ES2282235T3 - Inhibidores de la sintesis de la mucina. - Google Patents
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Abstract
Uso de una composición en la producción de un fármaco para el tratamiento de la sobreproducción de mucina asociada a una enfermedad del tracto respiratorio seleccionada del grupo consistente en enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad pulmonar inflamatoria, fibrosis quística y enfermedad infecciosa aguda o crónica; o una enfermedad del tracto gastrointestinal asociada a una fibrosis quística seleccionada del grupo consistente en síndrome de mala absorción, esteatorrea y diarrea en un sujeto, donde la composición comprende talniflumato o una sal derivada farmacéuticamente aceptable.
Description
Inhibidores de la síntesis de la mucina.
Esta solicitud reivindica el beneficio de la
solicitud provisional U.S. 60/179,127, solicitada el 31 de enero de
2000, solicitud provisional 60/193,111, solicitada el 30 de marzo
de 2000, solicitud provisional 60/230,783, solicitada el 7 de
septiembre de 2000, solicitud provisional 60/ solicitada el 23 de
octubre de 2000 y solicitud provisional 60/ solicitada el 20 de
noviembre de 2000. Todas las solicitudes a las que se ha hecho
referencia arriba se titulan "Inhibidores de la Síntesis de la
Mucina" y los inventores son Yuhong Zhou, Roy C. Levitt,
Nicholas C. Nicolaides, Steve Jones, y Mike McLane.
Esta invención se refiere a la modulación de la
síntesis de la mucina y el uso terapéutico de compuestos para
controlar la sobreproducción de mucina asociada a enfermedades
tales como asma, bronquitis crónica, enfermedades inflamatorias del
pulmón, fibrosis quistica y enfermedades respiratorias infecciosas
crónicas o agudas así como enfermedades pulmonares obstructivas
crónicas (EPOC).
Se sabe que el epitelio de las vías
respiratorias juega un papel íntegro en el mecanismo de defensa de
la vía respiratoria a través del sistema mucociliar y las barreras
mecánicas. Estudios recientes indican que las células epiteliales de
las vías respiratorias (AEC del inglés airway epithelial cells)
pueden ser activadas para producir y liberar mediadores biológicos
importantes en la patogénesis de múltiples enfermedades de las vías
respiratorias (Polito y Proud, 1998; Takizawa, 1998). La evidencia
ha demostrado que el epitelio enferma fundamentalmente en
enfermedades de las vías respiratorias crónicas tales como asma,
bronquitis crónica, efisema, y fibrosis quistica (Holgate et
Al., 1999; Jeffery PK, 1991; Salvato, 1968; Glynn y Michaels,
1960). Una de las características distintivas de estas enfermedades
de las vías respiratorias es la sobreproducción de moco por las
AEC. Los componentes macromoleculares principales del moco son las
grandes glicoproteinas conocidas como mucinas. Recientemente, se
determinó la estructura molecular de al menos 7 mucinas de origen
humano. Los transcritos de los genes de la mucina conocidos son
heterogéneos sin homología secuencial entre los genes (Voynow y
Rose, 1994), aunque son similares en su estructura global
repetitiva.
Se sabe que los estímulos deletéreos activan las
AEC. Estos estímulos pueden variar de antígenos en enfermedades
alérgicas a los fármacos o contaminantes medioambientales, humo de
tabaco, y agentes infecciosos asociados a formas de enfermedades
pulmonares obstructivas crónicas. la activación de las AEC conduce a
la alteración del transporte iónico, cambios en el latido ciliar y
al aumento de la producción y secreción de mucinas conduciendo a un
aumento de moco. Los mediadores producidos en respuesta a la
activación de las AEC incluyen quimiocinas que promueven la
afluencia de células inflamatorias (Takizawa, 1998). Estas células
inflamatorias pueden producir a su vez mediadores que pueden
deteriorar las AEC. El deterioro de las AEC estimula la
proliferación celular (hiperplasia de células caliciformes y
células de la glándula submucosa) que generan una fuente amplia y
continua de productos proinflamatorios, incluyendo proteasas al
igual que factores del crecimiento que promueven la remodelación de
la pared de la vía respiratoria lo que puede llevar a la
destrucción del pulmón y la pérdida de función (Holgate et
al, 1999).
La sobreproducción de moco y la alteración de
sus características fisioquímicas pueden contribuir a la patología
pulmonar de varias formas. La alteración del aclaramiento
fisiológico mucociliar por la sobreproducción de mucinas pueden
generar tapones de moco, atrapamiento aéreo y atelectasis que se
suele complicar por infección.
El asma es una enfermedad pulmonar obstructiva
crónica que parece que aumenta en prevalencia y gravedad (Gergen y
Weiss, 1992). Se estima que el 30-40% de la
población padece de alergia atópica y el 15% de los niños y el 5% de
los adultos de la población padecen de asma (Gergen y Weiss,
1992).
En el asma, la activación del sistema
inmunitario por antígenos conduce a la inflamación alérgica. Cuando
este tipo de activación inmunológica ocurre es acompañada por
inflamación pulmonar, hipersensibilidad bronquial, hiperplasia de
células caliciformes y de la glándula submucosa, y sobreproducción e
hipersecreción de mucina (Basle et al., 1989) (Paillasse,
1989) (Bosque et al., 1990). La sobreproducción y
taponamiento de moco asociado con la hiperplasia de células
caliciformes y células de la glándula submucosa es una parte
importante de la patología del asma y ha sido descrito examinando
las vías respiratorias tanto de asmáticos moderados como de
individuos que han muerto con estado asmático (Earle, 1953)
(Cardell y Pearson, 1959) (Dunnill, 1960) (Dunnill et al.,
1969) (Aikawa et al., 1992) (Cutz et al., 1978).
Algunas células inflamatorias son importantes en esta reacción
incluyendo la células T, las células con antígenos, las células B
que producen IgE, los basófilos que enlazan la IgE y los
eosinófilos. Estas células inflamatorias se acumulan en el lugar de
la inflamación alérgica y los productos tóxicos que éstas liberan
contribuyen a la destrucción de las AEC y otros tejidos relacionados
con estos trastornos.
En las solicitudes de patente relacionadas
mencionadas arriba, los solicitantes han demostrado que la
interleucina 9 (IL9), su receptor y las actividades efectuadas por
la IL9 son los objetivos apropiados para la intervención terapéutica
en alergia atópica, asma y enfermedades relacionadas. Desde hace
mucho se ha considerado la liberación de mediadores de mastocitos
por alérgeno una situación de inicio crítico de alergia. La IL9 fue
originalmente identificada como un factor de crecimiento de
mastocitos y se ha demostrado que la IL9 favorece la expresión de
las proteasas de los mastocitos incluyendo MCP-1,
MCP-2, MCP-4 (Eklund et al.,
1993) y granzima B (Louahed et al., 1995). Así, parece que
la IL9 juega un papel en la proliferación y diferenciación de los
mastocitos. Además, la IL9 favorece la expresión de la cadena alfa
del receptor de IgE de alta afinidad (Dugas et Al., 1993).
Además, estudios tanto in vitro como in vivo han
mostrado que la IL9 potencia la liberación de IgE de células B
cebadas (Petit-Frere et al., 1993).
Recientemente se demostró que la IL9 estimula la
síntesis de la mucina y pueden determinar incluso el
50-60% de la actividad estimulante de la mucina de
los fluidos pulmonares en enfermedades alérgicas de las vías
respiratorias (Longpre et al., 1999). Se produce una
síntesis de la mucina y sobreproducción del moco exageradas en
ratones transgénicos que expresan IL9 en comparación con ratones que
expresan la cepa del antecedente genético. La IL9 expresa
específicamente los genes y proteínas MUC2 y MUC5AC in vitro
e in vivo (Louahed et al., 2000). Además, el
anticuerpo que neutraliza la IL9 inhibe completamente la expresión
de mucinas en respuesta al desafío del antígeno en modelos animales
de asma (McLane et al., 2000)
Los tratamientos actuales del asma sufren varias
desventajas. Los principales agentes terapéuticos, agonistas
beta-receptores, reducen los síntomas
transitoriamente mejorando la función pulmonar, pero no actúan sobre
la inflamación causante ni suprimen la producción de mucina.
Además, el uso constante de agonistas
beta-receptores produce una desensibilización,
reduciendo su eficacia y seguridad (Molinoff et al., 1995).
Los agentes que pueden disminuir la inflamación causante, y de ese
modo reducir la producción de mucina, tales como esteroides
antiinflamatorios, tienen su propia lista de desventajas que
variarán desde la inmunosupresión hasta la pérdida ósea (Molinoff
et al., 1995).
La bronquitis crónica es otra forma de
enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Casi el 5% de los adultos
padecen de esta enfermedad pulmonar. La bronquitis crónica es
definida como la sobreproducción crónica de esputo. La
sobreproducción de moco está generalmente asociada a la inflamación
de las vías respiratorias conductoras. Los mediadores de las
células inflamatorias incluyendo los neutrófilos y macrófagos
pueden estar asociados a un aumento de la expresión genética de la
mucina en esta enfermedad (Voynow et al., 1999; Borchers
et al., 1999). La mayor producción de moco está asociada a
la obstrucción de la vía respiratoria, que es una de las
características cardenales de esta enfermedad pulmonar. La terapia
es ampliamente sintomática y enfocada en controlar la infección e
impedir una mayor pérdida de la función pulmonar. No se cree que los
descongestivos, expectorantes y combinaciones de estos agentes, que
son frecuentemente usados para tratar los síntomas de la
bronquitis, alteren la producción de mucina. Los mucolíticos pueden
estimular el aclaramiento mucociliar y proporcionan un alivio
sintomático al reducir la viscosidad y/o la elasticidad de las
secreciones de la vía respiratoria pero no inhiben la síntesis de la
mucina o la sobreproducción de moco. (Takahashi et al.,
1998)
La fibrosis quística (FQ) es otra enfermedad más
que afecta al pulmón y está asociadas a secreciones espesas que
producen la obstrucción de la vía respiratoria y la colonización e
infección posterior por microorganismos patógenos inhalados (Eng
et al., 1996). Los niveles del ADN aumentan
significativamente en el pulmón con la fibrosis quística y pueden
aumentar la viscosidad del esputo. Aunque el ADNsa recombinante en
aerosol es útil en estos pacientes, no hay ningún tratamiento eficaz
para la sobreproducción patológica de moco. Así, hay una necesidad
específica insatisfecha en la técnica de identificar agentes
capaces de inhibir la sobreproducción de mucina por las células
epiteliales de las vías respiratorias en la fibrosis quística.
Además de la obstrucción de la vía respiratoria provocada por las
secreciones de mucina, los pacientes con fibrosis quística también
padecen de tapones de moco en los conductos pancreáticos que
impiden el suministro de enzimas digestivas al tracto GI. El
resultado es síndrome de mala absorción, esteatorrea y diarrea.
Aunque la sobreproducción de moco es una de las
características distintivas de las múltiples enfermedades
pulmonares obstructivas crónicas, la técnica carece de cualquier
método para bloquear la síntesis o sobreproducción de mucinas
asociadas a estas enfermedades pulmonares. Por ello, hay una
necesidad específica en la técnica de inhibir la sobreproducción de
mucinas y disolver las secreciones de estos pacientes para
facilitar el aclaramiento mucociliar y preservar la función
pulmonar.
La presente invención se refiere al
descubrimiento de agentes que inhiben la síntesis y sobreproducción
de glicoproteínas mucinas y el uso de estas moléculas en la
fabricación de un fármaco para tratar la sobreproducción patológica
de moco en enfermedades pulmonares obstructivas crónicas y otras
enfermedades.
En un aspecto, la presente invención provee el
uso de un compuesto en la producción de un fármaco para tratar a un
sujeto con una enfermedad respiratoria caracterizada por la
producción de mucina, comprendiendo la administración al sujeto de
una cantidad eficaz de una composición comprendiendo al menos un
compuesto según la reivindicación 1 que reduce la síntesis o los
niveles de mucina en los pulmones o en el tracto GI. En algunas
formas de realización, la síntesis de la mucina puede ser
dependiente del canal de cloruro. En algunas formas de realización,
el compuesto reduce la síntesis de la mucina en células que
expresan un canal de cloruro ICACC. Las composiciones de la
presente invención comprenden talniflumato o una sal derivada
farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto de la presente invención los
compuestos según la reivindicación 1 que reducen la síntesis de la
mucina son también inhibidores de la enzima ciclooxigenasa. En una
forma de realización más preferida los compuestos son inhibidores
específicos de la enzima ciclooxigenasa 2.
En otra forma de realización, la presente
invención provee fármacos para tratar a un sujeto con una
enfermedad respiratoria caracterizada por la producción de mucina
administrando las composiciones de la invención por inhalación. En
algunas formas de realización, la composición está en forma de
líquido o en forma de polvo. En algunas formas de realización, la
composición está en aerosol. En otras formas de realización, la
composición además comprende al menos un agente expectorante,
antihistamínico, mucolítico, antibiótico o descongestionante. En
algunas formas de realización, el expectorante es guaifenesina. Las
composiciones de la invención pueden comprender además al menos un
agente estabilizante, un agente potenciador de la absorción o un
agente aromatizante. En algunas formas de realización preferidas,
el agente estabilizante es ciclodextrano y/o el agente potenciador
de la absorción es quitosano.
En algunas formas de realización preferidas, las
composiciones de la presente invención pueden ser usadas para
tratar una enfermedad respiratoria seleccionada del grupo
consistente en una enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC),
una enfermedad pulmonar inflamatoria, fibrosis quística y una
enfermedad infecciosa aguda o crónica. El tratamiento de cualquiera
de estas enfermedades puede ser por administración de una o más de
las composiciones de la invención por inhalación. En algunas formas
de realización, la composición es administrada por inhalación a los
pulmones. En formas de realización preferidas, la presente invención
provee materiales para tratar una EPOC seleccionada del grupo
consistente en efisema, bronquitis crónica y asma.
En otra forma de realización preferida, las
composiciones de la presente invención pueden ser usadas para
tratar las complicaciones GI de la fibrosis quística tales como el
síndrome de mala absorción, esteatorrea y diarrea. El tratamiento de
esta enfermedad puede ser por administración de una o más de las
composiciones de la invención por vía oral.
En otra forma de realización, la presente
invención provee una composición terapéutica formulada para su
administración por inhalación comprendiendo una cantidad eficaz
para reducir la producción o los niveles de mucina o de al menos un
compuesto seleccionado del grupo consistente en talniflumato, y
sales derivadas farmacéuticamente aceptables. En algunas formas de
realización, la composición está en forma de líquido o en forma de
polvo. En algunas formas de realización, la composición además
comprende al menos un agente expectorante, mucolítico, antibiótico,
antihistamínico o descongestionante. En algunas formas de
realización, el expectorante es guaifenesina.
Además de los agentes anteriormente descritos,
las composiciones farmacéuticas de la presente invención formuladas
para la inhalación pueden comprender además al menos un agente
estabilizante, un agente potenciador de la absorción o un agente
aromatizante. En algunas formas de realización, el agente
estabilizante es un ciclodextrano y/o el agente potenciador de la
absorción es quitosano.
La Figura 1 muestra el efecto del ácido
niflúmico NFA (del inglés niflumic acid) en la producción de
mucina. El inhibidor del NFA bloquea la sobreproducción de la
mucina in vitro.
La Figura 2 muestra la capacidad del NFA y
varios compuestos para suprimir la sobreproducción de mucina por
células Caco2 activadas. Esta figura muestra la inhibición de la
producción de mucina en células Caco2 activadas por fenamatos.
La Figura 3 muestra que el tratamiento de la
línea celular Caco2 activada con NFA no afectó su viabilidad. Esta
figura muestra que el NFA no afecta la proliferación de las células
epiteliales.
La Figura 4 muestra la inhibición de la
producción de células epiteliales de la quimiocina eotaxina. Esta
figura muestra que el NFA bloquea la activación epitelial
incluyendo la producción de quimiocina.
La Figura 5 muestra que la administración
intratraqueal de NFA suprime la hipersensibilidad de la vía
respiratoria inducida por antígenos (Af + NFA) en comparación con
el suero salino tamponado con fosfato (PBS). Esta figura muestra
que el NFA bloquea las respuestas al antígeno epitelial incluyendo
la hipersensibilidad de la vía respiratoria.
La Figura 6 muestra los resultados de la
administración intratraqueal de NFA. Esta figura muestra que el NFA
reduce in vivo la eosinofilia pulmonar inducida por
antígenos. Esto se ve comparando la eosinofilia después de la
activación con Aspergillus en presencia de NFA (Af + NFA) con la
eosinofilia después de la activación en ausencia de NFA con suero
salino tamponado con fosfato (Af + PBS).
La Figura 7 muestra los resultados de la
administración intratraqueal de NFA en aumentos de moco inducidos
por antígenos (glicoconjugados de mucina) (Af + NFA) en comparación
con suero salino tamponado con fosfato (PBS). Esta figura muestra
que el NFA bloquea la expresión aumentada de la mucina por antígenos
en pulmones expuestos de ratón.
La Figura 8 muestra que ratones transgénicos que
expresan IL9 constitutivamente sobreproducen mucina en la vía
respiratoria a diferencia de los ratones de control que expresan
FVB.
La Figura 9 muestra que la sobreproducción
constitutiva de mucina en el pulmón de los ratones transgénicos que
expresan IL9 está asociada a la expresión específica de los
transcriptos estacionarios MUC2 y MUC5AC en comparación con los
ratones que expresan la cepa del antecedente genético (FVB/NJ). Esta
figura muestra que los genes específicos de la mucina son
expresados en los pulmones de los ratones transgénicos que expresan
IL-9.
La Figura 10 muestra el efecto del anticuerpo
anti-IL-9 en la sobreproducción de
mucina en el pulmón de ratones expuestos a antígenos. Esta figura
muestra que la neutralización del anticuerpo IL-9
impide la sobreproducción de mucina en ratones expuestos a
antígenos.
La Figura 11 muestra una fórmula genérica para
análogos del ácido fenilantranilico que bloquean la producción de
mucina donde
X_{1} a X_{9} = cada uno independientemente
de los otros pueden ser C, S, O o N,
R_{1} a R_{11} = cada uno independientemente
de los otros pueden ser hidrógeno, alquilo, arilo, alquilo
sustituido, arilo sustituido, halógeno, alquilo sustituido por
halógeno, arilo sustituido por halógeno, alquilo o arilo formando un
anillo, alquilo o arilo sustituido formando un anillo, hidróxilo,
éter de alquilo o arilo, amina, amina de alquilo o arilo, éster de
alquilo o arilo, sulfonamida de alquilo o arilo, tiol, tioéter de
alquilo o arilo, sulfona de alquilo o arilo, sulfóxido o sulfonamida
de alquilo o arilo,
Y = carboxilato, carboxilato de alquilo,
sulfato, sulfonato, fosfato, fosfonato, amidas de ácidos
carboxilicos, ésteres de ácidos carboxílicos, amidas de ácidos
fosfóricos, ésteres de ácidos fosfóricos, amidas de ácidos
sulfónicos, ésteres de ácidos sulfónicos, amidas de ácidos
fosfónicos, ésteres de ácidos fosfónicos, sulfonamida, fosfonamida,
tetrazol, ácido hidroxámico u otro isóstero ácido,
Z = O, NR_{10}, S, CR_{10} R_{11},
sulfóxido o sulfona,
m = 0 ó 1,
n = 1 ó 2.
La Figura 12 muestra la expresión de la mucina
inducida por hICACC-1 en células
NCI-H292.
La Figura 13 muestra la sobreproducción de moco
en células NCI-H292 de sobreexpresión de
hICACC-1.
La Figura 14 muestra la inhibición de la
producción de mucina por talniflumato.
Las Figuras 15 A y B muestran la inhibición de
la sobreproducción de mucina por administración oral de
talniflumato en ratones. La Figura 15A muestra una sección de
pulmón (coloreado con H&E) de un ratón sensibilizado al
Aspergillus fumigatus y al que se dejó acceder regularmente
a alimento para ratones mouse chow.
La Figura 15B muestra una sección de pulmón
(coloreado con H&E) de un ratón sensibilizado con
Aspergillus fumigatus y al que se dejó acceder a alimento
para ratones mouse chow conteniendo Talniumato.
La Figura 16 muestra la inhibición de
eosinofilia pulmonar por administración oral de talniflumato en
ratones. Esta figura muestra AHR373: El efecto del alimento para
ratones mouse chow con talniflumato en el lavado broncoalveolar LBA
de ratones macho B6D2FIIJ sensibilizados con Aspergillus
fumigatus.
La Figura 17 muestra la inhibición de la
secreción MUC5AIC por Nimesulida (referencia)
La Figura 18 muestra la inhibición de la
secreción MUC5AIC por MSI-2079 (referencia)
La Figura 19 muestra la estructura de
MSI-2079 (referencia).
La presente invención procede, en parte, del
descubrimiento de que la sobreproducción de moco resultante de la
activación de células epiteliales no ciliadas del pulmón es
provocada por la inducción de genes de la mucina incluyendo MUC2 y
MUC5AC. Así, un aspecto de la invención es la inhibición de la
activación de las células epiteliales. Esta inhibición de la
activación de las AEC reduce la producción de quimiocina, la
sensibilidad bronquial y la expresión genética de la mucina.
Como se describe aquí, las formulaciones y
composiciones de la invención incluyen agentes que reducen la
síntesis o niveles de mucina, o reducen de alguna forma la
sobreproducción de mucina. Como se utiliza en este caso,
"reduce" se define como una reducción en el nivel, activación,
función, estabilidad, o síntesis de mucina. Los agentes preferidos
reducen el nivel dependiente del canal de cloruro, activación,
función, estabilidad, o síntesis de mucina. Como se utiliza aquí,
"canal de cloruro" se refiere, pero sin limitarse al canal de
cloruro ICACC y los canales relacionados a los que se hace
referencia en WO 99/44620.
La molécula que reduce la síntesis o niveles de
mucina es talniflumato.
Como se ha provisto en los ejemplos, los agentes
que modulan, disminuyen o reducen la expresión de mucina pueden ser
usados para modular procesos patológicos y biológicos asociados a
la producción de mucina.
Los solicitantes han observado que la IL9 induce
selectivamente la expresión de los productos genéticos de la
mucina. Así, el papel pleiotrópico de la IL9, que es importante
para un número de respuestas inducidas por antígenos, depende en
parte, de la expresión de la mucina en las AEC. Cuando las
funciones de la IL9 son reducidas por un tratamiento de anticuerpos
neutralizantes, los animales pueden ser completamente protegidos de
las respuestas inducidas por antígenos en el pulmón. Estas
respuestas incluyen: hipersensibilidad bronquial, eosinofilia y
recuentos elevados de células en lavado bronquial, IgE elevado en
suero, cambios histológicos en pulmón asociados a inflamación, e
hiperplasia de células caliciformes y células de la glándula
submucosa asociada a la sobreproducción de moco. La reducción de las
respuestas por IL9 y de tipo asmático está asociada a la expresión
reducida de la mucina (Figura 10). Así, la fabricación de un
fármaco para el tratamiento de tales respuestas, que provocan la
patogénesis del asma y se caracterizan por la inflamación alérgica
asociada a este trastorno, que reduzcan la producción de mucina, se
encuentra dentro del campo de esta invención.
El análisis histológico de las vías
respiratoiras de ratones transgénicos que expresan IL9 han mostrado
la sobreproducción de la mucina en células epiteliales no ciliadas
(Temann et al., 1998; Louahed et al., 2000). La
inducción de mucina en el pulmón del ratón transgénico que expresa
IL9 sugiere que la IL9 promueve la producción de moco por estas
células (ver Figura 8). Se produjeron y usaron células Caco2
activadas que expresan el ARNm de MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5B y
MUC5AC para probar inhibidores de la producción de mucina. Estas
células pueden ser coloreadas para detectar la mucina usando un
colorante de ácido periódico con reactivo de Schiff (PAS). Como se
muestra en la Figura 1A, las células Caco2 activadas no tratadas se
colorean intensamente por los glicoconjugados positivos de mucina
con PAS. Las células de control y activadas fueron cultivadas en
presencia de ácido niflúmico (NFA) o ácido
4,4'-diisotiocianostilbeno-2,2'-disulfónico
(DIDS). La coloración con PAS de las células activadas tratadas con
inhibidor reveló significativamente menos glicoconjugados con una
coloración positiva comparado con las células no tratadas (Figura
1D en comparación con 1B).
Aunque se ha identificado un potencial
terapéutico para la reducción de la mucina en el asma, los
solicitantes también han reconocido un potencial terapéutico para
la reducción de mucina en la fibrosis quística. Los pacientes con
fibrosis quística están impedidos por una enfermedad pulmonar
caracterizada por secreciones espesas que causan la obstrucción de
la vía respiratoria y la colonización e infección posterior por
microorganismos patógenos inhalados (Eng et al., 1996). Los
solicitantes en consecuencia proveen un fármaco para tratar la
fibrosis quística reduciendo la producción de mucina en el
pulmón.
La sobreproducción de mucina en la fibrosis
quística también está presente en los conductos pancreáticos que
suministran enzimas digestivas al tracto GI produciendo síndrome de
mala absorción, esteatorrea y diarrea. Los solicitantes en
consecuencia también proveen un fármaco para tratar la fibrosis
quística reduciendo la producción de mucina en el páncreas.
Los solicitantes también han identificado un
potencial terapéutico para la reducción de mucina en la bronquitis
crónica y el efisema. Los pacientes con bronquitis crónica y
efisema están impedidos por una enfermedad pulmonar caracterizada
por secreciones espesas que causan la obstrucción de la vía
respiratoria y colonización e infección posterior por
microorganismos patógenos inhalados (Eng et al., 1996). Los
solicitantes en consecuencia proveen un fármaco para tratar la
bronquitis crónica y el efisema reduciendo la producción de mucina
en el pulmón.
Como se utiliza aquí, un sujeto puede ser
cualquier mamífero, en la medida en que el mamífero necesite la
modulación de un proceso patológico o biológico mediado por la
producción de mucina. El término "mamífero" se entiende como un
individuo perteneciente a la categoría de los Mamíferos. La
invención es particularmente útil en el tratamiento de sujetos
humanos.
Los procesos patológicos se refieren a una
categoría de procesos biológicos que producen un efecto deletéreo.
Por ejemplo, la sobreproducción de mucina de la invención puede
estar asociada a una enfermedad respiratoria, incluyendo una
enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad pulmonar
inflamatoria, fibrosis quística y enfermedad infecciosa aguda o
crónica. Las EPOC incluyen bronquitis, asma y efisema. La
sobreproducción de mucina puede estar también asociadas a
enfermedades GI tales como síndrome de mala absorción, esteatorrea y
diarrea que están presentes en la fibrosis quística.
Como se utiliza aquí, se dice que un agente
modula un proceso patológico cuando el agente reduce el grado o
gravedad del proceso. Por ejemplo, se puede evitar la obstrucción
de la vía respiratoria o la progresión de la enfermedad modulada
por la administración de agentes que reduzcan o modulen de alguna
forma la síntesis, niveles y/o sobreproducción de mucina.
Los agentes de la presente invención puede ser
provistos solos o en combinación con otros agentes que modulen un
proceso patológico particular. Por ejemplo, un agente de la
presente invención puede ser administrado en combinación con
agentes antiasmáticos. En otra forma de realización, un agente puede
ser administrado en combinación con expectorantes, mucolíticos,
antibióticos, antihistamínicos o descongestivos. En otra forma más
de realización, un agente puede ser administrado con un agente
tensioactivo, un agente estabilizante, un agente potenciador de la
absorción, un agonista de un adrenorreceptor beta o de un receptor
de purina o un aromatizante u otro agente que mejore el sabor de las
composiciones. Como ejemplo, las composiciones de la invención
pueden contener, además del agente activo, un expectorante tal como
guaifenesina, un agente estabilizante tal como ciclodextrano y/o un
agente potenciador de la absorción tal como quitosano. Cualquiera
de tales agentes pueden ser usados en las composiciones de la
invención.
Como se utiliza aquí, se dice que dos o más
agentes son administrados en combinación cuando los agentes son
administrados simultáneamente o son administrados
independientemente de tal manera que los agentes actúen al mismo
tiempo.
Los agentes de la presente invención pueden ser
administrados vía parenteral, subcutánea, intravenosa,
intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, tópica u oral. De
forma alternativa, o al mismo tiempo, la administración puede ser
por vía oral o nasal o directamente a los pulmones. En una forma de
realización preferida, los compuestos de esta invención pueden ser
administrados por inhalación. Para la terapia por inhalación el
compuesto puede estar en una solución útil para la administración
por aerosol líquido, inhaladores dosificados, o de una forma
adecuada para un inhalador de polvo seco. La dosificación
administrada dependerá de la edad, salud, y peso del receptor, tipo
de tratamiento coexistente, si lo hubiere, frecuencia de tratamiento
y la naturaleza del efecto deseado.
En algunas formas de realización preferidas, los
agentes de la presente invención pueden ser formulados como
aerosoles. La formulación de aerosoles farmacéuticos es una rutina
para los expertos en la materia, ver por ejemplo, Sciarra, J. en
Remington: The Science and Practice of Pharmacy 19ª Edición,
capítulo 95, Editorial Mack, Easton, PA. Los agentes pueden ser
formulados como aerosoles de solución, dispersión o aerosoles de
suspensión de polvos secos, emulsiones o preparaciones semisólidas.
El aerosol puede ser suministrado usando cualquier sistema
propulsor conocido por los expertos en la materia. Los aerosoles
pueden ser aplicados al tracto respiratorio superior, por ejemplo
por inhalación nasal, o al tracto respiratorio inferior o a
ambos.
Los compuestos usados en los fármacos de esta
invención puede ser administrados sistémica o tópicamente,
dependiendo de consideraciones tales como la condición que debe ser
tratada, la necesidad de tratamiento en un sitio específico,
cantidad de fármaco que debe ser administrada y consideraciones
similares.
Se puede emplear cualquier formación tópica
común tal como una solución, suspensión, gel, pomada o bálsamo. La
preparación de tales formulaciones tópicas están descritas y
ejemplificadas en la técnica de formulaciones farmacéuticas, por
ejemplo, por Remington's Pharmaceutical Sciences. Para la aplicación
tópica, estos compuestos podrían también ser administrados como un
polvo o pulverización, particularmente en forma de aerosol. El
ingrediente activo puede ser administrado en composiciones
farmacéuticas adaptadas a la administración sistémica. Como se sabe,
si un fármaco debe ser administrado sistémicamente, puede ser
preparado como un polvo, píldora, pastilla o como un jarabe o
elixir para la administración oral. Para la administración
intravenosa, intraperitoneal o intralesional, el compuesto será
preparado como una solución o suspensión que pueda ser administrada
por inyección. En algunos casos, puede ser útil formular estos
compuestos en forma de supositorio o como una formulación de
liberación prolongada para depositar bajo la piel o con inyección
intramuscular.
Una cantidad eficaz de una composición o agente
contenido en ésta es aquella cantidad que descenderá, disminuirá o
reducirá la activación, función, estabilidad o síntesis de la
mucina. Las composiciones o agentes preferidos, descienden,
disminuyen o reducen la activación, función, estabilidad, o síntesis
de la mucina dependiente del canal de cloruro, incluyendo la
activación, función, estabilidad, o síntesis de la mucina
dependiente del canal de cloruro ICACC. Una cantidad eficaz dada
variará de una condición a otra y en algunos casos puede variar con
la gravedad de la enfermedad que es tratada y la sensibilidad del
paciente al tratamiento. Por consiguiente, una cantidad eficaz dada
será mejor determinada en el momento y lugar a través de la
experimentación rutinaria. No obstante, se anticipa que en el
tratamiento de enfermedades pulmonares obstructivas crónicas según
la presente invención, una formulación conteniendo entre 0,001 y 5
por ciento en peso, preferiblemente 0,01 a 1%, constituirá
normalmente una cantidad terapéuticamente eficaz. Cuando se
administra sistémicamente, una cantidad entre 0,01 y 100 mg por kg
de masa corporal al día, aunque preferiblemente 0,1 a 10 mg/kg/día,
producirá un resultado terapéutico en la mayoría de los casos.
Cuando se administra por inhalación, una
cantidad entre 0,01 y 100 mg por kg de masa corporal al día, aunque
preferiblemente 0,10 a 10 mg/kg/día, producirá un resultado
terapéutico en la mayoría de los casos. En algunos casos, una unidad
de aerosol dosificada contiene 0,8 mg de talniflumato. En esta
formulación, la dosis de mantenimiento para un adulto es
aproximadamente de 2 inhalaciones (1,6 mg) dos veces al día (3,2
mg).
La invención también incluye composiciones
farmacéuticas que comprenden los compuestos de la invención junto
con un soporte farmacéuticamente aceptable. Los soportes
farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos estériles, tales
como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen petrolífero,
animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite
de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es
un soporte preferido cuando la composición farmacéutica es
administrada por vía intravenosa o por inhalación. También se puede
emplear solución salina o suero salino tamponado con fosfato como
soportes, particularmente para la inhalación por aerosoles. También
se pueden emplear soluciones salinas con lactato y soluciones de
dextrosa acuosa y de glicerol como soportes líquidos,
particularmente para soluciones inyectables. Los soportes
farmacéuticos adecuados están descritos en Remington's
Pharmaceutical Sciences, Editorial Mack, 1995.
Además del agente farmacológicamente activo, las
composiciones de la presente invención puede contener soportes
adecuados farmacéuticamente aceptables comprendiendo excipientes y
auxiliares que faciliten el procesamiento de los compuestos activos
en preparaciones que puedan ser usadas farmacéuticamente para
administrar en el lugar de acción. Las formulaciones adecuadas para
la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los
compuestos activos en forma hidrosoluble, por ejemplo, sales
hidrosolubles. Además, se pueden administrar suspensiones de los
compuestos activos como suspensiones para inyección oleaginosas
apropiadas. Los solventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen
aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo, o ésteres de ácido
graso sintético, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las
suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que
aumenten la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo,
carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente,
la suspensión puede contener también estabilizadores como se ha
descrito anteriormente. También se pueden usar liposomas para
encapsular el agente para suministrar en la célula.
La formulación farmacéutica para la
administración sistémica según la invención puede ser formulada
para la administración entérica, parenteral o tópica. De hecho,
estos tres tipos de formulaciones pueden ser usadas simultáneamente
para conseguir la administración sistémica de la sustancia
activa.
Las formulaciones adecuadas para la
administración oral incluyen cápsulas de gelatina dura o blanda,
píldoras, comprimidos, incluyendo comprimidos revestidos, elixires,
suspensiones, jarabes o inhalaciones y formas de liberación
controlada de las mismas. Las formulaciones adecuadas para la
inhalación oral o la inhalación nasal incluyen soluciones acuosas
con o sin excipientes bien conocidos en la técnica.
La puesta en práctica de la presente invención
puede emplear los términos y técnicas convencionales de biología
molecular, farmacología, inmunología y bioquímica conocidos
comúnmente por los expertos en la materia. Por ejemplo, ver
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª
edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1985.
Sin más descripción, se cree que un experto en
la materia puede, usando la descripción anterior y los siguientes
ejemplos ilustrativos, hacer y utilizar los compuestos de la
presente invención y poner en práctica los métodos reivindicados.
En consecuencia, los siguientes ejemplos de trabajo precisan
específicamente formas de realización preferidas de la presente
invención.
Se produjeron y usaron células Caco2 activadas
que expresan el ARNm de MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5B y MUC5AC para
probar los inhibidores de la producción de mucina. Estas células
pueden ser coloreadas para detectar la mucina usando colorante de
ácido periódico con reactivo de Schiff (PAS). Como se muestra en la
Figura 1, aunque las células Caco2 de control mostraron una
coloración con PAS basal con unas pequeña vesículas de
glicoconjugados esparcidas (panel A), la activación de las células
Caco2 aumentó espectacularmente el número e intensidad de
glicoconjugados de mucina positivos de PAS (panel B). Las células
Caco2 activadas fueron cultivadas en presencia de ácido niflúmico
(NFA) o ácido
4,4'-diisotiocianostilbeno-2,2'-disulfónico
(DIDS). En las concentraciones indicadas (100 \muM para NFA y 300
\muM para DIDS), la coloración con PAS de las células Caco2
activadas tratadas con un inhibidor reveló significativamente menos
glicoconjugados de mucina con coloración positiva en comparación con
las células no tratadas (Figura 1D en comparación con 1B). Además,
la ligera coloración vista en las células del control fue también
inhibida (Figura 1C en comparación con 1A). La producción de mucina
por células Caco2 activadas podrían también ser inhibida por otros
fenamatos tales como flufenamato (FFA), tolfenamato (TFLA) y
parcialmente por mefenamato (MFA) y meclofenamato (MLFA) (Figura
2). Los compuestos relacionados Naproxen (MMNA) y Sulindac fueron
ineficaces. Esta menor producción de mucina en células tratadas con
NFA no fue debido a los cambios espectaculares de la condición
fisiológica de las células, puesto que no se afectó su viabilidad
mediante concentraciones incluso más altas de NFA (Figura 3).
Tomándolos en su conjunto, los resultados son coherentes con
aquellos fármacos que inhiben la activación epitelial. Además, los
resultados demuestran claramente un efecto directo del NFA y sus
análogos (derivados del ácido fenilantranílico mostrados en la
Figura 11), DIDS, y SIDS en la sobreproducción de moco, que es una
característica identificativa de múltiples enfermedades pulmonares
obstructivas crónicas.
Se produjeron y usaron células LHL4 activadas
que expresan y segregan eotaxina para probar los inhibidores de la
producción de eotaxina. Se evaluó la eotaxina de las células in
vitro por una técnica ELISA bien conocida en la técnica (R&D
Systems). Como se muestra en la Figura 4, las células LHL4
activadas fueron cultivadas en ausencia (control) o presencia de
concentraciones cada vez mayores de ácido niflúmico (NFA). Se
observó una inhibición significante de la producción de eotaxina
con concentraciones cada vez mayores de NFA. Se vio una inhibición
similar con DIDS y SIDS en un experimento idéntico. Las células
Mad/C3 muestran una inhibición similar de la producción de eotaxina
por NFA, DIDS, y SIDS. Tomándolos en su conjunto, estos resultados
demuestran claramente un efecto directo del NFA en la producción de
eotaxina.
Se adquirieron ratones machos y hembras
certificados como exentos de virus de las siguientes cepas, DBA,
C57B6 y B6D2F1 del Instituto Oncológico Nacional o de los
Laboratorios Jackson (Bar Harbor ME). Se obtuvieron ratones
transgénicos IL-9 (Tg5) y de la cepa genitora
(FVB), del Instituto Ludwig (Bruselas, Bélgica). Se alojaron los
animales en una instalación de aire pasado por un filtro absoluto y
se les dejó libre acceso a alimentos y agua durante 3 a 7 días antes
de la manipulación experimental. Las instalaciones para los
animales fueron mantenidas a 22°C y el ciclo de luz:oscuridad fue
automáticamente controlado (10:14 horas luz:oscuridad).
Los animales o no recibieron pretratamiento o
fueron sensibilizados por aspiración nasal al antígeno de
Aspergillus fumigatus para evaluar el efecto del
pretratamiento en la hipersensibilidad bronquial, composición del
fluido de lavado broncoalveolar, producción de mucina e IgE en
suero. Se les hizo un test de provocación a tos ratones con
Aspergillus o solución salina por vía intranasal (en los días 0, 7,
14, 21 y 22) y se fenotiparon 24 horas después de la última dosis.
Los ratones sensibilizados fueron tratados en los días
0-21 con bien PBS o 100 \mug de NFA por
instilación intratraqueal (IT). Se usó la inhibición de la
producción de moco y la expresión de la mucina en el pulmón para
evaluar el efecto del tratamiento con NFA, o podría ser usado para
evaluar los efectos de otros candidatos del fármaco. Para
determinar la respuesta broncoconstrictora, se midió la presión del
sistema respiratorio en la tráquea y se registró antes y durante la
exposición al fármaco. Se anestesiaron y se instrumentaron los
ratones tal y como se ha descrito anteriormente. (Levitt et
al., 1988; Levitt y Mitzner, 1989; Kleeberger et al.,
1990; Levitt, 1991; Levitt y Ewart, 1995; Ewart et al.,
1995). Se midió la sensibilidad de la vía respiratoria respecto a
uno o más de lo siguiente: 5-hidroxitriptamina,
acetilcolina, atracurio o un análogo de la sustancia P. Se usó una
medida simple y repetible del cambio en el valor máximo de la
presión inspiratoria seguido del test de provocación
broncoconstrictora que ha sido denominado Indice del Tiempo de
Presión de la Vía respiratoria (APTI) (Levitt et al., 1988;
Levitt y Mitzner, 1989). El APTI fue evaluado por el cambio en el
valor máximo de la presión respiratoria integrado desde el tiempo
de inyección hasta que el valor máximo de la presión vuelve a la
línea base o meseta. El APTI fue comparable a la resistencia de la
vía respiratoria, no obstante, el APTI incluye un componente
adicional relacionado con la recuperación de la
broncoconstricción.
Antes del sacrificio, se recogió sangre entera
para las mediciones del IgE en suero por punción con una aguja de
la vena cava inferior en los animales anestesiados. Las muestras
fueron centrifugadas para separar las células y se recogió el suero
y se usó para medir los niveles de IgE totales. Las muestras que no
se midieron inmediatamente fueron congeladas a -20°C.
Se midieron todas las muestras de suero IgE
usando un ensayo ELISA Sándwich para detectar anticuerpos. Se
revistieron placas de microtitulación, 50 \mul por pocillo, con
anticuerpo IgE antimurina de rata (Southern Biotechnology) a una
concentración de 2,5 \mug/ml en un tampón de revestimiento de
carbonato sódico-bicarbonato sódico con azida
sódica. Se cubrieron las placas con una envoltura plástica y se
incubaron a 4°C durante 16 horas. Se lavaron las placas tres veces
con un tampón de lavado de 0,05% Tween-20 en
solución salina tamponada con fosfato, incubando durante cinco
minutos para cada lavado. El bloqueo de sitios de enlace no
específicos fue realizado añadiendo 200 \mul por pocillo de
albúmina de suero bovino al 5% en solución salina tamponada con
fosfato, cubriendo con una envoltura plástica e incubando durante 2
horas a 37°C. Después de lavar tres veces con tampón de lavado, se
añadieron muestras de ensayo de 50 \mul duplicadas a cada pocillo.
Las muestras de ensayo fueron evaluadas después de ser diluidas
1:10,1:50 y 1:100 con albúmina de suero bovino al 5% en tampón de
lavado. Además de las muestras de ensayo, se evaluó un grupo de
estándares de IgE (PharMingen) a concentraciones de 0,8 ng/ml a 200
ng/ml en albúmina de suero bovino al 5% en tampón de lavado, para
generar una curva estándar. Se usó una placa preliminar sin muestra
o estándar para poner a cero el lector de placas (fondo). Después
de añadir las muestras y los estándares la placa fue cubierta con
una envoltura plástica e incubada durante 2 horas a temperatura
ambiente. Después de lavar tres veces con tampón de lavado, se
añadieron 50 \mul de un conjugado de peroxidasa para marcar la IgE
por alfalfa del anticuerpo secundario antimurina a una
concentración de 250 ng/ml en albúmina de suero bovino al 5% en
tampón de lavado. La placa fue cubierta con una envoltura plástica
e incubada 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar tres
veces con tampón de lavado, se añadió 100 \mul de sustrato 0,5
mg/ml de o-fenilenodiamina en 0,1 M de tampón de
citrato a cada pocillo. Después de 5-10 minutos la
reacción fue detenida con 50 \mul de de ácido sulfúrico al 12,5%
y se midió la absorbencia a 490 nm en un lector de placas MR5000
(Dynatech). Se construyó una curva estándar de las concentraciones
de IgE con la concentración de antígenos en el eje X (escala log) y
absorbencia en el eje Y (escala lineal). La concentración de IgE en
las muestras fue interpolada de la curva estándar.
Se realizó un lavado broncoalveolar (LBA) y un
análisis celular tal y como se ha descrito anteriormente
(Kleeberger et Al., 1990). Se realizó la histología pulmonar
después de o bien haber llenado los pulmones con fijador in
situ y colocarlos en formalina, o de haberlos extraído y
congelado inmediatamente en nitrógeno líquido. Puesto que la
instrumentación anterior puede inducir a errores, se usaron animales
separados para estos estudios. Así, un pequeño grupo de animales
fue tratado en paralelo exactamente del mismo modo que el grupo que
recibió varios tratamientos previos excepto que estos animales no
fueron usados para otros ensayos aparte del ensayo de sensibilidad
bronquial. Después de ensayar la sensibilidad bronquial, se
extrajeron los pulmones y se sumergieron en nitrógeno líquido como
se indicó arriba. Se realizó el crioseccionado, la coloración y el
examen histológico de una manera obvia para los expertos en la
materia.
Se usó terapéuticamente NFA, que bloquea la
activación de las células epiteliales y reduce la producción de
mucina y eotaxina in vitro, para evaluar la importancia de
la activación de las células epiteliales in vivo en la
producción de mucina inducida por antígenos, sensibilidad
bronquial, IgE en suero e inflamación de la vía respiratoria como
se evaluó por LBA en ratones. Se determinaron los efectos del
tratamiento con NFA en la sensibilidad de la vía respiratoria, LBA,
producción de moco, y niveles de IgE en suero respecto a los
controles correspondientes tratados con vehículo. Las Figuras 5 y 6
muestran que el NFA es capaz de suprimir la hipersensibilidad de la
vía respiratoria y la eosinofilia pulmonar por LBA respectivamente,
no obstante, no se produjo ningún efecto en los niveles de IgE en
suero. Además el NFA podría suprimir también la sobreproducción de
moco en el pulmón provocado por la exposición a antígenos (Figura
7).
Se criaron ratones transgénicos IL9 machos y
hembras certificados como exentos de virus
(IL9TG5-FVB/N) de 5-6 semanas de
edad en nuestros laboratorios. Se adquirieron ratones machos y
hembras FVB/N de 5-6 semanas de edad de los
Laboratorios Jackson (Bar Harbor ME). Se alojaron los animales en
una instalación de aire pasado por un filtro absoluto y se les dejó
libre acceso a alimentos y agua durante 3 a 7 días antes de la
manipulación experimental. Las instalaciones para los animales
fueron mantenidas a 22°C y el ciclo de luz:oscuridad fue
automáticamente controlado (10:14 horas luz:oscuridad).
Los animales fueron fenotipados antes de recibir
algo o 24 hrs después de recibir un pseudotratamiento (vehículo)
intratraqueal (IT), o fármacos en el mismo vehículo como el que se
usó en los controles tratados idénticamente. Los ratones fueron
tratados IT una vez al día durante tres días. NFA (100 \mug) o
anticuerpo para IL-9 fueron administrados en PBS IT.
Las respuestas al tratamiento fueron medidas valorando la
inhibición de la mucina por examen histológico (Coloración de PAS
superior a 10 secciones los pulmones tratados y del control o
transferencias proteínicas Western de expresión de MUC1, MUC2 y
MUC3 de los mismos pulmones. La Figura 8 muestra que los ratones
transgénicos IL-9 constitutivamente sobreproducen
mucina en comparación con los ratones FVB de control. Una reducción
de los altos niveles de producción de mucina constitutiva que ocurre
en el transgénico IL9 asmático (Figura 8) (control con vehículo y
sin recibir nada) a niveles comparables a la producción de mucina
de línea base más baja encontrada en los pulmones FVB/N (control
positivo normal) fue considerado significante para cualquier
fármaco. La expresión de la producción de moco en el transgénico
IL9 está específicamente asociada a unos mayores niveles de ARNm
estables de MUC2 y MUC5AC como se ha demostrado por reacción en
cadena de la polimerasa con transcripción reversa RT- PCR (Figura
9).
Se demostró que el anticuerpo
IL-9 de neutralización produce una reducción
significante de la producción de mucina en los pulmones de
transgénicos IL9 (Figura 10). El NFA también disminuyó la
producción de mucina en este modelo.
Se adquirieron ratones machos certificados
exentos de virus B6D2F1 de 5-6 semanas de edad de
Laboratorios Jackson (Bar Harbor ME). Se alojaron los animales en
instalaciones con aire pasado por un filtro absoluto y se les dejó
libre acceso a alimentos y agua 5 a 7 días antes de la manipulación
experimental. Las instalaciones de los animales fueron mantenidas a
22°C y el ciclo de luz:oscuridad fue automáticamente controlado
(12:12 horas de luz:
oscuridad).
oscuridad).
\newpage
Los animales fueron alimentados ad
libitum bien con alimento para ratones mouse chow conteniendo
talniflumato o con alimento para ratones mouse chow normal. Los
animales o no recibieron pretratamiento o fueron sensibilizados por
aspiración nasal de antígeno de Aspergillus fumigatus para
evaluar el efecto del pretratamiento en la hipersensibilidad
bronquial, composición del fluido del lavado broncoalveolar,
producción de mucina e IgE en suero. Se les hizo un test de
provocación a los ratones con Aspergillus (en los días 0, 7,16 y
17) y fueron fenotipados 24 horas después de la última dosis. Se
usó la inhibición de la producción de moco en el pulmón para evaluar
el efecto del tratamiento con talniflumato, o podría ser usado para
evaluar los efectos del tratamiento con otros candidatos del
fármaco. Para determinar la respuesta broncoconstrictora, se midió
la presión del sistema respiratorio en la tráquea y se registró
antes y durante la exposición al fármaco. Se anestesiaron y se
instrumentaron los ratones tal y como se ha descrito anteriormente.
(Levitt et al., 1988; Levitt y Mitzner, 1989; Kleeberger
et al., 1990; Levitt, 1991; Levitt y Ewart, 1995; Ewart et
al., 1995). Se midió la sensibilidad de la vía respiratoria
respecto a uno o más de lo siguiente:
5-hidroxitriptamina, acetilcolina, atracurio o un
análogo de la sustancia P. Se usó una medida simple y repetible del
cambio en el valor máximo de la presión inspiratoria seguido del
test de provocación broncoconstrictora que ha sido denominado
Indice del Tiempo de Presión de la Vía respiratoria (APTI) (Levitt
et al., 1988; Levitt y Mitzner, 1989). El APTI fue evaluado
por el cambio en el valor máximo de la presión respiratoria
integrado desde el tiempo de inyección hasta que el valor máximo de
la presión vuelve a la línea base o meseta. El APTI fue comparable a
la resistencia de la vía respiratoria, no obstante, el APTI incluye
un componente adicional relacionado con la recuperación de la
broncoconstricción. Se realizó un lavado broncoalveolar (LBA) y un
análisis celular tal y como se ha descrito anteriormente
(Kleeberger et Al., 1990). Se realizó la histología pulmonar
después de recoger los pulmones y congelarlos inmediatamente en
nitrógeno líquido. Después del ensayo de sensibilidad bronquial, se
extrajeron los pulmones y se sumergieron en nitrógeno líquido como
se ha indicado arriba. Se realizó el crioseccionado, la coloración y
el examen histológico de una manera obvia para los expertos en la
materia. Se midieron las respuestas al tratamiento por la
valoración de la inhibición de la mucina por examen histológico
(Coloración de PAS de los pulmones de control y tratados).
El tratamiento oral con talniflumato redujo la
coloración de la mucina. La Figura 15A muestra la Coloración de PAS
en un pulmón de ratón obtenido de ratones Asp-sens
que fueron alimentados con alimento para ratones mouse chow normal.
La Figura 15B muestra los resultados obtenidos de los ratones
Asp-sens alimentados con alimento para ratones
mouse chow conteniendo talniflumato. La Figura 16 muestra los
resultados de la alimentación con alimento para ratones mouse chow
cubierto con talniflumato en la eosinofilia pulmonar determinada
por lavado broncoalveolar. El talniflumato redujo el número de
células eosinofílicas obtenidas de ratones sensibilizados al
Aspergillus fumigatus en comparación con los ratones
sensibilizados alimentados con alimento para ratones mouse chow
estándar.
Se adquirieron células NCI-H292,
una línea celular de carcinoma mucoepidermoide pulmonar humana de
la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas VA) y se
cultivaron en un medio RPMI1640 complementado con 10% de FBS y 1%
de penicilina/estreptomicina (Gibco/BRL). Se hicieron crecer las
células en una incubadora conteniendo aire humedecido,
complementado con 5% de CO_{2} a 37°C. Se establecieron líneas
celulares estables NCI-H292 de sobreexpresión de
hICACC-1 por transfección de ADNc
3-hICACC-1 usando un kit de
transfección Fujin según las instrucciones del fabricante
(Boehringer-Mannheim). Se produjo una línea celular
de control, NCI-H292/ctl, por la transfección de
ADNpc 3 (ctl) en la línea celular NCI-H292 usando
el mismo procedimiento. La expresión del gen
hICACC-1 fue confirmada para el transfectante ADNpc
3-hICACC-1 por análisis
Northern.
Para el ensayo ELLA (ensayo de lectina enlazada
específica de la enzima), las células fueron colocadas en placas de
cultivo de tejido de 24 pocillos e incubadas durante 72 horas hasta
la confluencia. Se transfirieron los sobrenadantes a placas de 96
pocillos previamente cubiertas con 1 \mug/ml de anticuerpo
anti-MUC5AIC (New marker, Fremont CA) y bloqueadas
con 1% de BSA. El anticuerpo enlazado MUC5A/C fue luego detectado
con HRP-lectina (Sigma).
Para la RT-PCR total se aisló el
ARN de las líneas celulares usando reactivo Trizol (Gibco/BRL)
siguiendo el protocolo del fabricante. Se realizó la
RT-PCR por transcripción inversa de 1 pg de ARN
total y amplificando el ADNc con los cebadores apropiados por PCR.
Los productos fueron separados por electrofóresis en 2% de geles de
agarosa y visualizados por coloración con bromuro del etidio. Los
pares de cebador usados para generar el mensaje
ICACC-1 humano fueron:
5'-GGCACAGATCTTTTCATTGCTA-3' sentido
y 5'-GTGAATGCCAGGAATGGTGCT-3'
antisentido lo que dio un producto de 182 pares de bases. Los pares
de cebador usados para generar mensajes de mucina están
relacionados en la Tabla 1.
las células
NCI-H292 expresan MUC1 constitutivamente, mientras
que la expresión de ARNm de MUC2 y MUC5A/C están por debajo de los
niveles de detección en la línea base. La Figura 12A muestra los
resultados de un análisis de transferencia de Northern de células
transfectadas ANDpc 3-hICACC-1 que
muestran un mayor nivel de expresión para ARNm ICACC. El análisis de
transferencia Western de lisado celular completo a partir de clones
que sobreexpresan ICACC-1 reveló una producción de
la proteína MUC2 acentuada (Figura 12B). La expresión de MUC5A/C
aumentó significativamente en las células de sobreexpresión
ICACC-1, mientras que MUC1 no varió en el análisis
RT-PCR (Figura 12C). El análisis específico ELLA
también reveló la sobreproducción de proteína MUC5A/C en los clones
de sobreexpresión ICACC-1 en comparación con las
células no transfectadas NCI-H292 o las células
transfectadas con el vector vacío (Figura
12D).
Para la determinación de la producción de
glicoconjugado mucoso, se cultivaron células
NCI-H292/ctl y
NCI-H292/hICACC-1 (AAF 15) en placas
de 24 pocillos durante 3 días. Las células fueron luego fijadas con
Formalina y se visualizaron los glicoconjugados mucosos por
coloración AB/PAS (Sigma). Aunque las células de control
NCI-H292 mostraron una coloración por PAS basal con
unos pocos gránulos esparcidos (Figura 13A), la sobreexpresión de
ICACC-1 aumentó espectacularmente el número e
intensidad de muco-glicoconjugados positivos por PAS
(Figura 13B). Para los estudios del bloqueo del canal de cloruro,
se cultivaron células en presencia de ácido niflúmico (NFA) (Sigma)
a una concentración de 100 \muM, ácido mefanámico (MFA) a 125 o
250 \muM o talniflumato a 12,5,25 o 50 \muM, o medios solos. La
coloración por PAS de las células tratadas con NFA, MFA o
talniflumato reveló significativamente pocos
muco-glicoconjugados coloreados positivos en
comparación con las células no tratadas (Figuras 13C y D e inserto
de la figura 14). La coloración por PAS de las células del control
tratadas con inhibidor no mostró prácticamente ninguna diferencia
con las células no tratadas (Figuras 13A y C).
Los valores IC_{50} para talniflumato (figura
14), Nimesulida (referencia Figura 17) y MSI-2079
(Figura 18, se muestra la estructura de MSI-2079 en
la figura 19 referencia) fueron determinadas en base a su
inhibición de la secreción de MUC5A/C en células H292 de expresión
de hCLCA1. Las células confluyentes fueron tratadas con el
inhibidor a concentraciones de 0 a 250 \muM en OPTI MEM. Se
detectó el MUC5A/C secretado cuarenta y ocho horas después de
añadir el inhibidor por un ensayo ELLA como se describe en el
ejemplo 5. Los valores IC_{50} fueron determinados con el
software de análisis de datos GraphPad Prism. El inserto de la
figura 14 muestra los niveles de la mucina intracelular en
respuesta al tratamiento con talniflumato detectado por coloración
por PAS.
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Claims (24)
1. Uso de una composición en la producción de
un fármaco para el tratamiento de la sobreproducción de mucina
asociada a una enfermedad del tracto respiratorio seleccionada del
grupo consistente en enfermedad pulmonar obstructiva crónica
(EPOC), enfermedad pulmonar inflamatoria, fibrosis quística y
enfermedad infecciosa aguda o crónica; o una enfermedad del tracto
gastrointestinal asociada a una fibrosis quística seleccionada del
grupo consistente en síndrome de mala absorción, esteatorrea y
diarrea en un sujeto, donde la composición comprende talniflumato o
una sal derivada farmacéuticamente aceptable.
2. Uso según la reivindicación 1, donde la EPOC
es seleccionada del grupo consistente en efisema, bronquitis
crónica y asma.
3. Uso según la reivindicación 1, donde el
estado de enfermedad es el resultado de una respuesta inducida por
antígenos en un pulmón.
4. Uso según la reivindicación 3, donde la
respuesta inducida por antígenos es seleccionada del grupo
consistente en hipersensibilidad bronquial, eosinofilia y recuento
elevado de células en lavado bronquial, IgE elevado en suero,
cambios histológicos asociados a inflamación e hiperplasia de
células caliciformes y células de la glándula submucosa asociada a
la sobreproducción de moco.
5. Uso según la reivindicación 1, donde la
producción de mucina es dependiente del canal de cloruro.
6. Uso según la reivindicación 5, donde el
canal de cloruro es un canal de cloruro ICACC.
7. Uso según la reivindicación 1, donde la
composición inhibe una enzima ciclooxigenasa.
8. Uso según la reivindicación 7, donde la
enzima ciclooxigenasa es ciclooxigenasa 2.
9. Uso según la reivindicación 1, donde la
composición es administrada tópicamente, oralmente, parenteralmente
o por inhalación al sujeto.
10. Uso según la reivindicación 9, donde la
composición administrada tópicamente es una solución, suspensión,
gel, pomada o bálsamo.
11. Uso según la reivindicación 9, donde la
composición administrada oralmente es una pastilla, cápsula, jarabe
o elixir.
12. Uso según la reivindicación 9, donde la
composición administrada parenteralmente es dada por vía
intravenosa, intraperitoneal, intralesional, subcutánea o
intramuscular.
13. Uso según la reivindicación 9, donde la
composición inhalada es un líquido o polvo.
14. Uso según la reivindicación 13, donde la
composición inhalada está en aerosol.
15. Uso según la reivindicación 13, donde la
composición inhalada es administrada por inhalador dosificado.
16. Uso según la reivindicación 9, donde la
composición es administrada en una cantidad de 0,01 mg/kg/día a 100
mg/kg/día.
17. Uso según la reivindicación 16, donde la
composición es administrada en una cantidad de 0,10 mg/kg/día a 10
mg/kg/día.
18. Uso según la reivindicación 1, donde la
composición además comprende al menos un agente terapéutico
adicional.
19. Uso según la reivindicación 18, donde el al
menos un agente terapéutico adicional es seleccionado del grupo
consistente en un agente antiasmático, expectorante, mucolítico,
antibiótico antihistamínico, descongestionante, agonista
adrenorreceptor beta y agonista receptor de purina.
20. Uso según la reivindicación 19, donde el
expectorante es guaifenesina.
21. Uso según la reivindicación 1, donde la
composición además comprende al menos un elemento seleccionado del
grupo consistente en un agente tensioactivo, intensificador de la
absorción, agente estabilizante, agente aromatizante y soporte
farmacéuticamente aceptable.
22. Uso según la reivindicación 21, donde el
agente estabilizante es ciclodextrano.
23. Uso según la reivindicación 21, donde el
intensificador de la absorción es quitosano.
24. Uso según la reivindicación 1, donde el
sujeto es un humano.
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