された方法を使用する化学合成を用いてこのような変異体を調製することもできる。当業者に知られている他の方法もまた使用できる。好適な核酸変異体は、輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤を製造するのに使用されることになる宿主細胞にコドンを優先するヌクレオチド置換を含むものである。他の好適な変異体は、野生型と比較して上述の保存的アミノ酸変化をコードするもの（例えば、天然に生じるアミノ酸側鎖の電荷又は極性が、異なったアミノ酸との置換によって実質的に変化しないもの）、及び／又は輸送増強蛋白質の成長因子又は抗酸化剤成分上に新規なグリコシル化及び／又はリン酸化部位を生じるように設計されたもの、あるいは輸送増強蛋白質の成長因子又は抗酸化剤成分上の既存のグリコシル化及び／又はリン酸化部位を欠失させるように設計されたものである。
【００４０】
輸送増強成長因子をコードする融合遺伝子断片又は輸送増強抗酸化剤をコードする融合遺伝子断片を、宿主細胞中での発現のために適切な発現ベクター中に挿入することができる。ベクターは典型的には用いられる特定の宿主細胞中で機能性であるように選択される（つまり、ベクターは、融合遺伝子断片の増幅及び／又は融合遺伝子断片の発現が生じるように宿主細胞機構(machinery)と適合性がある)。
【００４１】
典型的には、任意の宿主細胞に使用されるベクターは５'フランキング配列（「プロモーター」とも呼ばれる）とまた他の調節エレメント、例えばエンハンサー(群)、転写終結エレメント、ドナー及びアクセプタースプライス部位を含む完全イントロン配列、シグナルペプチド配列、リボソーム結合部位エレメント、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、及び選択マーカーエレメントを含む。これらのエレメントの各々を以下に検討する。場合によっては、ベクターは「タグ」配列、つまりポリHis（例えばヘキサHis）をコードする輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤又は他の免疫原性小配列の５'又は３'末端に位置するオリゴヌクレオチド配列を含んでいてもよい。このタグは蛋白質と共に発現され、宿主細胞からの輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤の精製のための親和性タグとなりうる。場合によっては、タグは、続いて適切なペプチダーゼを用いるもののような様々な手段によって精製輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤から除去することができる。
【００４２】
５'フランキング配列は同種（つまり宿主細胞と同じ種及び／又は系統由来）、異種（宿主細胞種又は系統以外の種由来）、ハイブリッド（つまり一を超える供給源由来の５'フランキング配列の組合せ）、合成であり得、又は天然の成長因子又は抗酸化剤５'フランキング配列でありうる。このように、５'フランキング配列の供給源は、５'フランキング配列が宿主細胞機構中で機能的であり、それによって活性化され得ると仮定して、任意の真核細胞、典型的には哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞でありうる。
【００４３】
この発明のベクターに有用な５'フランキング配列は当該分野でよく知られている幾つかの方法の任意のものによって得ることができる。典型的には、天然に生じる成長因子又は抗酸化剤５'フランキング配列以外のここで有用な５'フランキング配列はマッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって既に同定されており、よって適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して適切な組織供給源から単離することができる。ある場合には、５'フランキング配列の全ヌクレオチド配列は既知でありうる。ここで、５'フランキング配列は一般的な分子生物学の方法を使用して合成してもよい。
【００４４】
５'フランキング配列の全部又は一部のみが既知の場合、それはＰＣＲを用いて、及び／又は適当なオリゴヌクレオチド及び／又は同じ又は他の種の５'フランキング配列断片を用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。
５'フランキング配列が未知の場合、５'フランキング配列を含むＤＮＡ断片は、例えばコード化配列又は他の遺伝子又は遺伝子群でさえ含みうる大きなＤＮＡ片から単離することができる。単離は適切なＤＮＡ断片を単離するために一又は複数の注意深く選択した酵素を用いた制限エンドヌクレアーゼ消化によって達成することができる。消化後に、所望の断片はアガロースゲル精製法、Qiagen(登録商標)カラム(Valencia, CA)又は当業者に知られている他の方法によって単離することができる。この目的を達成するための適切な酵素の選択は当業者には直ぐに明らかであろう。
【００４５】
転写終結エレメントは典型的には輸送増強成長因子コード配列又は輸送増強抗酸化剤コード配列の３'末端に位置し、輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤の転写を終結させる。
選択マーカー遺伝子エレメントは、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のような直ぐに同定可能なマーカー、あるいはＧ４１８のような選択培養培地中での宿主細胞の生存及び成長に必要な蛋白質をコードする。
【００４６】
一般に真核生物中のKozak配列と呼ばれるリボソーム結合エレメントはｍＲＮＡの翻訳開始に必要である。そのエレメントは典型的には合成される輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤のコード配列に５'が、プロモーターに３'が位置している。
多くの場合、輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤の転写はベクターに一又は複数のイントロンがあると増大される。これは、輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤が真核生物宿主細胞、特に哺乳動物宿主細胞において産生される場合に特にしかりである。使用されるイントロンは、特に使用される成長因子又は抗酸化剤配列が全長ゲノム配列又はその断片である場合、対応する成長因子又は抗酸化剤配列内で天然に生じうる。イントロンが成長因子又は抗酸化剤配列内で天然に生じない場合（殆どのｃＤＮＡｓに対して）、イントロン(群)は他の供給源から得ることができる。５'フランキング配列及び成長因子又は抗酸化剤コード配列に対するイントロンの位置は、イントロンが効果的であるには転写されなければならないので、重要である。従って、成長因子又は抗酸化剤核酸配列がｃＤＮＡ配列である場合、イントロンの好適な位置は３'が転写開始部位で、５'がポリＡ転写終結配列にある。成長因子又は抗酸化剤ｃＤＮＡｓに対して好ましくは、イントロンはコード配列を妨害しないように成長因子又は抗酸化剤コード配列の一側又は他側（つまり５'又は３'）に位置する。挿入される宿主細胞(群)とで適合性があるならば、あらゆるウイルス又は真核生物を含むあらゆる供給源からのあらゆるイントロンを用いてこの発明を実施することができる。ここでまた包含されるものは合成イントロンである。場合によっては、一を超えるイントロンをベクター中で使用してもよい。
【００４７】
上述のエレメントの一又は複数が使用されるベクター中にまだ存在していない場合、それらは個々に得られベクター中に結合させることができる。エレメントの各々を得るために使用される方法は当業者によく知られており、上述の方法に相当する（つまり、ＤＮＡの合成、ライブラリースクリーニング等々）。
【００４８】
この発明を実施するために使用される最終のベクターは典型的には市販のベクターのような出発ベクターから構築される。そのようなベクターは完成したベクター中に含められるエレメントの幾つかを含んでいても含んでいてなくてもよい。所望されるエレメントのどれも出発ベクター中に存在していない場合、各エレメントは、結合させるエレメントの端部とベクターの端部が結合に適合するように適切な制限エンドヌクレアーゼ(群)を用いてベクターを切断することによってベクター中に個々に結合させることができる。ある場合には、満足すべき結合を得るために互いに結合させる末端を「平滑にする」ことが必要である。末端平滑化は全ての４つのヌクレオチドの存在下でクレノウＤＮＡポリメラーゼ又はＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて「粘着末端」を最初に埋めることによって達成される。この手順は当該分野でよく知られており、例えばSambrook等に記載されている。
【００４９】
別法として、ベクター中に挿入されるエレメントの二又はそれ以上を最初に互いに結合させ（それらが互いに隣接して位置せしめられる場合）、ついでベクター中に結合させる。
ベクターの他の構築法は一反応混合物中で様々なエレメントの全てを同時に結合させることからなる。ここで、多くのナンセンス又は無機能ベクターがエレメントの不適切な結合又は挿入のために産生されるが、機能性ベクターが同定され制限エンドヌクレアーゼ消化によって選択されうる。
【００５０】
この発明を実施するための好適なベクターは哺乳動物宿主細胞、特にヒト細胞と適合性があるものである。当業者は、そのようなベクターが商業的に入手できることを知っている。ベクターを構築し、輸送ペプチド及び成長因子又は抗酸化剤をコードする遺伝子断片をベクターの適切な部位に挿入した後、完成したベクターを適切な宿主細胞中に挿入しうる。
適切な細胞又は細胞系統は哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞、例えばヒト真皮線維芽細胞、ケラチノサイト、又は上述したような、３次元培養に適した他の細胞タイプでありうる。
【００５１】
選択された宿主細胞中へのベクターの挿入は、塩化カルシウム沈降、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション又はＤＥＡＥ-デキストラン法のような方法を使用して達成することができる。選択される方法は部分的には使用される宿主細胞のタイプの関数である。これらの方法と他の適切な方法は当業者によく知られており、例えばSambrook等、Sambrook及びRussell、又はAusbel等に記載されている。
ベクターを含む宿主細胞は当業者によく知られた標準的な培地を用いて培養することができる。培地は通常、細胞の成長と生存に必要なあらゆる栄養物を含む。宿主細胞は、ベクターの長期の存在に応じて、一過性に形質転換されるか又は安定に形質転換されうる。典型的には、安定に形質転換される細胞が３次元培養の播種には望ましい。
【００５２】
宿主細胞中に産生される輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤の量は当該分野で知られた標準的な方法を使用して評価することができる。そのような方法には、限定されるものではないが、エライザ、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫沈降等々が含まれる。
上述した本発明は実施例を参照することによってよりよく理解される。次の実施例は例証のためのみのものであって、決して本発明の範囲を制限するものと考えてはいけない。
【００５３】
実施例１
線維芽細胞単層細胞培養
ヒト***から単離した正常なヒト真皮線維芽細胞を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で１０％仔ウシ血清(Hyclone Laboratories, Logan, UT)、非必須アミノ酸(GibcoBRL)、及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン-ストレプトマイシン-２５０ｎｇ／ｍｌアンホテレシンＢ(GibcoBRL)（「ＤＭＥＭ１」）を補填した馴化前細胞培養培地（この実施例では、高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ；GibcoBRL, Grand Island, NY)）を用いる単層培養で１５０ｃｍ２組織培養フラスコ（Corning, Corning, NY）中にて培養した。単層培養には週に２回新鮮な馴化前培地を供給し、記載されているように、１から１０スプリットを使用して毎週継代させた。一般には、Pinney等, J. Cell. Physio., 183:74-82 (2000)を参照のこと。真皮線維芽細胞をまたＤＭＥＭ１を含むローラーボトル中で増量させてもよい。これらの単層培養からの条件培地を集め、将来の使用のために保存した。
【００５４】
この実施例における例証には線維芽細胞を用いたが、当業者であれば、多くの他のタイプの細胞、例えば限定されないが他の上皮細胞タイプ、内皮細胞、平滑筋細胞、単球、ケラチノサイト、軟骨細胞等々を単層培養及び３次元培養で成長させることができることは分かるであろう。
【００５５】
実施例２
線維芽細胞３次元培養
例えば実施例１のヒト真皮線維芽細胞を、一般的な技法を用いてコラーゲン基質中に懸濁させるか様々な３次元フレームワーク上に播種することができる。例えば、細胞は、３次元乳酸塩／グリコール酸塩ポリマーフレームワーク又はポリグラクチン(polyglactin)９１０（ポリグリコール酸対ポリ乳酸が９０：１０のコポリマー）の生体分解性メッシュファイバーからなる縫合材料に一般的に使用される物質であるVicrylTMのような生体吸収性ポリグラクチンメッシュフレームワーク上に播種することができる。
【００５６】
線維芽細胞を、１０％ウシ血清、２ｍＭのＬ-グルタミン、非必須アミノ酸、及び５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸塩(J.T.Baker)を補填した無抗生物質の高グルコースＤＭＥＭ(「ＤＭＥＭ２」)中にて３次元乳酸塩／グリコール酸塩コポリマーフレームワーク上で、およそ２週間培養した。ＤＭＥＭ２の存在下、細胞成長に適した条件下で、線維芽細胞は増殖してフレームワークの格子間を満たす。細胞はコラーゲン及び他の細胞外マトリックス成分、成長因子、及びサイトカインをとりわけ分泌し、３次元ヒト組織、例えばとりわけ糖尿病性足部潰瘍の治療用に開発された組織工学製品であるDermagraft(登録商標)を作り出す（Advanced Tissue Sciences, La Jolla, CA）；Naughton, Dermal Equivalents, pp.891-902, Principles of Tissue Engineering, 2版, Lanza等編, Academic Press, 2000を参照のこと。
【００５７】
培養物に馴化前ＤＭＥＭ２を用いて３−４日毎に栄養補給し、条件培地を収集し、１０日目後に直ぐに試験するか、又は将来の試験のために−２０℃で凍結させた。条件培地の一調製物中の様々な成長因子及びサイトカインの濃度を定量するために、適当な市販のヒト成長因子エライザキット（Quantikine(登録商標)Immunoassays, R&D Systems, Minneapolis, MN）を用いて免疫検査を実施した。馴化前ＤＭＥＭ２を並行してネガティブ(バックグラウンド)コントロールとしてアッセイした。アッセイは種特異的であると特定されたが、ウシ血清のあるロットはＴＧＦβエライザで低レベルの交差反応性を示した。表３に示すように、条件培地は少なくとも６種の培養誘導成長因子を含んでいた。
【表３】
【００５８】
当業者であれば、これらの例示的な実施例は培養されている細胞のタイプに応じたＤＭＥＭ系馴化前培地を記述しているが、多くの他のタイプの細胞培養培地を使用することができることは分かっているであろう。例示的な細胞培養培地には、とりわけ、Sigma-Aldrich、Life Technologies-GibcoBRL、又はBioWhittakerから市販されている最小必須培地イーグル（ＭＥＭ）、ケラチノサイト培地、メラニン細胞培地、肝細胞培地、羊膜細胞培地、骨髄培地、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＢＧＪｂ培地（Fitton-Jackson改変）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｌ-１５培地（Liebovitz）、マッコイ５Ａ改変培地、ＭＣＤＢ培地、培地１９９、ハムＦ-１０培地、ハムＦ-１２培地、ＲＰＭＩ-１６４０、ウェイマウス培地等々が含まれる。
【００５９】
実施例３
代替の３次元線維芽細胞培養
８継代のヒト真皮線維芽細胞を、ローラーボトルの内面付近又は内面に位置した殺菌ナイロンメッシュのスキャフォールド(Industrial Fabrics)を含む一般的な１７５０ｃｍ２の波形ローラーボトル（Nalge又はNunc）中に播種した。８継代の線維芽細胞を１ローラーボトル当り約４−６ｘ１０７細胞の密度で播種し、抗生物質非含有馴化前培地(２ｍＭのＬ-グルタミン(Life Technologies)、非必須アミノ酸(Life Technologies)、５６ｍｇ／ｌのＬ-アスコルビン酸(J.T. Baker)、及び１０％仔ウシ血清(HyClone Laboratories)を補填したＤＭＥＭ(#078-0521-189, Life Technologies-Gibco))で培養した。ローラー装置でローラーボトルを３７℃にてインキュベートした。ローラーボトル中の培地を上述の馴化前培地を用いて毎日又は一日おきに取り替え、条件細胞培養培地を集めた。QuantikineヒトＶＥＧＦアッセイ（R & D Systems, Minneapolis, MN）を製造者に指示に従って用いて、条件培地中のＶＥＧＦレベルをエライザによって定量した。
【００６０】
２．５ミクロン等級の３ＭＴＭ５２２ハイパフォーマンス液体フィルターバッグ(Southcoast)を用いて細胞残屑のような大きな粒状物質を除去して、条件培地を前濾過し、「濾過培地」(１Ｘ条件培地とも称する)をつくった。ある種の用途に対しては、濾過培地をクロスフロー中空ファイバー限外濾過カートリッジ(モデル＃UFP-10-C-55A, A/G Technology Corp., Needham, MA)にて、製造者の操作ガイドに従って、毎分２５リットルの流量で濃縮した。最初の濃度のおよそ３倍から１５倍まで濃縮した「栄養剤液」（１０Ｘ条件培地とも称する）を集めた。
【００６１】
１Ｘ及び１０Ｘ条件培地が、化粧品的に許容可能な、医薬部外品的に許容可能な又は製薬的に許容可能な担体と共に化粧品、医薬部外品又は製薬処方物を含有する組成物を調製するために処方者によって使用される。当業者であれば、化粧品的に許容可能な担体、医薬部外品的に許容可能な担体及び製薬的に許容可能な担体は、組成物の意図される用途に応じて、同じであるか異なっていてもよい。
【００６２】
当業者であれば、この実施例ではローラーボトルが記載されているけれども、如何なる数のバイオリアクターでも、記載された条件を適当に変更して用いることができることは分かるであろう。当業者であればまた如何なる数の条件培地処理方法でも、例えば限定するものではないがクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、相分離、噴霧乾燥、蒸発、凍結乾燥等々、当該分野で知られた方法を用いて実施することができることが分かるであろう。
【００６３】
実施例４
細胞増殖に対する条件培地の効果
例えば実施例２において測定したように培養誘導成長因子が生物学的に活性であることを実証するために、ヒトケラチノサイト又は線維芽細胞を条件培地と共にインキュベートし、その増殖を測定した。簡単に述べれば、５ｘ１０３のヒトケラチノサイト又はヒト線維芽細胞を９６ウェルプレートのウェル中に播種した。これらの細胞に無血清培地、馴化前培地、又は１０％(ｖｏｌ／ｖｏｌ)の濃縮条件培地を補填した馴化前培地を供給し、４８時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を凍結溶解させ、２００ｍＬのCyquant染料を添加し(Molecular Probes, Eugene, OR)、Cytoflourで蛍光を測定した。ＥＢＭコントロールをベースラインに用いた。図１に示されるように、この実験では、ケラチノサイトと線維芽細胞の両方の増殖は条件培地において最も大であった。
【００６４】
実施例５
条件培地の抗酸化効果
この実施例は条件培地の抗酸化活性を実証する。ケラチノサイトＳＦＭに入った一次表皮ケラチノサイト(GibcoBRL)を一般的な１２ウェルの組織培養プレートに１ｘ１０５細胞／ｃｍ２で蒔き、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて一晩インキュベートした。次の日に、培地を新鮮なケラチノサイトＳＦＭ、ＤＭＥＭ１、又は条件培地を補填したＤＭＥＭ１と置き換えた。プレートをインキュベーターに戻して１０日間培養した。細胞はＰＢＳ中で一回洗浄した後、ジヒドロローダミン１２３（Molecular Probes, Eugene OR）を、ＤＭＳＯ中１ｍＭの原液を用いて１ｕＭの最終濃度まで添加した。ジヒドロローダミン１２３は非蛍光形態で細胞膜にインターカレートする。酸化したところで、この染料が蛍光のローダミン誘導体に転換される。よって平均蛍光は全細胞内酸化状態の尺度である。Handbook of Fluorescent Probes and Research Product, 8版, 19章, Molecular Probes, Eugene, OR; Royall等, Arch. Biochem. Biophys. 302:348-55 (1993)を参照のこと。
【００６５】
インキュベーターで更に３０分細胞をインキュベートした後、トリプシン処理し２-パラホルムアルデヒドに固定した。蛍光強度をFACScan(Becton-Dickinson)で測定する。この実験では、条件培地で成長させられた細胞が、馴化前培地又は無血清培地の何れかで成長させられた細胞と比較して有意に低い細胞内酸化レベルを有していた（図２参照）。
【００６６】
実施例６
条件培地中の抗酸化剤のＨＰＬＣ分析
培養された培地中に存在する特異的抗酸化剤を定量するために、実施例３の濾過培地の一定分量を、ＨＰＬＣ電気化学検出システム(Couloarray Detection System, ESA Inc)を用いて分析した。電気化学的検出器を、化合物と代謝産物の２次元特徴付けのためにＵＶ検出器と直列に配した(Roy等, Simultaneous Detection of Tocopherols and Tocotrienols in Biological Samples Using HPLC-Coulometric Electrode Array. Meth. Enzymol., 2001(印刷中))。
【００６７】
ａ．ビタミンＥ(α-トコフェロール及びγ-トコフェロール)
１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、ＢＨＴ(１０ｍｇ／ｍｌ)及びＳＤＳを含むリン酸緩衝生理食塩水を試料に添加した。混合物を４℃で１５分間激しく撹拌し、エタノールを添加した。ビタミンＥをヘキサンで抽出した。ヘキサン相を集め、窒素下で乾燥させた。試料をビタミンＥ移動相に再溶解させＨＰＬＣ系に注入した。記載されているようにして（Sen等, Molecular basis of vitamin E action. Tocotrienol potently inhibits glutamate-induced pp60(c-Src) kinase activation and death of HT4 neuronal cells. J Biol Chem. 2000 Apr 28;275(17):13049-55; Roy等, Simultaneous Detection of Tocopherols and Tocotrienols in Biological Samples Using HPLC-Coulometric Electrode Array. Meth. Enzymol. 2001 (印刷中)）、信頼できる化合物を用いて標準曲線を作成した。図３Ａに示されているように、この濾過培地調製物は１．６２μＭのα-トコフェロールと０．０６μＭのγ-トコフェロールを含有していた。
【００６８】
ｂ．グルタチオン
グルタチオン(ＧＳＨ)を酸性化された試料から抽出し、Ｃ-１８カラム(１５０ｍｍｘ４．６ｍｍ、５μｍ孔径; Alltech, Deerfield, IL)をＧＳＨの分離に使用した。ＨＰＬＣを、記載されているようにして実施した（Sen等, Molecular basis of vitamin E action. Tocotrienol potently inhibits glutamate-induced pp60(c-Src) kinase activation and death of HT4 neuronal cells. J Biol Chem. 2000 Apr 28;275(17):13049-55）。図３Ｂに示されているように、この濾過培地調製物は３．３６ｎＭのＧＳＨを含んでいた。
【００６９】
ｃ．システインとシスチン
試料を８％のｍ-リン酸を使用して酸性化し、蛋白質を遠心分離により沈殿させた。得られた抽出物を濾過し、ＨＰＬＣ装置に注入した。シスチン(酸化形態)の検出のために、最初に試料を室温で１０分間２-メルカプトエタノールで処理した後、記載されているようにして８％のｍ-リン酸で酸抽出を行った。ＨＰＬＣ条件は、移動相に対して組成が５０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ３．０)である以外はグルタチオンのものと同様であった。図３Ｃ及びＤにそれぞれ示されるように、この濾過培地調製物は１０．６４μＭのシステイン(還元形)と１１２．１μＭのシステインとシスチンを含んでいた。
【００７０】
まとめると、これらの結果は、条件培地が培養誘導抗酸化剤を含有していることを実証している。ユビキノン、ユビキノール、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ等々のような更なる抗酸化剤のためのＨＰＬＣ検査を同じ又は同様の方法を使用して実施することができる。別法として、抗酸化剤酵素活性を、当該分野で知られているように、適切な酵素アッセイを用いて定量することができる。
【００７１】
実施例７
コラーゲンの沈着に対する条件培地の効果
この実施例は３次元細胞培養中の線維芽細胞による細胞外マトリックス成分の沈着に対する条件培地の効果を実証している。コラーゲンＩ型のプロペプチド（コラーゲンＩ型テロペプチドとしても知られている）をコラーゲンＩ型の指示薬として用い、コラーゲンＩ型自体は細胞外マトリックス成分の生成の指示薬である。条件培地をDermagraft(登録商標)法における末期培地の変化から得て（約２週間）、窒素圧下で濃縮器(Amicon, Beverley, MA)での限外濾過によって濃縮した。条件培地の体積を元の体積の約１０分の１まで濃縮して、濃縮した条件培地を集めた。ＤＭＥＭ１に入れたヒト真皮線維芽細胞を５ｘ１０３細胞／ウェルで９６ウェルの組織培養プレートのウェル中に播種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中に約４８時間配した。培地をＤＭＥＭ１か、１０％の濃縮した条件培地を補填したＤＭＥＭ１と置き換えて、条件培地の最終濃度を約１Ｘとした。プレートを約２４時間の間インキュベーターに戻した。上清を各ウェルから集めて、市販のコラーゲンＩ型プロペプチドエライザ(タカラバイオメディカルズ，日本)を製造者の指示書に従って使用してコラーゲンＩ型プロペプチドの有無を検査した。
【００７２】
図４に示されるように、この実験では、馴化前培地に維持された培養物と比較して条件培地に維持された培養物中にコラーゲンの沈着の統計的に有意な増加(ｐ＝０．０５)が観察された。当業者であれば、コラーゲンのような細胞外マトリックス成分のインビボでの沈着の亢進は、とりわけ皺や起伏(contour)の欠陥の局所的処置にとって重要であることを理解しているであろう。
【００７３】
実施例８
無血清又は非ヒト動物産物非含有条件培地
この予言的実施例は常法を用いて馴化前UltraCULTURETM無血清培地へ例示的な血清含有馴化前ＤＭＥＭ培地で成長させたヒト真皮線維芽細胞培養物を適合させることを例証する。例えばBioWhittaker 1999/2000カタログの４２−４５頁を参照のこと。UltraCULTURETM(BioWhittakerカタログ番号12-725F)培地に製造者の指示に従ってＬ-グルタミン(カタログ番号17-605)を補填する(馴化前UltraCULTURETM無血清培地)。
【００７４】
ヒト真皮線維芽細胞の単層培養物を、１０％仔ウシ血清(Hyclone Laboratories, Logan, UT)、非必須アミノ酸(GibcoBRL)及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン-ストレプトマイシン-２５０ｎｇ／ｍｌアンホテレシンＢ(GibcoBRL)を補填した馴化前ＤＭＥＭ細胞培養培地(高グルコースダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ； GibcoBRL, Grand Island, NY))を用いて実施例１に記載されているようにして調製する。細胞を継代させ、馴化前UltraCULTURETM無血清培地を希釈剤として用いて１：２に分けた。細胞を皿に蒔き、必要に応じて馴化前UltraCULTURETM無血清培地を供給しながら最大の細胞密度が得られるまで３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターでインキュベートした。
【００７５】
細胞が少なくとも８５％の生存性を示していない場合、細胞を一継代に対して０．５％仔ウシ血清(HyClone Laboratories)を補填した馴化前UltraCULTURETM無血清培地を用いて１：２の比率で継代させた。それぞれの連続する継代に対して仔ウシ血清の量は、５代の継代後に馴化前UltraCULTURETM無血清培地が血清を含まないように、０．１％減少させる。この時点で、実施例２又は３に記載されているようにして、線維芽細胞を３次元培養で増殖させることができるが、但し、細胞は必要に応じてアスコルビン酸が補填された馴化前UltraCULTURETM無血清培地に維持される。条件無血清培地を適切な間隔で集める。
【００７６】
線維芽細胞単層培養が馴化前UltraCULTURETM無血清培地で成功裏に成長させられるのに適合しない場合、交互のウィーニングプロセスを使用する。細胞を記載されているようにして継代させ、３５０ｘｇで５分遠心分離させ、５％仔ウシ血清(Hyclone)を含む馴化前UltraCULTURETM無血清培地に再懸濁させ、１：２に分け、再び蒔いた。次の継代において、細胞ペレットを２％仔ウシ血清を含む馴化前UltraCULTURETM無血清培地に再懸濁させ、記載されているようにして分けて、蒔いた。次の５代の継代において、ペレットを２％、ついで１％、ついで０．５％、ついで０．１％、最後に０％の仔ウシ血清を含む馴化前UltraCULTURETM無血清培地に再懸濁させ、蒔いた。この時点で線維芽細胞は、実施例２又は３に記載されているようにして、３次元培養で増殖させることができるが、但し、細胞は馴化前UltraCULTURETM無血清培地に維持される。条件培地が必要に応じて集められる。
【００７７】
UltraCULTURETM無血清培地をこの予言的実施例に対して選択したが、とりわけそれがＤＭＥＭ系培地であり、ＨｕＳ-１＊ＡＴ皮膚細胞株を含む多くのヒト細胞株の成長を支援することが分かっているからである。BioWhittaker 1999/2000カタログ番号の４６−４７頁を参照のこと。しかしながら当業者ならば、多くの無血清及び動物産物非含有培地もまた様々なヒト細胞の成長を支援する合理的な可能性があり、そのような培地を過度の実験を行うことなく常套的に評価することができることが分かるであろう。
【００７８】
この予言的な実施例は例示的な馴化前無血清培地へ例示的な馴化前ＤＭＥＭ細胞培養培地で成長させたヒト真皮線維芽細胞を適合させることを記述しているが、当業者ならば、同じ手順を用いて、血清含有又は無血清培地の何れかにおける様々な培養細胞を馴化前動物産物非含有培地での成長に適合させることができることが分かるであろう。動物産物非含有培地での成長への適合化に続いて、そのような細胞は、記載されているようにして３次元培養で増殖させることができ、非ヒト動物産物非含有条件培地を必要に応じて集める。
【００７９】
実施例９
ＫＧＦの発現の増強
この実施例は適切な条件下での３次元培養中におけるヒト真皮線維芽細胞によるケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）分泌の誘導を実証する。およそ１１ｍｍｘ１１ｍｍのDermagraft(登録商標)片を２４ウェルの組織培養プレートのウェルに配した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに維持し、ＤＭＥＭ２か１ｎｇ／ｍｌの濃度のインターロイキン-１-アルファ(ＩＬ-１α)を補填したＤＭＥＭ２を供給した。条件培地を２４時間毎に集めた。条件培地中のＫＧＦの濃度は製造者の指示に従ってヒトＫＧＦイムノアッセイ(Quantikine, R & D Systems)を使用して決定した。図５に示された結果は、この実験において、ＩＬ-１αの存在下でDermagraft(登録商標)試料から条件培地中に存在しているＫＧＦのレベルがＩＬ-１αの不存在下の場合よりもおよそ４倍大きいことを実証している。よって、この実験において、３次元培養におけるヒト真皮線維芽細胞によるＫＧＦの発現はＩＬ-１αによって増強された。
【００８０】
実施例１０
ＶＥＧＦの発現の増強
この実施例は適切な条件下で３次元培養中でのヒト真皮線維芽細胞によるＶＥＧＦの発現が増強されうることを実証する。３次元ヒト真皮線維芽細胞培養物に馴化前ＤＭＥＭ２か０．５、１、２、４又は８ｎＭのＰＤＧＦ ＡＢ（組み合わせたＡ鎖及びＢ鎖）を補填した馴化前ＤＭＥＭ２を供給した。３７℃で４８時間のインキュベーション後、条件細胞培養培地を取り除き、典型的には収集日に試験した。６つの条件培地試料中に存在するＶＥＧＦの量（０、０．５、１、２、４及び８ｎＭのＰＤＧＦ）を製造者の指示に従ってQuantikineヒトＶＥＧＦイムノアッセイキット(カタログ番号DVE00, R & D Systems)を用いて測定した。図６に示されるように、馴化前培地中に増加した量のＰＤＧＦが存在するとＶＥＧＦの分泌が増加した。この実験では、外因性ＰＤＧＦの不存在下での３次元培養によりおよそ１．３ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦが生産される一方、８ｎＭまでのＰＤＧＦを含有する培地での平行培養によりおよそ６ｎｇ／ｍｌまでのＶＥＧＦが産生された。これらの結果は、ＶＥＧＦの分泌レベルが、ナノモル又はナノモル以下の濃度のＰＤＧＦの存在下で増強され得ることを実証している。
【００８１】
実施例１１
培養条件によるＶＥＧＦの分泌の比較
ＶＥＧＦの分泌に対する培養条件の効果を評価するために、ヒト真皮線維芽細胞を、ａ）単層培養、ｂ）３次元コラーゲンゲル培養、ｃ）３次元緊縮コラーゲンゲル培養、及びｄ）３次元スキャフォールドで平行して成長させた。単層培養に対しては、３ｘ１０６継代の８のヒト真皮線維芽細胞を１００ｍｍの組織培養皿に播種した。３次元スキャフォールドはウシ胎仔血清に前もって浸した５．５ｘ５．５ｃｍのシラスティック(silastic)裏のニットナイロンメッシュ(Biobrane(登録商標), Dow Hickum)を含んでいた。前処理に続いて、スキャフォールドを１００ｍｍの組織培養皿に配し、３ｘ１０６の継代の８のヒト真皮線維芽細胞をスキャフォールド上に播種した（「スキャフォールドベース」）。皿を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに配し、細胞に１０％仔ウシ血清、２ｍＭのＬ-グルタミン、５０μｇ／ｍｌのアスコルベート-ホスフェート、及び１０Ｕ／ｍｌのペニシリン-ストレプトマイシンを補填したＤＭＥＭを供給した。
【００８２】
二つのコラーゲンゲル培養物を、１０ｍｌのVitrogen(Collagen Corp.)に３ｘ１０６の継代の８のヒト真皮線維芽細胞を懸濁させることによって調製し、懸濁液を一般的な１００ｍｍの組織培養皿(「ストレスゲル」)か、又は収縮コラーゲンゲル培養に対しては、１００ｍｍの非処理培養皿(Costar)(「収縮ゲル」)に注いだ。皿を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに配し、細胞に１０％仔ウシ血清、２ｍＭのＬ-グルタミン、５０μｇ／ｍｌのアスコルベート-ホスフェート、及び１０Ｕ／ｍｌのペニシリン-ストレプトマイシンを補填したＤＭＥＭを供給した。コラーゲンは懸濁液中の線維芽細胞とインキュベーター中で速やかに重合した。一般的な組織培養皿中のコラーゲンポリマーは皿の側面に接触したままであった。これに対して、非処理培養皿中のコラーゲンポリマーは収縮し、ポリマーを培養皿の側面から離れるように引っ張った。
【００８３】
培養物に３日から４日毎に新鮮な馴化前培地を供給した。約２週間後に条件培地を４つの培養系の各々から収集し分析した。４つの培養の各々によって産生されたヒトＶＥＧＦの量を、QuantikineヒトＶＥＧＦイムノアッセイ(R & D Systems)を製造者の指示に従って用いて決定した。１日当たり１０６細胞につき分泌されたＶＥＧＦのナノグラムに基づいて結果を標準化した。図７に示されるように、この実験では、単層培養は１ｎｇＶＥＧＦ／１０６細胞／日未満分泌し、ストレスコラーゲンゲルと収縮コラーゲン培養はおよそ１．５ｎｇＶＥＧＦ／１０６細胞／日及び０．５ｎｇＶＥＧＦ／１０６細胞／日をそれぞれ分泌した。スキャフォールドベースの培養は、比較すると、４．０ｎｇを越えるＶＥＧＦ／１０６細胞／日を分泌した。
【００８４】
実施例１２
条件培地の安全性の研究
医薬部外品組成物に使用される条件培地の安全性を評価するために、栄養剤液をヒト患者に局所的に塗布し、正常及び擦過条件下に逐次的かつ連続して暴露した後の皮膚の炎症の出現を決定した。
【００８５】
栄養剤液を標準的な化粧品安全性プロトコルを使用して正常なヒトの成人の前腕皮膚に対する一次刺激及び蓄積性刺激について検査した。二百マイクロリットルのコントロール又は栄養剤液の何れかを上腕部の３．８ｃｍ２の密閉パッチ(Webril不織布コットンパッド)に塗布した。パッチを３Ｍ(登録商標)低アレルギー誘発性テープに配した。一次刺激研究には１５人の被験者（女性１３人と男性２人、２８−７７歳）が関与した。栄養剤液を２回の２４時間のインターバルで被験者の上腕部の正常な及び剥ぎ取られた(abraided)(Transporeテープを使用してテープを５回剥がして角質の外層を除去)皮膚上の密閉パッチに塗布した。蓄積性刺激の研究には３１人の被験者（女性２１人と男性１０人、２０−６５歳）が関与した。被験者１人がテープの刺激のために、また１人が個人的な理由から取り止めた。女性１９人と男性１０人の２９人が実験を最後まで行った。栄養剤液は上腕部に１４、連続、２４時間の適用であった。全体の観察は、光沢、ピーリング、かさぶた形成(scabbing)、ひび、色素沈着過度及び低色素沈着(hypopigmentation)に対して等級付けした。刺激性について５点の段階で目で見てスコアをつけ、紅斑、浮腫、丘疹、小水疱、水疱反応、湿潤性(weeping)、広がり、及び硬性(induration)に対して数的に等級をつけた。有資格の医療専門家が決定したところ、これらの研究では栄養剤液又はコントロールによって有害事象は誘発されなかった。
【００８６】
実施例１３
条件培地の効果の研究
正常な及び光損傷を受けたヒトの皮膚の組織に対する栄養剤液の医薬部外品的効果を評価するために、密閉パッチ検査を、本質的に実施例１２に記載されたようにして実施した。栄養剤液を含む密閉パッチを６人の女性の被験者（３７−４６歳）の各人の前腕部に月曜日から金曜日まで毎日貼り、土曜日に検査を行った。３人の被験者が５日間パッチを付け、３人の被験者が１２日間付けた。パンチバイオプシー（２ｍｍ）を最後の次の日のパッチから取った。バイオプシーを１０％のホルマリンに固定し、パラフィンに埋め込み、４ミクロンの切片を切り出し、コラーゲンに対してＨ＆Ｅ、トリ-クロム, エラスチンに対してVerhoeff Van Grieson染色液で染色した。刺激性について安全性の研究におけるようにしてスコアを付けた。有意な刺激は被験者には観察されなかった。１００ｘ及び２５０ｘの倍率で染色された切片の組織検査をしたところ、栄養剤液とコントロールの間に細胞構造の差はなかった。表皮厚み及び線維芽細胞核の漸進的増加が０から２から４週まで見られた。４週目までに平均表皮厚は２２％増加し、真皮線維芽細胞核は３８％増加した。
【００８７】
実施例１４
３次元培養(Dermagraft(登録商標))条件培地の臨床的評価
条件細胞培養培地を、３次元フレームワーク上で成長させたヒト真皮線維芽細胞を含む組織工学産物であるDermagraft(登録商標)(Advanced Tissue Sciences, La Jolla, CA)の調製物から得た。条件培地を６人のヒト被験者の前腕部に毎日２回塗布した。研究の０、１４及び２８日目にバイオプシーを取得し、常法によって組織検査した。前腕部バイオプシー材料は、０日目に集めたバイオプシー材料と比較して、２８日目でコラーゲンＩ型(＋＋)、コラーゲンＩＩＩ型(＋＋＋)、ヒアルロン酸(＋＋＋)、及びエラスチン(＋＋)の増加を示した。また表皮厚み及び線維芽細胞核の漸進的増加が４週の研究インターバルにわたって組織学的に観察された。
【００８８】
実施例１５
輸送増強成長因子の産生
この予言的実施例は一般的な分子生物学の方法を用いての輸送増強成長因子の産生を記述する。例えばAusbel等, Sambrook及びRussell、及びSambrook等を参照のこと。表３に特定された成長因子の任意のもののような成長因子をコードする遺伝子断片が、輸送ペプチドをコードする遺伝子断片、例えば限られるものではないが、表１に示されている輸送ペプチド配列（配列番号：１−配列番号：１９）の一つに融合される。典型的には、輸送ペプチドをコードする遺伝子断片は、輸送ペプチドが輸送増強成長因子のアミノ末端にあるように、成長因子をコードする遺伝子断片の上流に融合される。例えば、融合遺伝子断片は、一般的な分子生物学の手法を用いて、例えばＶＥＧＦをコードするＤＮＡ配列と配列番号：３をコードするＤＮＡ配列を結合させることによって、産生される。ＶＥＧＦのヌクレオチド配列は当該分野で知られている。しかして、配列番号：３の輸送ペプチドをコードする例示的ＤＮＡ配列：CGUAAAAAACGUCGUCAACGUCGUCGU(配列番号：２０)はＶＥＧＦをコードするＤＮＡ配列に結合させられる。ＤＮＡコードの重複性のため、当業者ならば、多くの代替配列が輸送ペプチド及びＶＥＧＦのアミノ酸配列をコードすることが分かるであろう。例えば、配列番号：３の輸送ペプチドをコードする多くの代替配列の一つは、CGCAAAAAACGCCGCCAACGCCGCCGC(配列番号：２１)である。しかして、当業者であれば、典型的には、所望の輸送ペプチドのアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列が、輸送増強成長因子融合遺伝子断片を生成するために所望の成長因子のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列と融合できることは分かるであろう。
【００８９】
ついで輸送増強成長因子融合遺伝子断片は、一般的な分子生物学の手法を使用して、所望の宿主細胞、典型的には線維芽細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞、平滑筋細胞等々のようなヒト細胞中で発現させるための適切な発現ベクター中に挿入される。発現ベクターは典型的には５'フランキング配列と他の適切な調節エレメント並びにエンハンサー(群)、転写終結エレメント、場合によってはドナー及びアクセプタースプライス部位を含む完全イントロン配列、必要ならばシグナルペプチド配列、リボソーム結合部位エレメント、ポリアデニル化配列、及び選択マーカーを含む。
【００９０】
ついで輸送増強成長因子発現ベクターが使用され、一般的な分子生物学の手法、例えばリン酸カルシウム共沈又はエレクトロポレーション法を使用して、例えば限定されるものではないが、ヒト真皮線維芽細胞に形質移入される。輸送増強成長因子発現ベクターを含む形質転換された細胞は、一般的な分子生物学の手法を使用して、選択され、細胞は単層培養で増量される。ついで、単層細胞が使用され、上に記載したもののような、３次元培養に播種される。そのような３次元培養を使用して馴化される培地は所望の輸送増強成長因子、ここでは輸送増強ＶＥＧＦを含んでいなければならない。
【００９１】
当業者ならば、この実施例はＨＩＶ-１Ｔａｔ伝達ドメイン(配列番号：３)及びＶＥＧＦを使用する輸送増強成長因子遺伝子断片の形成を記述しているが、所望の成長因子をコードする核酸配列の任意の数の組合せを、表１に示された輸送ペプチドの任意のものをコードする任意の数の核酸配列と融合させて、過度な実験を行うことなく、輸送増強成長因子遺伝子断片を産生させることができることが分かるであろう。
【００９２】
実施例１６
輸送増強抗酸化剤の産生
この予言的実施例は一般的な分子生物学の方法を用いての輸送増強抗酸化剤の産生を記述する。例えばAusbel等, Sambrook及びRussell、及びSambrook等を参照のこと。抗酸化剤をコードする遺伝子断片が、輸送ペプチドをコードする遺伝子断片と融合される。典型的には、輸送ペプチドをコードする遺伝子断片は、輸送ペプチドが輸送増強抗酸化剤のアミノ末端に又はその近くにあるように、抗酸化剤をコードする遺伝子断片の上流に融合される。
【００９３】
例えば、抗酸化剤、例えばグルタチオン、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ、グルタチオンジスルフィド、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アルファ-トコフェロール、ガンマ-トコフェロール、ユビキノール-９、ユビキノン-９、又はアスコルビン酸をコードする遺伝子断片は、輸送ペプチドをコードする遺伝子断片、例えば限定されるものではないが、表１に示される輸送ペプチド配列(配列番号：１−配列番号：１９)の一つに融合される。典型的には、輸送ペプチドをコードする遺伝子断片は、輸送ペプチドが輸送増強抗酸化剤のアミノ末端になるように、抗酸化剤をコードする遺伝子断片の上流に融合される。例えば、融合遺伝子断片は、一般的な分子生物学の手法を用いて、例えばそのヌクレオチド配列が当該分野で直ぐに利用できるグルタチオンをコードするＤＮＡ配列と配列番号：１８をコードするＤＮＡ配列を結合させることによって、産生される。しかして、配列番号：１８の輸送ペプチドをコードする例示的ＤＮＡ配列：AGAAGAAGAAGAAGAAGA(配列番号：２２)は、グルタチオン(γ-グルタミルシステイニルグリシン)をコードするＤＮＡ配列、例えばCAAUGUGGU(配列番号：２３)に結合させられる。ＤＮＡコードの重複性のため、当業者ならば、多くの代替配列が輸送ペプチド及びグルタチオンのアミノ酸配列をコードすることが分かるであろう。例えば、グルタチオンをコードする幾つかの代替配列の一つは、CAAUGUGGC(配列番号：２４)である。しかして、当業者であれば、典型的には、所望の輸送ペプチドのアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列が、輸送増強抗酸化剤融合遺伝子断片を生成するために所望の抗酸化剤のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列と融合できることは分かるであろう。
【００９４】
ついで輸送増強抗酸化剤融合遺伝子断片は、一般的な分子生物学の手法を使用して、所望の宿主細胞、典型的には線維芽細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞、平滑筋細胞等々のようなヒト細胞中で発現させるための適切な発現ベクター中に挿入される。発現ベクターは典型的には５'フランキング配列と他の適切な調節エレメント並びにエンハンサー(群)、転写終結エレメント、場合によってはドナー及びアクセプタースプライス部位を含む完全イントロン配列、必要ならばシグナルペプチド配列、リボソーム結合部位エレメント、ポリアデニル化配列、及び選択マーカーを含む。
【００９５】
ついで輸送増強抗酸化剤発現ベクターが使用され、一般的な分子生物学の手法、例えばリン酸カルシウム共沈又はエレクトロポレーション法を使用して、例えば限定されるものではないが、ヒト真皮線維芽細胞に形質移入される。輸送増強成長因子発現ベクターを含む安定に形質転換された細胞は、一般的な分子生物学の手法を使用して、選択され、細胞は単層培養で増量される。ついで、単層細胞が使用され、上に記載したもののような、３次元培養に播種される。そのような３次元培養を使用して馴化される培地は所望の輸送増強抗酸化剤、ここでは輸送増強グルタチオンを含んでいなければならない。
【００９６】
当業者であれば、この実施例はＲ６配列（配列番号：１８）とグルタチオンを使用する輸送増強抗酸化剤遺伝子断片の生成を記述しているが、所望の抗酸化剤をコードする核酸配列の任意の数の組合せを、表１に示した輸送ペプチドの任意のものをコードする任意の数の核酸配列と融合させて、過度な実験を行うことなく、輸送増強抗酸化剤遺伝子断片を産生させることができることが分かるであろう。
【００９７】
実施例１５及び１６に記載したような方法はまた輸送増強細胞外マトリックス成分を産生するために使用することもでき、これもまた本発明の範囲内にある。
本発明を様々な用途、方法及び組成物に関して説明したが、発明の範囲を逸脱することなく様々な変化及び変更を施すことができることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】線維芽細胞又はケラチノサイトの培養物のインビトロ増殖に対する無血清培地、馴化前培地又は条件培地の効果を示すグラフである。線維芽細胞の増殖は、誤差のバーを伴う黒塗りのバーで示される。ケラチノサイトの増殖は誤差のバーを伴う灰色の点描のバーで示される。
【図２】培養された上皮ケラチノサイトに対する無血清培地、対照培地（馴化前培地）及び条件培地の抗酸化剤活性を示すグラフである。
【図３Ａ】濾過された培地中の抗酸化剤レベルの測定結果を示すグラフである。パネル３ＡはビタミンＥの成分であるα-トコフェロールとγ-トコフェロールのＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図３Ｂ】パネル３Ｂはグルタチオン（ＧＳＨ）のＨＰＣＬ分析の結果を示す。
【図３Ｃ】パネル３ＣはシステインのＨＰＣＬ分析の結果を示す。
【図３Ｄ】パネル３Ｄはシステインとシスチンを組み合わせたもののＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図４】培養された線維芽細胞によるコラーゲンの付着に対する対照（馴化前）培地及び条件培地の効果を示すグラフである。
【図５】ＩＬ-１αを伴わない平行培養と比較した場合の、ＩＬ-１αの存在下での３次元ヒト真皮線維芽細胞培養物（Dermagraft(登録商標)）によるＫＧＦの分泌の亢進又はアップレギュレーションを示すグラフである。
【図６】ＰＤＧＦのＡＢ鎖の濃度を増大させた場合のＶＥＧＦ分泌の亢進を示すグラフである。
【図７】線維芽細胞の単層培養、線維芽細胞でストレスを受けたコラーゲンゲル３次元培養、線維芽細胞収縮コラーゲンゲル３次元培養、及び線維芽細胞スキャフォールドベースの３次元培養によるＶＥＧＦの分泌を比較するグラフである。
【０００１】
（関連出願）
この出願は、あらゆる目的のためにその全体を出典明示によりここに取り込む２００１年６月７日出願の米国仮特許出願第６０／２９７１７７号の優先権を主張する。この出願はあらゆる目的のためにその全体を出典明示によりここに取り込む１９９９年５月１４日出願の米国特許出願第０９／３１３５３８号に関する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は３次元培養において成長させた細胞により馴化された細胞培養培地を含む組成物に関する。培地を馴化するために使用される細胞は、培地中の成長因子及び抗酸化剤の濃度を変更するために遺伝子的に改変されうる。条件細胞培地（馴化培地）は、なかでも化粧品への応用、医薬部外品への(cosmeceutical)応用及び製薬への応用に有用である。本発明はまた細胞進入を亢進するペプチド配列を含む蛋白質、そのような蛋白質をコードするＤＮＡ、及びそのようなＤＮＡを含む細胞を含む。本発明の化合物を調製する方法もまた提供される。
【０００３】
（発明の概要）
本発明は３次元細胞培養を使用して生成される条件細胞培養培地又はその抽出物及び適切な担体を含んでなる組成物に関する。本発明はまたそのような組成物を調製するための方法に関する。ある実施態様では、３次元培養は真核細胞又はヒト細胞、特に真皮の線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、及び筋細胞を含む。ある実施態様では、適切な担体は製薬的に許容可能な担体、化粧品的に許容可能な担体、又は医薬部外品的(cosmeceutically)に許容可能な担体である。ある実施態様では、条件細胞培養培地は無血清又は動物産物を含まない馴化前培地を使用して産生される。
【０００４】
ある実施態様では、条件培地は少なくとも一の遺伝子組換型成長因子又は少なくとも一の遺伝子組換型抗酸化剤を含む。ある実施態様では、本発明の組成物は、少なくとも一の遺伝子組換型成長因子、少なくとも一の遺伝子組換型抗酸化剤、少なくとも一の遺伝子組換型細胞外マトリックス成分、又はその組合せを含む。ある実施態様では、少なくとも一の遺伝子組換型成長因子、少なくとも一の遺伝子組換型抗酸化剤、又は少なくとも一の遺伝子組換型細胞外マトリックス成分は、少なくとも一の輸送増強成長因子、輸送増強抗酸化剤、又は輸送増強細胞外マトリックス成分を含む。ある実施態様では、輸送増強成長因子、輸送増強抗酸化剤、又は輸送増強細胞外マトリックス成分は表１のアミノ酸配列（配列番号：１−配列番号：１９）の一つを更に含む。
【０００５】
ある実施態様では、細胞進入を亢進する異種ペプチド配列を含んでなる成長因子が提供される。ある実施態様では、細胞進入を亢進する異種ペプチド配列を含んでなる成長因子をコードするＤＮＡを含んでなる細胞が提供される。
【０００６】
ある実施態様では、細胞進入を亢進する異種ペプチド配列を含んでなる抗酸化剤が提供される。ある実施態様では、細胞進入を亢進する異種ペプチド配列を含んでなる抗酸化剤をコードするＤＮＡを含んでなる細胞が提供される。
【０００７】
ある実施態様では、細胞進入を亢進する異種ペプチド配列を含んでなる細胞外マトリックス成分が提供される。ある実施態様では、細胞進入を亢進する異種ペプチド配列を含んでなる細胞外マトリックス成分をコードするＤＮＡを含んでなる細胞が提供される。
【０００８】
ある実施態様では、本発明の組成物は、ローション、クリーム、ヒドロゲルを含むゲル、パウダー、セラム、軟膏、ファンデーション、フェイシャルマスク、リップケア製品、サンスクリーン、ヘアケア製品、例えばシャンプー、ディープコンディショナーを含むコンディショナー、ヘアケアトリートメント、ホットオイルトリートメント等、スキンクレンザー、落屑剤、コンパクト製剤等を含む。
【０００９】
ある実施態様では、条件培地は、少なくとも一の培養誘導成長因子であって、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、インターロイキン-３（ＩＬ-３）、ＩＬ-６、又はＩＬ-８の少なくとも一を含んでなる少なくとも一の成長因子と；少なくとも一の培養誘導抗酸化剤であって、グルタチオン、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ、グルタチオンジスルフィド、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アルファ-トコフェロール、ガンマ-トコフェロール、ユビキノール-９、ユビキノン-９、アスコルビン酸、システイン、及びシスチンの少なくとも一を含んでなる少なくとも一の抗酸化剤とを含有する。ある実施態様では、組成物は、少なくとも一の細胞外マトリックス成分、例えば可溶性コラーゲン、例えば限定するものではないがＩ型コラーゲン又はＩＩＩ型コラーゲンを更に含有する。
【００１０】
ある実施態様では、本方法は、適切な条件下で３次元培養物と馴化前培地を組み合わせて、少なくとも一の培養誘導成長因子であって血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、インターロイキン-３（ＩＬ-３）、ＩＬ-６、又はＩＬ-８の少なくとも一を含んでなる少なくとも一の成長因子と；少なくとも一の培養誘導抗酸化剤であって、グルタチオン、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ、グルタチオンジスルフィド、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アルファ-トコフェロール、ガンマ-トコフェロール、ユビキノール-９、ユビキノン-９、アスコルビン酸、システイン、又はシスチンの少なくとも一を含んでなる少なくとも一の抗酸化剤とを含有する条件培地を生成することを含む。本発明に係る方法では、条件培地又はその抽出物は許容可能な担体と組み合わされて組成物が生成される。ある実施態様では、組成物は医薬部外品組成物であり、許容可能な担体は医薬部外品的に許容可能な担体である。ある実施態様では、３次元培養は真核細胞、特にヒト真皮線維芽細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞、平滑筋細胞等々を含む。
【００１１】
（例示的な実施態様の詳細な説明）
この出願において、特に他の定義をしない限り、単数の使用は複数を含む。この出願では、特に他の定義をしない限り、「又は」の使用は「及び／又は」を意味する。更に、「含んでいる(including)」、並びに他の形態、例えば「含む(includes)」及び「含んだ（included）」という用語の使用は限定しているものではない。また、「エレメント」又は「成分」のような用語は、特に他の定義をしない限り、一つのユニットを含む要素及び成分と、一つより多いサブユニットを含む要素及び成分の双方を包含する。
【００１２】
ここで使用されるセクションの見出しは構成の目的だけのものであり、記載される主題事項を限定するものではない。この明細書において引用される全ての文献はあらゆる目的のためにその全体が出典明示によりここに取り込まれる。
【００１３】
ここで使用される「培養誘導(culture-derived)」なる用語は、細胞を培養し細胞に栄養を与えるために使用される最初の細胞培養培地には存在していないが、培養された細胞によって生成され培地に入る条件細胞培地の成分を意味する。例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）はヒト線維芽細胞の３次元培養から得られる条件細胞培養培地中に存在する一方、ＶＥＧＦは馴化前の元々の馴化前の細胞培養培地（「馴化前培地(pre-conditioned media)」）中には典型的には存在していない。よって、ＶＥＧＦは細胞によって培地中に分泌される。また培養誘導という用語に含まれるものは、馴化前培地中に最初から存在しているがその濃度が培養過程中に増大する化合物である。例えば、限定するものではないが、元々の馴化前培地が１ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを含み、馴化後の同じ培地が５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを含む場合、条件培地は培養誘導ＶＥＧＦを含む。
【００１４】
ここで使用される「成長因子」という用語は、細胞によって産生され、それ自身及び／又は様々な他の隣接した又は離れた細胞に効果をもたらし得る蛋白質、ポリペプチド又はサイトカインを含むポリペプチドの複合体を意味する。典型的には、成長因子は、発生的にか又は多数の生理学的又は環境上の刺激に応答して、特定の型の細胞の成長及び／又は分化に影響を及ぼす。全てではないがある成長因子はホルモンである。成長因子の例はインスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子、ＶＥＧＦ、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）を含む線維芽細胞成長因子（ＦＧＦｓ）、ＰＤＧＦ-ＡＡ及びＰＤＧＦ-ＡＢを含む血小板由来成長因子（ＰＤＧＦｓ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦα）、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３を含むトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）、インターロイキン-６（ＩＬ-６）、ＩＬ-８等々である。成長因子はなかでもMolecular Cell Biology, Scientific American Books, Darnell等編, 1986; The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair, Clark, Plenum Press, 1996;及びPrinciples of Tissue Engineering, 第２版, Lanza等編, Academic Press, 2000において議論されている。当業者であれば、ここに記載した条件培地中の任意のまたあらゆる培養誘導成長因子が本発明の範囲に入ることが分かるであろう。
【００１５】
抗酸化剤という用語はここでは広義に使用され、酸化又はフリーラジカルの生成を遅延させ又は防止するあらゆる物質を包含する。よって、抗酸化剤には、限定するものではないが皮膚のような組織中にとりわけ紫外線及び環境汚染物によって生成されるフリーラジカルの損傷付与効果を少なくとも部分的に防止することが可能な酵素及び他の化合物が含まれる。例えば、皮膚の抗酸化剤防御系には、抗酸化剤酵素及び一群の低分子量抗酸化剤（ＬＭＷＡ）が含まれる。ＬＭＷＡは直接的であれ又は間接的であれラジカル酸素種と相互作用することにより少なくとも部分的に酸化的損傷を防止することが実証されている。例示的な抗酸化剤はシステイン、グルタチオン、グルタチオンジスルフィド、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ、カタラーゼ、アルファ-トコフェロールとガンマ-トコフェロールを含むビタミンＥ、アスコルビン酸、ユビキノール９、ユビキノン９等々である。抗酸化剤の議論はなかでもKohen等, Toxicology 148: 149-157 (2000); Kohen, Biomed. Pharmacother. 53: 181-192 (1999); Kohen等, Methods of Enzymol. 300: 285-90, Academic Press (1999); Miyachi, Dermatol. Sci. 9:79-86 (1995);及びStohs, J. Basic Clin. Physio. Pharmacol. 6:206-228 (1995)において見出されうる。当業者であれば、ここに記載された条件培地中の任意のあらゆる培養誘導抗酸化剤が本発明の範囲に入るものと理解するであろう。
【００１６】
当業者であれば、「ＫＧＦの発現を増強するのに充分な量のＩＬ-１αで処理」又は「ＶＥＧＦの発現を増強するのに充分な量のＰＤＧＦで処理」のような語句が意味するものを即座に理解できるであろう。また、当業者であれば、適切なアッセイを実施することによって特定の成長因子の発現が誘導され又は増強されたかどうかを決定することができるであろう。例示的なアッセイには、適切なマーカー、標準(standards)、及び／又は市販のキットを必要に応じて使用するエライザ、ウェスタンブロット、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ等が含まれる。例えば、ＶＥＧＦ、ＫＧＦ又は様々な他の成長因子の定量のためのエライザキットはミネソタ州ミネアポリスのＲ＆Ｄシステムズ社から市販されている。
【００１７】
細胞外マトリックス（「ＥＣＭ」）という用語は細胞の外側に固定されている本質的に全ての分泌分子を包含する。インビボにおいて、ＥＣＭは細胞外空間に秩序を与え、分化された組織及び器官を樹立し、分離し、維持することに関連した機能を提供する。ＥＣＭは例えば結合組織と基底板(basal lamina)とも呼ばれる基底膜(basement membranes)に見出される複合構造体である。結合組織は典型的には細胞によって自然に分泌されるＥＣＭに囲まれる孤立細胞を含む。ＥＣＭの成分は成長及び分化因子、サイトカイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）、メタロプロテアーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰｓ）、及び細胞増殖、遊走、及び分化を調節する他の可溶性因子と相互作用し、及び／又はこれに結合することが実証されている。ＥＣＭとその成分の説明はとりわけGuidebook to the Extracellular Matrix, Anchor, and Adhesion Proteins, 第２版, Kreis及びVale編, Oxford University Press, 1999(「Kreis等」); Geiger等, Nature Reviews Molecular Cell Biology 2:793-803,2001; Iozzo, Annual Review of Biochemistry, 1998, Annual Reviews, Palo Alto, CA; Boudreau及びJones, Biochem. J. 339:481-88, 1999; Extracellular Matrix Protocols, Streuli及びGrant編, Humana Press 2000; Metzier, Biochemistry the Chemical Reactions of Living Cells, 第２版, vol.1, 2001, Academic Press, San Diego, 特に第８章; 及びLanza等, 特に第４章及び第２０章に見出されうる。
【００１８】
ある実施態様はＥＣＭの少なくとも一の成分を含む。ある実施態様では、細胞外マトリックス成分は、少なくとも一の蛋白質、少なくとも一の糖蛋白質、少なくとも一のプロテオグリカン、及び少なくとも一のグリコサミノグリカンの少なくとも一つを含む。例示的な糖蛋白質、プロテオグリカン、及びグリコサミノグリカンには、限定されるものではないが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、ＶＩＩＩ型コラーゲン、ＩＸ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲン、ＸＩ型コラーゲン、ＸＩＩ型コラーゲン、ＸＩＩＩ型コラーゲン、ＸＩＶ型コラーゲン、ＸＶ型コラーゲン、ＸＶＩ型コラーゲン、ＸＶＩＩ型コラーゲン、ＸＶＩＩＩ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、特にラミニン-１、ラミニン-２、ラミニン-４、及びラミニン-５、ルミカン、テネイシン、バーシカン(versican)、パールカン(perlecan)、トロンボスポンジン、特にトロンボスポンジン-２及びトロンボスポンジン-４、又はラミニン、特にラミニン-１、-２、-４、及び-５、アグリン、ナイドジェン、バマカン(bamacan)、デコリン、バイグリカン(biglycan)、フィブロモジュリン、エラスチン、フィブリリン、ヒアルロナン、ビトロネクチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、及びケラタン硫酸が含まれる。
【００１９】
条件細胞培養培地に関して使用される場合、「抽出物(extract)」という用語は、透析、分画、蒸留、相分離、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、中空ファイバー濾過、沈降、濃縮等々によって得られるかどうかにかかわらず、条件培地のフラクションの任意のサブコンポーネントを意味する。
【００２０】
フェノールレッド、「ウシ由来の成分」又は「非ヒト動物産物」に関して使用される場合の「実質的に含まない」と言う用語は、フェノールレッドがほとんどないかそれを含まないか、ウシ由来の成分がほとんどないかそれを含まないか、あるいは非ヒト動物産物あるいはそれらの組合せがほとんどないかそれを含まない、条件培地又は抽出物を意味する。ある実施態様では、条件細胞培養培地は４９．９９９％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、０．５％、０．０５％未満のフェノールレッドを含むか、あるいはフェノールレッドを含まない（０％）。ある実施態様では、条件細胞培養培地は４９．９９９％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、０．５％、０．０５％未満のウシ由来の成分を含むか、あるいはウシ由来の成分を含まない（０％）。ウシ由来の培地成分の例にはウシ胎児血清、仔ウシ血清、ウシ血清、ウシコラーゲン、ウシインスリン、ウシトランスフェリン等々が含まれる。ある実施態様では、条件細胞培養培地は４９．９９９％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、０．５％、０．０５％未満の非ヒト動物産物を含むか、あるいは非ヒト動物産物を含まない（０％）。上に列挙したウシ由来の成分の例に加えて、非ヒト動物産物には、ヒト由来ではない任意の動物産物、例えばブタ由来の組織培養成分及び産物が含まれる。当業者であれば、「無血清」培地及び動物産物を含まない培地が細胞培養培地の幾つかの製造メーカーから市販されていることを知っているであろう。同様に、フェノールレッドを含まない培地はまた市販され又は調製することができる。
【００２１】
医薬部外品的という用語は、製品の使用者に効果を有する少なくとも一の生物学的に活性な成分と少なくとも一の医薬部外品的に許容可能な担体を含有する製剤又は組成物を意味する。医薬部外品は、ある応用と適切な条件下では医薬又は薬物のような恩恵をもたらしうる化粧品とみることができる。例えばある応用では、医薬部外品は皮膚の支持構造に影響を及ぼし、シワの深さを減少させ、あるいは皮膚に対する光酸化又は加齢の影響を覆し又は軽減しうる。医薬部外品は皮膚ケア製品、ヘアケア製品、及びサンケア製品として特に有用でありうる。ある実施態様では、医薬部外品組成物はリポソーム、シクロデキストリン、ポリマー系、又はヒアルロン酸又は関連化合物の少なくとも一つを含む送達系を含む。医薬部外品組成物は医薬部外品的に許容可能な担体を含む。当業者であれば、局所適用に適した製薬的に許容可能な担体又は製剤はまた典型的には医薬部外品的に許容可能な担体又は製剤であることを理解するであろう。
【００２２】
典型的な化粧品又は医薬部外品用軟膏、ローション、又はゲル組成物は、典型的には、化粧品的に許容可能な担体又は医薬部外品的に許容可能な担体、例えば製薬的クリーム基剤、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、ゲル等中に、約１から９９％、約５から９５％、約２０から７５％、又は約５から２０％の、条件培地又はその抽出物を含んでなる活性成分濃度を含む。局所使用用の様々な化粧品用及び医薬部外品用組成物には、条件培地又は抽出物と適切な担体を含むドロップ、チンキ(tinctures)、ローション、クリーム、膏薬(salves)、セラム、溶液、及び軟膏(ointments)が含まれる。各組成物中の条件培地又は抽出物の最適なパーセントは組成物の処方と望まれる治療効果に応じて変わる。
【００２３】
製剤分野の当業者であれば、本発明の組成物が、製品タイプ、組成物の性質、組成物の使用部位、所望される効果等々に応じて、多くの化粧品的、医薬部外品的又は製薬的に許容可能な処方の任意のものを含みうることを理解するであろう。専売製剤が製剤分野で一般的であるが、通常の熟練度の製剤技術者であれば、過度の実験を行わないでも特定の用途に適した処方を決定し又は容易に選択することができるであろう。
【００２４】
当業者であれば、本発明の組成物の適切な担体が、化粧品及び医薬部外品の分野で典型的に見出されるもののような成分：油、ロウ又は他の標準的な脂肪物質、又は一般的なゲル化剤及び／又は増粘剤；乳化剤；保湿剤；エモリエント剤；サンスクリーン剤；親水性又は親油性活性剤、例えばセラミド；フリーラジカルに抗するための薬剤；殺菌薬；金属イオン封鎖剤；保存料；塩基性化又は酸性化剤；香料；界面活性剤；フィラー；天然物質又は天然物質抽出物、例えばアロエ又は緑茶エキス；ビタミン；又は着色物質を含むことを理解するであろう。これらの様々な成分の量は組成物の用途及び所望される化粧品的又は医薬部外品的効果に応じて変わる。
【００２５】
化粧品的及び医薬部外品的に許容可能な成分及び製剤の議論は、とりわけ、FDA Cosmetics Handbook, U.S. Food and Drug Administration; Handbook of Cosmetic and Personal Care Additives, Ash及びAsh編纂, 1994, Chemical Publishing, New York, NY; Bennett's Cosmetic Formulary, 1993, Chemical Publishing Co.; Harry's Cosmeticology, 7版, Wilkinson & Moore, 1982及び8版, Rieger, 2000, Chemical Publishing; Cosmetic Bench Reference-2001, Allerud Publishing Corp.; CTFA Compendium of Cosmetic Ingredient Composition, Nikitakis及びMcEwen編, 1990, Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Washington, D.C., Surfactant Encyclopedia, 改訂2版, Rieger, 1996, Allured Publishing; The Chemistry and Manufacture of Cosmetics, 2版, De Navarre, Van Nostrand, Princeton, N.J.; Encyclopedia of Common Natural Ingredients Used in Food, Drugs, and Cosmetics, Leung, 1996, John Wiley; A Consumer's Dictionary of Cosmetic Ingredients, 5版, Winter, 1999, Three Rivers Press, New York, NY; Cosmeceuticals: Active Skin Treatment, 1998, Allured Publishing; Handbook of Cosmetic Science and Technology, Knowlton及びPearce, 1993, Elsevier Advanced Technology, Oxford, UK; Personal-Care Formulas, 1997, Allured Publishing; Beginning Cosmetic Chemistry, Scheuller及びRomanowski, 1999, Allured Publishing;及びSkin Permeation: Fundamentals and Application, Zatz, 1993, Allured Publishingに見出すことができる。製薬的に許容可能な成分及び製剤の検討はとりわけRemington's Pharmaceutical Sciences, 18版, Gennaro編, 1990, Mack Publishingに見出すことができる。
【００２６】
ある実施態様では、条件培地は無血清又は無動物産物の馴化前培地を用いて製造される。無血清又は無動物産物（しばしば無蛋白と言う）培地は、他にも製造者はあるが、Life Technologies-GibcoBRL, Rockville, MD; Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO;又はBioWhittaker, Walkersville, MDから商業的に入手できる。無血清培地の例には、BioWhittakerのUltraCULTURETM, UltraDOMATM及びUltraCHOTM;Sigma-Aldrichの無血清ハイブリドーマ培地、ＣＨＯ無血清培地、及びＭＤＣＫ無血清培地;及びLife Technologiesのケラチノサイト-SFM (KSFM), AIM V(登録商標)培地, StemPro(登録商標)-34 SFM, ヒト内皮-SFM, マクロファージ-SFM, 及びHepatoZYME-SFMが含まれる。無蛋白培地の例には、BioWhittakerのUltraDOMA-PFTM;Sigma-Aldrichの無動物成分ハイブリドーマ培地、無血清及び無蛋白ハイブリドーマ培地Hybri-Max(登録商標)、ＣＨＯ無蛋白培地、化学的限定ＣＨＯ培地、及びＭＤＣＫ無蛋白培地;及びLife Technologiesの限定ケラチノサイト-SFMが含まれる。当業者は、哺乳動物細胞培養のための無血清培地の使用は充分に確立され、とりわけ、Cold Spring Harbor Conferences on Cell Proliferation, Vol.9, Sato等編, (1982) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Barnes等, Anal. Biochem. 102, 255(1980); BioWhittaker 1999/2000カタログ, pp.42-51; Barnes, Serum-Free Animal Cell Culture, BioTechniques 5(6):534-42; 及びFreshney, Culture of Animal Cells, ３版, Wiley-Liss, New York, NY, 1994に記載されていることを評価するであろう。
【００２７】
ある実施態様では、３次元細胞培養はスキャフォールド(足場)又はフレームワークを含む。３次元細胞培養フレームワークは、とりわけ、米国特許第４９６３４８９号；第５４６０９３９号；及び米国特許出願第０９／１３７５６７号に記載されている；またPachence及びKohn, Biodegradable Polymers, pp.263-77, Principles of Tissue Engineering, 2版, Lanza等編, Academic Press, 2000(適切な材料と選択培地を記載)を参照のこと。他の実施態様では、３次元細胞培養は、収縮コラーゲンゲルを含むコラーゲン基質；ゼラチン基質；又はゲル基質を含む。ある実施態様では、コラーゲン基質はヒトコラーゲンを含む。ある実施態様では、コラーゲン基質はウシコラーゲン、ブタコラーゲン、ラットコラーゲン、あるいはそれらの組合せを含む。ヒドロゲルスキャフォールドとして使用されるコラーゲンゲルは、とりわけ、Pachence及びKohn, Biodegradable Polymers, pp.263-77, Principles of Tissue Engineering, 2版, Lanza等編, Academic Press, 2000；及びParenteau, The First Tissue-Engineered Products, Scientific American 280:83-84, 1999に記載されている。一般には、Principles of Tissue Engineering, Lanza等編, R.G. Landes Co. 及びAcademic Press, 1997；及びPrinciples of Tissue Engineering, 2版, Lanza等編, Academic Press, 2000を参照のこと。
【００２８】
ある実施態様では、条件培地は少なくとも一の遺伝子組換型成長因子、少なくとも一の遺伝子組換型抗酸化剤、及び／又は少なくとも一の遺伝子組換型細胞外マトリックス成分を含み、少なくとも一の成長因子又は抗酸化剤は、蛋白トランスダクションとも呼ばれる細胞進入を増強可能な異種ペプチド配列を含む。異種ペプチド配列は天然に生じる成長因子又は抗酸化剤に見いだせないアミノ酸連続列である。むしろ、異種ペプチドは、遺伝子工学のような一般的な分子生物学の方法を使用して、天然に生じる成長因子又は抗酸化剤の、典型的にはアミノ末端又はカルボキシ末端に又はその近くに導入した。そのような「輸送増強」成長因子、抗酸化剤、又は細胞外マトリックス成分は、適切な条件下で、その天然に生じる対応物よりも簡単に又は速やかに細胞に進入しうる。細胞膜進入又は輸送を増強させることが知られている異種ペプチドの例を以下の表１に示す。
【表１】
当業者であれば、表１に示された輸送ペプチドは典型的にはＬ-アミノ酸を含んでいるが、Ｄ４３-５８のようなＤ-アミノ酸を全体に又は部分的に含んでいる輸送ペプチド(Derossi等)もまた本発明の範囲に入ることは分かるであろう。そのようなペプチドはより安定であるという効果を有しており、例えばＬ-鏡像異性体よりも蛋白質分解を受けにくい。当業者であれば、成長因子、抗酸化剤、又は細胞外マトリックス成分をコードしている核酸配列に作用可能に結合した、限定はしないが例えば表１に示されたペプチド（Ｄ-アミノ酸残基を含むか含まない）の一つのような輸送ペプチドをコードしている核酸配列を含んでなる遺伝子組換型コンストラクトはコンストラクトに応じて誘導的にか又は構成的に輸送増強成長因子、輸送増強抗酸化剤、又は輸送増強細胞外マトリックス成分を産生することが分かる。適切な調節配列、例えば一又は複数のプロモーター、一又は複数のエンハンサー、polyＡコード配列、及び終止配列に作用可能に結合した場合、そのような遺伝子組換型コンストラクトは、当該分野で知られている方法を使用して、適切な条件下で、限定しないがヒト細胞を含む真核細胞を安定に形質転換するために使用されうる。これらの安定に形質転換された細胞は３次元フレームワーク、コラーゲンゲル等々に播種するのに使用でき、ついで一般的な方法を用いて増殖させて３次元培養を産生する。これらの培養からの条件培地は、適切な条件下で、輸送増強成長因子、輸送増強抗酸化剤、及び／又は輸送増強細胞外マトリックス成分を含むであろう。
【００３０】
輸送増強ペプチドの例と輸送増強分子の遺伝子組換方法は、とりわけ、Stephens等, Proc. Natl. Acad. Sci., 印刷中(2001)(www.pnas.org.cgi/doi/pnas.081065198); Schwarze等, Trends in Cell Biology, 10:290-95(2000); Falwell等, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:664-68 (1994); Pooga等, FASEB J. 12:67-77(1998); Vives等, J. Biol. Chem. 272:16010-17(1997); Derossi等, J. Biol. Chem. 271:18188-93(1996); Kwon等, FEBS Letters 485:163-67 (2000); Barka等, J. Histochem. Cytochem. 48:1453-60 (2000); Steffen, Methods in Mol. Biol. 161:141-148 (2001); 及びFutaki等, J. Biol. Chem. 276:5836-40 (2001)に見出すことができる。
【００３１】
一般的な分子生物学の技術とプロトコールの説明は、とりわけ、Ausbel等, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc (1995, 2001年6月7日の補遺版含む)(「Ausbel等」); Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2版, Cold Spring Harbor Press (1989)(「Sambrook等」); Sambrook及びRussell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3版, Cold Spring Harbor Press (2001)(「Sambrook及びRussell」)に見出すことができる。
【００３２】
ここで使用される「輸送増強成長因子」、「輸送増強抗酸化剤」、又は「輸送増強細胞外マトリックス成分」という用語は、対応する天然に生じる成長因子、抗酸化剤、又は細胞外マトリックス成分のように、細胞進入又は輸送以外の、それぞれ成長因子、抗酸化剤、又は細胞外マトリックス成分の性質を持つあらゆる蛋白質又はポリペプチドを意味する。例えば、限定するものではないが、輸送増強ＶＥＧＦと天然に生じるＶＥＧＦである。特定の輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤は（１）輸送ペプチドをコードする遺伝子断片に融合した特定の成長因子又は特定の抗酸化剤をコードする遺伝子断片によりコードされたアミノ酸配列、及びそれから誘導される生物学的に活性なペプチド又はポリペプチド断片、（２）対応する天然に生じる成長因子又は抗酸化剤と比較して一又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を生じる遺伝子断片の天然に生じるアレル変異体及び／又は（３）化学修飾誘導体並びにここで提供されるそれらの核酸及び／又はアミノ酸配列変異体を意味する。
【００３３】
ここで使用される場合、「輸送増強成長因子断片」又は「輸送増強抗酸化剤断片」という用語は、天然に生じる輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤の全長アミノ酸配列より少ない配列を含むが、輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤と実質的に同じ生物学的活性を有するペプチド又はポリペプチドを意味する。そのような断片はアミノ末端、カルボキシ末端が、及び／又は内部が切断されていてもよく、また化学的に修飾されていてもよい。
【００３４】
ここで使用される場合、「輸送増強成長因子誘導体」又は「輸送増強成長因子変異体」という用語は、輸送増強成長因子、又は１）例えば一又は複数のポリエチレングリコール分子、糖類、リン酸塩、又は天然に生じる成長因子に天然には結合していない他のそのような分子の添加によって化学的に修飾され、及び／又は２）天然に生じる成長因子と比較して一又は複数の核酸又はアミノ酸配列の置換、欠失、及び／又は挿入を含む断片を意味する。ここで使用される場合、「輸送増強成抗酸化剤誘導体」又は「輸送増強抗酸化剤変異体」という用語は、輸送増強抗酸化剤、又は１）例えば一又は複数のポリエチレングリコール分子、糖類、リン酸塩、又は対応する天然に生じる抗酸化剤に天然には結合していない他のそのような分子の添加によって化学的に修飾され、及び／又は２）天然に生じる抗酸化剤と比較して一又は複数の核酸又はアミノ酸配列の置換、欠失、及び／又は挿入を含む断片を意味する。
【００３５】
配列パーセント同一性は、二つのポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較するために通常使用されている標準的な方法によって決定することができる。例を挙げると、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡのようなコンピュータプログラムを用いて、配列パーセント同一性が決定される二つのポリペプチドを、その各アミノ酸を最適に一致させるためにアラインさせる（「一致したスパン」は、一方又は両方の配列の全長、あるいは一方又は両方の配列の予め決まった部分を含みうる）。各コンピュータプログラムは「デフォルト」オープニングペナルティ及び「デフォルト」ギャップペナルティ、及びＰＡＭ２５０のようなスコアマトリックスを提供する。標準的なスコアマトリックス（Dayhoff等, Atlas of Protein Sequence and Structure, vol.5,補遺 3(1978)を参照）をコンピュータプログラムに関連して用いることができる。ついで、パーセント同一性はＦＡＳＴＡ：＃＃ＥＱＵ１＃＃のようなプログラムに含まれるアルゴリズムを用いてパーセント同一性を決定することによって計算することができる。
【００３６】
少なくとも７０パーセント同一であるポリペプチドは、対応する天然に生じる成長因子又は抗酸化剤と比較して典型的には一又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有する。通常、置換は蛋白質の全体の真の電荷、極性又は疎水性に対する影響が少ないか影響がないように保存的であるが、場合によっては輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤の活性を増大させるかもしれない。保存的置換を以下の表２にまとめる。
【表２】
ここで使用される場合、「有効量」、「治療的に有効量」、及び「医薬部外品的に有効量」という用語は所望の製薬的又は医薬部外品的効果を生じせしめるのに必要な条件培地又は抽出物の量を意味する。
本発明を実施するのに使用される輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤は、天然に生じる全長ポリペプチド、又は切断されたポリペプチド又はペプチド（すなわち「断片」）でありうる。以下に記載されるように、ポリペプチド又は断片は化学的に修飾されていてもよく、つまりグリコシル化、リン酸化、及び／又はポリマーに結合されていてもよい。また、ポリペプチド又は断片は対応する天然に生じる成長因子又は抗酸化剤の変異体でありうる（つまり、天然に生じる成長因子又は抗酸化剤と比較して一又は複数のアミノ酸の欠失、挿入、及び／又は置換を含みうる）。
【００３８】
全長輸送増強成長因子又はその断片又は全長輸送増強抗酸化剤又はその断片はよく知られたＤＮＡ組換テクノロジーの方法を使用して調製することができる。別法としては、輸送増強成長因子又は断片、あるいは輸送増強抗酸化剤又は断片をコードする遺伝子断片は、Engels等(Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734(1989))によって記載されたもののような、当業者によく知られた方法を使用して化学合成によって調製することができる。これらの方法には、とりわけ、核酸合成のためのリン酸トリエステル、ホスホラミダイト(phosphoramidite)、及びＨ-ホスホナート法が含まれる。そのような化学合成の好適な方法は標準的なホスホラミダイト化学を使用するポリマー支援合成法である。典型的には、輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤をコードするＤＮＡは数百ヌクレオチド長であろう。約１００ヌクレオチドより大きい核酸はこれらの方法を用いて数個の断片として合成することができる。ついで、断片を一緒に結合させて、輸送増強抗酸化剤の全長輸送増強成長因子を形成することができる。ある実施態様では、ポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡ断片は、メチオニン残基をコードするＡＴＧを有している。このメチオニンは輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤の成熟型に存在しているか又は存在していない。
【００３９】
ある場合には、天然に生じる成長因子又は抗酸化剤の核酸及び／又はアミノ酸変異体を調製することが望ましい。核酸変異体（ここで一又は複数のヌクレオチドは野生型又は天然に生じる成長因子又は抗酸化剤とは異なるように設計されている）は、プライマー(群)が所望の点突然変異を有する部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ増幅（突然変異誘発の技術の説明についてはSambrook等、Sambrook及びRussell、及びAusubel等を参照）を用いて製造されうる。上掲のEngels等によって記載された方法を使用する化学合成を用いてこのような変異体を調製することもできる。当業者に知られている他の方法もまた使用できる。好適な核酸変異体は、輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤を製造するのに使用されることになる宿主細胞にコドンを優先するヌクレオチド置換を含むものである。他の好適な変異体は、野生型と比較して上述の保存的アミノ酸変化をコードするもの（例えば、天然に生じるアミノ酸側鎖の電荷又は極性が、異なったアミノ酸との置換によって実質的に変化しないもの）、及び／又は輸送増強蛋白質の成長因子又は抗酸化剤成分上に新規なグリコシル化及び／又はリン酸化部位を生じるように設計されたもの、あるいは輸送増強蛋白質の成長因子又は抗酸化剤成分上の既存のグリコシル化及び／又はリン酸化部位を欠失させるように設計されたものである。
【００４０】
輸送増強成長因子をコードする融合遺伝子断片又は輸送増強抗酸化剤をコードする融合遺伝子断片を、宿主細胞中での発現のために適切な発現ベクター中に挿入することができる。ベクターは典型的には用いられる特定の宿主細胞中で機能性であるように選択される（つまり、ベクターは、融合遺伝子断片の増幅及び／又は融合遺伝子断片の発現が生じるように宿主細胞機構(machinery)と適合性がある)。
【００４１】
典型的には、任意の宿主細胞に使用されるベクターは５'フランキング配列（「プロモーター」とも呼ばれる）とまた他の調節エレメント、例えばエンハンサー(群)、転写終結エレメント、ドナー及びアクセプタースプライス部位を含む完全イントロン配列、シグナルペプチド配列、リボソーム結合部位エレメント、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、及び選択マーカーエレメントを含む。これらのエレメントの各々を以下に検討する。場合によっては、ベクターは「タグ」配列、つまりポリHis（例えばヘキサHis）をコードする輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤又は他の免疫原性小配列の５'又は３'末端に位置するオリゴヌクレオチド配列を含んでいてもよい。このタグは蛋白質と共に発現され、宿主細胞からの輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤の精製のための親和性タグとなりうる。場合によっては、タグは、続いて適切なペプチダーゼを用いるもののような様々な手段によって精製輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤から除去することができる。
【００４２】
５'フランキング配列は同種（つまり宿主細胞と同じ種及び／又は系統由来）、異種（宿主細胞種又は系統以外の種由来）、ハイブリッド（つまり一を超える供給源由来の５'フランキング配列の組合せ）、合成であり得、又は天然の成長因子又は抗酸化剤５'フランキング配列でありうる。このように、５'フランキング配列の供給源は、５'フランキング配列が宿主細胞機構中で機能的であり、それによって活性化され得ると仮定して、任意の真核細胞、典型的には哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞でありうる。
【００４３】
この発明のベクターに有用な５'フランキング配列は当該分野でよく知られている幾つかの方法の任意のものによって得ることができる。典型的には、天然に生じる成長因子又は抗酸化剤５'フランキング配列以外のここで有用な５'フランキング配列はマッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって既に同定されており、よって適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して適切な組織供給源から単離することができる。ある場合には、５'フランキング配列の全ヌクレオチド配列は既知でありうる。ここで、５'フランキング配列は一般的な分子生物学の方法を使用して合成してもよい。
【００４４】
５'フランキング配列の全部又は一部のみが既知の場合、それはＰＣＲを用いて、及び／又は適当なオリゴヌクレオチド及び／又は同じ又は他の種の５'フランキング配列断片を用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。
５'フランキング配列が未知の場合、５'フランキング配列を含むＤＮＡ断片は、例えばコード化配列又は他の遺伝子又は遺伝子群でさえ含みうる大きなＤＮＡ片から単離することができる。単離は適切なＤＮＡ断片を単離するために一又は複数の注意深く選択した酵素を用いた制限エンドヌクレアーゼ消化によって達成することができる。消化後に、所望の断片はアガロースゲル精製法、Qiagen(登録商標)カラム(Valencia, CA)又は当業者に知られている他の方法によって単離することができる。この目的を達成するための適切な酵素の選択は当業者には直ぐに明らかであろう。
【００４５】
転写終結エレメントは典型的には輸送増強成長因子コード配列又は輸送増強抗酸化剤コード配列の３'末端に位置し、輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤の転写を終結させる。
選択マーカー遺伝子エレメントは、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のような直ぐに同定可能なマーカー、あるいはＧ４１８のような選択培養培地中での宿主細胞の生存及び成長に必要な蛋白質をコードする。
【００４６】
一般に真核生物中のKozak配列と呼ばれるリボソーム結合エレメントはｍＲＮＡの翻訳開始に必要である。そのエレメントは典型的には合成される輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤のコード配列に５'が、プロモーターに３'が位置している。
多くの場合、輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤の転写はベクターに一又は複数のイントロンがあると増大される。これは、輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤が真核生物宿主細胞、特に哺乳動物宿主細胞において産生される場合に特にしかりである。使用されるイントロンは、特に使用される成長因子又は抗酸化剤配列が全長ゲノム配列又はその断片である場合、対応する成長因子又は抗酸化剤配列内で天然に生じうる。イントロンが成長因子又は抗酸化剤配列内で天然に生じない場合（殆どのｃＤＮＡｓに対して）、イントロン(群)は他の供給源から得ることができる。５'フランキング配列及び成長因子又は抗酸化剤コード配列に対するイントロンの位置は、イントロンが効果的であるには転写されなければならないので、重要である。従って、成長因子又は抗酸化剤核酸配列がｃＤＮＡ配列である場合、イントロンの好適な位置は３'が転写開始部位で、５'がポリＡ転写終結配列にある。成長因子又は抗酸化剤ｃＤＮＡｓに対して好ましくは、イントロンはコード配列を妨害しないように成長因子又は抗酸化剤コード配列の一側又は他側（つまり５'又は３'）に位置する。挿入される宿主細胞(群)とで適合性があるならば、あらゆるウイルス又は真核生物を含むあらゆる供給源からのあらゆるイントロンを用いてこの発明を実施することができる。ここでまた包含されるものは合成イントロンである。場合によっては、一を超えるイントロンをベクター中で使用してもよい。
【００４７】
上述のエレメントの一又は複数が使用されるベクター中にまだ存在していない場合、それらは個々に得られベクター中に結合させることができる。エレメントの各々を得るために使用される方法は当業者によく知られており、上述の方法に相当する（つまり、ＤＮＡの合成、ライブラリースクリーニング等々）。
【００４８】
この発明を実施するために使用される最終のベクターは典型的には市販のベクターのような出発ベクターから構築される。そのようなベクターは完成したベクター中に含められるエレメントの幾つかを含んでいても含んでいてなくてもよい。所望されるエレメントのどれも出発ベクター中に存在していない場合、各エレメントは、結合させるエレメントの端部とベクターの端部が結合に適合するように適切な制限エンドヌクレアーゼ(群)を用いてベクターを切断することによってベクター中に個々に結合させることができる。ある場合には、満足すべき結合を得るために互いに結合させる末端を「平滑にする」ことが必要である。末端平滑化は全ての４つのヌクレオチドの存在下でクレノウＤＮＡポリメラーゼ又はＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて「粘着末端」を最初に埋めることによって達成される。この手順は当該分野でよく知られており、例えばSambrook等に記載されている。
【００４９】
別法として、ベクター中に挿入されるエレメントの二又はそれ以上を最初に互いに結合させ（それらが互いに隣接して位置せしめられる場合）、ついでベクター中に結合させる。
ベクターの他の構築法は一反応混合物中で様々なエレメントの全てを同時に結合させることからなる。ここで、多くのナンセンス又は無機能ベクターがエレメントの不適切な結合又は挿入のために産生されるが、機能性ベクターが同定され制限エンドヌクレアーゼ消化によって選択されうる。
【００５０】
この発明を実施するための好適なベクターは哺乳動物宿主細胞、特にヒト細胞と適合性があるものである。当業者は、そのようなベクターが商業的に入手できることを知っている。ベクターを構築し、輸送ペプチド及び成長因子又は抗酸化剤をコードする遺伝子断片をベクターの適切な部位に挿入した後、完成したベクターを適切な宿主細胞中に挿入しうる。
適切な細胞又は細胞系統は哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞、例えばヒト真皮線維芽細胞、ケラチノサイト、又は上述したような、３次元培養に適した他の細胞タイプでありうる。
【００５１】
選択された宿主細胞中へのベクターの挿入は、塩化カルシウム沈降、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション又はＤＥＡＥ-デキストラン法のような方法を使用して達成することができる。選択される方法は部分的には使用される宿主細胞のタイプの関数である。これらの方法と他の適切な方法は当業者によく知られており、例えばSambrook等、Sambrook及びRussell、又はAusbel等に記載されている。
ベクターを含む宿主細胞は当業者によく知られた標準的な培地を用いて培養することができる。培地は通常、細胞の成長と生存に必要なあらゆる栄養物を含む。宿主細胞は、ベクターの長期の存在に応じて、一過性に形質転換されるか又は安定に形質転換されうる。典型的には、安定に形質転換される細胞が３次元培養の播種には望ましい。
【００５２】
宿主細胞中に産生される輸送増強成長因子又は輸送増強抗酸化剤の量は当該分野で知られた標準的な方法を使用して評価することができる。そのような方法には、限定されるものではないが、エライザ、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫沈降等々が含まれる。
上述した本発明は実施例を参照することによってよりよく理解される。次の実施例は例証のためのみのものであって、決して本発明の範囲を制限するものと考えてはいけない。
【００５３】
実施例１
線維芽細胞単層細胞培養
ヒト***から単離した正常なヒト真皮線維芽細胞を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で１０％仔ウシ血清(Hyclone Laboratories, Logan, UT)、非必須アミノ酸(GibcoBRL)、及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン-ストレプトマイシン-２５０ｎｇ／ｍｌアンホテレシンＢ(GibcoBRL)（「ＤＭＥＭ１」）を補填した馴化前細胞培養培地（この実施例では、高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ；GibcoBRL, Grand Island, NY)）を用いる単層培養で１５０ｃｍ２組織培養フラスコ（Corning, Corning, NY）中にて培養した。単層培養には週に２回新鮮な馴化前培地を供給し、記載されているように、１から１０スプリットを使用して毎週継代させた。一般には、Pinney等, J. Cell. Physio., 183:74-82 (2000)を参照のこと。真皮線維芽細胞をまたＤＭＥＭ１を含むローラーボトル中で増量させてもよい。これらの単層培養からの条件培地を集め、将来の使用のために保存した。
【００５４】
この実施例における例証には線維芽細胞を用いたが、当業者であれば、多くの他のタイプの細胞、例えば限定されないが他の上皮細胞タイプ、内皮細胞、平滑筋細胞、単球、ケラチノサイト、軟骨細胞等々を単層培養及び３次元培養で成長させることができることは分かるであろう。
【００５５】
実施例２
線維芽細胞３次元培養
例えば実施例１のヒト真皮線維芽細胞を、一般的な技法を用いてコラーゲン基質中に懸濁させるか様々な３次元フレームワーク上に播種することができる。例えば、細胞は、３次元乳酸塩／グリコール酸塩ポリマーフレームワーク又はポリグラクチン(polyglactin)９１０（ポリグリコール酸対ポリ乳酸が９０：１０のコポリマー）の生体分解性メッシュファイバーからなる縫合材料に一般的に使用される物質であるVicrylTMのような生体吸収性ポリグラクチンメッシュフレームワーク上に播種することができる。
【００５６】
線維芽細胞を、１０％ウシ血清、２ｍＭのＬ-グルタミン、非必須アミノ酸、及び５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸塩(J.T.Baker)を補填した無抗生物質の高グルコースＤＭＥＭ(「ＤＭＥＭ２」)中にて３次元乳酸塩／グリコール酸塩コポリマーフレームワーク上で、およそ２週間培養した。ＤＭＥＭ２の存在下、細胞成長に適した条件下で、線維芽細胞は増殖してフレームワークの格子間を満たす。細胞はコラーゲン及び他の細胞外マトリックス成分、成長因子、及びサイトカインをとりわけ分泌し、３次元ヒト組織、例えばとりわけ糖尿病性足部潰瘍の治療用に開発された組織工学製品であるDermagraft(登録商標)を作り出す（Advanced Tissue Sciences, La Jolla, CA）；Naughton, Dermal Equivalents, pp.891-902, Principles of Tissue Engineering, 2版, Lanza等編, Academic Press, 2000を参照のこと。
【００５７】
培養物に馴化前ＤＭＥＭ２を用いて３−４日毎に栄養補給し、条件培地を収集し、１０日目後に直ぐに試験するか、又は将来の試験のために−２０℃で凍結させた。条件培地の一調製物中の様々な成長因子及びサイトカインの濃度を定量するために、適当な市販のヒト成長因子エライザキット（Quantikine(登録商標)Immunoassays, R&D Systems, Minneapolis, MN）を用いて免疫検査を実施した。馴化前ＤＭＥＭ２を並行してネガティブ(バックグラウンド)コントロールとしてアッセイした。アッセイは種特異的であると特定されたが、ウシ血清のあるロットはＴＧＦβエライザで低レベルの交差反応性を示した。表３に示すように、条件培地は少なくとも６種の培養誘導成長因子を含んでいた。
【表３】
当業者であれば、これらの例示的な実施例は培養されている細胞のタイプに応じたＤＭＥＭ系馴化前培地を記述しているが、多くの他のタイプの細胞培養培地を使用することができることは分かっているであろう。例示的な細胞培養培地には、とりわけ、Sigma-Aldrich、Life Technologies-GibcoBRL、又はBioWhittakerから市販されている最小必須培地イーグル（ＭＥＭ）、ケラチノサイト培地、メラニン細胞培地、肝細胞培地、羊膜細胞培地、骨髄培地、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＢＧＪｂ培地（Fitton-Jackson改変）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｌ-１５培地（Liebovitz）、マッコイ５Ａ改変培地、ＭＣＤＢ培地、培地１９９、ハムＦ-１０培地、ハムＦ-１２培地、ＲＰＭＩ-１６４０、ウェイマウス培地等々が含まれる。
【００５９】
実施例３
代替の３次元線維芽細胞培養
８継代のヒト真皮線維芽細胞を、ローラーボトルの内面付近又は内面に位置した殺菌ナイロンメッシュのスキャフォールド(Industrial Fabrics)を含む一般的な１７５０ｃｍ２の波形ローラーボトル（Nalge又はNunc）中に播種した。８継代の線維芽細胞を１ローラーボトル当り約４−６ｘ１０７細胞の密度で播種し、抗生物質非含有馴化前培地(２ｍＭのＬ-グルタミン(Life Technologies)、非必須アミノ酸(Life Technologies)、５６ｍｇ／ｌのＬ-アスコルビン酸(J.T. Baker)、及び１０％仔ウシ血清(HyClone Laboratories)を補填したＤＭＥＭ(#078-0521-189, Life Technologies-Gibco))で培養した。ローラー装置でローラーボトルを３７℃にてインキュベートした。ローラーボトル中の培地を上述の馴化前培地を用いて毎日又は一日おきに取り替え、条件細胞培養培地を集めた。QuantikineヒトＶＥＧＦアッセイ（R & D Systems, Minneapolis, MN）を製造者に指示に従って用いて、条件培地中のＶＥＧＦレベルをエライザによって定量した。
【００６０】
２．５ミクロン等級の３ＭＴＭ５２２ハイパフォーマンス液体フィルターバッグ(Southcoast)を用いて細胞残屑のような大きな粒状物質を除去して、条件培地を前濾過し、「濾過培地」(１Ｘ条件培地とも称する)をつくった。ある種の用途に対しては、濾過培地をクロスフロー中空ファイバー限外濾過カートリッジ(モデル＃UFP-10-C-55A, A/G Technology Corp., Needham, MA)にて、製造者の操作ガイドに従って、毎分２５リットルの流量で濃縮した。最初の濃度のおよそ３倍から１５倍まで濃縮した「栄養剤液」（１０Ｘ条件培地とも称する）を集めた。
【００６１】
１Ｘ及び１０Ｘ条件培地が、化粧品的に許容可能な、医薬部外品的に許容可能な又は製薬的に許容可能な担体と共に化粧品、医薬部外品又は製薬処方物を含有する組成物を調製するために処方者によって使用される。当業者であれば、化粧品的に許容可能な担体、医薬部外品的に許容可能な担体及び製薬的に許容可能な担体は、組成物の意図される用途に応じて、同じであるか異なっていてもよい。
【００６２】
当業者であれば、この実施例ではローラーボトルが記載されているけれども、如何なる数のバイオリアクターでも、記載された条件を適当に変更して用いることができることは分かるであろう。当業者であればまた如何なる数の条件培地処理方法でも、例えば限定するものではないがクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、相分離、噴霧乾燥、蒸発、凍結乾燥等々、当該分野で知られた方法を用いて実施することができることが分かるであろう。
【００６３】
実施例４
細胞増殖に対する条件培地の効果
例えば実施例２において測定したように培養誘導成長因子が生物学的に活性であることを実証するために、ヒトケラチノサイト又は線維芽細胞を条件培地と共にインキュベートし、その増殖を測定した。簡単に述べれば、５ｘ１０３のヒトケラチノサイト又はヒト線維芽細胞を９６ウェルプレートのウェル中に播種した。これらの細胞に無血清培地、馴化前培地、又は１０％(ｖｏｌ／ｖｏｌ)の濃縮条件培地を補填した馴化前培地を供給し、４８時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を凍結溶解させ、２００ｍＬのCyquant染料を添加し(Molecular Probes, Eugene, OR)、Cytoflourで蛍光を測定した。ＥＢＭコントロールをベースラインに用いた。図１に示されるように、この実験では、ケラチノサイトと線維芽細胞の両方の増殖は条件培地において最も大であった。
【００６４】
実施例５
条件培地の抗酸化効果
この実施例は条件培地の抗酸化活性を実証する。ケラチノサイトＳＦＭに入った一次表皮ケラチノサイト(GibcoBRL)を一般的な１２ウェルの組織培養プレートに１ｘ１０５細胞／ｃｍ２で蒔き、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃にて一晩インキュベートした。次の日に、培地を新鮮なケラチノサイトＳＦＭ、ＤＭＥＭ１、又は条件培地を補填したＤＭＥＭ１と置き換えた。プレートをインキュベーターに戻して１０日間培養した。細胞はＰＢＳ中で一回洗浄した後、ジヒドロローダミン１２３（Molecular Probes, Eugene OR）を、ＤＭＳＯ中１ｍＭの原液を用いて１ｕＭの最終濃度まで添加した。ジヒドロローダミン１２３は非蛍光形態で細胞膜にインターカレートする。酸化したところで、この染料が蛍光のローダミン誘導体に転換される。よって平均蛍光は全細胞内酸化状態の尺度である。Handbook of Fluorescent Probes and Research Product, 8版, 19章, Molecular Probes, Eugene, OR; Royall等, Arch. Biochem. Biophys. 302:348-55 (1993)を参照のこと。
【００６５】
インキュベーターで更に３０分細胞をインキュベートした後、トリプシン処理し２-パラホルムアルデヒドに固定した。蛍光強度をFACScan(Becton-Dickinson)で測定する。この実験では、条件培地で成長させられた細胞が、馴化前培地又は無血清培地の何れかで成長させられた細胞と比較して有意に低い細胞内酸化レベルを有していた（図２参照）。
【００６６】
実施例６
条件培地中の抗酸化剤のＨＰＬＣ分析
培養された培地中に存在する特異的抗酸化剤を定量するために、実施例３の濾過培地の一定分量を、ＨＰＬＣ電気化学検出システム(Couloarray Detection System, ESA Inc)を用いて分析した。電気化学的検出器を、化合物と代謝産物の２次元特徴付けのためにＵＶ検出器と直列に配した(Roy等, Simultaneous Detection of Tocopherols and Tocotrienols in Biological Samples Using HPLC-Coulometric Electrode Array. Meth. Enzymol., 2001(印刷中))。
【００６７】
ａ．ビタミンＥ(α-トコフェロール及びγ-トコフェロール)
１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、ＢＨＴ(１０ｍｇ／ｍｌ)及びＳＤＳを含むリン酸緩衝生理食塩水を試料に添加した。混合物を４℃で１５分間激しく撹拌し、エタノールを添加した。ビタミンＥをヘキサンで抽出した。ヘキサン相を集め、窒素下で乾燥させた。試料をビタミンＥ移動相に再溶解させＨＰＬＣ系に注入した。記載されているようにして（Sen等, Molecular basis of vitamin E action. Tocotrienol potently inhibits glutamate-induced pp60(c-Src) kinase activation and death of HT4 neuronal cells. J Biol Chem. 2000 Apr 28;275(17):13049-55; Roy等, Simultaneous Detection of Tocopherols and Tocotrienols in Biological Samples Using HPLC-Coulometric Electrode Array. Meth. Enzymol. 2001 (印刷中)）、信頼できる化合物を用いて標準曲線を作成した。図３Ａに示されているように、この濾過培地調製物は１．６２μＭのα-トコフェロールと０．０６μＭのγ-トコフェロールを含有していた。
【００６８】
ｂ．グルタチオン
グルタチオン(ＧＳＨ)を酸性化された試料から抽出し、Ｃ-１８カラム(１５０ｍｍｘ４．６ｍｍ、５μｍ孔径; Alltech, Deerfield, IL)をＧＳＨの分離に使用した。ＨＰＬＣを、記載されているようにして実施した（Sen等, Molecular basis of vitamin E action. Tocotrienol potently inhibits glutamate-induced pp60(c-Src) kinase activation and death of HT4 neuronal cells. J Biol Chem. 2000 Apr 28;275(17):13049-55）。図３Ｂに示されているように、この濾過培地調製物は３．３６ｎＭのＧＳＨを含んでいた。
【００６９】
ｃ．システインとシスチン
試料を８％のｍ-リン酸を使用して酸性化し、蛋白質を遠心分離により沈殿させた。得られた抽出物を濾過し、ＨＰＬＣ装置に注入した。シスチン(酸化形態)の検出のために、最初に試料を室温で１０分間２-メルカプトエタノールで処理した後、記載されているようにして８％のｍ-リン酸で酸抽出を行った。ＨＰＬＣ条件は、移動相に対して組成が５０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ３．０)である以外はグルタチオンのものと同様であった。図３Ｃ及びＤにそれぞれ示されるように、この濾過培地調製物は１０．６４μＭのシステイン(還元形)と１１２．１μＭのシステインとシスチンを含んでいた。
【００７０】
まとめると、これらの結果は、条件培地が培養誘導抗酸化剤を含有していることを実証している。ユビキノン、ユビキノール、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ等々のような更なる抗酸化剤のためのＨＰＬＣ検査を同じ又は同様の方法を使用して実施することができる。別法として、抗酸化剤酵素活性を、当該分野で知られているように、適切な酵素アッセイを用いて定量することができる。
【００７１】
実施例７
コラーゲンの沈着に対する条件培地の効果
この実施例は３次元細胞培養中の線維芽細胞による細胞外マトリックス成分の沈着に対する条件培地の効果を実証している。コラーゲンＩ型のプロペプチド（コラーゲンＩ型テロペプチドとしても知られている）をコラーゲンＩ型の指示薬として用い、コラーゲンＩ型自体は細胞外マトリックス成分の生成の指示薬である。条件培地をDermagraft(登録商標)法における末期培地の変化から得て（約２週間）、窒素圧下で濃縮器(Amicon, Beverley, MA)での限外濾過によって濃縮した。条件培地の体積を元の体積の約１０分の１まで濃縮して、濃縮した条件培地を集めた。ＤＭＥＭ１に入れたヒト真皮線維芽細胞を５ｘ１０３細胞／ウェルで９６ウェルの組織培養プレートのウェル中に播種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中に約４８時間配した。培地をＤＭＥＭ１か、１０％の濃縮した条件培地を補填したＤＭＥＭ１と置き換えて、条件培地の最終濃度を約１Ｘとした。プレートを約２４時間の間インキュベーターに戻した。上清を各ウェルから集めて、市販のコラーゲンＩ型プロペプチドエライザ(タカラバイオメディカルズ，日本)を製造者の指示書に従って使用してコラーゲンＩ型プロペプチドの有無を検査した。
【００７２】
図４に示されるように、この実験では、馴化前培地に維持された培養物と比較して条件培地に維持された培養物中にコラーゲンの沈着の統計的に有意な増加(ｐ＝０．０５)が観察された。当業者であれば、コラーゲンのような細胞外マトリックス成分のインビボでの沈着の亢進は、とりわけ皺や起伏(contour)の欠陥の局所的処置にとって重要であることを理解しているであろう。
【００７３】
実施例８
無血清又は非ヒト動物産物非含有条件培地
この予言的実施例は常法を用いて馴化前UltraCULTURETM無血清培地へ例示的な血清含有馴化前ＤＭＥＭ培地で成長させたヒト真皮線維芽細胞培養物を適合させることを例証する。例えばBioWhittaker 1999/2000カタログの４２−４５頁を参照のこと。UltraCULTURETM(BioWhittakerカタログ番号12-725F)培地に製造者の指示に従ってＬ-グルタミン(カタログ番号17-605)を補填する(馴化前UltraCULTURETM無血清培地)。
【００７４】
ヒト真皮線維芽細胞の単層培養物を、１０％仔ウシ血清(Hyclone Laboratories, Logan, UT)、非必須アミノ酸(GibcoBRL)及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン-ストレプトマイシン-２５０ｎｇ／ｍｌアンホテレシンＢ(GibcoBRL)を補填した馴化前ＤＭＥＭ細胞培養培地(高グルコースダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ； GibcoBRL, Grand Island, NY))を用いて実施例１に記載されているようにして調製する。細胞を継代させ、馴化前UltraCULTURETM無血清培地を希釈剤として用いて１：２に分けた。細胞を皿に蒔き、必要に応じて馴化前UltraCULTURETM無血清培地を供給しながら最大の細胞密度が得られるまで３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターでインキュベートした。
【００７５】
細胞が少なくとも８５％の生存性を示していない場合、細胞を一継代に対して０．５％仔ウシ血清(HyClone Laboratories)を補填した馴化前UltraCULTURETM無血清培地を用いて１：２の比率で継代させた。それぞれの連続する継代に対して仔ウシ血清の量は、５代の継代後に馴化前UltraCULTURETM無血清培地が血清を含まないように、０．１％減少させる。この時点で、実施例２又は３に記載されているようにして、線維芽細胞を３次元培養で増殖させることができるが、但し、細胞は必要に応じてアスコルビン酸が補填された馴化前UltraCULTURETM無血清培地に維持される。条件無血清培地を適切な間隔で集める。
【００７６】
線維芽細胞単層培養が馴化前UltraCULTURETM無血清培地で成功裏に成長させられるのに適合しない場合、交互のウィーニングプロセスを使用する。細胞を記載されているようにして継代させ、３５０ｘｇで５分遠心分離させ、５％仔ウシ血清(Hyclone)を含む馴化前UltraCULTURETM無血清培地に再懸濁させ、１：２に分け、再び蒔いた。次の継代において、細胞ペレットを２％仔ウシ血清を含む馴化前UltraCULTURETM無血清培地に再懸濁させ、記載されているようにして分けて、蒔いた。次の５代の継代において、ペレットを２％、ついで１％、ついで０．５％、ついで０．１％、最後に０％の仔ウシ血清を含む馴化前UltraCULTURETM無血清培地に再懸濁させ、蒔いた。この時点で線維芽細胞は、実施例２又は３に記載されているようにして、３次元培養で増殖させることができるが、但し、細胞は馴化前UltraCULTURETM無血清培地に維持される。条件培地が必要に応じて集められる。
【００７７】
UltraCULTURETM無血清培地をこの予言的実施例に対して選択したが、とりわけそれがＤＭＥＭ系培地であり、ＨｕＳ-１＊ＡＴ皮膚細胞株を含む多くのヒト細胞株の成長を支援することが分かっているからである。BioWhittaker 1999/2000カタログ番号の４６−４７頁を参照のこと。しかしながら当業者ならば、多くの無血清及び動物産物非含有培地もまた様々なヒト細胞の成長を支援する合理的な可能性があり、そのような培地を過度の実験を行うことなく常套的に評価することができることが分かるであろう。
【００７８】
この予言的な実施例は例示的な馴化前無血清培地へ例示的な馴化前ＤＭＥＭ細胞培養培地で成長させたヒト真皮線維芽細胞を適合させることを記述しているが、当業者ならば、同じ手順を用いて、血清含有又は無血清培地の何れかにおける様々な培養細胞を馴化前動物産物非含有培地での成長に適合させることができることが分かるであろう。動物産物非含有培地での成長への適合化に続いて、そのような細胞は、記載されているようにして３次元培養で増殖させることができ、非ヒト動物産物非含有条件培地を必要に応じて集める。
【００７９】
実施例９
ＫＧＦの発現の増強
この実施例は適切な条件下での３次元培養中におけるヒト真皮線維芽細胞によるケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）分泌の誘導を実証する。およそ１１ｍｍｘ１１ｍｍのDermagraft(登録商標)片を２４ウェルの組織培養プレートのウェルに配した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに維持し、ＤＭＥＭ２か１ｎｇ／ｍｌの濃度のインターロイキン-１-アルファ(ＩＬ-１α)を補填したＤＭＥＭ２を供給した。条件培地を２４時間毎に集めた。条件培地中のＫＧＦの濃度は製造者の指示に従ってヒトＫＧＦイムノアッセイ(Quantikine, R & D Systems)を使用して決定した。図５に示された結果は、この実験において、ＩＬ-１αの存在下でDermagraft(登録商標)試料から条件培地中に存在しているＫＧＦのレベルがＩＬ-１αの不存在下の場合よりもおよそ４倍大きいことを実証している。よって、この実験において、３次元培養におけるヒト真皮線維芽細胞によるＫＧＦの発現はＩＬ-１αによって増強された。
【００８０】
実施例１０
ＶＥＧＦの発現の増強
この実施例は適切な条件下で３次元培養中でのヒト真皮線維芽細胞によるＶＥＧＦの発現が増強されうることを実証する。３次元ヒト真皮線維芽細胞培養物に馴化前ＤＭＥＭ２か０．５、１、２、４又は８ｎＭのＰＤＧＦ ＡＢ（組み合わせたＡ鎖及びＢ鎖）を補填した馴化前ＤＭＥＭ２を供給した。３７℃で４８時間のインキュベーション後、条件細胞培養培地を取り除き、典型的には収集日に試験した。６つの条件培地試料中に存在するＶＥＧＦの量（０、０．５、１、２、４及び８ｎＭのＰＤＧＦ）を製造者の指示に従ってQuantikineヒトＶＥＧＦイムノアッセイキット(カタログ番号DVE00, R & D Systems)を用いて測定した。図６に示されるように、馴化前培地中に増加した量のＰＤＧＦが存在するとＶＥＧＦの分泌が増加した。この実験では、外因性ＰＤＧＦの不存在下での３次元培養によりおよそ１．３ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦが生産される一方、８ｎＭまでのＰＤＧＦを含有する培地での平行培養によりおよそ６ｎｇ／ｍｌまでのＶＥＧＦが産生された。これらの結果は、ＶＥＧＦの分泌レベルが、ナノモル又はナノモル以下の濃度のＰＤＧＦの存在下で増強され得ることを実証している。
【００８１】
実施例１１
培養条件によるＶＥＧＦの分泌の比較
ＶＥＧＦの分泌に対する培養条件の効果を評価するために、ヒト真皮線維芽細胞を、ａ）単層培養、ｂ）３次元コラーゲンゲル培養、ｃ）３次元緊縮コラーゲンゲル培養、及びｄ）３次元スキャフォールドで平行して成長させた。単層培養に対しては、３ｘ１０６継代の８のヒト真皮線維芽細胞を１００ｍｍの組織培養皿に播種した。３次元スキャフォールドはウシ胎仔血清に前もって浸した５．５ｘ５．５ｃｍのシラスティック(silastic)裏のニットナイロンメッシュ(Biobrane(登録商標), Dow Hickum)を含んでいた。前処理に続いて、スキャフォールドを１００ｍｍの組織培養皿に配し、３ｘ１０６の継代の８のヒト真皮線維芽細胞をスキャフォールド上に播種した（「スキャフォールドベース」）。皿を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに配し、細胞に１０％仔ウシ血清、２ｍＭのＬ-グルタミン、５０μｇ／ｍｌのアスコルベート-ホスフェート、及び１０Ｕ／ｍｌのペニシリン-ストレプトマイシンを補填したＤＭＥＭを供給した。
【００８２】
二つのコラーゲンゲル培養物を、１０ｍｌのVitrogen(Collagen Corp.)に３ｘ１０６の継代の８のヒト真皮線維芽細胞を懸濁させることによって調製し、懸濁液を一般的な１００ｍｍの組織培養皿(「ストレスゲル」)か、又は収縮コラーゲンゲル培養に対しては、１００ｍｍの非処理培養皿(Costar)(「収縮ゲル」)に注いだ。皿を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに配し、細胞に１０％仔ウシ血清、２ｍＭのＬ-グルタミン、５０μｇ／ｍｌのアスコルベート-ホスフェート、及び１０Ｕ／ｍｌのペニシリン-ストレプトマイシンを補填したＤＭＥＭを供給した。コラーゲンは懸濁液中の線維芽細胞とインキュベーター中で速やかに重合した。一般的な組織培養皿中のコラーゲンポリマーは皿の側面に接触したままであった。これに対して、非処理培養皿中のコラーゲンポリマーは収縮し、ポリマーを培養皿の側面から離れるように引っ張った。
【００８３】
培養物に３日から４日毎に新鮮な馴化前培地を供給した。約２週間後に条件培地を４つの培養系の各々から収集し分析した。４つの培養の各々によって産生されたヒトＶＥＧＦの量を、QuantikineヒトＶＥＧＦイムノアッセイ(R & D Systems)を製造者の指示に従って用いて決定した。１日当たり１０６細胞につき分泌されたＶＥＧＦのナノグラムに基づいて結果を標準化した。図７に示されるように、この実験では、単層培養は１ｎｇＶＥＧＦ／１０６細胞／日未満分泌し、ストレスコラーゲンゲルと収縮コラーゲン培養はおよそ１．５ｎｇＶＥＧＦ／１０６細胞／日及び０．５ｎｇＶＥＧＦ／１０６細胞／日をそれぞれ分泌した。スキャフォールドベースの培養は、比較すると、４．０ｎｇを越えるＶＥＧＦ／１０６細胞／日を分泌した。
【００８４】
実施例１２
条件培地の安全性の研究
医薬部外品組成物に使用される条件培地の安全性を評価するために、栄養剤液をヒト患者に局所的に塗布し、正常及び擦過条件下に逐次的かつ連続して暴露した後の皮膚の炎症の出現を決定した。
【００８５】
栄養剤液を標準的な化粧品安全性プロトコルを使用して正常なヒトの成人の前腕皮膚に対する一次刺激及び蓄積性刺激について検査した。二百マイクロリットルのコントロール又は栄養剤液の何れかを上腕部の３．８ｃｍ２の密閉パッチ(Webril不織布コットンパッド)に塗布した。パッチを３Ｍ(登録商標)低アレルギー誘発性テープに配した。一次刺激研究には１５人の被験者（女性１３人と男性２人、２８−７７歳）が関与した。栄養剤液を２回の２４時間のインターバルで被験者の上腕部の正常な及び剥ぎ取られた(abraided)(Transporeテープを使用してテープを５回剥がして角質の外層を除去)皮膚上の密閉パッチに塗布した。蓄積性刺激の研究には３１人の被験者（女性２１人と男性１０人、２０−６５歳）が関与した。被験者１人がテープの刺激のために、また１人が個人的な理由から取り止めた。女性１９人と男性１０人の２９人が実験を最後まで行った。栄養剤液は上腕部に１４、連続、２４時間の適用であった。全体の観察は、光沢、ピーリング、かさぶた形成(scabbing)、ひび、色素沈着過度及び低色素沈着(hypopigmentation)に対して等級付けした。刺激性について５点の段階で目で見てスコアをつけ、紅斑、浮腫、丘疹、小水疱、水疱反応、湿潤性(weeping)、広がり、及び硬性(induration)に対して数的に等級をつけた。有資格の医療専門家が決定したところ、これらの研究では栄養剤液又はコントロールによって有害事象は誘発されなかった。
【００８６】
実施例１３
条件培地の効果の研究
正常な及び光損傷を受けたヒトの皮膚の組織に対する栄養剤液の医薬部外品的効果を評価するために、密閉パッチ検査を、本質的に実施例１２に記載されたようにして実施した。栄養剤液を含む密閉パッチを６人の女性の被験者（３７−４６歳）の各人の前腕部に月曜日から金曜日まで毎日貼り、土曜日に検査を行った。３人の被験者が５日間パッチを付け、３人の被験者が１２日間付けた。パンチバイオプシー（２ｍｍ）を最後の次の日のパッチから取った。バイオプシーを１０％のホルマリンに固定し、パラフィンに埋め込み、４ミクロンの切片を切り出し、コラーゲンに対してＨ＆Ｅ、トリ-クロム, エラスチンに対してVerhoeff Van Grieson染色液で染色した。刺激性について安全性の研究におけるようにしてスコアを付けた。有意な刺激は被験者には観察されなかった。１００ｘ及び２５０ｘの倍率で染色された切片の組織検査をしたところ、栄養剤液とコントロールの間に細胞構造の差はなかった。表皮厚み及び線維芽細胞核の漸進的増加が０から２から４週まで見られた。４週目までに平均表皮厚は２２％増加し、真皮線維芽細胞核は３８％増加した。
【００８７】
実施例１４
３次元培養(Dermagraft(登録商標))条件培地の臨床的評価
条件細胞培養培地を、３次元フレームワーク上で成長させたヒト真皮線維芽細胞を含む組織工学産物であるDermagraft(登録商標)(Advanced Tissue Sciences, La Jolla, CA)の調製物から得た。条件培地を６人のヒト被験者の前腕部に毎日２回塗布した。研究の０、１４及び２８日目にバイオプシーを取得し、常法によって組織検査した。前腕部バイオプシー材料は、０日目に集めたバイオプシー材料と比較して、２８日目でコラーゲンＩ型(＋＋)、コラーゲンＩＩＩ型(＋＋＋)、ヒアルロン酸(＋＋＋)、及びエラスチン(＋＋)の増加を示した。また表皮厚み及び線維芽細胞核の漸進的増加が４週の研究インターバルにわたって組織学的に観察された。
【００８８】
実施例１５
輸送増強成長因子の産生
この予言的実施例は一般的な分子生物学の方法を用いての輸送増強成長因子の産生を記述する。例えばAusbel等, Sambrook及びRussell、及びSambrook等を参照のこと。表３に特定された成長因子の任意のもののような成長因子をコードする遺伝子断片が、輸送ペプチドをコードする遺伝子断片、例えば限られるものではないが、表１に示されている輸送ペプチド配列（配列番号：１−配列番号：１９）の一つに融合される。典型的には、輸送ペプチドをコードする遺伝子断片は、輸送ペプチドが輸送増強成長因子のアミノ末端にあるように、成長因子をコードする遺伝子断片の上流に融合される。例えば、融合遺伝子断片は、一般的な分子生物学の手法を用いて、例えばＶＥＧＦをコードするＤＮＡ配列と配列番号：３をコードするＤＮＡ配列を結合させることによって、産生される。ＶＥＧＦのヌクレオチド配列は当該分野で知られている。しかして、配列番号：３の輸送ペプチドをコードする例示的ＤＮＡ配列：CGUAAAAAACGUCGUCAACGUCGUCGU(配列番号：２０)はＶＥＧＦをコードするＤＮＡ配列に結合させられる。ＤＮＡコードの重複性のため、当業者ならば、多くの代替配列が輸送ペプチド及びＶＥＧＦのアミノ酸配列をコードすることが分かるであろう。例えば、配列番号：３の輸送ペプチドをコードする多くの代替配列の一つは、CGCAAAAAACGCCGCCAACGCCGCCGC(配列番号：２１)である。しかして、当業者であれば、典型的には、所望の輸送ペプチドのアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列が、輸送増強成長因子融合遺伝子断片を生成するために所望の成長因子のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列と融合できることは分かるであろう。
【００８９】
ついで輸送増強成長因子融合遺伝子断片は、一般的な分子生物学の手法を使用して、所望の宿主細胞、典型的には線維芽細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞、平滑筋細胞等々のようなヒト細胞中で発現させるための適切な発現ベクター中に挿入される。発現ベクターは典型的には５'フランキング配列と他の適切な調節エレメント並びにエンハンサー(群)、転写終結エレメント、場合によってはドナー及びアクセプタースプライス部位を含む完全イントロン配列、必要ならばシグナルペプチド配列、リボソーム結合部位エレメント、ポリアデニル化配列、及び選択マーカーを含む。
【００９０】
ついで輸送増強成長因子発現ベクターが使用され、一般的な分子生物学の手法、例えばリン酸カルシウム共沈又はエレクトロポレーション法を使用して、例えば限定されるものではないが、ヒト真皮線維芽細胞に形質移入される。輸送増強成長因子発現ベクターを含む形質転換された細胞は、一般的な分子生物学の手法を使用して、選択され、細胞は単層培養で増量される。ついで、単層細胞が使用され、上に記載したもののような、３次元培養に播種される。そのような３次元培養を使用して馴化される培地は所望の輸送増強成長因子、ここでは輸送増強ＶＥＧＦを含んでいなければならない。
【００９１】
当業者ならば、この実施例はＨＩＶ-１Ｔａｔ伝達ドメイン(配列番号：３)及びＶＥＧＦを使用する輸送増強成長因子遺伝子断片の形成を記述しているが、所望の成長因子をコードする核酸配列の任意の数の組合せを、表１に示された輸送ペプチドの任意のものをコードする任意の数の核酸配列と融合させて、過度な実験を行うことなく、輸送増強成長因子遺伝子断片を産生させることができることが分かるであろう。
【００９２】
実施例１６
輸送増強抗酸化剤の産生
この予言的実施例は一般的な分子生物学の方法を用いての輸送増強抗酸化剤の産生を記述する。例えばAusbel等, Sambrook及びRussell、及びSambrook等を参照のこと。抗酸化剤をコードする遺伝子断片が、輸送ペプチドをコードする遺伝子断片と融合される。典型的には、輸送ペプチドをコードする遺伝子断片は、輸送ペプチドが輸送増強抗酸化剤のアミノ末端に又はその近くにあるように、抗酸化剤をコードする遺伝子断片の上流に融合される。
【００９３】
例えば、抗酸化剤、例えばグルタチオン、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ、グルタチオンジスルフィド、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アルファ-トコフェロール、ガンマ-トコフェロール、ユビキノール-９、ユビキノン-９、又はアスコルビン酸をコードする遺伝子断片は、輸送ペプチドをコードする遺伝子断片、例えば限定されるものではないが、表１に示される輸送ペプチド配列(配列番号：１−配列番号：１９)の一つに融合される。典型的には、輸送ペプチドをコードする遺伝子断片は、輸送ペプチドが輸送増強抗酸化剤のアミノ末端になるように、抗酸化剤をコードする遺伝子断片の上流に融合される。例えば、融合遺伝子断片は、一般的な分子生物学の手法を用いて、例えばそのヌクレオチド配列が当該分野で直ぐに利用できるグルタチオンをコードするＤＮＡ配列と配列番号：１８をコードするＤＮＡ配列を結合させることによって、産生される。しかして、配列番号：１８の輸送ペプチドをコードする例示的ＤＮＡ配列：AGAAGAAGAAGAAGAAGA(配列番号：２２)は、グルタチオン(γ-グルタミルシステイニルグリシン)をコードするＤＮＡ配列、例えばCAAUGUGGU(配列番号：２３)に結合させられる。ＤＮＡコードの重複性のため、当業者ならば、多くの代替配列が輸送ペプチド及びグルタチオンのアミノ酸配列をコードすることが分かるであろう。例えば、グルタチオンをコードする幾つかの代替配列の一つは、CAAUGUGGC(配列番号：２４)である。しかして、当業者であれば、典型的には、所望の輸送ペプチドのアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列が、輸送増強抗酸化剤融合遺伝子断片を生成するために所望の抗酸化剤のアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列と融合できることは分かるであろう。
【００９４】
ついで輸送増強抗酸化剤融合遺伝子断片は、一般的な分子生物学の手法を使用して、所望の宿主細胞、典型的には線維芽細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞、平滑筋細胞等々のようなヒト細胞中で発現させるための適切な発現ベクター中に挿入される。発現ベクターは典型的には５'フランキング配列と他の適切な調節エレメント並びにエンハンサー(群)、転写終結エレメント、場合によってはドナー及びアクセプタースプライス部位を含む完全イントロン配列、必要ならばシグナルペプチド配列、リボソーム結合部位エレメント、ポリアデニル化配列、及び選択マーカーを含む。
【００９５】
ついで輸送増強抗酸化剤発現ベクターが使用され、一般的な分子生物学の手法、例えばリン酸カルシウム共沈又はエレクトロポレーション法を使用して、例えば限定されるものではないが、ヒト真皮線維芽細胞に形質移入される。輸送増強成長因子発現ベクターを含む安定に形質転換された細胞は、一般的な分子生物学の手法を使用して、選択され、細胞は単層培養で増量される。ついで、単層細胞が使用され、上に記載したもののような、３次元培養に播種される。そのような３次元培養を使用して馴化される培地は所望の輸送増強抗酸化剤、ここでは輸送増強グルタチオンを含んでいなければならない。
【００９６】
当業者であれば、この実施例はＲ６配列（配列番号：１８）とグルタチオンを使用する輸送増強抗酸化剤遺伝子断片の生成を記述しているが、所望の抗酸化剤をコードする核酸配列の任意の数の組合せを、表１に示した輸送ペプチドの任意のものをコードする任意の数の核酸配列と融合させて、過度な実験を行うことなく、輸送増強抗酸化剤遺伝子断片を産生させることができることが分かるであろう。
【００９７】
実施例１５及び１６に記載したような方法はまた輸送増強細胞外マトリックス成分を産生するために使用することもでき、これもまた本発明の範囲内にある。
本発明を様々な用途、方法及び組成物に関して説明したが、発明の範囲を逸脱することなく様々な変化及び変更を施すことができることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】線維芽細胞又はケラチノサイトの培養物のインビトロ増殖に対する無血清培地、馴化前培地又は条件培地の効果を示すグラフである。線維芽細胞の増殖は、誤差のバーを伴う黒塗りのバーで示される。ケラチノサイトの増殖は誤差のバーを伴う灰色の点描のバーで示される。
【図２】培養された上皮ケラチノサイトに対する無血清培地、対照培地（馴化前培地）及び条件培地の抗酸化剤活性を示すグラフである。
【図３Ａ】濾過された培地中の抗酸化剤レベルの測定結果を示すグラフである。パネル３ＡはビタミンＥの成分であるα-トコフェロールとγ-トコフェロールのＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図３Ｂ】パネル３Ｂはグルタチオン（ＧＳＨ）のＨＰＣＬ分析の結果を示す。
【図３Ｃ】パネル３ＣはシステインのＨＰＣＬ分析の結果を示す。
【図３Ｄ】パネル３Ｄはシステインとシスチンを組み合わせたもののＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図４】培養された線維芽細胞によるコラーゲンの付着に対する対照（馴化前）培地及び条件培地の効果を示すグラフである。
【図５】ＩＬ-１αを伴わない平行培養と比較した場合の、ＩＬ-１αの存在下での３次元ヒト真皮線維芽細胞培養物（Dermagraft(登録商標)）によるＫＧＦの分泌の亢進又はアップレギュレーションを示すグラフである。
【図６】ＰＤＧＦのＡＢ鎖の濃度を増大させた場合のＶＥＧＦ分泌の亢進を示すグラフである。
【図７】線維芽細胞の単層培養、線維芽細胞でストレスを受けたコラーゲンゲル３次元培養、線維芽細胞収縮コラーゲンゲル３次元培養、及び線維芽細胞スキャフォールドベースの３次元培養によるＶＥＧＦの分泌を比較するグラフである。
Claims (74)
- 少なくとも一の培養誘導成長因子であって、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、インターロイキン-３（ＩＬ-３）、ＩＬ-６、及びＩＬ-８の少なくとも一を含んでなる少なくとも一の成長因子と；少なくとも一の培養誘導抗酸化剤であって、グルタチオン、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ、グルタチオンジスルフィド、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アルファ-トコフェロール、ガンマ-トコフェロール、ユビキノール-９、ユビキノン-９、アスコルビン酸、システイン、及びシスチンの少なくとも一を含んでなる少なくとも一の抗酸化剤と；少なくとも一の培養誘導可溶性コラーゲンを含有する条件細胞培養培地、又はその抽出物；及び適切な担体を含有する組成物。
- 少なくとも一の成長因子が遺伝子組換型成長因子を含んでなる請求項１に記載の組成物。
- 遺伝子組換型成長因子が少なくとも一の輸送増強成長因子を含んでなる請求項２に記載の組成物。
- 少なくとも一の抗酸化剤が少なくとも一の遺伝子組換型抗酸化剤を含んでなる請求項１に記載の組成物。
- 少なくとも一の遺伝子組換型抗酸化剤が少なくとも一の輸送増強抗酸化剤を含んでなる請求項４に記載の組成物。
- 適切な担体が製薬的に許容可能な担体である請求項１に記載の組成物。
- 細胞培養培地が３次元培養において真核細胞により馴化される請求項６に記載の組成物。
- 真核細胞がヒト線維芽細胞である請求項７に記載の組成物。
- 適切な担体が化粧品的に許容可能な担体である請求項１に記載の組成物。
- 適切な担体が医薬部外品的に許容可能な担体である請求項１に記載の組成物。
- 細胞培養培地が３次元培養において真核細胞により馴化される請求項１０に記載の組成物。
- 真核細胞がヒト線維芽細胞である請求項１１に記載の組成物。
- ３次元培養がフレームワーク、コラーゲン基質、ゼラチン基質又はゲル基質を含んでなる請求項１１に記載の組成物。
- ３次元培養がフレームワーク又は収縮コラーゲンゲル基質を含む請求項１３に記載の組成物。
- ３次元培養がフレームワークを含む請求項１３に記載の組成物。
- 組成物が実質的にフェノールレッドを含んでない請求項１１に記載の組成物。
- 組成物が実質的にウシ由来の成分を含んでない請求項１１に記載の組成物。
- 組成物が実質的に非ヒト動物産物を含んでない請求項１１に記載の組成物。
- 少なくとも一の成長因子が遺伝子組換型成長因子を含んでなる請求項１１に記載の組成物。
- 遺伝子組換型成長因子が少なくとも一の輸送増強成長因子を含んでなる請求項１９に記載の組成物。
- 少なくとも一の輸送増強成長因子が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、又は配列番号：１９を有する請求項２０に記載の組成物。
- 少なくとも一の抗酸化剤が少なくとも一の遺伝子組換型抗酸化剤を含んでなる請求項１１に記載の組成物。
- 少なくとも一の遺伝子組換型抗酸化剤が少なくとも一の輸送増強抗酸化剤を含んでなる請求項２２に記載の組成物。
- 少なくとも一の輸送増強抗酸化剤が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、又は配列番号：１９を有する請求項２３に記載の組成物。
- ３次元培養物とのインキュベーションによって馴化された細胞培養培地又はその抽出物を含んでなり、条件培地又は抽出物が、少なくとも一の培養誘導成長因子であって、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、インターロイキン-３（ＩＬ-３）、ＩＬ-６、及びＩＬ-８の少なくとも一を含んでなる少なくとも一の成長因子と；少なくとも一の培養誘導抗酸化剤であって、グルタチオン、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ、グルタチオンジスルフィド、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アルファ-トコフェロール、ガンマ-トコフェロール、ユビキノール-９、ユビキノン-９、アスコルビン酸、システイン、及びシスチンの少なくとも一を含んでなる少なくとも一の抗酸化剤と；医薬部外品的に許容可能な担体を含んでなる医薬部外品組成物。
- 少なくとも一の成長因子が遺伝子組換型成長因子を含んでなる請求項２５に記載の組成物。
- 遺伝子組換型成長因子が少なくとも一の輸送増強成長因子を含んでなる請求項２６に記載の組成物。
- 少なくとも一の輸送増強成長因子が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、又は配列番号：１９を有する請求項２７に記載の組成物。
- 少なくとも一の抗酸化剤が少なくとも一の遺伝子組換型抗酸化剤を含んでなる請求項２５に記載の組成物。
- 少なくとも一の遺伝子組換型抗酸化剤が少なくとも一の輸送増強抗酸化剤を含んでなる請求項２９に記載の組成物。
- 少なくとも一の輸送増強抗酸化剤が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、又は配列番号：１９を有する請求項３０に記載の組成物。
- 上記少なくとも一の成長因子がＫＧＦを含んでなる請求項２５に記載の組成物。
- ３次元線維芽細胞培養が、ＫＧＦの発現を増強するのに充分な量のＩＬ-１αで処理される請求項３２に記載の組成物。
- ３次元線維芽細胞培養が、ＶＥＧＦの発現を増強するのに充分な量のＰＤＧＦで処理される請求項２５に記載の組成物。
- 組成物が実質的にフェノールレッドを含んでない請求項２５に記載の組成物。
- 組成物が実質的にウシ由来の成分を含んでない請求項２５に記載の組成物。
- 組成物が実質的に非ヒト動物産物を含んでない請求項２５に記載の組成物。
- ３次元培養がフレームワーク、コラーゲン基質、ゼラチン基質又はゲル基質を含んでなる請求項２５に記載の組成物。
- ３次元培養がフレームワーク又は収縮コラーゲンゲル基質を含む請求項３８に記載の組成物。
- ３次元培養がフレームワークを含む請求項３９に記載の組成物。
- 細胞培養培地が３次元培養において真核細胞により馴化される請求項２５に記載の組成物。
- 真核細胞がヒト線維芽細胞である請求項４１に記載の組成物。
- 少なくとも一の成長因子がグルタチオン、アルファ-トコフェロール、ガンマ-トコフェロール、又はシステインの少なくとも一を含む請求項２５に記載の組成物。
- 少なくとも一の培養由来可溶性コラーゲンを更に含む請求項２５に記載の組成物。
- ３次元培養物と馴化前培地を適切な条件下で組み合わせて、少なくとも一の培養誘導成長因子であって血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、インターロイキン-３（ＩＬ-３）、ＩＬ-６、及びＩＬ-８の少なくとも一を含んでなる少なくとも一の成長因子と；少なくとも一の培養誘導抗酸化剤であって、グルタチオン、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ、グルタチオンジスルフィド、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アルファ-トコフェロール、ガンマ-トコフェロール、ユビキノール-９、ユビキノン-９、アスコルビン酸、システイン、及びシスチンの少なくとも一を含んでなる少なくとも一の抗酸化剤とを含有する条件培地を生成し；
条件培地を医薬部外品的に許容可能な担体と組合せて医薬部外品組成物を生成する、医薬部外品組成物の調製方法。 - ３次元培養物と馴化前培地を適切な条件下で組み合わせて、少なくとも一の培養誘導成長因子であって血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、インターロイキン-３（ＩＬ-３）、ＩＬ-６、及びＩＬ-８の少なくとも一を含んでなる少なくとも一の成長因子と；少なくとも一の培養誘導抗酸化剤であって、グルタチオン、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ、グルタチオンジスルフィド、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、アルファ-トコフェロール、ガンマ-トコフェロール、ユビキノール-９、ユビキノン-９、アスコルビン酸、システイン、及びシスチンの少なくとも一を含んでなる少なくとも一の抗酸化剤とを含有する条件培地を生成し；
条件培地を許容可能な担体と組合せて組成物を生成する、組成物の調製方法。 - 少なくとも一の成長因子が少なくとも一の遺伝子組換型成長因子を含んでなる請求項４５又は４６に記載の方法。
- 少なくとも一の遺伝子組換型成長因子が少なくとも一の輸送増強成長因子を含んでなる請求項４７に記載の方法。
- 少なくとも一の抗酸化剤が少なくとも一の遺伝子組換型抗酸化剤を含んでなる請求項４５又は４６に記載の方法。
- 少なくとも一の遺伝子組換型抗酸化剤が少なくとも一の輸送増強抗酸化剤を含んでなる請求項４９に記載の方法。
- 許容可能な担体が製薬的に許容可能な担体である請求項４６に記載の方法。
- 馴化前培地が３次元培養において真核細胞により馴化される請求項４５又は４６に記載の方法。
- 真核細胞がヒト線維芽細胞である請求項５２に記載の方法。
- ３次元培養がフレームワーク、コラーゲン基質、ゼラチン基質又はゲル基質を含んでなる請求項４５又は４６に記載の方法。
- ３次元培養がフレームワーク又は収縮コラーゲンゲル基質を含む請求項５４に記載の方法。
- 組成物が実質的にフェノールレッドを含んでない請求項４５又は４６に記載の方法。
- 組成物が実質的にウシ由来の成分を含んでない請求項４５又は４６に記載の方法。
- 組成物が実質的に非ヒト動物産物を含んでない請求項４５又は４６に記載の方法。
- 少なくとも一の輸送増強成長因子が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、又は配列番号：１９を有する請求項４８に記載の方法。
- 少なくとも一の輸送増強抗酸化剤が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、又は配列番号：１９を有する請求項５０に記載の方法。
- 少なくとも一の培養誘導可溶性コラーゲンを更に含む、請求項２５に記載の組成物。
- 条件培地の抽出物を担体と組み合わせて組成物を生成する請求項４５又は４６に記載の方法。
- 細胞進入を亢進させる異種ペプチド配列を含む成長因子。
- 成長因子が、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子、ＶＥＧＦ、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦα）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）、インターロイキン-６（ＩＬ-６）、及びインターロイキン-８（ＩＬ-８）の少なくとも一を含み；
異種ペプチド配列が、次の配列：配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、及び配列番号：１９の少なくとも一を含む請求項６３に記載の成長因子。 - 細胞進入を亢進させる異種ペプチド配列を含む抗酸化剤。
- 抗酸化剤が、システイン、シスチン、アスコルビン酸、グルタチオン、グルタチオンジスルフィド、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ、グルタチオンジスルフィド、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ビタミンＥ、アスコルビン酸、ユビキノール-９、及びユビキノン-９の少なくとも一を含み；
異種ペプチド配列が次の配列：配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、及び配列番号：１９の少なくとも一を含む請求項６５に記載の抗酸化剤。 - 細胞進入を亢進させる異種ペプチド配列を含んでなる細胞外マトリックス成分。
- 細胞外マトリックス成分が、少なくとも一の糖蛋白質、少なくとも一のプロテオグリカン、及び少なくとも一のグリコサミノグリカンの少なくとも一を含み；
異種ペプチド配列が次の配列：配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、及び配列番号：１９の少なくとも一を含む請求項６７に記載の細胞外マトリックス成分。 - 細胞進入を亢進させる異種ペプチド配列を含んでなる成長因子をコードするＤＮＡを含む細胞。
- 成長因子が、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子、ＶＥＧＦ、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦα）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）、インターロイキン-６（ＩＬ-６）、及びインターロイキン-８（ＩＬ-８）の少なくとも一を含み；
異種ペプチド配列が、次の配列：配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、及び配列番号：１９の少なくとも一を含む請求項６９に記載の細胞。 - 細胞進入を亢進させる異種ペプチド配列を含んでなる抗酸化剤をコードするＤＮＡを含む細胞。
- 抗酸化剤が、システイン、シスチン、アスコルビン酸、グルタチオン、グルタチオンジスルフィド、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオンレダクターゼ、グルタチオンジスルフィド、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ビタミンＥ、アスコルビン酸、ユビキノール-９、及びユビキノン-９の少なくとも一を含み；
異種ペプチド配列が次の配列：配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、及び配列番号：１９の少なくとも一を含む請求項７１に記載の細胞。 - 細胞進入を亢進させる異種ペプチド配列を含んでなる細胞外マトリックス成分をコードするＤＮＡを含む細胞。
- 細胞外マトリックス成分が、少なくとも一の糖蛋白質、少なくとも一のプロテオグリカン、及び少なくとも一のグリコサミノグリカンの少なくとも一を含み；
異種ペプチド配列が次の配列：配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、及び配列番号：１９の少なくとも一を含む請求項７３に記載の細胞。
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