JP2004277323A - フィブリノーゲン含有溶液のウイルス除去法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ウイルス夾雑の危惧のあるフィブリノーゲン溶液のウイルス除去法において、より濾過効率がよく、工業的に有利なウイルス除去方法の提供。
【解決手段】フィブリノーゲン溶液をウイルス除去膜処理する前に、濾過助剤と濾過膜を用いた予備濾過処理を行うことにより前記課題を解決した。
【選択図】なし
【解決手段】フィブリノーゲン溶液をウイルス除去膜処理する前に、濾過助剤と濾過膜を用いた予備濾過処理を行うことにより前記課題を解決した。
【選択図】なし
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液からウイルス除去膜を用いてウイルスを除去する方法において、濾過助剤と濾過膜を用いた予備濾過工程を行った後ウイルス除去膜処理することにより、単位面積当たりの濾過液量を増加させ、効率的にウイルスを除去する方法を提供することにある。
【0002】
【従来の技術】
フィブリノーゲンはプラスミノーゲン、トロンビン、フィブロネクチンおよび血小板のような多くの生理学的に重要なタンパク質と相互作用することが知られており、中でもトロンビンにより限定分解され不溶性のフィブリンとなり、血小板の凝集とともに血餅を生成し、血管障害部位にフィブリン塊となって止血に働くことがよく知られている。このフィブリノーゲンはフィブリノーゲン製剤あるいはフィブリン糊の成分として配合されているもので、ヒトのプール血漿あるいは血漿の寒冷沈殿物より精製される。
フィブリノーゲンを含有する製剤など、ヒト血漿、その誘導画分等の血液製剤は、エイズウイルス、各種肝炎ウイルス、ヒトパルボウイルスB19などのウイルスに汚染されている可能性がある。従って血液製剤の製造に際しては、ウイルスを十分に不活化及び/又は除去する工程を組み込むことが必須である。
血液製剤に夾雑してくる危惧のあるウイルスを不活化する方法としては、水溶液状態での加熱処理法(以下、液状加熱という。)が提案され、それ以来この方法は血液製剤のウイルス不活化法として広く採用されている(非特許文献1)。
【0003】
一方ウイルスを除去する方法としては血液凝固VIII因子製剤中に意図的に添加したウイルスを再生セルロース製多孔性中空糸フィルターで濾過することにより除去する方法が記載されている(特許文献1)。
また免疫グロブリン製剤製造工程中にウイルス除去用中空糸フィルターによるウイルス除去工程を導入する方法が関口らによって報告されている(非特許文献2)。
しかしながら、これらのウイルス除去フィルターを用いたウイルス除去法は蛋白質がフィブリノーゲンである場合は特に濾過性が悪く、収率の低下及び使用膜量の増大などの問題点があり、工業的生産性の点で大きな課題となっている。また、血漿蛋白質のなかでもフィブリノーゲンは他の蛋白質製剤に比べてウイルス夾雑の危険性が高いと言われている。このためウイルスの不活化や除去については他の蛋白製剤より更に厳重に行う必要がある。
【0004】
ウイルスの不活化法としては、液状加熱法、乾燥加熱法、ソルベントデタージェント(SD)法などがあり、ウイルス除去法としてはウイルス除去フィルターによるウイルス除去法がある。またエタノール沈澱法及びカラムクロマトグラフィー法においてもウイルス除去が可能であることが知られている。ウイルスを吸着除去する目的でたんぱく質溶液に珪藻土、ベントナイトなどの吸着剤を混合して遠心分離又は濾過によりウイルスを分離する方法も提案されている(特許文献2)。
ウイルス除去膜を用いる処理時に、フィブリノーゲン含有溶液に塩基性アミノ酸(リジン、アルギニン)および塩化ナトリウムを含有させることによって、ウイルス除去膜処理の濾過性を改善させることも知られている(特許文献3)。
SD処理後に界面活性剤の濃度を調整して、ウイルス除去膜処理する際のタンパク質の濾過性を改善する報告もなされている(特許文献4)。
【0005】
【特許文献1】特開平2−167232号
【特許文献2】特許2987554号
【特許文献3】特開2001−335509号
【特許文献4】特表2001−521941号
【非特許文献1】Murrayら,The New York Academy of Medicine,31巻(5)341〜358(1955)
【非特許文献2】Japanese Journal of Transfusion Medicine,34巻(6)615〜617(1988)
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
以上述べた各種の方法を複数組み合わせることはウイルスの不活化、ウイルス除去の完璧を期すための有効な手段であると考えられるが、そのためには各処理工程においてフィブリノーゲンの収率低下を最小限に抑え、効率的に処理することが重要な課題となってくる。
本発明の課題はウイルス夾雑の危惧のあり、かつアルブミン、グロブリン、アンチトロンビン−III、トロンビンなどの他の血漿蛋白と比べウイルス除去膜を用いる際の濾過工程の濾過性が特に低いフィブリノーゲン溶液から産業的有利にウイルスを除去する方法を提供することにある。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するため種々の研究を重ねた結果、フィブリノーゲンを含有する溶液をウイルス除去膜処理する際に、予備濾過を行うことによりウイルス除去膜処理の濾過性が著しく改善されることを知見した。そこでこの予備濾過について種々の条件を検討した結果、濾過助剤を添加して深層濾過膜による予備濾過を行うと、フィブリノーゲンが安定的且つ効果的に濾過されることを見いだし、さらに検討を重ねて本発明を完成した。
【0008】
すなわち本発明は
(1)ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液に濾過助剤を加えて濾過膜により濾過し、得られた濾液をウイルス除去膜により濾過するウイルス除去法、
(2)濾過助剤が珪藻土、パーライトおよびベントナイトから選ばれる少なくとも1種である(1)記載のウイルス除去法、
(3)濾過助剤を加えたウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液の濾過に用いる濾過膜が深層濾過膜である(1)記載のウイルス除去法、
(4)ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液中に濾過助剤を1.0〜5.0重量%添加して濾過を行う請求項1記載のウイルス除去法、
(5)深層濾過膜の濾過孔径が0.1〜0.5μmである(3)記載のウイルス除去法、
(6)ウイルス除去膜が中空糸フィルターまたはメンブランフィルターである(1)記載のウイルス除去法、
(7)中空糸フィルターまたはメンブランフィルターの平均孔径が20〜60nmである(6)記載のウイルス除去法、および
(8)ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液がヒト血漿由来の画分である(1)記載のウイルス除去法、
である。
【0009】
【発明の実施の形態】
本発明の方法における出発原料は、ヒト血漿由来のコーンフラクションIまたはクリオペーストをクエン酸ナトリウム水溶液に溶解し、必要により濾過助剤を使用して濾過し、濃度の異なるエタノールによる精製によって得られたものが好ましい。
フィブリノーゲン含有溶液の蛋白濃度は1.0重量%以下、好ましくは0.5重量%に調製して濾過助剤を添加する。また、フィブリノーゲン含有溶液には必要により緩衝剤、安定化剤を添加することができ、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウムなどが用いられ溶液のpHとしては5.5〜7.5、好適には6.0〜6.5に調製しておくことが好ましく、フィブリノーゲンを安定化するための安定化剤としては、糖、アミノ酸、有機酸などを任意に配合することができ、特に塩基性アミノ酸であるアルギニン、リジン、酸性アミノ酸であるグルタミン酸を含んでいることが好ましい。
【0010】
本発明において使用する濾過助剤としては、珪藻土、パーライト、ベントナイトなどから選ばれる1種以上の混合物を添加することができ、中でも珪藻土を含むセライト(セライト社製)がより好適に用いられる。
濾過助剤の添加濃度は、通常0.5〜5.0重量%、好ましくは1.0〜2.0重量%、さらに好ましくは1.0重量%である。濾過助剤を添加した後にフィブリノーゲン含有溶液を攪拌して予備濾過を施した後ウイルス除去膜処理を施す。また、濾過助剤は予め予備濾過膜上にプレコートしておくことも有効である。ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲンを含有する溶液に濾過助剤を加えたものを予備濾過する濾過膜は、通常たんぱく質の濾過に用いられるものであればどのようなものでも利用できるが、特に深層濾過膜の使用が望ましい。濾過膜は濾過孔径が0.1〜0.5μm程度のものが用いられ、より好ましくは0.1〜0.2μmのものが用いられる。このような濾過膜としては、例えば、ゼータプラス90(キュノ社製)、SEITESUPRAEKS(P)(ザイツ社製)などが挙げられる。さらに、深層濾過膜による濾過後、濾過口径0.45μm以下、好ましくは0.1μm以下の多孔質膜やメンブランフィルターまたは60nm以上の中空糸膜フィルターでの濾過を行うことが好ましい。
【0011】
本発明に用いるウイルス除去フィルターは、ウイルスを通過させない多孔性膜であれば平膜状でも中空糸状でもよく、またその材料としては銅アンモニア法、ビスコース法、セルロースエステルのけん化法などの再生セルロース、アセテートなどの酢化セルロース、ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)、ポリアクリロニトリル(PAN)、ポリスルホン(PS)及びポリメチルメタクリレート(PMMA)等の合成高分子化合物があげられる。その中でも銅アンモニア法再生セルロース製多孔膜中空糸及びPVDF製メンブランフィルターが特に好ましい。また、銅アンモニア法再生セルロース製多孔膜中空糸は該中空糸の内壁面から外壁面への膜厚方向に層状構造を有しているので、高い蛋白の透過性と高いウイルスの阻止性能を併せ持っている。この中空糸の膜厚は10〜100μmが好ましく、50〜90μmがさらに好ましい。ウイルス除去フィルターの平均孔径は、通常10〜80nm、好ましくは15〜75nm、より好ましくは20〜60nmである。平均孔径が20nm以下のフィルターを用いると、パルボウイルスB19のような粒子径の小さなウイルスも除去することができる。しかしながら実際の工業スケールで生産する場合にはフィブリノーゲンが短時間で通過できるサイズでなければならず、且つ膜の透過率、透過時間等より20〜60nm程度が好ましく、より好適には30〜50nm程度のものが好適に用いられる。好適に用いられる具体的なフィルターは、プラノバ35N(平均孔径 35±2nm、旭化成製)またはDV50(ポール社製)である。また、場合によってはウイルス除去膜の孔径を75〜100nmのウイルス除去膜処理後にさらに30〜50nmのウイルス除去膜を使用することも可能であり、当該2段階のウイルス除去膜操作は膜の濾過液量を増加させることができ、フィルターの目詰まりを防止する観点で好ましいが、濾過助剤を用いた予備濾過工程を経ることで、必ずしも2つのウイルス除去フィルターを用いる必要はない。
本発明の各工程は、0〜30℃の温度で実施することができるが、蛋白の安定性の観点より2〜25℃が好ましく、より好適には15〜25℃で実施することが好ましい。
【0012】
【実施例】
以下に実施例、比較例および試験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
実施例1
ヒト血漿由来のコーンフラクションI 100gを7.5%エタノール含有55mMのクエン酸ソーダ水溶液(pH6.4)2リットルにて洗浄し、得られた沈殿物を55mMクエン酸水溶液pH6.4にて溶解した。ついで液を0℃まで冷却し、エタノール濃度が2.0v/v%となるようにエタノールを添加した。遠心分離で得られた上清画分に、さらにエタノール濃度8.0v/v%となるようにエタノールを添加し、沈殿物として精製フィブリノーゲン画分を得た。上記フィブリノーゲン画分沈殿物を55mM、pH6.4のクエン酸水溶液に溶解し、得られたフィブリノーゲン溶液に塩化ナトリウム、Lリジン塩酸、Lアルギニン塩酸をそれぞれ0.9w/v%、1.0w/v%、1.0w/v%の濃度になるように添加して薬液を調製した。
【0013】
実施例2
実施例1で得られた薬液100mLに濾過助剤セライトHSCを1.0w/v%濃度になるように添加して攪拌後に予備濾過として90LA(キュノ社製)フィルター、濾過孔径0.1μmメンブランフィルターで濾過した後、0.06MPaの一次圧でウイルス除去フィルター(プラノバ35N、旭化成(株)製)を通過させ、ウイルス除去を行った。
【0014】
実施例3
実施例1で得られた薬液100mLに濾過助剤セライトHSCを1.0w/v%濃度になるように添加して攪拌後に予備濾過として90LA(キュノ社製)フィルター、0.1μmメンブランフィルターで濾過した後、0.14MPaの一次圧でウイルス除去フィルター(DV50、日本ポール製)を通過させウイルス除去を行った。
【0015】
実施例4
実施例1で得られた薬液100mLに濾過助剤セライト酸洗浄HSCを1.0w/v%濃度となるように添加し、攪拌後に予備濾過として90LA(キュノ社製)フィルター、0.1μmメンブランフィルターを用いて濾過した後、0.14MPaの一次圧でウイルス除去フィルター(DV50、日本ポール(株)製)を通過させ、ウイルス除去を行った。
【0016】
実施例5
実施例1で得られた薬液100mLに濾過助剤セライト“Celpure 3000”を1.0w/v%濃度となるように添加し、攪拌後に予備濾過として90LA(キュノ社製)フィルター、0.1μmメンブランフィルターを用いて濾過した後、0.14MPaの一次圧でウイルス除去フィルター(DV50、日本ポール(株)製)を通過させ、ウイルス除去を行った。
【0017】
比較例1(濾過助剤処理なし)
実施例1で得られた薬液100mLを予備濾過として90LA(キュノ社製)フィルター、0.1μmメンブランフィルターで濾過した後、0.06MPaの一次圧でウイルス除去フィルター(プラノバ35N、旭化成製)を通過させウイルス除去を行った。
【0018】
比較例2(濾過助剤処理なし)
実施例1で得られた薬液100mLを予備濾過として0.45μm、0.1μmのメンブランフィルターで順次濾過した後、0.06MPaの一次圧でウイルス除去フィルター(プラノバ35N、旭化成製)を通過させウイルス除去を行った。
【0019】
比較例3(濾過助剤処理なし)
実施例1で得られた薬液100mLを予備濾過として90LA(キュノ社製)フィルター、0.1μmメンブランフィルターで濾過した後、0.14MPaの一次圧でウイルス除去フィルター(DV50、日本ポール製)を通過させウイルス除去を行った。
【0020】
比較例4(濾過助剤処理なし)
実施例1で得られた薬液100mLを予備濾過として0.45μm、0.1μmのメンブランフィルターで順次濾過した後、0.14MPaの一次圧でウイルス除去フィルター(DV50、日本ポール製)を通過させウイルス除去を行った。
【0021】
試験例1
実施例2〜5および比較例1〜4において、ウイルス除去膜処理前のフィブリノーゲン濃度およびウイルス除去膜処理後のフィブリノーゲン濃度をLaki法及びBlomback法を組み合わせて測定した。ウイルス除去膜処理前後のフィブリノーゲン濃度から、濾過前の濃度を100とした時の処理後の濃度を濃度回収率(%)として示した。また、ウイルス除去膜処理前後のフィブリノーゲン濃度に容量を乗じたフィブリノーゲン量から、濾過前に対する濾過後のフィブリノーゲンの収量を算出した。さらに、使用したウイルス除去膜の膜面積と濾過できた液量からウイルス除去膜1m2当たりの液量を濾過液量として算出した。それらの結果を〔表1〕に示す。
【0022】
【表1】
〔表1〕に示すように、実施例2〜5のフィブリノーゲン溶液は、同条件で濾過助剤添加を行わない比較例1〜4の溶液に比してウイルス除去膜を用いた時の濾過性が遙かに優れていた。
【0023】
【発明の効果】
このようにして濾過助剤を添加して予備濾過調製したフィブリノーゲンを含有する溶液は、従来にない高い濾過性並びにフィブリノーゲン回収性を示す。これはフィブリノーゲン含有溶液中に含まれる凝集体が濾過助剤と深層濾過膜の組み合わせにより高度に吸着除去され、かつフィルターを目詰まりさせることなく効率的にウイルスが除去されるからである。また、単なる予備濾過だけでは予備濾過後にウイルス除去膜処理する工程において新たな凝集体が生成してくることがあるが、本発明の濾過助剤を用いた予備濾過処理後にウイルス除去膜を通過させることにより、この問題点も解決された。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液からウイルス除去膜を用いてウイルスを除去する方法において、濾過助剤と濾過膜を用いた予備濾過工程を行った後ウイルス除去膜処理することにより、単位面積当たりの濾過液量を増加させ、効率的にウイルスを除去する方法を提供することにある。
【0002】
【従来の技術】
フィブリノーゲンはプラスミノーゲン、トロンビン、フィブロネクチンおよび血小板のような多くの生理学的に重要なタンパク質と相互作用することが知られており、中でもトロンビンにより限定分解され不溶性のフィブリンとなり、血小板の凝集とともに血餅を生成し、血管障害部位にフィブリン塊となって止血に働くことがよく知られている。このフィブリノーゲンはフィブリノーゲン製剤あるいはフィブリン糊の成分として配合されているもので、ヒトのプール血漿あるいは血漿の寒冷沈殿物より精製される。
フィブリノーゲンを含有する製剤など、ヒト血漿、その誘導画分等の血液製剤は、エイズウイルス、各種肝炎ウイルス、ヒトパルボウイルスB19などのウイルスに汚染されている可能性がある。従って血液製剤の製造に際しては、ウイルスを十分に不活化及び/又は除去する工程を組み込むことが必須である。
血液製剤に夾雑してくる危惧のあるウイルスを不活化する方法としては、水溶液状態での加熱処理法(以下、液状加熱という。)が提案され、それ以来この方法は血液製剤のウイルス不活化法として広く採用されている(非特許文献1)。
【0003】
一方ウイルスを除去する方法としては血液凝固VIII因子製剤中に意図的に添加したウイルスを再生セルロース製多孔性中空糸フィルターで濾過することにより除去する方法が記載されている(特許文献1)。
また免疫グロブリン製剤製造工程中にウイルス除去用中空糸フィルターによるウイルス除去工程を導入する方法が関口らによって報告されている(非特許文献2)。
しかしながら、これらのウイルス除去フィルターを用いたウイルス除去法は蛋白質がフィブリノーゲンである場合は特に濾過性が悪く、収率の低下及び使用膜量の増大などの問題点があり、工業的生産性の点で大きな課題となっている。また、血漿蛋白質のなかでもフィブリノーゲンは他の蛋白質製剤に比べてウイルス夾雑の危険性が高いと言われている。このためウイルスの不活化や除去については他の蛋白製剤より更に厳重に行う必要がある。
【0004】
ウイルスの不活化法としては、液状加熱法、乾燥加熱法、ソルベントデタージェント(SD)法などがあり、ウイルス除去法としてはウイルス除去フィルターによるウイルス除去法がある。またエタノール沈澱法及びカラムクロマトグラフィー法においてもウイルス除去が可能であることが知られている。ウイルスを吸着除去する目的でたんぱく質溶液に珪藻土、ベントナイトなどの吸着剤を混合して遠心分離又は濾過によりウイルスを分離する方法も提案されている(特許文献2)。
ウイルス除去膜を用いる処理時に、フィブリノーゲン含有溶液に塩基性アミノ酸(リジン、アルギニン)および塩化ナトリウムを含有させることによって、ウイルス除去膜処理の濾過性を改善させることも知られている(特許文献3)。
SD処理後に界面活性剤の濃度を調整して、ウイルス除去膜処理する際のタンパク質の濾過性を改善する報告もなされている(特許文献4)。
【0005】
【特許文献1】特開平2−167232号
【特許文献2】特許2987554号
【特許文献3】特開2001−335509号
【特許文献4】特表2001−521941号
【非特許文献1】Murrayら,The New York Academy of Medicine,31巻(5)341〜358(1955)
【非特許文献2】Japanese Journal of Transfusion Medicine,34巻(6)615〜617(1988)
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
以上述べた各種の方法を複数組み合わせることはウイルスの不活化、ウイルス除去の完璧を期すための有効な手段であると考えられるが、そのためには各処理工程においてフィブリノーゲンの収率低下を最小限に抑え、効率的に処理することが重要な課題となってくる。
本発明の課題はウイルス夾雑の危惧のあり、かつアルブミン、グロブリン、アンチトロンビン−III、トロンビンなどの他の血漿蛋白と比べウイルス除去膜を用いる際の濾過工程の濾過性が特に低いフィブリノーゲン溶液から産業的有利にウイルスを除去する方法を提供することにある。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題を解決するため種々の研究を重ねた結果、フィブリノーゲンを含有する溶液をウイルス除去膜処理する際に、予備濾過を行うことによりウイルス除去膜処理の濾過性が著しく改善されることを知見した。そこでこの予備濾過について種々の条件を検討した結果、濾過助剤を添加して深層濾過膜による予備濾過を行うと、フィブリノーゲンが安定的且つ効果的に濾過されることを見いだし、さらに検討を重ねて本発明を完成した。
【0008】
すなわち本発明は
(1)ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液に濾過助剤を加えて濾過膜により濾過し、得られた濾液をウイルス除去膜により濾過するウイルス除去法、
(2)濾過助剤が珪藻土、パーライトおよびベントナイトから選ばれる少なくとも1種である(1)記載のウイルス除去法、
(3)濾過助剤を加えたウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液の濾過に用いる濾過膜が深層濾過膜である(1)記載のウイルス除去法、
(4)ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液中に濾過助剤を1.0〜5.0重量%添加して濾過を行う請求項1記載のウイルス除去法、
(5)深層濾過膜の濾過孔径が0.1〜0.5μmである(3)記載のウイルス除去法、
(6)ウイルス除去膜が中空糸フィルターまたはメンブランフィルターである(1)記載のウイルス除去法、
(7)中空糸フィルターまたはメンブランフィルターの平均孔径が20〜60nmである(6)記載のウイルス除去法、および
(8)ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液がヒト血漿由来の画分である(1)記載のウイルス除去法、
である。
【0009】
【発明の実施の形態】
本発明の方法における出発原料は、ヒト血漿由来のコーンフラクションIまたはクリオペーストをクエン酸ナトリウム水溶液に溶解し、必要により濾過助剤を使用して濾過し、濃度の異なるエタノールによる精製によって得られたものが好ましい。
フィブリノーゲン含有溶液の蛋白濃度は1.0重量%以下、好ましくは0.5重量%に調製して濾過助剤を添加する。また、フィブリノーゲン含有溶液には必要により緩衝剤、安定化剤を添加することができ、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウムなどが用いられ溶液のpHとしては5.5〜7.5、好適には6.0〜6.5に調製しておくことが好ましく、フィブリノーゲンを安定化するための安定化剤としては、糖、アミノ酸、有機酸などを任意に配合することができ、特に塩基性アミノ酸であるアルギニン、リジン、酸性アミノ酸であるグルタミン酸を含んでいることが好ましい。
【0010】
本発明において使用する濾過助剤としては、珪藻土、パーライト、ベントナイトなどから選ばれる1種以上の混合物を添加することができ、中でも珪藻土を含むセライト(セライト社製)がより好適に用いられる。
濾過助剤の添加濃度は、通常0.5〜5.0重量%、好ましくは1.0〜2.0重量%、さらに好ましくは1.0重量%である。濾過助剤を添加した後にフィブリノーゲン含有溶液を攪拌して予備濾過を施した後ウイルス除去膜処理を施す。また、濾過助剤は予め予備濾過膜上にプレコートしておくことも有効である。ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲンを含有する溶液に濾過助剤を加えたものを予備濾過する濾過膜は、通常たんぱく質の濾過に用いられるものであればどのようなものでも利用できるが、特に深層濾過膜の使用が望ましい。濾過膜は濾過孔径が0.1〜0.5μm程度のものが用いられ、より好ましくは0.1〜0.2μmのものが用いられる。このような濾過膜としては、例えば、ゼータプラス90(キュノ社製)、SEITESUPRAEKS(P)(ザイツ社製)などが挙げられる。さらに、深層濾過膜による濾過後、濾過口径0.45μm以下、好ましくは0.1μm以下の多孔質膜やメンブランフィルターまたは60nm以上の中空糸膜フィルターでの濾過を行うことが好ましい。
【0011】
本発明に用いるウイルス除去フィルターは、ウイルスを通過させない多孔性膜であれば平膜状でも中空糸状でもよく、またその材料としては銅アンモニア法、ビスコース法、セルロースエステルのけん化法などの再生セルロース、アセテートなどの酢化セルロース、ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)、ポリアクリロニトリル(PAN)、ポリスルホン(PS)及びポリメチルメタクリレート(PMMA)等の合成高分子化合物があげられる。その中でも銅アンモニア法再生セルロース製多孔膜中空糸及びPVDF製メンブランフィルターが特に好ましい。また、銅アンモニア法再生セルロース製多孔膜中空糸は該中空糸の内壁面から外壁面への膜厚方向に層状構造を有しているので、高い蛋白の透過性と高いウイルスの阻止性能を併せ持っている。この中空糸の膜厚は10〜100μmが好ましく、50〜90μmがさらに好ましい。ウイルス除去フィルターの平均孔径は、通常10〜80nm、好ましくは15〜75nm、より好ましくは20〜60nmである。平均孔径が20nm以下のフィルターを用いると、パルボウイルスB19のような粒子径の小さなウイルスも除去することができる。しかしながら実際の工業スケールで生産する場合にはフィブリノーゲンが短時間で通過できるサイズでなければならず、且つ膜の透過率、透過時間等より20〜60nm程度が好ましく、より好適には30〜50nm程度のものが好適に用いられる。好適に用いられる具体的なフィルターは、プラノバ35N(平均孔径 35±2nm、旭化成製)またはDV50(ポール社製)である。また、場合によってはウイルス除去膜の孔径を75〜100nmのウイルス除去膜処理後にさらに30〜50nmのウイルス除去膜を使用することも可能であり、当該2段階のウイルス除去膜操作は膜の濾過液量を増加させることができ、フィルターの目詰まりを防止する観点で好ましいが、濾過助剤を用いた予備濾過工程を経ることで、必ずしも2つのウイルス除去フィルターを用いる必要はない。
本発明の各工程は、0〜30℃の温度で実施することができるが、蛋白の安定性の観点より2〜25℃が好ましく、より好適には15〜25℃で実施することが好ましい。
【0012】
【実施例】
以下に実施例、比較例および試験例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
実施例1
ヒト血漿由来のコーンフラクションI 100gを7.5%エタノール含有55mMのクエン酸ソーダ水溶液(pH6.4)2リットルにて洗浄し、得られた沈殿物を55mMクエン酸水溶液pH6.4にて溶解した。ついで液を0℃まで冷却し、エタノール濃度が2.0v/v%となるようにエタノールを添加した。遠心分離で得られた上清画分に、さらにエタノール濃度8.0v/v%となるようにエタノールを添加し、沈殿物として精製フィブリノーゲン画分を得た。上記フィブリノーゲン画分沈殿物を55mM、pH6.4のクエン酸水溶液に溶解し、得られたフィブリノーゲン溶液に塩化ナトリウム、Lリジン塩酸、Lアルギニン塩酸をそれぞれ0.9w/v%、1.0w/v%、1.0w/v%の濃度になるように添加して薬液を調製した。
【0013】
実施例2
実施例1で得られた薬液100mLに濾過助剤セライトHSCを1.0w/v%濃度になるように添加して攪拌後に予備濾過として90LA(キュノ社製)フィルター、濾過孔径0.1μmメンブランフィルターで濾過した後、0.06MPaの一次圧でウイルス除去フィルター(プラノバ35N、旭化成(株)製)を通過させ、ウイルス除去を行った。
【0014】
実施例3
実施例1で得られた薬液100mLに濾過助剤セライトHSCを1.0w/v%濃度になるように添加して攪拌後に予備濾過として90LA(キュノ社製)フィルター、0.1μmメンブランフィルターで濾過した後、0.14MPaの一次圧でウイルス除去フィルター(DV50、日本ポール製)を通過させウイルス除去を行った。
【0015】
実施例4
実施例1で得られた薬液100mLに濾過助剤セライト酸洗浄HSCを1.0w/v%濃度となるように添加し、攪拌後に予備濾過として90LA(キュノ社製)フィルター、0.1μmメンブランフィルターを用いて濾過した後、0.14MPaの一次圧でウイルス除去フィルター(DV50、日本ポール(株)製)を通過させ、ウイルス除去を行った。
【0016】
実施例5
実施例1で得られた薬液100mLに濾過助剤セライト“Celpure 3000”を1.0w/v%濃度となるように添加し、攪拌後に予備濾過として90LA(キュノ社製)フィルター、0.1μmメンブランフィルターを用いて濾過した後、0.14MPaの一次圧でウイルス除去フィルター(DV50、日本ポール(株)製)を通過させ、ウイルス除去を行った。
【0017】
比較例1(濾過助剤処理なし)
実施例1で得られた薬液100mLを予備濾過として90LA(キュノ社製)フィルター、0.1μmメンブランフィルターで濾過した後、0.06MPaの一次圧でウイルス除去フィルター(プラノバ35N、旭化成製)を通過させウイルス除去を行った。
【0018】
比較例2(濾過助剤処理なし)
実施例1で得られた薬液100mLを予備濾過として0.45μm、0.1μmのメンブランフィルターで順次濾過した後、0.06MPaの一次圧でウイルス除去フィルター(プラノバ35N、旭化成製)を通過させウイルス除去を行った。
【0019】
比較例3(濾過助剤処理なし)
実施例1で得られた薬液100mLを予備濾過として90LA(キュノ社製)フィルター、0.1μmメンブランフィルターで濾過した後、0.14MPaの一次圧でウイルス除去フィルター(DV50、日本ポール製)を通過させウイルス除去を行った。
【0020】
比較例4(濾過助剤処理なし)
実施例1で得られた薬液100mLを予備濾過として0.45μm、0.1μmのメンブランフィルターで順次濾過した後、0.14MPaの一次圧でウイルス除去フィルター(DV50、日本ポール製)を通過させウイルス除去を行った。
【0021】
試験例1
実施例2〜5および比較例1〜4において、ウイルス除去膜処理前のフィブリノーゲン濃度およびウイルス除去膜処理後のフィブリノーゲン濃度をLaki法及びBlomback法を組み合わせて測定した。ウイルス除去膜処理前後のフィブリノーゲン濃度から、濾過前の濃度を100とした時の処理後の濃度を濃度回収率(%)として示した。また、ウイルス除去膜処理前後のフィブリノーゲン濃度に容量を乗じたフィブリノーゲン量から、濾過前に対する濾過後のフィブリノーゲンの収量を算出した。さらに、使用したウイルス除去膜の膜面積と濾過できた液量からウイルス除去膜1m2当たりの液量を濾過液量として算出した。それらの結果を〔表1〕に示す。
【0022】
【表1】
〔表1〕に示すように、実施例2〜5のフィブリノーゲン溶液は、同条件で濾過助剤添加を行わない比較例1〜4の溶液に比してウイルス除去膜を用いた時の濾過性が遙かに優れていた。
【0023】
【発明の効果】
このようにして濾過助剤を添加して予備濾過調製したフィブリノーゲンを含有する溶液は、従来にない高い濾過性並びにフィブリノーゲン回収性を示す。これはフィブリノーゲン含有溶液中に含まれる凝集体が濾過助剤と深層濾過膜の組み合わせにより高度に吸着除去され、かつフィルターを目詰まりさせることなく効率的にウイルスが除去されるからである。また、単なる予備濾過だけでは予備濾過後にウイルス除去膜処理する工程において新たな凝集体が生成してくることがあるが、本発明の濾過助剤を用いた予備濾過処理後にウイルス除去膜を通過させることにより、この問題点も解決された。
Claims (8)
- ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液に濾過助剤を加えて濾過膜により予備濾過し、得られた濾液をウイルス除去膜により濾過するウイルス除去法。
- 濾過助剤が珪藻土、パーライトおよびベントナイトから選ばれる少なくとも1種である請求項1記載のウイルス除去法。
- 濾過助剤を加えたウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液の予備濾過に用いる濾過膜が、深層濾過膜である請求項1記載のウイルス除去法。
- ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液中に濾過助剤を1.0〜5.0重量%添加して予備濾過を行う請求項1記載のウイルス除去法。
- 深層濾過膜の濾過孔径が0.1〜0.5μmである請求項3記載のウイルス除去法。
- ウイルス除去膜が中空糸フィルターまたはメンブランフィルターである請求項1記載のウイルス除去法。
- 中空糸フィルターまたはメンブランフィルターの平均孔径が20〜60nmである請求項6記載のウイルス除去法。
- ウイルス混在のおそれのあるフィブリノーゲン含有溶液がヒト血漿由来の画分である請求項1記載のウイルス除去法。
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Cited By (4)
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-
2003
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Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9272245B2 (en) | 2008-05-22 | 2016-03-01 | Asahi Kasei Medical Co., Ltd. | Filtration method |
CN104321133A (zh) * | 2013-02-25 | 2015-01-28 | 甘布罗伦迪亚股份公司 | 病毒过滤器 |
WO2018230397A1 (ja) | 2017-06-12 | 2018-12-20 | 旭化成メディカル株式会社 | タンパク質含有液のろ過方法 |
KR20200003396A (ko) | 2017-06-12 | 2020-01-09 | 아사히 가세이 메디컬 가부시키가이샤 | 단백질 함유액의 여과 방법 |
US11590452B2 (en) | 2017-06-12 | 2023-02-28 | Asahi Kasei Medical Co., Ltd. | Method for filtering protein-containing liquid |
CN115894604A (zh) * | 2022-12-16 | 2023-04-04 | 康日百奥生物科技(苏州)有限公司 | 重组蛋白澄清纯化方法 |
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