JP2004507444A - ムチン合成インヒビター - Google Patents
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Abstract
Description
(関連出願の引用)
本出願は、2000年1月31日に出願された米国仮出願第60/179,127号、2000年3月30日に出願した米国仮出願第60/193,111号、2000年9月7日に出願した米国仮出願第60/230,783号、2000年10月23日に出願した米国仮出願第60/ 号および2000年11月20日に出願した米国仮出願第60/ 号の利益を主張する。これらの出願は全て、その全体が本明細書中に参考として援用される。上記に引用した出願の全ては、「ムチン合成インヒビター」と題され、そして発明者は、Yuhong Zhou、Roy C.Levitt、Nicholas C.Nicolaides、Steve Jones、およびMike Mclaneである。
【0002】
本発明はまた、1996年8月23日に出願され、2000年3月14日に米国特許第6,037,149号として発行された米国特許出願第08/702,110号の主題に関し、そして1999年6月9日に出願された米国特許出願第09/325,571号および1999年6月1日に発行された米国特許第5,908,839号に関する。これらは全て、その全体が本明細書中に参考として援用される。さらに、本出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される、1997年12月1日に出願した米国特許出願第08/980,872号に関する。
【0003】
(発明の分野)
本発明は、ムチン合成を調節する方法、および疾患(例えば、喘息、慢性気管支炎、炎症性肺疾患、嚢胞性線維症および急性または慢性の呼吸器感染疾患ならびに慢性閉塞性肺疾患(COPD))に関連するムチン過剰産生を制御する際の化合物の治療適用に関する。
【0004】
(発明の背景)
気道上皮は、粘膜線毛(mucociliary)系および機械的障壁を通して、気道防御機構において肝要な役割を果たすことが公知である。近年の研究は、気道上皮細胞(AEC)が活性化されて、複数の気道障害の病因において重要な生物学的メディエーターを産生および放出し得ることを示す(PolitoおよびProud、1998;Takizawa、1998)。上皮が、慢性気道障害(例えば、喘息、慢性気管支炎、気腫および嚢胞性線維症)において基本的に障害を受けているという証拠が示された(Holgateら、1999;Jeffery PK、1991;Salvato、1968;GlynnおよびMichaels、1960)。これらの気道障害の特徴の1つは、AECによる粘液の過剰産生である。粘液の主要な高分子成分は、ムチンとして公知の大きな糖タンパク質である。近年、少なくとも7つのヒトムチンの分子構造が決定された。公知のムチン転写産物は、不均質であり、これらの遺伝子間に配列相同性はない(VoynowおよびRose、1994)が、これらはその全体的な繰り返し構造が類似している。
【0005】
有害な刺激は、AECを活性化することが公知である。これらの刺激は、慢性閉塞性肺疾患の形態に関連した薬物または環境汚染物質、タバコの煙および感染性因子に対するアレルギー性疾患において抗原によって変化し得る。AECの活性化は、イオン輸送の変化、毛様体の拍動の変化、ならびにムチンの産生および分泌の増加をもたらし、粘液の増加をもたらす。AEC活性化に応答して産生されるメディエーターとしては、炎症細胞の流入を促進するケモカインが挙げられる(Takizawa、1998)。これらの炎症細胞は次いで、AECを損傷し得るメディエーターを産生し得る。AECの損傷は、前炎症(pro−inflammatory)産物(肺の破壊および機能喪失をもたらし得る、気道壁再造形を駆動する、プロテアーゼおよび増殖因子を含む)の拡大しかつ連続した供給源をもたらす、細胞増殖を刺激する(杯細胞および粘膜下腺細胞過形成)(Holgateら、1999)。
【0006】
粘液の過剰産生およびその生理化学的特徴の変化は、肺の病因に多くの方法で寄与し得る。ムチンの過剰産生による生理学的粘膜線毛クリアランスの破壊は、粘液のつまり、空気の捕捉、およびしばしば感染を併発する無気肺をもたらし得る。
【0007】
喘息は、有病率および重篤度が増加しているようである慢性の閉塞性肺障害である(GergenおよびWeiss、1992)。人口の30〜40%がアトピー性アレルギーに罹患しており、そして人口のうち小児の15%および成人の5%が喘息に罹患していると見積もられている(GergenおよびWeiss、1992)。
【0008】
喘息では、抗原による免疫系の活性化が、アレルギー性炎症をもたらす。この型の免疫活性化が生じた場合、これは、肺の炎症、気管支反応性亢進(bronchial hyperresponsiveness)、杯細胞および粘膜下腺過形成、ならびにムチンの過剰産生および過剰分泌を併発する(Basleら、1989)(Paillasse、1989)(Bosqueら、1990)。杯細胞および粘膜下腺細胞過形成に関連した粘液の過剰産生およびつまりは、喘息の病因の重要な部分であり、そして軽度の喘息および喘息発作重積状態で死亡した個体の両方の気道の検査について記載されている(Earle、1953)(CardellおよびPearson、1959)(Dunnill、1960)(Dunnillら、1969)(Aikawaら、1992)(Cutzら、1978)。特定の炎症細胞は、この反応において重要である。このような炎症細胞としては、T細胞、抗原提示細胞、IgEを産生するB細胞、IgEを結合する好塩基球、および好酸球が挙げられる。これらの炎症細胞は、アレルギー性炎症の部位に蓄積し、そしてこれらが放出する毒性産物は、AECおよびこれらの障害に関連する他の組織の破壊に寄与する。
【0009】
上記に述べた関連の特許出願では、出願人は、インターロイキン−9(IL9)、そのレセプターおよびIL9によってもたらされる活性が、アトピー性アレルギー、喘息および関連の障害において治療介入の適切な標的であることを実証した。アレルゲンによって肥満細胞から放出されるメディエーターは、アレルギーにおける重要な開始事象であると考えられてきた。IL9は元々、肥満細胞増殖因子として同定され、そしてIL9が肥満細胞プロテアーゼ(MCP−1、MCP−2、MCP−4を含む)(Eklundら、1993)およびグランザイムB(Louahedら、1995)の発現をアップレギュレートすることが実証された。従って、IL9は、肥満細胞の増殖およびまたは分化において役割を果たすようである。さらに、IL9は、高親和性IgEレセプターのα鎖の発現をアップレギュレートする(Dugasら、1993)。さらに、インビトロおよびインビボの両方での研究は、刺激されたB細胞からのIgEの放出をIL9が増強することを示した(Petit−Frereら、1993)。
【0010】
近年、IL9は、ムチン合成を刺激することが示された。そしてIL9は、アレルギー性気道疾患における肺の流体のムチン刺激活性のうちの50〜60%程度を占め得る(Longpreら、1999)。バックグラウンド系統由来のマウスと比較したムチン合成および粘液過剰産生の正味のアップレギュレーションは、IL9トランスジェニックマウスにおいて生じる。IL9は、MUC2およびMUC5ACの遺伝子およびタンパク質をインビトロおよびインビボで特異的にアップレギュレートする(Louahedら、2000)。さらに、IL9中和抗体は、喘息の動物モデルにおける抗原チャレンジに応答したムチンのアップレギュレーションを完全に阻害する(McLaneら、2000)。
【0011】
現行の喘息処置は、多数の欠点がある。主な治療剤であるβ−レセプターアゴニストは、症状を減少させ、それによって肺の機能を一時的に改善させるが、基礎をなす炎症には影響を与えず、かつムチン産生を抑制もしない。さらに、β−レセプターアゴニストの不断の使用は、脱感作を生じ、これにより、その効力および安全性が低下する(Molinoffら、1995)。基礎をなす炎症を減少させ得、それによってムチン産生を減少させ得る薬剤(例えば、抗炎症ステロイド)は、免疫抑制から骨損失までの範囲にわたる、それ自体の欠点のリストを有する(Molinoffら、1995)。
【0012】
慢性気管支炎は、別の形態の慢性閉塞性肺障害である。成人のうちのほぼ5%がこの肺障害に罹患している。慢性気管支炎は、痰の慢性過剰産生として定義される。粘液過剰産生は一般に、誘導気道の炎症に関連している。好中球およびマクロファージを含む、炎症細胞のメディエーターは、この障害におけるムチン遺伝子発現増加に関連し得る(Voynowら、1999;Borchersら、1999)。粘液産生増加は、気道閉塞に関連しており、気道閉塞は、この肺障害の主な特徴のうちの一つである。治療は主に症候性であり、そして感染を制御することおよび肺機能のさらなる欠損を防ぐことに集中する。気管支炎の症状を処置するためにしばしば用いられる、鬱血除去薬、去痰薬およびこれらの薬剤の組み合わせは、ムチン産生を変化させるとは考えられない。粘液溶解は、気道分泌物の粘度および/または弾性を減少させることによって粘膜線毛クリアランスを促進し得、そして症状の軽減を提供し得るが、ムチンの合成も粘液過剰産生をも阻害しない(Takahashiら、1998)。
【0013】
嚢胞性線維症(CF)は、肺に変化をもたらし、そして濃い分泌物に関連するなお別の疾患であり、気道閉塞および吸入された病原性微生物によるその後の集落形成(colonization)および感染をもたらす(Engら、1996)。DNAレベルは、CF肺において顕著に増加し、そして痰の粘度を上昇させ得る。エアゾール化された組換えDNaseはこれらの患者において有益なものであるが、病原性の粘液過剰産生について有効な処置は存在しない。従って、当該分野には、CFにおける気道上皮細胞によるムチン過剰産生を阻害し得る薬剤の同定についての特異的な、まだ対処されていない必要性がある。ムチン分泌物によって引き起こされる気道閉塞に加えて、CF患者はまた、消化管への消化酵素の送達を妨げる、膵管での粘液つまりを罹患する。この結果は、吸収不良症候群、脂肪便および下痢である。
【0014】
粘液過剰産生は多くの慢性閉塞性肺障害の特徴のうちの1つであるが、当該分野には、これらの肺障害に関連したムチンの合成または過剰産生をブロックする方法はない。従って、当該分野には、ムチンの過剰産生を阻害し、そしてこれらの患者の分泌物を薄めて粘膜線毛クリアランスを促進し、そして肺の機能を保つという、特定の必要性が存在する。
【0015】
(発明の要旨)
本発明は、ムチン糖タンパク質の合成および過剰産生を阻害する薬剤の発見、ならびに慢性閉塞性肺障害および他の疾患における粘液の病理的な過剰産生を処置するためのこれらの分子を使用する方法に関する。
【0016】
1つの局面では、本発明は、ムチンの産生によって特徴付けられる呼吸器疾患を有する被験体を処置する方法を提供し、この方法は、肺または胃腸管におけるムチンの合成またはレベルを減少させる少なくとも1つの化合物を含む組成物の有効量をこの被験体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態では、ムチン合成は、塩素イオンチャネル依存性であり得る。いくつかの実施形態では、この化合物は、ICACC塩素イオンチャネルを発現する細胞におけるムチン合成を減少させる。いくつかの実施形態では、この化合物は、アントラニル酸のアナログおよび誘導体、2−アミノ−ニコチン酸のアナログおよび誘導体、2−アミノ−フェニル酢酸のアナログおよび誘導体、ベンドロフルメチアジド、それらの塩およびそれらのプロドラッグからなる群より選択される。いくつかの好ましい実施形態では、この化合物は、タルニフルマート、フルフェナム酸、ニフルム酸、メフェナム酸、それらの塩、それらの誘導体およびそれらのプロドラッグからなる群より選択される。いくつかの好ましい実施形態では、本発明の組成物は、タルニフルマート、タルニフルマート誘導体、それらの塩またはそれらのプロドラッグを含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、肺または胃腸管におけるムチンの合成またはレベルを減少させる少なくとも1つの化合物を含み得、ここで、この化合物は、キノリンまたはキノリン誘導体である。いくつかの実施形態では、この化合物は、アミン基を用いて、好ましくはキノリンの2位または3位で改変されたキノリンであり得る。好ましい実施形態では、この化合物は、環外窒素が1以上の部分を用いて改変された3−アミノ−キノリンであり得る。いくつかの実施形態では、この環外アミン基は、芳香族部分を用いて改変され得る。この芳香族部分は、改変されていても改変されていなくてもよい。好ましい実施形態では、この芳香族基は、1以上の置換基を用いて改変され得るベンジル基である。適切な置換基としては、ハロゲンが挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、この化合物は、N−(フルオロベンジル)−3−アミノ−キノリン(図19)であり、好ましくは、このフッ素はメタ位に存在する。
【0018】
本発明の別の局面では、ムチン合成を減少させる化合物はまた、酵素シクロオキシゲナーゼのインヒビター(例えば、タルニフルマート)である。より好ましい実施形態では、この化合物は、酵素シクロオキシゲナーゼ−2の特異的インヒビターである。
【0019】
別の実施形態では、本発明は、吸入によって本発明の組成物を投与することによって、ムチンの産生によって特徴付けられる呼吸器疾患を有する被験体を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この組成物は、液体の形態または粉末の形態である。いくつかの実施形態では、この組成物は、エアゾール化されている。他の実施形態では、この組成物はさらに、少なくとも1つの去痰薬、抗ヒスタミン薬、粘液溶解剤、抗生物質または鬱血除去剤を含む。いくつかの実施形態では、この去痰薬は、グアイフェネシンである。本発明の組成物は、少なくとも1つの安定剤、吸収増強剤または矯味矯臭剤を含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、この安定剤はシクロデキストランであり、そして/またはこの吸収増強剤はキトサンである。
【0020】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明の組成物および方法は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、炎症性肺疾患、嚢胞性線維症および急性または慢性の感染性疾患からなる群より選択される呼吸器疾患を処置するために用いられ得る。これらの疾患のうちのいずれか1つの処置は、1以上の本発明の組成物を吸入によって投与することによって行われ得る。いくつかの実施形態では、この組成物は、吸入によって肺へと投与される。好ましい実施形態では、本発明は、気腫、慢性気管支炎および喘息からなる群より選択されるCOPDを処置するための方法および材料を提供する。
【0021】
別の好ましい実施形態では、本発明の組成物および方法は、嚢胞性線維症の胃腸合併症(例えば、吸収不良症候群、脂肪便および下痢)を処置するために用いられ得る。この疾患の処置は、本発明の1以上の組成物を経口投与することによって行われ得る。
【0022】
別の実施形態では、本発明は、吸入送達のために処方された治療組成物を提供し、この組成物は、タルニフルマート、フルフェナム酸、ニフルム酸、メフェナム酸、それらの塩、それらの誘導体およびそれらのプロドラッグからなる群より選択される少なくとも1つの化合物を、ムチンの産生またはレベルを減少させるのに有効な量で含む。いくつかの好ましい実施形態では、この組成物は、タルニフルマート、タルニフルマート誘導体、それらの塩またはそれらのプロドラッグを含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、液体の形態または粉末の形態である。いくつかの実施形態では、この組成物は、少なくとも1つの去痰薬、粘液溶解剤、抗生物質、抗ヒスタミン薬または鬱血除去剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、この去痰薬は、グアイフェネシンである。
【0023】
上記の薬剤に加えて、吸入のために処方された本発明の薬学的組成物は、少なくとも1つの安定剤、吸収増強剤または矯味矯臭剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、この安定剤はシクロデキストランであり、そして/またはこの吸収増強剤はキトサンである。
【0024】
本発明はまた、上記のような治療組成物を含む吸入デバイスを提供する。
【0025】
(発明の詳細な説明)
本発明は部分的に、肺の非線毛性上皮細胞の活性化からもたらされる粘液過剰産生が、MUC2およびMUC5ACを含むムチン遺伝子の誘導によって引き起こされるという知見から誘導される。従って、本発明の1つの局面は、上皮細胞活性化の阻害である。AEC活性化のこの阻害は、ケモカイン産生、気管支応答性およびムチン遺伝子発現をダウンレギュレートする。それゆえ、ムチンの合成またはレベルを減少させる分子は、本発明の一部である。
【0026】
(ムチンの合成またはレベルを減少させる薬剤)
本明細書中に記載する場合、本発明の処方物および組成物は、ムチンの合成もしくはレベルを減少させるか、または何らかの方法でムチンの過剰産生を減少させる薬剤を含む。本明細書中で使用する場合、「減少させる」は、ムチンのレベル、活性化、機能、安定性または合成のダウンレギュレーションと定義される。好ましい薬剤は、ムチンの塩素イオンチャネル依存性のレベル、活性化、機能、安定性または合成を減少させる。本明細書中で使用される場合、「塩素イオンチャネル」とは、ICACC塩素イオンチャネルおよびWO 99/44620(これは、その全体が本明細書中に参考として援用される)において言及された関連するチャネルをいうがこれらに限定されない。これらの定義に入る薬剤は、実施例に記載のアッセイにおけるスクリーニングによってそれらの活性が同定され得るかまたは確認され得る。例えば、実施例7および8に記載されるインビトロおよびインビボでのアッセイを用いて、薬剤の活性をスクリーニング、同定または確認し得る。
【0027】
ムチンの合成またはレベルを減少させる分子としては、アントラニル酸(2−アミノ安息香酸)のアナログおよび誘導体が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、この分子は、N−誘導体化アントラニル酸であり得る。いくつかの実施形態では、アントラニル酸のアミノ基は、1以上の基で改変され得る。いくつかの実施形態では、この基は、芳香族基であり得る。好ましい実施形態では、この基は、トリフルオロメチル−フェニル基(好ましくは3−トリフルオロメチル−フェニル基)であり得、そしてムチンの合成またはレベルを減少させる分子はフルフェナム酸である。別の好ましい実施形態では、このアミノ基は、2,3−ジメチル−フェニル基で誘導体化され得、そしてムチンの合成またはレベルを減少させる分子はメフェナム酸である。当業者は、アントラニル酸の他のフェニル誘導体が本発明において用いられ得ることを認識する。他の好ましい実施形態では、安息香酸の環は、1以上の置換基を含み得る。好ましい実施形態では、安息香酸の環およびアミノ基の両方が改変され得る。他の好ましい実施形態は、安息香酸の環上の置換基および芳香族基がアミノ基に結合した分子を含む。
【0028】
いくつかの実施形態では、ムチンの合成を減少させる分子は、2−アミノ−ニコチン酸のアナログおよび誘導体を含む。いくつかの実施形態では、環外アミノ基は、1以上の基を含むように改変され得る。いくつかの好ましい実施形態では、この環外アミン基は、全ての芳香族基で改変され得る。適切な芳香族基としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:フェニル基、改変されたフェニル基、ベンジル基、改変されたベンジル基など。好ましい実施形態では、この芳香族基は3−トリフルオロメチル−フェニル基であり得、そして2−アミノ−ニコチン酸の誘導体はニフルム酸である。
【0029】
いくつかの実施形態では、ムチンの合成を減少させる分子は、2−アミノ−フェニル酢酸のアナログまたは誘導体であり得る。いくつかの実施形態では、このアミノ基は、1以上の基を含むように改変され得る。いくつかの実施形態では、このアミノ基は、芳香族基で改変され得る。適切な芳香族基としては以下が挙げられるがこれらに限定されない:フェニル基、改変されたフェニル基、ベンジル基、改変されたベンジル基など。好ましい実施形態では、2−アミノ−フェニル酢酸は2,6−ジクロロフェニル基でN−改変され、そしてムチンの合成またはレベルを減少させる分子はタルニフルマートである。
【0030】
いくつかの実施形態では、ムチンの合成またはレベルを減少させる分子はベンドロフルメチアジドであり得る。
【0031】
本発明はまた、上記の、ムチンの合成またはレベルを減少させる分子の1以上のプロドラッグの使用を意図する。本明細書中で定義するように、プロドラッグは、上記の形態以外の形態で投与され、そして被験体の身体中で、記載された形態へと変換される分子である。好ましいプロドラッグとしては、フェナメートのプロドラッグが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの好ましいプロドラッグは、ムチンの合成またはレベルを減少させる酸の形態の分子のエステルである。好ましいエステルとしては、NFAのエステル(例えば、β−モルホリノエチルエステル、モルニフルメート(morniflumate)およびフタリジルエステル、タルニフルマート)が挙げられるがこれらに限定されない。
【0032】
(ムチンの産生を調節する薬剤についての用途)
実施例に提供するように、ムチンの発現を調節、減少またはダウンレギュレートさせる薬剤を用いて、ムチン産生に関連した、生物学的プロセスおよび病理プロセスを改変し得る。
【0033】
出願人は、IL9がムチン遺伝子産物の発現を選択的に誘導することを観察した。従って、IL9(これは、多数の抗原誘発性応答に対して重要である)についての多面的役割は部分的に、AECにおけるムチンのアップレギュレーションに依存する。IL9の機能が中和抗体処置によってダウンレギュレートされる場合、動物は、肺における抗原誘発性応答から完全に防御され得る。これらの応答としては、以下が挙げられる:気管支反応性亢進、気管支洗浄液における好酸球増加および細胞数上昇、血清IgEの上昇、炎症に関連した、肺における組織学的変化、ならびに粘液の過剰産生に関連した杯細胞および粘膜下腺細胞過形成。IL9のダウンレギュレーションおよび喘息様応答は、ムチンのダウンレギュレートされた発現に関連する(図10)。従って、喘息の病因の基礎となり、そしてムチン産生をダウンレギュレーションすることによって、この障害に関連したアレルギー性炎症を特徴付ける、このような応答の処置は、本発明の範囲内にある。
【0034】
IL9トランスジェニックマウス気道の組織学的分析は、非線毛化上皮細胞におけるムチン過剰産生を示した(Temannら、1998;Louahedら、2000)。IL9トランスジェニックマウスの肺におけるムチンの誘導は、IL9がこれらの細胞による粘液産生を促進することを示唆する(図8を参照のこと)。MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5BおよびMUC5ACのmRNAを発現する、活性化されたCaco2細胞が産生され、そしてムチン産生のインヒビターについての試験のために用いられた。これらの細胞は、過ヨウ素酸シッフ染色(PAS)を用いてムチンについて染色され得る。図1Aに示すように、処理されていない活性化されたCaco2細胞は、PAS陽性ムチン糖結合体について強く染まる。コントロールの細胞および活性化された細胞は、ニフルム酸(NFA)または4,4’−ジイソチオシアノスチルベン−2,2’−ジスルホン酸(DIDS)の存在下で培養された。インヒビターで処理した活性化された細胞のPAS染色は、未処理細胞と比較して有意に少ない陽性染色糖結合体を示した(図1Bと比較して図1D)。
【0035】
ムチンダウンレギュレーションについての治療の可能性が、喘息において同定された一方で、出願人はまた、嚢胞性線維症におけるムチンのダウンレギュレーションについての治療の可能性を認めた。嚢胞性線維症を有する患者は、濃い分泌物によって特徴付けられる肺疾患によって障害を受けている。これは、気道閉塞および吸入された病原性微生物によるその後の集落形成および感染を引き起こす(Engら、1996)。それゆえ、出願人は、肺におけるムチン産生をダウンレギュレートすることによって嚢胞性線維症を処置するための方法を提供する。
【0036】
嚢胞性線維症におけるムチンの過剰産生はまた、消化酵素を消化管へと送達する膵管に存在して、吸収不良症候群、脂肪便および下痢をもたらす。それゆえ、出願人はまた、膵臓におけるムチン産生をダウンレギュレートすることによって嚢胞性線維症を処置するための方法を提供する。
【0037】
出願人はまた、慢性気管支炎および気腫におけるムチンダウンレギュレーションについての治療の可能性を同定した。慢性気管支炎および気腫を有する患者は、濃い分泌物によって特徴付けられる肺疾患によって妨げられている。これは、気道閉塞および吸入された病原性微生物によるその後の集落形成および感染を引き起こす(Engら、1996)。それゆえ、出願人は、肺におけるムチン産生をダウンレギュレートすることによって慢性気管支炎および気腫を処置するための方法を提供する。
【0038】
本明細書中で使用する場合、哺乳動物がムチン産生によって媒介される病理プロセスまたは生物学的プロセスの調節を必要とする限り、被験体は、任意の哺乳動物であり得る。用語「哺乳動物」は、哺乳綱に属する個体を意味する。本発明はヒト被験体の処置において特に有用である。
【0039】
病理プロセスとは、有害な効果を生ずる生物学的プロセスのカテゴリーをいう。例えば、本発明のムチンの過剰産生は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、炎症性肺疾患、嚢胞性線維症ならびに急性または慢性の感染性疾患を含む、呼吸器疾患に関連し得る。COPDとしては、気管支炎、喘息および気腫が挙げられるがこれらに限定されない。ムチンの過剰産生はまた、嚢胞性線維症において存在する胃腸管疾患(例えば、吸収不良症候群、脂肪便および下痢)に関連し得る。
【0040】
本明細書中で使用される場合、薬剤が、病理プロセスの程度または重篤度を減少させる場合、その薬剤は、病理プロセスを調節すると言われる。例えば、気道閉塞は、ムチンの合成、レベルおよび/または過剰産生を何らかの方法で減少させるかまたは調節する薬剤の投与によって、予防され得るか、または疾患の進行が調節され得る。
【0041】
(治療組成物)
本発明の薬剤は、単独で提供され得るか、または特定の病理プロセスを調節する他の薬剤と組み合わせて提供され得る。例えば、本発明の薬剤は、抗喘息剤と組み合わせて投与され得る。別の実施形態では、薬剤は、去痰薬、粘液溶解剤、抗生物質、抗ヒスタミン薬または鬱血除去薬と組み合わせて投与され得る。なお別の実施形態では、薬剤は、界面活性剤、安定剤、吸収増強剤、βアドレナリン作用性レセプターもしくはプリンレセプターのアゴニストまたは矯味矯臭剤または組成物の嗜好性を増加させる他の薬剤とともに投与され得る。一例として、本発明の組成物は、活性薬剤に加えて、去痰薬(例えば、グアイフェネシン)、安定剤(例えば、シクロデキストラン)および/または吸収増強剤(例えば、キトサン)を含み得る。任意のこのような薬剤は、本発明の組成物において使用され得る。
【0042】
本明細書中で使用される場合、2以上の薬剤は、これらの薬剤が同時に投与されるかまたはこのような薬剤が同時に作用するような様式で独立して投与される場合、組み合わせて投与されるといわれる。
【0043】
本発明の薬剤は、非経口経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、経皮経路、局所経路または頬内経路を通して投与され得る。あるいは、または同時に、投与は、経口経路もしくは鼻腔内経路によって行われ得るか、または肺へと直接的に行われ得る。好ましい実施形態では、本発明の化合物は、吸入によって投与され得る。吸入治療のためには、この化合物は、液体エアゾール、計量用量吸入器による投与に有用な溶液、または乾燥粉末吸入器に適切な形態であり得る。投与される投薬量(dosage)は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、同時に行われる処置の種類(存在する場合)、処置の頻度、および所望される効果の性質に依存する。
【0044】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明の薬剤は、エアゾールとして処方され得る。薬学的エアゾールの処方は、当業者には慣用である。例えば、Sciarra,J.、Remington:The Science and Practice of Pharmacy 第19版、第95章、Mack Publishing Company、Easton、PAを参照のこと。この薬剤は、乾燥粉末、エマルジョンまたは半固体調製物の溶液のエアゾール、分散物または懸濁物のエアゾールとして処方され得る。このエアゾールは、当業者に公知の任意のプロペラント系を用いて送達され得る。このエアゾールは、例えば、鼻腔内吸入により、上気道に、または下気道に、あるいはその両方に適用され得る。
【0045】
本発明の処置方法において用いられる化合物は、処置されるべき条件、部位特異的処置の必要性、投与されるべき薬物の量および同様の考慮すべき事柄のような考慮すべき事柄に依存して、全身的または局所的に投与され得る。
【0046】
任意の一般的な局所的処方物(例えば、溶液、懸濁物、ゲル、軟膏(ointment)もしくは軟膏(salve)など)が用いられ得る。このような局所処方物の調製は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciencesによって例示されるように、薬学的処方物の分野において充分に記載されている。局所適用のためには、これらの化合物はまた、粉末またはスプレーとして、特にエアゾール形態で投与され得る。その活性成分は、全身投与に適合させた薬学的組成物中で投与され得る。公知のとおり、薬物が全身投与される場合には、薬物は、経口投与のための散剤、丸剤、錠剤などとして、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤として、調製され得る。静脈内、腹腔内または病巣内(intra−lesional)投与のためには、この化合物は、注射により投与され得る溶液または懸濁物として調製される。特定の場合には、これらの化合物を坐剤形態で、または皮膚下貯蔵(deposit under the skin)のための長期放出処方物または筋肉内注射として処方することが有用であり得る。
【0047】
これらに含まれる組成物または薬剤の有効量は、ムチンの活性化、機能、安定性または合成を減少、低下またはダウンレギュレートする量である。好ましい組成物または薬剤は、ICACC塩素イオンチャネル依存性のムチンの活性化、機能、安定性または合成を含む、塩素イオンチャネル依存性のムチンの活性化、機能、安定性または合成を減少、低下、もしくはダウンレギュレートする。所定の有効量は、状態によって変化し、そして特定の場合では、処置される状態の重篤度および患者の処置への感受性により変化し得る。従って、所定の有効量は、慣用的な実験によりその時点および場所について最良に決定される。しかし、本発明による慢性閉塞性肺障害の処置において、0.001重量パーセントと5重量パーセントとの間、好ましくは約0.01〜1%を含む処方物が、通常、治療有効量を構成することが予想される。全身投与される場合、大部分の場合、1日あたり体重1kgあたり0.01mgと100mgとの間の量、しかし好ましくは約0.1〜10mg/kg/日が、治療結果を達成する。
【0048】
吸入により投与される場合、大部分の場合、1日あたり体重1kgあたり0.01mgと100mgとの間の量、しかし好ましくは約0.10〜10mg/kg/日が、治療結果を達成する。いくつかの例では、計量用量エアゾール単位は、約0.8mgの本発明の化合物(例えば、タルニフルマート)を含む。この処方では、成体のための維持用量は、約2回の吸入(約1.6mg)を1日2回(約3.2mg)である。
【0049】
本発明はまた、本発明の化合物を薬学的に受容可能なキャリアとともに含む薬学的組成物を含む。薬学的に受容可能なキャリアは、無菌の溶液(例えば、水および油)であり得る。このような油としては、石油、動物、植物または合成の起源の油(例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など)が挙げられる。水は、薬学的組成物が静脈内にまたは吸入によって投与される場合、好ましいキャリアである。生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水はまた、キャリアとして特にエアゾールによる吸入のために用いられ得る。乳酸加生理食塩水溶液ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液もまた、液体キャリアとして、特に注射可能溶液のために用いられ得る。適切な薬学的キャリアは、Remington’s Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、1995に記載される。
【0050】
薬理学的に活性な薬剤に加えて、本発明の組成物は、作用部位への送達のために薬学的に用いられ得る調製物への活性化合物の加工を促進する賦形剤および補助物質を含む、適切な薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。非経口投与のために適切な処方物としては、水溶性形態(例えば、水溶性塩)の活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、適切な油状注射懸濁物としての活性化合物の懸濁物が投与され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油(例えば、ゴマ油)または合成脂肪酸エステル(例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド)が挙げられる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増加させる物質(例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび/またはデキストランが挙げられる)を含み得る。必要に応じて、懸濁物はまた、上記の通りの安定剤を含み得る。リポソームもまた、細胞への送達のために薬剤をカプセル化するために用いられ得る。
【0051】
本発明による、全身投与のための薬学的処方物は、腸内、非経口または局所での投与のために処方され得る。実際、3つ全ての型の処方物は、同時に用いて、活性成分の全身投与を達成し得る。
【0052】
経口投与のために適切な処方物としては、硬質または軟質のカプセル剤、丸剤、錠剤(コーティングされた錠剤を含む)、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤または吸入剤およびそれらの制御放出形態が挙げられる。経口吸入または鼻腔内吸入のために適切な処方物としては、当該分野で周知の賦形剤を含むかまたは含まない、水溶液が挙げられる。
【0053】
本発明の治療的または薬学的な組成物または処方物は、この組成物または処方物が、気管支分泌物が濃くなること、刺激された気道膜が粘液の流れの増加を通して滑らかになることならびに/または粘着性の濃縮した粘液の産生の減少およびその除去を促進することによって、下気道排液を促進する能力について扱う説明書またはラベルを伴って、容器、バイアル、吸入デバイスなどの中に充填され得る。このラベルまたは説明書はまた、指標および使用法(例えば、本明細書中に記載されるような種々の状態の症状の軽減の維持)を扱い得る。このような状態としては、中程度から重度の喘息、慢性気管支炎、嚢胞性線維症、上気道および下気道の感染および気道または身体の他の場所における粘着性の粘液の存続を伴う他の状態が挙げられるがこれらに限定されない。
【0054】
本発明のデバイスは、1以上の治療組成物を上気道および/または下気道へと導入することに適応させた任意のデバイスであり得る。いくつかの好ましい実施形態では、本発明のデバイスは、計量用量吸入器であり得る。このデバイスは、本発明の治療組成物を、細かく分散された霧状の液体、発泡物または粉末の形態で送達するために適合され得る。このデバイスは、ポンプ、液化ガス、圧縮ガスなどを含むがこれらに限定されない、当業者に公知の任意のプロペラント系を用い得る。本発明のデバイスは代表的に、治療組成物の流れが移動する1以上のバルブおよびこの流れを制御するためのアクチュエータを備える容器を含む。本発明における使用のために適切なデバイスは、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy、第19版、第95章、1676−1692頁、Mack Publishing Co.、Easton PA 1995において見出され得る。
【0055】
本発明の実施では、当業者の通常の技術範囲内である、分子生物学、薬理学、免疫学および生化学の従来の用語および技術を用い得る。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1985を参照のこと。
【0056】
さらに説明することなしに、当業者は、前述の記載および以下の例示的な実施例を用いて、本発明の化合物を作製および利用し得、そして本願方法を実施し得ると考えられる。それゆえ、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘する。そして、以下の実施例は、残りの部分の開示を制限するとは決して解釈されるべきでない。
【0057】
(実施例)
(実施例1:NFAは、ムチンを過剰産生するように活性化されたCaco2細胞によるムチン産生を阻害する)
MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5BおよびMUC5ACのmRNAを発現する活性化されたCaco2細胞を作製し、そしてこれを用いてムチン産生のインヒビターについて試験した。これらの細胞は、ムチンについて過ヨウ素酸シッフ染色(PAS)を用いて染色され得る。図1に示すように、Caco2コントロール細胞は、いくつかの小さな糖結合体小胞が散在した基本的なPAS染色を提示した(パネルA)とはいえ、Caco2細胞の活性化は、PAS陽性ムチン糖結合体の数および強度を劇的に増加させた(パネルB)。この活性化されたCaco2細胞を、ニフルム酸(NFA)または4,4’−ジイソチオシアノスチルベン−2,2’−ジスルホン酸(DIDS)の存在下で培養した。示した濃度(NFAについては100μm、そしてDIDSについては300μm)、インヒビターで処理された活性化されたCaco2細胞のPAS染色は、未処理の細胞と比較して有意に少ない陽性染色ムチン糖結合体を示した(図1Bと比較して図1D)。さらに、コントロール細胞において見られたわずかな染色もまた阻害された(図1Aと比較して図1C)。活性化されたCaco2細胞によるムチン産生もまた、フルフェナメート(FFA)、トルフェナメート(TFLA)のような他のフェナメートによって阻害され得、そしてメフェナメート(MFA)およびメクロフェナメート(MLFA)によって部分的に阻害され得た(図2)。関連する化合物であるナプロキセン(MMNA)およびスリンダクは無効であった。NFA処理細胞におけるこの減少したムチン産生は、この細胞の生理学的条件の劇的な変化には起因しなかった。なぜなら、これらの細胞の生存率は、さらに高い濃度のNFAによって影響されなかったからである(図3)。総合すると、この結果は、これらの薬物が上皮の活性化を阻害することと一致する。さらに、この結果は、複数の慢性閉塞性肺障害の特徴である粘液の過剰産生に対するNFAおよびそのアナログ(図11に示すフェニルアントラニル酸誘導体)、DIDSおよびSIDSの直接的な効果を明らかに実証する。
【0058】
(実施例2:NFAは、ムチンを過剰産生するように活性化されたCaco2細胞によるエオタキシン産生を阻害する)
エオタキシンを発現および分泌する活性化されたLHL4細胞が産生され、そしてこの細胞を用いて、エオタキシン産生のインヒビターについて試験した。これらの細胞を、当該分野で周知のELISA技術(R&D Systems)によってエオタキシンについてインビトロでアッセイした。図4に示すように、活性化されたLHL4細胞を、ニフルム酸(NFA)の非存在下(コントロール)または漸増濃度のニフルム酸の存在下で培養した。エオタキシン産生の顕著な阻害が、漸増濃度のNFAについて注目された。同様の阻害は、同一の実験においてDIDSおよびSIDSについて見られた。Mad/C3細胞は、NFA、DIDSおよびSIDSによるエオタキシン産生の類似の阻害を示す。まとめると、これらの結果は明らかに、エオタキシン産生に対するNFAの直接的な効果を実証する。
【0059】
(実施例3:NFAによる、喘息のマウスモデルにおけるムチン過剰産生の阻害)
以下の系統(DBA、C57B6およびB6D2F1)の保証されたウイルスフリーの雄性および雌性のマウスを、National Cancer InstituteまたはJackson Laboratories(Bar Harbor ME)から購入した。IL−9トランスジェニックマウス(Tg5)およびそれらの親系統(FVB)を、Ludwig Institute(Brussels、Belgium)から入手した。動物を、高い効率の粒子濾過空気施設で飼育し、そして実験操作の前に3日間〜7日間にわたって食物および水を自由に摂らせた。この動物施設を22℃に維持し、そして明暗周期を自動的に制御した(10時間:14時間の明:暗)。
【0060】
(表現型分類および前処理の効力)
動物は、気管支反応性亢進、気管支肺胞洗浄液の組成、ムチン産生および血清IgEに対する前処理の効果を評価するために、前処理を受けなかったかまたはAspergillus fumigatus抗原の鼻腔内呼吸によって感作されたかのいずれかであった。マウスに、Aspergillusまたは生理食塩水を鼻腔内抗原投与(challenge)し(0日目、7日目、14日目、21日目および22日目)、そして最後の用量の24時間後に表現型分類(phenotype)した。感作したマウスを、0〜21日目にPBSまたは100μgのNFAのいずれかで、気管内点滴注入(IT)によって処置した。肺における粘液産生およびムチン発現の阻害を用いて、NFAの処置効果を評価したか、またはこれを用いて、他の薬物候補の処置効果を評価し得る。気管支収縮応答を決定するために、薬物への曝露の前および曝露の間に呼吸器系の圧力を気管で測定し、そして記録した。以前に記載されたように、マウスに麻酔をし、そして器具を取り付けた(Levittら、1988;LevittおよびMitzner、1989;Kleebergerら、1990;Levitt、1991;LevittおよびEwart、1995;Ewartら、1995)。気道応答性を、以下のうちの1以上について測定する:5−ヒドロキシトリプタミン、アセチルコリン、アトラクリウムまたはサブスタンスPアナログ。気管支収縮抗原投与後のピーク吸息圧における変化の単純かつ反復可能な測定を用いた。これを、気道圧力時間指数(Airway Pressure Time Index;APTI)(Levittら、1988;LevittおよびMitzner、1989)と呼んだ。APTIを、注射時点から、ピーク圧力がベースラインまたはプラトーに戻るまで積算されたピーク吸息圧における変化によって評価した。APTIは、気道抵抗に匹敵した。しかし、APTIは、気管支収縮からの回復に関連するさらなる成分を含む。
【0061】
屠殺の前に、全血を、麻酔した動物の下大静脈の針穿刺によって血清IgE測定のために収集した。サンプルを遠心分離して細胞を分離し、そして血清を収集し、この血清を用いて総IgEレベルを測定した。すぐに測定しないサンプルを、−20℃にて凍結させた。
【0062】
全てのIgE血清サンプルを、ELISA抗体サンドイッチアッセイを用いて測定した。マイクロタイタープレートを、アジ化ナトリウムを含む炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウムのコーティング緩衝液中2.5μg/mlの濃度のラット抗マウスIgE抗体(Southern Biotechnology)で1ウェルあたり50μlでコーティングした。プレートを、プラスチックラップで覆い、そして4℃にて16時間インキュベートした。このプレートを、1回の洗浄につき5分間インキュベートして、リン酸緩衝化生理食塩水中0.05% Tween−20の洗浄緩衝液で3回洗浄した。非特異的結合部位のブロッキングを、リン酸緩衝化生理食塩水中5%ウシ血清アルブミンを1ウェルあたり200μl添加し、プラスチックラップで覆い、そして37℃にて2時間インキュベートすることによって達成した。洗浄緩衝液で3回洗浄した後、2連の50μlの試験サンプルを各ウェルに添加した。試験サンプルを、洗浄緩衝液中の5%ウシ血清アルブミンで1:10、1:50および1:100に希釈した後でアッセイした。試験サンプルに加えて、洗浄緩衝液中の5%ウシ血清アルブミン中の0.8ng/ml〜200ng/mlの濃度のIgE標準(PharMingen)のセットをアッセイして、標準曲線を作成した。サンプルも標準もないブランクを用いて、プレートリーダーを0にした(バックグラウンド)。サンプルおよび標準を加えた後、プレートをプラスチックラップで覆い、そして室温にて2時間インキュベートした。洗浄緩衝液で3回洗浄した後、50μlの二次抗体ラット抗マウスIgE−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を、洗浄緩衝液中の5%ウシ血清アルブミン中250ng/mlの濃度で添加した。このプレートをプラスチックラップで覆い、そして室温にて2時間インキュベートした。洗浄緩衝液で3回洗浄した後、0.1Mクエン酸緩衝液中の基質0.5mg/ml o−フェニレンジアミン100μlを全てのウェルに添加した。5〜10分後、この反応を50μlの12.5%硫酸で停止させ、そして吸光度をMR5000プレートリーダー(Dynatech)で490nmにて測定した。標準曲線を、X軸を抗原濃度(対数目盛)およびY軸を吸光度(一様目盛)にして標準IgE濃度から作成した。サンプル中のIgEの濃度を、標準曲線から外挿した。
【0063】
気管支肺胞洗浄(BAL)および細胞分析を、以前に記載された(Kleebergerら、1990)ように行った。肺の組織学を、肺にインサイチュで固定液を満たし、そしてホルマリンを入れた後、または、抽出し、そして液体窒素中で直ちに凍結した後のいずれかの後に行った。先の器具使用がアーチファクトを導入し得ることから、別々の動物をこれらの研究に用いた。従って、小さな群の動物を、これらの動物を気管支応答性試験以外の他の試験に用いないこと以外は種々の前処置を受けたコホートと正確に同じに並行して処置した。気管支応答性試験の後、肺を取り出し、そして上記の通りに液体窒素に浸漬した。凍結切片化、染色および組織学的検査を、当業者に明らかな様式で実施した。
【0064】
NFAは、上皮細胞活性化をブロックし、そしてインビトロでのムチンおよびエオタキシンの産生をダウンレギュレートする。NFAを治療的に用いて、抗原誘発性ムチン産生、気管支応答性、血清IgEおよびマウスにおいてBALによって評価した場合の気道炎症に対するインビボでの上皮細胞活性化の重要性を評価した。ビヒクル処置をした一致するコントロールと比較した、気道応答性、BAL、粘液産生および血清IgEレベルに対するNFA処置の効果を決定した。図5および図6は、NFAが、気道反応性亢進およびBAL肺好酸球増加をそれぞれ抑制し得るが、血清IgEレベルに対しては何の効果もないことを示す。さらに、NFAはまた、抗原に対する曝露によって引き起こされる肺における粘液の過剰産生を抑制し得る(図7)。
【0065】
(実施例4:トランスジェニックマウスにおけるIL9による上皮活性化は、粘液過剰産生およびムチン遺伝子のアップレギュレーションを生じる。薬物スクリーニングについてのモデル)
5〜6週齢の保証されたウイルスフリーの雄性および雌性のIL9トランスジェニックマウス(IL9TG5−FVB/N)を、本発明者らの研究室で交配させた。5〜6週齢の雄性および雌性のFVB/Nマウスを、Jackson Laboratories(Bar Harbor ME)から購入した。動物を、高い効率の粒子濾過空気施設で飼育し、そして実験操作の前に3日間〜7日間にわたって食物および水を自由に摂らせた。この動物施設を22℃に維持し、そして明暗周期を自動的に制御した(10時間:14時間の明:暗)。
【0066】
(表現型分類および処置の効力)
動物を、未刺激、または気管内(IT)偽(ビヒクル)処置を受けてから24時間後、同一に処置したコントロールで用いたビヒクルと同じビヒクル中での薬物を受けてから24時間後に表現型分類した。マウスを、ITで一日1回、3日間にわたって処置した。NFA(100μg)またはIL−9に対する抗体を、PBS中でITで投与した。処置応答を、組織学的検査(処置肺およびコントロール肺の全体についての10を超える切片のPAS染色または同じ肺からのMUC1、MUC2およびMUC3の発現のウェスタンブロット)によるムチン阻害の評価によって測定した。図8は、IL−9トランスジェニックマウスが、コントロールのFVBマウスと比較してムチンを構成的に過剰産生することを示す。喘息性IL9トランスジェニックにおいて生じる高レベルの構成性ムチン産生(図8)(未刺激およびビヒクルコントロール)から、FVB/N肺(正常な陽性コントロール)において見出されるずっと低いベースラインのムチン産生に匹敵するレベルへの減少を、任意の薬物について有意であるとみなした。IL9トランスジェニックにおける粘液産生のアップレギュレーションは、RT−PCRによって示されるようなMUC2およびMUC5ACの増加した定常mRNAレベルに特異的に関連する(図9)。
【0067】
中和IL−9抗体は、IL9トランスジェニック肺においてムチン産生の有意な減少を生じることが示された(図10)。NFAはまた、このモデルにおけるムチン産生を減少させた。
【0068】
(実施例5:タルニフルマートによる喘息のマウスモデルにおけるムチン過剰産生の阻害)
5〜6週齢の保証されたウイルスフリーの雄性のB6D2F1マウスを、Jackson Laboratories(Bar Harbor ME)から購入した。動物を、高い効率の粒子濾過空気施設で飼育し、そして実験操作の前に5日間〜7日間にわたって食物および水を自由に摂らせた。この動物施設を22℃に維持し、そして明暗周期を自動的に制御した(12時間:12時間の明:暗)。
【0069】
(表現型分類および処置の効力)
動物に、タルニフルマートを含むマウス用餌または通常のマウス用餌のいずれかを自由に給餌した。動物は、気管支反応性亢進、気管支肺胞洗浄液の組成、ムチン産生および血清IgEに対する前処置の効果を評価するために、感作を受けなかったかまたはAspergillus fumigatus抗原の鼻腔内吸入によって感作されたかのいずれかであった。マウスに、Aspergillusを鼻腔内抗原投与し(0日目、7日目、16日目および17日目)、そして最後の用量の24時間後に表現型を決定した。肺における粘液産生の阻害を用いて、タルニフルマートの処置効果を評価したか、またはこの阻害を用いて、他の薬物候補の処置効果を評価し得る。気管支収縮応答を決定するために、薬物への曝露の前および曝露の間に呼吸器系の圧力を気管で測定し、そして記録した。以前に記載されたように、マウスに麻酔をし、そして器具を取り付けた(Levittら、1988;LevittおよびMitzner、1989;Kleebergerら、1990;Levitt、1991;LevittおよびEwart、1995;Ewartら、1995)。気道応答性を、以下のうちの1以上について測定する:5−ヒドロキシトリプタミン、アセチルコリン、アトラクリウムまたはサブスタンスPアナログ。気管支収縮抗原投与後のピーク吸息圧における変化の単純かつ反復可能な測定を用いた。これを、気道圧力時間指数(APTI)(Levittら、1988;LevittおよびMitzner、1989)と呼んだ。APTIを、注射時点から、ピーク圧力がベースラインまたはプラトーに戻るまで積算されたピーク吸息圧における変化によって評価した。APTIは、気道抵抗に匹敵した。しかし、APTIは、気管支収縮からの回復に関連するさらなる成分を含む。気管支肺胞洗浄(BAL)および細胞分析を、以前に記載された(Kieebergerら、1990)通りに行った。肺の組織学を、肺を採取し、そして液体窒素中で直ちに凍結した後に実施した。気管支応答性試験の後、肺を取り出し、そして上記の通りに液体窒素に浸漬した。凍結切片化、染色および組織学的検査を、当業者に明らかな様式で実施した。
【0070】
処置応答を、組織学的検査(処置肺およびコントロール肺のPAS染色)によるムチン阻害の評価によって測定した。
【0071】
タルニフルマートでの経口処置は、ムチン染色を減少させた。図15Aは、通常のマウス用餌を給餌したAsp−sensマウスから得られたマウス肺におけるPAS染色を示す。図15Bは、タルニフルマートを含む餌を給餌したAsp−sensマウスから得られた結果を示す。図16は、タルニフルマートでコーティングされたマウス用餌を給餌した結果を、気管支肺胞洗浄によって決定した肺好酸球増加について示す。タルニフルマートは、Aspergillus fumigatusに感作させたマウスから得られる好酸球細胞の数を、標準的なマウス用餌を給餌した感作したマウスと比較して減少させた。
【0072】
(実施例6:上皮細胞株におけるICACC−1の過剰発現は、ムチン産生を増強する)
NCI−H292細胞(ヒト肺粘液性類表皮癌細胞株)を、American Type Culture Collection(Manassas VA)から購入し、そして10% FBSおよび1% ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco/BRL)を補充したRPMI1640培地中で培養した。加湿し、5% CO2を補充した空気含有インキュベーター中で37℃にてこの細胞を増殖させた。hICACC−Iを過剰発現する安定なNCI−H292細胞株を、製造業者の指示書(Boehringer−Mannheim)に従ってFujin Transfectionキットを用いたpcDNA3−hICACC−1のトランスフェクションによって樹立した。同じ手順を用いたNCI−H292細胞株へのpcDNA3(ctl)のトランスフェクションによってコントロール細胞株NCI−H292/ctlを産生した。hICACC−1遺伝子の発現は、ノーザン分析によってpcDNA3−hICACC−1トランスフェクタントについて確認された。
【0073】
s−ELLA(特異的酵素結合レクチンアッセイ)のために、細胞を24ウェル組織培養プレートにプレーティングし、そして72時間インキュベートしてコンフルエントにした。上清を、1μg/mlの抗MUC5A/C抗体(New marker、Fremont CA)で予めコーティングしかつ1% BSAでブロックした96ウェルプレート中に移した。次いで、抗体が結合したMUC5A/Cを、HRP−レクチン(Sigma)を用いて検出した。
【0074】
RT−PCRのために、総RNAを、製造業者のプロトコルに従ってTRIzol試薬(Gibco/BRL)を用いて細胞株から単離した。RT−PCRを、1μgの総RNAを逆転写し、そして適切なプライマーを用いてPCRによってcDNAを増幅することによって行った。産物を、2%アガロースゲルでの電気泳動によって分離し、そして臭化エチジウム染色によって可視化した。ヒトICACC−1メッセージを作製するために用いたプライマー対は以下の通りであった:センス5’−GGCACAGATCTTTTCATTGCTA−3’およびアンチセンス5’−GTGAATGCCAGGAATGGTGCT−3’(これらは、182bpの産物を産生する)。ムチンのメッセージを作成するために用いられたプライマー対を表1に列挙する。
【0075】
【表1】
NCI−H292細胞はMUC1を構成的に発現し、一方、MUC2およびMUC5A/C mRNA発現は、ベースラインでは検出レベル未満である。図12Aは、pcDNA3−hICACC−1でトランスフェクトされた細胞のノーザンブロット分析の結果を示し、これは、ICACC mRNAについての発現レベルの増加を示す。ICACC−1を過剰発現するクローンからの細胞全体の溶解産物のウェスタンブロット分析は、MUC2タンパク質産生の増強を示した(図12B)。MUC5A/C発現は、ICACC−1を過剰発現する細胞において有意に増加し、一方、MUC1は、RT−PCR分析において変化しなかった(図12C)。特異的ELLA分析はまた、トランスフェクトしていないNCI−H292細胞または空のベクターでトランスフェクトした細胞と比較して、ICACC−Iを発現するクローンにおいてMUC5A/Cタンパク質の過剰産生を示した(図12D)。
【0076】
(実施例7:hICACC−1を過剰発現するNCI−H292細胞における粘液過剰産生およびMUC 5A/C発現の阻害)
粘液糖結合体産生の決定のために、NCI−H292/ctlおよびNCI−H292/hICACC−1(AAF 15)細胞を、24ウェルプレート中で3日間にわたって培養した。次いで、細胞をホルマリンで固定し、そして粘液糖結合体をAB/PAS染色(Sigma)によって可視化した。NCI−H292コントロール細胞は、いくつかの散在した顆粒を伴って基本的PAS染色を提示した(図13A)が、ICACC−1の過剰発現は、PAS陽性粘液糖結合体の数および強度を劇的に増加させた(図13B)。塩素イオンチャネル遮断研究のために、細胞を、100μM濃度のニフルム酸(NFA)(Sigma)、125μMもしくは250μMのメフェナム酸(MFA)または12.5μM、25μMもしくは50μMのタルニフルマートの存在下で、または培地単独で培養した。NFA、MFAまたはタルニフルマートで処理した細胞のPAS染色は、未処理の細胞と比較して有意に少ない陽性染色粘液糖結合体を示した(図13Cおよび図13Dならびに図14の挿入図)。インヒビターで処理したコントロール細胞のPAS染色は、未処理の細胞との相違を実質的に全く示さなかった(図13Aおよび図13C)。
【0077】
タルニフルマート(図14)、ニメスリド(図17)およびMSI−2079(図18、MSI−2079の構造を図19に示す)についてのIC50値を、hCLCA1を発現するH292細胞におけるMUC5A/C分泌の阻害に基づいて決定した。コンフルエントな細胞を、このインヒビターで、OPTI MEM中で0μM〜250μMの濃度で処理した。分泌されたMUC5A/Cは、実施例5に記載される通りのELLAアッセイによってこのインヒビターの添加の48時間後に検出された。IC50値を、データ分析ソフトウェアGraphPad Prismを用いて決定した。図14の挿入図は、PAS染色によって検出された、タルニフルマート処理に応答した細胞内ムチンレベルを示す。
【0078】
本発明を種々の特定の材料、手順および例を参照して本明細書中に記載および例示してきたが、本発明は、その目的のために選択された材料および手順の特定の組み合わせに制限されないことが理解される。このような詳細の多数のバリエーションは、当業者に認識されるように示され得る。本出願を通して引用される全ての特許、特許出願および他の参考文献は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【0079】
(参考文献)
以下の参考文献は、本出願において言及された全ての参考文献、特許または特許出願と同様に、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【0080】
【表2】
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、ムチン産生に対するNFAの効果を示す顕微鏡写真である。NFAインヒビターは、インビトロでのムチン過剰産生をブロックする。
【図2】
図2は、NFAおよび種々の化合物の、活性化されたCaco2細胞によるムチンの過剰産生を抑制する能力を示す顕微鏡写真である。この図は、フェナメートによる、活性化されたCaco2細胞におけるムチン産生の阻害を示す。
【図3】
図3は、活性化されたCaco2細胞株の、NFAでの処理が、そのCaco2細胞株の生存率に影響を有さないことを示すグラフである。この図は、NFAが上皮細胞増殖に影響を有さないことを示す。
【図4】
図4は、ケモカインであるエオタキシンの上皮細胞による産生の阻害を示すグラフである。この図は、NFAが、ケモカイン産生を含む上皮活性化をブロックすることを示す。
【図5】
図5は、NFAの気管内投与が、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)と比較して、抗原誘発性気道反応性亢進(Af+NFA)を抑制することを示すグラフである。この図は、NFAが、気道反応性亢進を含む上皮抗原応答をブロックすることを示す。
【図6】
図6は、NFAの気管内投与の結果を示すグラフである。この図は、NFAが抗原誘発性肺好酸球増加をインビボで減少させることを示す。これは、NFAの存在下でAspergillus(Af+NFA)を用いた活性化後の好酸球増加を、NFAが存在しないリン酸緩衝化生理食塩水(Af+PBS)での活性化後の好酸球増加と比較することにより見られる。
【図7】
図7は、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)と比較した、粘液(ムチン糖結合体)における抗原誘発性増加に対するNFAの気管内投与(Af+NFA)の結果を示す顕微鏡写真である。この図は、曝露したマウスの肺における抗原に起因して、NFAがムチン発現の増加をブロックすることを示す。
【図8】
図8は、コントロールのFVBマウスとは対照的に、IL9トランスジェニックマウスが、気道においてムチンを構成的に過剰産生することを示す顕微鏡写真である。
【図9】
図9は、IL9トランスジェニックマウスの肺におけるムチンの構成的過剰産生が、バックグラウンドの系統(FVB/NJ)のマウスと比較して、MUC2およびMUC5ACの定常状態の転写物の特異的アップレギュレーションに関連することを示す顕微鏡写真である。この図は、特異的ムチン遺伝子が、IL−9トランスジェニックマウスの肺においてアップレギュレートされることを示す。
【図10】
図10は、抗原に曝露されたマウスの肺におけるムチン過剰産生に対する抗IL−9抗体の効果を示す顕微鏡写真である。この図は、中和IL−9抗体が、抗原に曝露したマウスにおけるムチン過剰産生を妨げることを示す。
【図11】
図11は、ムチン産生をブロックするフェニルアントラニル酸アナログの一般式を示す化学式であり、ここで、
X1〜X9=各々他とは独立して、C、S、OまたはNであり得、
R1〜R11=各々他とは独立して、水素、アルキル、アリール、置換アルキル、置換アリール、ハロゲン、ハロゲン置換アルキル、ハロゲン置換アリール、環を形成するアルキル、環を形成するアリール、環を形成する置換アルキル、環を形成する置換アリール、ヒドロキシル、アルキルエーテル、アリールエーテル、アミン、アルキルアミン、アリールアミン、アルキルエステル、アリールエステル、アルキルスルホンアミド、アリールスルホンアミド、チオール、アルキルチオエーテル、アリールチオエーテル、アルキルスルホン、アリールスルホン、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルスルホンアミドまたはアリールスルホンアミドであり得、
Y=カルボキシレート、アルキルカルボキシレート、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、ホスホネート、カルボン酸のアミド、カルボン酸のエステル、リン酸のアミド、リン酸のエステル、スルホン酸のアミド、スルホン酸のエステル、ホスホン酸のアミド、ホスホン酸のエステル、スルホンアミド、ホスホンアミド(phosphonamide)、テトラゾール、ヒドロキサム酸または他の酸の同配体、
Z=O、NR10、S、CR10R11、スルホキシドまたはスルホン、
m=0または1、
n=1または2である。
【図12】
図12は、NCI−H292細胞においてhICACC−1によって誘導されたムチン発現を示すノーザンブロットである。
【図13】
図13は、hICACC−1を過剰発現するNCI−H292細胞における粘液過剰産生を示す顕微鏡写真である。
【図14】
図14は、タルニフルマートによるムチン産生の阻害を示すグラフである。
【図15A】
図15Aは、マウスにおけるタルニフルマートの経口投与によるムチン過剰産生の阻害を示す顕微鏡写真である。図15Aは、Aspergillus fumigatusに対して感作し、そして通常のマウス用の餌を採らせたマウス由来の肺(H&Eで染色した)の切片を示す。
【図15B】
図15Bは、マウスにおけるタルニフルマートの経口投与によるムチン過剰産生の阻害を示す顕微鏡写真である。図15Bは、Aspergillus fumigatusに対して感作し、そしてタルニフルマートを含有するマウス用の餌を採らせたマウス由来の肺(H&Eで染色した)の切片を示す。
【図16】
図16は、マウスにおけるタルニフルマートの経口投与による肺好酸球増加の阻害を示すグラフである。この図は、AHR373:Aspergillus fumigatusで感作したB6D2F1/J雄性マウスのBALに対するタルニフルマートマウス用餌の効果を示す。
【図17】
図17は、ニメスリドによるMUC5A/C分泌の阻害を示すグラフである。
【図18】
図18は、MSI−2079によるMUC5A/C分泌の阻害を示すグラフである。
【図19】
図19は、MSI−2079の構造を示す化学式である。
Claims (41)
- ムチンの産生によって特徴付けられる疾患を有する被験体の処置方法であって、該被験体におけるムチンの合成またはレベルを減少させる少なくとも1つの化合物を含む組成物の有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
- 前記ムチン合成が、塩素イオンチャネル依存性である、請求項1に記載の方法。
- 前記化合物が、ICACC塩素イオンチャネルを発現する細胞におけるムチンの合成を減少させる、請求項2に記載の方法。
- 前記化合物が、アントラニル酸のアナログおよび誘導体、2−アミノ−ニコチン酸のアナログおよび誘導体、2−アミノ−フェニル酢酸のアナログおよび誘導体、ベンドロフルメチアジド、アミノキノリンのアナログおよび誘導体、それらの塩およびそれらのプロドラッグからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記化合物が、タルニフルマート、フルフェナム酸、ニフルム酸、メフェナム酸、ベンドロフルメチアジド、N−(3−フルオロベンジル)−3−アミノキノリン、それらの塩、それらの誘導体およびそれらのプロドラッグからなる群より選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記組成物が、タルニフルマート、タルニフルマート誘導体、それらの塩またはそれらのプロドラッグを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記組成物が、吸入によって投与される、請求項4に記載の方法。
- 前記組成物が、液体の形態である、請求項7に記載の方法。
- 前記組成物が、粉末の形態である、請求項7に記載の方法。
- 前記液体が、エアゾール化されている、請求項8に記載の方法。
- 前記組成物が、少なくとも1つの去痰薬、粘液溶解剤、抗生物質または鬱血除去剤をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記去痰薬が、グアイフェネシンである、請求項11に記載の方法。
- 前記組成物が、少なくとも1つの安定剤、吸収増強剤または矯味矯臭剤をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記安定剤がシクロデキストランである、請求項13に記載の方法。
- 前記吸収増強剤がキトサンである、請求項13に記載の方法。
- 前記疾患が、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、炎症性肺疾患、嚢胞性線維症および急性または慢性の感染性疾患からなる群より選択される、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組成物が、吸入によって投与される、請求項16に記載の方法。
- 前記組成物が、吸入によって肺または鼻の通路へと投与される、請求項17に記載の方法。
- 前記COPDが、気腫、慢性気管支炎および喘息からなる群より選択される、請求項16に記載の方法。
- 肺への吸入送達のために処方された治療組成物であって、タルニフルマート、フルフェナム酸、ニフルム酸、メフェナム酸、N−(3−フルオロベンジル)−3−アミノキノリン、それらの塩、それらの誘導体およびそれらのプロドラッグからなる群より選択される少なくとも1つの化合物をムチンの産生またはレベルを減少させるのに有効な量で含む、治療組成物。
- 前記組成物が、タルニフルマート、タルニフルマート誘導体、それらの塩またはそれらのプロドラッグを含む、請求項20に記載の治療組成物。
- 前記組成物が、液体の形態である、請求項20に記載の治療組成物。
- 前記組成物が、粉末の形態である、請求項20に記載の治療組成物。
- 前記組成物が、少なくとも1つの去痰薬、粘液溶解剤、抗生物質または鬱血除去剤をさらに含む、請求項20に記載の治療組成物。
- 前記去痰薬が、グアイフェネシンである、請求項24に記載の治療組成物。
- 前記組成物が、少なくとも1つの安定剤、吸収増強剤または矯味矯臭剤をさらに含む、請求項20に記載の治療組成物。
- 前記安定剤が、シクロデキストランである、請求項26に記載の治療組成物。
- 前記吸収増強剤が、キトサンである、請求項26に記載の治療組成物。
- 請求項20〜28のいずれか1項に記載の治療組成物を含む、吸入デバイス。
- 前記化合物が、タルニフルマートである、請求項5に記載の方法。
- 前記化合物が、N−(3−フルオロベンジル)−3−アミノキノリン、その塩、その誘導体およびそのプロドラッグからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記化合物が、経口投与される、請求項4に記載の方法。
- 前記組成物が、経口投与される、請求項30に記載の方法。
- ムチンの産生によって特徴付けられる疾患を有する被験体を処置する方法であって、該被験体におけるムチンの合成またはレベルを減少させ、そしてシクロオキシゲナーゼ酵素を阻害する少なくとも1つの化合物を含む組成物の有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
- 前記化合物が、シクロオキシゲナーゼ2を特異的に阻害する、請求項34に記載の方法。
- 前記化合物が、アントラニル酸のアナログおよび誘導体、2−アミノ−ニコチン酸のアナログおよび誘導体、2−アミノ−フェニル酢酸のアナログおよび誘導体、ベンドロフルメチアジド、アミノキノリンのアナログおよび誘導体、それらの塩およびそれらのプロドラッグからなる群より選択される、請求項34に記載の方法。
- 前記化合物が、タルニフルマート、フルフェナム酸、ニフルム酸、メフェナム酸、ベンドロフルメチアジド、N−(3−フルオロベンジル)−3−アミノキノリン、それらの塩、それらの誘導体およびそれらのプロドラッグからなる群より選択される、請求項34に記載の方法。
- 前記組成物が、タルニフルマート、タルニフルマート誘導体、それらの塩またはそれらのプロドラッグを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記組成物が、N−(3−フルオロベンジル)−3−アミノキノリン、その塩、その誘導体およびそのプロドラッグを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記組成物が、肺への吸入送達のために処方されている、請求項34に記載の方法。
- 前記組成物が、経口送達のために処方されている、請求項34に記載の方法。
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