JP2004267090A

JP2004267090A - Method for inspecting alergic disease

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Publication number: JP2004267090A
Application number: JP2003061436A
Authority: JP
Inventors: Kenji Izuhara; 賢治出原; Noriko Otani; 則子大谷; Akira Shinagawa; 朗品川; Yuji Sugita; 雄二杉田
Original assignee: JENOKKUSU SOYAKU KENKYUSHO KK; Genox Research Inc
Current assignee: JENOKKUSU SOYAKU KENKYUSHO KK; Genox Research Inc
Priority date: 2003-03-07
Filing date: 2003-03-07
Publication date: 2004-09-30

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for inspecting allergic diseases. <P>SOLUTION: The method for inspecting allergic diseases and a method for screening compounds useful for treating such diseases are provided respectively, with the expression level of an AHR(aryl hydrocarbon receptor, dioxin receptor) gene in a biological specimen as an indicator. Further, a model animal for allergic diseases enhanced in the expression of the AHR gene is also provided. The AHR gene, which is useful as a marker gene for allergic diseases, is such as to be selected as a gene significantly varying in expression in a plurality of bronchoepithelial cells stimulated by IL-4 or IL-13. It has also been confirmed that the expression level of the AHR gene is also enhanced in peripheral blood B cells stimulated by IL4 or IL4+CD40 ligand+anti-IgM antibody. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アレルギー性疾患の検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アレルギー性疾患は、多因子性の病気（ｍｕｌｔｉｆａｃｔｏｒｉａｌｄｉｓｅａｓｅｓ）と考えられている。つまりアレルギー性疾患は多くの異なる遺伝子の発現の相互作用によって起こり、これらの個々の遺伝子の発現は、複数の環境要因によって影響を受ける。このため、アレルギー性疾患を起こす特定の遺伝子を解明することは、非常に困難であった。
たとえば、気管支喘息は、気道における慢性の炎症性疾患として位置付けられている。そして気管支喘息の病態形成には、気道粘膜や気管支平滑筋におけるアレルギー反応の密接な関与が指摘されている。したがって気管支喘息の診断においては、これらの組織や全身性のアレルギー反応の状態を把握することが重要な課題である。また気管支喘息の治療においては、アレルギー反応の制御が課題となる。
【０００３】
一方、アレルギー性疾患には、変異や欠損を有する遺伝子の発現や、特定の遺伝子の過剰発現や発現量の減少が関わっていると考えられている。病気に関して遺伝子発現が果たしている役割を解明するためには、遺伝子が発症にどのように関わり、薬剤などの外的な刺激が遺伝子発現をどのように変化させるのかを理解する必要がある。
【０００４】
さて、気管支喘息の患者の多くに、ＩｇＥ抗体の産生亢進を伴うアトピー素因が見られる。気管支喘息には、多様な原因が考えられているが、アトピー素因が多くの患者において過敏症の原因となっていることは疑いを入れない。喘息発作の気道閉塞の機序には、気管支平滑筋の収縮、あるいは気道粘膜の浮腫や気道内分泌亢進が予想されている。このような気道の変化には、病因アレルゲンへの曝露によるＩ型アレルギー反応が重要な役割を果たしている。
【０００５】
さて、現在アレルギー性疾患の診断においては、一般に、問診、家族歴、そして本人の既往症の確認が重要な要素となっている。またアレルギーをより客観的な情報に基づいて診断するために、血液を試料とする試験方法や、アレルゲンに対する患者の免疫学的な応答を観察する方法も実施されている。前者の例として、アレルゲン特異的ＩｇＥ測定、白血球ヒスタミン遊離試験、あるいはリンパ球幼若化試験等が挙げられる。アレルゲン特異的ＩｇＥの存在は、そのアレルゲンに対するアレルギー反応の証明である。しかし患者によっては、必ずしもアレルゲン特異的なＩｇＥを検出できるとは限らない場合もある。また、その測定原理上、診断に必要なアレルゲンの全てに対して、試験を実施しなければならない。白血球ヒスタミン遊離試験やリンパ球幼若化試験は、免疫システムのアレルゲンに対する反応をｉｎｖｉｔｒｏで観察する方法である。これらの方法は、操作が煩雑である。
一方、患者を実際にアレルゲンに接触させたときに観察される免疫応答をアレルギーの診断に役立てる方法（後者）も公知である。プリック・テスト、スクラッチ・テスト、パッチ・テスト、皮内反応、あるいは誘発試験等が、この種の試験に含まれる。これらの試験では、患者のアレルギー反応を直接診断することができる反面、実際に被検者をアレルゲンに曝露する侵襲性の高い検査であると言うことができる。
【０００６】
この他、アレルゲンに関わらず、アレルギー反応の関与を証明するための試験方法も試みられている。たとえば、血清ＩｇＥ値が高値である場合、その患者にはアレルギー反応が起きていると推定することができる。血清ＩｇＥ値は、アレルゲン特異ＩｇＥの総量に相当する情報である。アレルゲンの種類に関わらずＩｇＥの総量を決定することは容易であるが、非アトピー型気管支炎等の疾患を持つ患者では、ＩｇＥが低値となる場合がある。
【０００７】
したがって、患者に対する危険が少なく、しかも診断に必要な情報を容易に得ることができる、アレルギー性疾患のマーカーが提供されれば有用である。このようなマーカーは、アレルギー性疾患の発症に深く関与していると考えられるので、診断のみならず、アレルギー症状のコントロールにおいても、重要な標的となる可能性がある。
【０００８】
【文献１】Ｃａｒｖｅｒ，ＬＡ＆ＢｒａｄｆｉｅｌｄＣＡ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１１４５２−１１４５６，１９９７
【文献２】Ｍｉｍｕｒａ，Ｊ．＆Ｆｕｊｉｉ−Ｋｕｒｉｙａｍａ，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．，９，７１−８１，２００２
【文献３】ＫＯ，ＨＰ．，Ｏｋｉｎｏ，ＳＴ．，Ｍａ，Ｑ．，Ｗｈｉｔｌｏｃｋ，ＪＰ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，４３０−４３６，１９９６
【文献４】Ｗｉｌｋ，ｒ．，Ｗｅｉｚｍａｎ，Ｉ．，＆Ｓｈｉｌｏ，ＢＺ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，１０，９３−１０２，１９９６
【文献５】Ｋｏｌｌｕｒｉ，ＳＫＷｅｉｓｓ，Ｃ．，Ｋｏｆｆ，Ａ．＆Ｇｏｔｔｌｉｃｈｅｒ，Ｍ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，１３，１７４２−１７５３，１９９９
【文献６】ＭｉｕｒａＪｅｔ．ａｌ．ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１３，２０−２５，１９９９
【文献７】Ａｂｂｏｔｔ，ＢＤ．，Ｂｉｒｎｂａｕｍ，ＬＳ．＆Ｐｅｒｄｅｗ，ＧＨ．，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２０４，１３３−１４３，１９９５
【文献８】Ａｂｂｏｔｔ，ＢＤ．＆Ｐｒｏｂｓｔ，ＭＲ．，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２０４，１４４−１５５，１９９５
【文献９】Ａｂｂｏｔｔ，ＢＤ．ｅｔ．ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１５５，６２−７０，１９９９
【文献１０】Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌｇｕｅｒｏ，ＰＭ．ｅｔ．ａｌ．Ｖｅｔ．Ｐａｔｈｏｌ．，３４，６０５−６１４，１９９７
【文献１０】Ｓｉｎｄｈｕ，ＲＫ．Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ，＆Ｋｉｋｋａｗａ，Ｙ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９２，１００８−１０１４，２０００
【文献１１】Ａｄａｃｈｉ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，３１４７５−３１４７８，２００１
【文献１２】Ｍｉｍｕｒａ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，ＧｅｎｅｓＣｅｌｌｓ，２，６４５−６５４，１９９７
【文献１３】Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌｇｕｅｒｏ，ＰＭ．ｅｔ．ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１４０，１７３−１７９，１９９６
【文献１４】Ｔｉａｎ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，５１０−５１５，１９９９
【文献１５】Ｏｉｋａｗａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ．，２９０，９８４−９８７，２００２
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アレルギー性疾患の検査を可能とする指標の提供を課題とする。さらに、本発明は該指標に基づく、アレルギー性疾患の検査方法および治療薬候補化合物のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
ＩＬ−４とＩＬ−１３がアレルギー反応に深く関与していることは、いくつかの報告により示唆されている。たとえばＩＬ−４（Ｙｓｓｅｌ，ＨａｎｄＧｒｏｕｘ，Ｈ：Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．ＡｌｌｅｒｇｙＩｍｍｕｎｏｌ．，１２１；１０−１８，２０００）や、ＳＴＡＴ６（Ａｋｉｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔａｌ．：Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８７，１５３７−１５４２，１９９８）をノックアウトしたマウスでは、気道過敏性が消失する。モデルマウスにおいては、ＩＬ−１３がＩｇＥ産生やＴｈ２型に関係なく喘息様病態の形成に関与している（Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ，Ｍ．ｅｔａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，２２５８−２２６１，１９９８；Ｇｒｕｎｉｇ，Ｇ．ｅｔａｌ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，２２６１−２２６３，１９９８；Ｚｈｕ，Ｚ．ｅｔａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０３，７７９−７８８，１９９９）。
【００１１】
またヒト気道上皮細胞、気管支平滑筋に、ＩＬ−４受容体及びＩＬ−１３受容体が高発現している（Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ，Ａ．ｅｔａｌ．：Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，９：５４９−５５９，２０００）。このことから、これらの組織はＩＬ−４及びＩＬ−１３の標的細胞と思われる。一方、ＩＬ−４受容体α及びＩＬ−１３に存在するＳＮＰが、アレルギー疾患の遺伝的要因の１つであることが示された（Ｍｉｔｓｕｙａｓｕ，Ｈ．，ｅｔａｌ．：ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．，１９，１１９−１２０，１９９８；Ｍｉｔｓｕｙａｓｕ，Ｈ．，ｅｔａｌ．：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：１２２７−１２３１，１９９９；Ｋｒｕｓｅ，Ｓ．，ｅｔａｌ．：Ｉｍｍｎｏｌ．，９６，３６５−３７１，１９９９；Ｈｅｉｎｚｍａｎｎ，Ａ．ｅｔａｌ．：Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，９：５４９−５５９，２０００）。更に、可溶型ＩＬ−４受容体αによりＩＬ−４あるいはＩＬ−１３の作用を阻害することが気管支喘息の治療として有効であることも示された（Ｂｏｒｉｓｈ，Ｌ．Ｃ．ｅｔａｌ．：Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．ＣａｒｅＭｅｄ．，１６０：９１２−９２２，１９９９）。
【００１２】
以上のように、ＩＬ−４とＩＬ−１３には、特に呼吸器症状を中心とするアレルギー反応との深い関係が示唆されている。つまりＩＬ−４及びＩＬ−１３によるシグナル伝達経路を構成する遺伝子は、アレルギー反応に深い関連性を有する遺伝子と言える。したがって、これらの遺伝子を単離し、アレルギー反応との関連性を明らかにすることにより、アレルギー性を含む気管支喘息のような疾患の治療の新たな標的を見出すことができる。
【００１３】
本発明者らは、このような考えかたに基づいて、ヒト気管支上皮細胞をＩＬ−４及びＩＬ−１３で処理したときに、発現レベルに変化を示す遺伝子を探索すれば、アレルギー反応に関連する遺伝子を単離することができるのではないかと考えた。同様のアプローチにより、ＩＬ−４やＩＬ−１３の処理によって発現レベルが変化する遺伝子の単離を試みた報告もある（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２０００，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｍａｙ１２−１６，２０００）。しかし公知の探索方法においては、解析に用いた細胞のロット数が少ない上、発現レベルの変化の幅が明らかでないので、ＩＬ−４やＩＬ−１３の刺激に対する特異性が期待できない。
【００１４】
そこで本発明者らは、ＩＬ−４やＩＬ−１３の刺激に対してより特異的に応答する遺伝子を単離するために、発現レベルの変動が２倍以上に及ぶ遺伝子としてアリル炭化水素受容体（以下、ＡＨＲと記載する）遺伝子を選択した。更に、ＡＨＲ遺伝子のアレルギー症状との関連性を明らかにするために、ＩＬ−４、ＣＤ４０リガンド、あるいは抗ＩｇＭ抗体で刺激した末梢血Ｂ細胞におけるＡＨＲ遺伝子の変動を観察した。ＣＤ４０リガンドとしては抗ＣＤ４０抗体を用いた。その結果、ＡＨＲ遺伝子の発現レベルは、これらの処理を施した末梢血Ｂ細胞においても有意に上昇することが確認された。
【００１５】
Ｂ細胞から抗体が産生されるようになる前に、全てのＢ細胞は再編成を終えた同一のＶ遺伝子によりコードされる膜型免疫グロブリン分子ＩｇＭをＢ細胞レセプターとして細胞表面に発現する。イソタイプスイッチを終了したメモリーＢ細胞は、ＩｇＭ以外の新たな免疫グロブリンを産生できるようになる。
Ｂ細胞表面免疫グロブリン分子の架橋によって細胞内シグナル伝達経路が活性化されることは、良く知られており、ｉｎｖｉｔｒｏでは、例えば抗ＩｇＭ抗体を作用させることによりＩｇＭを架橋すると、ｂｌｋ，ｌｃｋ，ｆｙｎ，ｌｙｎ等のチロシンキナーゼの活性化が起こる。
【００１６】
また、Ｂ細胞の免疫反応で重要なのは、ヘルパーＴ細胞との相互作用による活性化である。抗原特異的ナイーブＢ細胞が抗原のみによって活性化されることはない。Ｂ細胞の場合、ヘルパーＴ細胞由来の補助シグナルが必要となる。Ｂ細胞表面のＣＤ４０は、ヘルパーＴ細胞表面のＣＤ４０リガンドと結合し、また、ヘルパーＴ細胞の産生するサイトカインによりＢ細胞は活性化される。Ｉｎｖｉｔｒｏでは、Ｂ細胞にＣＤ４０リガンドを加えることにより活性化を促すことができる。また、ＣＤ４０リガンドの効果は、抗ＣＤ４０抗体を作用させることでも同様に観察可能である。したがって、ＩＬ−４、ＣＤ４０リガンド、あるいは抗ＩｇＭ抗体などで刺激されたＢ細胞において発現レベルが変動する遺伝子は、Ｂ細胞の活性化と関連する遺伝子であると考えることができる。
【００１７】
以上の知見に基づいて本発明者らは、ＡＨＲ遺伝子、並びにＡＨＲ遺伝子によってコードされる蛋白質を指標とすることによって、アレルギー性疾患の検査が可能となることを見出し本発明を完成した。また本発明者らは、ＡＨＲ遺伝子の発現レベル、あるいはＡＨＲ遺伝子によってコードされる蛋白質の活性を指標とすることによって、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングできることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の検査方法、並びにスクリーニング方法に関する。
〔１〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の検査方法であって、指標遺伝子がアリル炭化水素受容体遺伝子である方法。
ａ）被検者の生体試料における、指標遺伝子の発現レベルを測定する工程
ｂ）アレルギー性疾患ではない生体の生体試料における指標遺伝子の発現レベルと比較する工程
〔２〕生体試料が血液である〔１〕に記載の検査方法。
〔３〕遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔４〕遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する〔１〕に記載の検査方法。
〔５〕アリル炭化水素受容体遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アレルギー性疾患の検査用試薬。
〔６〕アリル炭化水素受容体蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、アレルギー性疾患の検査用試薬。
〔７〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が、アリル炭化水素受容体遺伝子、または該遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（３）対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔８〕細胞が株化Ｂ細胞である〔７〕に記載の方法。
〔９〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が、アリル炭化水素受容体遺伝子、または該遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、
（２）被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１０〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が、アリル炭化水素受容体遺伝子、または該遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較してレポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
〔１１〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標蛋白質が、アリル炭化水素受容体遺伝子、または該遺伝子と機能的に同等な遺伝子によってコードされる蛋白質である方法。
（１）指標蛋白質と候補物質を接触させる工程、
（２）指標蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較して指標蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程
〔１２〕〔７〕、〔９〕、〔１０〕、および〔１１〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、アレルギー性疾患の治療薬。
〔１３〕指標遺伝子のセンス鎖の塩基配列の連続する少なくとも１５塩基の配列に対して相補的な配列を含むアンチセンスＤＮＡを主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子がアリル炭化水素受容体遺伝子または該遺伝子と機能的に同等な遺伝子である治療薬。
〔１４〕アリル炭化水素受容体に結合する抗体を主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬。
〔１５〕指標遺伝子のＢ細胞における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物のアレルギー性疾患のモデル動物としての使用であって、指標遺伝子が、アリル炭化水素受容体遺伝子、または該遺伝子と機能的に同等な遺伝子である使用。
〔１６〕指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドと、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子が、アリル炭化水素受容体遺伝子、または該遺伝子と機能的に同等な遺伝子であるキット。
〔１７〕指標遺伝子によってコードされる蛋白質を認識する抗体と、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子が、アリル炭化水素受容体遺伝子、または該遺伝子と機能的に同等な遺伝子であるキット。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明において、アレルギー性疾患（ａｌｌｅｒｇｉｃｄｉｓｅａｓｅ）とはアレルギー反応の関与する疾患の総称である。より具体的には、アレルゲンが同定され、アレルゲンへの曝露と病変の発症に深い結びつきが証明され、その病変に免疫学的な機序が証明されることと定義することができる。ここで、免疫学的な機序とは、アレルゲンの刺激によって白血球細胞が免疫応答を示すことを意味する。アレルゲンとしては、ダニ抗原や花粉抗原等を例示することができる。
代表的なアレルギー性疾患には、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症、あるいは昆虫アレルギー等を示すことができる。アレルギー素因（ａｌｌｅｒｇｉｃｄｉａｔｈｅｓｉｓ）とは、アレルギー性疾患を持つ親から子に伝えられる遺伝的な因子である。家族性に発症するアレルギー性疾患はアトピー性疾患とも呼ばれ、その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー素因である。喘息は、アトピー性疾患のうち、特に呼吸器症状を伴う疾患に対して与えられた総称である。
【００１９】
本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、被検者の生体試料におけるＡＨＲ遺伝子の発現レベルを測定し、アレルギー性疾患ではない生体の測定値と比較する工程を含む。両者の比較の結果、アレルギー性疾患ではない生体よりも発現が亢進している場合には、被検者はアレルギー性疾患患者であると判定される。本発明において、アレルギー性疾患ではない生体とは健常者のほか、健常とは言えないが明らかにアレルギー性疾患を有さないと診断された生体が含まれる。
【００２０】
本発明においてＡＨＲ遺伝子とは、本実施例において同定されたヒトＡＨＲ遺伝子およびそれと同一の遺伝子座または他生物において相同の遺伝子座にある遺伝子を言う。例えば本発明においてＡＨＲ遺伝子は、本実施例において同定されたヒトＡＨＲ遺伝子と同じまたは相同の遺伝子座にある任意の対立遺伝子が含まれる。本発明においてＡＨＲ遺伝子には、具体的には、本実施例において同定されたヒトＡＨＲ遺伝子、その多型（ＳＮＰを含む）、変異体、スプライシングバリアント、および他生物のホモログを含む。これらの遺伝子は、ヒトＡＨＲ遺伝子と実質的に同一または類似の発現制御を受けていると考えられることから、それらの発現を検出することにより、本発明のアレルギー性疾患の検査を行うことが可能である。
【００２１】
具体的には、本発明においてＡＨＲ遺伝子は、以下の核酸からなる内在性遺伝子と実質的に同一の遺伝子である。内在性遺伝子とは、自然界の生物が元来保持している、人の手により改変されていない遺伝子を言い、それと同一の塩基配列からなる遺伝子は、内在性遺伝子と実質的に同一の遺伝子である。また「遺伝子」とは、ここでは転写産物またはそれをコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を言う。
（ａ）ＡＨＲ遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ．＃ＮＭ＿００１６２１）から選択された塩基配列を含む核酸。
（ｂ）ＡＨＲ遺伝子のコード配列の塩基配列において、１または複数の塩基が置換、欠失、および／または挿入した塩基配列を含む核酸。
（ｃ）ＡＨＲ蛋白質のアミノ酸配列の連続した少なくとも１５アミノ酸をコードする核酸。
（ｄ）ＡＨＲ蛋白質のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入したアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする核酸。
（ｅ）ＡＨＲ遺伝子の連続した少なくとも５０塩基を含み、ＡＨＲ遺伝子の塩基配列以外の配列を含まない核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸。
【００２２】
（ａ）に記載の核酸には、好ましくはＡＨＲ遺伝子（より好ましくはそのコード配列）に記載の塩基配列の連続した少なくとも４０塩基、より好ましくは６０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上、より好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上、より好ましくは１０００塩基以上、最も好ましくは全長を含む核酸が含まれる。このような核酸には、主に同一種内の遺伝子の多型、変異体、およびスプライシングバリアントが含まれ得る。また（ａ）に記載の核酸としては、ＡＨＲ遺伝子の塩基配列の連続した少なくとも３０塩基、より好ましくは３５塩基以上、より好ましくは４０塩基以上、より好ましくは４５塩基以上、より好ましくは５０塩基以上の塩基配列を含む核酸が挙げられる。塩基配列は、ＡＨＲ遺伝子のコード配列から選択することが好ましい。塩基配列は、任意の数を選択することができる。複数の塩基配列を選択する場合には、オーバーラップしないように２箇所以上、好ましくは３箇所以上、より好ましくは４箇所以上、より好ましくは５箇所以上の連続した塩基配列を含む核酸がより好ましい。
【００２３】
（ｂ）に記載の核酸には、好ましくはＡＨＲ遺伝子のコード配列において、全塩基数の１５％以内、より好ましくは１０％以内、より好ましくは８％以内、より好ましくは５％以内、より好ましくは１％以内の塩基が置換、欠失、および／または挿入した塩基配列を含む核酸が含まれる。このような核酸には、近縁の他種生物のカウンターパートの遺伝子、その多型、その変異体、およびそのスプライシングバリアントなどが含まれ得る。このような核酸は、好ましくはＡＨＲ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００１６２１）のコード配列と８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸である。
【００２４】
塩基配列またはアミノ酸配列の同一性は、例えばＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）を用いて決定することができる。具体的には、塩基配列の同一性を決定するにはｂｌａｓｔｎプログラム、アミノ酸配列の同一性を決定するにはｂｌａｓｔｐプログラムを用い、例えばＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｈｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴのウェブサイトにおいてＬｏｗｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙを含むフィルターは全てＯＦＦにして、デフォルトのパラメータを用いて検索を行う（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔａｌ．（１９９３）ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔａｌ．（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．（１９９７）ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．７：６４９−６５６）。例えば２つの配列の比較を行うｂｌａｓｔ２ｓｅｑｕｅｎｃｅｓプログラム（ＴａｔｉａｎａＡｅｔａｌ．（１９９９）ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に扱い、ＡＨＲ遺伝子のコード配列全体に対する同一性の値を計算する。
【００２５】
（ｃ）に記載の核酸には、好ましくはＡＨＲ蛋白質のアミノ酸配列の連続した少なくとも２０アミノ酸、より好ましくは３０アミノ酸以上、より好ましくは５０アミノ酸以上、より好ましくは１００アミノ酸以上、より好ましくは３００アミノ酸以上、より好ましくは５００アミノ酸以上、最も好ましくは全長をコードする核酸が含まれる。このような核酸には、上記の（ａ）と同様に、主に同一種内の遺伝子の多型、変異体、およびスプライシングバリアントが含まれ得る。また（ｃ）に記載の核酸としては、ＡＨＲ蛋白質の塩基配列の連続した少なくとも８アミノ酸、より好ましくは１０アミノ酸以上、より好ましくは１５アミノ酸以上、より好ましくは２０アミノ酸以上、より好ましくは２５アミノ酸以上のアミノ酸配列をコードする塩基配列部分を、オーバーラップしないように２箇所以上、好ましくは３箇所以上、より好ましくは４箇所以上、より好ましくは５箇所以上含む核酸がより好ましい。
【００２６】
（ｄ）に記載の核酸には、好ましくはＡＨＲ蛋白質のアミノ酸配列において、全アミノ酸数の１５％以内、より好ましくは１０％以内、より好ましくは８％以内、より好ましくは５％以内、より好ましくは１％以内のアミノ酸が置換、欠失、および／または挿入したアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする核酸が含まれる。この核酸は、非翻訳配列を含んでいてよい。このような核酸には、近縁の他種生物のカウンターパートの遺伝子、その多型、その変異体、およびそのスプライシングバリアントなどが含まれ得る。このような核酸は、好ましくはＡＨＲ蛋白質のアミノ酸配列と８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする核酸である。ギャップはミスマッチと同様に扱い、ＡＨＲ蛋白質のアミノ酸配列全体に対する同一性の値を計算する。アミノ酸配列の同一性は上記に従って決定することができる。
【００２７】
（ｅ）に記載の核酸には、好ましくはＡＨＲ遺伝子（より好ましくはコード配列）に記載の連続した少なくとも８０塩基、より好ましくは１００塩基以上、より好ましくは１２０塩基以上、より好ましくは２００塩基以上を含み、ＡＨＲ遺伝子（より好ましくはコード配列）に記載した塩基配列以外の配列を実質的に含まない核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸が含まれる。このような核酸は、例えばＡＨＲ遺伝子の塩基配列を含む核酸を鋳型にして作製されたプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であってよい。５０塩基から数百塩基の長さのプローブは、例えばＤＮＡ合成により合成することもできるし、あるいはランダムプライム法、ニックトランスレーション、またはＰＣＲ法などにより作製することができる。
【００２８】
（ｅ）に記載の核酸における、ストリンジェントな条件とは、好ましくは０．５〜０．９Ｍ程度のＮａＣｌを含むハイブリダイゼーション溶液中、６０℃、好ましくは６２℃、より好ましくは６５℃でハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温度で１×ＳＳＣ中、好ましくは０．５×ＳＳＣ中、より好ましくは０．２×ＳＳＣ中、より好ましくは０．１×ＳＳＣ中で、１時間洗浄する条件である。但し、ストリンジェンシーを大きく左右するハイブリダイゼーションや洗浄の温度条件は、プローブの融解温度（Ｔｍ）に応じて調整することができる。Ｔｍはハイブリダイズする塩基対に占める構成塩基の割合、プローブの鎖長、ハイブリダイゼーション溶液組成（塩濃度およびホルムアミド濃度）によって変動する。したがって、当業者であればこれらの条件を考慮して同等のストリンジェンシーを与える条件を経験的に設定することができる。ハイブリダイゼーション溶液としては、例えば４×ＳＳＣ、または好ましくはＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（登録商標）ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＳｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などを用いることができる。
【００２９】
本発明において、指標遺伝子の発現レベルとは、これらの遺伝子のｍＲＮＡへの転写、並びに蛋白質への翻訳を含む。したがって本発明によるアレルギー性疾患の検査方法は、前記遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現強度、あるいは前記遺伝子によってコードされる蛋白質の発現レベルの比較に基づいて行われる。
【００３０】
発現レベルの比較のためには、通常、たとえば健常者における前記指標遺伝子の発現レベルに基づいて、標準値が設定される。この標準値をもとに、たとえば±２Ｓ．Ｄ．の範囲が許容範囲とされる。指標遺伝子の測定値に基づいて、標準値や許容範囲を設定する手法は公知である。被検者における指標遺伝子の発現レベルが許容範囲よりも高ければ、その被検者はアレルギー性疾患を有していると予想される。また許容範囲内、あるいは許容範囲に満たない場合には、アレルギー性疾患の可能性は低いと予想される。
【００３１】
本発明におけるアレルギー性疾患の検査における指標遺伝子の発現レベルの測定は、公知の遺伝子解析方法にしたがって実施することができる。具体的には、たとえばこの遺伝子にハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、または本発明の遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用することができる。
【００３２】
本発明の検査に用いられるプローブまたはプライマーは、前記指標遺伝子の塩基配列に基づいて設定することができる。前記指標遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００１６２１）は公知である。
なお一般に高等動物の遺伝子は、高い頻度で多型を伴う。また、スプライシングの過程で相互に異なるアミノ酸配列からなるアイソフォームを生じる分子も多く存在する。多型やアイソフォームによって塩基配列に変異を含む遺伝子であっても、前記指標遺伝子と同様の活性を持ち、アレルギーに関与する遺伝子は、いずれも本発明の指標遺伝子に含まれる。
【００３３】
プライマーあるいはプローブには、前記指標遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な少なくとも１５ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、Ａ：Ｔ（ＲＮＡの場合はＵ）、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ等のアルゴリズムにより決定することができる。
【００３４】
このようなポリヌクレオチドは、指標遺伝子を検出するためのプローブとして、また指標遺伝子を増幅するためのプライマーとして利用することができる。プライマーとして用いる場合には、通常、１５ｂｐ〜１００ｂｐ、好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、指標遺伝子（またはその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも１５ｂｐの鎖長のＤＮＡが用いられる。プライマーとして用いる場合、３’側の領域は相補的である必要があるが、５’側には制限酵素認識配列やタグなどを付加することができる。
【００３５】
なお、本発明における「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡあるいはＲＮＡであることができる。これらポリヌクレオチドは、合成されたものでも天然のものでもよい。また、ハイブリダイゼーションに用いるプローブＤＮＡは、通常、標識したものが用いられる。標識方法としては、例えば次のような方法を示すことができる。なお用語オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのうち、重合度が比較的低いものを意味している。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれる。
・ＤＮＡポリメラーゼＩを用いるニックトランスレーションによる標識
・ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識
・クレノーフラグメントによるフィルイン末端標識（ＢｅｒｇｅｒＳＬ，ＫｉｍｍｅｌＡＲ．（１９８７）ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＭｅｔｈｏｄｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ；ＨａｍｅｓＢＤ，ＨｉｇｇｉｎｓＳＪ（１９８５）ＧｅｎｅｓＰｒｏｂｅｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬＰｒｅｓｓ；ＳａｍｂｒｏｏｋＪ，ＦｒｉｔｓｃｈＥＦ，ＭａｎｉａｔｉｓＴ．（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄＥｄｎ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）
・ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による標識（ＭｅｌｔｏｎＤＡ，Ｋｒｉｅｇ，ＰＡ，ＲｅｂａｇｋｉａｔｉＭＲ，ＭａｎｉａｔｉｓＴ，ＺｉｎｎＫ，ＧｒｅｅｎＭＲ．（１９８４）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．，１２，７０３５−７０５６）
・放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドをＤＮＡに取り込ませる方法（ＫｒｉｃｋａＬＪ．（１９９２）ＮｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃＤＮＡＰｒｏｂｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）
【００３６】
ハイブリダイゼーション技術を利用したアレルギー性疾患の検査は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイを用いた方法などを使用して行うことができる。さらには、ＲＴ−ＰＣＲ法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター法を用いることにより、本発明の遺伝子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。
【００３７】
ＰＣＲ遺伝子増幅モニター法においては、両端を互いの蛍光を打ち消し合う異なった蛍光色素で標識したプローブを用い、検出対象（ＤＮＡもしくはＲＮＡの逆転写産物）にハイブリダイズさせる。ＰＣＲ反応が進んでＴａｑポリメラーゼの５’−３’ エクソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の明らかな標準試料について同時に測定することにより、ＰＣＲ増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピー数を決定する（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．ｅｔａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：７２７６−７２８０；Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．ｅｔａｌ．，１９９５，ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ４（６）：３５７−３６２；Ｈｅｉｄ，Ｃ．Ａ．ｅｔａｌ．，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ６：９８６−９９４；Ｇｉｂｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．Ｕ．ｅｔａｌ．，１９９６，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ６：９９５−１００１）。ＰＣＲ増幅モニター法においては、例えば、ＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることができる。
【００３８】
また本発明のアレルギー性疾患検査方法は、前記指標遺伝子によりコードされる蛋白質を検出することにより行うこともできる。以下、本明細書において、前記指標遺伝子によりコードされる蛋白質を指標蛋白質と記載する。このような検査方法としては、例えば、これら指標蛋白質に結合する抗体を利用したウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法などを利用することができる。
【００３９】
この検出に用いる前記指標蛋白質に結合する抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体（ＭｉｌｓｔｅｉｎＣ，ｅｔａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ３０５（５９３４）：５３７−４０）であることができる。例えば、指標蛋白質に対するポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。あるいは必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。ヒトＡＨＲに対するポリクローナル抗体は市販されている（ＳＡＮＴＡＣＲＵＺＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＩＮＣ．，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓｃ−５５７９／ｒａｂｂｉｔｐｏｌｙｃｌｏｎａｌＩｇＧ，Ｓｃ−８０８８／ｇｏａｔｐｏｌｙｃｌｏｎａｌＩｇＧ）。
また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させる。こうして得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から抗体を回収しモノクローナル抗体とすることができる。
【００４０】
指標蛋白質の検出には、これらの抗体を適宜標識して用いればよい。また、この抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインＡやプロテインＧを標識して間接的に検出することもできる。具体的な検出方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。
抗原に用いる蛋白質もしくはその部分ペプチドは、例えば該遺伝子もしくはその一部を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換え蛋白質を発現させ、発現させた組み換え蛋白質を培養体または培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、これらの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、あるいは全長ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。
【００４１】
更に本発明においては、指標遺伝子の発現レベルのみならず、生体試料における指標蛋白質の活性を指標として、アレルギー性疾患を検査することもできる。指標蛋白質の活性とは、各蛋白質が備える生物学的な活性を言う。前記指標蛋白質の活性の検出は、公知の方法に基づいて行うことができる。ＡＨＲの活性の測定方法は公知である。
【００４２】
先に述べたように、ＡＨＲは転写因子としての活性を有する。ＡＨＲの転写因子としての活性を測定する方法として、たとえば次のような方法を利用することができる。たとえば、ＸＲＥを有するプロモーター配列の下流に適当なレポーター遺伝子を導入して、ＡＨＲの転写活性を評価するためのレポーターコンストラクトを構築することができる。プロモーターとしては、たとえばＣＹＰ１Ａ１のプロモータ領域を用いることができる。ＣＹＰ１Ａ１のプロモータ領域は既に明らかにされている（Ｆｕｊｉｉ−ＫｕｒｉｙａｍａＹｅｔ．ａｌ．ＦＡＳＥＢＪ．，６，７０６−７１０，１９９２，ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＣＹＰ１Ａ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．；Ｋｏｂａｙａｓｈｉａ，ＳｏｇａｗａＫ＆Ｆｕｊｉｉ−ＫｕｒｉｙａｍａＹ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１２３１０−１２３１６，１９９６，ＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＡｈＲ，ＡｒｎｔａｎｄＳｐ１ｆｏｒｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＹＰ１Ａ１ｇｅｎｅ．）。またレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、β−ｇａｌ、あるいはＧＦＰ等が一般に利用されている。
【００４３】
こうして構築されたレポーターコンストラクトを、適当な宿主に導入する。この宿主細胞において転写因子としての活性を評価すべき蛋白質をコードする蛋白質を発現させ、転写活性を誘導すれば、レポーター遺伝子の発現量に基づいて、転写因子としての活性を評価することができる。転写活性の誘導のためには、リガンドを供給する。具体的には、ＡＨＲはリガンド依存的に機能するので外因性リガンドとしてダイオキシン類が用いられる。
【００４４】
本発明の検査方法においては、通常、被検者から採取された生体試料を試料とする。生体試料としては、血液試料が望ましい。血液試料とは、全血、あるいは全血から得られた血漿や血清を用いることができる。また本発明における生体試料としては、血液のほか、喀痰、鼻粘膜分泌物、気管支肺胞洗浄液、肺擦か細胞などを用いることもできる。これらの生体試料の採取方法は公知である。
生体試料がＢ細胞等の細胞である場合には、ライセートを調製すれば、前記蛋白質の免疫学的な測定のための試料とすることができる。あるいはこのライセートからｍＲＮＡを抽出すれば、前記遺伝子に対応するｍＲＮＡの測定のための試料とすることができる。生体試料のライセートやｍＲＮＡの抽出には、市販のキットを利用すると便利である。あるいは、血液、鼻粘膜分泌物、並びに気管支肺胞洗浄液のような液状の生体試料においては、必要に応じて緩衝液等で希釈して蛋白質や遺伝子の測定のための試料とすることができる。
【００４５】
細胞における指標遺伝子の発現レベルの測定値は、公知の方法によって補正することができる。補正により、細胞における遺伝子の発現レベルの変化を比較することができる。測定値の補正は、Ｂ細胞に発現し、かつ細胞の状態に関わらず発現レベルが大きく変動しない遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの測定値に基づいて、本発明において指標とすべき遺伝子の発現レベルの測定値を補正することによって行われる。
【００４６】
本発明におけるアレルギー性疾患の検査とは、たとえば以下のような検査が含まれる。アレルギー性疾患の症状を示しながら、一般的な検査ではアレルギー性疾患と判定できない患者であっても、本発明に基づく検査を行えばアレルギー反応に起因する病態であることが容易に判定できる。
たとえば喘息症状を示す患者における指標遺伝子の発現の上昇は、その症状の原因がアレルギー性の気管支喘息である可能性が高いことを示している。気管支喘息には、アレルギー反応が原因となっているものと、そうでないものがある。両者の治療方法はまったく異なるので、いずれの原因によって喘息の症状がもたらされているのかを診断することは、治療上、たいへん重要な工程である。本発明の検査方法は、気管支喘息の原因の特定において、きわめて重要な情報を提供することができる。
【００４７】
あるいは、本発明によってアレルギー性疾患が改善に向かっているのかどうかを判断するための検査が可能となる。本発明の指標遺伝子は、ＩＬ−４、ＣＤ４０リガンド、および抗ＩｇＭ抗体で刺激されたＢ細胞において発現が増加する遺伝子である。アレルギー反応を強力に誘導するサイトカインであるＩＬ−４、ＣＤ−４０リガンド、および抗ＩｇＭ抗体で刺激されたＢ細胞において発現が変動する遺伝子の発現産物であって、血中において測定値が変動する蛋白質は、治療効果の判定に有用である。より具体的には、アレルギー性疾患と診断された患者における指標蛋白質の測定値の上昇は、アレルギー症状が増悪している可能性が高いことを示している。
【００４８】
以上のように、ＩＬ−４あるいはＩＬ−１３で刺激された気管支上皮細胞やＢ細胞において発現が高まる蛋白質をコードする遺伝子には重要な意味がある。そのため、この遺伝子の発現レベルを上昇させることによって得ることができるトランスジェニック動物をアレルギー性疾患のモデル動物として使用し、遺伝子の役割や、遺伝子を標的とする薬剤を評価することには大きな意義がある。
また本発明によるアレルギー性疾患モデル動物は、後に述べるアレルギー性疾患の発作の治療または予防のための医薬品のスクリーニングに加えて、アレルギー性疾患のメカニズムの解明、さらにはスクリーニングされた化合物の安全性の試験に有用である。
たとえば本発明によるアレルギー性疾患モデル動物が気管支喘息を発症したり、何らかのアレルギー性疾患に関連した測定値の変化を示せば、それを回復させる作用を持った化合物を探索するスクリーニングシステムが構築できる。
【００４９】
本発明の指標遺伝子は、ＩＬ−４あるいはＩＬ−１３の刺激によって気管支上皮細胞やＢ細胞において発現が増加することが明らかにされた。したがって、気管支上皮細胞やＢ細胞においてこれら遺伝子、またはこれらの遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルを人為的に増強した動物は、アレルギー性疾患のモデル動物として利用することができる。本発明においてトランスジェニック動物とは、ゲノムＤＮＡにおける１または複数のヌクレオチドの挿入、置換、および／または欠失を伴う、遺伝的に改変された動物（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄａｎｉｍａｌｓ）を言う。このアレルギー性疾患モデル動物は、アレルギーにおける生体内の変化を明らかにするために有用である。更に、本発明のアレルギー性疾患モデル動物は、アレルギー性疾患の治療薬の評価およびスクリーニングに有用である。なおＢ細胞における発現レベルの上昇には、気管支上皮細胞、あるいはＢ細胞を含む他の細胞における指標遺伝子の発現レベルの上昇を伴う場合も含まれる。すなわち、前記指標遺伝子の発現レベルを上昇させるのは気管支上皮細胞、あるいはＢ細胞のみである場合のみならず、Ｂ細胞以外の血液細胞や全身性に前記遺伝子の発現レベルが上昇している場合を含む。
【００５０】
本発明においてＡＨＲ遺伝子と機能的に同等な遺伝子とは、ＡＨＲ遺伝子によってコードされる蛋白質（指標蛋白質）の活性と同等の活性を備えた蛋白質をコードする遺伝子である。このような遺伝子としては、ヒトＡＨＲ遺伝子または他の生物のそのカウンターパートの人為的な改変体などが含まれる。例えば、ある遺伝子を発現ベクターに挿入する場合には、Ｎ末端またはＣ末端の数アミノ酸を欠失させたり、タグペプチドの配列または発現ベクター由来の他のアミノ酸配列を付加することが頻繁に行われる。このような蛋白質は天然の細胞が持つ内在性蛋白質とアミノ酸配列が異なるが、その活性は実質的に内因性蛋白質と同等である。本発明においてこのような蛋白質をコードする遺伝子は、内因性遺伝子と機能的に同等な遺伝子と称する。
【００５１】
本発明における指標蛋白質の活性としては転写活性が挙げられる。例えばヒトＡＨＲ蛋白質の１または複数のアミノ酸を欠失、挿入、および／または置換した蛋白質であって、転写活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を、本発明のトランスジェニックモデル動物の作製のために用いることができる。このような改変体蛋白質は、ヒトＡＨＲ蛋白質のアミノ酸配列に対して、たとえば９０％以上、望ましくは９５％以上、更に望ましくは９９％以上の相同性を有する蛋白質である。また、ＡＨＲ遺伝子の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む遺伝子であって、転写活性を有する蛋白質をコードする遺伝子も、ＡＨＲ遺伝子と機能的に同等な遺伝子として用いることができる。ＡＨＲの転写活性を評価するための方法は既に述べた。
【００５２】
あるいはヒトＡＨＲタンパク質のアミノ酸配列に対して、たとえば９０％以上、望ましくは９５％以上、更に望ましくは９９％以上の相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ＡＨＲ遺伝子と機能的な遺伝子として示すことができる。また、実施例において用いた配列番号：２と配列番号：３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅することができる遺伝子であって、アレルギー性疾患にともなって血中濃度が上昇する蛋白質をコードする遺伝子や、気管支上皮細胞やＢ細胞における発現が増大する遺伝子も、機能的に同等な遺伝子である。
【００５３】
本発明のモデル動物は、例えば（ａ）該モデル動物の表現型を検出する工程、および（ｂ）該モデル動物と比べＢ細胞における該指標遺伝子の発現レベルが低い動物（対照）の対応する表現型に対する違いをアレルギー疾患と関連付ける工程により、アレルギー疾患のモデルとして使用することができる。対照の動物としては、該モデル動物と同じ遺伝背景を持つ非トランスジェニック動物、または空のベクターを導入したトランスジェニック動物などが挙げられる。表現型としては、例えば皮膚炎、鼻炎、または喘息等のアレルギー症状、あるいは免疫系細胞の活性化または遺伝子発現の変化などを含む、所望の表現型が挙げられる。
【００５４】
本発明において、指標遺伝子ＡＨＲのＢ細胞における発現レベルを上昇させることによって得ることができるトランスジェニック動物をアレルギー性疾患モデル動物として使用し、この遺伝子の役割や、この遺伝子を標的とする薬剤を評価することには大きな意義がある。また本発明によるアレルギー性疾患モデル動物は、後に述べるアレルギー性疾患の治療または予防のための医薬品のスクリーニングに有用であると同時に、アレルギー性疾患のメカニズムの解明、さらにはスクリーニングされた化合物の安全性の試験にも有用である。たとえば本発明によるアレルギー性疾患モデル動物がアレルギー性喘息を発症したり、何らかのアレルギー性疾患に関連した測定値の変化を示せば、それを回復させる作用を持った化合物を探索するスクリーニングシステムが構築できる。
【００５５】
本発明において、発現レベルの上昇とは、目的とする遺伝子が外来遺伝子として導入され強制発現している状態、宿主が備える遺伝子の転写および／または蛋白質への翻訳が増強されている状態、並びに翻訳産物である蛋白質の分解が抑制された状態のいずれかを意味する。遺伝子の発現レベルは、たとえば実施例に示すような定量的なＰＣＲにより確認することができる。また翻訳産物である蛋白質の発現量または活性は、正常な状態と比較することにより確認することができる。
【００５６】
代表的なトランスジェニック動物は、目的とする遺伝子を導入し強制発現させた動物である。この他のトランスジェニック動物には、たとえばｍＲＮＡの非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列などからＲＮＡ不安定化の要因となる配列を除去してｍＲＮＡの半減期を伸ばしたりすることができる。また、指標遺伝子のコード領域に変異を導入し、その活性を増強したり、あるいは分解されにくいアミノ酸配列に改変することなどを示すことができる。アミノ酸配列の変異には、置換、欠失、挿入、あるいは付加を示すことができる。その他、遺伝子の転写調節領域を変異させることにより、指標遺伝子の発現そのものを上昇させることもできる。
【００５７】
特定の遺伝子を対象として、トランスジェニック動物を得る方法は公知である。すなわち、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第４８７３１９１号）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に遺伝子を導入する方法などによってトランスジェニック動物を得ることができる。その他、レトロウィルスベクターに遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法、および、***を介して遺伝子を卵に導入する***ベクター法等も開発されている。***ベクター法とは、***に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で***細胞内に取り込ませた後に、この***を卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（Ｍ．Ｌａｖｉｔｒａｎｏｅｔら，Ｃｅｌｌ，５７，７１７，１９８９）。
【００５８】
本発明のアレルギー性疾患モデル動物として用いるトランスジェニック動物は、ヒト以外のあらゆる脊椎動物を利用して作成することができる。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、サル、あるいはウシ等の脊椎動物において様々な遺伝子の導入や発現レベルを改変されたトランスジェニック動物が作り出されている。
【００５９】
更に本発明は、アレルギー性疾患の治療薬候補化合物のスクリーニング方法に関する。本発明における指標遺伝子は、ＩＬ−４、ＣＤ４０リガンド、および抗ＩｇＭ抗体で刺激したＢ細胞において有意に発現レベルが上昇する。したがって、これらの遺伝子の発現レベルを低下させることができる化合物を選択することによって、アレルギー性疾患の治療薬を得ることができる。本発明において遺伝子の発現レベルを低下させる化合物とは、遺伝子の転写、翻訳、タンパク質の活性発現のいずれかのステップに対して阻害的に作用する作用を持つ化合物である。
本発明のアレルギー性疾患の治療候補化合物のスクリーニング方法は、ｉｎｖｉｖｏで行なうこともｉｎｖｉｔｒｏで行うこともできる。このスクリーニングは、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。なお本発明のスクリーニング方法における指標遺伝子とは、先に指標遺伝子として挙げたＡＨＲ遺伝子に加え、それらの遺伝子と機能的に同等ないずれかの遺伝子を含む。
（１）被験動物に、候補化合物を投与する工程、
（２）被験動物の生体試料における前記指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（３）対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【００６０】
本発明のスクリーニング方法における被験動物としては、たとえばヒトの指標遺伝子を強制発現させたトランスジェニック動物からなるアレルギー性疾患モデル動物を利用することができる。発現ベクターに使用するプロモーターとして、適当な薬剤等の物質により転写が調節されるプロモーターを用いれば、該物質の投与によってトランスジェニック動物における外来性の指標遺伝子の発現レベルを調整することができる。
【００６１】
このようにして指標遺伝子を強制発現させたモデル動物に薬剤候補化合物を投与し、モデル動物の生体試料における指標遺伝子の発現に対する化合物の作用をモニターすることにより、指標遺伝子の発現レベルに与える薬剤候補化合物の影響を検出することができる。被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現レベルの変動は、前記本発明の検査方法と同様の手法によってモニターすることができる。更にこの検出の結果に基づいて、指標遺伝子の発現レベルを低下させる薬剤候補化合物を選択すれば、薬剤候補化合物をスクリーニングすることができる。
より具体的には、被験動物から、生体試料を採取し、前記指標遺伝子の発現レベルを対照と比較することにより、本発明によるスクリーニングを実施することができる。血液細胞や血液細胞から単離されたＢ細胞を生体試料として用いることができる。実際には、全血、末梢血単核球、あるいは末梢血リンパ球など試料としてを利用することができる。これらの生体試料の採取方法、および調製方法は公知である。
【００６２】
このようなスクリーニングにより、指標遺伝子の発現に様々な形で関与する薬剤を選択することができる。具体的には、たとえば次のような作用点を持つ薬剤候補化合物を見出すことができる。
指標遺伝子の転写活性を低下させる作用、
指標遺伝子の転写産物からの翻訳を低下させる作用、
指標遺伝子の翻訳産物の活性を阻害する作用、
指標遺伝子の転写産物の安定化を低下もしくは分解を促進する作用等、
【００６３】
また前記スクリーニング方法において、候補化合物の投与前および／または投与後に、被験動物をアレルゲンで刺激する工程を含む方法も本発明に含まれる。候補化合物の投与前にアレルゲンで刺激した場合には、候補化合物の、アレルゲン刺激後の免疫応答を抑制する作用を検出することができる。このようなスクリーニングによって得ることができる化合物には、アレルギー性疾患の治療効果を期待できる。
【００６４】
あるいは候補化合物の投与後にアレルゲンで刺激した場合には、候補化合物の、アレルゲン刺激による免疫応答の開始を抑制する作用を検出することができる。このようなスクリーニングによって得ることができる化合物には、アレルギー性疾患の予防効果を期待できる。本発明のスクリーニング方法に用いることができるアレルゲンとしては、公知のアレルゲン性の物質を用いることができる。具体的には、ダニ、ハウスダスト、植物の花粉、あるいは各種の食品由来のタンパク質等がアレルゲン性物質として公知である。これらのアレルゲンは、天然に由来するものであっても良いし、遺伝子組換えなどの手法によって合成されたものであっても良い。またアレルゲンは、タンパク質の断片であることもできる。精製アレルゲンの調製方法も公知である。
【００６５】
また、ｉｎｖｉｔｒｏでのスクリーニングにおいては、例えば、指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させ、これら遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する方法が挙げられる。このスクリーニングは、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（３）対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【００６６】
本発明において、指標遺伝子を発現する細胞は、指標遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。利用できるベクター、および宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現し得るものであればよい。宿主−ベクター系における宿主細胞としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が例示でき、それぞれ利用できるベクターを適宜選択することができる。
【００６７】
ベクターの宿主への導入方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことができる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（ＨＶＪ（センダイウイルス）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、電気的細胞融合法、微少核融合法（染色体移入））が挙げられる。また、物理的方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ジーンパーティクルガン（ｇｅｎｅｇｕｎ）を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられる。
【００６８】
指標遺伝子を発現する細胞として、ＤＮＤ３９、およびＲａｊｉ（ＡＴＣＣＣＣＬ−８６）などの株化Ｂ細胞は、本発明のスクリーニング方法に好適である。Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣＣＣＬ−８６）は、ＡＴＣＣより購入することができる。
【００６９】
本発明のスクリーニングの方法は、まず前記細胞株に候補化合物を添加する。その後、該細胞株における指標遺伝子の発現レベルを測定し、該遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する。
【００７０】
なお本発明のスクリーニング方法において、指標遺伝子の発現レベルは、これらの遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルのみならず、対応するｍＲＮＡを検出することにより比較することもできる。ｍＲＮＡによって発現レベルの比較を行うには、タンパク質試料の調製工程に代えて、先に述べたようなｍＲＮＡ試料の調製工程を実施する。ｍＲＮＡやタンパク質の検出は、先に述べたような公知の方法によって実施することができる。
【００７１】
さらに本発明の開示に基づいて本発明の指標遺伝子の転写調節領域を取得し、レポーターアッセイ系を構築することができる。レポーターアッセイ系とは、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する転写調節因子をスクリーニングするアッセイ系をいう。
すなわち本発明は、次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が、ＡＨＲ遺伝子またはＡＨＲ遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法に関する。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較してレポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
【００７２】
転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、さらには、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス等を例示することができる。またレポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、成長ホルモン遺伝子等を利用することができる。
転写調節領域は、ゲノムの塩基配列から推測することができる。ＡＨＲ遺伝子は、ヒト７番染色体の７ｐ２１．１の約４７ｋｂにマッピングされている。この領域の塩基配列はＱＶ４０以上（１００００ｂに１ヶ所以下のエラー頻度）の精度で既に解析され、塩基配列が明らかにされている（ＧｅｎｅＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃ＮＴ＿００７８１９）。ＡＨＲ遺伝子は、ＮＴ＿００７８１９の塩基配列上で塩基番号１６６３１７７１から１６６８１２４１に位置している。転写調節領域は一般に転写開始点付近に位置しているので、当該領域を中心として上記転写調節領域に特徴的な塩基配列を検索することによって、目的とする転写調節領域を予測することができる。予測された領域をクローニングし、実際に転写因子によって認識され、転写が開始されることを確認して、転写調節領域を単離することができる。
【００７３】
得られた転写調節領域を、レポーター遺伝子の上流に位置するようにクローニングしてレポーターコンストラクトを構築する。得られたレポーターコンストラクトを培養細胞株に導入してスクリーニング用の形質転換体とする。この形質転換体に候補化合物を接触させ、レポーター遺伝子の発現を制御する化合物のスクリーニングを行うことができる。
【００７４】
また、指標遺伝子の転写調節領域の制御下に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞は、いわゆるノックイン動物の細胞であってもよい。ノックイン動物とは、内在性標的遺伝子の蛋白質コード領域に他の外来遺伝子が挿入された遺伝子改変動物を言う。ノックインされたこの外来遺伝子は、標的遺伝子の転写調節領域の下流に挿入されるため、内在性標的遺伝子と同様の発現制御を受けて発現する。ノックイン遺伝子としてレポーター遺伝子を用い、得られたノックイン動物またはその動物から得た細胞を使ってスクリーニングを行うことができる。ノックイン動物を用いてスクリーニングを行う方法は、（ａ）指標遺伝子部位にレポーター遺伝子がノックインされた動物に候補化合物を投与する工程、（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、および（ｃ）該候補化合物を投与しない対照と比較して該レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程、を含む。
【００７５】
例えば候補化合物を投与した場合および投与しない場合で、該ノックイン動物の白血球好ましくはＢ細胞における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定し、その発現を低下させる化合物を選択する。またノックイン動物からの細胞を用いたスクリーニングは、（ａ）指標遺伝子部位にレポーター遺伝子がノックインされた動物からの細胞に候補化合物を接触させる工程、（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、および（ｃ）該候補化合物を接触させない対照と比較して該レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程、を含む。
【００７６】
例えば候補化合物の存在下または非存在下でノックイン動物から得た白血球好ましくはＢ細胞における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定し、該発現レベルを低下させる化合物を選択する。これらのスクリーニングは本発明の方法に含まれる。特に個体を用いたスクリーニングにおいては、指標遺伝子本来の機能を完全に欠損させないように、片方のアレルは正常のままにして指標遺伝子が発現するようにして、もう片方のアレルにレポーター遺伝子がノックインされているヘテロノックイン接合体を用いてスクリーニングを行うことが好ましい。
【００７７】
ＡＨＲの発現阻害剤として、たとえばドミナントネガティブ（ｄｏｍｉｎａｎｔｎｅｇａｔｉｖｅ）を利用することができる。ドミナントネガティブ効果を有する変異体の例として、次のような変異体を示すことができる。これらの変異体において、用量依存的なドミナントネガティブ効果が報告されている（ＭｏｈａｎＢＫ．ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４２３０２−４２３１０，２００１，ＴｈｅＱ−ｒｉｃｈｓｕｂｄｏｍａｉｎｏｆｔｈｅｈｕｍａｎＡｈｒｅｃｅｐｔｏｒｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｄｉｏｘｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖｉｔｙ）。
ＡｈＲ／Ｌ６７８Ａ変異体、および
ＡｈＲ（１−５９９）変異体（６００−８４８アミノ酸残基の欠失変異体）
【００７８】
ｉｎｖｉｔｒｏでの本発明によるスクリーニング方法として、指標蛋白質の活性に基づくスクリーニング方法を利用することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子がＡＨＲ、またはＡＨＲ遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法に関する。
（１）指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、
（２）前記蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較して前記蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程
ここで指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子としては、上記のように内在性ＡＨＲ遺伝子の人為的な改変体などが含まれる。
【００７９】
このようなスクリーニングは、例えば指標遺伝子を外来的に細胞で発現させ、その細胞内における指標蛋白質の活性を測定することにより実施することができる。これらの活性を指標として、その活性を阻害する活性を有する化合物をスクリーニングすることができる。このようにして得ることができる化合物は、ＡＨＲの働きを抑制する。その結果、Ｂ細胞において発現が誘導された指標蛋白質の阻害を通じて、アレルギー性疾患を制御することができる。
【００８０】
このためには、指標遺伝子を発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な哺乳動物細胞などに導入する。ベクターの宿主への導入方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことができる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（ＨＶＪ（センダイウイルス）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、電気的細胞融合法、微少核融合法（染色体移入））が挙げられる。また、物理的方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ジーンパーティクルガン（ｇｅｎｅｇｕｎ）を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられる。
【００８１】
これらスクリーニングに用いる被検候補化合物としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により合成された化合物標品、コンビナトリアルケミストリーにより合成された化合物標品のほか、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられる。
【００８２】
本発明による各種のスクリーニング方法に必要な、ポリヌクレオチド、抗体、細胞株、あるいはモデル動物は、予め組み合わせてキットとすることができる。より具体的には、たとえば指標遺伝子を発現する細胞と、これらの指標遺伝子の発現レベルを測定するための試薬とで構成される。指標遺伝子の発現レベルを測定するための試薬としては、たとえば少なくとも１つの指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、若しくはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドが用いられる。あるいは、少なくとも１つの指標蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体を試薬として用いることができる。これらのキットには、標識の検出に用いられる基質化合物、細胞の培養のための培地や容器、陽性や陰性の標準試料、更にはキットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
【００８３】
本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。あるいは、本発明における指標遺伝子の発現を抑制することができるアンチセンスＤＮＡも、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。好ましくはこのようなアンチセンスＤＮＡは、本発明における指標遺伝子のセンス鎖の塩基配列の連続する少なくとも２０塩基、より好ましくは２５塩基以上、より好ましくは３０塩基以上、より好ましくは４０塩基以上、より好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上の配列に対して相補的な配列を含むアンチセンスＤＮＡである。アンチセンス領域としては、指標遺伝子の転写産物（プロセッシング前、中間産物、またはプロセッシング後のいずれの転写産物でもよい）の任意の部位のアンチセンスであってもよい。このような部位としては、例えば翻訳開始コドンを含む領域などが挙げられる。
【００８４】
更に、本発明における指標遺伝子によってコードされる蛋白質に結合する抗体は、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。蛋白質の活性を抑制する抗体の調製方法は公知である。前記のドミナントネガティブ効果を確認した報告（ＭｏｈａｎＢＫ．ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４２３０２−４２３１０，２００１）においては、Ｑ−ｒｉｃｈを欠失した変異体（ＡｈＲ１−６３７，ＡｈＲ１−６６３）で、ＸＲＥ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現誘導が抑制されている。したがって、Ｑ−ｒｉｃｈサブドメインの適当な配列をエピトープとする抗体がＡｈＲの転写調節活性を抑制する可能性が考えられる。抗体をヒトに投与する場合には、キメラ抗体やヒト化抗体、あるいはヒト型抗体とすることにより、安全性の高い薬剤とすることができる。
【００８５】
本発明のアレルギー性疾患の治療薬は、前記スクリーニング方法によって選択された化合物、該アンチセンスＤＮＡ、または該抗体を少なくとも１つの主成分として含み、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合することによって製造することができる。本発明のアレルギー性疾患の治療剤は、アレルギー症状の改善を目的として、経口、あるいは非経口的に投与することができる。
経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。
【００８６】
投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人あたり、一回につき０．１ｍｇから５００ｍｇの範囲で、好ましくは０．５ｍｇから２０ｍｇの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
【００８７】
また、投与すべき化合物がタンパク質からなる場合には、それをコードする遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、治療効果を達成することができる。治療効果をもたらすタンパク質をコードする遺伝子を生体に導入し、発現させることによって、疾患を治療する手法は公知である。
あるいはアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーター配列の下流に組み込み、アンチセンスＲＮＡ発現ベクターとして投与することができる。この発現ベクターをアレルギー性疾患患者のＢ細胞へ導入すれば、これらの遺伝子のアンチセンスを発現し、当該遺伝子の発現レベルの低下によってアレルギー性疾患の治療効果を達成することができる。Ｂ細胞への発現ベクターの導入としては、ｉｎｖｉｖｏ、あるいはｅｘｖｉｖｏで行う方法が公知である。
【００８８】
本発明においては、アレルギー性疾患の指標遺伝子としてＡＨＲ遺伝子が選択された。ＡＨＲは、ダイオキシン類に非常に感受性の高いβＨＬＨ−ＰＡＳ型転写因子ファミリーに属する受容体型因子として知られている。ＡＨＲに関してはダイオキシン類に対する応答についての様々な報告があるが、アレルギー性疾患との関連についての報告は無い。以下に、ＡＨＲについて得られている代表的な知見についてまとめた。以下にまとめたように、ＡＨＲとアレルギー性疾患の関連を示唆する報告は無い。
【００８９】
細胞質中で、ＡＨＲはＨｓｐ９０等と複合体を形成し存在している（文献１／Ｃａｒｖｅｒ，ＬＡ＆ＢｒａｄｆｉｅｌｄＣＡ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１１４５２−１１４５６，１９９７；文献２／Ｍｉｍｕｒａ，Ｊ．＆Ｆｕｊｉｉ−Ｋｕｒｉｙａｍａ，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．，９，７１−８１，２００２）。ダイオキシン類の強力な生体毒性から、ＡＨＲの生理機能について興味が持たれている。ＡＨＲは、そのリガンドであるダイオキシン類と結合することによって核内に移行する。リガンドとして作用するダイオキシン類としては、例えば２，３，７，８−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ−ｐ−ｄｉｏｘｉｎ（ＴＣＤＤ）が同定されている。
【００９０】
核内に移行したＡＨＲは、予め核内に存在するＡＲＮＴと出会うとＨｓｐ９０を解離し、ＡＲＮＴとヘテロ二量体を形成する。ＡＨＲ−ＡＲＮＴヘテロ二量体はＤＮＡ結合型転写因子として働き、プロモーター領域にＸＲＥ（ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ）と呼ばれるエンハンサーエレメント（ＴＮＧＣＧＴＧ，Ｎは任意）を認識して結合する。ＡＨＲ−ＡＲＮＴヘテロ二量体がＸＲＥに結合すると、プロモーター領域のクロマチン構造がほどかれ、基本転写因子の結合が促進される結果、転写が活性化される（文献３／ＫＯ，ＨＰ．，Ｏｋｉｎｏ，ＳＴ．，Ｍａ，Ｑ．，Ｗｈｉｔｌｏｃｋ，ＪＰ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，４３０−４３６，１９９６）。
【００９１】
ＡＨＲの転写制御を受けている代表的な遺伝子として、シトクロムＰ４５０１Ａ１，１Ａ２，１Ｂ１等の薬物代謝酵素遺伝子が挙げられる。薬物代謝酵素遺伝子以外にもＴＣＤＤによりＪｕｎ−Ｂ等の細胞周期調節因子、インターロイキン１β、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−α、β２）などの成長因子やアルデヒドデヒドロゲナーゼ３（ＡＤＨ−３）等の発現が誘導される。これらの遺伝子の中にプロモーター領域にＸＲＥが存在し、ＡＨＲ依存的であることが示されているものもあるが、Ｊｕｎ−Ｂのように不明なものもある（文献４／Ｗｉｌｋ，ｒ．，Ｗｅｉｚｍａｎ，Ｉ．，＆Ｓｈｉｌｏ，ＢＺ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，１０，９３−１０２，１９９６；文献５／Ｋｏｌｌｕｒｉ，ＳＫＷｅｉｓｓ，Ｃ．，Ｋｏｆｆ，Ａ．＆Ｇｏｔｔｌｉｃｈｅｒ，Ｍ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，１３，１７４２−１７５３，１９９９）。
【００９２】
ＡＨＲ関連遺伝子群の一つであるＡＨＲＲは、一次構造がＡＨＲとＮ末側で似ているがＣ末側の構造は全く異なる。ＡＨＲＲはＡＨＲのパートナー分子であるＡＲＮＴと核内でヘテロ二量体を形成し、ＸＲＥに結合することができる。このときリガンドは必要ない。ＡＨＲＲ遺伝子はプロモーター領域にＸＲＥを有し、ＡＨＲ／ＡＲＮＴによる転写制御を受けることから、ＡＨＲＲはＡＨＲのネガティブフィードバック制御に働くことが示唆されている（文献６／ＭｉｕｒａＪｅｔ．ａｌ．ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１３，２０−２５，１９９９）。
【００９３】
マウスにおけるＡＨＲ発現の組織分布に関する報告がある（文献７／Ａｂｂｏｔｔ，ＢＤ．，Ｂｉｒｎｂａｕｍ，ＬＳ．＆Ｐｅｒｄｅｗ，ＧＨ．，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２０４，１３３−１４３，１９９５）。ＡＨＲｍＲＮＡは成体マウスでは、肺、肝臓での発現が高いが、その他の組織でも量的には低いものの普遍的に発現している。ＡＲＮＴは、殆どの組織で普遍的に発現している（文献８／Ａｂｂｏｔｔ，ＢＤ．＆Ｐｒｏｂｓｔ，ＭＲ．，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２０４，１４４−１５５，１９９５）。
【００９４】
ＡＨＲは、長らくオーファンレセプターとされており、その機能や生理的リガンドが不明であった。最近のＡＨＲノックアウトマウスの研究では、生殖能力の低下や肝臓での血管形成異常が報告されている（文献９／Ａｂｂｏｔｔ，ＢＤ．ｅｔ．ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１５５，６２−７０，１９９９）。ＡＨＲホモノックアウトマウスは、週齡を重ねると心筋症などの病変や、免疫機能の低下により感染症を起こす（文献１０／Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌｇｕｅｒｏ，ＰＭ．ｅｔ．ａｌ．Ｖｅｔ．Ｐａｔｈｏｌ．，３４，６０５−６１４，１９９７）。これらの知見は、少なくともマウスではＡＨＲが何等かの生理機能維持に関与していることを示している。
機能解析の糸口として内因性リガンドの探索が試みられている。その結果、紫外線やオゾン処理されたトリプトファン産物がＡＨＲのアゴニストして働くことが明らかにされた（文献１０／Ｓｉｎｄｈｕ，ＲＫ．Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ，＆Ｋｉｋｋａｗａ，Ｙ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９２，１００８−１０１４，２０００）。また尿中に***されるインディルビンがＡＨＲと高親和性のリガンドとして機能することが報告されている（文献１１／Ａｄａｃｈｉ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，３１４７５−３１４７８，２００１）。
【００９５】
ダイオキシンの受容体であるＡＨＲの機能研究は、ダイオキシンの毒性研究の一環として研究されてきた経緯がある。ＡＨＲホモノックアウトマウスにおけるＴＣＤＤ毒性が検討されている。ノックアウトマウスでは、ＴＣＤＤによる薬物代謝酵素の発現誘導はみられない。妊娠１２．５日の野生型マウス母体にＴＣＤＤを経口投与すると、ほぼ１００％の胎児に口蓋裂、水腎症という奇形が生じる。しかしＡＨＲ−／−あるいは＋／−の交配で生まれたホモ欠損マウス胎仔は、口蓋裂も水腎症も発症しない（文献１２／Ｍｉｍｕｒａ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，ＧｅｎｅｓＣｅｌｌｓ，２，６４５−６５４，１９９７）。野生型のマウスにＴＣＤＤを投与すると胸腺の萎縮やリンパ球の減少がみられるが、ホモ欠損マウスでは変化がない（文献１３／Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｌｇｕｅｒｏ，ＰＭ．ｅｔ．ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１４０，１７３−１７９，１９９６）。これらのことはＴＣＤＤの毒性にはＡＨＲが必須であることを示している。
【００９６】
リガンドの結合したＡＨＲとＮＦ−κＢが相互作用し、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路を阻害することが報告されている（文献１４／Ｔｉａｎ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，５１０−５１５，１９９９）。この阻害作用によりアポトーシスが誘導されることからＴＣＤＤによる免疫の抑制はＡＨＲによるＮＦ−κＢの阻害が関係している可能性がある。ダイオキシンを曝露したマウスＥＳ細胞とコントロールの遺伝子発現パターンを比較したところ、ヒスタミン放出因子がダイオキシンにより誘導、分泌される報告がある（文献１５／Ｏｉｋａｗａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ．，２９０，９８４−９８７，２００２）。これは、炎症メディエーターとダイオキシンの関連を示す最初の報告であるが、この現象にＡＨＲが関与しているかどうかは明らかでない。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００９７】
【実施例】
［実施例１］ＤＮＡマイクロアレイを使った候補遺伝子の選択
１．正常ヒト気管支上皮細胞の培養とＩＬ−４あるいはＩＬ−１３刺激
Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社より販売している正常ヒト気管支上皮細胞を３ロット購入した（８Ｆ１７５６，８Ｆ１５４８，８Ｆ１８０５）。１バイヤル中に入っている５ｘ１０^５細胞を未刺激、ＩＬ−４刺激、ＩＬ−１３刺激用に３等分し（１．６７ｘ１０^５／７５ｃｍ^２ｆｌａｓｋ）、ＳＡＢＭ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社）にて培地交換しながら約８−１０日間培養した。その際に培地にＢＰＥ（ウシ脳下垂体抽出液）、Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ，ｈＥＧＦ，Ｅｐｉｎｅｐｈｒｉｎｅ，Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，Ｉｎｓｕｌｉｎ，ＲｅｔｉｎｏｉｃＡｃｉｄ，ＢＳＡ−ＦＡＦ，Ｔｒｉｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ，ＧＡ−１０００（Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ／Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ−Ｂ）を添付のプロトコールに従い添加した。
細胞はサイトカイン刺激前に、ＰＢＳで洗浄後、添加因子を除いたＳＡＢＭに交換した。そこにＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ），ＩＬ−１３（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加し（両者ともＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、２４時間培養した。
【００９８】
２．ＧｅｎｅＣｈｉｐ用ＲＮＡの調製
上記のように処理した気道上皮細胞をＩｓｏｇｅｎ（日本ジーン；和光純薬）に溶解し、この溶液から、Ｉｓｏｇｅｎに添付されているプロトコルに従ってＲＮＡを分離した。クロロホルムを加え、攪拌遠心して水層を回収した。次にイソプロパノールを加え、攪拌遠心して沈殿の全ＲＮＡを回収した。
【００９９】
３．ＧｅｎｅＣｈｉｐ用のｃＤＮＡ合成
ｌｏｔ８Ｆ１５４８、および８Ｆ１８０５の細胞より調製した全ＲＮＡ５μｇから、Ｔ７−（ｄＴ）_２４（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ社）をプライマーとして、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓＴｅｃｈｎｉｃａｌＭａｎｕａｌの方法に従いＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて逆転写し１本鎖ｃＤＮＡを作製した。Ｔ７−（ｄＴ）_２４プライマーは、以下のようにＴ７プロモーターの塩基配列にｄ（Ｔ）_２４を付加した塩基配列からなる。
Ｔ７−（ｄＴ）２４プライマー（配列番号：１）
５’−ＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧ−（ｄＴ） _２４−３’
次に、ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓＴｅｃｈｎｉｃａｌＭａｎｕａｌに従い、ＤＮＡＬｉｇａｓｅ，ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ及びＲＮａｓｅＨを加え、２本鎖ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡをフェノール・クロロホルム抽出後、ＰｈａｓｅＬｏｃｋＧｅｌｓに通し、エタノール沈澱し精製した。
さらに、ＢｉｏＡｒｒａｙＨｉｇｈＹｉｅｌｄＲＮＡＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＬａｂｅｌｉｎｇＫｉｔを用い、ビオチンラベルしたｃＲＮＡを合成した。ＲＮｅａｓｙＳｐｉｎｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｃＲＮＡを精製し、熱処理により断片化した。
そのうち１２．５ μｇのｃＲＮＡをＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓＴｅｃｈｎｉｃａｌＭａｎｕａｌに従いＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＣｏｃｋｔａｉｌに加えた。これをアレイに入れ、４５℃ １６時間ハイブリダイゼーションした。
アレイを洗浄した後、ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎを加え染色した。洗浄後、ｎｏｒｍａｌヤギＩｇＧとビオチン化ヤギＩｇＧの抗体混合液をアレイに加えた。さらに、蛍光強度を増強する目的で、再度ＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎを加え染色した。洗浄後、スキャナーにセットし、ＧｅｎｅＣｈｉｐＳｏｆｔｗａｒｅにて解析した。
【０１００】
４．ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析
ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析ソフトであるＳｕｉｔｅを用いてデータ解析を行った。Ａｂｓｏｌｕｔｅａｎａｌｙｓｉｓで、ＡｖｅｒａｇｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙ（１）とＢａｃｋｇｒｏｕｎｄＡｖｅｒａｇｅ（２）を調べ、（１）から（２）を引いた、未刺激、ＩＬ−４刺激、またはＩＬ−１３刺激の３つの平均を補正値（ＳｃａｌｅＦａｃｔｏｒ）としてＣｏｍｐａｒｉｓｏｎＡｎａｌｙｓｉｓを行った。
まず、ＡｂｓｏｌｕｔｅＡｎａｌｙｓｉｓを行い１個のチップデータの解析をした。プローブセットのパーフェクトマッチとミスマッチの蛍光強度を比較して、ｐｏｓｉｔｉｖｅとｎｅｇａｔｉｖｅを決定した。ＰｏｓＦｒａｃｔｉｏｎ，ＬｏｇＡｖｇ，Ｐｏｓ／Ｎｅｇの値から判定されるＡｂｓｏｌｕｔｅＣａｌｌであるＰ（ｐｒｅｓｅｎｔ）、Ａ（ａｂｓｅｎｔ）、およびＭ（ｍａｒｇｉｎａｌ）の３区分の判定をした。
ＰｏｓＦｒａｃｔｉｏｎ；Ｐｏｓｉｔｉｖｅなペアの割合。
ＬｏｇＡｖｇ；パーフェクトマッチとミスマッチのプローブセルの蛍光強度比の対数の平均
Ｐｏｓ／Ｎｅｇ；Ｐｏｓｉｔｉｖｅペア数とＮｅｇａｔｉｖｅペア数の比
また、それぞれの遺伝子において、パーフェクトマッチとミスマッチのプローブセルの蛍光強度の差の平均値であるＡｖｅｒａｇｅＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（ＡｖｇＤｉｆｆ）も計算した。
【０１０１】
次に２つのデータを比較解析（ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎＡｎａｌｙｓｉｓ）した。未刺激とＩＬ−４刺激あるいは未刺激とＩＬ−１３刺激で比較し、発現レベルの差を以下のようにランキングした。Ｉｎｃ／Ｄｅｃ，ＩｎｃＲａｔｉｏ，Ｄｐｏｓ−ＤｎｅｇＲａｔｉｏ，ＬｏｇＡｖｇＲａｔｉｏＣｈａｎｇｅの値から判定されるＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅＣａｌｌであるＩ，Ｄ，ＭＩ，ＭＤ，ＮＣの５区分の判定をした。
Ｉｎｃ：ＩＬ−４刺激あるいはＩＬ−１３刺激と未刺激の対応するプローブペアについてＩＬ−４刺激あるいはＩＬ−１３刺激の方が増加していると判定されたペア数。
Ｄｅｃ：ＩＬ−４刺激あるいはＩＬ−１３刺激の方が減少していると判定されたペア数。
Ｉｎｃ／Ｄｅｃ：Ｉｎｃと判定されたペア数とＤｅｃと判定されたペア数の比。
ＩｎｃＲａｔｉｏ：Ｉｎｃと判定されたペア数／実際に使用されたペア数。
Ｄｐｏｓ／ＤｎｅｇＲａｔｉｏ：ＰｏｓＣｈａｎｇｅからＮｅｇＣｈａｎｇｅを引いた数と実際に使用されたペア数の比
ＰｏｓＣｈａｎｇｅ：ＩＬ−４刺激あるいはＩＬ−１３刺激のＡｂｓｏｌｕｔｅＡｎａｌｙｓｉｓでＰｏｓｉｔｉｖｅなペア数と未刺激のＡｂｓｏｌｕｔｅＡｎａｌｙｓｉｓでＰｏｓｉｔｉｖｅなペア数の差。
ＮｅｇＣｈａｎｇｅ：ＩＬ−４刺激あるいはＩＬ−１３刺激のＡｂｓｏｌｕｔｅＡｎａｌｙｓｉｓでＮｅｇａｔｉｖｅなペア数と未刺激のＡｂｓｏｌｕｔｅＡｎａｌｙｓｉｓでＮｅｇａｔｉｖｅなペア数の差
ＬｏｇＡｖｇＲａｔｉｏＣｈａｎｇｅ：ＩＬ−４刺激あるいはＩＬ−１３刺激と未刺激のＡｂｓｏｌｕｔｅＡｎａｌｙｓｉｓでのＬｏｇＡｖｇの差。
増加：Ｉ（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）、
減少：Ｄ（Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）、
わずかに増加：ＭＩ（ＭａｒｇｉｎａｌｌｙＩｎｃｒｅａｓｅｄ）、
わずかに減少：ＭＤ（ＭａｒｇｉｎａｌｌｙＤｅｃｒｅａｓｅｄ）、および
変化無し：ＮＣ（ｎｏｃｈａｎｇｅ）
【０１０２】
また、未刺激とＩＬ−４刺激あるいは未刺激とＩＬ−１３刺激のＡｂｓｏｌｕｔｅＡｎａｌｙｓｉｓでのＡｖｇＤｉｆｆの比であるＦｏｌｄＣｈａｎｇｅの値でＩＬ−４刺激、またはＩＬ−１３刺激によって発現が増強する遺伝子としてＡＨＲ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ．Ｎｏ．ＮＭ＿００１６２１）を選抜した。プローブＬ１９８７２＿ａｔは遺伝子ＡＨＲ（ＨｕｍａｎＡｒｙｌｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｒｅｃｅｐｔｏｒ）に対応する。ＡＨＲのヒト正常気管支上皮細胞におけるＦｏｌｄＣｈａｎｇｅの値を表１に示した。
【０１０３】
【表１】

【０１０４】
表１からわかるように、ＡＨＲはアレルギー関連サイトカインである、ＩＬ−４およびＩＬ−１３の何れの刺激によっても、発現レベルが増大する、アレルギーに密接に関連した遺伝子である。
【０１０５】
［実施例２］候補遺伝子の発現レベルの確認
実施例１で選択されたＡＨＲ遺伝子の発現量を定量的に確認するために、ヒト末梢血Ｂ細胞、およびヒト正常気管支上皮細胞を用いて更にＡＢＩ７７００による定量的ＰＣＲを行った。ＡＢＩ７７００による測定に用いたプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブは、ＡＨＲ遺伝子の配列情報に基づいてＰｒｉｍｅｒＥｘｐｒｅｓｓ（ＰＥバイオシステムズ）により設計した。ＴａｑＭａｎプローブの５’末端はＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）で、また３’末端はＴＡＭＲＡ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）で標識されている。フォワードプライマー（Ｆ）、リバースプライマー（Ｒ）、およびＴａｑＭａｎプローブ（ＴＰ）に用いたオリゴヌクレオチドの塩基配列は、以下に示すとおりである。
【０１０６】
ＡＨＲ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ＃ＮＭ＿００１６２１）
Ｆ：ＣＡＡＴＡＣＴＴＣＣＡＣＣＴＣＡＧＴＴＧＧＣ（配列番号：２）
Ｒ：ＧＣＡＴＣＡＣＡＡＣＣＡＡＴＡＧＧＴＧＴＧＡ（配列番号：３）
ＴＰ：ＡＧＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＴＡＣＴＴＧＡＡＡＴＣＣＧＧ（配列番号：４）
【０１０７】
末梢血Ｂ細胞は、全血よりＣＤ１９ポジティブセレクションにより単離した。Ｂ細胞の単離方法はＤｙｎａｌＢｉｏｔｅｃｈ社のＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−４５０ＣＤ１９のプロトコールに従った。すなわち、健常ヒトボランティアから採血した全血１００ｍｌに対し、１００μｌの抗ＣＤ１９抗体結合磁気ビーズ（ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−４５０ＣＤ１９，ＤｙｎａｌＢｉｏｔｅｃｈ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を加え、氷冷下で３０分、穏やかに混合しながらインキュベートした。インキュベート後、試料を磁気濃縮装置（ＤｙｎａｌＭＰＣ，ＤｙｎａｌＢｉｏｔｅｃｈ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）に静置し、ビーズ−細胞結合物を管壁に集め上清を除去した。磁気濃縮装置から試験管を外し、冷ＰＢＳを加えビーズ−細胞結合物を再懸濁し、再度磁気濃縮装置に静置し上清を除去した。
【０１０８】
ビーズに結合したＣＤ１９陽性Ｂ細胞を、ビーズから剥離させるため、ＤＥＴＡＣＨａＢＥＡ（ＤｙｎａｌＢｉｏｔｅｃｈ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を使用した。ビーズ−細胞結合物を１００μｌのｗａｓｈｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（終濃度２％のＦＢＳを含むＰＢＳ）に再浮遊させ、１０μｌのＤＥＴＡＣＨａＢＥＡＤ加え、２秒間ボルテキシングで完全に混合した。室温で穏やかに混合しながら１時間放置してビーズを離脱させた。試験管を磁気濃縮装置に静置しビーズを回収し、剥離した細胞を含む上清を回収した。回収した１×１０^６細胞のＢ細胞を１．５ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中でＩＬ−４単独、あるいはＩＬ−４、ＣＤ４０リガンド及び抗ＩｇＭ抗体で刺激し、２４時間培養した。
一方ヒト気管支上皮細胞については、実施例１と同様の処理を与えた細胞を試料とした。
【０１０９】
各細胞サンプルからの前述の方法で抽出した全ＲＮＡをＤＮａｓｅ（ニッポンジーン）処理した。その後、ｒａｎｄａｍｈｅｘａｍｅｒ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）をプライマーとして逆転写したｃＤＮＡを鋳型とした。コピー数を算出する標準曲線のために両プライマーで増幅される塩基配列領域を含むプラスミドクローンを各々の遺伝子について準備し、その段階希釈を鋳型として反応を行った。ＰＣＲ増幅のモニタリングのための反応液の組成は表２に示した。
【０１１０】
【表２】

【０１１１】
また、試料中のｃＤＮＡ濃度の差を補正するため、補正用内部標準としてβ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子、およびグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子について同様の定量解析を行い、それら遺伝子のコピー数を基に補正して、目的遺伝子のコピー数を算出した。
【０１１２】
βアクチン、あるいはＧＡＰＤＨ測定用のプライマーとプローブは、ＴａｑＭａｎ β−ａｃｔｉｎＣｏｎｔｒｏｌＲｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥバイオシステムズ）に添付のものを用いた。塩基配列は以下の通りである。βアクチンにより補正したＡＨＲの発現量（ｃｏｐｙ／ｎｇＲＮＡ）を、図１（末梢血Ｂ細胞）および図２（気管支上皮細胞）に示す。
【０１１３】
またβ−アクチン補正して、未刺激群を１としたときのヒト正常気管支上皮細胞におけるｆｏｌｄｃｈａｎｇｅの値を表３に、そしてヒト末梢血Ｂ細胞におけるｆｏｌｄｃｈａｎｇｅの値を表４に示す。
【０１１４】
【表３】

【０１１５】
【表４】

【０１１６】
βアクチンフォーワードプライマー（配列番号：５）
ＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡ
βアクチンリバースプライマー（配列番号：６）
ＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧ
βアクチンＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：７）
（ＦＡＭ）ＡＴＧＣＣＣ−Ｔ（ＴＡＭＲＡ）−ＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＧＴｐ−３’
ＧＡＰＤＨフォーワードプライマー（配列番号：８）
ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴ
ＧＡＰＤＨリバースプライマー（配列番号：９）
ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ
ＧＡＰＤＨＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：１０）
（ＦＡＭ）ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ（ＴＡＭＲＡ）−３’
ＦＡＭ：６−ｃａｒｂｏｘｙ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ
ＴＡＭＲＡ：６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ
【０１１７】
定量的ＰＣＲの結果、実施例１で選択したＡＨＲ遺伝子のＢ細胞における発現レベルは、抗ＩｇＭ抗体及び抗ＣＤ４０抗体で活性化した細胞に対するＩＬ−４刺激で１０倍近く上昇した。ヒト正常気管支上皮細胞でも若干の上昇が認められたが、Ｂ細胞で観察されたような変化はなかった。これらの結果に基づいて、活性化したＢ細胞ではＩＬ−４の刺激に応答して、ＡＨＲ遺伝子の発現レベルが上昇することが予測された。
アレルギー反応との密接な関連が知られているＩＬ−４やＩＬ−１３の刺激によって、発現レベルが上昇するＡＨＲ遺伝子は、アレルギー反応の進行を制御する重要な遺伝子であると考えられる。
【０１１８】
［実施例３］ＡｈＲ遺伝子発現誘導のＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇによる確認
上述のようにして回収したＢ細胞をＩＬ−４、抗ＣＤ４０抗体あるいは抗ＩｇＭ抗体で刺激し、ＡｈＲ蛋白質の発現をウェスタンブロッティングにより確認した。
１×１０^６細胞のＢ細胞を１．５ｍｌの１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で２４時間培養した。このとき、次の５つの条件で培養する系をそれぞれ設定した。
１）無処理、
２）ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）、
３）ＩＬ−４＋抗ＩｇＭ抗体（１０μｇ／ｍｌ，Ｃａｐｐｅｌ＃５５０５５）、
４）ＩＬ−４＋抗ＣＤ４０抗体（０．５μｇ／ｍｌ，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ＃１３７４）、および
５）ＩＬ−４＋抗ＩｇＭ抗体＋抗ＣＤ４０抗体を添加
【０１１９】
培養後の細胞をＰＢＳで洗浄後、３０μｌのＬｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ、１０μｌの４×ＳＤＳ−ＰＡＧＥｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒに懸濁し、４℃で３０分間インキュベートした。得られた細胞溶解液のうち２５μｌを常法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動後のゲルをメンブレンにトランスファー後、一次抗体として抗ＡｈＲ抗体（ＴＯＹＯＢＯＳＣ−５５７９）あるいは抗ＡＲＮＴ抗体（ＴＯＹＯＢＯＳＣ−５５８０）と反応させた後、二次抗体としてａｎｔｉｒａｂｂｉｔＩｇＨＲＰｌｉｎｋｅｄＦａｂ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＮＡ９３４０）で処理した。メンブレンをＥＣＬｐｌｕｓ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）に１分間イクスポーズした後、ルミノイメージアナライザーＬＡＳ１００（富士写真フィルム）で画像を取得し、ＡｈＲあるいはＡＲＮＴタンパク質の発現を確認した。
【０１２０】
その結果、ＡｈＲの発現はＢ細胞をＩＬ−４単独で処理しても誘導されないが、ＩＬ−４で刺激した際に、抗ＩｇＭ抗体あるいは抗ＣＤ４０抗体が共存させると明らかに発現の誘導が認められた。さらに、ＡｈＲの発現は抗ＩｇＭ抗体、抗ＣＤ４０抗体及びＩＬ−４で刺激した場合、最も強く誘導された。
【０１２１】
【発明の効果】
本発明により、炎症性のサイトカインの刺激によってＢ細胞において発現レベルが増強される遺伝子が見出された。本発明においてアレルギー性疾患との関連性が見出された遺伝子ＡＨＲは、アレルギー関連サイトカインである、ＩＬ４＋ＣＤ４０リガンド＋抗ＩｇＭ抗体の刺激によっても、末梢血Ｂ細胞において、発現レベルが１０倍近く増大する、アレルギーに密接に関連した遺伝子である。このような特徴を有する遺伝子は、アレルギー性疾患の本質的な原因となっている可能性が高い。したがって本発明によって提供された指標遺伝子は、炎症性の症状がアレルギー症状によってもたらされたものかどうかを確実に知ることができる有用な指標となる。アレルギー性の免疫応答によってもたらされた疾患を確実に診断できることにより、的確な治療方法を早期に選択することができる。
【０１２２】
ＩＬ−４あるいはＩＬ−１３は、アレルギー反応を増強する重要な因子である。したがって、これらの因子の刺激に伴って発現が増加する遺伝子は、アレルギー症状の病態形成において重要な役割を果たしていると考えられる。既に述べたように遺伝子発現解析に用いた気管支上皮細胞は、アレルギー性の喘息患者においては、ＩＬ−４やＩＬ−１３の刺激によってアレルギー性の応答を示す細胞である。またＢ細胞は、ＩＬ４のほか、ＣＤ４０リガンドや抗ＩｇＭ抗体による刺激により活性化される。この過程で発現レベルが増強されたＡＨＲ遺伝子は、アレルギー性反応の特徴であるＩｇＥ産生の過程で発現レベルが上昇する遺伝子と言うことができる。本発明者らか明らかにしたこれらの知見は、本発明の指標遺伝子が、アレルギー性疾患に欠かせない存在であることを裏付けている。
このように、本発明の指標遺伝子は、いずれもその発現亢進が炎症性サイトカインによる刺激と結びついていることから、それを抑えることがアレルギー性疾患の治療戦略のターゲットとなるとともに、そのような新しい治療法におけるモニタリングのための新しい臨床診断指標としての有用性が期待できる。
【０１２３】
本発明によって提供された指標遺伝子は、アレルゲンの種類に関わらず、簡便にその発現レベルを知ることができる。したがって、アレルギー反応の病態を総合的に把握することができる。
また本発明によるアレルギーの検査方法は、生体試料を試料としてその発現レベルを解析することができるので、患者に対する侵襲性が低い。しかも遺伝子発現解析に関しては、微量サンプルによる高感度な測定が可能である。遺伝子解析技術は、年々ハイスループット化、低価格化が進行している。したがって本発明によるアレルギーの検査方法は、近い将来、ベッドサイドにおける重要な診断方法となることが期待される。この意味でこれらの病態関連遺伝子の診断的価値は高い。
【０１２４】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ＩＬ−４単独、あるいはＩＬ−４、ＣＤ４０リガンドおよび抗ＩｇＭ抗体で刺激したＢ細胞におけるＡＨＲ遺伝子の発現レベル（ｃｏｐｙ／ｎｇＲＮＡ）を測定した結果を示すグラフ。横軸に培養条件を示した。
【図２】ＩＬ−４およびＩＬ−１３で刺激した気管支上皮細胞におけるＡＨＲ遺伝子の発現レベル（ｃｏｐｙ／ｎｇＲＮＡ）を測定した結果を示すグラフ。左側がロット８Ｆ１５４８、右側が８Ｆ１８０５の測定結果である。各カラムは、左からサイトカイン無添加（ｎｏｎｅ）、ＩＬ−４、およびＩＬ−１３による処理の結果である。
【図３】次の５つの条件で処理したときの、末梢血Ｂ細胞におけるＡＨＲ遺伝子の発現レベルをウエスタンブロッティング法で確認した結果を示す写真。
１）無処理、
２）ＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）、
３）ＩＬ−４＋抗ＩｇＭ抗体（１０μｇ／ｍｌ，Ｃａｐｐｅｌ＃５５０５５）、
４）ＩＬ−４＋抗ＣＤ４０抗体（０．５μｇ／ｍｌ，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ＃１３７４）、および
５）ＩＬ−４＋抗ＩｇＭ抗体＋抗ＣＤ４０抗体を添加[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for testing an allergic disease.
[0002]
[Prior art]
Allergic diseases are considered to be multifactorial diseases. Thus, allergic diseases are caused by the interaction of the expression of many different genes, and the expression of these individual genes is affected by multiple environmental factors. For this reason, it has been very difficult to elucidate the specific genes that cause allergic diseases.
For example, bronchial asthma is positioned as a chronic inflammatory disease in the airways. It has been pointed out that allergic reactions in airway mucosa and bronchial smooth muscle are closely involved in the pathogenesis of bronchial asthma. Therefore, in diagnosing bronchial asthma, it is important to understand these tissues and the state of systemic allergic reactions. In the treatment of bronchial asthma, control of an allergic reaction becomes an issue.
[0003]
On the other hand, allergic diseases are considered to involve the expression of genes having mutations or deficiencies, or overexpression or reduction of the expression level of specific genes. To understand the role of gene expression in disease, it is necessary to understand how genes are involved in the pathogenesis and how external stimuli such as drugs alter gene expression.
[0004]
By the way, many patients with bronchial asthma have an atopic predisposition accompanied by enhanced production of IgE antibodies. Although there are a variety of causes for bronchial asthma, there is no doubt that atopic predisposition causes hypersensitivity in many patients. As a mechanism of airway obstruction due to asthma attack, contraction of bronchial smooth muscle, edema of airway mucosa, and enhancement of airway endocrine secretion are expected. Type I allergic reactions due to exposure to etiological allergens play an important role in such airway changes.
[0005]
Now, in the diagnosis of allergic diseases, interviews, family histories, and confirmation of the patient's history are important factors in general. In order to diagnose allergy based on more objective information, a test method using blood as a sample and a method of observing a patient's immunological response to an allergen have been implemented. Examples of the former include an allergen-specific IgE measurement, a leukocyte histamine release test, and a lymphocyte blastogenesis test. The presence of allergen-specific IgE is evidence of an allergic reaction to the allergen. However, in some patients, it is not always possible to detect allergen-specific IgE. In addition, due to its measurement principle, tests must be performed for all allergens required for diagnosis. The leukocyte histamine release test and lymphocyte blastogenesis test are methods for observing the response of the immune system to allergens in vitro. These methods are complicated in operation.
On the other hand, a method of using an immune response observed when a patient is actually contacted with an allergen to diagnose allergy (the latter) is also known. Such tests include prick tests, scratch tests, patch tests, intradermal reactions, or provocation tests. While these tests can directly diagnose a patient's allergic reaction, they can be said to be highly invasive tests that actually expose the subject to an allergen.
[0006]
In addition, test methods for proving the involvement of allergic reactions regardless of allergens have been attempted. For example, when the serum IgE level is high, it can be estimated that the patient has an allergic reaction. The serum IgE value is information corresponding to the total amount of allergen-specific IgE. Although it is easy to determine the total amount of IgE regardless of the type of allergen, IgE may be low in patients with diseases such as non-atopic bronchitis.
[0007]
Therefore, it would be useful to provide a marker for an allergic disease, which has a low risk to the patient and which can easily obtain information necessary for diagnosis. Since such a marker is considered to be deeply involved in the development of allergic diseases, it may be an important target not only in diagnosis but also in control of allergic symptoms.
[0008]
[Reference 1] Carver, LA & Bradfield CA. J. Biol. Chem. , 272, 11452-11456, 1997.
[Reference 2] Mimura, J .; & Fujii-Kuriyama, Environ. Sci. , 9, 71-81, 2002
[Reference 3] KO, HP. Okino, ST. , Ma, Q.S. , Whitlock, JP. Mol. Cell. Biol. , 16, 430-436, 1996.
[Reference 4] Wilk, r. , Weizman, I .; , & Shilo, BZ. , Genes Dev. , 10, 93-102, 1996
[Reference 5] Kolluri, SK Weiss, C.I. , Koff, A .; & Gottlicer, M.A. , Genes Dev. , 13, 1742-1735, 1999
[Reference 6] Miura J et. al. Genes Dev. 13, 20-25, 1999
[Reference 7] Abbott, BD. , Birnbaum, LS. & Perdew, GH. , Dev. Dyn. , 204, 133-143, 1995
[Reference 8] Abbott, BD. & Probst, MR. , Dev. Dyn. , 204, 144-155, 1995.
[Reference 9] Abbott, BD. et. al. , Toxicol. Appl. Pharmacol. , 155, 62-70, 1999.
[Reference 10] Fernandez-Salguero, PM. et. al. Vet. Pathol. , 34, 605-614, 1997.
[Reference 10] Sindhu, RK. Mitsuhashi, & Kikkawa, Y .; , J. et al. Pharmacol. Exp. Ther. , 292, 1008-1014, 2000
[Reference 11] Adachi, J .; et. al. , J. et al. Biol. Chem. , 276, 31475-31478, 2001.
[Reference 12] Mimura, J .; et. al. , Genes Cells, 2, 645-654, 1997.
[Reference 13] Fernandez-Salguero, PM. et. al. , Toxicol. Appl. Pharmacol. , 140, 173-179, 1996.
[Reference 14] Tian, Y .; et. al. J. Biol. Chem. , 274, 510-515, 1999
[Reference 15] Oikawa, K .; et. al. , Biochem Biophys Res Commun. , 290, 984-987, 2002.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an index that enables a test for an allergic disease. Furthermore, an object of the present invention is to provide a method for testing an allergic disease and a method for screening a candidate compound for a therapeutic drug based on the index.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
Several reports have suggested that IL-4 and IL-13 are deeply involved in allergic reactions. For example, IL-4 (Yssel, Hand and Groux, H: Int. Arch. Allergy Immunol., 121; 10-18, 2000) and STAT6 (Akimoto, T. et al .: J. Exp. Med., 187, 1537-1542, 1998), the airway hyperresponsiveness disappears. In model mice, IL-13 is involved in the formation of asthma-like pathologies irrespective of IgE production or Th2 type (Wills-Karp, M. et al .: Science, 282, 2258-2261, 1998; Grunig, G. et al .: Science, 282,2261-2263, 1998; Zhu, Z. et al .: J. Clin. Invest., 103, 779-788, 1999).
[0011]
Further, IL-4 receptor and IL-13 receptor are highly expressed in human airway epithelial cells and bronchial smooth muscle (Heinzmann, A. et al .: Hum. Mol. Genet., 9: 549-559, 2000). This suggests that these tissues are target cells for IL-4 and IL-13. On the other hand, it has been shown that SNPs present in IL-4 receptor α and IL-13 are one of the genetic factors of allergic diseases (Mitsuyasu, H., et al .: Nature Genet., 19, Mitsuyasu, H., et al .: J. Immunol., 162: 1227-1231, 1999; Kruse, S., et al .: Immunol., 96, 365-371, 1999; Heinzmann, A. et al .: Hum. Mol. Genet., 9: 549-559, 2000). Furthermore, it has been shown that inhibiting the action of IL-4 or IL-13 by soluble IL-4 receptor α is effective as a treatment for bronchial asthma (Borish, LC et al .: Am. J. Respir. Crit. Care Med., 160: 912-922, 1999).
[0012]
As described above, it has been suggested that IL-4 and IL-13 have a deep relationship with allergic reactions, particularly respiratory symptoms. In other words, genes constituting a signal transduction pathway by IL-4 and IL-13 can be said to be genes closely related to allergic reactions. Thus, by isolating these genes and elucidating their relevance to allergic reactions, new targets for the treatment of diseases including allergic, such as bronchial asthma, can be found.
[0013]
Based on such a concept, the present inventors will search for a gene showing a change in the expression level when human bronchial epithelial cells are treated with IL-4 and IL-13. We thought that it would be possible to isolate a gene that would A similar approach has been used to isolate a gene whose expression level is changed by treatment with IL-4 or IL-13 (Wang et al., Immunology 2000, Seattle, May 12-16, 2000). However, in the known search method, since the number of lots of cells used for analysis is small and the range of change in the expression level is not clear, specificity for IL-4 or IL-13 stimulation cannot be expected.
[0014]
In order to isolate a gene that responds more specifically to the stimulation of IL-4 or IL-13, the present inventors have proposed an allyl hydrocarbon receptor as a gene whose expression level fluctuates twice or more. The gene (hereinafter referred to as AHR) was selected. Furthermore, in order to clarify the relationship between the AHR gene and allergic symptoms, changes in the AHR gene in peripheral blood B cells stimulated with IL-4, CD40 ligand, or anti-IgM antibody were observed. An anti-CD40 antibody was used as a CD40 ligand. As a result, it was confirmed that the expression level of the AHR gene was significantly increased also in peripheral blood B cells subjected to these treatments.
[0015]
Before antibodies can be produced from B cells, all B cells express the membrane-type immunoglobulin molecule IgM encoded by the same rearranged V gene as a B cell receptor on the cell surface. Memory B cells that have completed isotype switching can produce new immunoglobulins other than IgM.
It is well known that cross-linking of B-cell surface immunoglobulin molecules activates intracellular signaling pathways. In vitro, when IgM is cross-linked, for example, by the action of an anti-IgM antibody, blk, lck, Activation of tyrosine kinases such as fyn and lyn occurs.
[0016]
Also important in the immune response of B cells is activation by interaction with helper T cells. Antigen-specific naive B cells are not activated by antigen alone. In the case of B cells, an auxiliary signal derived from helper T cells is required. CD40 on the surface of B cells binds to CD40 ligand on the surface of helper T cells, and B cells are activated by cytokines produced by helper T cells. In vitro, activation can be promoted by adding CD40 ligand to B cells. The effect of the CD40 ligand can be similarly observed by causing an anti-CD40 antibody to act. Therefore, genes whose expression levels fluctuate in B cells stimulated with IL-4, CD40 ligand, anti-IgM antibody or the like can be considered to be genes associated with B cell activation.
[0017]
Based on the above findings, the present inventors have found that it is possible to test for allergic diseases by using the AHR gene and the protein encoded by the AHR gene as indices, and have completed the present invention. In addition, the present inventors have found that a therapeutic agent for an allergic disease can be screened by using the expression level of the AHR gene or the activity of the protein encoded by the AHR gene as an index, and completed the present invention.
That is, the present invention relates to the following inspection methods and screening methods.
[1] A method for testing an allergic disease, comprising the following steps, wherein the indicator gene is an allyl hydrocarbon receptor gene.
a) a step of measuring the expression level of an indicator gene in a biological sample of a subject
b) a step of comparing with the expression level of the indicator gene in a biological sample of a living body not having an allergic disease
[2] The test method according to [1], wherein the biological sample is blood.
[3] The test method according to [1], wherein the expression level of the gene is measured by cDNA PCR.
[4] The test method according to [1], wherein the expression level of the gene is measured by detecting a protein encoded by the gene.
[5] A reagent for testing an allergic disease, comprising a polynucleotide containing a base sequence of an allyl hydrocarbon receptor gene or an oligonucleotide having a base sequence complementary to a complementary strand thereof and having a length of at least 15 bases.
[6] A reagent for testing allergic diseases, comprising an antibody that recognizes a peptide containing an amino acid sequence of an allyl hydrocarbon receptor protein.
[7] A method for screening a therapeutic drug for an allergic disease, comprising the following steps, wherein the indicator gene is an allyl hydrocarbon receptor gene or a gene functionally equivalent to the gene.
(1) A step of bringing a candidate compound into contact with cells expressing the indicator gene
(2) measuring the expression level of the indicator gene;
(3) Step of selecting a compound that reduces the expression level of the indicator gene as compared to a control
[8] The method of [7], wherein the cells are established B cells.
[9] A method for screening a therapeutic drug for an allergic disease, comprising the following steps, wherein the indicator gene is an allyl hydrocarbon receptor gene or a gene functionally equivalent to the gene.
(1) administering a candidate compound to a test animal,
(2) measuring the expression level of the indicator gene in the biological sample of the test animal;
(3) Step of selecting a compound that reduces the expression level of the indicator gene as compared to a control
[10] A method for screening a therapeutic agent for an allergic disease, comprising the following steps, wherein the indicator gene is an allyl hydrocarbon receptor gene or a gene functionally equivalent to the gene.
(1) contacting a candidate substance with a cell into which a vector containing a reporter gene expressed under the control of the transcriptional regulatory region of the indicator gene and the transcriptional regulatory region has been introduced;
(2) measuring the activity of the reporter gene;
(3) selecting a compound that reduces the level of reporter gene expression as compared to a control
[11] A method for screening a therapeutic drug for an allergic disease, comprising the following steps, wherein the indicator protein is an allyl hydrocarbon receptor gene or a protein encoded by a gene functionally equivalent to the gene. Method.
(1) contacting the indicator protein with the candidate substance;
(2) measuring the activity of the indicator protein; and
(3) Step of selecting a compound that reduces the activity of the indicator protein as compared to the control
[12] A therapeutic agent for an allergic disease, comprising as an active ingredient a compound obtainable by the screening method according to any one of [7], [9], [10], and [11].
[13] A therapeutic agent for an allergic disease, comprising, as a main component, an antisense DNA containing a sequence complementary to a continuous sequence of at least 15 bases in the base sequence of the sense strand of the indicator gene, wherein the indicator gene is A therapeutic agent which is an allyl hydrocarbon receptor gene or a gene functionally equivalent to the gene.
[14] A therapeutic agent for an allergic disease, comprising an antibody that binds to an allyl hydrocarbon receptor as a main component.
[15] Use as a model animal of an allergic disease of a transgenic non-human vertebrate in which the intensity of expression of an indicator gene in B cells is increased, wherein the indicator gene is an allyl hydrocarbon receptor gene or Uses that are functionally equivalent genes.
[16] a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the indicator gene, or an oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to the complementary strand thereof and having a length of at least 15 nucleotides, and a cell expressing the indicator gene; A kit for screening a therapeutic drug candidate compound, wherein the indicator gene is an allyl hydrocarbon receptor gene or a gene functionally equivalent to the gene.
[17] A kit for screening a candidate drug for a therapeutic drug for an allergic disease, comprising an antibody recognizing a protein encoded by an indicator gene and cells expressing the indicator gene, wherein the indicator gene is an allyl hydrocarbon. A kit which is a receptor gene or a gene functionally equivalent to the gene.
[0018]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the present invention, an allergic disease is a general term for diseases in which an allergic reaction is involved. More specifically, it can be defined as identifying an allergen, demonstrating a deep link between allergen exposure and the development of a lesion, and demonstrating an immunological mechanism for the lesion. Here, the immunological mechanism means that white blood cells show an immune response by allergen stimulation. Examples of the allergen include a mite antigen and a pollen antigen.
Representative allergic diseases can include bronchial asthma, allergic rhinitis, hay fever, or insect allergy. An allergic diathesis is a genetic factor transmitted from a parent having an allergic disease to a child. An allergic disease that develops familially is also called atopic disease, and a genetically transmitted factor that causes it is atopic predisposition. Asthma is a general term given to atopic diseases, particularly those associated with respiratory symptoms.
[0019]
The method for testing an allergic disease of the present invention includes a step of measuring the expression level of an AHR gene in a biological sample of a subject and comparing the measured level with a measured value of a living body that is not an allergic disease. As a result of comparison between the two, when the expression is higher than that of a living body not having an allergic disease, the subject is determined to be a patient with an allergic disease. In the present invention, the living body having no allergic disease includes a healthy person and a living body that is not healthy but has been clearly diagnosed as having no allergic disease.
[0020]
In the present invention, the term "AHR gene" refers to the human AHR gene identified in this example and a gene at the same locus or a homologous locus in another organism. For example, in the present invention, the AHR gene includes any allele at the same or homologous locus as the human AHR gene identified in the present example. In the present invention, the AHR gene specifically includes the human AHR gene identified in the present example, its polymorphism (including SNP), mutant, splicing variant, and homolog of another organism. Since these genes are considered to have substantially the same or similar expression control as the human AHR gene, it is possible to test the allergic disease of the present invention by detecting their expression. It is.
[0021]
Specifically, in the present invention, the AHR gene is substantially the same as an endogenous gene consisting of the following nucleic acids. An endogenous gene refers to a gene originally retained by a natural organism and not modified by human hand, and a gene consisting of the same nucleotide sequence is a gene substantially identical to an endogenous gene. is there. The term "gene" as used herein refers to a transcript or a nucleic acid (such as DNA or RNA) encoding the transcript.
(A) A nucleic acid comprising a base sequence selected from the base sequence of the AHR gene (GenBank Acc. # NM_001621).
(B) a nucleic acid comprising a base sequence in which one or more bases have been substituted, deleted, and / or inserted in the base sequence of the coding sequence of the AHR gene.
(C) a nucleic acid encoding at least 15 consecutive amino acids of the amino acid sequence of the AHR protein.
(D) a nucleic acid encoding a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, and / or inserted in the amino acid sequence of the AHR protein.
(E) a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid containing at least 50 consecutive bases of the AHR gene and containing no sequence other than the base sequence of the AHR gene.
[0022]
The nucleic acid according to (a) preferably has at least 40 continuous nucleotides, more preferably at least 60 nucleotides, more preferably at least 100 nucleotides, more preferably at least continuous nucleotide sequence of the nucleotide sequence described in the AHR gene (more preferably the coding sequence thereof). Includes nucleic acids containing 200 bases or more, more preferably 500 bases or more, more preferably 1000 bases or more, and most preferably the full length. Such nucleic acids may include primarily polymorphisms, variants, and splice variants of the gene within the same species. Further, the nucleic acid described in (a) includes a continuous sequence of at least 30 bases, more preferably 35 bases or more, more preferably 40 bases or more, more preferably 45 bases or more, more preferably 50 bases or more in the base sequence of the AHR gene. And a nucleic acid comprising the nucleotide sequence of The nucleotide sequence is preferably selected from the coding sequence of the AHR gene. Any number of base sequences can be selected. When a plurality of base sequences are selected, a nucleic acid containing a continuous base sequence of 2 or more, preferably 3 or more, more preferably 4 or more, and more preferably 5 or more is more preferable so as not to overlap. .
[0023]
The nucleic acid according to (b) preferably has a total number of bases of 15% or less, more preferably 10% or less, more preferably 8% or less, more preferably 5% or less, more preferably the total number of bases in the coding sequence of the AHR gene. Includes a nucleic acid containing a base sequence in which 1% or less of bases have been substituted, deleted, and / or inserted. Such nucleic acids can include genes for counterparts of closely related other organisms, polymorphisms, variants thereof, splice variants thereof, and the like. Such a nucleic acid preferably has a coding sequence of the AHR gene (GenBank Acc. No. NM_001621) of 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably It is a nucleic acid containing a base sequence having 99% or more identity.
[0024]
The identity of the nucleotide sequence or amino acid sequence can be determined using, for example, the BLAST program (Altschul, SF et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410). Specifically, the blastn program is used to determine the identity of the nucleotide sequence, and the blastp program is used to determine the identity of the amino acid sequence. For example, the BLAST website of NCBI (National Center for Biotechnology Information) has a low complexity. (Altschul, SF et al. (1993) Nature Genet. 3: 266-272; Madden, TL et al.) 1996) Meth. Enzymol. 266: 131-141; Altschul, SF et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 338. . -3402; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) Genome Res 7: 649-656). For example, an alignment of the two sequences can be made and the sequence identity determined by the blast2sequences program (Tatiana A et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250) that compares the two sequences. Gaps are treated in the same way as mismatches and an identity value for the entire coding sequence of the AHR gene is calculated.
[0025]
The nucleic acid according to (c) preferably has at least 20 consecutive amino acids, more preferably at least 30 amino acids, more preferably at least 50 amino acids, more preferably at least 100 amino acids, more preferably at least 300 amino acids in the amino acid sequence of the AHR protein. Above, more preferably more than 500 amino acids, most preferably full length encoding nucleic acids. Such nucleic acids can include, mainly as in (a) above, polymorphisms, variants, and splice variants of genes within the same species. Further, the nucleic acid according to (c) includes a continuous sequence of at least 8 amino acids, more preferably at least 10 amino acids, more preferably at least 15 amino acids, more preferably at least 20 amino acids, more preferably at least 25 amino acids in the base sequence of the AHR protein. More preferably, the nucleic acid contains two or more, preferably three or more, more preferably four or more, and more preferably five or more base sequence portions encoding the amino acid sequence of the above.
[0026]
In the nucleic acid according to (d), the amino acid sequence of the AHR protein is preferably within 15%, more preferably within 10%, more preferably within 8%, more preferably within 5%, more preferably within the total number of amino acids. Includes a nucleic acid encoding a protein containing an amino acid sequence in which 1% or less of amino acids have been substituted, deleted, and / or inserted. The nucleic acid may include untranslated sequences. Such nucleic acids can include genes for counterparts of closely related other organisms, polymorphisms, variants thereof, splice variants thereof, and the like. Such a nucleic acid preferably has an identity of 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 99% or more with the amino acid sequence of the AHR protein. It is a nucleic acid that encodes a protein containing an amino acid sequence. Gaps are treated in the same way as mismatches, and the identity value for the entire amino acid sequence of the AHR protein is calculated. Amino acid sequence identity can be determined as described above.
[0027]
The nucleic acid according to (e) preferably has at least 80 consecutive bases, more preferably at least 100 bases, more preferably at least 120 bases, more preferably at least 200 bases, as described in the AHR gene (more preferably, the coding sequence). And a nucleic acid that does not substantially contain a sequence other than the base sequence described in the AHR gene (more preferably the coding sequence), and a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions. Such a nucleic acid may be, for example, a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a probe prepared using a nucleic acid containing the base sequence of the AHR gene as a template. The probe having a length of 50 bases to several hundred bases can be synthesized, for example, by DNA synthesis, or can be prepared by a random prime method, nick translation, PCR method or the like.
[0028]
The stringent conditions in the nucleic acid described in (e) are preferably at 60 ° C., preferably 62 ° C., more preferably 65 ° C. in a hybridization solution containing about 0.5 to 0.9 M NaCl. Perform hybridization and then wash for 1 hour in 1 × SSC, preferably in 0.5 × SSC, more preferably in 0.2 × SSC, more preferably in 0.1 × SSC at the same temperature as the hybridization Condition. However, the temperature conditions for hybridization and washing that greatly affect the stringency can be adjusted according to the melting temperature (Tm) of the probe. Tm varies depending on the ratio of the constituent bases to the base pairs to be hybridized, the chain length of the probe, and the composition of the hybridization solution (salt concentration and formamide concentration). Therefore, those skilled in the art can empirically set conditions that give equivalent stringency in consideration of these conditions. As the hybridization solution, for example, 4 × SSC, or preferably ExpressHyb (registered trademark) Hybridization Solution (manufactured by Clontech) can be used.
[0029]
In the present invention, the expression level of an indicator gene includes transcription of these genes into mRNA and translation into proteins. Therefore, the method for testing for an allergic disease according to the present invention is performed based on a comparison of the expression intensity of mRNA corresponding to the gene or the expression level of a protein encoded by the gene.
[0030]
For comparison of the expression level, a standard value is usually set based on, for example, the expression level of the indicator gene in a healthy person. Based on this standard value, for example, ± 2S. D. Is regarded as an allowable range. Techniques for setting a standard value and an allowable range based on a measured value of an indicator gene are known. If the expression level of the indicator gene in the subject is higher than the acceptable range, the subject is expected to have an allergic disease. In addition, if it is within the allowable range or less than the allowable range, the possibility of allergic disease is expected to be low.
[0031]
The measurement of the expression level of the indicator gene in the test for an allergic disease according to the present invention can be performed according to a known gene analysis method. Specifically, for example, a hybridization technique using a nucleic acid that hybridizes to the gene as a probe or a gene amplification technique using a DNA that hybridizes to the gene of the present invention as a primer can be used.
[0032]
The probe or primer used for the test of the present invention can be set based on the base sequence of the indicator gene. The nucleotide sequence of the indicator gene (GenBank Acc. No. NM_001621) is known.
In general, higher animal genes are frequently associated with polymorphism. Also, there are many molecules that generate isoforms composed of mutually different amino acid sequences in the process of splicing. Even if the gene has a mutation in the base sequence due to polymorphism or isoform, any gene having the same activity as the indicator gene and involved in allergy is included in the indicator gene of the present invention.
[0033]
As the primer or the probe, a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of the indicator gene or a polynucleotide containing at least 15 nucleotides complementary to a complementary strand thereof can be used. Here, the “complementary strand” refers to one strand of a double-stranded DNA consisting of A: T (U for RNA) and G: C base pairs with respect to the other strand. The term "complementary" is not limited to the case where the sequence is completely complementary in at least 15 contiguous nucleotide regions, but is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90%, and still more preferably 95%. It is only necessary to have the above homology on the base sequence. The homology of the nucleotide sequences can be determined by an algorithm such as BLAST.
[0034]
Such a polynucleotide can be used as a probe for detecting the indicator gene and as a primer for amplifying the indicator gene. When used as a primer, it usually has a chain length of 15 bp to 100 bp, preferably 15 bp to 35 bp. When used as a probe, a DNA having at least a part or all of the sequence of the indicator gene (or its complementary strand) and a chain length of at least 15 bp is used. When used as a primer, the region on the 3 ′ side must be complementary, but a restriction enzyme recognition sequence, a tag, or the like can be added to the 5 ′ side.
[0035]
The “polynucleotide” in the present invention can be DNA or RNA. These polynucleotides may be synthetic or natural. The probe DNA used for hybridization is usually labeled. As the labeling method, for example, the following method can be shown. The term oligonucleotide means a polynucleotide having a relatively low degree of polymerization among polynucleotides. Oligonucleotides are included in polynucleotides.
Labeling by nick translation using DNA polymerase I
・ End labeling using polynucleotide kinase
Fill-in end labeling with Klenow fragment (Berger SL, Kimmel AR. (1987) Guide to Molecular Cloning Technologies, Methods in Enzymology, Academic Press; Pharmaceuticals; Pharmaceuticals; Pharmaceuticals; J, Fritsch EF, Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Labeling by transcription using RNA polymerase (Melton DA, Krieg, PA, Rebagkiati MR, Maniatis T, Zinn K, Green MR. (1984) Nucleic Acid Res., 12, 7035-7056)
A method of incorporating a modified nucleotide without using a radioisotope into DNA (Kricka LJ. (1992) Nonisotopic DNA Probing Technologies. Academic Press)
[0036]
Testing for allergic diseases using hybridization techniques can be performed using, for example, Northern hybridization, dot blotting, a method using a DNA microarray, and the like. Further, a gene amplification technique such as an RT-PCR method can be used. In the RT-PCR method, more quantitative analysis can be performed on the expression of the gene of the present invention by using the PCR amplification monitoring method in the gene amplification process.
[0037]
In the PCR gene amplification monitoring method, a probe whose both ends are labeled with different fluorescent dyes that cancel each other's fluorescence is hybridized to a detection target (reverse transcript of DNA or RNA). When the PCR reaction proceeds and the probe is degraded by the 5'-3 'exonuclease activity of Taq polymerase, the two fluorescent dyes are separated and the fluorescence is detected. This fluorescence is detected in real time. The number of copies of the detection target in the target sample is determined based on the number of linear cycles of PCR amplification by simultaneously measuring a standard sample whose copy number is clearly known as the detection target (Holland, PM et al., Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280; Livak, KJ. Et al., 1995, PCR Methods and Applications 4 (6): 357-362; Heid, CA. , Genome Research 6: 986-994; Gibson, EM U et al., 1996, Genome Research 6: 995-1001). In the PCR amplification monitoring method, for example, ABI PRISM7700 (PE Biosystems) can be used.
[0038]
Further, the method for testing an allergic disease of the present invention can also be performed by detecting a protein encoded by the indicator gene. Hereinafter, in this specification, a protein encoded by the indicator gene is referred to as an indicator protein. As such a test method, for example, a Western blotting method, an immunoprecipitation method, an ELISA method, or the like using an antibody that binds to these indicator proteins can be used.
[0039]
Antibodies that bind to the indicator protein used for this detection can be obtained using techniques well known to those skilled in the art. The antibody used in the present invention can be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody (Milstein C, et al., 1983, Nature 305 (5934): 537-40). For example, a polyclonal antibody against an indicator protein is obtained by extracting blood of a mammal sensitized with an antigen and separating serum from the blood by a known method. Serum containing the polyclonal antibody can be used as the polyclonal antibody. Alternatively, if necessary, a fraction containing a polyclonal antibody can be further isolated from the serum. Polyclonal antibodies to human AHR are commercially available (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Cat. No. Sc-5579 / rabbit polyclonal IgG, Sc-8088 / goat polyclonal IgG).
In addition, to obtain a monoclonal antibody, immune cells are removed from a mammal sensitized with the above antigen, and are fused with myeloma cells or the like. The hybridoma thus obtained is cloned, and the antibody is recovered from the culture to obtain a monoclonal antibody.
[0040]
These antibodies may be appropriately labeled and used for detection of the indicator protein. Further, without labeling the antibody, a substance that specifically binds to the antibody, for example, protein A or protein G can be labeled and detected indirectly. As a specific detection method, for example, an ELISA method can be mentioned.
A protein or a partial peptide thereof used as an antigen can be prepared, for example, by incorporating the gene or a part thereof into an expression vector, introducing this into an appropriate host cell, preparing a transformant, culturing the transformant, and performing recombination. It can be obtained by expressing a protein and purifying the expressed recombinant protein from a culture or a culture supernatant. Alternatively, an oligopeptide consisting of an amino acid sequence encoded by these genes or a partial amino acid sequence of an amino acid sequence encoded by a full-length cDNA can be chemically synthesized and used as an immunogen.
[0041]
Furthermore, in the present invention, not only the expression level of the indicator gene but also the activity of the indicator protein in a biological sample can be used as an indicator to examine allergic diseases. The activity of the indicator protein refers to the biological activity of each protein. The activity of the indicator protein can be detected based on a known method. Methods for measuring AHR activity are known.
[0042]
As mentioned above, AHR has activity as a transcription factor. As a method for measuring the activity of AHR as a transcription factor, for example, the following method can be used. For example, a reporter construct for evaluating the transcriptional activity of AHR can be constructed by introducing an appropriate reporter gene downstream of a promoter sequence having XRE. As the promoter, for example, the promoter region of CYP1A1 can be used. The promoter region of CYP1A1 has already been elucidated (Fujii-Kuriyama Y et. Al. FASEB J., 6, 706-710, 1992, Regulation of CYP1A1 expression. Biol.Chem.271, 12310-12316, 1996, Cooperative interaction beween AhR, Ant and Sp1 for drug-inducible expression of CYP1A1en. As a reporter gene, luciferase, β-gal, GFP or the like is generally used.
[0043]
The reporter construct thus constructed is introduced into a suitable host. By expressing a protein encoding a protein whose activity as a transcription factor is to be evaluated in this host cell and inducing the transcription activity, the activity as a transcription factor can be evaluated based on the expression level of the reporter gene. For induction of transcription activity, a ligand is supplied. Specifically, since AHR functions in a ligand-dependent manner, dioxins are used as exogenous ligands.
[0044]
In the test method of the present invention, a biological sample collected from a subject is usually used as a sample. As the biological sample, a blood sample is desirable. As the blood sample, whole blood or plasma or serum obtained from whole blood can be used. In addition, as a biological sample in the present invention, sputum, nasal mucosa secretion, bronchoalveolar lavage fluid, lung scraping cells, and the like can be used in addition to blood. Methods for collecting these biological samples are known.
When the biological sample is a cell such as a B cell, a lysate can be prepared to be used as a sample for immunological measurement of the protein. Alternatively, if mRNA is extracted from this lysate, it can be used as a sample for measuring mRNA corresponding to the gene. It is convenient to use a commercially available kit for extracting a lysate or mRNA from a biological sample. Alternatively, a liquid biological sample such as blood, nasal mucosal secretion, or bronchoalveolar lavage fluid can be diluted with a buffer or the like as necessary to obtain a sample for protein or gene measurement.
[0045]
The measured value of the expression level of the indicator gene in the cell can be corrected by a known method. With the correction, changes in the expression level of the gene in the cells can be compared. The correction of the measured value is based on the measured value of the expression level of a gene (housekeeping gene) which is expressed in B cells and whose expression level does not fluctuate greatly irrespective of the state of the cell. This is done by correcting the measured expression level.
[0046]
The test for allergic disease in the present invention includes, for example, the following tests. A patient who cannot determine an allergic disease by a general test while showing symptoms of an allergic disease can easily determine that the condition is caused by an allergic reaction by performing the test according to the present invention.
For example, an increase in the expression of an indicator gene in a patient with asthma symptoms indicates that the cause of the symptoms is likely to be allergic bronchial asthma. Some bronchial asthma is caused by an allergic reaction, while others are not. Diagnosing which causes the symptoms of asthma is a very important therapeutic step because the treatment methods are quite different. The test method of the present invention can provide extremely important information in identifying the cause of bronchial asthma.
[0047]
Alternatively, the present invention allows testing to determine whether an allergic disease is improving. The indicator gene of the present invention is a gene whose expression increases in B cells stimulated with IL-4, CD40 ligand, and anti-IgM antibody. An expression product of a gene whose expression fluctuates in B cells stimulated with IL-4, a CD-40 ligand that is a cytokine that strongly induces an allergic reaction, and an anti-IgM antibody, and a measured value fluctuates in blood Proteins are useful in determining therapeutic efficacy. More specifically, an increase in the measured value of the indicator protein in a patient diagnosed with an allergic disease indicates that the allergic symptoms are likely to be exacerbated.
[0048]
As described above, genes encoding proteins whose expression is increased in bronchial epithelial cells and B cells stimulated with IL-4 or IL-13 have important significance. Therefore, it is of great significance to use transgenic animals obtained by increasing the expression level of this gene as model animals for allergic diseases, and to evaluate the role of the gene and drugs that target the gene. is there.
In addition, allergic disease model animals according to the present invention, in addition to screening for drugs for treating or preventing attacks of allergic disease described below, elucidation of the mechanism of allergic disease, furthermore, the safety of the screened compound Useful for testing.
For example, if the allergic disease model animal according to the present invention develops bronchial asthma or shows a change in a measured value related to any allergic disease, a screening system for searching for a compound having an action to restore it can be constructed.
[0049]
It has been clarified that the expression of the indicator gene of the present invention is increased in bronchial epithelial cells and B cells by stimulation of IL-4 or IL-13. Therefore, animals in which the expression levels of these genes or genes functionally equivalent to these genes in bronchial epithelial cells or B cells are artificially enhanced can be used as model animals for allergic diseases. In the present invention, a transgenic animal refers to a genetically modified animal that has one or more nucleotides inserted, substituted, and / or deleted in genomic DNA. This allergic disease model animal is useful for elucidating in vivo changes in allergy. Further, the allergic disease model animal of the present invention is useful for evaluation and screening of a therapeutic agent for an allergic disease. Note that the increase in the expression level in B cells includes the case where the expression level of the indicator gene in bronchial epithelial cells or other cells including B cells is increased. That is, the expression level of the indicator gene is increased not only in bronchial epithelial cells or B cells alone, but also when the expression level of the gene is increased in blood cells other than B cells or systemically. Including.
[0050]
In the present invention, a gene functionally equivalent to the AHR gene is a gene encoding a protein having an activity equivalent to the activity of the protein (indicator protein) encoded by the AHR gene. Such genes include the human AHR gene or artificial modifications of its counterpart in other organisms. For example, when a certain gene is inserted into an expression vector, it is frequently performed to delete several amino acids at the N-terminal or C-terminal, or to add a tag peptide sequence or another amino acid sequence derived from the expression vector. . Such proteins differ in amino acid sequence from the endogenous proteins of natural cells, but have substantially the same activity as the endogenous proteins. In the present invention, a gene encoding such a protein is referred to as a gene functionally equivalent to an endogenous gene.
[0051]
The activity of the indicator protein in the present invention includes a transcription activity. For example, a gene in which one or more amino acids of the human AHR protein have been deleted, inserted, and / or substituted and which encodes a protein having transcription activity is used for producing the transgenic model animal of the present invention. be able to. Such a variant protein is a protein having, for example, 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more homology to the amino acid sequence of human AHR protein. In addition, a gene containing a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with DNA containing the nucleotide sequence of the AHR gene, and that encodes a protein having transcription activity is also a gene functionally equivalent to the AHR gene. Can be used. Methods for assessing the transcriptional activity of AHR have already been described.
[0052]
Alternatively, a gene encoding a protein having a homology of, for example, 90% or more, desirably 95% or more, and more desirably 99% or more with the amino acid sequence of human AHR protein should be shown as a functional gene with the AHR gene. Can be. In addition, the gene is a gene that can be amplified using the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 as a primer, and its blood concentration increases with allergic disease. Genes encoding proteins and genes whose expression in bronchial epithelial cells and B cells are increased are also functionally equivalent genes.
[0053]
The model animal of the present invention comprises, for example, (a) a step of detecting the phenotype of the model animal, and (b) the corresponding expression of an animal (control) having a lower expression level of the indicator gene in B cells as compared to the model animal. The process of associating differences in type with allergic diseases can be used as a model for allergic diseases. Examples of the control animal include a non-transgenic animal having the same genetic background as the model animal, a transgenic animal into which an empty vector has been introduced, and the like. The phenotype includes a desired phenotype including, for example, allergic symptoms such as dermatitis, rhinitis, or asthma, or activation of immune system cells or altered gene expression.
[0054]
In the present invention, a transgenic animal obtained by increasing the expression level of the indicator gene AHR in B cells is used as an allergic disease model animal, and the role of this gene and a drug targeting this gene are evaluated. Doing so has great significance. In addition, the allergic disease model animal according to the present invention is useful for screening a drug for treating or preventing an allergic disease described later, while elucidating the mechanism of the allergic disease, and furthermore, the safety of the screened compound. It is also useful for testing. For example, if the allergic disease model animal according to the present invention develops allergic asthma or shows a change in a measured value related to any allergic disease, a screening system for searching for a compound having an action to restore it can be constructed. .
[0055]
In the present invention, the expression level increase refers to a state in which a target gene is introduced as a foreign gene and is forcibly expressed, a state in which transcription and / or translation of a gene provided in a host is enhanced, and translation. It means any state in which the degradation of the product protein is suppressed. The expression level of the gene can be confirmed, for example, by quantitative PCR as described in Examples. The expression level or activity of the protein as a translation product can be confirmed by comparison with a normal state.
[0056]
A typical transgenic animal is an animal into which a target gene has been introduced and forcedly expressed. In other transgenic animals, for example, the half-life of mRNA can be increased by removing the sequence that causes RNA instability from the sequence of the untranslated region (UTR) of mRNA. It can also be shown that a mutation is introduced into the coding region of the indicator gene to enhance its activity, or to modify the amino acid sequence to an amino acid sequence that is hardly degraded. Mutations in the amino acid sequence can indicate substitutions, deletions, insertions, or additions. In addition, the expression itself of the indicator gene can be increased by mutating the transcriptional regulatory region of the gene.
[0057]
Methods for obtaining a transgenic animal for a specific gene are known. That is, a method in which a gene and an egg are mixed and treated with calcium phosphate, a method in which a gene is directly introduced into a nucleus of a pronuclear stage egg with a micropipette under a phase contrast microscope (microinjection method, US Pat. No. 4,873,191), A transgenic animal can be obtained by, for example, a method of introducing a gene into embryonic stem cells (ES cells). In addition, a method of inserting a gene into a retroviral vector and infecting an egg, a method of introducing a gene into an egg via sperm, and a sperm vector method have also been developed. The sperm vector method is a gene recombination method in which a foreign gene is introduced into sperm cells by attaching a foreign gene to the sperm or by a method such as electroporation and then fertilizing the sperm into an egg to introduce the foreign gene. (M. Lavitranoet et al., Cell, 57, 717, 1989).
[0058]
The transgenic animal used as the allergic disease model animal of the present invention can be prepared using any vertebrate other than human. Specifically, transgenic animals in which various genes have been introduced and expression levels of which have been modified in vertebrates such as mice, rats, rabbits, minipigs, goats, sheep, monkeys, and cattle have been created.
[0059]
Furthermore, the present invention relates to a method for screening a candidate compound for a therapeutic agent for an allergic disease. The expression level of the indicator gene in the present invention is significantly increased in B cells stimulated with IL-4, CD40 ligand, and anti-IgM antibody. Therefore, a therapeutic agent for an allergic disease can be obtained by selecting a compound that can reduce the expression levels of these genes. In the present invention, the compound that reduces the expression level of a gene is a compound that acts to inhibit any of the steps of gene transcription, translation, and protein activity expression.
The method for screening a candidate compound for treating an allergic disease according to the present invention can be performed in vivo or in vitro. This screening can be performed, for example, according to the following steps. In addition, the indicator gene in the screening method of the present invention includes, in addition to the AHR gene mentioned above as the indicator gene, any gene functionally equivalent to those genes.
(1) administering a candidate compound to a test animal;
(2) measuring the expression level of the indicator gene in a biological sample of a test animal;
(3) Step of selecting a compound that reduces the expression level of the indicator gene as compared to a control
[0060]
As a test animal in the screening method of the present invention, for example, an allergic disease model animal composed of a transgenic animal in which a human indicator gene is forcibly expressed can be used. If a promoter whose transcription is regulated by a substance such as an appropriate drug is used as the promoter used in the expression vector, the expression level of the exogenous indicator gene in the transgenic animal can be adjusted by administering the substance.
[0061]
A drug candidate compound is administered to the model animal in which the indicator gene has been forcibly expressed in this way, and by monitoring the effect of the compound on the expression of the indicator gene in a biological sample of the model animal, the drug candidate compound given to the expression level of the indicator gene is monitored. The effect of the compound can be detected. Fluctuations in the expression level of the indicator gene in the biological sample of the test animal can be monitored by the same method as the above-described test method of the present invention. Further, by selecting a drug candidate compound that reduces the expression level of the indicator gene based on the result of this detection, the drug candidate compound can be screened.
More specifically, the screening according to the present invention can be performed by collecting a biological sample from a test animal and comparing the expression level of the indicator gene with a control. Blood cells or B cells isolated from blood cells can be used as a biological sample. In practice, samples such as whole blood, peripheral blood mononuclear cells, or peripheral blood lymphocytes can be used. Methods for collecting and preparing these biological samples are known.
[0062]
By such a screening, it is possible to select drugs that are involved in various ways in the expression of the indicator gene. Specifically, for example, drug candidate compounds having the following action points can be found.
Action to decrease the transcription activity of the indicator gene,
The action of reducing the translation from the transcript of the indicator gene,
The action of inhibiting the activity of the translation product of the indicator gene,
Such as an effect of reducing stabilization or promoting degradation of a transcript of an indicator gene,
[0063]
The screening method also includes a method comprising stimulating a test animal with an allergen before and / or after administration of the candidate compound. When the candidate compound is stimulated with an allergen before administration, the action of the candidate compound to suppress an immune response after the allergen stimulation can be detected. Compounds obtained by such screening can be expected to have therapeutic effects on allergic diseases.
[0064]
Alternatively, when the candidate compound is stimulated with an allergen after administration, the action of the candidate compound to suppress the initiation of an immune response due to the allergen stimulation can be detected. Compounds obtained by such screening can be expected to have a preventive effect on allergic diseases. As an allergen that can be used in the screening method of the present invention, a known allergenic substance can be used. Specifically, ticks, house dust, pollen of plants, proteins derived from various foods, and the like are known as allergenic substances. These allergens may be derived from nature or may be synthesized by a technique such as genetic recombination. The allergen can also be a fragment of a protein. Methods for preparing purified allergens are also known.
[0065]
In addition, in the in vitro screening, for example, a method of bringing a candidate compound into contact with cells expressing the indicator gene and selecting a compound that reduces the expression level of these genes can be mentioned. This screening can be performed, for example, according to the following steps.
(1) A step of bringing a candidate compound into contact with cells expressing the indicator gene
(2) measuring the expression level of the indicator gene;
(3) Step of selecting a compound that reduces the expression level of the indicator gene as compared to a control
[0066]
In the present invention, cells that express the indicator gene can be obtained by inserting the indicator gene into an appropriate expression vector and introducing the vector into an appropriate host cell. Usable vectors and host cells may be any as long as they can express the gene of the present invention. Examples of host cells in the host-vector system include Escherichia coli, yeast, insect cells, animal cells, and the like, and any available vector can be appropriately selected.
[0067]
Examples of a method for introducing a vector into a host include a biological method, a physical method, and a chemical method. Examples of biological methods include a method using a viral vector, a method using a specific receptor, a cell fusion method (HVJ (Sendai virus), polyethylene glycol (PEG), an electric cell fusion method, micronucleus fusion). Method (chromosome transfer)). Examples of the physical method include a microinjection method, an electroporation method, and a method using a gene particle gun. Examples of the chemical method include a calcium phosphate precipitation method, a liposome method, a DEAE dextran method, a protoplast method, an erythrocyte ghost method, an erythrocyte membrane ghost method, and a microcapsule method.
[0068]
As cells that express the indicator gene, established B cells such as DND39 and Raji (ATCC CCL-86) are suitable for the screening method of the present invention. Raji (ATCC CCL-86) can be purchased from ATCC.
[0069]
In the screening method of the present invention, first, a candidate compound is added to the cell line. Thereafter, the expression level of the indicator gene in the cell line is measured, and a compound that reduces the expression level of the gene is selected.
[0070]
In the screening method of the present invention, the expression levels of the indicator genes can be compared not only by the expression levels of the proteins encoded by these genes but also by detecting the corresponding mRNA. In order to compare the expression levels using mRNA, the above-described mRNA sample preparation step is performed instead of the protein sample preparation step. Detection of mRNA and protein can be performed by the known methods as described above.
[0071]
Further, based on the disclosure of the present invention, a transcription regulatory region of the indicator gene of the present invention can be obtained, and a reporter assay system can be constructed. The reporter assay system refers to an assay system that screens for a transcription regulatory factor acting on the transcription regulatory region using the expression level of a reporter gene located downstream of the transcription regulatory region as an index.
That is, the present invention relates to a method for screening a therapeutic agent for an allergic disease, comprising the following steps, wherein the indicator gene is an AHR gene or a gene functionally equivalent to the AHR gene.
(1) contacting a candidate substance with a cell into which a vector containing a reporter gene expressed under the control of the transcriptional regulatory region of the indicator gene and the transcriptional regulatory region has been introduced;
(2) measuring the activity of the reporter gene;
(3) selecting a compound that reduces the level of reporter gene expression as compared to a control
[0072]
Examples of the transcription control region include a promoter, an enhancer, and a CAAT box, a TATA box, and the like usually found in a promoter region. As the reporter gene, CAT (chloramphenicol acetyltransferase) gene, luciferase gene, growth hormone gene and the like can be used.
The transcription regulatory region can be inferred from the nucleotide sequence of the genome. The AHR gene has been mapped to approximately 47 kb of 7p21.1 on human chromosome 7. The base sequence in this region has already been analyzed with an accuracy of QV40 or more (error frequency of one place or less in 10000b), and the base sequence has been clarified (GeneBank accession # NT_007819). The AHR gene is located at nucleotide numbers 16631771 to 16681241 on the nucleotide sequence of NT_007819. Since the transcription control region is generally located near the transcription start point, a target transcription control region can be predicted by searching for a nucleotide sequence characteristic of the transcription control region around the region. By cloning the predicted region and confirming that it is actually recognized by the transcription factor and that transcription is initiated, the transcription regulatory region can be isolated.
[0073]
The obtained transcription regulatory region is cloned so as to be located upstream of the reporter gene to construct a reporter construct. The resulting reporter construct is introduced into a cultured cell line to obtain a transformant for screening. A candidate compound can be brought into contact with the transformant to screen for a compound that controls reporter gene expression.
[0074]
The cell containing the reporter gene linked under the control of the transcriptional regulatory region of the indicator gene may be a so-called knock-in animal cell. A knock-in animal refers to a genetically modified animal in which another foreign gene has been inserted into the protein coding region of the endogenous target gene. Since the knocked-in foreign gene is inserted downstream of the transcription regulatory region of the target gene, it is expressed under the same expression control as that of the endogenous target gene. Using a reporter gene as a knock-in gene, screening can be performed using the obtained knock-in animal or cells obtained from the animal. A method for screening using a knock-in animal includes the steps of (a) administering a candidate compound to an animal in which a reporter gene has been knocked-in to an indicator gene site, (b) measuring the expression level of the reporter gene, and (c) And b) selecting a compound that reduces the level of expression of the reporter gene as compared to a control to which the candidate compound is not administered.
[0075]
For example, the expression level of the reporter gene in leukocytes, preferably B cells, of the knock-in animal is measured with and without the administration of the candidate compound, and a compound that reduces the expression is selected. Screening using cells from a knock-in animal includes: (a) contacting a candidate compound with cells from an animal in which a reporter gene has been knocked-in to an indicator gene site; and (b) measuring the expression level of the reporter gene. And (c) selecting a compound that reduces the level of expression of the reporter gene as compared to a control not contacted with the candidate compound.
[0076]
For example, the expression level of the reporter gene in leukocytes, preferably B cells, obtained from a knock-in animal in the presence or absence of a candidate compound is measured, and a compound that reduces the expression level is selected. These screens are included in the method of the present invention. In particular, in screening using individuals, the reporter gene is knocked-in to the other allele so that the indicator gene is expressed while the other allele remains normal so that the original function of the indicator gene is not completely lost. It is preferable to carry out screening using a heteroknock-in conjugate that has been used.
[0077]
As an AHR expression inhibitor, for example, dominant negative can be used. As examples of mutants having a dominant negative effect, the following mutants can be shown. In these mutants, a dose-dependent dominant negative effect has been reported (Mohan BK. Et. Al. J. Biol. Chem., 276, 42302-42310, 2001, The Q-rich subdomain of the human Ah. (receptor transduction domain is required for dioxin-mediated transcriptional activity).
AhR / L678A mutant, and
AhR (1-599) mutant (deletion mutant of 600-848 amino acid residues)
[0078]
As an in vitro screening method according to the present invention, a screening method based on the activity of an indicator protein can also be used. That is, the present invention relates to a method for screening a therapeutic agent for an allergic disease, comprising the following steps, wherein the indicator gene is AHR or a gene functionally equivalent to the AHR gene.
(1) contacting the protein encoded by the indicator gene with the candidate substance;
(2) measuring the activity of the protein, and
(3) selecting a compound that reduces the activity of the protein compared to a control
Here, the gene functionally equivalent to the indicator gene includes an artificially modified endogenous AHR gene as described above.
[0079]
Such screening can be carried out, for example, by exogenously expressing the indicator gene in a cell and measuring the activity of the indicator protein in the cell. Using these activities as indicators, compounds having an activity of inhibiting the activity can be screened. The compounds obtainable in this way suppress the action of AHR. As a result, allergic diseases can be controlled through inhibition of the indicator protein whose expression is induced in B cells.
[0080]
For this, the indicator gene is inserted into an expression vector, and the vector is introduced into a suitable mammalian cell or the like. Examples of a method for introducing a vector into a host include a biological method, a physical method, and a chemical method. Examples of biological methods include a method using a viral vector, a method using a specific receptor, a cell fusion method (HVJ (Sendai virus), polyethylene glycol (PEG), an electric cell fusion method, micronucleus fusion). Method (chromosome transfer)). Examples of the physical method include a microinjection method, an electroporation method, and a method using a gene particle gun. Examples of the chemical method include a calcium phosphate precipitation method, a liposome method, a DEAE dextran method, a protoplast method, an erythrocyte ghost method, an erythrocyte membrane ghost method, and a microcapsule method.
[0081]
The test candidate compounds used in these screenings include compound preparations synthesized by existing chemical methods such as steroid derivatives, compound preparations synthesized by combinatorial chemistry, extracts of animal and plant tissues, or cultures of microorganisms. And a mixture containing a plurality of compounds, and a sample purified therefrom.
[0082]
Polynucleotides, antibodies, cell lines, or model animals required for various screening methods according to the present invention can be combined in advance to form a kit. More specifically, it is composed of, for example, cells expressing the indicator genes and reagents for measuring the expression levels of these indicator genes. As a reagent for measuring the expression level of the indicator gene, for example, a polynucleotide containing a nucleotide sequence of at least one indicator gene, or an oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to a complementary strand thereof and having a length of at least 15 bases Is used. Alternatively, an antibody that recognizes a peptide containing the amino acid sequence of at least one indicator protein can be used as a reagent. These kits must be packaged with the substrate compound used to detect the label, culture media and containers for culturing cells, positive and negative standard samples, and instructions describing how to use the kit. You can also.
[0083]
The compound selected by the screening method of the present invention is useful as a therapeutic drug for allergic diseases. Alternatively, antisense DNA capable of suppressing the expression of the indicator gene in the present invention is also useful as a therapeutic drug for allergic diseases. Preferably, such an antisense DNA is at least 20 bases, more preferably 25 bases or more, more preferably 30 bases or more, more preferably 40 bases or more, which are continuous in the base sequence of the sense strand of the indicator gene in the present invention. It is preferably an antisense DNA containing a sequence complementary to a sequence of 50 bases or more, more preferably 100 bases or more. The antisense region may be an antisense at any site of a transcript of the indicator gene (which may be any of transcripts before processing, an intermediate product, or after processing). Examples of such a site include a region including a translation initiation codon.
[0084]
Further, the antibody that binds to the protein encoded by the indicator gene in the present invention is useful as a therapeutic drug for allergic diseases. Methods for preparing antibodies that suppress protein activity are known. In the report confirming the dominant negative effect (Mohan BK. Et. Al. J. Biol. Chem., 276, 42302-42310, 2001), mutants (AhR1-637, AhR1) lacking Q-rich are described. -663), the expression induction of the XRE-luciferase reporter gene is suppressed. Therefore, it is conceivable that an antibody having an appropriate sequence of the Q-rich subdomain as an epitope may suppress the transcriptional regulatory activity of AhR. When an antibody is administered to a human, a highly safe drug can be obtained by using a chimeric antibody, a humanized antibody, or a humanized antibody.
[0085]
The therapeutic agent for an allergic disease of the present invention contains a compound selected by the screening method, the antisense DNA, or the antibody as at least one main component, and is a physiologically acceptable carrier, excipient, or It can be produced by mixing with a diluent or the like. The therapeutic agent for an allergic disease of the present invention can be administered orally or parenterally for the purpose of improving allergic symptoms.
As oral preparations, dosage forms such as granules, powders, tablets, capsules, solvents, emulsions, and suspensions can be selected. Injections include subcutaneous injections, intramuscular injections, and intraperitoneal injections.
[0086]
The dose varies depending on the age, sex, weight and condition of the patient, therapeutic effect, administration method, treatment time, or the type of active ingredient contained in the pharmaceutical composition. It can be administered in the range of 0.1 mg to 500 mg, preferably in the range of 0.5 mg to 20 mg. However, since the dose varies depending on various conditions, a dose smaller than the above dose may be sufficient, and a dose exceeding the above range may be required in some cases.
[0087]
When the compound to be administered consists of a protein, a therapeutic effect can be achieved by introducing a gene encoding the protein into a living body using a gene therapy technique. Techniques for treating a disease by introducing a gene encoding a protein having a therapeutic effect into a living body and expressing the gene in a living body are known.
Alternatively, antisense DNA can be incorporated downstream of an appropriate promoter sequence and administered as an antisense RNA expression vector. When this expression vector is introduced into B cells of a patient with an allergic disease, the antisense of these genes is expressed, and a therapeutic effect on allergic diseases can be achieved by reducing the expression level of the genes. Methods for introducing an expression vector into B cells are known in vivo or ex vivo.
[0088]
In the present invention, the AHR gene was selected as an indicator gene for an allergic disease. AHR is known as a receptor-type factor belonging to the βHLH-PAS type transcription factor family which is very sensitive to dioxins. Regarding AHR, there have been various reports on the response to dioxins, but no reports on its association with allergic diseases. The following is a summary of typical findings obtained for AHR. As summarized below, there are no reports suggesting a relationship between AHR and allergic diseases.
[0089]
In the cytoplasm, AHR forms a complex with Hsp90 and the like and exists (Literature 1 / Carver, LA & Bradfield CA. J. Biol. Chem., 272, 11452-11456, 1997; Literature 2 / Mimura, J & Fujii-Kuriyama, Environ. Sci., 9, 71-81, 2002). Due to the strong biotoxicity of dioxins, there is interest in the physiological function of AHR. AHR is translocated into the nucleus by binding to its ligand dioxins. As a dioxin acting as a ligand, for example, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) has been identified.
[0090]
When the AHR that has translocated into the nucleus encounters ARNT that is present in the nucleus in advance, it dissociates Hsp90 and forms a heterodimer with the ARNT. The AHR-ARNT heterodimer functions as a DNA-binding transcription factor, and recognizes and binds to the promoter region of an enhancer element (TNGCGTG, N is arbitrary) called XRE (xenobiotic response element). When the AHR-ARNT heterodimer binds to XRE, the chromatin structure of the promoter region is unraveled, and the binding of basic transcription factors is promoted, resulting in activation of transcription (Reference 3 / KO, HP., Okino, ST., Ma, Q., Whitlock, JP. Mol. Cell. Biol., 16, 430-436, 1996).
[0091]
Representative genes under the transcriptional control of AHR include drug metabolizing enzyme genes such as cytochromes P4501A1, 1A2, and 1B1. In addition to drug metabolizing enzyme genes, expression of cell cycle regulators such as Jun-B, growth factors such as interleukin 1β, transforming growth factor (TGF-α, β2), aldehyde dehydrogenase 3 (ADH-3) and the like by TCDD. Is induced. Some of these genes have an XRE in the promoter region and have been shown to be AHR-dependent, but others are unknown such as Jun-B (Reference 4 / Wilk, r., Weizman, I., & Shilo, BZ., Genes Dev., 10, 93-102, 1996; Reference 5 / Kolluri, SK Weiss, C., Koff, A. & Gottricher, M., Genes Dev. -1753, 1999).
[0092]
AHRR, which is one of the AHR-related genes, has a primary structure similar to that of AHR on the N-terminal side, but has a completely different structure on the C-terminal side. AHRR can form a heterodimer in the nucleus with ARNT, a partner molecule of AHR, and bind to XRE. No ligand is required at this time. Since the AHRR gene has XRE in the promoter region and is under transcriptional control by AHR / ARNT, it is suggested that AHRR acts on the negative feedback control of AHR (Reference 6 / Miura J et. Al. Genes Dev. 13, 20-25, 1999).
[0093]
There is a report on the tissue distribution of AHR expression in mice (Reference 7 / Abbott, BD., Birnbaum, LS & Perdew, GH., Dev. Dyn., 204, 133-143, 1995). AHR mRNA is highly expressed in the lungs and liver in adult mice, but is ubiquitously expressed in other tissues, albeit quantitatively low. ARNT is ubiquitously expressed in most tissues (Reference 8 / Abbott, BD. & Probst, MR., Dev. Dyn., 204, 144-155, 1995).
[0094]
AHR has long been considered an orphan receptor, and its function and physiological ligands have not been clarified. Recent studies on AHR knockout mice have reported reduced fertility and abnormal vascularization in the liver (Abbott, BD. Et. Al., Toxicol. Appl. Pharmacol., 155, 62-70). , 1999). AHR homo-knockout mice develop lesions such as cardiomyopathy and infectious diseases due to a decrease in immune function as they grow older (Reference 10 / Fernandez-Salguero, PM. Et. Al. Vet. Pathol., 34, 605-). 614, 1997). These findings indicate that at least in mice, AHR is involved in maintaining some physiological functions.
The search for endogenous ligands has been attempted as a clue for functional analysis. As a result, it was revealed that tryptophan products treated with ultraviolet rays or ozone acted as AHR agonists (Reference 10 / Sindhu, RK. Mitsuhashi, & Kikkawa, Y., J. Pharmacol. Exp. Ther., 292). , 1008-1014, 2000). It has also been reported that indirubin excreted in urine functions as a ligand having a high affinity for AHR (Reference 11 / Adachi, J. et. Al., J. Biol. Chem., 276, 31475). 31478, 2001).
[0095]
Functional studies of AHR, a dioxin receptor, have been studied as part of dioxin toxicity studies. TCDD toxicity in AHR homo knockout mice has been studied. In knockout mice, TCDD does not induce the expression of drug-metabolizing enzymes. Oral administration of TCDD to the mother of a wild-type mouse at 12.5 days of gestation causes malformation of cleft palate and hydronephrosis in almost 100% of fetuses. However, homodeficient mouse embryos born from AHR − / − or +/− matings do not develop cleft palate or hydronephrosis (12 / Mimura, J. et. Al., Genes Cells, 2, 645-654). , 1997). Administration of TCDD to wild-type mice shows atrophy of the thymus and a decrease in lymphocytes, but no change in homodeficient mice (Reference 13 / Fernandez-Salguero, PM. Et. Al., Toxicol. Appl. Pharmacol. , 140, 173-179, 1996). These facts indicate that AHR is essential for TCDD toxicity.
[0096]
It has been reported that ligand-bound AHR interacts with NF-κB to inhibit the NF-κB signaling pathway (Reference 14 / Tian, Y. et. Al. J. Biol. Chem., 274). 510-515, 1999). Since apoptosis is induced by this inhibitory effect, suppression of immunity by TCDD may be related to inhibition of NF-κB by AHR. Comparison of the gene expression patterns of mouse ES cells exposed to dioxin and the control revealed that histamine releasing factor was induced and secreted by dioxin (Reference 15 / Oikawa, K. et. Al., Biochem Biophys Res Commun. , 290, 984-987, 2002). This is the first report indicating a link between inflammatory mediators and dioxins, but it is not clear whether AHR is involved in this phenomenon.
Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
[0097]
【Example】
[Example 1] Selection of candidate genes using DNA microarray
1. Culture of normal human bronchial epithelial cells and stimulation with IL-4 or IL-13
Three lots of normal human bronchial epithelial cells sold by Clonetics were purchased (8F1756, 8F1548, 8F1805). 5x10 in one vial ⁵ The cells were divided into three equal parts (1.67 × 10 6) for unstimulated, IL-4 stimulated, and IL-13 stimulated. ⁵ / 75 cm ² flash) and a SABM medium (Clonetics) while changing the medium for about 8-10 days. At that time, BPE (bovine pituitary extract), Hydrocortisone, hEGF, Epinephrine, Transferrin, Insulin, Retinoic Acid, BSA-FAF, Triodithroneine, GA-1000 with Triodithroneine and GA-1000 were added to the culture medium. did.
The cells were washed with PBS before cytokine stimulation, and then replaced with SABM from which additional factors had been removed. IL-4 (10 ng / ml) and IL-13 (50 ng / ml) were added thereto (both from Peprotech) and cultured for 24 hours.
[0098]
2. Preparation of RNA for GeneChip
The airway epithelial cells treated as described above were dissolved in Isogen (Nippon Gene; Wako Pure Chemical Industries), and RNA was isolated from this solution according to the protocol attached to Isogen. Chloroform was added, and the mixture was centrifuged with stirring to collect an aqueous layer. Next, isopropanol was added, and the mixture was centrifuged with stirring to collect the total RNA in the precipitate.
[0099]
3. CDNA synthesis for GeneChip
From 5 μg of total RNA prepared from cells of lot 8F1548 and 8F1805, T7- (dT) ₂₄ (Amersham Pharmacia) as a primer and according to the method of Affymetrix's Expression Analysis Technical Manual, Superscript II Reverse Transcriptase was used to transfer cDNA from the reverse transcriptase of a DNA fragment produced by reverse transcriptase from LifeScript. T7- (dT) ₂₄ The primer has d (T) in the base sequence of the T7 promoter as follows. ₂₄ Consists of a base sequence to which is added.
T7- (dT) 24 primer (SEQ ID NO: 1)
5'-GGCCAGGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG- (dT) ₂₄ -3 '
Next, DNA Ligase, DNA polymerase I and RNase H were added according to Expression Analysis Technical Manual to synthesize a double-stranded cDNA. After cDNA was extracted with phenol / chloroform, the cDNA was passed through Phase Lock Gels, precipitated with ethanol, and purified.
Furthermore, using the BioArray High Yield RNA Transcription Labeling Kit, biotin-labeled cRNA was synthesized. The cRNA was purified using RNeasy Spin column (QIAGEN) and fragmented by heat treatment.
12.5 μg of the cRNA was added to the Hybridization Cocktail according to the Expression Analysis Technical Manual. This was put into an array and hybridized at 45 ° C. for 16 hours.
After washing the array, Streptavidin Phycoerythrin was added for staining. After washing, an antibody mixture of normal goat IgG and biotinylated goat IgG was added to the array. Further, for the purpose of enhancing the fluorescence intensity, Streptavidin Phycoerythrin was added again and stained. After washing, it was set on a scanner and analyzed by GeneChip Software.
[0100]
4. GeneChip analysis
Data analysis was performed using Suite, which is GeneChip analysis software. In Absolute analysis, examine Average Intensity (1) and Background Average (2), and subtract the (2) from (1), and calculate the average of three unstimulated, IL-4 stimulated, or IL-13 stimulated correction values ( Comparison Analysis was performed as a Scale Factor).
First, Absolute Analysis was performed to analyze one chip data. The positive and negative fluorescent intensities of the probe set were compared to determine positive and negative. Three classifications of P (present), A (absent), and M (marginal), which are Absolute Calls determined from the values of Pos Fraction, Log Avg, and Pos / Neg, were determined.
Pos Fraction; Positive pair ratio.
Log Avg; average of logarithm of fluorescence intensity ratio of perfect match and mismatch probe cells
Pos / Neg; Ratio of the number of positive pairs to the number of negative pairs
In addition, Average Difference (Avg Diff), which is the average value of the difference between the fluorescence intensities of the perfect match and mismatch probe cells, was calculated for each gene.
[0101]
Next, the two data were compared and analyzed (Comparison Analysis). Comparison was made between unstimulated and IL-4 stimulated or unstimulated and IL-13 stimulated, and differences in expression levels were ranked as follows. Five classifications of I, D, MI, MD, and NC, which are Difference Calls determined from the values of Inc / Dec, Inc Ratio, Dpos-Dneg Ratio, and Log Avg Ratio Change, were performed.
Inc: The number of pairs for which IL-4 stimulation or IL-13 stimulation has been determined to be increasing for the corresponding probe pair that has not been stimulated with IL-4 stimulation or IL-13 stimulation.
Dec: The number of pairs determined to be decreased in IL-4 stimulation or IL-13 stimulation.
Inc / Dec: The ratio of the number of pairs determined to be Inc to the number of pairs determined to be Dec.
Inc Ratio: The number of pairs determined to be Inc / the number of pairs actually used.
Dpos / Dneg Ratio: ratio of Pos Change minus Neg Change to the number of pairs actually used
Pos Change: The difference between the number of positive pairs in Absolute Analysis with IL-4 stimulation or IL-13 stimulation and the number of positive pairs in unstimulated Absolute Analysis.
Neg Change: The difference between the number of negative pairs in Absolute Analysis with IL-4 stimulation or IL-13 stimulation and the number of negative pairs in non-stimulated Absolute Analysis.
Log Avg Ratio Change: Log Avg difference between IL-4 stimulated or IL-13 stimulated and unstimulated Absolute Analysis.
Increase: I (Increased),
Decrease: D (Decreased),
Slight increase: MI (Marginally Increased),
Slightly reduced: MD (Marginally Decreased), and
No change: NC (no change)
[0102]
Further, as a gene whose expression is enhanced by IL-4 stimulation or IL-13 stimulation, the value of Fold Change, which is the ratio of Avg Diff in unstimulated and IL-4 stimulated or in Absolute Analysis between unstimulated and IL-13 stimulated AHR (GenBank Acc. No. NM_001621) was selected. The probe L19872_at corresponds to the gene AHR (Human Arylhydrocarbon receptor). Table 1 shows the Fold Change values of AHR in human normal bronchial epithelial cells.
[0103]
[Table 1]

[0104]
As can be seen from Table 1, AHR is a gene closely related to allergy, whose expression level is increased by stimulation of any of allergy-related cytokines, IL-4 and IL-13.
[0105]
[Example 2] Confirmation of expression level of candidate gene
To quantitatively confirm the expression level of the AHR gene selected in Example 1, quantitative PCR was further performed using ABI 7700 using human peripheral blood B cells and human normal bronchial epithelial cells. The primer and TaqMan probe used for the measurement with ABI 7700 were designed by Primer Express (PE Biosystems) based on the sequence information of the AHR gene. The 5 'end of the TaqMan probe is labeled with FAM (6-carboxy-fluorescein), and the 3' end is labeled with TAMRA (6-carboxy-N, N, N ', N'-tetramethylrhodamine). The nucleotide sequences of the oligonucleotides used for the forward primer (F), the reverse primer (R), and the TaqMan probe (TP) are as shown below.
[0106]
AHR (GenBank Acc # NM_001621)
F: CAATACTTCCCACTCAGTTGGC (SEQ ID NO: 2)
R: GCATCACAACCAATAGGGTGTGA (SEQ ID NO: 3)
TP: AGCACCCATCCATACTTGAATCCCGG (SEQ ID NO: 4)
[0107]
Peripheral blood B cells were isolated from whole blood by CD19 positive selection. B cells were isolated according to the protocol of Dynabeads M-450 CD19 from Dynal Biotech. That is, 100 μl of anti-CD19 antibody-bound magnetic beads (Dynabeads M-450 CD19, Dynal Biotech, Oslo, Norway) was added to 100 ml of whole blood collected from a healthy human volunteer, and gently mixed for 30 minutes under ice cooling. While incubating. After incubation, the samples were placed on a magnetic concentrator (Dynal MPC, Dynal Biotech, Oslo, Norway), the beads-cell conjugate was collected on the tube wall and the supernatant was removed. The test tube was removed from the magnetic concentrator, cold PBS was added to resuspend the bead-cell conjugate, and the suspension was again placed on the magnetic concentrator to remove the supernatant.
[0108]
To detach the CD19-positive B cells bound to the beads from the beads, DETACHaBEA (Dynal Biotech, Oslo, Norway) was used. The bead-cell conjugate was resuspended in 100 μl of washing buffer (PBS containing 2% final concentration of FBS), added with 10 μl of DETACHaBEAD, and mixed thoroughly by vortexing for 2 seconds. The beads were left for 1 hour with gentle mixing at room temperature to release the beads. The test tube was allowed to stand in a magnetic concentrator to collect the beads, and the supernatant containing the detached cells was collected. 1 × 10 collected ⁶ B cells were stimulated with IL-4 alone or IL-4, CD40 ligand and anti-IgM antibody in 1.5 ml of RPMI1640 medium containing 10% FCS, and cultured for 24 hours.
On the other hand, as for human bronchial epithelial cells, cells treated in the same manner as in Example 1 were used as samples.
[0109]
Total RNA extracted from each cell sample by the method described above was treated with DNase (Nippon Gene). Thereafter, reverse transcribed cDNA was used as a template with random hexamer (GIBCO BRL) as a primer. For a standard curve for calculating the copy number, a plasmid clone containing a nucleotide sequence region amplified by both primers was prepared for each gene, and the reaction was performed using the serial dilution as a template. The composition of the reaction solution for monitoring the PCR amplification is shown in Table 2.
[0110]
[Table 2]

[0111]
In addition, in order to correct the difference in cDNA concentration in the sample, the same quantitative analysis was performed for the β-actin (β-actin) gene and the glyceraldehyde triphosphate dehydrogenase (GAPDH) gene as internal standards for correction. Then, the copy number of the target gene was calculated by correcting based on the copy number of those genes.
[0112]
As the primer and probe for β-actin or GAPDH measurement, those attached to TaqMan β-actin Control Reagents (PE Biosystems) were used. The base sequence is as follows. The expression level of AHR (copy / ng RNA) corrected by β-actin is shown in FIG. 1 (peripheral blood B cells) and FIG. 2 (bronchial epithelial cells).
[0113]
Table 3 shows the value of fold change in human normal bronchial epithelial cells when β-actin correction was performed and the unstimulated group was set to 1, and Table 4 shows the value of fold change in human peripheral blood B cells.
[0114]
[Table 3]

[0115]
[Table 4]

[0116]
β actin forward primer (SEQ ID NO: 5)
TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A
β-actin reverse primer (SEQ ID NO: 6)
CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G
β-actin TaqMan probe (SEQ ID NO: 7)
(FAM) ATGCCC-T (TAMRA) -CCCCCATGCCATCCTGCGTp-3 '
GAPDH forward primer (SEQ ID NO: 8)
GAAGGTGAAGGTCGGAGT
GAPDH reverse primer (SEQ ID NO: 9)
GAAGATGGTGGATGGGATTTC
GAPDH TaqMan probe (SEQ ID NO: 10)
(FAM) CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC (TAMRA) -3 '
FAM: 6-carboxy-fluorescein
TAMRA: 6-carboxy-N, N, N ', N'-tetramethylrhodamine
[0117]
As a result of the quantitative PCR, the expression level of the AHR gene selected in Example 1 in B cells was increased nearly 10-fold by IL-4 stimulation on cells activated with anti-IgM antibody and anti-CD40 antibody. A slight increase was also observed in human normal bronchial epithelial cells, but there was no change as observed in B cells. Based on these results, it was predicted that the activated B cells would increase the expression level of the AHR gene in response to IL-4 stimulation.
The AHR gene whose expression level is increased by stimulation of IL-4 or IL-13, which is known to be closely related to allergic reactions, is considered to be an important gene that controls the progress of allergic reactions.
[0118]
[Example 3] Confirmation of AhR gene expression induction by Western blotting
The B cells collected as described above were stimulated with IL-4, anti-CD40 antibody or anti-IgM antibody, and the expression of AhR protein was confirmed by Western blotting.
1 × 10 ⁶ The B cells were cultured in 1.5 ml of RPMI 1640 medium containing 10% FCS for 24 hours. At this time, a system to be cultured under the following five conditions was set.
1) No treatment,
2) IL-4 (10 ng / ml),
3) IL-4 + anti-IgM antibody (10 μg / ml, Cappel # 55055),
4) IL-4 + anti-CD40 antibody (0.5 μg / ml, Immunotech # 1374), and
5) Add IL-4 + anti-IgM antibody + anti-CD40 antibody
[0119]
After the cultured cells were washed with PBS, they were suspended in 30 μl of Lysis buffer and 10 μl of 4 × SDS-PAGE sample buffer and incubated at 4 ° C. for 30 minutes. 25 μl of the obtained cell lysate was subjected to SDS-PAGE according to a conventional method. The gel after electrophoresis was transferred to a membrane, and reacted with an anti-AhR antibody (TOYOBO SC-5579) or an anti-ARNT antibody (TOYOBO SC-5580) as a primary antibody, and then as an anti-rabbit Ig HRP linked Fab (AmershamPharmac) as a secondary antibody. NA 9340). After exposing the membrane to ECLplus (AmershamPharmacia) for 1 minute, an image was obtained with a lumino image analyzer LAS100 (Fuji Photo Film), and the expression of AhR or ARNT protein was confirmed.
[0120]
As a result, AhR expression was not induced by treating B cells with IL-4 alone, but when stimulated with IL-4, expression was clearly induced when anti-IgM antibody or anti-CD40 antibody coexisted. Was done. Furthermore, AhR expression was most strongly induced when stimulated with anti-IgM, anti-CD40 and IL-4.
[0121]
【The invention's effect】
According to the present invention, a gene whose expression level is enhanced in B cells by stimulation of an inflammatory cytokine has been found. In the present invention, the expression level of the gene AHR, which has been found to be associated with an allergic disease, is increased nearly 10-fold in peripheral blood B cells even by stimulation of an allergy-related cytokine, IL4 + CD40 ligand + anti-IgM antibody. , A gene closely related to allergy. Genes having such characteristics are likely to be an essential cause of allergic diseases. Therefore, the indicator gene provided by the present invention is a useful indicator that can reliably determine whether an inflammatory condition is caused by an allergic condition. The ability to reliably diagnose a disease caused by an allergic immune response allows early selection of an appropriate treatment method.
[0122]
IL-4 or IL-13 is an important factor that enhances allergic reactions. Therefore, genes whose expression increases in response to stimulation of these factors are considered to play an important role in the pathogenesis of allergic symptoms. As described above, bronchial epithelial cells used in gene expression analysis are cells that show an allergic response to IL-4 or IL-13 stimulation in allergic asthmatics. B cells are activated by stimulation with CD40 ligand or anti-IgM antibody in addition to IL4. The AHR gene whose expression level has been enhanced in this process can be said to be a gene whose expression level increases in the process of IgE production which is a characteristic of allergic reactions. These findings clarified by the present inventors support that the indicator gene of the present invention is indispensable for allergic diseases.
As described above, all of the indicator genes of the present invention are associated with stimulation of inflammatory cytokines, and thus suppressing their expression is a target of therapeutic strategies for allergic diseases. It is expected to be useful as a new clinical diagnostic index for monitoring in therapy.
[0123]
The expression level of the indicator gene provided by the present invention can be easily determined regardless of the type of allergen. Therefore, the pathology of the allergic reaction can be comprehensively grasped.
In addition, the method of testing for allergy according to the present invention can analyze the expression level of a biological sample as a sample, and therefore has low invasiveness to patients. In addition, regarding gene expression analysis, highly sensitive measurement using a small amount of sample is possible. Gene analysis technology has been increasing in throughput and lowering its price year by year. Therefore, the method of testing for allergy according to the present invention is expected to be an important diagnostic method at the bedside in the near future. In this sense, the diagnostic value of these disease-related genes is high.
[0124]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the results of measuring the expression level (copy / ng RNA) of the AHR gene in B cells stimulated with IL-4 alone or IL-4, CD40 ligand and an anti-IgM antibody. The culture conditions are shown on the horizontal axis.
FIG. 2 is a graph showing the results of measuring the expression level (copy / ng RNA) of the AHR gene in bronchial epithelial cells stimulated with IL-4 and IL-13. The left side shows the measurement result of lot 8F1548, and the right side shows the measurement result of 8F1805. Each column shows the results of treatment with cytokine-free (none), IL-4, and IL-13 from the left.
FIG. 3 is a photograph showing the results of confirming the expression level of AHR gene in peripheral blood B cells by Western blotting when treated under the following five conditions.
1) No treatment,
2) IL-4 (10 ng / ml),
3) IL-4 + anti-IgM antibody (10 μg / ml, Cappel # 55055),
4) IL-4 + anti-CD40 antibody (0.5 μg / ml, Immunotech # 1374), and
5) Add IL-4 + anti-IgM antibody + anti-CD40 antibody

Claims

次の工程を含む、アレルギー性疾患の検査方法であって、指標遺伝子がアリル炭化水素受容体遺伝子である方法。
ａ）被検者の生体試料における、指標遺伝子の発現レベルを測定する工程
ｂ）アレルギー性疾患ではない生体の生体試料における指標遺伝子の発現レベルと比較する工程A method for testing an allergic disease, comprising the following steps, wherein the indicator gene is an allyl hydrocarbon receptor gene.
a) a step of measuring the expression level of an indicator gene in a biological sample of a subject b) a step of comparing the expression level of the indicator gene with a biological sample of a living body not having an allergic disease

生体試料が血液である請求項１に記載の検査方法。The test method according to claim 1, wherein the biological sample is blood.

遺伝子の発現レベルを、ｃＤＮＡのＰＣＲによって測定する請求項１に記載の検査方法。The test method according to claim 1, wherein the expression level of the gene is measured by PCR of cDNA.

遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する請求項１に記載の検査方法。The test method according to claim 1, wherein the expression level of the gene is measured by detecting a protein encoded by the gene.

アリル炭化水素受容体遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アレルギー性疾患の検査用試薬。A reagent for testing an allergic disease, comprising a polynucleotide containing a base sequence of an allyl hydrocarbon receptor gene or an oligonucleotide having a base sequence complementary to a complementary strand thereof and having a length of at least 15 bases.

アリル炭化水素受容体蛋白質のアミノ酸配列を含むペプチドを認識する抗体からなる、アレルギー性疾患の検査用試薬。A reagent for testing allergic diseases, comprising an antibody that recognizes a peptide containing the amino acid sequence of an allyl hydrocarbon receptor protein.

次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が、アリル炭化水素受容体遺伝子、または該遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程
（２）指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、
（３）対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程A method for screening a therapeutic drug for an allergic disease, comprising the following steps, wherein the indicator gene is an allyl hydrocarbon receptor gene or a gene functionally equivalent to the gene.
(1) contacting the candidate compound with a cell that expresses the indicator gene; (2) measuring the expression level of the indicator gene;
(3) Step of selecting a compound that reduces the expression level of the indicator gene as compared to a control

細胞が株化Ｂ細胞である請求項７に記載の方法。The method according to claim 7, wherein the cell is an established B cell.

次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が、アリル炭化水素受容体遺伝子、または該遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）被験動物に候補化合物を投与する工程、
（２）被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および
（３）対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程A method for screening a therapeutic drug for an allergic disease, comprising the following steps, wherein the indicator gene is an allyl hydrocarbon receptor gene or a gene functionally equivalent to the gene.
(1) administering a candidate compound to a test animal,
(2) a step of measuring the expression level of the indicator gene in a biological sample of the test animal; and (3) a step of selecting a compound that reduces the expression level of the indicator gene as compared with a control.

次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が、アリル炭化水素受容体遺伝子、または該遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。
（１）指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、
（２）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較してレポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程A method for screening a therapeutic drug for an allergic disease, comprising the following steps, wherein the indicator gene is an allyl hydrocarbon receptor gene or a gene functionally equivalent to the gene.
(1) contacting a candidate substance with a cell into which a vector containing a reporter gene expressed under the control of the transcriptional regulatory region of the indicator gene and the transcriptional regulatory region has been introduced;
(2) a step of measuring the activity of the reporter gene, and (3) a step of selecting a compound that reduces the expression level of the reporter gene as compared to a control.

次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標蛋白質が、アリル炭化水素受容体遺伝子、または該遺伝子と機能的に同等な遺伝子によってコードされる蛋白質である方法。
（１）指標蛋白質と候補物質を接触させる工程、
（２）指標蛋白質の活性を測定する工程、および
（３）対照と比較して指標蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程A method for screening a therapeutic agent for an allergic disease, comprising the following steps, wherein the indicator protein is a protein encoded by an allyl hydrocarbon receptor gene or a gene functionally equivalent to the gene.
(1) contacting the indicator protein with the candidate substance;
(2) measuring the activity of the indicator protein, and (3) selecting a compound that reduces the activity of the indicator protein as compared to a control

請求項７、請求項９、請求項１０、および請求項１１のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、アレルギー性疾患の治療薬。A remedy for allergic diseases, comprising as an active ingredient a compound obtainable by the screening method according to any one of claims 7, 9, 10, and 11.

指標遺伝子のセンス鎖の塩基配列の連続する少なくとも１５塩基の配列に対して相補的な配列を含むアンチセンスＤＮＡを主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子がアリル炭化水素受容体遺伝子または該遺伝子と機能的に同等な遺伝子である治療薬。A remedy for allergic diseases comprising as a main component an antisense DNA containing a sequence complementary to at least a continuous sequence of at least 15 bases of the base sequence of the sense strand of the indicator gene, wherein the indicator gene is an allyl hydrocarbon A therapeutic agent which is a receptor gene or a gene functionally equivalent to the gene.

アリル炭化水素受容体に結合する抗体を主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬。A therapeutic drug for allergic diseases, comprising as an active ingredient an antibody that binds to an allyl hydrocarbon receptor.

指標遺伝子のＢ細胞における発現強度を上昇させたトランスジェニック非ヒト脊椎動物のアレルギー性疾患のモデル動物としての使用であって、指標遺伝子が、アリル炭化水素受容体遺伝子、または該遺伝子と機能的に同等な遺伝子である使用。A use as a model animal of an allergic disease of a transgenic non-human vertebrate in which the expression intensity of an indicator gene is increased in B cells, wherein the indicator gene is an allyl hydrocarbon receptor gene or Uses that are equivalent genes.

指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも１５塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドと、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子が、アリル炭化水素受容体遺伝子、または該遺伝子と機能的に同等な遺伝子であるキット。A therapeutic drug candidate for an allergic disease, comprising a polynucleotide containing the nucleotide sequence of the indicator gene, or an oligonucleotide having a nucleotide sequence complementary to a complementary strand thereof and having a length of at least 15 nucleotides, and a cell expressing the indicator gene. A kit for screening a compound, wherein the indicator gene is an allyl hydrocarbon receptor gene or a gene functionally equivalent to the gene.

指標遺伝子によってコードされる蛋白質を認識する抗体と、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子が、アリル炭化水素受容体遺伝子、または該遺伝子と機能的に同等な遺伝子であるキット。An antibody, which recognizes a protein encoded by an indicator gene, and a kit for screening a candidate drug for a therapeutic agent for an allergic disease, comprising a cell expressing the indicator gene, wherein the indicator gene is an allyl hydrocarbon receptor gene Or a gene that is a gene functionally equivalent to the gene.