JP2004505630A5 - - Google Patents
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発明の概要
変種(variant)のEGIII又はEGIII様セルラーゼが提供され、Trichoderma reesei由来のEGIII中の残基W7,G31,A35,T145,Y147,Q162及び/又はY168の一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む。好ましい態様において、変種は、EGIII中の残基W7Y,G31Q,A35V,T145E,Y147W,Q162P及び/又はY168Fの一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む。この態様の一つの側面において、上記セルラーゼは、真菌、細菌又は放線菌に由来する。より好ましい側面において、上記セルラーゼは真菌に由来する。もっとも好ましい態様において、繊維状真菌である。好ましくは、繊維状真菌は、真正子嚢菌類(Euascomycete)、特にアスペルギルス(Aspergillus)種、グリオクラジウム(Gliocladium)種、フザリウム(Fusarium)種、アクレモニウム(Acremonium)種、ミセリオフトーラ(Myceliophtora)種、バーティシリウム(Verticillium)種、ミロセシウム(Myrothecium)種又はペニシリウム(Penicillium)種に属する。この態様の別の側面において、この発明のEGIII様セルラーゼはエンドグルカナーゼである。
変種(variant)のEGIII又はEGIII様セルラーゼが提供され、Trichoderma reesei由来のEGIII中の残基W7,G31,A35,T145,Y147,Q162及び/又はY168の一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む。好ましい態様において、変種は、EGIII中の残基W7Y,G31Q,A35V,T145E,Y147W,Q162P及び/又はY168Fの一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む。この態様の一つの側面において、上記セルラーゼは、真菌、細菌又は放線菌に由来する。より好ましい側面において、上記セルラーゼは真菌に由来する。もっとも好ましい態様において、繊維状真菌である。好ましくは、繊維状真菌は、真正子嚢菌類(Euascomycete)、特にアスペルギルス(Aspergillus)種、グリオクラジウム(Gliocladium)種、フザリウム(Fusarium)種、アクレモニウム(Acremonium)種、ミセリオフトーラ(Myceliophtora)種、バーティシリウム(Verticillium)種、ミロセシウム(Myrothecium)種又はペニシリウム(Penicillium)種に属する。この態様の別の側面において、この発明のEGIII様セルラーゼはエンドグルカナーゼである。
発明の別の態様において、この発明のEGIII変種セルラーゼをコードするDNAが提供される。好ましい態様において、DNAはベクター中にある。さらなる態様において、上記DNAは上記ベクターにより形質転換された宿主細胞中にある。
この発明の別の態様において、この発明のEGIII変種セルラーゼを生産する方法が提供される。当該方法は、セルラーゼを生産するために適した条件下で適当な培養培地中で請求項11記載の宿主細胞を培養し、そして生産されたセルラーゼを得る工程を含む。
発明のさらに別の態様において、界面活性剤及びセルラーゼを含む洗浄剤が提供される。好ましい態様において、上記セルラーゼは、Trichoderma reesei由来のEGIII中の残基W7,G31,A35,T145,Y147,Q162及び/又はY168の一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む変種EGIII様セルラーゼを含む。より好ましい態様において、変種は、EGIII中の残基W7Y,G31Q,A35V,T145E,Y147W,Q162P及び/又はY168Fの一つ又は複数に対応する位置において置換又は欠失を含む。
この発明の好ましい側面において、洗浄剤はランドリー用又は皿洗い用の洗浄剤である。この発明の別の態様において、上記変種EGIII又はEGIII様セルラーゼは、セルロース含有織物の処理、特にストーンウオッシュ又はインディゴ染色されたデニムに使用される。あるいは、この発明のセルラーゼは、飼料添加物として、ウッドパルプの処理において、及びバイオマスのグルコースへの転化において使用することができる。
この発明の好ましい側面において、洗浄剤はランドリー用又は皿洗い用の洗浄剤である。この発明の別の態様において、上記変種EGIII又はEGIII様セルラーゼは、セルロース含有織物の処理、特にストーンウオッシュ又はインディゴ染色されたデニムに使用される。あるいは、この発明のセルラーゼは、飼料添加物として、ウッドパルプの処理において、及びバイオマスのグルコースへの転化において使用することができる。
発明の詳細な説明
出願人は、Trichoderma reesei由来のEGIIIに相同性を有するセルラーゼのファミリーの新規なメンバーを単離した。これらのセルラーゼの分析は、有意な相同性にも拘わらず、セルラーゼの間で異なる性能をもたらした。特に、Humicola insolens,Humicola grisea,Memnonella echinata、Fusarium javanicum及びEmericella desertoru由来のEGIII様セルラーゼは熱ストレス下の条件において優秀な性能を有することが発見された。これらのEGIII様セルラーゼにおけるアミノ酸配列をEGIIIのそれと整列化することにより、熱に対してより安定なセルラーゼとEGIIIの間の残基の差異を同定して、即ちEGIII様セルラーゼの熱安定性を改善するのに重要な残基を同定することが可能である。従って、EGIII内並びにEGIII様セルラーゼ内で同定された残基を最適化することにより、EGIII及びEGIII様セルラーゼの両方の熱安定性をさらに改善することが可能である。
出願人は、Trichoderma reesei由来のEGIIIに相同性を有するセルラーゼのファミリーの新規なメンバーを単離した。これらのセルラーゼの分析は、有意な相同性にも拘わらず、セルラーゼの間で異なる性能をもたらした。特に、Humicola insolens,Humicola grisea,Memnonella echinata、Fusarium javanicum及びEmericella desertoru由来のEGIII様セルラーゼは熱ストレス下の条件において優秀な性能を有することが発見された。これらのEGIII様セルラーゼにおけるアミノ酸配列をEGIIIのそれと整列化することにより、熱に対してより安定なセルラーゼとEGIIIの間の残基の差異を同定して、即ちEGIII様セルラーゼの熱安定性を改善するのに重要な残基を同定することが可能である。従って、EGIII内並びにEGIII様セルラーゼ内で同定された残基を最適化することにより、EGIII及びEGIII様セルラーゼの両方の熱安定性をさらに改善することが可能である。
本発明により改善された蛋白質は、前駆体蛋白質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含む。前駆体蛋白質は天然に生じる蛋白質又は組換え蛋白質であってよい。改善された蛋白質のアミノ酸配列は、前駆体アミノ酸配列の一つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失又は挿入により前駆体蛋白質のアミノ酸配列に由来する。そのような修飾は、前駆体蛋白質自体の操作よりもむしろ前駆体蛋白質のアミノ酸配列をコードする前駆体DNA配列に一般的である。前駆体DNA配列のそのような修飾の適切な方法は、本明細書において援用される、共通の譲受人の米国特許第4,760,025号、第5,185,258号に開示された方法を含む。
【0121】
【表1】
表1
EGIII様セルラーゼ ハーフタイム(分)
H.grisea 安定*
H.insolens 安定*
E.desertoru 200
F.javanicum 93
M.echinata 192
T.reesei(EGIII) 23
*「安定」は200分間で20%未満の活性損失を示す
上記の結果から認識し得るとおり、EGIII様セルラーゼはT.reesei由来のEGIIIに対して相対的に相同であるにも拘わらず、有意に改善された安定性を有した。従って、より安定な相同体において異なる残基がEGIII様セルラーゼの改善された安定性に必須であり、そしてそのようにして、これらの残基を修飾することによりEGIII様セルラーゼ及びEGIII自体のさらなる改善がEGIII及びEGIII様セルラーゼの安定性の追加の改善をもたらすことは明らかである。
実施例3:熱安定性のEGIII様セルラーゼからの残基を有するEGIIIの安定性
以下のプライマーを用いて、T.reesei由来のEGIII及びH.grisea由来のEGIII様セルラーゼの中のシステイン置換を生じさせた。PCRは公知の技術に従い実施した。
【表1】
表1
EGIII様セルラーゼ ハーフタイム(分)
H.grisea 安定*
H.insolens 安定*
E.desertoru 200
F.javanicum 93
M.echinata 192
T.reesei(EGIII) 23
*「安定」は200分間で20%未満の活性損失を示す
上記の結果から認識し得るとおり、EGIII様セルラーゼはT.reesei由来のEGIIIに対して相対的に相同であるにも拘わらず、有意に改善された安定性を有した。従って、より安定な相同体において異なる残基がEGIII様セルラーゼの改善された安定性に必須であり、そしてそのようにして、これらの残基を修飾することによりEGIII様セルラーゼ及びEGIII自体のさらなる改善がEGIII及びEGIII様セルラーゼの安定性の追加の改善をもたらすことは明らかである。
実施例3:熱安定性のEGIII様セルラーゼからの残基を有するEGIIIの安定性
以下のプライマーを用いて、T.reesei由来のEGIII及びH.grisea由来のEGIII様セルラーゼの中のシステイン置換を生じさせた。PCRは公知の技術に従い実施した。
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