JP5193997B2 - エンドグルカナーゼppceおよびそれを含んでなるセルラーゼ調製物 - Google Patents
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Description
PPCE)及びそれを含むセルラーゼ調製物、並びにそれらを利用したセルロース含有繊維の処理方法を提供するものである。本発明者は、ペニシリウム・ピノフィラム(Penicillium
pinophilum)PF1365株(FERM BP−10780株)から単離された新規なエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質が極めて高いセルロース含有繊維の外観改善効果及び、着色されたセルロース含有繊維の「ストーンウォッシュ」の外観付与効果を有することを見出した。特にエンドグルカナーゼPPCE(以下「PPCE」と略記することもある)は、代表的な繊維加工用セルラーゼとして主に酸性条件下で広く使用されているエンドグルカナーゼSCE3〔特許文献5〕やEGIII〔非特許文献1〕に比べ、顕著に高い繊維処理効果を有していた。更に、そのエンドグルカナーゼPPCEは、その至適pH、至適温度が従来より知られている繊維加工用セルラーゼと比較して顕著に低く、pH3、30℃付近であるという驚くべき知見を得た。またこれは、繊維加工用としての使用例はないが、ペニシリウム・ピィノフィラムIMI87160ii株由来であるエンドグルカナーゼIの至適温度(50〜55℃)、至適pH(4.0〜5.0)〔非特許文献3〕と比較しても顕著に低いものであった。
pinophilum) PF1365株(FERM BP−10780株)由来のエンドグルカナーゼ活性を有する新規なタンパク質及びその遺伝子、並びに前記タンパク質を含有し、良好な特性を有するセルラーゼ調製物を提供するものである。また、本発明は、前記タンパク質をコードする遺伝子によって形質転換された宿主細胞、及び前記宿主細胞を培養して目的タンパク質を採取する方法を提供するものである。更に、本発明のタンパク質又は本発明のセルラーゼ調製物によりセルロース含有繊維を処理する方法を提供するものである。
(1)以下の(a)、(b)、及び(c)の特性を有するタンパク質。
(a)ペニシリウム・ピノフィラム(Penicillium pinophilum)由来であり、
(b)エンドグルカナーゼ活性を有し、
(c)N末端のアミノ酸配列が、(1)配列番号2で表わされる配列、または、(2)配列番号2で表される配列において、1個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加した配列である。
(2)以下の(d)の特性を有する(1)に記載のタンパク質。
(d)ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)により測定した平均分子量が25kD〜27kDのタンパク質。
(3)以下の(e)〜(i)から選択される、タンパク質。
(e)配列番号4で表わされる16位〜236位のアミノ酸配列を含む、タンパク質。
(f)配列番号4で表わされる1位〜236位のアミノ酸配列を含む、タンパク質。
(g)配列番号30で表されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
(h)配列番号4で表される16位〜236位又は1位〜236位のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、及び/又は修飾されたアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有する改変タンパク質。
(i)配列番号4で表される16位〜236位若しくは1位〜236位のアミノ酸配列、又は配列番号30で表されるアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有する相同タンパク質。
(4)(1)〜(3)のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(5)以下の(j)、(k)から選択される、ポリヌクレオチド。
(j)配列番号3又は28で表わされる塩基配列、又は配列番号3又は28で表される46位〜834位の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
(k)配列番号3又は28で表わされる塩基配列又は配列番号3又は28で表される46位〜834位の塩基配列において、1個又は複数個の塩基が欠失、置換、及び/又は付加された塩基配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(6)(4)又は(5)に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
(7)(6)に記載の発現ベクターにより形質転換された、宿主細胞。
(8)宿主が酵母又は糸状菌である、(7)に記載の宿主細胞。
(9)糸状菌が、トリコデルマ(Trichoderma)属、フミコーラ(Humicola)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、アクレモニウム(Acremonium)属又はペニシリウム(Penicillium)属に属する微生物である、(8)に記載の宿主細胞。
(10)糸状菌が、トリコデルマ(Trichoderma)属に属する微生物である、(9)に記載の宿主細胞。
(11)糸状菌が、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)である、(10)に記載の宿主細胞。
(12)(7)〜(11)のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する工程、及び前記培養によって得られる宿主細胞又はその培養物から(1)〜(3)のいずれか一項に記載のタンパク質を採取する工程を含む、タンパク質の製造方法。
(13)(12)に記載の方法で生産されたタンパク質。
(14)(1)〜(3)及び(13)のいずれか一項に記載のタンパク質を含む、セルラーゼ調製物。
(15)(1)〜(3)及び(13)のいずれか一項に記載のタンパク質、又は(14)に記載のセルラーゼ調製物を含む、洗剤組成物。
(16)セルロース含有繊維の処理方法であって、セルロース含有繊維を、(1)〜(3)及び(13)のいずれかの一項に記載のタンパク質、(14)に記載のセルラーゼ調製物、又は(15)に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
(17)セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改善を目的として減量加工する方法であって、セルロース含有繊維を、(1)〜(3)及び(13)のいずれか一項に記載のタンパク質、(14)に記載のセルラーゼ調製物、又は(15)に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
(18)着色されたセルロース含有繊維の色を局所的に変化させる方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、(1)〜(3)及び(13)のいずれか一項に記載のタンパク質、(14)に記載のセルラーゼ調製物、又は(15)に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
(19)着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、(1)〜(3)及び(13)のいずれか一項に記載のタンパク質、(14)に記載のセルラーゼ調製物、又は(15)に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
(20)セルロース含有繊維が毛羽立ち始める速度を遅延させる方法、又はセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減させる方法であって、セルロース含有繊維を、(1)〜(3)及び(13)のいずれか一項に記載のタンパク質、(14)に記載のセルラーゼ調製物、又は(15)に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
(21)セルロース含有繊維がごわつき始める速度を低減させるか又はセルロース含有繊維のごわつきを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、(1)〜(3)及び(13)のいずれか一項に記載のタンパク質、(14)に記載のセルラーゼ調製物、又は(15)に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
(22)洗剤組成物と接触させる工程が、その繊維の浸漬、洗濯、又はすすぎを通じて行われる(16)〜(21)のいずれか一項に記載の方法。
(23)古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、(1)〜(3)及び(13)のいずれか一項に記載のタンパク質、又は(14)に記載のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする、古紙の脱インキ方法。
(24)紙パルプのろ水性の改善方法であって、紙パルプを、(1)〜(3)及び(13)のいずれか一項に記載のタンパク質、又は(14)に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法。
(25)動物飼料の消化能を改善する方法であって、動物飼料を、(1)〜(3)及び(13)のいずれか一項に記載のタンパク質、又は(14)に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法。
(26)セルロース系の物質を分解・糖化し、バイオマスエタノールを製造する方法であって、セルロース系物質を、(1)〜(3)及び(13)のいずれか一項に記載のタンパク質、又は(14)に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法。
本明細書において「エンドグルカナーゼ」とは、エンドグルカナーゼ活性を有する酵素、すなわちエンド−1,4−β−グルカナーゼ(EC3.2.1.4)を意味し、前記酵素は、β−1,4−グルカンのβ−1,4−グルコピラノシル結合を加水分解する。
pinophilum)PF1365株(FERM BP−10780株)から取得することができる。また、これらはその変異株であってもよい。更に、本発明によるタンパク質は、典型的には、そのN末端のアミノ酸配列が配列番号2で表わされる配列を有する。N末端のアミノ酸配列は、例えば後述の実施例2で示した方法により決定することができる。本発明によれば、ペニシリウム・ピノフィラム(Penicillium
pinophilum)由来の、下記の特性を有するタンパク質が提供される:
(A)エンドグルカナーゼ活性を有し、
(B)N末端のアミノ酸配列が、(1)配列番号2で表わされる配列、または、(2)配列番号2で表される配列において、1個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加した配列を有し、
(C)SDS−PAGEにより測定した平均分子量が25kD〜27kDである。
ここで、SDS−PAGEによる平均分子量は、実施例1に示した方法によって決定することができる。また、ペニシリウム・ピノフィラム由来の本発明によるタンパク質は、典型的には、配列番号4で表わされる16位〜236位のアミノ酸配列からなり、そのN末端グルタミン(Gln)残基がピログルタミン酸残基(pyroGlu)に修飾されている(すなわち、配列番号30で表されるアミノ酸配列からなる)。
デフォルト条件:
Unit Size to Compare = 2
Pick up Location = 1
本発明によれば、配列番号4で表わされるアミノ酸配列又はその部分配列を含むタンパク質、または、改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定まり、よって、本発明のタンパク質をコードする種々の塩基配列を選択することができる。なお、本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」には、DNA及びRNAの両方が含まれ、DNAが好ましい。
(a)配列番号3又は28で表わされる塩基配列(又はその部分配列)を含むポリヌクレオチド、
(b)配列番号3又は28で表わされる塩基配列(又はその部分配列)において、1個又は複数個の塩基が欠失、置換、及び/又は付加された塩基配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
配列番号3で表される塩基配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチドには、例えば配列番号3で表される1位〜834位の塩基酸配列を有するポリヌクレオチド、または46位〜834位の塩基酸配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
本発明においては、配列番号4で表わされるアミノ酸配列又はその部分配列を含むタンパク質、または、その改変タンパク質をコードするポリヌクレオチド(以下「本発明によるポリヌクレオチド」という)を、宿主微生物内で複製可能で、かつ、その塩基配列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含む発現ベクターが提供される。本発現ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、本発現ベクターは、宿主微生物に導入されたとき、その宿主微生物のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。本発明によるベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。本発明による発現ベクターは、これを実際に宿主微生物に導入して所望の活性を有するタンパク質を発現させるために、前記の本発明によるポリヌクレオチドの他に、その発現を制御する塩基配列等を含んでいるのが望ましい。発現を制御する塩基配列としては、プロモーター、ターミネーター及びシグナルペプチドをコードする塩基配列等がこれに含まれる。プロモーターは宿主微生物において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種もしくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御する塩基配列として得ることができる。
reesei)、トリコデルマ・ロンジブラシアトウム(Trichoderma longibrachiatum)、フミコーラ・インソレンス(Humicola
insolens)、フミコーラ・サーモイデア(Humicola thermoidea)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus
niger)、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)、アクレモニウム・セルロリティカス(Acremonium
cellulolyticus)又はペニシリウム・ピノフィラム(Penicillium pinophilum)が挙げられるが、更により好ましくは、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma
viride)、又はフミコーラ・インソレンス(Humicola insolens)が挙げられる。
本発明は、本発明のタンパク質(例えば、配列番号4で表わされるアミノ酸配列又はその部分配列を含むタンパク質、又はその改変タンパク質、あるいは、本発明の宿主細胞を培養することにより得られるタンパク質)を含むセルラーゼ調製物にも関する。
(1)減量による繊維の肌触り及び外観の改善
(2)着色セルロース含有繊維の色の局所的な変化の付与、すなわち、着色セルロース含有繊維、代表的にはジーンズへのストーンウォッシュ様の外観及び風合いの付与
(3)着色セルロース含有繊維の色の澄明化
(4)柔軟化(ごわつき始める速度の低減、ごわつきの低減)
(5)毛羽の除去(毛羽立ち始める速度の低減、毛羽立ちの低減)
本発明によるエンドグルカナーゼPPCEの由来であるペニシリウム・ピノフィラム(Penicillium pinophilum)PF1365株は、2007年(平成19年)2月7日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(あて名:〒305−8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に国際寄託され、国際受託番号はFERM BP−10780である。
viride)MC300−1株は、1996年(平成8年)9月9日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(あて名:〒305−8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に国内寄託(原寄託)されたものであり、1997年(平成9年)8月11日から国際寄託に移管されている。国際受託番号(国際受託番号に続く[
]内は国内受託番号)は、FERM BP−6047[FERM P−15842]である。
ペニシリウム・ピノフィラム(Penicillium pinophilum)PF1365株を、TS培地(2.0%可溶性でんぷん、1.0%グルコース、0.5%ポリペプトン、0.6%小麦胚芽、0.3%酵母エキス、0.2%大豆粕、0.2%炭酸カルシウム、pH7.0)中、25℃で振とう培養した。24時間培養の後、(N)培地(5.0%アビセル、2.0%酵母エキス、0.1%ポリペプトン、0.03%硫酸マグネシウム、pH6.8)に植菌し、更に25℃5日間培養した。菌体を除去した培養上清液を粗精製セルラーゼ調製液とした。この粗精製セルラーゼ調製液を最終濃度1.2mol/Lの硫酸アンモニウムの溶液になるように調製した後、1.2mol/L硫酸アンモニウムを含む50mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)で平衡化させたHiTrapTMPhenylHPカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)にアプライし、50mmol/L酢酸ナトリウム緩衝液(pH5)中、硫酸アンモニウム濃度が1.2mol/L、0.96mol/L、0.72mol/L、0.48mol/L、0.24mol/L、0mol/Lのステップワイズ溶離法により溶出して、分画した。このうち硫酸アンモニウム濃度が0.24mol/Lのときに溶出した画分に着色綿布に対する毛羽除去活性が認められた。着色綿布に対する毛羽除去活性は、以下のように行った。予め染色された青色綿ニットの生地を大型ワッシャー中で毛羽立たせた。その後、この毛羽立たせた青色綿ニット生地を下記の条件で毛羽除去処理を行い、処理後の布の毛羽の取れ具合を目視にて判定し、毛羽除去活性の有無を調べた。
温度 :40℃
時間 :120分
反応pH:pH2(5mmol/Lクエン酸緩衝液)
処理液には、分画液とともにステンレスビーズを適当量加えた。
実施例1において得られたPPCE画分をSDS−PAGEに供した後、マルチフォーII(GEヘルスケバイオサイエンス社製)を用いてPVDF膜(ミリポア社製)へ電気的にブロットした。これをブリリアントブルーG(東京化成工業社製)で染色した後、脱色した。この膜から分子量約26kDのタンパク質(PPCE)がブロットされた部分を切り出し、プロテインシークエンサーModel492(アプライドバイオシステムズ社製)に供し、N末端アミノ酸配列の解析を試みたがエドマン分解によるシグナルは得られなかった。よってN末端アミノ酸が修飾保護されていることが判明した。
シーケンス結果:Gln-Ser-Leu-Xaa-Ser-Gln-Tyr-Ser-Ser-Tyr-Thr-Ser(12残基)(配列番号1)
PPCEのN末端アミノ酸配列:Gln-Gln-Ser-Leu-Cys-Ser-Gln-Tyr-Ser-Ser-Tyr-Thr-Ser(13残基;但し、N末端グルタミンはピログルタミン酸に修飾されている)(配列番号2)
PPCEのN末端アミノ酸配列が、ファミリー12に属するペニシリウム・ベルクロッサム由来のエンドグルカナーゼIIIと相同性を有していたことから、ロシア公開第2238974号に記載のEGIIIの塩基配列に基づき、PCRによるペニシリウム・ピノフィラム(Penicillium
pinophilum)PF1365株由来エンドグルカナーゼPPCE遺伝子の増幅を試みた。
ペニシリウム・ピノフィラム(Penicillium pinophilum)PF1365株をTS培地で28℃、24時間培養し、遠心分離によって菌体を回収した。得られた菌体よりISOPLANT(ニッポンジーン社製)を用いてクロモソームDNAの抽出を行った。条件はキットに添付のマニュアルに記載の条件に従った。
ペニシリウム・ベルクロッサム(Penicillium verruculosum)由来のエンドグルカナーゼIIIのN末端、C末端のアミノ酸配列に対応するDNA配列に基づき、以下の配列の合成プライマーを作製した。
MSW−N:CAACAGAGTCTATGCGCTCAATACTCGAGCTACACCAGT(配列番号5)
MSW−C:CTAATTGACAGCTGCAGACCAA(配列番号6)
Rev:CAGGAAACAGCTATGAC (配列番号7)
ゲノムウォーカーキット(ベクトン・デッキンソン社製)を用い、PCRにより増幅されたペニシリウム・ピノフィラムPF1365株由来ファミリー12エンドグルカナーゼ遺伝子断片の上・下流域の増幅を試みた。条件についてはキットに添付の条件に従った。ペニシリウム・ピノフィラム(Penicillium pinophilum)PF1365株より抽出したクロモソームDNAを制限酵素PvuII、StuIを用いて完全分解し、分解したクロモソームDNAとキットに添付のアダプターを連結し、ライブラリーを作製した。また、実施例3で得られた配列をもとに、次に、下記の配列を有する合成プライマーを作製し、PCR反応に用いた。
24−GSP−R1:CGCCAGAGCTGGAAATGGAGTTGACATAAG(配列番号8)
24−GSP−R2:GTGCACTGGGAGCCAGAGCCACTGCTCTCA(配列番号9)
24−GSP−F1:TTTCGTATGATCTCTTCACGGCAGCGGATA(配列番号10)
24−GSP−F2:ATCAACCATGTTACCTACAGTGGTGACTAT(配列番号11)
pinophilum)PF1365株由来のPPCE遺伝子の全長が明らかとなった。得られたPPCE遺伝子の塩基配列(配列番号3)は、ペニシリウム・ベルクロッサム(Penicillium
verruculosum)由来のエンドグルカナーゼIII遺伝子の翻訳領域と相同な領域を含んでいた。そしてその遺伝子の相同性を、市販の遺伝子情報処理ソフトウェアGENETYX(ゼネティックス社製)を用いて算出したところ、82%であった。更にDNA断片の配列より推定されるアミノ酸配列(配列番号4)をもとに、GENETYX(ゼネティックス社製)を用いて相同性を算出したところ、ペニシリウム・ベルクロッサム(Penicillium
verruculosum)由来のエンドグルカナーゼIIIと86%の相同性であった。また、DNA断片の配列より推定されるアミノ酸配列(配列番号4)をもとに、公知のデータベース(NCBI)でblastp検索を行ったところ、アスペルギルス・アキュレータス(Aspergollus
aculeatus)由来のFI−CMCaseと72%、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)由来のEGIIIと53%の相同性を有していた。これらは全てファミリー12に属するエンドグルカナーゼであることから、得られたDNA断片はペニシリウム・ピノフィラム PF1365株由来由来のファミリー12エンドグルカナーゼ遺伝子の翻訳領域及びその上・下流を含む遺伝子断片であるものと考えられた。
(1)PPCE発現用遺伝子断片の取得
PPCE遺伝子は、開始コドンの上流の配列にStuI、終止コドンの下流にPstIを予め含む形で以下のような変異導入用プライマーを設計し、PCR法にて増幅した。
32228−NSTU:CCAGGCCTGCGCATCATGAAGCTAACTTTTCTCCTG (配列番号12)
32228−CPST:CCCTGCAGCTAATTGACAGAAGCAGACC (配列番号13)
プラスミドp28FULL18を制限酵素StuIおよびPstIで切断し、アガロースゲル電気泳動により反応後のサンプルを分離し、約800bpの遺伝子断片を切り出し、QIAQUICK GEL EXTRACTION KIT(キアゲン社製)を用いて、DNAの精製を行った。次に、プラスミドpCBI−M2[国際公開第2005/056787号の実施例B1]を制限酵素StuIおよびPstIで切断し、アガロースゲル電気泳動により反応後のサンプルを分離し、約5.6kbpの遺伝子断片を切り出し、QIAQUICK GEL EXTRACTION KIT(キアゲン社製)を用いて、DNAの精製を行った。これに先に得られた約800bpの遺伝子断片をTaKaRa DNA Ligation Kit Ver.1(タカラバイオ社製)を用いて連結し、プラスミドpPPCE−F2を作製した。
実施例5(2)で得られたプラスミドpPPCE−F2によるトリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)の形質転換は、国際公開第2005/056787号に記載の方法に従い、実施した。即ち、ウラシル生合成遺伝子(pyr4)欠損株であるトリコデルマ・ビリデ(Trichoderma
viride)strain2株を宿主とし、選択マーカーとしてニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)のpyr4遺伝子を用いたコートランスフォーメーション(co-transformation)法により形質転換を実施した。まず、国際公開第2005/056787号に記載の方法に従い、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma
viride)strain2のプロトプラストを調製し、得られたプロトプラスト懸濁液100μLと7μgのプラスミドpPPCE−F2及び3μgのプラスミドpPYR4(ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora
crassa)由来のpyr4遺伝子をLITMUS28にサブクローンしたプラスミド)を混合した。混合液を氷冷下で5分間静置し、400μLのPEG溶液(60%ポリエチレングリコール4000、10mmol/L塩化カルシウム、10mmol/Lトリス塩酸緩衝液、pH7.5)を加え、更に氷冷下で20分間静置した。以上の処理をしたプロトプラスト懸濁液をSUTC緩衝液(0.5mol/Lシュークロース、10mmol/L塩化カルシウム、10mmol/Lトリス塩酸緩衝液、pH7.5)で洗浄した後、0.5mol/Lシュークロースを含む最少培地に軟寒天とともに重層し、28℃で5日間培養した。培養後、生育したコロニーを再度、最少培地に移植し、ここで生育したコロニーを形質転換体とした。
実施例5(3)で得られた形質転換体50株をPSW培地(1.0%グルコース、4.0%ラクトース、2.0%大豆粕、1.0%小麦胚芽、0.2%リン酸二水素カリウム、0.2%硫酸アンモニウム、0.2%リン酸アンモニウム、0.2%炭酸カルシウム)に植菌し、28℃にて5日間培養した。培養後、遠心分離により菌体を除去し、得られた培養上清を粗酵素液とした。粗酵素液をSDS−PAGEに供したところ、形質転換体において特異的に約26kDのタンパク質が発現していた。特に発現量の多かった322F−205株の培養上清を用いて、以降の洗浄試験を実施した。
(1)発現タンパク質濃度の測定
PPCE遺伝子発現株の毛羽除去活性を評価するため、対照としてトリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)由来のEGIII〔非特許文献1〕及び、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma
viride)由来のエンドグルカナーゼSCE3〔特許文献5〕及びアスペルギルス・アキュレータス(Aspergollus aculeatus)由来のFI−CMCase〔非特許文献2〕の遺伝子を実施例5に従い、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma
viride)において発現させ、同様に培養上清を調製した。得られた培養上清及びPPCE遺伝子発現株の培養上清を実施例1の方法に従い、12%ゲルを用いてSDS−PAGEに供した。泳動後、SYPRO Ruby protein gel stain(インビトロジェン社製)で染色、水洗し、モレキュラーイメージャーFX(バイオラッドラボラトリーズ社製)及びQuantity One(バイオ・ラッドラボラトリーズ社製)を用いてバンド解析を行い、全タンパク質に占める発現タンパク質比率を測定した。次に培養上清中の全タンパク質濃度をプロティンアッセイキット(バイオラッドラボラトリーズ社製)により、ウシγグロブリンをスタンダードとして定量した。得られた全タンパク質濃度と発現タンパク質比率を乗じることにより、発現タンパク質濃度を求めた。
PPCE遺伝子発現株及び実施例6(1)で得られた対照株の培養上清を用いて、毛羽除去活性を測定した。まず、予め染色された茶色綿ニットの生地を大型ワッシャー中で毛羽立たせた。その後、この毛羽立たせた茶色綿ニット生地を下記の条件で毛羽除去処理を行い、処理後の布の毛羽の取れ具合を目視にて判定し、毛羽除去活性を調べた。
温度 :40℃
時間 :60分
反応液 :5mmol/L酢酸緩衝液(pH4) 40mL
処理液には、培養上清とともにステンレスビーズを適当量加えた。
(1)PPCEの毛羽除去活性による温度プロファイル
実施例6で用いたPPCEとEGIII発現株の培養上清を使用して温度プロファイルを以下の洗浄条件にて調べた。洗浄後、目視により毛羽の除去度を評価し、毛羽が目視評価でほぼ50%除去されるのに要する培養上清液量を算出した。この液量より、各サンプル中で最も毛羽を除去した温度を100%として相対活性を求めた。表3に示す通り、PPCEの至適温度は30℃、EGIIIの至適温度は40℃であった。
温度 :20℃〜60℃
時間 :60分
反応液 :5mmol/L酢酸緩衝液(pH4) 40mL
処理液には、培養上清とともにステンレスビーズを適当量加えた。
実施例6で用いたPPCEとEGIII発現株の培養上清を使用してpHプロファイルを以下の洗浄条件にて調べた。洗浄後、目視により毛羽の除去度を評価し、毛羽が目視評価でほぼ50%除去されるのに要する培養上清液量を算出した。この液量より、各サンプル中で最も毛羽を除去したpHを100%として相対活性を求めた。表4に示す通り、PPCEの至適はpHは3、EGIIIの至適pHは4であった。
温度 :40℃
時間 :60分
反応液 :5mmol/Lクエン酸または酢酸緩衝液(pH2〜6) 40mL
処理液には、培養上清とともにステンレスビーズを適当量加えた。
(1)コドン最適化PPCE遺伝子の取得
トリコデルマ属において使用頻度の高いコドンのみで構成するPPCE遺伝子をPCR反応により合成した。
まず、以下の配列を有する2本の合成オリゴヌクレオチドを作製した。
PCEM−1:
CCAGGCCTGCGCATCATGAAGCTGACCTTCCTGCTGAACCTGGCCGTCGCCGCCAGCGCCCAGCAGAGCCTGTGCAGCCAGTACAGCAGCTACAC(配列番号14)
PCEM−2:
TGGCTGCCGCTGCCGCTGCTCTCGCCCCACAGGTTGTTGTTGACGCTGTACTGGCCGCTGGTGTAGCTGCTGTACTGGCT(配列番号15)
まず、以下の配列を有する2本の合成オリゴヌクレオチドを作製した。
PCEM−3:
AGCAGCGGCAGCGGCAGCCAGTGCACCTACGTCAACAGCATCAGCAGCAGCGGCGTCAGCTGGAGCACCACCTGGAACTG(配列番号16)
PCEM−4:
TTGGTCAGGCCGCTCAGCTGGCTGTTGGCGTAGCTCTTGACGCTGGTGCTGCCGCCGCTCCAGTTCCAGGTGGTGCTCCA(配列番号17)
鋳型非存在下で上記のプライマー(PCEM−3、PCEM−4)を20pmol使用し、実施例8(1)a)の方法に従い、PCR反応、断片の精製を行った。得られた約140bpのDNA断片をPCEM3−4とした。
まず、以下の配列を有する2本の合成オリゴヌクレオチドを作製した。
PCEM−5:
CAGCTGAGCGGCCTGACCAAGAAGCTGGTCAGCAACCTGCAGAGCATCCCCACCAGCGTCCAGTGGAGCTACAGCAACAC(配列番号18)
PCEM−6:
GTGACGTGGTTGATGTCGGCGGCGGTGAACAGGTCGTAGCTGACGTCGGCGACGATGTTGGTGTTGCTGTAGCTCCACTG(配列番号19)
鋳型非存在下で上記のプライマー(PCEM−5、PCEM−6)を20pmol使用し、実施例8(1)a)の方法に従い、PCR反応、断片の精製を行った。得られた約140bpのDNA断片をPCEM5−6とした。
まず、以下の配列を有する2本の合成オリゴヌクレオチドを作製した。
PCEM−7:
GCCGACATCAACCACGTCACCTACAGCGGCGACTACGAGCTGATGATCTGGTAAATATGCCCCCGTCGTATTTCAAGTAT(配列番号20)
PCEM−8:
CAGGGGCTGGGCGCCGCCGTACTTGCCCAGCCTGATATCTTGATTAGCGGGAGATGTCTCATACTTGAAATACGACGGGG(配列番号21)
鋳型非存在下で上記のプライマー(PCEM−7、PCEM−8)を20pmol使用し、実施例8(1)a)の方法に従い、PCR反応、断片の精製を行った。得られた約140bpのDNA断片をPCEM7−8とした。
まず、以下の配列を有する2本の合成オリゴヌクレオチドを作製した。
PCEM−9:
ACGGCGGCGCCCAGCCCCTGGGCAGCCAGATCGGCACCGCCAACGTCGGCGGCGCCACCTGGCAGCTGTGGTACGGCGTC(配列番号22)
PCEM−10:
GCCGTTCCAGCTGGTGGTCTGGCTGCTGGCGACGAAGCTGTAGGTCTTCTGGCTGCCGTTGACGCCGTACCACAGCTGCC(配列番号23)
鋳型非存在下で上記のプライマー(PCEM−9、PCEM−10)を20pmol使用し、実施例8(1)a)の方法に従い、PCR反応、断片の精製を行った。得られた約140bpのDNA断片をPCEM9−10とした。
まず、以下の配列を有する2本の合成オリゴヌクレオチドを作製した。
PCEM−11:
AGACCACCAGCTGGAACGGCGACATCCTGCAGTTCTTCAAGTACCTGCAGAGCAACCAGGGCTTCCCCGCCAGCAGCCAG(配列番号24)
PCEM−12:
ATCATGTCAGATACAAGGAGTCTATAGGAACAGAAAGGGTCATGGCTTACCGATCAGGTACTGGCTGCTGGCGGGGAAGC(配列番号25)
鋳型非存在下で上記のプライマー(PCEM−11、PCEM−12)を20pmol使用し、実施例8(1)a)の方法に従い、PCR反応、断片の精製を行った。得られた約140bpのDNA断片をPCEM11−12とした。
まず、以下の配列を有する2本の合成オリゴヌクレオチドを作製した。
PCEM−13:
CTCCTTGTATCTGACATGATTGCTTCGGTATCAGACCTGCAGTTCGGCACCGAGCCCTTCACCGGCAGCCAGACCACCCT(配列番号26)
PCEM−14:CCCTCGAGCTAGTTGACGCTGGCGCTCCAGTGGTTGACGGTCAGGGTGGTCTGGCTGCCGGT(配列番号27)
鋳型非存在下で上記のプライマー(PCEM−13、PCEM−14)を20pmol使用し、実施例8(1)a)の方法に従い、PCR反応、断片の精製を行った。得られた約120bpのDNA断片をPCEM13−14とした。
実施例8(1)a)で得られたPCEM1−2及び実施例8(1)b)で得られたPCEM3−4各1μLを鋳型とし、上記のプライマー(PCEM−1、PCEM−4)を20pmol使用し、Primestar MAX DNA POLYMERASE(タカラ社製)を用いて2回目のPCR反応を行った。条件は、98℃10秒・55℃5秒・72℃30秒の反応を30サイクル行った。反応液はQIAQUICK PCR PURIFICATION KIT(キアゲン社製)を用いてDNAの精製を行い50μLのTEバッファーに溶出した。得られた約270bpのDNA断片をPCEM1−4とした。
実施例8(1)c)で得られたPCEM5−6及び実施例8(1)d)で得られたPCEM7−8各1μLを鋳型とし、上記のプライマー(PCEM−5、PCEM−8)を20pmol使用し、2回目の反応を行った。上記の実施例8(1)h)の方法に従い、PCR反応、断片の精製を行い、得られた約260bpのDNA断片をPCEM5−8とした。
実施例8(1)e)で得られたPCEM9−10及び実施例8(1)f)で得られたPCEM11−12各1μLを鋳型とし、上記のプライマー(PCEM−9、PCEM−12)を20pmol使用し、2回目の反応を行った。上記の実施例8(1)h)の方法に従い、PCR反応、断片の精製を行い、得られた約260bpのDNA断片をPCEM9−12とした。
実施例8(1)h)で得られたPCEM1−4及び実施例8(1)i)で得られたPCEM5−8各1μLを鋳型とし、上記のプライマー(PCEM−1、PCEM−8)を20pmol使用し、Primestar MAX DNA POLYMERASE(タカラ社製)を用いて3回目のPCR反応を行った。条件は、98℃10秒・55℃5秒・72℃30秒の反応を30サイクル行った。反応液はQIAQUICK PCR PURIFICATION KIT(キアゲン社製)を用いてDNAの精製を行い50μLのTEバッファーに溶出した。得られた約510bpのDNA断片をPCEM1−8とした。
実施例8(1)j)で得られたPCEM9−12及び実施例8(1)g)で得られたPCEM13−14各1μLを鋳型とし、上記のプライマー(PCEM−9、PCEM−14)を20pmol使用し、3回目の反応を行った。上記の実施例8(1)k)の方法に従い、PCR反応、断片の精製を行い、得られた約360bpのDNA断片をPCEM9−14とした。
実施例8(1)k)で得られたPCEM1−8及び実施例8(1)l)で得られたPCEM9−14各1μLを鋳型とし、上記のプライマー(PCEM−1、PCEM−14)を20pmol使用し、4回目のPCR反応を行った。条件は、98℃10秒・55℃5秒・72℃30秒の反応を30サイクル行った。アガロースゲル電気泳動により反応後のサンプルを分離し、約800bpの遺伝子断片を切り出し、QIAQUICK GEL EXTRACTION KIT(キアゲン社製)を用いてDNAの精製を行い50μLのTEバッファーに溶出した。得られた精製DNAにdNTP、バッファー及びEXTaq(タカラ社製)を加え、72℃で10分インキュベートしA塩基を付加した後に、TOPO PCR CLONING KIT(インビトロジェン社製)を用い、TOPOベクター(PCR2.1−TOPO)にクローン化した。得られたプラスミドをpCR−PCEmとした。プラスミドpCR−PCEmを定法により増幅・精製し、上述の方法に従いDNA配列を解析した。その結果、プラスミドpCR−PCEmは、コドン最適化PPCE遺伝子の翻訳領域(配列番号28)に加え、開始コドンの上流に制限酵素StuIの認識配列、終止コドンの下流にXhoIの認識配列を有することが確認できた。
プラスミドpCR−PCEmを制限酵素StuIおよびXhoIで切断し、アガロースゲル電気泳動により反応後のサンプルを分離し、約800bpの遺伝子断片を切り出し、QIAQUICK GEL EXTRACTION KIT(キアゲン社製)を用いて、DNAの精製を行った。
次に、実施例5(2)と同様に、プラスミドpCBI−M2を制限酵素StuIおよびXhoIで切断し、約5.6kbpの遺伝子断片を回収、精製した。これに先に得られた約800bpの遺伝子断片をLigation High(東洋紡社製)を用いて連結し、プラスミドpPPCE−Mを作製した。
実施例8(2)で得られたプラスミドpPPCE−Mにより、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)を形質転換した。形質転換の方法は、実施例5(3)の方法に従い、ウラシル生合成遺伝子(pyr4)欠損株であるトリコデルマ・ビリデ(Trichoderma
viride)strain2株を宿主とし、選択マーカーとしてニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)のpyr4遺伝子を用いたコートランスフォーメーション(co-transformation)法により形質転換を実施した。7μgのプラスミドpPPCE−M及び3μgのプラスミドpPYR4を使用してトリコデルマ・ビリデ strain2を形質転換し、40株の形質転換体を得た。
実施例8(3)で得られた形質転換体40株を実施例5(4)記載のPSW培地に植菌し、28℃にて5日間培養した。培養後、遠心分離により菌体を除去し、得られた培養上清を粗酵素液とした。粗酵素液をSDS−PAGEに供したところ、形質転換体において特異的に約26kDのタンパク質が発現していた。また、これらの粗酵素液の毛羽除去活性を実施例7に従い測定したところ(測定条件・・・温度;30℃、時間;60分、反応液;5mmol/Lクエン酸緩衝液pH3.0)、非形質転換の宿主と比較して、形質転換体において特異的に活性が向上していた。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (24)
- 以下の(a)〜(e)から選択される、タンパク質。
(a)配列番号4で表わされる16位〜236位のアミノ酸配列を含む、タンパク質。
(b)配列番号4で表わされる1位〜236位のアミノ酸配列を含む、タンパク質。
(c)配列番号30で表されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
(d)配列番号4で表される16位〜236位又は1位〜236位のアミノ酸配列において、1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、及び/又は修飾されたアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有する改変タンパク質。
(e)配列番号4で表される16位〜236位若しくは1位〜236位のアミノ酸配列、又は配列番号30で表されるアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有する相同タンパク質。 - 請求項1に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 以下の(f)、(g)から選択される、ポリヌクレオチド。
(f)配列番号3又は28で表わされる塩基配列、又は配列番号3又は28で表される46位〜834位の塩基配列を含むポリヌクレオチド。
(g)配列番号3又は28で表わされる塩基配列又は配列番号3又は28で表される46位〜834位の塩基配列において、1個又は複数個の塩基が欠失、置換、及び/又は付加された塩基配列を含み、かつエンドグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 請求項2又は3に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項4に記載の発現ベクターにより形質転換された、宿主細胞。
- 宿主が酵母又は糸状菌である、請求項5に記載の宿主細胞。
- 糸状菌が、トリコデルマ(Trichoderma)属、フミコーラ(Humicola)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、アクレモニウム(Acremonium)属又はペニシリウム(Penicillium)属に属する微生物である、請求項6に記載の宿主細胞。
- 糸状菌が、トリコデルマ(Trichoderma)属に属する微生物である、請求項7に記載の宿主細胞。
- 糸状菌が、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)である、請求項8に記載の宿主細胞。
- 請求項5〜9のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する工程、及び前記培養によって得られる宿主細胞又はその培養物から請求項1に記載のタンパク質を採取する工程を含む、タンパク質の製造方法。
- 請求項10に記載の方法で生産されたタンパク質。
- 請求項1又は11に記載のタンパク質を含む、セルラーゼ調製物。
- 請求項1又は11に記載のタンパク質、又は請求項12に記載のセルラーゼ調製物を含む、洗剤組成物。
- セルロース含有繊維の処理方法であって、セルロース含有繊維を、請求項1又は11に記載のタンパク質、請求項12に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項13に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
- セルロース含有繊維の肌触り及び外観の改善を目的として減量加工する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項1又は11に記載のタンパク質、請求項12に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項13に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
- 着色されたセルロース含有繊維の色を局所的に変化させる方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、請求項1又は11に記載のタンパク質、請求項12に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項13に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
- 着色されたセルロース含有繊維の色を澄明化する方法であって、着色されたセルロース含有繊維を、請求項1又は11に記載のタンパク質、請求項12に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項13に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
- セルロース含有繊維が毛羽立ち始める速度を遅延させる方法、又はセルロース含有繊維の毛羽立ちを低減させる方法であって、セルロース含有繊維を、請求項1又は11に記載のタンパク質、請求項12に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項13に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
- セルロース含有繊維がごわつき始める速度を低減させるか又はセルロース含有繊維のごわつきを低減する方法であって、セルロース含有繊維を、請求項1又は11に記載のタンパク質、請求項12に記載のセルラーゼ調製物、又は請求項13に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
- 洗剤組成物と接触させる工程が、その繊維の浸漬、洗濯、又はすすぎを通じて行われる、請求項14〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 古紙を脱インキ薬品により処理して脱インキを行う工程において、請求項1又は11に記載のタンパク質、又は請求項12に記載のセルラーゼ調製物を用いることを特徴とする、古紙の脱インキ方法。
- 紙パルプのろ水性の改善方法であって、紙パルプを、請求項1又は11に記載のタンパク質、又は請求項12に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法。
- 動物飼料の消化能を改善する方法であって、動物飼料を、請求項1又は11に記載のタンパク質、又は請求項12に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法。
- セルロース系の物質を分解・糖化し、バイオマスエタノールを製造する方法であって、セルロース系物質を、請求項1又は11に記載のタンパク質、又は請求項12に記載のセルラーゼ調製物で処理する工程を含む、方法。
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