JP4624033B2 - 間葉系幹細胞の培養方法および肝細胞増殖因子の使用方法 - Google Patents
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Description
この発明は、間葉系幹細胞の培養方法および肝細胞増殖因子の使用方法に関するものである。
骨髄液等に含まれている間葉系幹細胞は、骨、軟骨、脂肪等に分化可能な多分化能を有しているため、細胞治療や再生医療の細胞ソースとして注目を集めている。しかしながら、骨髄液等に含まれている間葉系幹細胞はごく微量であるため、臨床治療に用いる場合には、骨髄液内から集めた間葉系幹細胞を短期間で大量に増殖させることが重要である。
従来、間葉系幹細胞を効率よく増殖させる方法として、例えば、特許文献１および特許文献２に開示されている方法が知られている。
これらの方法は、間葉系幹細胞の増殖能刺激物質として繊維芽細胞増殖因子を培地に添加するものである。
国際公開第ＷＯ０２／２２７８８Ａ１号公報
国際公開第ＷＯ０１／４８１４７Ａ１号公報
これらの方法は、間葉系幹細胞の増殖能刺激物質として繊維芽細胞増殖因子を培地に添加するものである。
これに対して、本発明者は、試験、研究の結果、間葉系幹細胞をさらに短期間で大量に増殖させる増殖因子を見いだした。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、患者から採取した間葉系幹細胞を短期間で大量に増殖させることができ、大量の間葉系幹細胞を必要とする臨床治療に貢献し得る間葉系幹細胞の培養方法および肝細胞増殖因子の使用方法を提供することを目的としている。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、患者から採取した間葉系幹細胞を短期間で大量に増殖させることができ、大量の間葉系幹細胞を必要とする臨床治療に貢献し得る間葉系幹細胞の培養方法および肝細胞増殖因子の使用方法を提供することを目的としている。
上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明の参考例は、肝細胞増殖因子を１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した培地を提供する。
上記発明においては、肝細胞増殖因子を２０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加することが好ましい。
本発明の参考例は、肝細胞増殖因子を１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した培地を提供する。
上記発明においては、肝細胞増殖因子を２０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加することが好ましい。
また、上記発明においては、ビタミンＣを２５μｇ／ｍｌ〜４０００μｇ／ｍｌの濃度で添加することが好ましい。
ビタミンＣを添加した場合には、肝細胞増殖因子を４０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加することが好ましい。
ビタミンＣを添加した場合には、肝細胞増殖因子を４０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加することが好ましい。
本発明は、肝細胞増殖因子及びビタミンＣを間葉系幹細胞の増殖刺激物質として添加した培地において間葉系幹細胞を培養する間葉系幹細胞の培養方法を提供する。
この方法においては、前記培地内における肝細胞増殖因子の濃度が、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。
また、前記培地内における肝細胞増殖因子の濃度が２０ｎｇ／ｍｌであることがさらに好ましい。
この方法においては、前記培地内における肝細胞増殖因子の濃度が、１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。
また、前記培地内における肝細胞増殖因子の濃度が２０ｎｇ／ｍｌであることがさらに好ましい。
また、この場合には、前記培地内におけるビタミンＣの濃度が２５μｇ／ｍｌ〜４０００μｇ／ｍｌであることが好ましい。
また、ビタミンＣを添加した場合には、前記培地内における肝細胞増殖因子の濃度が４０ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。
また、ビタミンＣを添加した場合には、前記培地内における肝細胞増殖因子の濃度が４０ｎｇ／ｍｌであることが好ましい。
さらに、本発明は、培地内に骨髄液を投入して培養することにしてもよい。骨髄液内に含まれる造血幹細胞の増殖が、間葉系幹細胞と同様に肝細胞増殖因子の作用によって促進される。造血幹細胞は間葉系幹細胞の増殖を促進することが知られているので、本発明によれば、患者から採取した骨髄液の初代培養においても効率的に間葉系幹細胞を増殖させることができる。
また、本発明は、間葉系幹細胞の増殖能刺激物質として肝細胞増殖因子及びビタミンＣを使用する肝細胞増殖因子の使用方法を提供する。肝細胞増殖因子及びビタミンＣによって間葉系幹細胞の増殖を促進することができる。
本発明によれば、間葉系幹細胞を効率的に増殖して、患者から採取した骨髄液等に含まれる微量の間葉系幹細胞から、短期に、かつ大量に間葉系幹細胞を得ることができるという効果を奏する。
以下、本発明の一参考実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法および肝細胞増殖因子の使用方法について説明する。
本実施形態に係る培地は、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）に１０％のＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）またはヒト血清、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの肝細胞増殖因子（Hepatocyte Growth Factor：以下、単にＨＧＦという。）および抗生物質を混合したものである。
本実施形態に係る培地は、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）に１０％のＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）またはヒト血清、１０〜１００ｎｇ／ｍｌの肝細胞増殖因子（Hepatocyte Growth Factor：以下、単にＨＧＦという。）および抗生物質を混合したものである。
本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法は、培地として上記培地を使用して所定の培養条件（例えば、温度３７℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％）で間葉系幹細胞の培養を行う方法である。
また、本実施形態に係るＨＧＦの使用方法は、このような培養方法において、ＨＧＦを間葉系幹細胞の増殖能刺激物質として使用する方法である。
本実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法および肝細胞増殖因子の使用方法によれば、ＨＧＦの作用により、ＨＧＦを含まない場合と比較して間葉系幹細胞を大幅に増殖させることができるという効果がある。
また、本実施形態に係るＨＧＦの使用方法は、このような培養方法において、ＨＧＦを間葉系幹細胞の増殖能刺激物質として使用する方法である。
本実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法および肝細胞増殖因子の使用方法によれば、ＨＧＦの作用により、ＨＧＦを含まない場合と比較して間葉系幹細胞を大幅に増殖させることができるという効果がある。
次に、本発明の一実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法およびＨＧＦの使用方法について説明する。
本実施形態に係る培地は、ＤＭＥＭに１０％のＦＢＳまたはヒト血清、２５〜４０００μｇ／ｍｌのビタミンＣ、１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦおよび抗生物質を混合したものである。
本実施形態に係る培地は、ＤＭＥＭに１０％のＦＢＳまたはヒト血清、２５〜４０００μｇ／ｍｌのビタミンＣ、１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦおよび抗生物質を混合したものである。
本実施形態に係る間葉系幹細胞の培養方法は、培地として上記培地を使用して所定の培養条件（例えば、温度３７℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％）で間葉系幹細胞の培養を行う方法である。
また、本実施形態に係るＨＧＦの使用方法は、このような培養方法において、ＨＧＦを間葉系幹細胞の増殖能刺激物質として使用する方法である。
本実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法および肝細胞増殖因子の使用方法によれば、ＨＧＦおよびビタミンＣの作用により、ビタミンＣを含まない場合と比較して間葉系幹細胞を大幅に増殖させることができるという効果がある。
また、本実施形態に係るＨＧＦの使用方法は、このような培養方法において、ＨＧＦを間葉系幹細胞の増殖能刺激物質として使用する方法である。
本実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法および肝細胞増殖因子の使用方法によれば、ＨＧＦおよびビタミンＣの作用により、ビタミンＣを含まない場合と比較して間葉系幹細胞を大幅に増殖させることができるという効果がある。
［第１の参考実施例］
一参考実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法およびＨＧＦの使用方法の第１の参考実施例を以下に説明する。
本実施例において使用された培地は、ＤＭＥＭに１０％のＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦおよび抗生物質を混合したものである。
一参考実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法およびＨＧＦの使用方法の第１の参考実施例を以下に説明する。
本実施例において使用された培地は、ＤＭＥＭに１０％のＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦおよび抗生物質を混合したものである。
本実施例においては、まず、対数増殖中の間葉系幹細胞をトリプシンで回収し、細胞数１０６個／ｍｌとなるように１０％濃度のＦＢＳ入り培地で懸濁した。次いで、その細胞を３０００個／ｃｍ２となるように、６ウェルプレートに播いた。そして、上記のようにＤＭＥＭに１０％のＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦおよび抗生物質を混合した培地３ｍｌを加えた。
このように調製された間葉系幹細胞をＣＯ ２ インキュベータ内に投入し、温度３７℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％の培養条件下で１週間培養した。培養期間中、培地の交換を２回行った。培養３日目と７日目において細胞をトリプシンで回収して血球計算盤で細胞数を計測した。その結果を図１に示す。コントロールとして、ＨＧＦを含まない培地で同様の培養を行った結果を示す。
この実施例によれば、培地に２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを添加した場合の方が、添加しないコントロールの場合と比較して、培養３日目および７日目のいずれの場合も、約１．５倍も多く間葉系幹細胞を増殖させることができた。
［第２の参考実施例］
次に、一参考実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法およびＨＧＦの使用方法の第２の参考実施例を以下に説明する。この実施例は、ＨＧＦの濃度を変化させて培養したものである。
次に、一参考実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法およびＨＧＦの使用方法の第２の参考実施例を以下に説明する。この実施例は、ＨＧＦの濃度を変化させて培養したものである。
本実施例においては、まず、対数増殖中の間葉系幹細胞をトリプシンで回収し、細胞数１０６個／ｍｌとなるように１０％濃度のＦＢＳ入り培地で懸濁した。次いで、その細胞を３０００個／ｃｍ２となるように、１２ウェルプレートに播いた。そして、上記のようにＤＭＥＭに１０％のＦＢＳ、抗生物質およびそれぞれ０，１０，２０，４０，６０，１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを混合した培地２ｍｌを加えた。
このように調製された間葉系幹細胞をＣＯ ２ インキュベータ内に投入し、温度３７℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％の培養条件下で培養し、培養４日目に、トリプシンで回収した間葉系幹細胞の細胞数を血球計算盤によって計測した。その結果を図２に示す。
この実施例によれば、ＨＧＦが間葉系幹細胞の増殖を促進していること、および、その増殖促進効果がＨＧＦの濃度に依存してことがわかった。
この実施例によれば、ＨＧＦが間葉系幹細胞の増殖を促進していること、および、その増殖促進効果がＨＧＦの濃度に依存してことがわかった。
図２によれば、ＨＧＦ濃度が１０ｎｇ／ｍｌであっても、間葉系幹細胞の増殖促進効果が見られる。また、ＨＧＦ濃度が２０ｎｇ／ｍｌ以上となると、間葉系幹細胞の増殖促進効果はほぼ一定となっている。ＨＧＦ濃度があまりに高い場合には、間葉系幹細胞の健全性が害される可能性があり、現実的には１００ｎｇ／ｍｌ以下であることが好ましい。
したがって、間葉系幹細胞の増殖促進効果を得るためのＨＧＦ濃度としては、１０〜１００ｎｇ／ｍｌが好ましく、２０ｎｇ／ｍｌであることがさらに好ましい。
したがって、間葉系幹細胞の増殖促進効果を得るためのＨＧＦ濃度としては、１０〜１００ｎｇ／ｍｌが好ましく、２０ｎｇ／ｍｌであることがさらに好ましい。
［第１の実施例］
一実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法およびＨＧＦの使用方法の第１の実施例を以下に説明する。この実施例は、ＨＧＦの濃度を変化させて培養したものである。
一実施形態に係る培地、間葉系幹細胞の培養方法およびＨＧＦの使用方法の第１の実施例を以下に説明する。この実施例は、ＨＧＦの濃度を変化させて培養したものである。
本実施例においては、まず、対数増殖中の間葉系幹細胞をトリプシンで回収し、細胞数１０６個／ｍｌとなるように１０％濃度のＦＢＳ入り培地で懸濁した。次いで、その細胞を３０００個／ｃｍ２となるように、１２ウェルプレートに播いた。そして、上記のようにＤＭＥＭに１０％のＦＢＳ、抗生物質、５０μｇ／ｍｌのビタミンＣおよびそれぞれ０，１０，２０，４０，６０，１００ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを混合した培地２ｍｌを加えた。
このように調製された間葉系幹細胞をＣＯ ２ インキュベータ内に投入し、温度３７℃、湿度１００％、ＣＯ２濃度５％の培養条件下で培養し、培養４日目に、トリプシンで回収した間葉系幹細胞の細胞数を血球計算盤によって計測した。その結果を図３に示す。
図３は、図２に示した第２の実施例の結果を併せて示している。
図３によれば、間葉系幹細胞の培養において、ＨＧＦに加えてビタミンＣを併用することで、ビタミンＣを併用しない場合と比較して、間葉系幹細胞の増殖促進効果が向上していることがわかる。
図３は、図２に示した第２の実施例の結果を併せて示している。
図３によれば、間葉系幹細胞の培養において、ＨＧＦに加えてビタミンＣを併用することで、ビタミンＣを併用しない場合と比較して、間葉系幹細胞の増殖促進効果が向上していることがわかる。
また、ビタミンＣを添加した場合には、ＨＧＦが４０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度において間葉系幹細胞の増殖促進効果が一定値となっている。したがって、ビタミンＣを添加した場合には、ＨＧＦの濃度を４０ｎｇ／ｍｌ以上とすることが好ましく、４０ｎｇ／ｍｌとすることがさらに好ましい。
なお、ビタミンＣの濃度については、５０μｇ／ｍｌとした場合について実施したが、これに代えて、２５〜４０００μｇ／ｍｌの範囲において任意の濃度値を選択することにしてもよい。
また、上記各実施形態においては、対数増殖中の間葉系幹細胞について、ＨＧＦによる増殖促進効果を示したが、これに代えて、患者の体内から採取した骨髄液に対してＨＧＦおよび／またはビタミンＣを添加した培地を用いて、骨髄液内の間葉系幹細胞を培養することにしてもよい。この場合には、ＨＧＦによって骨髄液内に含有される造血幹細胞の増殖が促進され、これにより間葉系幹細胞の増殖が促進されることになる。このようにすることで、患者から採取した骨髄液の初代培養においても効率的に間葉系幹細胞を増殖させることができる。
また、上記各実施形態においては、対数増殖中の間葉系幹細胞について、ＨＧＦによる増殖促進効果を示したが、これに代えて、患者の体内から採取した骨髄液に対してＨＧＦおよび／またはビタミンＣを添加した培地を用いて、骨髄液内の間葉系幹細胞を培養することにしてもよい。この場合には、ＨＧＦによって骨髄液内に含有される造血幹細胞の増殖が促進され、これにより間葉系幹細胞の増殖が促進されることになる。このようにすることで、患者から採取した骨髄液の初代培養においても効率的に間葉系幹細胞を増殖させることができる。
Claims (2)
- 間葉系幹細胞の増殖能刺激物質として肝細胞増殖因子及びビタミンＣを使用する肝細胞増殖因子の使用方法。
- 肝細胞増殖因子及びビタミンＣを間葉系幹細胞の増殖能刺激物質として添加した培地において間葉系幹細胞を培養する間葉系幹細胞の培養方法。
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|---|---|---|---|---|
| WO2002024875A1 (fr) * | 2000-09-22 | 2002-03-28 | Hokkaido Technology Licensing Office Co.,Ltd. | Solution de culture de cellules normales mures de foie humain |
| WO2002086108A1 (en) * | 2001-04-19 | 2002-10-31 | Hyun Soo Kim | Method for differentiating mesenchymal stem cells into neural cells |
| JP2003235548A (ja) * | 2001-12-13 | 2003-08-26 | Japan Science & Technology Corp | ヒト細胞の培養用培地および培養方法 |
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