JP2004500844A - Tweakアゴニストおよび血管形成因子を使用する、新血管新生を促進するための方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、血管形成活性を増強して、新血管新生を促進するための方法に関し、この方法は、被験体に、相乗効果的に有効量のTWEAKアゴニストおよび血管形成因子を含む処方物を添加する工程を包含する。本発明は、哺乳動物において血管形成活性を増強して、新血管新生を促進するための方法に関し、この方法は、動物に、新血管新生を促進するのに十分な、相乗効果的に有効量のTWEAKアゴニストおよび血管形成因子を含む処方物を投与する工程を包含する。
Description
【0001】
(発明の分野)
本発明は、新血管新生(neovascularization)を促進するために血管形成活性(angiogenic activity)を促進するための方法に関する。
【0002】
(発明の背景)
微小血管の成長、すなわち血管形成(angiogenesis)は、新血管への内皮細胞(EC)の増殖、遊走、分化、および構造編制を含む。
【0003】
血管形成調節因子は、種々のレベルでの内皮細胞(EC)の変化を誘導し(その増殖、遊走、分泌、および接着特性が挙げられる)、そしてこの血管形成調節因子の作用を介してECまたは他の細胞型に対してそのように変化を誘導し得る(Kumarら,1998,Int.J.Oncology 12:749−757;Bussolinoら,1997,Trends in Biochem,22:251−256)。これまででは、いくつかのTNFファミリーのリガンドが、血管形成のプロセスに関与している(すなわちTNFα、FasLおよびTWEAK)。
【0004】
(発明の要旨)
TWEAK(TNFリガンドファミリーの新規メンバー)は、いくつかの上皮腫瘍細胞株によるIL−8産生を誘導するその能力、減少した増殖因子条件下での種々のヒトECおよび大動脈平滑筋細胞における増殖、ならびにラット角膜に移植された場合の血管形成応答の刺激に基づいて、血管形成を促進し得る。本明細書中、本発明者らは、TWEAKの血管形成の潜在能をさらに特徴付け、TWEAKが線維芽細胞増殖因子(FGF)と相乗作用を起こして、ECの増殖および遊走を誘導することを実証する。TWEAKはEC生存を弱く促進するが、EC増殖に対するTWEAKおよびFGFの相乗作用効果は、細胞死を減少するよりも、細胞***の増強に起因するようである。TWEAKはまた、FGFまたはVEGFについてのレセプターの発現(すなわち、インテグリンα1、α5、αv、β1、またはβ3の発現)を検出可能に変更しなかった。ECを誘導して、他の細胞型の非存在下で毛細血管を形成するTWEAKの能力は、3Dフィブリンゲルマトリックス中で実証され、ここで、TWEAKは著しく、侵襲の際に管腔の形態形成を誘導した(bFGF依存性EC索)。本発明者らの発見によってさらに、TWEAKを他のTNFファミリーリガンドと区別し、複数の別々の段階において血管形成を促進するTWEAKの能力を実証する。
【0005】
本発明の1つの局面は、インビトロ培養物において内皮細胞増殖を促進するための方法であって、この方法は、細胞培養物に相乗効果的に有効量のTWEAKアゴニストおよび血管形成因子から本質的になる処方物を添加する工程を包含する。
【0006】
本発明の第2の局面は、哺乳動物において血管形成活性を増強して、新血管新生を促進するための方法であって、この方法は、新血管新生を促進するのに十分な、相乗効果的に有効量のTWEAKアゴニストおよび血管形成因子を含む処方物をこの動物に投与する工程を包含する。好ましい実施形態はbFGFの使用である。
【0007】
(詳細な説明)
本明細書中に使用される場合、用語「血管形成(angiogenesis)」、「血管再生(revascularization)」、「増加した側枝循環」、および「血管の再生(regeneration of blood vessels)」は、同意語とみなされる。
【0008】
「血管形成」は、既存の脈管床(vascular bed)の任意の変更または組織灌流に役立つ新規脈管構造の形成として規定される。これには、既存の血管からの内皮細胞の出芽による新規脈管の形成、またはサイズ、成熟度、方向または流れの特性を変更して組織の血液灌流を改善する既存の脈管のリモデリングを含む。
【0009】
治療剤は、「血管形成」を調節する際に「治療効果」を有すると言われ、そして治療剤の量は、その治療剤の量の投与が、血管形成の調節を必要とする被験体(例えば、動物モデルまたはヒト患者)に投与されたとき血管形成活性に有意な調節(すなわち、増加または減少)を引起すのに十分である場合、「血管形成調節量」といわれる。
【0010】
用語、血管形成因子は、血管形成プロセス(以下のプロセスの段階が挙げられるが、これらに限定されない:すなわち、細胞外マトリックスの分解、細胞増殖、細胞遊走、および構造編制)を促進する因子をいう(Kumarら,1998,Int.J.Oncology 12:749−757;Bussolinoら,1997,Trends in Biochem,22:251−256)。血管形成因子としては、線維芽細胞増殖因子(bFGF)、酸性FGF(aFGF)、FGF−5、血管内皮細胞増殖因子アイソフォーム(VEGF)、アンギオポエチン(angiopoietin)−1(Ang−1)およびアンギオポエチン2(Ang−2)、血小板由来内皮細胞増殖因子(PD−ECGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、インターロイキン−8(IL−8)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、胎盤増殖因子、プロリフェリン(proliferin)、B61、可溶性脈管細胞接着分子−1、可溶性E−セレクチン(E−selection)、12−ヒドラジエイコサテトラエノン酸(12−hydrozyeicosatetraenoic acid)、HIV−1のTatタンパク質、アンギオゲニン、TNFα、FasL、トランスフォーミング増殖因子−βが挙げられるが、これらに限定されない。
【0011】
本明細書中に使用される場合、別の血管形成因子と相乗作用的に作用するTWEAKの能力は、TWEAKおよび血管形成因子の組合せが、血管形成プロセスの段階を測定する1つ以上のインビトロアッセイにおいて測定されるように、いずれかの因子単独に対する応答の和よりも大きい応答を誘導することを意味する。この血管形成プロセスの段階としては、本明細書中に記載されるように、内皮細胞の生存、増殖、遊走、または毛細管形成が挙げられるが、これらに限定されない。
【0012】
用語「薬学的に受容可能な」は、天然物質または合成物質に対して言及される場合、その物質がはるかに大きい有利な効果を考慮して受容可能な毒性効果を有することを意味する。一方、関連する用語「生理学的に受容可能な」は、その物質が比較的低い毒性を有することを意味する。
【0013】
本明細書中に使用される場合、用語「抗体ホモログ」は、ジスルフィド結合を介して連結した免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖からなるインタクトな抗体を含む。用語「抗体ホモログ」はまた、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、および1つ以上の抗原(すなわち、TWEAKまたは一部(patched))に結合し得るそれらの抗原結合フラグメントから選択される1つ以上のポリペプチドを含むTWEAK治療剤を含むことが意図される。1つより多くのポリペプチドから構成される抗体ホモログの成分ポリペプチドは、必要に応じて、ジスルフィド結合するか、さもなくば共有結合的に架橋し得る。従って、「抗体ホモログ」は、IgA型、IgG型、IgE型、IgD型、IgM型(ならびにこれらにサブタイプ)のインタクトな免疫グロブリンを含み、ここで、免疫グロブリンの軽鎖は、κ型もしくはλ型であっても、抗原結合特異性を保持するインタクトな抗体の一部(例えば、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメント、F(v)フラグメント、重鎖単量体もしくは二量体、軽鎖単量体もしくは二量体、1つの重鎖および1つの軽鎖からなる二量体など)であってもよい。
【0014】
本明細書中に使用される場合、「ヒト化抗体ホモログ」は、組み換えDNA技術によって産生された抗体ホモログであり、ここで、抗原結合に必要とされないヒト免疫グロブリンの軽鎖または重鎖のアミノ酸のいくらかまたは全てが、非ヒト哺乳動物免疫グロブリンの軽鎖または重鎖由来の対応するアミノ酸の代わりに置換されている。「ヒト抗体ホモログ」は、免疫グロブリンの軽鎖または重鎖のアミノ酸の全てが(抗原結合に必要とされるか否かにかかわらず)、ヒト供給源由来である抗体ホモログである。
【0015】
「アミノ酸」は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の単量体単位である。天然に存在するペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質には20個のアミノ酸が見出されていて、これらの全ては、L異性体である。この用語はまた、アミノ酸のアナログならびにタンパク質アミノ酸およびそのアナログのD異性体も含む。
【0016】
用語「バイオアベイラビリティー」は、投与後に体によって吸収される化合物の能力をいう。例えば、第1および第2の化合物の両方が等量投与されたときに、第1化合物が第2化合物よりも大きい程度で血液に吸収される場合、この第1化合物は第2化合物よりも大きいバイオアベイラビリティーを有する。
【0017】
「発現ベクター」は、ポリヌクレオチドであり、例えば、この発現ベクターが宿主細胞に導入された場合に少なくとも1つの遺伝子の発現を可能にするDNAプラスミドまたはファージ(とりわけ一般的な例)である。ベクターは、宿主細胞中で複製されることができても、できなくてもよい。
【0018】
句「細胞外シグナル伝達タンパク質」は、細胞から分泌されるかまたは細胞膜に結合しているいずれかの任意のタンパク質を意味し、そして、標的細胞上のこのタンパク質に対するレセプターへの結合の際に、標的細胞に応答を誘発する。
【0019】
アミノ酸残基の「機能的等価体」は、(i)その機能的等価体によって置換されたアミノ酸残基と類似の反応特性を有するアミノ酸、(ii)本発明のポリペプチドのリガンドのアミノ酸(このアミノ酸は、その機能的等価体によって置換されたアミノ酸残基と類似の特性を有する)、(iii)その機能的等価体によって置換されたアミノ酸残基と類似の特性を有する非アミノ酸分子である。
【0020】
「異種プロモーター」は、本明細書中に使用される場合、遺伝子または精製核酸と天然に結合していないプロモーターである。
【0021】
「相同性」および「同一性」は、各々、2つのポリペプチド配列間の配列類似性をいい、「相同性」および「同一性」の両方は、その開示において交換可能に使用される。「相同性」は、比較目的のために整列され得る各配列中の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列中の位置が同じアミノ酸残基によって占められる場合、これらのポリペプチドは、その位置において同一であるといわれ得;等価な部位が同じアミノ酸(例えば、同一)または類似のアミノ酸(例えば、立体的な性質および/または電子的な性質が類似)によって占められる場合、この分子は、その位置において相同であるといわれ得る。配列間の相同性のパーセンテージは、これらの配列によって共有される一致した位置または相同な位置の数の関数である。「関連していない」配列または「非相同」配列は、本発明の配列と40%未満の同一性(もっとも、好ましくは25%未満の同一性)を共有する。
【0022】
例えば、2つの配列において10個の位置のうちの6個の位置が、一致しているかまたは相同である場合、2つの配列は60%相同である。例として、DNA配列CTGACTおよびCAGGTTは、50%の相同性(全部で6個の位置のうち3個の位置が一致している)を共有する。一般に、比較は、2つの配列が最大の相同性を与えるように整列される場合に、行われる。このような整列は、例えば、Needlemanら、J.Mol Biol.48:443−453(1970)の方法(以下により詳細に記載されるコンピュータープログラムによって簡便に実行される)を使用して提供され得る。相同配列は、同一アミノ酸残基または類似アミノ酸残基を共有し、ここで、類似の残基は、整列された参照配列における対応するアミノ酸残基の保存的置換(すなわち「許容点変異(allowed point mutations)」)である。この点に関して、参照配列における残基の「保存的置換」は、対応する参照残基(例えば、類似のサイズ、形、電荷、化学的特性(共有結合または水素結合を形成する能力を含む)などを有する)に物理的または機能的に類似である残基の置換である。特に好ましい保存的置換は、Dayhoffら、5:Atlas of Protein Sequence and Structure,5:補遺.3,第22章:354−352、Nat.Biomed.Res.Foundation,Wasington,D.C.(1978)における「許容点変異」について定義される基準を満たす保存的置換である。
【0023】
2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の「パーセント相同性/同一性」は、KarlinおよびAltshul(Proc.Nat.Acad.Sci.,USA 90:5873(1993))において改変されるように、KarlinおよびAltshul(Proc.Nat.Acad.Sci.,USA 87:2264(1990))の整列アルゴリズムを使用して決定される。このようなアルゴリズムは、Altschulら、J.Mol.Biol.215:403(1990)のNBLASTまたはXBLASTプログラムに組み込まれる。BLAST検索は、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12を用いて実施され、本発明の核酸に相同なヌクレオチド配列を得る。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3を用いて実施され、参照ポリペプチド配列に相同なアミノ酸配列を得る。比較のためのギャップ付き(gapped)整列を得るために、ギャップ付きBLASTが、Altschulら、Nucleic Acids Res.,25:3389(1997)において記載されるように使用される。BLASTおよびギャップ付きBLASTを使用する場合、それぞれのプログラム(XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメーターが使用される。http://www/ncbi.nlm.nih.govを参照のこと。
【0024】
用語「疎水性」は、非極性原子を有する化学部分が、水または他の極性原子とではなくお互いに相互作用する傾向をいう。「疎水性」である物質は、多くは水中で不溶性である。疎水性性質を有する天然産物としては、脂質、脂肪酸、リン脂質、スフィンゴ脂質、アシルグリセロール、ワックス、ステロール、ステロイド、テルペン、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン、イソプレノイド、レテノイド(retenoid)、ビオチン、ならびにトリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、アラニン、プロリン、およびチロシンのような疎水性アミノ酸が挙げられる。化学的部分はまた、その物理的性質が非極性原子の存在によって決定される場合、疎水性であるかまたは疎水性性質を有する。
【0025】
成句「内部アミノ酸(internal amino acid)」は、N末端アミノ酸またはC末端アミノ酸のいずれでもないペプチド配列中の任意のアミノ酸を意味する。
【0026】
「単離された」(「実質的に純粋な」と交換可能に使用される)は、核酸(すなわち、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列)に適用される場合、その起源または操作によって、(i)天然において結合するポリヌクレオチドの全てとは結合しない(例えば、発現ベクターまたはその一部として宿主細胞中に存在する)か;または(ii)天然において結合するもの以外の核酸または他の化学部位に結合するか;または(iii)天然に存在しない、RNAまたはDNAポリヌクレオチド、ゲノムポリヌクレオチドの一部分、cDNAまたは合成ポリヌクレオチドを意味する。「単離された」はさらに、(i)例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってインビトロで増幅されるか;(ii)化学的に合成されるか;(iii)クローニングによって組換え的に産生されるか;または(iv)切断およびゲル分離によって精製される、ポリヌクレオチド配列を意味する。
【0027】
「単離された」(「実質的に純粋な」と交換可能に使用される)は、ポリペプチドに適用される場合、その起源または操作によって、(i)発現ベクターの一部の発現産物として宿主細胞中に存在するか;または(ii)天然において結合するもの以外のタンパク質または他の化学部位に結合するか;または(iii)天然に存在しない、ポリペプチドまたはその部分(例えば、天然において見出されない形態でタンパク質が存在するように、少なくとも1つの疎水性部分をタンパク質に付加する(appending)かまたは付加する(adding)ことによって化学的に操作されたタンパク質)を意味する。「単離された」はさらに、(i)化学的に合成されるか;または(ii)宿主細胞において発現され、そして結合タンパク質および混入タンパク質から離れて精製される、タンパク質を意味する。この用語は一般に、天然に存在する他のタンパク質および核酸から分離されたポリペプチドを意味する。好ましくは、このポリペプチドはまた、これらを精製するために使用される抗体またはゲルマトリクス(ポリアクリルアミド)のような物質から分離される。
【0028】
「タンパク質」は、20個のアミノ酸のいずれかから基本的になる任意のポリマーである。「ポリペプチド」は、しばしば、比較的大きいポリペプチドに関して使用され、そして「ペプチド」は、しばしば、小さいポリペプチドに関して使用される。これらの用語の使用は、当該分野で重複し、そして変化する。本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」は、他に示されない限り、ペプチド、タンパク質およびポリペプチドをいう。
【0029】
用語「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書中で交換可能に使用される。用語「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」はまた、本明細書中で交換可能に使用される。
【0030】
本明細書中で使用される場合、「組換え体」は、タンパク質が組換え哺乳動物発現系に由来することを意味する。
【0031】
従って、「実質的に純粋な核酸」は、この核酸が由来する生物体の天然に存在するゲノム中に通常連続するコード配列の1つまたは両方と直接連続していない核酸である。実質的に純粋なDNAはまた、さらなるTWRAK配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAを含む。
【0032】
新血管新生を促進する血管形成活性を増強する際に有効であることが必要されるTWEAKアゴニストおよび血管形成因子の量は、もちろん、処置される患者と共に変化し、そして最終的に医者の裁量である。考慮されるべき因子としては、処置される患者の状態、使用される特定のTWEAKアゴニストの効力、処方物の性質、および患者の体重が挙げられる。TWEAKアゴニストを同時に投与することは可能であるが、血管形成因子は、TWEAKアゴニストの注入の開始の前に、ボーラスとして与えられ得ることがまた意図される。血管形成因子は、TWEAKアゴニストの注入後に投与され得ることがまた意図される。
【0033】
TWEAKアゴニストは、WO98/05783、WO98/35061およびWO99/19490(これら全ては、本明細書中に参考として援用される)において教示されるようなアゴニストを含む。このようなTWEAKアゴニストは、可溶性組換えTWEAKタンパク質を含む。
【0034】
「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の両方について0.5×SSC〜約5×SSCかつ65℃に実質的に等価な塩および温度条件をいう。従って、本明細書中で使用される場合、用語「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、操作上の定義であり、そしてハイブリダイゼーション条件の範囲を含む。それにも関わらず、本発明の開示の目的のために「高ストリンジェンシー」条件は、プラークスクリーニング緩衝液(0.2%ポリビニルピロリドン、0.2%Ficoll 400;0.2%ウシ血清アルブミン、50mM Tris−HCl(pH7.5);1M NaCl;0.1%ピロリン酸ナトリウム;1%SDS);10%硫酸デキストラン、および100μg/ml変性超音波処理サケ***DNAを用いて、65℃で12〜20時間ハイブリダイズすること、および75mM NaCl/7.5mMクエン酸ナトリウム(0.5×SSC)/1%SDSを用いて、65℃で洗浄することを含む。「低ストリンジェンシー」条件は、プラークスクリーニング緩衝液、10%硫酸デキストラン、および110μg/ml変性超音波処理サケ***DNAを用いて、55℃で12〜20時間ハイブリダイズすること、および300mM NaCl/30mMクエン酸ナトリウム(2.0×SSC)/1%SDSを用いて、55℃で洗浄することを含む。Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.New York,Sections 6.3.1−6.3.6,(1989)もまた参照のこと。
【0035】
本明細書中で使用される場合、「治療的組成物」は、本発明の治療的成分および他の生物学的に適合性の成分を含むとして定義される。この治療的組成物は、水のような賦形剤、鉱物およびタンパク質のようなキャリアを含み得る。
【0036】
「野生型」は、それがインビボにおいて正常に存在するような、それぞれ、タンパク質もしくはその部分のエキソンの天然に存在するポリヌクレオチド配列、または天然に存在するタンパク質配列もしくはその部分を意味する。
【0037】
本発明の実施は、他に示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えDNA、タンパク質化学、および免疫学(これらは、当該分野内である)の従来の技術を使用する。このような技術は、文献に記載されている。他に明記されない限り、詳細な説明において引用される全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用される。
【0038】
(A.フラグメントおよびアナログの生成)
単離されたタンパク質のフラグメント(例えば、TWEAKのフラグメント)はまた、組換え方法、タンパク質分解的消化、または当業者に公知の方法を使用する化学的合成によって、効率的に生成され得る。組換え方法において、ポリペプチドの内部フラグメントまたは末端フラグメントは、単離されたTWEAKポリペプチドをコードするDNA配列の1つの末端(末端フラグメントについて)または両方の末端(内部フラグメントについて)から1つ以上のヌクレオチドを除去することによって生成され得る。変異誘発されたDNAの発現は、ポリペプチドフラグメントを生成する。「末端切除(nibbling)」エンドヌクレアーゼはまた、一連のフラグメントをコードするDNAを生成し得る。タンパク質のフラグメントをコードするDNAはまた、無作為な剪断、制限消化、もしくは組み合わせ、または両方によって生成され得る。タンパク質フラグメントは、インタクトなタンパク質から直接生成され得る。ペプチドは、タンパク質分解酵素(プラスミン、トロンビン、トリプシン、キモトリプシン、またはペプシンを含むがこれらに限定されない)によって特異的に切断され得る。これらの酵素の各々は、それが攻撃するペプチド結合の型に特異的である。トリプシンは、カルボニル基が塩基性アミノ酸(通常、アルギニンまたはリジン)に由来するペプチド結合の加水分解を触媒する。ペプシンおよびキモトリプシンは、芳香族アミノ酸(例えば、トリプトファン、チロシン、およびフェニルアラニン)由来のペプチド結合の加水分解を触媒する。切断されたタンパク質フラグメントの代替のセットは、タンパク質分解酵素に感受性である部位における切断を防止することによって生成される。例えば、穏やかに塩基性の溶液における、リジンのε−アミノ酸基のエチルトリフルオロチオアセテートとの反応は、隣接するペプチド結合がもはやトリプシンによる加水分解に感受性ではない、ブロックされたアミノ酸残基を生じる。タンパク質は、タンパク質分解酵素に感受性であるペプチド結合を作製するように改変され得る。例えば、β−ハロエチルアミンを用いるシステイン残基のアルキル化は、トリプシンによって加水分解されるペプチド結合を生じる(Lindley,(1956)Nature 178,647)。さらに、特定の残基においてペプチド鎖を切断する化学試薬が使用され得る。例えば、臭化シアンは、メチオニン残基においてペプチドを切断する(Gross and Witkip,(1961)J.Am.Chem.Soc.83,1510)。従って、修飾因子、タンパク質分解酵素および/または化学試薬の種々の組み合わせを用いてタンパク質を処理することによって、タンパク質は、重複のないフラグメントを有する所望の長さのフラグメントに分けられ得るか、または所望の長さの重複するフラグメントに分けられ得る。
【0039】
フラグメントはまた、メリフィールド固相F mocまたはt−Boc化学のような当業者に公知の技術を使用して、化学的に合成され得る。Merrifield,Recent Progress in Hormone Research 23:451(1967)。
【0040】
(B.変更されたDNAおよびペプチド配列の生成:無作為な方法)
タンパク質のアミノ酸配列改変体は、タンパク質またはその特定の部分をコードするDNAの無作為変異誘発によって調製され得る。有用な方法としては、PCR変異誘発および飽和変異誘発が挙げられる。無作為アミノ酸配列改変体のライブラリーはまた、変性オリゴヌクレオチド配列のセットの合成によって生成され得る。変更されたDNAおよびペプチドを使用して所定のタンパク質のアミノ酸配列改変体を生成する方法は、当業者に周知である。以下のこのような方法の例は、本発明の範囲を制限することを意図するのではなく、単に例示的な技術を示すために役立つ。当業者は、他の方法もまたこの点について有用であることを認識する。
PCR変異誘発:例えば、Leungら、(1989)Technique 1,11−15を参照のこと。
飽和変異誘発:1つの方法が、Mayersら、(1989)Science 229,242において一般に記載される。
変性オリゴヌクレオチド変異誘発:例えば、Harang,S.A.(1983)Tetrahedron 39,3;Itakuraら、(1984)Ann.Rev.Biochem.53,323およびItakuraら、Recombinant DNA,Proc.第3版 Cleveland Symposium on Macromolecules,273−289頁(A.G.Walton編)、Elsevier,Amsterdam,1981を参照のこと。
【0041】
(C.変更されたDNAおよびペプチド配列の生成;指向された方法)
非無作為(すなわち指向された)変異誘発は、単離されたポリペプチドの公知のアミノ酸配列の残基の欠失、挿入、または置換を含む改変体を提供するために、特定の配列または単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の特定の部分における変異を提供する。変異部位は、例えば、(1)最初に保存されたアミノ酸と置換し、次いで、達成される結果に依存して、より極端な選択アミノ酸と置換するか;(2)標的残基を欠失させるか;または(3)位置決めされた部位に隣接する同じまたは異なるクラスの残基を挿入するか、あるいは選択肢1〜3の組み合わせによって、個々にかまたは連続的に改変され得る。
【0042】
明らかに、このような部位指向方法は、N末端システイン(または機能的等価物)が疎水性部分の接着部位を提供するために、所定のポリペプチド配列に導入され得る1つの方法である。
アラニンスキャニング変異誘発:CunninghamおよびWells,(1989)Science 244,1081−1085を参照のこと。
オリゴヌクレオチド媒介性変異誘発:例えば、Adelmanら、(1983)DNA 2,183を参照のこと。
カセット変異誘発:Wellsら、(1985)Gene 34,315を参照のこと。
コンビナトリアル変異誘発:例えば、Ladnerら、WO88/06630を参照のこと。
【0043】
(処置方法)
本発明の方法は、新血管新生を促進するために、増大した血管形成活性が所望される疾患における処置として有用である。このような疾患および状態は、としては、以下が挙げられる:心筋虚血状態(例えば、心筋梗塞、心筋虚血に罹患した冠状動脈疾患を有する患者における増大した血流、または末梢脈管疾患におけるような心臓以外の領域への不十分な血流(ここでは、減少した血流が問題である)、例えば亀裂骨折または血管形成後での心筋層の壊死組織の脈管再生、アンギナ、心臓移植、脈管移植片、ならびに血管新生、灌流、膠原化、およびこれらの病変の器質化を改善するための血管再開(reopening vessel))、創傷治癒、ならびに組織および器官の移植(例えば、自己または異種の微小血管移植の増強)。創傷治癒の促進としては、切開、骨修復、熱傷治癒、心筋損傷における梗塞形成後修復、一般的には形成を促進するための胃潰瘍および胃腸管の他の潰瘍の治癒、組織の維持および修復が挙げられる。移植された(grafted)かまたは移植された(transplanted)組織の新血管新生もまた、特に脈管不全に罹患している被験体(例えば、糖尿病患者)において意図される。
【0044】
一般的事項として、本発明の方法は、新血管形成の調節が必要な任意の哺乳動物被験体のために利用され得る。本発明の方法に従って処置され得る哺乳動物被験体としては、ヒト被験体または患者が挙げられるがこれらに限定されない。しかし、本発明はさらに、飼い慣らされた哺乳動物(ヒトコンパニオンとして養われる哺乳動物(例えば、イヌ、ネコ、ウマ)、有意な商業的価値を有する哺乳動物(例えば、乳牛、肉牛、スポーツ用動物)、有意な科学的価値を有する哺乳動物(例えば、絶滅の危機にある種の捕獲検体または自由検体)、あるいは他の価値を有する哺乳動物)の処置において利用され得る。さらに、一般的事項として、本発明の方法で処置するための被験体は、新血管形成の調節の必要性と関連する徴候以外の、本発明の因子で処置するための徴候を示す必要はない。すなわち、処置のための被験体は、本発明のTWEAK治療剤での処置についての徴候がないことが予想される。
【0045】
医学または獣医学分野の当業者は、新血管形成の調節が必要であり得る被験体を認識するように訓練される。特に、現在開示されている処置方法および他の処置方法に関連する臨床試験および非臨床試験、ならびに蓄積された経験は、当業者が決定する際に、所定の被験体が調節の必要があるか否か、および任意の特定の処置が、本発明に従う処置を含めてこの被験体の必要性に最適であるか否かを知らせることが予測される。
【0046】
従って、本発明の方法は、新血管形成を促進するため(例えば、心筋梗塞の結果としての心筋組織の損傷を修復するため)に、TWEAKアゴニストまたはその生物学的に活性な部分、および血管形成因子を利用し得る。このような方法はまた、虚血後の心臓血管系の修復(側副血管系の増殖を含む)を含み得る。TWEAKアゴニストおよび血管形成因子を利用する方法は、冠状バイパス手術が行われる場合の移植された組織および側副血管系の増殖を刺激するために利用され得る。方法はまた、冠状動脈疾患ならびに末梢神経系および中枢神経系の脈管疾患または虚血の結果として損傷した管脈組織を処置し得る。
【0047】
本発明の方法はまた、特に損傷組織に血管を移植するために、または虚血の間に側枝の血流を刺激するために、および新しい毛細管の新血管形成が所望される場合に、創傷治癒を促進し得る。本発明の他の方法は、真皮性潰瘍のような全層創傷(とこずれ、静脈性潰瘍、および糖尿病性潰瘍を含む)を処置するために利用され得る。さらに、TWEAK治療剤を利用する方法は、全層熱傷および損傷(ここで、このような熱傷および損傷を処置するために、皮膚移植片または皮弁が使用される)を処置するために利用され得る。このようなTWEAKアゴニストおよび血管形成因子はまた、形成手術(例えば、裂傷、熱傷、または他の外傷の修復)における使用のために利用され得る。泌尿器科学において、本発明の方法は、***機能の回復を補助し得る。
【0048】
新血管形成は、創傷を清潔かつ感染されないように保つことにおいて重要であるので、方法は、手術および引き続く切断の修復に関連して利用され得る。これらはまた、感染の危険性が高い腹創傷の処置のために利用され得る。本明細書中に記載のTWEAK治療剤を使用する方法は、脈管移植手術における内皮化(endothelialization)の促進のために利用され得る。移植された材料または合成材料のいずれかを使用する脈管移植の場合において、TWEAKアゴニストおよび血管形成因子は、内皮細胞と関連して脈管平滑筋および外膜細胞の増殖を促進するために、移植片の表面または接合部に適用され得る。
【0049】
本発明の方法はまた、移植される材料の拒絶を最小にするため、そして移植された材料の血管新生(vascularization)を刺激するために、身体に移植される人工プロテーゼまたは天然の器官をコートするために利用され得、そしてこの方法はまた、脈管組織の修復(例えば、動脈硬化の間に起こる修復、および脈管組織が損傷した部分でバルーン血管形成の後に必要とされる修復)のために利用され得る。具体的には、本発明の方法は、動脈壁の損傷からの回復を促進するため、従って再狭窄を防止するために利用され得る。
【0050】
TWEAKアゴニストをコードする核酸配列はまた、科学的研究、DNAの合成およびDNAベクターの製造に関連するインビトロの目的で、そしてヒト疾患を処置するための診断剤および治療剤の生成のために利用され得る。例えば、本発明の方法は、脈管平滑筋細胞、線維芽細胞、造血細胞、筋肉、筋腱(myotendonous)接合部、骨または軟骨誘導細胞、および他の間葉細胞のインビトロ培養を含み得、ここでTWEAK治療剤は、馴化培地に10ng/ml〜20μg/mlの濃度で添加される。
【0051】
これらの治療剤は、利用される特定の薬剤と適合性の任意の経路によって投与され得る。本発明の治療剤は、任意の適切な手段(好ましくは直接的(例えば、組織部位への注射または局所投与によるように局所的に)あるいは全身的(例えば、非経口的または経口的))によって個体へと供給され得る。この薬剤が非経口的に(例えば、静脈内、動脈内、皮下、または筋肉内投与によって)提供される場合、この薬剤は、好ましくは、水溶液の部分を構成する。この溶液は、被験体への所望の薬剤の送達に加えて、この溶液が被験体の電解質および/または容量の平衡に他の悪影響を与えないように、生理学的に受容可能である。この治療剤のための水性媒体は、通常の生理食塩水(例えば、9.85% NaCl、0.15M、pH7〜7.4)を含み得る。
【0052】
この治療剤は、好ましくは薬学的に受容可能なキャリアを含む滅菌の薬学的組成物として投与され、このキャリアは、多数の周知のキャリア(例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、またはこれらの組み合わせ)のいずれかであり得る。本発明の化合物は、無機または有機の酸および塩基から誘導される薬学的に受容可能な塩の形態で使用され得る。このような酸塩には、以下が含まれる:酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫化水素塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、二グルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩(hemisulfate)、へプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、2−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、2−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピルビン酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシレート、およびウンデカン酸塩。塩基塩としては、以下が挙げられる:アンモニウム塩、アルカリ金属塩(例えば、ナトリウム塩およびカリウム塩)、アルカリ土類金属塩(例えば、カルシウム塩およびマグネシウム塩)、有機塩基を有する塩(例えば、ジシクロヘキシルアミン塩、N−メチル−D−グルカミン、トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミンおよびアミノ酸(例えば、アルギニン、リジンなど)を有する塩)。また、塩基性窒素含有基は、アルキルハライド(例えば、メチル、エチル、プロピル、およびブチルクロリド、ブロミドおよびヨージド);硫酸ジアルキル(例えば、硫酸ジメチル、硫酸ジエチル、硫酸ジブチル、および硫酸ジアミル)、長鎖ハライド(たとえば、デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステアリルクロリド、ブロミド、およびヨージド)、アラルキルハライド(例えば、ベンジルブロミドおよびフェネチルブロミド)などのような薬剤で四級化され得る。水または油に溶解性または分散性の生成物は、これによって得られる。
【0053】
TWEAKアゴニストおよび血管形成因子の薬学的組成物は、任意の薬学的に受容可能なキャリアと共に、本発明の化合物、またはそれらの薬学的に受容可能な誘導体のいずれかを含む。用語「キャリア」は、本明細書中で使用される場合、受容可能なアジュバントおよびビヒクルを含む。本発明の薬学的組成物において使用され得る薬学的に受容可能なキャリアとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン)、緩衝性物質(例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質(例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、硫酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂)。
【0054】
(注射送達)
本発明に従って、この薬学的組成物は、滅菌注射可能調製物(例えば、滅菌注射可能な水性または油性の懸濁液)の形態であり得る。この懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、当該分野で公知の技術に従って処方され得る。この滅菌注射可能調製物はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射可能な溶液または懸濁液(例えば、1,3−ブタンジオール中の溶液のような)であり得る。利用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒は、水、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として慣習的に利用されている。この目的のために、任意の穏やかな不揮発性油(合成のモノ−またはジグリセリドを含む)が利用され得る。脂肪酸(例えば、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体)は、天然の薬学的に受容可能な油(例えば、オリーブ油またはヒマシ油)と同様に、注射可能物質(特に、そのポリオキシエチル化バージョンにおいて)の調製において有用である。これらの油溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤または分散剤を含み得る。
【0055】
特定の治療剤の制御放出投与は有用であり得る。例えば、治療剤は、静脈内注入、移植可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与形態を使用して、投与され得る。1つの実施形態において、ポンプが使用され得る[Langerら編,Medical Applications of Controlled Release,CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974);Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.,14:201(1987);Buchwaldら,Surgery,88:507(1980);Saudekら,N.Engl.J.Med.,321:574(1989)]。別の実施形態において、ポリマー材料が使用され得る[Langer,1974,前出;Sefton,1987,前出;Smolenら編,Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Wiley,N.Y.(1984);Rangerら,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.,23:61(1983)を参照のこと;Levyら,Science,228:190(1985);Duringら,Ann.Neurol.,25:351(1989);Howardら,J.Neurosurg.,71:105(1989)もまた参照のこと]。なお別の実施形態において、制御放出系は、治療標的(例えば、腫瘍)の近位に配置され得、従って、全身容量の画分のみを必要とする[例えば、Goodson、Medical Applications of Controlled Release,vol.2,pp.115−138(1984)を参照のこと]。他の制御放出系は、Langer,Science,249:1527−1533(1990)による総説において議論される。別の実施形態において、この治療化合物は、小胞(特に、リポソーム)中で送達され得る(Langer,1990,前出;Treatら,Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez−BeresteinおよびFidler(編),Liss,New York,pp.353−365(1989);Lopez−Berestein,pp.317−327を参照のこと;一般的には同書を参照のこと)。
【0056】
(経口送達)
経口固体用量形態が本明細書中で使用のために意図され、これは、Martin,Chapter 89,1990,前出(これは、本明細書中で参考として援用される)において一般に記載される。固体用量形態としては、錠剤、カプセル、丸剤、トローチまたはロゼンジ、カシェあるいはペレットが挙げられる。また、リポソームまたはプロテイノイドカプセル化は、本発明の組成物を処方するために使用され得る(例えば、米国特許第4,925,673号に報告されるプロテイノイドミクロスフェアのように)。リポソームカプセル化が使用され得、そしてこのリポソームは、種々のポリマーから誘導体化され得る(例えば、米国特許第5,013,556号)。治療剤について可能な固体用量形態の記載は、Marshall,Modern Pharmaceutics,Chapter 10,BankerおよびRhodes編(1979)(本明細書中に参考として援用される)によって与えられる。一般に、この処方物は、治療剤(または化学的に修飾された形態)、ならびに胃の環境に対する保護および生物学的活性材料の腸での放出を可能にする不活性成分を含む。
【0057】
タンパク質(または誘導体)について、放出の位置は、胃、小腸(十二指腸、空腸(jejunem)、または回腸)、あるいは大腸であり得る。当業者は、胃では溶解せず、この材料を十二指腸また腸の他の部位に放出する、利用可能な処方物を有する。好ましくは、この放出は、タンパク質(または誘導体)の保護によって、または胃の環境を越えての生物学的活性材料の放出(例えば、腸において)によってのいずれかで、胃の環境の有害な影響を回避する。胃への完全な耐性を保証するために、少なくともpH5.0まで不浸透性であるコーティングが必須である。腸陽性コーティングとして使用されるより一般的な不活性成分の例は、トリメリト酸酢酸セルロース(CAT)、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、フタル酸酢酸ポリビニル(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、フタル酸酢酸セルロース(CAP)、Eudragit L、Eudragit S、およびShellac。これらのコーティングは、混合フィルムとして使用され得る。コーティングまたはコーティング混合物はまた、錠剤において使用され得、これは胃に対する保護について意図されない。これは、糖コーティング、またはより飲み込みやすい錠剤を作製するコーティングを含み得る。カプセルは、乾燥治療剤(すなわち、粉末)の送達のための硬質殻(例えばゼラチン)からなり得;液体形態については、軟質ゼラチン殻が使用され得る。カプセルの殻材料は、厚いデンプンまたは他の食用紙であり得る。丸剤、ロゼンジ、成形錠剤または錠剤粉砕物について、湿式集結技術が使用され得る。
【0058】
治療剤は、粒子径約1mmの顆粒またはペレットの形態における微細多成分のような処方物を含み得る。カプセル投与のための処方材料はまた、粉末、軽く圧縮されたプラグ、または錠剤でさえあり得る。治療剤は、圧縮によって調製され得る。着色剤および香味剤は、全て含まれ得る。例えば、タンパク質(または誘導体)が処方され得(例えば、リポソームまたはミクロスフェア被包によって)、次いでさらに、食用品(例えば、着色剤および香味剤を含む冷蔵された飲料)に含まれ得る。不活性材料を用いて希釈し、治療剤の用量を増し得る。これらの希釈剤は、以下を含み得る:炭水化物、特にマンニトール、α−乳糖、無水乳糖、セルロース、ショ糖、修飾デキストラン、およびデンプン。特定の無機塩はまた、カルシウム三リン酸、炭酸マグネシウム、および塩化ナトリウムを含む賦形剤として使用され得る。いくつかの市販の希釈剤は、Fast−Flo、Emdex、STA−Rx 1500、Emcompress、およびAvicellである。崩壊剤は、固形投与形態中における治療剤の処方物中に含まれ得る。崩壊剤として使用される材料は、デンプンを基にした市販の崩壊材であるExplotabを含むデンプンを含むが、これに限定されない。デンプングリコレートナトリウム、アンバーライト(Amberlite)、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン(ultramylopectin)、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、みかんの皮、カルボキシルメチルセルロース酸、天然のスポンジ、およびベントナイトは、全て用いられ得る。この崩壊剤の別の形態は、不可溶性のカチオン交換樹脂である。粉末化されたゴムは、賦形剤および結合剤として用いられ得て、これらは、粉末化されたゴム(例えば、寒天、Karaya,またはトラガカントを含み得る。アルギン酸およびこのナトリウム塩はまた、崩壊剤として有用である。結合剤を用いて、治療剤を合わせて、固い錠剤を形成し得る。結合剤は、天然物(例えば、アカシア、トラガカント、デンプン、およびゼラチン)由来の材料を含む。他は、メチルセルロース(MC)、エチルセルロース(EC)、およびカルボキシメチルセルロース(CMC)を含む。ポリビニルピロリドン(PVP)およびヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)は両方、アルコール溶液中で用いられて、治療剤を顆粒化し得る。抗摩擦剤は、治療剤の処方物中に含まれて、処方のプロセスの間の固着を予防し得る。潤滑剤は、治療剤とダイウォール(die wall)の間の層として、用いられ得、これは、以下を含むが、これらに限定されない:ステアリン酸(このマグネシウム塩およびカルシウム塩を含む)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、流動パラフィン、野菜油、およびワックス。可溶性の潤滑剤はまた、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、Carbowax 4000および6000が用いられる。処方の間の薬物の流動特性を改善し得、圧縮の間の再構成を助けるグリダント(glidant)を添加し得る。グリダントは、デンプン、タルク、発熱性シリカ、およびケイアルミン酸水和物を含み得る。
【0059】
水性の環境への治療剤の溶解を助けるために、表面活性剤を湿潤剤として添加し得る。表面活性剤は、アニオン性界面活性剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、およびスルホン酸ジオクチルナトリウム)を含み得る。カチオン性界面活性剤が使用され得、これは、塩化ベンザルコニウム、または塩化ベンゼトニウムを含み得る。界面活性剤のような処方物中に含まれ得る潜在的非イオン性界面活性剤の列挙は、ラウロマクロゴール400、ポリオキシ40ステアリン酸、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油10、50ならびに60、モノステアリン酸グリセリン、ポリソルベート40、60、65、ならびに80、糖脂肪酸エステル、メチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースである。これらの表面活性剤は、タンパク質または誘導体の処方物中に、単独または異なる割合での混合物のいずれかで存在し得る。タンパク質(または誘導体)の取りこみを潜在的に増大する添加物は、例えば、脂肪酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸である。
【0060】
(肺送達)
本発明のタンパク質(またはこれの誘導体)の肺送達も本明細書中において考慮される。タンパク質(または誘導体)は、吸入され、肺上皮内層を通って、血流へ横断し、哺乳動物の肺へ送達される。このことの他の報告は、Adjeiら,Pharmaceutical Research,7(6):565−569(1990);Adjeiら,International Journal of Pharmaceutics,63:135−144(1990)(酢酸ロイプロリド);Braquetら,Journal of Cardiovascular Pharmacology,13(suppl.5):143−146(1989)(エンドセリン−1);Hubbardら,Annals of Internal Medicine,3(3):206−212(1989)(α1−抗トリプシン);Smithら,J.Clin.Invest.,84:1145−1146(1989)(α1−プロテイナーゼ) ;Osweinら,「Aerosolization of Proteins」,Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery lI,Keystone,Colo.,(1990年3月)(組換えヒト成長ホルモン);Debsら,J.Immunol.,140:3482−3488(1988)(インターフェロン−γおよび腫瘍壊死因子α)、およびPlatzら,米国特許第5,284,656号(顆粒球コロニー刺激因子)。本発明の実施における使用のための治療製品の肺送達のために設計される広範な機械的装置(噴霧器、定量吸入器、および粉末吸入器(これら全ては、当業者によく知られている)を含むが、これらに限定されない)が考慮される。
【0061】
本発明の実施に適切な市販の装置のいくつかの特定の例は、Ultravent噴霧器(Mallinckrodt,Inc.,St.Louis,Mo.製);Acorn II噴霧器(Marquest Medical Products,Englewood,Colo.製)、Ventolin定量吸入器(Glaxo Inc.,Research Triangle Park,N.C.製);Spinhaler粉末吸入器(Fisons Corp.,Bedford,Mass.製)である。全てのこのような装置は、タンパク質(または誘導体)の調剤のための適切な処方物の使用を必要とする。代表的に、各処方物は、用いられる装置の型に特異的であり、治療に有用な希釈材、アジュバント、および/またはキャリアの使用に加えて、適切な噴霧剤材料の使用を含み得る。また、リポソーム、マイクロカプセル、もしくはミクロスフェア、包含複合体、または他の型のキャリアの使用が考慮される。化学修飾されたタンパク質はまた、化学修飾の型または使用される装置の型に依存して異なる処方物に調製され得る。
【0062】
噴霧器(ネブライザー)(ジェットまたは超音波のいずれか)の使用に適切な処方物は、代表的に水中に溶液1mLあたり約0.1〜25mgの生物学的に活性なタンパク質の溶液濃度で溶解したタンパク質(または誘導体)を含む。処方物はまた、緩衝液および単糖(例えば、タンパク質安定化および浸透圧の制御のため)を含む。噴霧剤処方物はまた、界面活性剤を含み、エアロゾルを形成における溶液の微粒化によって起きる、表面タンパク質の定量誘導凝集を減少または予防し得る。
【0063】
定量吸入器装置を用いて使用する処方物は一般に、界面活性剤に助けを借りて噴霧剤中に懸濁されたタンパク質(または誘導体)を含む、微細に分けられた粉末を含む。噴霧剤は、この目的のために用いられる任意の従来の材料であり、例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、または炭化水素(トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、およびジクロロテトラフルオロエタノール、および1,1,1,2−テトラクロルエタン)、またはこれらの組み合せを含む。適切な界面活性剤は、ソルビタントリオレートおよび豆レシチンを含む。オレイン酸はまた、界面活性剤として有用であり得る。
【0064】
粉末吸入装置から調剤するための処方物は、タンパク質(または誘導体)を含む、微細に分けられた乾燥粉末を含み、またバルキング剤(例えば、乳糖、ソルビトール、ショ糖、またはマンニトールを、装置からの粉末の撒布を容易にする量(例えば、処方物の50〜90重量%)において含み得る。タンパク質(または誘導体)は、肺の末端に最も効率よく送達するために、平均粒子径が10mu m(すなわちμm)未満(最も好ましくは、0.5〜5mu m)である特定の形態において最も有利に調製されるべきである。
【0065】
(投薬)
全ての上記分子について、さらなる研究が考慮されるにつれて、種々の患者における種々の状況の処置のための適切な投与レベルについての情報が明らかにされ、通常の当業者は、レシピエントの治療的背景、年齢、および全身の健康を考慮して、適した投薬を確立し得る。一般に、注射または輸液について、投薬は、0.01mu gの生物学的に活性なタンパク質/kg体重(タンパク質質量のみを計算し、化学修飾を考慮しない)と10mg/kg(同様に基づく)の間である。使用されるタンパク質もしくは誘導体の循環中半減期、ポリペプチドがボーラス用量によって送達されれるのかまたは連続した注入によって送達されれるのか、および使用される処方物に依存して、投与スケジュールは、変化し得る。
【0066】
(他の化合物を用いた投与)
新血管形成を改変することに関する治療について、本発明のTWEAKアゴニスト(または誘導体)および血管新生因子を、新血管形成を改変する必要のある他の臨床的合併症の処置のために使用される、1つ以上の薬学的組成物(例えば、癌の処置に使用される組成物(例えば、化学療法剤)、悪疫質、高血圧、高コレステロール、および他の悪条件の処置に使用される組成物)と組み合せて投与し得る。投与は、同時にされ得るか、順次行われ得る。
【0067】
(核酸に基づく治療的処置)
TWEAKアゴニストをコードする核酸配列は、ヒト腫瘍または血管壁細胞中に誘導され、遺伝子治療を展開する。
【0068】
1つの実施形態において、TWEAKアゴニストをコードする核酸配列は、ウイルスベクターにおいて、インビボ誘導される。このようなベクターは、弱毒化されたDNAウイルスまたは欠損DNAウイルス(例えば、単純疱疹ウイルス(HSV)、乳頭腫ウイルス、エプスタイン−バーウイルス(EBV)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)に限定されない)を含む。ウイルス遺伝子の全体またはほぼ全体が欠損している欠損DNAウイルスが好ましい。欠損DNAウイルスベクターは、細胞導入後に、感染性でない。欠損DNAウイルスの使用は、特定の、局在領域における細胞への投与を可能にし、ベクターが他の細胞に感染し得ることを考慮する必要はない。従って、脂肪組織は、特異的に標的化され得る。特定のベクターの例は、欠損ヘルペスウイルス1(HSV1)ベクター(Kaplittら, Molec.Cell.Neurosci.,2:320−330(1991))、弱毒化されたアデノウイルスベクター(例えば、Stratford−Perricaudetら,J.Clin.Invest.,90:626−630(1992)に記載されるベクター)、および欠損アデノ随伴ウイルスベクター(Samulskiら,J.Virol.,61:3096−3101(1987);Samulskiら,J.Virol.,63:3822−3828(1989))を含むが、これらに限定されない。別の実施形態において、核酸は、レトロウイルスベクター(例えば、Andersonら,米国特許第5,399,346号;Mannら,Cell,33:153(1983);Teminら,米国特許第4,650,764号;Teminら,米国特許第4,980,289号;Markowitzら,J.Virol.,62:1120(1988);Teminら,米国特許第5,124,263号;Doughertyらによる国際公開特許出願WO95/07358(1995年3月16日公開);およびKuoら,Blood,82:845(1993)に記載される)に導入され得る。あるいは、ベクターは、リポフェクションによってインビボ導入され得る。過去10年間、インビトロでの核酸の被包およびトランスフェクションのためのリポソームの使用が増えてきている。リポソーム媒介トランスフェクションに含まれる困難性および危険性を制限するよう設計された合成カチオン性脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製し得る(Felgnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7413−7417(1987);Mackeyら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:8027−8031(1988)を参照)。カチオン性脂質の使用は、陰性に荷電した核酸の被包を促進し得、また陰性に荷電した細胞膜との融合を促進する(Felgnerら,Science,337:387−388(1989))。外因性遺伝子を特定の器官にインビボで導入するためのリポフェクションの使用は、特定の実用上の利点を有する。リポソームの特定の細胞への分子標的化は、1つの領域の利点を示す。特定の細胞型へのトランスフェクションを指向することは、細胞不均一性を有する組織(例えば、膵臓、肝臓、腎臓、および脳)において、特に有利であることが明らかである。脂質は、標的化の目的のために、化学的に他の分子に結合され得る(Mackeyら,1988,前述)。標的化ペプチド(例えば、ホルモンまたは神経伝達物質)、およびタンパク質(例えば、抗体)、または非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合され得る。
【0069】
ベクターを裸のDNAプラスミドとして、インビボで導入することもまた可能である。遺伝子治療のための裸のDNAベクターは、当該分野において公知の方法(例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、またはDNAベクタートランスポーターの使用)によって、所望の細胞中に導入され得る(例えば、Wuら,J.Biol.Chem.,267:963−967(1992);Wuら,J.Biol.Chem.,263:14621−14624(1988);Hartmutら,カナダ特許出願第2,012,311号(1990年3月15日に出願)を参照のこと)。
【0070】
カテーテルまたは他の装置と組み合せて、ベクターをインビボで導入することも可能である。Valeら,1999年;Kornowskiら,2000年を参照のこと。
【0071】
(実施例)
以下の実施例は、本発明の局面を例示するが、限定として解釈されるべきでない。本実施例において使用される記号および約束事は、現代の医学的および化学的文献において使用されるものと一致する。
【0072】
(実験手順)
(細胞)ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)をCell System Corporation(CS−C)(Kirkland,WA)またはClonetics(San Diego,CA)から入手し、そしてヒト肺動脈内皮細胞(HPAEC)、ヒト肺微小血管内皮細胞(HMVEC−L)、ヒト皮膚微小血管内皮細胞(HMVEC−D)をCloneticsから入手した。HUVECを慣用的にCS−C培地中において継代し、7回継代するまで実験に用いた。他の初代細胞を、慣用的にMicrovascular Endothelial Cell Growth Medium−2(EGM2−MV)(Clonetics)において継代した。2%胎仔ウシ血清(FBS)を含むEC Basal Medium(EBM)(「基礎培地」として規定される)、ならびに2%FBSおよび増殖補助因子を含むEBM(完全培地として規定される)を増殖、遊走、および免疫蛍光染色実験に用いた。EC Basal Medium 2(EBM−2)および増殖補助因子を特定化のための毛細血管形成アッセイにおいて用いた。
【0073】
(試薬および抗体)組換えヒトbFGFを増殖補助因子(Clonetics)として入手し、bFGFはまた、R&D Systems(Minneapolis,MN)およびSigma(St.Louis,MO)から入手した。アネキシンV−FITCをPharmingen(San Diego,CA)から入手し、ヨウ化プロピジウム(PI)をSigma(St.Louis,MO)から入手し、ウサギ抗ヒトFlk−1抗体およびウサギ抗Flt−1抗体を、Research Diagnostics Inc.(Flanders,NJ)から入手し、マウス抗Flgモノクローナル抗体(mAb)をChemicon(Temecula,CA)から入手し、マウス抗ヒトβ3、マウス抗ヒトβ1(クローンLIA 1/2)、およびラット抗ヒトαVmAbをImmunotech(Westbrook,ME)から入手し、マウス抗ヒトα5をPharmingen(San Diego,CA)から入手し、マウス抗ヒトα1(クローンAJH10)をBiogenから入手した(Gotwals P.J,ら,1999年、Biochem.38:8280−8288)。
【0074】
フィコエリトリン(PE)−結合体化ロバ抗ウサギIgG、ヤギ抗マウスIgG、およびロバ抗ラットIgGをJackson Immunoresearch Labs Inc.(West Groove,PA)から入手し、ビオチン結合体化抗フラッグをEastman Kodak Company(New Haven,CT)から入手し、そしてRPE−ストレプトアビジンをSouthern Biotechnology Associates,Inc.(Birmingham,AL)から入手した。可溶性CD40LをBiogenにおいて以前に記載したように調製された(Karpusas,M.ら,1995.Structure 3:1426−xxx)。
【0075】
TWEAK特異的mAbであるBE.B3およびAB.D3を、可溶性ヒトTWEAKタンパク質で免疫することにより、そして標準的ハイブリドーマ生成手順によりアルメニアハムスターにおいて生成した。AB.D3がヒトおよびマウスTWEAKに結合する能力、ならびにBE.B3がヒトTWEAKに結合する能力を、96ウェルマイクロタイタープレートに固定化した組換え可溶性TWEAKタンパク質を用いてELISAアッセイにおいて決定した。AB.D3のブロッキング能力を、FACS分析において、このmAb(BE.B3ではない)が、HT29細胞への可溶性FLAGタグ化ヒトTWEAK結合を阻害する能力により決定した。BE.B3を製造業者のプロトコル(Pierce,Rockford,IL)に従ってImmunoPure Biotinylationキットを用いてビオチン化し、そして調製した。ハムスターコントロールIg(クローンHa4/8−3.1)をアメリカンタイプカルチャーコレクションから得て、mAbを、プロテインA Fast Flowカラム(Pharmacia,Piscataway,NJ)により培養上清から精製した。
組換え可溶性ヒトTWEAKタンパク質−mycタグ化ヒトTWEAKについての可溶性発現構築物を、以前に記載したように構築した(Chicheportiche,Y.ら1997.J.Biol.Chem.272:32401−32410)。Flagタグ化および非タグ化形態もまた作製した。これらの可溶性形態のTWEAKを、酵母Pichia pastoris株GS 115において、標準的方法を用いて発現させた。
【0076】
増殖アッセイ−HUVECを、96ウェルマイクロタイタープレートにおいてコンフルエント未満に(4000細胞/ウェル)プレートし、そして製造業者の増殖補充物を添加することなくCS−C培地中で一晩増殖させた。培地を、上記で規定されるように完全培地または基礎培地と交換した。細胞を、TWEAK(100ng/ml)、bFGF増殖補充物(Clonetics)の1/500−1/1000希釈物を用いたbFGF、もしくは1ng/ml(R&D Systems),VEGF(10ng/ml)またはこれらの因子の組み合わせありまたはなしの基礎培地中で培養した。示された場合、10μg/mlの抗TWEAK mAbであるAB.D3、BE.B3またはハムスターコントロールIg Ha4/8もまた添加した。細胞を、5%CO2とともに37℃で3日間インキュベートし、そして増殖を、3H−チミジンで培養の最後の10時間にわたりパルスすることにより測定した。細胞に結合した放射活性を、BetaplateTM(EG&G Wallac,Gaithersburg,MD)を用いて測定した。
【0077】
アポトーシスの分析−HUVECを、1.2×105細胞/ウェルの密度で6ウェルプレートに播種し、製造業者の増殖補充物なしでCS−C培地中で一晩インキュベートした。培地を、完全培地、あるいはTWEAK(200ng/ml)、bFGF(1ng/ml)もしくはこれらの因子の組み合わせありまたはなしの基礎培地と交換し、細胞を24時間培養した。細胞をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄し、ディスパーゼ(CS−C)と37℃で15分間インキュベートし、続いて5mM EDTAおよび0.1% BSAを含むPBSを37℃で15分間再配置することにより剥離した。PBSでさらに洗浄した後、細胞を、製造業者(Pharmingen)に従って、FITC−アネキシン−Vおよび5μg/mlのヨウ化プロピジウムで染色した。蛍光を、FACStarPLUS(Becton Dickinson,San Jose,CA)を用いて時間内に分析した。
【0078】
内皮細胞創傷修復アッセイ−標準的な創傷修復アッセイを、以前に記載のように(Bussolino F.,et al,1991.J.Clin.Invest.87:986−991)用いた。簡潔には、コンフルエントな単層のHUVECを、2mmグリッド付きの35×10mm細胞培養ディッシュ(Nalge Nunc International,Naperville,IL)のCS−S培地中で増殖させた。この単層を、このディッシュの直径にわたり、1mmチップで2回直角に引っ掻く(stroke)ことにより傷をつけた(Morales D.E.ら,1995.Circulation 91:755−763)。押しのけた細胞を吸引し、プレートをPBSでリンスした。細胞を完全培地、あるいはTWEAK(200ng/ml)、bFGF(1/1000もしくは1ng/ml)、VEGF(10ng/ml)もしくはこれらの組み合わせありまたはなしの新鮮な基礎培地中で培養し、5%CO2とともに37℃で18時間インキュベートした。この時点で、プレートを1%パラホルムアルデヒドで固定し、Harris Hematoxylin(Sigma,St.Louis,MO)で染色した。創傷修復を、間隙が移動細胞により覆い隠されたグリッドの数を肉眼で計数することによって定量した。この数を創傷を配置したグリッドの総数で割り、結果を平均%創傷修復+/−SEMとしてあらわした。
【0079】
免疫蛍光染色−HUVECを、TWEAK(200ng/ml)、bFGF(1ng/ml)または両因子ありまたはなしの基礎培地中で24時間培養した。細胞を上記のように剥離し、0.1%ウシ血清アルブミンおよび0.02% NaN3を含有する200μlのPBS中の1次抗体10μg/mlを用いて4℃で20分間染色した。同じ緩衝液で洗浄した後、PE結合体化検出抗体を、製造業者により特定された濃度で、さらに15分間4℃で添加した。細胞をflagまたはmycのいずれかでタグ化したTWEAKとともにインキュベートすることによりTWEAK結合について分析した。ビオチン化したマウス抗flag抗体またはビオチン化BE.B3のいずれか、およびストレプトアビジン−PEを用いて結合を検出した。コールド競合を非タグ化TWEAKで行い、ブロッキングをAB.D3 mAbで行った。
【0080】
毛細管形成アッセイ−ECによる毛細管形成を、以前に記載された方法(Mach,F.ら,1999.Am.J.Pathol.154:229−239)に基づいて、3次元フィブリンマトリクスゲルアッセイを用いて分析した。簡潔には、4mg/mlのプラスミノゲン非含有ヒトフィブリノゲン(Calbiochem,San Diego,CA)を、ヘパリンおよびポリミキシンB(ともに1μg/ml)(Sigma)ならびに製造業者の補充物の全て(VEGFおよびbFGFを除く)を含有する無血清EBM−2培地中に溶解した。フィブリン溶液を濾過滅菌し、フィブリンマトリクスを、24ウェルプレートにおいてトロンビン(20〜50ミリユニット/ml)(Sigma)を添加し、300μl/ウェルで分配することにより調製した。次いで、ゲル表面に適切な濃度のEC(HUVECおよびHPAECについては4×104細胞/cm2、ならびにHMVEC−LおよびHMVEC−Dについては8×104/cm2)を播種し、上記のようにEBM−2倍地を重層し、特定されたように、TWEAK、bFGF、sCD40Lまたはこれらの因子の組み合わせの存在下および非存在下で5%FBSを重層した。培養して72時間後、ゲル表面の位相差顕微鏡写真を撮影した。ゲルを最初のウェルから新しいウェルに移し、10%エタノールで10分間、次いで4%パラホルムアルデヒドで固定した。ゲルを分析のために断片で切片にし、写真を撮った。
【0081】
(実施例1:TWEAKは、bFGF依存性増殖を増強する)
TWEAKのEC機能に対する効果を、TWEAK単独および別の血管形成性増殖因子と組み合わせて処理した培養物においてEC増殖を試験することにより調査した。ヒト臍静脈EC(HUVEC)を、bFGFの存在下および非存在下で基礎培地中で培養した(図1)。TWEAKの添加により、有意なECの増殖は誘導されなかった。対照的に、TWEAKおよび最適濃度のbFGFとともに培養した細胞は、bFGF単独の存在下で培養した細胞と比較して、有意に増強した増殖応答が示された。達成された増殖の程度は、完全培地で培養したECの程度に匹敵するか、またはこれより大きかった。1ng/mlのbFGFを用いて、同様の結果が認められた。TWEAKとbFGFの相乗的活性は、抗TWEAK mAbであるAB.D3により完全に阻害され、このことは、TWEAKの効果が特異的であるのに対して、抗TWEAK mAbであるBE.B3または無関係のコントロールIgによる阻害がなかったことを示唆する。さらに、組換え可溶性APRIL(別のTNFリガンド)では、増強は認められなかった(データは示さず)。図1に示した結果についての実験条件を、ここで詳細に記載する。HUVECを、完全培地または基礎培地中で培養した。TWEAK(100ng/ml)、bFGF(1/500希釈)またはこれらの因子の組み合わせを示されるように基礎培地に3日間添加し、3H−チミジン取り込みにより増殖を測定した。図1において、データは、3連のウェルの平均値+/−SDを示す。これらの結果は、4つの独立した実験の代表値である。ここで、bFGF+TWEAK処理培養物での増殖は、bFGF単独、TWEAK単独および基礎培地で培養したものとは、有意に異なり(P値<0.05)、TWEAKありまたはなしの基礎培地での培養物の間に有意差はなかった。増殖因子に加えて、ブロッキング抗TWEAK mAbであるAB.D3、非ブロッキング抗TWEAK mAbであるBE.B3、および無関係のハムスターコントロールIg Ha4/8(10μg/ml)を、示された場合に添加した。結果は、2つの独立した実験のうちの1つの代表値である。
【0082】
(実施例2:bFGFとTWEAKによるEC増殖の増強は、細胞死の減少に起因しない)
TWEAK/bFGF組み合わせによるHUVEC増殖の見掛けの増強は、細胞***の増加および細胞死の減少に起因し得る。この機構を扱うために、TWEAK、bFGFもしくは両方ありまたはなしの基礎培地中で培養したHUVECを分析して、アポトーシス細胞の頻度を決定した。アネキシンV染色を用いて、アポトーシスを受ける細胞を検出し、ヨウ化プロピジウム(PI)色素排除を用いて生細胞を検出した。TWEAKおよびbFGFの組み合わせで処理した培養物は、bFGF単独で処理した培養物のものと匹敵する生細胞、アポトーシス細胞および死細胞の割合を示した。これらの割合を、図2において、それぞれ四半分3、4および2に示す。2つのさらなる実験において同様の結果を得、ここ2倍体未満のDNA含有量を有する細胞を定量した(bFGF中で11%およびbFGF/TWEAK処理した培養物において11%)。従って、TWEAKによるbFGF依存性増殖の増強は、細胞死の減少に起因しない。にもかかわらず、TWEAK単独により細胞死の頻度が22%から14%にまで減少したことは注目すべきである。このパターンはまた、2つの独立した実験において認められ、ここで2倍体未満のDNAを有する細胞の割合は、TWEAKの存在下および非存在下で、それぞれ平均18+/−1%および9+/−0%であった。
【0083】
図2における結果についての実験条件を、ここで詳細に記載する。TWEAK(200ng/ml)、bFGF(1ng/ml)または両サイトカインありまたはなしの基礎培地中で24時間培養したHUVECを、アポトーシス細胞についてはFITC−アネキシン−V(x軸)および生存性についてはPI色素排除(y軸)で染色した。図2は、それぞれ四半分3、4および2において、生細胞、アポトーシス細胞または死細胞の割合を示す。
【0084】
(実施例3:TWEAKはbFGF依存性HUVEC移動を増強する)
TWEAKがEC移動をもたらす能力を、他の血管形成因子の存在下および非存在下で評価した。コンフルエントなHUVEC単層に傷を付け、EC移動を、創傷修復の程度を決定することにより、最初の18時間内にモニターした。しかし、基礎培地へのTWEAKまたはbFGFの添加により、低レベルの創傷修復が示されたが、これは、基礎培地単独で認められたものより有意に大きくはなかった。対照的に、TWEAKおよびbFGFの両方で処理した培養物は、基礎培地およびいずれかの因子単独を含有する培地での培養物より、有意に大きな程度まで修復され、完全培地におけるものと同様であった。HUVECを培養物から回収し、細胞数の何らかの増加が実験過程で生じるか否かを決定するために、計数した。全ての処理群において、細胞回復は比較可能であり(データは示さず)、このことは、TWEAKおよびbFGFの組み合わせ効果が細胞移動のレベルにあることを支持する。
【0085】
図3に示した結果についての実験条件を、ここで詳細に記載する。TWEAK(200ng/ml)、bFGF(1ng/mlもしくは1/1000希釈)、およびこれらの因子の組み合わせで処理したコンフルエントなHUVEC単層に傷を付け、培養して18時間後に修復を測定した。図3は、4つの実験の平均+/−SEMを示し、bFGF+TWEAKにより誘導された修復は、いずれか単独または基礎培地により誘導されたものとは有意に異なっている(P値<0.05)。
【0086】
(実施例4:TWEAKの効果は、増殖因子レセプターまたはインテグリンの調節によって媒介されない)
インテグリン(特に、αvβ3、α1β1およびα2β1)は、細胞外マトリクスを通過する細胞移動を容易にし、そしてまた細胞生存および血管形成因子に対する応答に必要な細胞内シグナル伝達を調節する(Eliceiri,B. and Cheresh,D.A.,1999.J.Clin.Invest.103:1227−1230;Senger,D.R.ら,1997.Proc.Natl.Acad.Sci.94:13612−13617)。従って、本発明者らは、TWEAKがEC上で発現される増殖因子レセプターまたはインテグリンを調節するか否かを決定することを目的とした。VEGFレセプターFlk−1およびFlt−1ならびにbFGFレセプターFlgは、基礎培地で培養したHUVEC上で非常に低レベルで発現した。ポジティブコントロールとして、これらのレセプター特異的mAbは、ヒト皮膚毛細管EV(HMVEC−D)上で強い染色を示した。Lynchら(11)による研究と一致して、本発明者らは、TWEAK処理培養物におけるVEGFレセプターFlk−1およびFlt−1の発現の変化も見出さず、bFGFもしくはTWEAK/bFGF組み合わせで処理した培養物においてもVEGFレセプター発現における変化は見られなかった。さらに、本発明者らは、TWEAK処理が、bFGFレセプターFlgまたはインテグリン(αv、α1、α5、β1およびβ3)のレベルを変化させないことを見出した。
【0087】
(実施例5:TWEAKは、EC形態形成を誘導する)
血管形成プロセスにおける重要な事象は、毛細管にECを侵襲するという構成である。TWEAKのこの形態形成工程に対する効果を、bFGFの存在下および非存在下で、3次元フィブリンゲルの表面に播種したECで測定した。本発明者らは、TWEAKがEC単層に対して効果がないが、最適濃度のbFGFが細胞侵襲およびECの索(cord)への組織化を促進することを見出した。TWEAKのbFGFへの添加は、EC単層において明らかな形態形成変化を誘導した。同様の結果がいくつかの異なるEC型で認められ、これらの型としては、HUVEC、ヒト肺動脈EC(HPAEC)、ヒト肺毛細管EC(HMVEC−L)およびHMVEC−Dが挙げられる。さらにこれらのゲルの断面分析により、TWEAKのbFGFへの添加が、ECの管腔を有する管への侵襲の構造組織化を誘導することが明らかになった。別のTNFメンバーであるCD40Lは、単独でも、bFGFとの組み合わせにおいても効果を有さなかった。従って、TWEAKは、bFGFと相乗効果を発揮して、毛細管管腔の形態形成を誘導する。この結果を、図4に示す。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、bFGF依存性HUVEC増殖に対するTWEAKの効果を示す。
【図2】
図2は、HUVEC死に対するTWEAKの効果を示す。
【図3】
図3は、bFGF依存性HUVEC遊走に対するTWEAKの効果を示す。
【図4】
図4は、毛細管形成に対するTWEAKおよびbFGFの相乗作用効果を示す。
(発明の分野)
本発明は、新血管新生(neovascularization)を促進するために血管形成活性(angiogenic activity)を促進するための方法に関する。
【0002】
(発明の背景)
微小血管の成長、すなわち血管形成(angiogenesis)は、新血管への内皮細胞(EC)の増殖、遊走、分化、および構造編制を含む。
【0003】
血管形成調節因子は、種々のレベルでの内皮細胞(EC)の変化を誘導し(その増殖、遊走、分泌、および接着特性が挙げられる)、そしてこの血管形成調節因子の作用を介してECまたは他の細胞型に対してそのように変化を誘導し得る(Kumarら,1998,Int.J.Oncology 12:749−757;Bussolinoら,1997,Trends in Biochem,22:251−256)。これまででは、いくつかのTNFファミリーのリガンドが、血管形成のプロセスに関与している(すなわちTNFα、FasLおよびTWEAK)。
【0004】
(発明の要旨)
TWEAK(TNFリガンドファミリーの新規メンバー)は、いくつかの上皮腫瘍細胞株によるIL−8産生を誘導するその能力、減少した増殖因子条件下での種々のヒトECおよび大動脈平滑筋細胞における増殖、ならびにラット角膜に移植された場合の血管形成応答の刺激に基づいて、血管形成を促進し得る。本明細書中、本発明者らは、TWEAKの血管形成の潜在能をさらに特徴付け、TWEAKが線維芽細胞増殖因子(FGF)と相乗作用を起こして、ECの増殖および遊走を誘導することを実証する。TWEAKはEC生存を弱く促進するが、EC増殖に対するTWEAKおよびFGFの相乗作用効果は、細胞死を減少するよりも、細胞***の増強に起因するようである。TWEAKはまた、FGFまたはVEGFについてのレセプターの発現(すなわち、インテグリンα1、α5、αv、β1、またはβ3の発現)を検出可能に変更しなかった。ECを誘導して、他の細胞型の非存在下で毛細血管を形成するTWEAKの能力は、3Dフィブリンゲルマトリックス中で実証され、ここで、TWEAKは著しく、侵襲の際に管腔の形態形成を誘導した(bFGF依存性EC索)。本発明者らの発見によってさらに、TWEAKを他のTNFファミリーリガンドと区別し、複数の別々の段階において血管形成を促進するTWEAKの能力を実証する。
【0005】
本発明の1つの局面は、インビトロ培養物において内皮細胞増殖を促進するための方法であって、この方法は、細胞培養物に相乗効果的に有効量のTWEAKアゴニストおよび血管形成因子から本質的になる処方物を添加する工程を包含する。
【0006】
本発明の第2の局面は、哺乳動物において血管形成活性を増強して、新血管新生を促進するための方法であって、この方法は、新血管新生を促進するのに十分な、相乗効果的に有効量のTWEAKアゴニストおよび血管形成因子を含む処方物をこの動物に投与する工程を包含する。好ましい実施形態はbFGFの使用である。
【0007】
(詳細な説明)
本明細書中に使用される場合、用語「血管形成(angiogenesis)」、「血管再生(revascularization)」、「増加した側枝循環」、および「血管の再生(regeneration of blood vessels)」は、同意語とみなされる。
【0008】
「血管形成」は、既存の脈管床(vascular bed)の任意の変更または組織灌流に役立つ新規脈管構造の形成として規定される。これには、既存の血管からの内皮細胞の出芽による新規脈管の形成、またはサイズ、成熟度、方向または流れの特性を変更して組織の血液灌流を改善する既存の脈管のリモデリングを含む。
【0009】
治療剤は、「血管形成」を調節する際に「治療効果」を有すると言われ、そして治療剤の量は、その治療剤の量の投与が、血管形成の調節を必要とする被験体(例えば、動物モデルまたはヒト患者)に投与されたとき血管形成活性に有意な調節(すなわち、増加または減少)を引起すのに十分である場合、「血管形成調節量」といわれる。
【0010】
用語、血管形成因子は、血管形成プロセス(以下のプロセスの段階が挙げられるが、これらに限定されない:すなわち、細胞外マトリックスの分解、細胞増殖、細胞遊走、および構造編制)を促進する因子をいう(Kumarら,1998,Int.J.Oncology 12:749−757;Bussolinoら,1997,Trends in Biochem,22:251−256)。血管形成因子としては、線維芽細胞増殖因子(bFGF)、酸性FGF(aFGF)、FGF−5、血管内皮細胞増殖因子アイソフォーム(VEGF)、アンギオポエチン(angiopoietin)−1(Ang−1)およびアンギオポエチン2(Ang−2)、血小板由来内皮細胞増殖因子(PD−ECGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、インターロイキン−8(IL−8)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、胎盤増殖因子、プロリフェリン(proliferin)、B61、可溶性脈管細胞接着分子−1、可溶性E−セレクチン(E−selection)、12−ヒドラジエイコサテトラエノン酸(12−hydrozyeicosatetraenoic acid)、HIV−1のTatタンパク質、アンギオゲニン、TNFα、FasL、トランスフォーミング増殖因子−βが挙げられるが、これらに限定されない。
【0011】
本明細書中に使用される場合、別の血管形成因子と相乗作用的に作用するTWEAKの能力は、TWEAKおよび血管形成因子の組合せが、血管形成プロセスの段階を測定する1つ以上のインビトロアッセイにおいて測定されるように、いずれかの因子単独に対する応答の和よりも大きい応答を誘導することを意味する。この血管形成プロセスの段階としては、本明細書中に記載されるように、内皮細胞の生存、増殖、遊走、または毛細管形成が挙げられるが、これらに限定されない。
【0012】
用語「薬学的に受容可能な」は、天然物質または合成物質に対して言及される場合、その物質がはるかに大きい有利な効果を考慮して受容可能な毒性効果を有することを意味する。一方、関連する用語「生理学的に受容可能な」は、その物質が比較的低い毒性を有することを意味する。
【0013】
本明細書中に使用される場合、用語「抗体ホモログ」は、ジスルフィド結合を介して連結した免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖からなるインタクトな抗体を含む。用語「抗体ホモログ」はまた、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、および1つ以上の抗原(すなわち、TWEAKまたは一部(patched))に結合し得るそれらの抗原結合フラグメントから選択される1つ以上のポリペプチドを含むTWEAK治療剤を含むことが意図される。1つより多くのポリペプチドから構成される抗体ホモログの成分ポリペプチドは、必要に応じて、ジスルフィド結合するか、さもなくば共有結合的に架橋し得る。従って、「抗体ホモログ」は、IgA型、IgG型、IgE型、IgD型、IgM型(ならびにこれらにサブタイプ)のインタクトな免疫グロブリンを含み、ここで、免疫グロブリンの軽鎖は、κ型もしくはλ型であっても、抗原結合特異性を保持するインタクトな抗体の一部(例えば、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメント、F(v)フラグメント、重鎖単量体もしくは二量体、軽鎖単量体もしくは二量体、1つの重鎖および1つの軽鎖からなる二量体など)であってもよい。
【0014】
本明細書中に使用される場合、「ヒト化抗体ホモログ」は、組み換えDNA技術によって産生された抗体ホモログであり、ここで、抗原結合に必要とされないヒト免疫グロブリンの軽鎖または重鎖のアミノ酸のいくらかまたは全てが、非ヒト哺乳動物免疫グロブリンの軽鎖または重鎖由来の対応するアミノ酸の代わりに置換されている。「ヒト抗体ホモログ」は、免疫グロブリンの軽鎖または重鎖のアミノ酸の全てが(抗原結合に必要とされるか否かにかかわらず)、ヒト供給源由来である抗体ホモログである。
【0015】
「アミノ酸」は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の単量体単位である。天然に存在するペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質には20個のアミノ酸が見出されていて、これらの全ては、L異性体である。この用語はまた、アミノ酸のアナログならびにタンパク質アミノ酸およびそのアナログのD異性体も含む。
【0016】
用語「バイオアベイラビリティー」は、投与後に体によって吸収される化合物の能力をいう。例えば、第1および第2の化合物の両方が等量投与されたときに、第1化合物が第2化合物よりも大きい程度で血液に吸収される場合、この第1化合物は第2化合物よりも大きいバイオアベイラビリティーを有する。
【0017】
「発現ベクター」は、ポリヌクレオチドであり、例えば、この発現ベクターが宿主細胞に導入された場合に少なくとも1つの遺伝子の発現を可能にするDNAプラスミドまたはファージ(とりわけ一般的な例)である。ベクターは、宿主細胞中で複製されることができても、できなくてもよい。
【0018】
句「細胞外シグナル伝達タンパク質」は、細胞から分泌されるかまたは細胞膜に結合しているいずれかの任意のタンパク質を意味し、そして、標的細胞上のこのタンパク質に対するレセプターへの結合の際に、標的細胞に応答を誘発する。
【0019】
アミノ酸残基の「機能的等価体」は、(i)その機能的等価体によって置換されたアミノ酸残基と類似の反応特性を有するアミノ酸、(ii)本発明のポリペプチドのリガンドのアミノ酸(このアミノ酸は、その機能的等価体によって置換されたアミノ酸残基と類似の特性を有する)、(iii)その機能的等価体によって置換されたアミノ酸残基と類似の特性を有する非アミノ酸分子である。
【0020】
「異種プロモーター」は、本明細書中に使用される場合、遺伝子または精製核酸と天然に結合していないプロモーターである。
【0021】
「相同性」および「同一性」は、各々、2つのポリペプチド配列間の配列類似性をいい、「相同性」および「同一性」の両方は、その開示において交換可能に使用される。「相同性」は、比較目的のために整列され得る各配列中の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列中の位置が同じアミノ酸残基によって占められる場合、これらのポリペプチドは、その位置において同一であるといわれ得;等価な部位が同じアミノ酸(例えば、同一)または類似のアミノ酸(例えば、立体的な性質および/または電子的な性質が類似)によって占められる場合、この分子は、その位置において相同であるといわれ得る。配列間の相同性のパーセンテージは、これらの配列によって共有される一致した位置または相同な位置の数の関数である。「関連していない」配列または「非相同」配列は、本発明の配列と40%未満の同一性(もっとも、好ましくは25%未満の同一性)を共有する。
【0022】
例えば、2つの配列において10個の位置のうちの6個の位置が、一致しているかまたは相同である場合、2つの配列は60%相同である。例として、DNA配列CTGACTおよびCAGGTTは、50%の相同性(全部で6個の位置のうち3個の位置が一致している)を共有する。一般に、比較は、2つの配列が最大の相同性を与えるように整列される場合に、行われる。このような整列は、例えば、Needlemanら、J.Mol Biol.48:443−453(1970)の方法(以下により詳細に記載されるコンピュータープログラムによって簡便に実行される)を使用して提供され得る。相同配列は、同一アミノ酸残基または類似アミノ酸残基を共有し、ここで、類似の残基は、整列された参照配列における対応するアミノ酸残基の保存的置換(すなわち「許容点変異(allowed point mutations)」)である。この点に関して、参照配列における残基の「保存的置換」は、対応する参照残基(例えば、類似のサイズ、形、電荷、化学的特性(共有結合または水素結合を形成する能力を含む)などを有する)に物理的または機能的に類似である残基の置換である。特に好ましい保存的置換は、Dayhoffら、5:Atlas of Protein Sequence and Structure,5:補遺.3,第22章:354−352、Nat.Biomed.Res.Foundation,Wasington,D.C.(1978)における「許容点変異」について定義される基準を満たす保存的置換である。
【0023】
2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の「パーセント相同性/同一性」は、KarlinおよびAltshul(Proc.Nat.Acad.Sci.,USA 90:5873(1993))において改変されるように、KarlinおよびAltshul(Proc.Nat.Acad.Sci.,USA 87:2264(1990))の整列アルゴリズムを使用して決定される。このようなアルゴリズムは、Altschulら、J.Mol.Biol.215:403(1990)のNBLASTまたはXBLASTプログラムに組み込まれる。BLAST検索は、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12を用いて実施され、本発明の核酸に相同なヌクレオチド配列を得る。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3を用いて実施され、参照ポリペプチド配列に相同なアミノ酸配列を得る。比較のためのギャップ付き(gapped)整列を得るために、ギャップ付きBLASTが、Altschulら、Nucleic Acids Res.,25:3389(1997)において記載されるように使用される。BLASTおよびギャップ付きBLASTを使用する場合、それぞれのプログラム(XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメーターが使用される。http://www/ncbi.nlm.nih.govを参照のこと。
【0024】
用語「疎水性」は、非極性原子を有する化学部分が、水または他の極性原子とではなくお互いに相互作用する傾向をいう。「疎水性」である物質は、多くは水中で不溶性である。疎水性性質を有する天然産物としては、脂質、脂肪酸、リン脂質、スフィンゴ脂質、アシルグリセロール、ワックス、ステロール、ステロイド、テルペン、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン、イソプレノイド、レテノイド(retenoid)、ビオチン、ならびにトリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、アラニン、プロリン、およびチロシンのような疎水性アミノ酸が挙げられる。化学的部分はまた、その物理的性質が非極性原子の存在によって決定される場合、疎水性であるかまたは疎水性性質を有する。
【0025】
成句「内部アミノ酸(internal amino acid)」は、N末端アミノ酸またはC末端アミノ酸のいずれでもないペプチド配列中の任意のアミノ酸を意味する。
【0026】
「単離された」(「実質的に純粋な」と交換可能に使用される)は、核酸(すなわち、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列)に適用される場合、その起源または操作によって、(i)天然において結合するポリヌクレオチドの全てとは結合しない(例えば、発現ベクターまたはその一部として宿主細胞中に存在する)か;または(ii)天然において結合するもの以外の核酸または他の化学部位に結合するか;または(iii)天然に存在しない、RNAまたはDNAポリヌクレオチド、ゲノムポリヌクレオチドの一部分、cDNAまたは合成ポリヌクレオチドを意味する。「単離された」はさらに、(i)例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってインビトロで増幅されるか;(ii)化学的に合成されるか;(iii)クローニングによって組換え的に産生されるか;または(iv)切断およびゲル分離によって精製される、ポリヌクレオチド配列を意味する。
【0027】
「単離された」(「実質的に純粋な」と交換可能に使用される)は、ポリペプチドに適用される場合、その起源または操作によって、(i)発現ベクターの一部の発現産物として宿主細胞中に存在するか;または(ii)天然において結合するもの以外のタンパク質または他の化学部位に結合するか;または(iii)天然に存在しない、ポリペプチドまたはその部分(例えば、天然において見出されない形態でタンパク質が存在するように、少なくとも1つの疎水性部分をタンパク質に付加する(appending)かまたは付加する(adding)ことによって化学的に操作されたタンパク質)を意味する。「単離された」はさらに、(i)化学的に合成されるか;または(ii)宿主細胞において発現され、そして結合タンパク質および混入タンパク質から離れて精製される、タンパク質を意味する。この用語は一般に、天然に存在する他のタンパク質および核酸から分離されたポリペプチドを意味する。好ましくは、このポリペプチドはまた、これらを精製するために使用される抗体またはゲルマトリクス(ポリアクリルアミド)のような物質から分離される。
【0028】
「タンパク質」は、20個のアミノ酸のいずれかから基本的になる任意のポリマーである。「ポリペプチド」は、しばしば、比較的大きいポリペプチドに関して使用され、そして「ペプチド」は、しばしば、小さいポリペプチドに関して使用される。これらの用語の使用は、当該分野で重複し、そして変化する。本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」は、他に示されない限り、ペプチド、タンパク質およびポリペプチドをいう。
【0029】
用語「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書中で交換可能に使用される。用語「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」はまた、本明細書中で交換可能に使用される。
【0030】
本明細書中で使用される場合、「組換え体」は、タンパク質が組換え哺乳動物発現系に由来することを意味する。
【0031】
従って、「実質的に純粋な核酸」は、この核酸が由来する生物体の天然に存在するゲノム中に通常連続するコード配列の1つまたは両方と直接連続していない核酸である。実質的に純粋なDNAはまた、さらなるTWRAK配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAを含む。
【0032】
新血管新生を促進する血管形成活性を増強する際に有効であることが必要されるTWEAKアゴニストおよび血管形成因子の量は、もちろん、処置される患者と共に変化し、そして最終的に医者の裁量である。考慮されるべき因子としては、処置される患者の状態、使用される特定のTWEAKアゴニストの効力、処方物の性質、および患者の体重が挙げられる。TWEAKアゴニストを同時に投与することは可能であるが、血管形成因子は、TWEAKアゴニストの注入の開始の前に、ボーラスとして与えられ得ることがまた意図される。血管形成因子は、TWEAKアゴニストの注入後に投与され得ることがまた意図される。
【0033】
TWEAKアゴニストは、WO98/05783、WO98/35061およびWO99/19490(これら全ては、本明細書中に参考として援用される)において教示されるようなアゴニストを含む。このようなTWEAKアゴニストは、可溶性組換えTWEAKタンパク質を含む。
【0034】
「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の両方について0.5×SSC〜約5×SSCかつ65℃に実質的に等価な塩および温度条件をいう。従って、本明細書中で使用される場合、用語「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、操作上の定義であり、そしてハイブリダイゼーション条件の範囲を含む。それにも関わらず、本発明の開示の目的のために「高ストリンジェンシー」条件は、プラークスクリーニング緩衝液(0.2%ポリビニルピロリドン、0.2%Ficoll 400;0.2%ウシ血清アルブミン、50mM Tris−HCl(pH7.5);1M NaCl;0.1%ピロリン酸ナトリウム;1%SDS);10%硫酸デキストラン、および100μg/ml変性超音波処理サケ***DNAを用いて、65℃で12〜20時間ハイブリダイズすること、および75mM NaCl/7.5mMクエン酸ナトリウム(0.5×SSC)/1%SDSを用いて、65℃で洗浄することを含む。「低ストリンジェンシー」条件は、プラークスクリーニング緩衝液、10%硫酸デキストラン、および110μg/ml変性超音波処理サケ***DNAを用いて、55℃で12〜20時間ハイブリダイズすること、および300mM NaCl/30mMクエン酸ナトリウム(2.0×SSC)/1%SDSを用いて、55℃で洗浄することを含む。Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.New York,Sections 6.3.1−6.3.6,(1989)もまた参照のこと。
【0035】
本明細書中で使用される場合、「治療的組成物」は、本発明の治療的成分および他の生物学的に適合性の成分を含むとして定義される。この治療的組成物は、水のような賦形剤、鉱物およびタンパク質のようなキャリアを含み得る。
【0036】
「野生型」は、それがインビボにおいて正常に存在するような、それぞれ、タンパク質もしくはその部分のエキソンの天然に存在するポリヌクレオチド配列、または天然に存在するタンパク質配列もしくはその部分を意味する。
【0037】
本発明の実施は、他に示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えDNA、タンパク質化学、および免疫学(これらは、当該分野内である)の従来の技術を使用する。このような技術は、文献に記載されている。他に明記されない限り、詳細な説明において引用される全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用される。
【0038】
(A.フラグメントおよびアナログの生成)
単離されたタンパク質のフラグメント(例えば、TWEAKのフラグメント)はまた、組換え方法、タンパク質分解的消化、または当業者に公知の方法を使用する化学的合成によって、効率的に生成され得る。組換え方法において、ポリペプチドの内部フラグメントまたは末端フラグメントは、単離されたTWEAKポリペプチドをコードするDNA配列の1つの末端(末端フラグメントについて)または両方の末端(内部フラグメントについて)から1つ以上のヌクレオチドを除去することによって生成され得る。変異誘発されたDNAの発現は、ポリペプチドフラグメントを生成する。「末端切除(nibbling)」エンドヌクレアーゼはまた、一連のフラグメントをコードするDNAを生成し得る。タンパク質のフラグメントをコードするDNAはまた、無作為な剪断、制限消化、もしくは組み合わせ、または両方によって生成され得る。タンパク質フラグメントは、インタクトなタンパク質から直接生成され得る。ペプチドは、タンパク質分解酵素(プラスミン、トロンビン、トリプシン、キモトリプシン、またはペプシンを含むがこれらに限定されない)によって特異的に切断され得る。これらの酵素の各々は、それが攻撃するペプチド結合の型に特異的である。トリプシンは、カルボニル基が塩基性アミノ酸(通常、アルギニンまたはリジン)に由来するペプチド結合の加水分解を触媒する。ペプシンおよびキモトリプシンは、芳香族アミノ酸(例えば、トリプトファン、チロシン、およびフェニルアラニン)由来のペプチド結合の加水分解を触媒する。切断されたタンパク質フラグメントの代替のセットは、タンパク質分解酵素に感受性である部位における切断を防止することによって生成される。例えば、穏やかに塩基性の溶液における、リジンのε−アミノ酸基のエチルトリフルオロチオアセテートとの反応は、隣接するペプチド結合がもはやトリプシンによる加水分解に感受性ではない、ブロックされたアミノ酸残基を生じる。タンパク質は、タンパク質分解酵素に感受性であるペプチド結合を作製するように改変され得る。例えば、β−ハロエチルアミンを用いるシステイン残基のアルキル化は、トリプシンによって加水分解されるペプチド結合を生じる(Lindley,(1956)Nature 178,647)。さらに、特定の残基においてペプチド鎖を切断する化学試薬が使用され得る。例えば、臭化シアンは、メチオニン残基においてペプチドを切断する(Gross and Witkip,(1961)J.Am.Chem.Soc.83,1510)。従って、修飾因子、タンパク質分解酵素および/または化学試薬の種々の組み合わせを用いてタンパク質を処理することによって、タンパク質は、重複のないフラグメントを有する所望の長さのフラグメントに分けられ得るか、または所望の長さの重複するフラグメントに分けられ得る。
【0039】
フラグメントはまた、メリフィールド固相F mocまたはt−Boc化学のような当業者に公知の技術を使用して、化学的に合成され得る。Merrifield,Recent Progress in Hormone Research 23:451(1967)。
【0040】
(B.変更されたDNAおよびペプチド配列の生成:無作為な方法)
タンパク質のアミノ酸配列改変体は、タンパク質またはその特定の部分をコードするDNAの無作為変異誘発によって調製され得る。有用な方法としては、PCR変異誘発および飽和変異誘発が挙げられる。無作為アミノ酸配列改変体のライブラリーはまた、変性オリゴヌクレオチド配列のセットの合成によって生成され得る。変更されたDNAおよびペプチドを使用して所定のタンパク質のアミノ酸配列改変体を生成する方法は、当業者に周知である。以下のこのような方法の例は、本発明の範囲を制限することを意図するのではなく、単に例示的な技術を示すために役立つ。当業者は、他の方法もまたこの点について有用であることを認識する。
PCR変異誘発:例えば、Leungら、(1989)Technique 1,11−15を参照のこと。
飽和変異誘発:1つの方法が、Mayersら、(1989)Science 229,242において一般に記載される。
変性オリゴヌクレオチド変異誘発:例えば、Harang,S.A.(1983)Tetrahedron 39,3;Itakuraら、(1984)Ann.Rev.Biochem.53,323およびItakuraら、Recombinant DNA,Proc.第3版 Cleveland Symposium on Macromolecules,273−289頁(A.G.Walton編)、Elsevier,Amsterdam,1981を参照のこと。
【0041】
(C.変更されたDNAおよびペプチド配列の生成;指向された方法)
非無作為(すなわち指向された)変異誘発は、単離されたポリペプチドの公知のアミノ酸配列の残基の欠失、挿入、または置換を含む改変体を提供するために、特定の配列または単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の特定の部分における変異を提供する。変異部位は、例えば、(1)最初に保存されたアミノ酸と置換し、次いで、達成される結果に依存して、より極端な選択アミノ酸と置換するか;(2)標的残基を欠失させるか;または(3)位置決めされた部位に隣接する同じまたは異なるクラスの残基を挿入するか、あるいは選択肢1〜3の組み合わせによって、個々にかまたは連続的に改変され得る。
【0042】
明らかに、このような部位指向方法は、N末端システイン(または機能的等価物)が疎水性部分の接着部位を提供するために、所定のポリペプチド配列に導入され得る1つの方法である。
アラニンスキャニング変異誘発:CunninghamおよびWells,(1989)Science 244,1081−1085を参照のこと。
オリゴヌクレオチド媒介性変異誘発:例えば、Adelmanら、(1983)DNA 2,183を参照のこと。
カセット変異誘発:Wellsら、(1985)Gene 34,315を参照のこと。
コンビナトリアル変異誘発:例えば、Ladnerら、WO88/06630を参照のこと。
【0043】
(処置方法)
本発明の方法は、新血管新生を促進するために、増大した血管形成活性が所望される疾患における処置として有用である。このような疾患および状態は、としては、以下が挙げられる:心筋虚血状態(例えば、心筋梗塞、心筋虚血に罹患した冠状動脈疾患を有する患者における増大した血流、または末梢脈管疾患におけるような心臓以外の領域への不十分な血流(ここでは、減少した血流が問題である)、例えば亀裂骨折または血管形成後での心筋層の壊死組織の脈管再生、アンギナ、心臓移植、脈管移植片、ならびに血管新生、灌流、膠原化、およびこれらの病変の器質化を改善するための血管再開(reopening vessel))、創傷治癒、ならびに組織および器官の移植(例えば、自己または異種の微小血管移植の増強)。創傷治癒の促進としては、切開、骨修復、熱傷治癒、心筋損傷における梗塞形成後修復、一般的には形成を促進するための胃潰瘍および胃腸管の他の潰瘍の治癒、組織の維持および修復が挙げられる。移植された(grafted)かまたは移植された(transplanted)組織の新血管新生もまた、特に脈管不全に罹患している被験体(例えば、糖尿病患者)において意図される。
【0044】
一般的事項として、本発明の方法は、新血管形成の調節が必要な任意の哺乳動物被験体のために利用され得る。本発明の方法に従って処置され得る哺乳動物被験体としては、ヒト被験体または患者が挙げられるがこれらに限定されない。しかし、本発明はさらに、飼い慣らされた哺乳動物(ヒトコンパニオンとして養われる哺乳動物(例えば、イヌ、ネコ、ウマ)、有意な商業的価値を有する哺乳動物(例えば、乳牛、肉牛、スポーツ用動物)、有意な科学的価値を有する哺乳動物(例えば、絶滅の危機にある種の捕獲検体または自由検体)、あるいは他の価値を有する哺乳動物)の処置において利用され得る。さらに、一般的事項として、本発明の方法で処置するための被験体は、新血管形成の調節の必要性と関連する徴候以外の、本発明の因子で処置するための徴候を示す必要はない。すなわち、処置のための被験体は、本発明のTWEAK治療剤での処置についての徴候がないことが予想される。
【0045】
医学または獣医学分野の当業者は、新血管形成の調節が必要であり得る被験体を認識するように訓練される。特に、現在開示されている処置方法および他の処置方法に関連する臨床試験および非臨床試験、ならびに蓄積された経験は、当業者が決定する際に、所定の被験体が調節の必要があるか否か、および任意の特定の処置が、本発明に従う処置を含めてこの被験体の必要性に最適であるか否かを知らせることが予測される。
【0046】
従って、本発明の方法は、新血管形成を促進するため(例えば、心筋梗塞の結果としての心筋組織の損傷を修復するため)に、TWEAKアゴニストまたはその生物学的に活性な部分、および血管形成因子を利用し得る。このような方法はまた、虚血後の心臓血管系の修復(側副血管系の増殖を含む)を含み得る。TWEAKアゴニストおよび血管形成因子を利用する方法は、冠状バイパス手術が行われる場合の移植された組織および側副血管系の増殖を刺激するために利用され得る。方法はまた、冠状動脈疾患ならびに末梢神経系および中枢神経系の脈管疾患または虚血の結果として損傷した管脈組織を処置し得る。
【0047】
本発明の方法はまた、特に損傷組織に血管を移植するために、または虚血の間に側枝の血流を刺激するために、および新しい毛細管の新血管形成が所望される場合に、創傷治癒を促進し得る。本発明の他の方法は、真皮性潰瘍のような全層創傷(とこずれ、静脈性潰瘍、および糖尿病性潰瘍を含む)を処置するために利用され得る。さらに、TWEAK治療剤を利用する方法は、全層熱傷および損傷(ここで、このような熱傷および損傷を処置するために、皮膚移植片または皮弁が使用される)を処置するために利用され得る。このようなTWEAKアゴニストおよび血管形成因子はまた、形成手術(例えば、裂傷、熱傷、または他の外傷の修復)における使用のために利用され得る。泌尿器科学において、本発明の方法は、***機能の回復を補助し得る。
【0048】
新血管形成は、創傷を清潔かつ感染されないように保つことにおいて重要であるので、方法は、手術および引き続く切断の修復に関連して利用され得る。これらはまた、感染の危険性が高い腹創傷の処置のために利用され得る。本明細書中に記載のTWEAK治療剤を使用する方法は、脈管移植手術における内皮化(endothelialization)の促進のために利用され得る。移植された材料または合成材料のいずれかを使用する脈管移植の場合において、TWEAKアゴニストおよび血管形成因子は、内皮細胞と関連して脈管平滑筋および外膜細胞の増殖を促進するために、移植片の表面または接合部に適用され得る。
【0049】
本発明の方法はまた、移植される材料の拒絶を最小にするため、そして移植された材料の血管新生(vascularization)を刺激するために、身体に移植される人工プロテーゼまたは天然の器官をコートするために利用され得、そしてこの方法はまた、脈管組織の修復(例えば、動脈硬化の間に起こる修復、および脈管組織が損傷した部分でバルーン血管形成の後に必要とされる修復)のために利用され得る。具体的には、本発明の方法は、動脈壁の損傷からの回復を促進するため、従って再狭窄を防止するために利用され得る。
【0050】
TWEAKアゴニストをコードする核酸配列はまた、科学的研究、DNAの合成およびDNAベクターの製造に関連するインビトロの目的で、そしてヒト疾患を処置するための診断剤および治療剤の生成のために利用され得る。例えば、本発明の方法は、脈管平滑筋細胞、線維芽細胞、造血細胞、筋肉、筋腱(myotendonous)接合部、骨または軟骨誘導細胞、および他の間葉細胞のインビトロ培養を含み得、ここでTWEAK治療剤は、馴化培地に10ng/ml〜20μg/mlの濃度で添加される。
【0051】
これらの治療剤は、利用される特定の薬剤と適合性の任意の経路によって投与され得る。本発明の治療剤は、任意の適切な手段(好ましくは直接的(例えば、組織部位への注射または局所投与によるように局所的に)あるいは全身的(例えば、非経口的または経口的))によって個体へと供給され得る。この薬剤が非経口的に(例えば、静脈内、動脈内、皮下、または筋肉内投与によって)提供される場合、この薬剤は、好ましくは、水溶液の部分を構成する。この溶液は、被験体への所望の薬剤の送達に加えて、この溶液が被験体の電解質および/または容量の平衡に他の悪影響を与えないように、生理学的に受容可能である。この治療剤のための水性媒体は、通常の生理食塩水(例えば、9.85% NaCl、0.15M、pH7〜7.4)を含み得る。
【0052】
この治療剤は、好ましくは薬学的に受容可能なキャリアを含む滅菌の薬学的組成物として投与され、このキャリアは、多数の周知のキャリア(例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、またはこれらの組み合わせ)のいずれかであり得る。本発明の化合物は、無機または有機の酸および塩基から誘導される薬学的に受容可能な塩の形態で使用され得る。このような酸塩には、以下が含まれる:酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫化水素塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、二グルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩(hemisulfate)、へプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、2−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、2−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピルビン酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシレート、およびウンデカン酸塩。塩基塩としては、以下が挙げられる:アンモニウム塩、アルカリ金属塩(例えば、ナトリウム塩およびカリウム塩)、アルカリ土類金属塩(例えば、カルシウム塩およびマグネシウム塩)、有機塩基を有する塩(例えば、ジシクロヘキシルアミン塩、N−メチル−D−グルカミン、トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミンおよびアミノ酸(例えば、アルギニン、リジンなど)を有する塩)。また、塩基性窒素含有基は、アルキルハライド(例えば、メチル、エチル、プロピル、およびブチルクロリド、ブロミドおよびヨージド);硫酸ジアルキル(例えば、硫酸ジメチル、硫酸ジエチル、硫酸ジブチル、および硫酸ジアミル)、長鎖ハライド(たとえば、デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステアリルクロリド、ブロミド、およびヨージド)、アラルキルハライド(例えば、ベンジルブロミドおよびフェネチルブロミド)などのような薬剤で四級化され得る。水または油に溶解性または分散性の生成物は、これによって得られる。
【0053】
TWEAKアゴニストおよび血管形成因子の薬学的組成物は、任意の薬学的に受容可能なキャリアと共に、本発明の化合物、またはそれらの薬学的に受容可能な誘導体のいずれかを含む。用語「キャリア」は、本明細書中で使用される場合、受容可能なアジュバントおよびビヒクルを含む。本発明の薬学的組成物において使用され得る薬学的に受容可能なキャリアとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン)、緩衝性物質(例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質(例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、硫酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂)。
【0054】
(注射送達)
本発明に従って、この薬学的組成物は、滅菌注射可能調製物(例えば、滅菌注射可能な水性または油性の懸濁液)の形態であり得る。この懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、当該分野で公知の技術に従って処方され得る。この滅菌注射可能調製物はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射可能な溶液または懸濁液(例えば、1,3−ブタンジオール中の溶液のような)であり得る。利用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒は、水、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として慣習的に利用されている。この目的のために、任意の穏やかな不揮発性油(合成のモノ−またはジグリセリドを含む)が利用され得る。脂肪酸(例えば、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体)は、天然の薬学的に受容可能な油(例えば、オリーブ油またはヒマシ油)と同様に、注射可能物質(特に、そのポリオキシエチル化バージョンにおいて)の調製において有用である。これらの油溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤または分散剤を含み得る。
【0055】
特定の治療剤の制御放出投与は有用であり得る。例えば、治療剤は、静脈内注入、移植可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与形態を使用して、投与され得る。1つの実施形態において、ポンプが使用され得る[Langerら編,Medical Applications of Controlled Release,CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974);Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.,14:201(1987);Buchwaldら,Surgery,88:507(1980);Saudekら,N.Engl.J.Med.,321:574(1989)]。別の実施形態において、ポリマー材料が使用され得る[Langer,1974,前出;Sefton,1987,前出;Smolenら編,Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Wiley,N.Y.(1984);Rangerら,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.,23:61(1983)を参照のこと;Levyら,Science,228:190(1985);Duringら,Ann.Neurol.,25:351(1989);Howardら,J.Neurosurg.,71:105(1989)もまた参照のこと]。なお別の実施形態において、制御放出系は、治療標的(例えば、腫瘍)の近位に配置され得、従って、全身容量の画分のみを必要とする[例えば、Goodson、Medical Applications of Controlled Release,vol.2,pp.115−138(1984)を参照のこと]。他の制御放出系は、Langer,Science,249:1527−1533(1990)による総説において議論される。別の実施形態において、この治療化合物は、小胞(特に、リポソーム)中で送達され得る(Langer,1990,前出;Treatら,Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez−BeresteinおよびFidler(編),Liss,New York,pp.353−365(1989);Lopez−Berestein,pp.317−327を参照のこと;一般的には同書を参照のこと)。
【0056】
(経口送達)
経口固体用量形態が本明細書中で使用のために意図され、これは、Martin,Chapter 89,1990,前出(これは、本明細書中で参考として援用される)において一般に記載される。固体用量形態としては、錠剤、カプセル、丸剤、トローチまたはロゼンジ、カシェあるいはペレットが挙げられる。また、リポソームまたはプロテイノイドカプセル化は、本発明の組成物を処方するために使用され得る(例えば、米国特許第4,925,673号に報告されるプロテイノイドミクロスフェアのように)。リポソームカプセル化が使用され得、そしてこのリポソームは、種々のポリマーから誘導体化され得る(例えば、米国特許第5,013,556号)。治療剤について可能な固体用量形態の記載は、Marshall,Modern Pharmaceutics,Chapter 10,BankerおよびRhodes編(1979)(本明細書中に参考として援用される)によって与えられる。一般に、この処方物は、治療剤(または化学的に修飾された形態)、ならびに胃の環境に対する保護および生物学的活性材料の腸での放出を可能にする不活性成分を含む。
【0057】
タンパク質(または誘導体)について、放出の位置は、胃、小腸(十二指腸、空腸(jejunem)、または回腸)、あるいは大腸であり得る。当業者は、胃では溶解せず、この材料を十二指腸また腸の他の部位に放出する、利用可能な処方物を有する。好ましくは、この放出は、タンパク質(または誘導体)の保護によって、または胃の環境を越えての生物学的活性材料の放出(例えば、腸において)によってのいずれかで、胃の環境の有害な影響を回避する。胃への完全な耐性を保証するために、少なくともpH5.0まで不浸透性であるコーティングが必須である。腸陽性コーティングとして使用されるより一般的な不活性成分の例は、トリメリト酸酢酸セルロース(CAT)、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、フタル酸酢酸ポリビニル(PVAP)、Eudragit L30D、Aquateric、フタル酸酢酸セルロース(CAP)、Eudragit L、Eudragit S、およびShellac。これらのコーティングは、混合フィルムとして使用され得る。コーティングまたはコーティング混合物はまた、錠剤において使用され得、これは胃に対する保護について意図されない。これは、糖コーティング、またはより飲み込みやすい錠剤を作製するコーティングを含み得る。カプセルは、乾燥治療剤(すなわち、粉末)の送達のための硬質殻(例えばゼラチン)からなり得;液体形態については、軟質ゼラチン殻が使用され得る。カプセルの殻材料は、厚いデンプンまたは他の食用紙であり得る。丸剤、ロゼンジ、成形錠剤または錠剤粉砕物について、湿式集結技術が使用され得る。
【0058】
治療剤は、粒子径約1mmの顆粒またはペレットの形態における微細多成分のような処方物を含み得る。カプセル投与のための処方材料はまた、粉末、軽く圧縮されたプラグ、または錠剤でさえあり得る。治療剤は、圧縮によって調製され得る。着色剤および香味剤は、全て含まれ得る。例えば、タンパク質(または誘導体)が処方され得(例えば、リポソームまたはミクロスフェア被包によって)、次いでさらに、食用品(例えば、着色剤および香味剤を含む冷蔵された飲料)に含まれ得る。不活性材料を用いて希釈し、治療剤の用量を増し得る。これらの希釈剤は、以下を含み得る:炭水化物、特にマンニトール、α−乳糖、無水乳糖、セルロース、ショ糖、修飾デキストラン、およびデンプン。特定の無機塩はまた、カルシウム三リン酸、炭酸マグネシウム、および塩化ナトリウムを含む賦形剤として使用され得る。いくつかの市販の希釈剤は、Fast−Flo、Emdex、STA−Rx 1500、Emcompress、およびAvicellである。崩壊剤は、固形投与形態中における治療剤の処方物中に含まれ得る。崩壊剤として使用される材料は、デンプンを基にした市販の崩壊材であるExplotabを含むデンプンを含むが、これに限定されない。デンプングリコレートナトリウム、アンバーライト(Amberlite)、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン(ultramylopectin)、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、みかんの皮、カルボキシルメチルセルロース酸、天然のスポンジ、およびベントナイトは、全て用いられ得る。この崩壊剤の別の形態は、不可溶性のカチオン交換樹脂である。粉末化されたゴムは、賦形剤および結合剤として用いられ得て、これらは、粉末化されたゴム(例えば、寒天、Karaya,またはトラガカントを含み得る。アルギン酸およびこのナトリウム塩はまた、崩壊剤として有用である。結合剤を用いて、治療剤を合わせて、固い錠剤を形成し得る。結合剤は、天然物(例えば、アカシア、トラガカント、デンプン、およびゼラチン)由来の材料を含む。他は、メチルセルロース(MC)、エチルセルロース(EC)、およびカルボキシメチルセルロース(CMC)を含む。ポリビニルピロリドン(PVP)およびヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)は両方、アルコール溶液中で用いられて、治療剤を顆粒化し得る。抗摩擦剤は、治療剤の処方物中に含まれて、処方のプロセスの間の固着を予防し得る。潤滑剤は、治療剤とダイウォール(die wall)の間の層として、用いられ得、これは、以下を含むが、これらに限定されない:ステアリン酸(このマグネシウム塩およびカルシウム塩を含む)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、流動パラフィン、野菜油、およびワックス。可溶性の潤滑剤はまた、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、Carbowax 4000および6000が用いられる。処方の間の薬物の流動特性を改善し得、圧縮の間の再構成を助けるグリダント(glidant)を添加し得る。グリダントは、デンプン、タルク、発熱性シリカ、およびケイアルミン酸水和物を含み得る。
【0059】
水性の環境への治療剤の溶解を助けるために、表面活性剤を湿潤剤として添加し得る。表面活性剤は、アニオン性界面活性剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、およびスルホン酸ジオクチルナトリウム)を含み得る。カチオン性界面活性剤が使用され得、これは、塩化ベンザルコニウム、または塩化ベンゼトニウムを含み得る。界面活性剤のような処方物中に含まれ得る潜在的非イオン性界面活性剤の列挙は、ラウロマクロゴール400、ポリオキシ40ステアリン酸、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油10、50ならびに60、モノステアリン酸グリセリン、ポリソルベート40、60、65、ならびに80、糖脂肪酸エステル、メチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースである。これらの表面活性剤は、タンパク質または誘導体の処方物中に、単独または異なる割合での混合物のいずれかで存在し得る。タンパク質(または誘導体)の取りこみを潜在的に増大する添加物は、例えば、脂肪酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸である。
【0060】
(肺送達)
本発明のタンパク質(またはこれの誘導体)の肺送達も本明細書中において考慮される。タンパク質(または誘導体)は、吸入され、肺上皮内層を通って、血流へ横断し、哺乳動物の肺へ送達される。このことの他の報告は、Adjeiら,Pharmaceutical Research,7(6):565−569(1990);Adjeiら,International Journal of Pharmaceutics,63:135−144(1990)(酢酸ロイプロリド);Braquetら,Journal of Cardiovascular Pharmacology,13(suppl.5):143−146(1989)(エンドセリン−1);Hubbardら,Annals of Internal Medicine,3(3):206−212(1989)(α1−抗トリプシン);Smithら,J.Clin.Invest.,84:1145−1146(1989)(α1−プロテイナーゼ) ;Osweinら,「Aerosolization of Proteins」,Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery lI,Keystone,Colo.,(1990年3月)(組換えヒト成長ホルモン);Debsら,J.Immunol.,140:3482−3488(1988)(インターフェロン−γおよび腫瘍壊死因子α)、およびPlatzら,米国特許第5,284,656号(顆粒球コロニー刺激因子)。本発明の実施における使用のための治療製品の肺送達のために設計される広範な機械的装置(噴霧器、定量吸入器、および粉末吸入器(これら全ては、当業者によく知られている)を含むが、これらに限定されない)が考慮される。
【0061】
本発明の実施に適切な市販の装置のいくつかの特定の例は、Ultravent噴霧器(Mallinckrodt,Inc.,St.Louis,Mo.製);Acorn II噴霧器(Marquest Medical Products,Englewood,Colo.製)、Ventolin定量吸入器(Glaxo Inc.,Research Triangle Park,N.C.製);Spinhaler粉末吸入器(Fisons Corp.,Bedford,Mass.製)である。全てのこのような装置は、タンパク質(または誘導体)の調剤のための適切な処方物の使用を必要とする。代表的に、各処方物は、用いられる装置の型に特異的であり、治療に有用な希釈材、アジュバント、および/またはキャリアの使用に加えて、適切な噴霧剤材料の使用を含み得る。また、リポソーム、マイクロカプセル、もしくはミクロスフェア、包含複合体、または他の型のキャリアの使用が考慮される。化学修飾されたタンパク質はまた、化学修飾の型または使用される装置の型に依存して異なる処方物に調製され得る。
【0062】
噴霧器(ネブライザー)(ジェットまたは超音波のいずれか)の使用に適切な処方物は、代表的に水中に溶液1mLあたり約0.1〜25mgの生物学的に活性なタンパク質の溶液濃度で溶解したタンパク質(または誘導体)を含む。処方物はまた、緩衝液および単糖(例えば、タンパク質安定化および浸透圧の制御のため)を含む。噴霧剤処方物はまた、界面活性剤を含み、エアロゾルを形成における溶液の微粒化によって起きる、表面タンパク質の定量誘導凝集を減少または予防し得る。
【0063】
定量吸入器装置を用いて使用する処方物は一般に、界面活性剤に助けを借りて噴霧剤中に懸濁されたタンパク質(または誘導体)を含む、微細に分けられた粉末を含む。噴霧剤は、この目的のために用いられる任意の従来の材料であり、例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、または炭化水素(トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、およびジクロロテトラフルオロエタノール、および1,1,1,2−テトラクロルエタン)、またはこれらの組み合せを含む。適切な界面活性剤は、ソルビタントリオレートおよび豆レシチンを含む。オレイン酸はまた、界面活性剤として有用であり得る。
【0064】
粉末吸入装置から調剤するための処方物は、タンパク質(または誘導体)を含む、微細に分けられた乾燥粉末を含み、またバルキング剤(例えば、乳糖、ソルビトール、ショ糖、またはマンニトールを、装置からの粉末の撒布を容易にする量(例えば、処方物の50〜90重量%)において含み得る。タンパク質(または誘導体)は、肺の末端に最も効率よく送達するために、平均粒子径が10mu m(すなわちμm)未満(最も好ましくは、0.5〜5mu m)である特定の形態において最も有利に調製されるべきである。
【0065】
(投薬)
全ての上記分子について、さらなる研究が考慮されるにつれて、種々の患者における種々の状況の処置のための適切な投与レベルについての情報が明らかにされ、通常の当業者は、レシピエントの治療的背景、年齢、および全身の健康を考慮して、適した投薬を確立し得る。一般に、注射または輸液について、投薬は、0.01mu gの生物学的に活性なタンパク質/kg体重(タンパク質質量のみを計算し、化学修飾を考慮しない)と10mg/kg(同様に基づく)の間である。使用されるタンパク質もしくは誘導体の循環中半減期、ポリペプチドがボーラス用量によって送達されれるのかまたは連続した注入によって送達されれるのか、および使用される処方物に依存して、投与スケジュールは、変化し得る。
【0066】
(他の化合物を用いた投与)
新血管形成を改変することに関する治療について、本発明のTWEAKアゴニスト(または誘導体)および血管新生因子を、新血管形成を改変する必要のある他の臨床的合併症の処置のために使用される、1つ以上の薬学的組成物(例えば、癌の処置に使用される組成物(例えば、化学療法剤)、悪疫質、高血圧、高コレステロール、および他の悪条件の処置に使用される組成物)と組み合せて投与し得る。投与は、同時にされ得るか、順次行われ得る。
【0067】
(核酸に基づく治療的処置)
TWEAKアゴニストをコードする核酸配列は、ヒト腫瘍または血管壁細胞中に誘導され、遺伝子治療を展開する。
【0068】
1つの実施形態において、TWEAKアゴニストをコードする核酸配列は、ウイルスベクターにおいて、インビボ誘導される。このようなベクターは、弱毒化されたDNAウイルスまたは欠損DNAウイルス(例えば、単純疱疹ウイルス(HSV)、乳頭腫ウイルス、エプスタイン−バーウイルス(EBV)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)に限定されない)を含む。ウイルス遺伝子の全体またはほぼ全体が欠損している欠損DNAウイルスが好ましい。欠損DNAウイルスベクターは、細胞導入後に、感染性でない。欠損DNAウイルスの使用は、特定の、局在領域における細胞への投与を可能にし、ベクターが他の細胞に感染し得ることを考慮する必要はない。従って、脂肪組織は、特異的に標的化され得る。特定のベクターの例は、欠損ヘルペスウイルス1(HSV1)ベクター(Kaplittら, Molec.Cell.Neurosci.,2:320−330(1991))、弱毒化されたアデノウイルスベクター(例えば、Stratford−Perricaudetら,J.Clin.Invest.,90:626−630(1992)に記載されるベクター)、および欠損アデノ随伴ウイルスベクター(Samulskiら,J.Virol.,61:3096−3101(1987);Samulskiら,J.Virol.,63:3822−3828(1989))を含むが、これらに限定されない。別の実施形態において、核酸は、レトロウイルスベクター(例えば、Andersonら,米国特許第5,399,346号;Mannら,Cell,33:153(1983);Teminら,米国特許第4,650,764号;Teminら,米国特許第4,980,289号;Markowitzら,J.Virol.,62:1120(1988);Teminら,米国特許第5,124,263号;Doughertyらによる国際公開特許出願WO95/07358(1995年3月16日公開);およびKuoら,Blood,82:845(1993)に記載される)に導入され得る。あるいは、ベクターは、リポフェクションによってインビボ導入され得る。過去10年間、インビトロでの核酸の被包およびトランスフェクションのためのリポソームの使用が増えてきている。リポソーム媒介トランスフェクションに含まれる困難性および危険性を制限するよう設計された合成カチオン性脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製し得る(Felgnerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7413−7417(1987);Mackeyら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:8027−8031(1988)を参照)。カチオン性脂質の使用は、陰性に荷電した核酸の被包を促進し得、また陰性に荷電した細胞膜との融合を促進する(Felgnerら,Science,337:387−388(1989))。外因性遺伝子を特定の器官にインビボで導入するためのリポフェクションの使用は、特定の実用上の利点を有する。リポソームの特定の細胞への分子標的化は、1つの領域の利点を示す。特定の細胞型へのトランスフェクションを指向することは、細胞不均一性を有する組織(例えば、膵臓、肝臓、腎臓、および脳)において、特に有利であることが明らかである。脂質は、標的化の目的のために、化学的に他の分子に結合され得る(Mackeyら,1988,前述)。標的化ペプチド(例えば、ホルモンまたは神経伝達物質)、およびタンパク質(例えば、抗体)、または非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合され得る。
【0069】
ベクターを裸のDNAプラスミドとして、インビボで導入することもまた可能である。遺伝子治療のための裸のDNAベクターは、当該分野において公知の方法(例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、またはDNAベクタートランスポーターの使用)によって、所望の細胞中に導入され得る(例えば、Wuら,J.Biol.Chem.,267:963−967(1992);Wuら,J.Biol.Chem.,263:14621−14624(1988);Hartmutら,カナダ特許出願第2,012,311号(1990年3月15日に出願)を参照のこと)。
【0070】
カテーテルまたは他の装置と組み合せて、ベクターをインビボで導入することも可能である。Valeら,1999年;Kornowskiら,2000年を参照のこと。
【0071】
(実施例)
以下の実施例は、本発明の局面を例示するが、限定として解釈されるべきでない。本実施例において使用される記号および約束事は、現代の医学的および化学的文献において使用されるものと一致する。
【0072】
(実験手順)
(細胞)ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)をCell System Corporation(CS−C)(Kirkland,WA)またはClonetics(San Diego,CA)から入手し、そしてヒト肺動脈内皮細胞(HPAEC)、ヒト肺微小血管内皮細胞(HMVEC−L)、ヒト皮膚微小血管内皮細胞(HMVEC−D)をCloneticsから入手した。HUVECを慣用的にCS−C培地中において継代し、7回継代するまで実験に用いた。他の初代細胞を、慣用的にMicrovascular Endothelial Cell Growth Medium−2(EGM2−MV)(Clonetics)において継代した。2%胎仔ウシ血清(FBS)を含むEC Basal Medium(EBM)(「基礎培地」として規定される)、ならびに2%FBSおよび増殖補助因子を含むEBM(完全培地として規定される)を増殖、遊走、および免疫蛍光染色実験に用いた。EC Basal Medium 2(EBM−2)および増殖補助因子を特定化のための毛細血管形成アッセイにおいて用いた。
【0073】
(試薬および抗体)組換えヒトbFGFを増殖補助因子(Clonetics)として入手し、bFGFはまた、R&D Systems(Minneapolis,MN)およびSigma(St.Louis,MO)から入手した。アネキシンV−FITCをPharmingen(San Diego,CA)から入手し、ヨウ化プロピジウム(PI)をSigma(St.Louis,MO)から入手し、ウサギ抗ヒトFlk−1抗体およびウサギ抗Flt−1抗体を、Research Diagnostics Inc.(Flanders,NJ)から入手し、マウス抗Flgモノクローナル抗体(mAb)をChemicon(Temecula,CA)から入手し、マウス抗ヒトβ3、マウス抗ヒトβ1(クローンLIA 1/2)、およびラット抗ヒトαVmAbをImmunotech(Westbrook,ME)から入手し、マウス抗ヒトα5をPharmingen(San Diego,CA)から入手し、マウス抗ヒトα1(クローンAJH10)をBiogenから入手した(Gotwals P.J,ら,1999年、Biochem.38:8280−8288)。
【0074】
フィコエリトリン(PE)−結合体化ロバ抗ウサギIgG、ヤギ抗マウスIgG、およびロバ抗ラットIgGをJackson Immunoresearch Labs Inc.(West Groove,PA)から入手し、ビオチン結合体化抗フラッグをEastman Kodak Company(New Haven,CT)から入手し、そしてRPE−ストレプトアビジンをSouthern Biotechnology Associates,Inc.(Birmingham,AL)から入手した。可溶性CD40LをBiogenにおいて以前に記載したように調製された(Karpusas,M.ら,1995.Structure 3:1426−xxx)。
【0075】
TWEAK特異的mAbであるBE.B3およびAB.D3を、可溶性ヒトTWEAKタンパク質で免疫することにより、そして標準的ハイブリドーマ生成手順によりアルメニアハムスターにおいて生成した。AB.D3がヒトおよびマウスTWEAKに結合する能力、ならびにBE.B3がヒトTWEAKに結合する能力を、96ウェルマイクロタイタープレートに固定化した組換え可溶性TWEAKタンパク質を用いてELISAアッセイにおいて決定した。AB.D3のブロッキング能力を、FACS分析において、このmAb(BE.B3ではない)が、HT29細胞への可溶性FLAGタグ化ヒトTWEAK結合を阻害する能力により決定した。BE.B3を製造業者のプロトコル(Pierce,Rockford,IL)に従ってImmunoPure Biotinylationキットを用いてビオチン化し、そして調製した。ハムスターコントロールIg(クローンHa4/8−3.1)をアメリカンタイプカルチャーコレクションから得て、mAbを、プロテインA Fast Flowカラム(Pharmacia,Piscataway,NJ)により培養上清から精製した。
組換え可溶性ヒトTWEAKタンパク質−mycタグ化ヒトTWEAKについての可溶性発現構築物を、以前に記載したように構築した(Chicheportiche,Y.ら1997.J.Biol.Chem.272:32401−32410)。Flagタグ化および非タグ化形態もまた作製した。これらの可溶性形態のTWEAKを、酵母Pichia pastoris株GS 115において、標準的方法を用いて発現させた。
【0076】
増殖アッセイ−HUVECを、96ウェルマイクロタイタープレートにおいてコンフルエント未満に(4000細胞/ウェル)プレートし、そして製造業者の増殖補充物を添加することなくCS−C培地中で一晩増殖させた。培地を、上記で規定されるように完全培地または基礎培地と交換した。細胞を、TWEAK(100ng/ml)、bFGF増殖補充物(Clonetics)の1/500−1/1000希釈物を用いたbFGF、もしくは1ng/ml(R&D Systems),VEGF(10ng/ml)またはこれらの因子の組み合わせありまたはなしの基礎培地中で培養した。示された場合、10μg/mlの抗TWEAK mAbであるAB.D3、BE.B3またはハムスターコントロールIg Ha4/8もまた添加した。細胞を、5%CO2とともに37℃で3日間インキュベートし、そして増殖を、3H−チミジンで培養の最後の10時間にわたりパルスすることにより測定した。細胞に結合した放射活性を、BetaplateTM(EG&G Wallac,Gaithersburg,MD)を用いて測定した。
【0077】
アポトーシスの分析−HUVECを、1.2×105細胞/ウェルの密度で6ウェルプレートに播種し、製造業者の増殖補充物なしでCS−C培地中で一晩インキュベートした。培地を、完全培地、あるいはTWEAK(200ng/ml)、bFGF(1ng/ml)もしくはこれらの因子の組み合わせありまたはなしの基礎培地と交換し、細胞を24時間培養した。細胞をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄し、ディスパーゼ(CS−C)と37℃で15分間インキュベートし、続いて5mM EDTAおよび0.1% BSAを含むPBSを37℃で15分間再配置することにより剥離した。PBSでさらに洗浄した後、細胞を、製造業者(Pharmingen)に従って、FITC−アネキシン−Vおよび5μg/mlのヨウ化プロピジウムで染色した。蛍光を、FACStarPLUS(Becton Dickinson,San Jose,CA)を用いて時間内に分析した。
【0078】
内皮細胞創傷修復アッセイ−標準的な創傷修復アッセイを、以前に記載のように(Bussolino F.,et al,1991.J.Clin.Invest.87:986−991)用いた。簡潔には、コンフルエントな単層のHUVECを、2mmグリッド付きの35×10mm細胞培養ディッシュ(Nalge Nunc International,Naperville,IL)のCS−S培地中で増殖させた。この単層を、このディッシュの直径にわたり、1mmチップで2回直角に引っ掻く(stroke)ことにより傷をつけた(Morales D.E.ら,1995.Circulation 91:755−763)。押しのけた細胞を吸引し、プレートをPBSでリンスした。細胞を完全培地、あるいはTWEAK(200ng/ml)、bFGF(1/1000もしくは1ng/ml)、VEGF(10ng/ml)もしくはこれらの組み合わせありまたはなしの新鮮な基礎培地中で培養し、5%CO2とともに37℃で18時間インキュベートした。この時点で、プレートを1%パラホルムアルデヒドで固定し、Harris Hematoxylin(Sigma,St.Louis,MO)で染色した。創傷修復を、間隙が移動細胞により覆い隠されたグリッドの数を肉眼で計数することによって定量した。この数を創傷を配置したグリッドの総数で割り、結果を平均%創傷修復+/−SEMとしてあらわした。
【0079】
免疫蛍光染色−HUVECを、TWEAK(200ng/ml)、bFGF(1ng/ml)または両因子ありまたはなしの基礎培地中で24時間培養した。細胞を上記のように剥離し、0.1%ウシ血清アルブミンおよび0.02% NaN3を含有する200μlのPBS中の1次抗体10μg/mlを用いて4℃で20分間染色した。同じ緩衝液で洗浄した後、PE結合体化検出抗体を、製造業者により特定された濃度で、さらに15分間4℃で添加した。細胞をflagまたはmycのいずれかでタグ化したTWEAKとともにインキュベートすることによりTWEAK結合について分析した。ビオチン化したマウス抗flag抗体またはビオチン化BE.B3のいずれか、およびストレプトアビジン−PEを用いて結合を検出した。コールド競合を非タグ化TWEAKで行い、ブロッキングをAB.D3 mAbで行った。
【0080】
毛細管形成アッセイ−ECによる毛細管形成を、以前に記載された方法(Mach,F.ら,1999.Am.J.Pathol.154:229−239)に基づいて、3次元フィブリンマトリクスゲルアッセイを用いて分析した。簡潔には、4mg/mlのプラスミノゲン非含有ヒトフィブリノゲン(Calbiochem,San Diego,CA)を、ヘパリンおよびポリミキシンB(ともに1μg/ml)(Sigma)ならびに製造業者の補充物の全て(VEGFおよびbFGFを除く)を含有する無血清EBM−2培地中に溶解した。フィブリン溶液を濾過滅菌し、フィブリンマトリクスを、24ウェルプレートにおいてトロンビン(20〜50ミリユニット/ml)(Sigma)を添加し、300μl/ウェルで分配することにより調製した。次いで、ゲル表面に適切な濃度のEC(HUVECおよびHPAECについては4×104細胞/cm2、ならびにHMVEC−LおよびHMVEC−Dについては8×104/cm2)を播種し、上記のようにEBM−2倍地を重層し、特定されたように、TWEAK、bFGF、sCD40Lまたはこれらの因子の組み合わせの存在下および非存在下で5%FBSを重層した。培養して72時間後、ゲル表面の位相差顕微鏡写真を撮影した。ゲルを最初のウェルから新しいウェルに移し、10%エタノールで10分間、次いで4%パラホルムアルデヒドで固定した。ゲルを分析のために断片で切片にし、写真を撮った。
【0081】
(実施例1:TWEAKは、bFGF依存性増殖を増強する)
TWEAKのEC機能に対する効果を、TWEAK単独および別の血管形成性増殖因子と組み合わせて処理した培養物においてEC増殖を試験することにより調査した。ヒト臍静脈EC(HUVEC)を、bFGFの存在下および非存在下で基礎培地中で培養した(図1)。TWEAKの添加により、有意なECの増殖は誘導されなかった。対照的に、TWEAKおよび最適濃度のbFGFとともに培養した細胞は、bFGF単独の存在下で培養した細胞と比較して、有意に増強した増殖応答が示された。達成された増殖の程度は、完全培地で培養したECの程度に匹敵するか、またはこれより大きかった。1ng/mlのbFGFを用いて、同様の結果が認められた。TWEAKとbFGFの相乗的活性は、抗TWEAK mAbであるAB.D3により完全に阻害され、このことは、TWEAKの効果が特異的であるのに対して、抗TWEAK mAbであるBE.B3または無関係のコントロールIgによる阻害がなかったことを示唆する。さらに、組換え可溶性APRIL(別のTNFリガンド)では、増強は認められなかった(データは示さず)。図1に示した結果についての実験条件を、ここで詳細に記載する。HUVECを、完全培地または基礎培地中で培養した。TWEAK(100ng/ml)、bFGF(1/500希釈)またはこれらの因子の組み合わせを示されるように基礎培地に3日間添加し、3H−チミジン取り込みにより増殖を測定した。図1において、データは、3連のウェルの平均値+/−SDを示す。これらの結果は、4つの独立した実験の代表値である。ここで、bFGF+TWEAK処理培養物での増殖は、bFGF単独、TWEAK単独および基礎培地で培養したものとは、有意に異なり(P値<0.05)、TWEAKありまたはなしの基礎培地での培養物の間に有意差はなかった。増殖因子に加えて、ブロッキング抗TWEAK mAbであるAB.D3、非ブロッキング抗TWEAK mAbであるBE.B3、および無関係のハムスターコントロールIg Ha4/8(10μg/ml)を、示された場合に添加した。結果は、2つの独立した実験のうちの1つの代表値である。
【0082】
(実施例2:bFGFとTWEAKによるEC増殖の増強は、細胞死の減少に起因しない)
TWEAK/bFGF組み合わせによるHUVEC増殖の見掛けの増強は、細胞***の増加および細胞死の減少に起因し得る。この機構を扱うために、TWEAK、bFGFもしくは両方ありまたはなしの基礎培地中で培養したHUVECを分析して、アポトーシス細胞の頻度を決定した。アネキシンV染色を用いて、アポトーシスを受ける細胞を検出し、ヨウ化プロピジウム(PI)色素排除を用いて生細胞を検出した。TWEAKおよびbFGFの組み合わせで処理した培養物は、bFGF単独で処理した培養物のものと匹敵する生細胞、アポトーシス細胞および死細胞の割合を示した。これらの割合を、図2において、それぞれ四半分3、4および2に示す。2つのさらなる実験において同様の結果を得、ここ2倍体未満のDNA含有量を有する細胞を定量した(bFGF中で11%およびbFGF/TWEAK処理した培養物において11%)。従って、TWEAKによるbFGF依存性増殖の増強は、細胞死の減少に起因しない。にもかかわらず、TWEAK単独により細胞死の頻度が22%から14%にまで減少したことは注目すべきである。このパターンはまた、2つの独立した実験において認められ、ここで2倍体未満のDNAを有する細胞の割合は、TWEAKの存在下および非存在下で、それぞれ平均18+/−1%および9+/−0%であった。
【0083】
図2における結果についての実験条件を、ここで詳細に記載する。TWEAK(200ng/ml)、bFGF(1ng/ml)または両サイトカインありまたはなしの基礎培地中で24時間培養したHUVECを、アポトーシス細胞についてはFITC−アネキシン−V(x軸)および生存性についてはPI色素排除(y軸)で染色した。図2は、それぞれ四半分3、4および2において、生細胞、アポトーシス細胞または死細胞の割合を示す。
【0084】
(実施例3:TWEAKはbFGF依存性HUVEC移動を増強する)
TWEAKがEC移動をもたらす能力を、他の血管形成因子の存在下および非存在下で評価した。コンフルエントなHUVEC単層に傷を付け、EC移動を、創傷修復の程度を決定することにより、最初の18時間内にモニターした。しかし、基礎培地へのTWEAKまたはbFGFの添加により、低レベルの創傷修復が示されたが、これは、基礎培地単独で認められたものより有意に大きくはなかった。対照的に、TWEAKおよびbFGFの両方で処理した培養物は、基礎培地およびいずれかの因子単独を含有する培地での培養物より、有意に大きな程度まで修復され、完全培地におけるものと同様であった。HUVECを培養物から回収し、細胞数の何らかの増加が実験過程で生じるか否かを決定するために、計数した。全ての処理群において、細胞回復は比較可能であり(データは示さず)、このことは、TWEAKおよびbFGFの組み合わせ効果が細胞移動のレベルにあることを支持する。
【0085】
図3に示した結果についての実験条件を、ここで詳細に記載する。TWEAK(200ng/ml)、bFGF(1ng/mlもしくは1/1000希釈)、およびこれらの因子の組み合わせで処理したコンフルエントなHUVEC単層に傷を付け、培養して18時間後に修復を測定した。図3は、4つの実験の平均+/−SEMを示し、bFGF+TWEAKにより誘導された修復は、いずれか単独または基礎培地により誘導されたものとは有意に異なっている(P値<0.05)。
【0086】
(実施例4:TWEAKの効果は、増殖因子レセプターまたはインテグリンの調節によって媒介されない)
インテグリン(特に、αvβ3、α1β1およびα2β1)は、細胞外マトリクスを通過する細胞移動を容易にし、そしてまた細胞生存および血管形成因子に対する応答に必要な細胞内シグナル伝達を調節する(Eliceiri,B. and Cheresh,D.A.,1999.J.Clin.Invest.103:1227−1230;Senger,D.R.ら,1997.Proc.Natl.Acad.Sci.94:13612−13617)。従って、本発明者らは、TWEAKがEC上で発現される増殖因子レセプターまたはインテグリンを調節するか否かを決定することを目的とした。VEGFレセプターFlk−1およびFlt−1ならびにbFGFレセプターFlgは、基礎培地で培養したHUVEC上で非常に低レベルで発現した。ポジティブコントロールとして、これらのレセプター特異的mAbは、ヒト皮膚毛細管EV(HMVEC−D)上で強い染色を示した。Lynchら(11)による研究と一致して、本発明者らは、TWEAK処理培養物におけるVEGFレセプターFlk−1およびFlt−1の発現の変化も見出さず、bFGFもしくはTWEAK/bFGF組み合わせで処理した培養物においてもVEGFレセプター発現における変化は見られなかった。さらに、本発明者らは、TWEAK処理が、bFGFレセプターFlgまたはインテグリン(αv、α1、α5、β1およびβ3)のレベルを変化させないことを見出した。
【0087】
(実施例5:TWEAKは、EC形態形成を誘導する)
血管形成プロセスにおける重要な事象は、毛細管にECを侵襲するという構成である。TWEAKのこの形態形成工程に対する効果を、bFGFの存在下および非存在下で、3次元フィブリンゲルの表面に播種したECで測定した。本発明者らは、TWEAKがEC単層に対して効果がないが、最適濃度のbFGFが細胞侵襲およびECの索(cord)への組織化を促進することを見出した。TWEAKのbFGFへの添加は、EC単層において明らかな形態形成変化を誘導した。同様の結果がいくつかの異なるEC型で認められ、これらの型としては、HUVEC、ヒト肺動脈EC(HPAEC)、ヒト肺毛細管EC(HMVEC−L)およびHMVEC−Dが挙げられる。さらにこれらのゲルの断面分析により、TWEAKのbFGFへの添加が、ECの管腔を有する管への侵襲の構造組織化を誘導することが明らかになった。別のTNFメンバーであるCD40Lは、単独でも、bFGFとの組み合わせにおいても効果を有さなかった。従って、TWEAKは、bFGFと相乗効果を発揮して、毛細管管腔の形態形成を誘導する。この結果を、図4に示す。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、bFGF依存性HUVEC増殖に対するTWEAKの効果を示す。
【図2】
図2は、HUVEC死に対するTWEAKの効果を示す。
【図3】
図3は、bFGF依存性HUVEC遊走に対するTWEAKの効果を示す。
【図4】
図4は、毛細管形成に対するTWEAKおよびbFGFの相乗作用効果を示す。
Claims (6)
- インビトロ培養物において内皮細胞増殖を増強するための方法であって、該方法は、細胞培養物に、相乗効果的に有効量のTWEAKアゴニストおよび血管形成因子から本質的になる処方物を添加する工程を包含する、方法。
- 哺乳動物において血管形成活性を増強して、新血管新生を促進するための方法であって、該方法は、該動物に、新血管新生を促進するのに十分な、相乗効果的に有効量のTWEAKアゴニストおよび血管形成因子を含む処方物を投与する工程を包含する、方法。
- 請求項1または2に記載の方法であって、前記血管形成因子が、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、アンギオポエチン1、アンギオポエチン2、および単球走化性タンパク質−1(MCP−1)からなる群から選択される、方法。
- 前記血管形成因子がbFGFである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記方法が、心筋虚血状態の処置に使用される、請求項2に記載の方法。
- 前記方法が、創傷治癒を促進するために使用される、請求項2に記載の方法。
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