JP2004248675A - 変性ヌクレオチド三燐酸基質を利用できる組み換えタンパクキナーゼ - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 タンパク質キナーゼにおいて、ヌクレオチド三リン酸基質との結合に関与する部位に存在するアミノ酸を他のアミノ酸によって置換する。
【選択図】 なし
Description
米国政府は、この発明のライセンス契約費用を支払っており、NSFグラントNo.MCB9506929およびDHHS NCIグラントNo.RO1 CA70331-01の協定に規定されているように、本特許権者が他の者とライセンス契約を結ぶことを請求する権利を持つ。
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より詳細には、本発明はしばしば酵素工学とも呼ばれる分野に関連し、そこでは遺伝子改変またはその他の手段を利用して、対象とする酵素のアミノ酸配列を変更し、結果としてその触媒性能を変更または改良する。
以下に記載される本発明の態様は、遺伝子操作および酵素学の分野における方法論を包含し、またより具体的にはタンパクキナーゼおよび他の多重基質性酵素(このような酵素の阻害性物質を含む)の設計並びに関連物質、技術および利用を包含する。
多細胞生物における細胞間の連絡は、迅速でなければならず、かつ該連絡は多様かつ複雑な様式で、細胞同士の相互の応答を可能とするものである必要がある、ことのみが論理にかなったものである。典型的には、利用される細胞内シグナルは、「リガンド」と呼ばれる分子であり、与えられたリガンドは、このシグナルを受け取ることになる該細胞表面上の、特定の型のレセプタと結合することができる。しかしながら、この簡単なリガンド結合のみでは、該受容細胞が行う必要のある、該複雑な応答のためには不十分である。従って、細胞は、このシグナルを増幅し、かつ該細胞内での触媒活性の迅速な調節に導く、複雑な、時としてカスケード的な機構を介して、複雑性を付与し、結果として複雑な、時として劇的な細胞内応答をもたらすことができる。概して、初期のリガンド結合から、該細胞内応答の完了に至るこの過程は、「シグナル伝達」と呼ばれる。
本発明は、単一のタンパクキナーゼを特異的に阻害することができ、しかも他のタンパクキナーゼを同時に阻害することのない、物質並びに方法を提供することによって、上記問題点に対する解決策を提供する。
本発明は、更にこのように化学的に修飾されたヌクレオチド三燐酸基質、これらの製法、およびこれらの利用法をも提供する。本発明の方法は、該組み換え操作されたキナーゼと共に、該変成された基質を使用して、どのタンパク基質が該キナーゼに作用するかを同定し、このような作用の程度を測定し、かつテスト化合物が、このような作用を調節するか否かを、決定する方法を含む。
更に、該方法では、また該組み換え操作された酵素を、細胞または完全な動物中に、好ましくは対応する野生型酵素の代わりに挿入し、次いで該酵素に適合する該阻害剤を、該酵素と疾患との関連性を研究するための手段として使用し、かつ最終的に該疾患の治療用の薬物として使用する。
図9:
本図は、以下においてSrcタンパタキナーゼの基質を発見するために、本発明で使用する、キナーゼ基質を同定するための実験を模式的に示す図である。本図の上部における卵型は、矢印に隣接するタンパクキナーゼによってホスホリル化される、タンパクキナーゼ基質を表す。線で結ばれた数個の卵型を含む該タンパクキナーゼは、タンパクキナーゼ(Src,Fyn,Lck)の「Src−群」の構成員である。一つのキナーゼ(Src)は、切り取られたノッチを含み、これはこのキナーゼのアデニン結合ポケットに余分の空間を生成する、I338G変異を表す。このキナーゼ上の記号は、そのオルソゴナル阻害剤を表し、該阻害剤は、突起を含み、該突起はその固有の阻害によって生ずる、該Src I338Gキナーゼにおける該変異を補充する。一個の大きな丸い卵型と二つの突出する針状の部分をもつこのキナーゼは、F-アクチン依存性タンパクキナーゼ(FAK)である。ただ一つの卵型をもつタンパクキナーゼは、セリンまたはスレオニン特異的タンパクキナーゼ群の構成員である。小さなPを含む、矢印の下方の卵型は、該タンパクキナーゼによる作用後の、ホスホリル化された(P)基質を表す。本図の下部のシミュレートされたゲルは、野生型のSrcの代わりに、全ての野生型キナーゼまたは一つの変異キナーゼ(Src−I338G)の何れかを発現する細胞を、該オルソゴナル阻害剤で処理した場合に、予想される結果を表す。該阻害剤は、該細胞中に存在するリンタンパクに何等の作用も及ぼさないはずであり、該細胞は該変異Srcキナーゼを発現せず(ゲルの左側の同等なパターン)、また幾つかのリンタンパクは、該阻害剤による、該変異体発現細胞の処理後には、存在しないはずである(右側のゲル)。
図11Aおよび図11Bは、種々の嵩高い置換基を持つ構造を示す図であり、該置換基は、PP3のN−4またはアデノシン二燐酸のN6、もしくはアデノシン一燐酸のN6、またはアデノシン(特に、N6シクロペンチルオキシアデノシン)に付加して、本発明の組み換えられたキナーゼである、該変異キナーゼv−Src(T120G)の阻害剤を生成する場合に使用される。これら阻害剤の合成並びに阻害定数は、以下の実施例12で議論する。
キナーゼを再度組み換えして、野生型のチロシンおよびセリン/スレオニンキナーゼの存在下で、その真正の基質をユニークに標識する上で満たすべき、いくつかの基準がある。該組み換えキナーゼは、(1)野生型タンパクキナーゼによってはさほど容易に利用されない、ATP類似体(A*TP)を受け取り、好ましくは野生型キナーゼによっては実質的に利用されないA*TPを受け取り、最も好ましくは野生型キナーゼによっては全く利用されないA*TPを受け取り、(2)好ましくは、高い触媒効率をもつA*TP類似体を利用し、かつ(3)好ましくは、天然のヌクレオチド基質(ATP)に対して低い触媒活性をもち、結果として細胞レベルのATP(1−2mM)の存在下で、該突然変異キナーゼは、該燐酸基ドナーとして、優先的にA*TPを利用する。このような組み換えキナーゼを、該野生型キナーゼのタンパク基質特異性の研究で使用する場合には、これらの基準は、該キナーゼのタンパクターゲット特異性を実質的に変えること無しに満たす必要がある。
これらは、「エラープローン(error prone)」ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、「セクシュアル(sexual)」PCR,または該タンパク配列における固定位置にランダムなヌクレオチドをもつプライマーを使用するPCR法を含む。他の配列ランダム化法は、cDNAまたはプラスミドDNAまたはバクテリアのMutD型の菌株の化学的な変異形成体を使用する方法を含み、これらは発現するタンパク中に、ランダムに変異を誘発することが知られている。ランダムに変異形成されたタンパクキナーゼまたは他の多重基質型の酵素を製造するために、このような方法を利用し、次いで特定の高い活性をもつ、特定のオルソゴナル基質をもつ、あるいは上記の章において記載したように、組み合わせ合成法を利用して製造した、該推定的なオルソゴナル基質の幾分かまたはその全部を持つものについて、スクリーニングすることによって、本発明を実施することができる。以下の実施例に記載するアッセイ法は、この目的にとって適しており、また当業者は容易に別の方法を工夫することができよう。
本発明の極めて簡単な態様を、以下に示す。まず、該オルソゴナル阻害剤を、該組み換えキナーゼに対して付加された遺伝子を発現するか、あるいは対象とする該キナーゼの正常な複製体を発現する、対象とする2種のサンプルに添加する。この阻害剤は、シグナルカスケード(例えば、透過性にされた細胞、細胞抽出物、または自然な状態でこれらに対して透過性である細胞)の活性化の前、後またはその間に、添加することができる。次に、細胞または細胞画分中のホスホリル化されたタンパク全ての検出を、放射性燐[γ−32P]ATPを使用することによって、またはホスホリル化されたアミノ酸に対して特異的なモノクローナル抗体を使用することによって可能とする方法を、対象とする該キナーゼの特異的阻害の結果を明らかにするために使用する。対象とする該キナーゼの正常な複製物を発現する細胞において、元のキナーゼの該タンパク基質が、該阻害剤の存在下においてさえ標識され、一方で該組み換えキナーゼの該タンパク基質は、少なくとも低度に標識され、好ましくは該組み換えキナーゼの該タンパク基質は、実質的に標識されず、また最も好ましくはこれらは全く標識されない。
上記のように、キナーゼは種々の疾患において、重要な役割を演じているので、単一の野生型キナーゼまたは一群の野生型キナーゼを、特異的に阻害することのできる阻害剤を開発することは、極めて興味深いことである。これらの疾患関連キナーゼの活性をダウンモジュレーションすることによって、該疾患の症状を軽減し、もしくは該疾患を治癒することさえ可能となるはずである。
本発明の変異キナーゼおよび阻害剤は、またヒト並びに動物における疾患を治療するために、直接利用することもできる。動物モデル系について、すぐ前に記載したように、これらのキナーゼが媒介する疾患に罹った患者に、遺伝子置換法を利用することもできる。一種以上のこのような野生型のキナーゼに対する、この野生型の遺伝子は、例えば当分野で公知の「ノックアウト法」によって除去し、次いでこれら一以上のキナーゼの、特異的に阻害可能な変異体を、例えば「ノックイン法」または当分野で公知の遺伝子療法により、動物のゲノムに添加する。従って、該阻害剤は、これら一以上の変異キナーゼをダウンモジュレートし、結果として該疾患を、少なくともある程度まで改善することを可能とする、薬物として使用できるが、正常な細胞機能のために必要であることが知られている、これらキナーゼの活性の程度を、維持することができる。勿論、該キナーゼは、治療上有効であることが明らかである場合には、強力に阻害することによって、本質的に活性低下させることも可能である。更に、該疾患が、ダウンレギュレーションまたは活性低下期間中に、大幅に改善または治癒されることが明らかとなった場合、該阻害剤の投与を中断することができ、また該疾患は再発または悪化することは、殆どない。そうでなくとも、阻害を長期間に渡り、あるいは永続的に中断し、外患者の残りの人生では、該野生型のキナーゼの代わりに、該変異体を機能状態に維持することも可能である。本発明のこの特異的な阻害剤は、環境中には存在しないので、該変異キナーゼは、正に野生型と同様に挙動するはずである(但し、該組み換え操作が、その活性または速度を変更する可能性があることを除く)。また、該疾患が、将来において再発または突発した場合には、該遺伝子交換を繰り返すこと無しに、外患者を該阻害剤で、再度治療することができる。
上記のように、本発明は変異キナーゼ、オルソゴナル阻害剤、およびその合成並びに使用に制限されない。本発明は、他の多重基質型酵素に対しても、同様に良好に機能し、該酵素は、本明細書でドナーと呼ぶ一基質の一部または全体を、本明細書でレシピエントと呼ぶ他の基質に伝達する。また、これから発見されるであろう多くのこのような酵素が存在する。このような例の何れかにおいて、本明細書を検討した当業者は、本発明のこのような酵素に対する適用性を、十分に理解するであろう。このような例において利用できる作業は、上記のキナーゼについてここに詳細に記載したものと、全く同一である。まず、該ドナー基質が何であるかを同定し、および/または該キナーゼを阻害できる化合物(たとえ該化合物が該キナーゼに対して特異的ではないにしても)を同定する必要がある。
生物工学において一般的であるように、本明細書における本発明の説明は、多数の技術的用語の使用を必要としている。完全に説明し尽くすことは実際的ではないが、これら用語の幾つかに関する定義を、照会を容易にする目的でここに与える。他の用語に関する定義も、本明細書の至る部分に見られるが、これらについて、ここでは繰り返さない。ここに定義する、あるいは本明細書の至る部分で定義する用語は、当業者が当分野で使用する際にもつものと理解しているであろう以上の意味を与える意図はない、ことに注意することは重要である。従って、これら用語のおよび本明細書の至る部分で定義された用語の意味を解釈する上で、他の原典をも参考とすべきことを主張するものである。しかし、ここでおよび本明細書の至る部分で与えられた定義は、該定義された用語の意図された範囲並びに意味を決定する上で、常に考慮すべきである。
多くの異なる型の酵素基質および阻害剤が公知であり、例えば競合型、非−競合型、不競合型、「スイサイド」阻害剤等がある。競合型阻害剤は、その結合サイトに対する基質と競合する。しかし、該阻害剤は、該酵素が行う触媒反応に関与できないので、これは触媒反応の速度を低下する。非−競合型阻害剤は、該活性サイトと結合するが、結果として該酵素のタンパク構造と、共有結合的にまたはイオン的に結合して、分離できなくなる。
従って、これらは、該反応から酵素分子を完全に取り去ることによって、触媒反応を阻害する。これらのおよび他の競合的メカニズムのより詳細な説明は、様々な源に見出すことができる(例えば、72)。このようなメカニズムに関する技術の理解を、本発明の阻害剤の設計に適用することによって、この種の全ての阻害剤を製造することができた。
下記の実施例は、本発明を具体的に説明するためのものである。それだけで本発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。当業者は、他の多くの実施態様が上記及び請求の範囲の本発明の範囲内に包含することを十分理解するであろう。
ATP類縁体の合成
12種類の異なる直交性ATP類縁体を合成した。図2は、それらの構造の図式である。図は、アデノシン三リン酸(ATP)を示し、"X"は6位に結合し、下の枠内の図式は実施例に記載された各直交性ATP類縁体の"X"の場所に用いる12の側鎖を示す(常に太字の数字1-12で表される)。それらの類縁体は下記の通りである。
1-N6(メトキシ)ATP 7-N6(ピロリジノ)ATP
2-N6(エトキシ)ATP 8-N6(シクロペンチル)ATP
3-N6(アセチル)ATP 9-N6(シクロペンチルオキシ)ATP
4-N6(i-プロポキシ)ATP 10-N6(ピペリジノ)ATP
5-N6(ベンジル)ATP 11-N6(シクロヘキシル)ATP
6-N6(ベンジルオキシ)ATP 12-N6(シクロヘキシルオキシ)ATP
ヌクレオチド類縁体のスクリーニング
既存の細胞キナーゼ(53)が基質として受容しない化合物を同定するために、タンパク質チロシンキナーゼ(13)を多く含むマウスリンパ球溶解物(CF)において合成A*TP類縁体のパネルをスクリーニングした。
突然変異v-Srcの設計
不活性キナーゼのいくつかの構造は解析されているが、チロシンキナーゼの活性コンホメーションの結晶構造は解析されていない(54、55)。しかしながら、触媒活性ser/thrキナーゼの2つの結晶構造は解析されている(56、57)。双方のキナーゼファミリー(cAMP依存性キナーゼのK72、v-SrcのK295)(58、58)中の同じ触媒活性リシン残基を親和性標識することにより示されるようにser/thrとチロシンキナーゼ触媒ドメイン間に高程度の機能相同性がある。PKA(56)とサイクリン依存性キナーゼ-2(CDK2)-サイクリンA(57)結晶構造から結合ATPのN 6 アミノ基の4Å範囲内に2つのアミノ酸側鎖:V104/M120(PKA)及びV64/F80(CDK2)(60)が示された。
突然変異体の合成、発現及び精製
突然変異体(V323A、I338A)を下記のように作成した。v-Src触媒ドメインの野生型と二重アラニン変異体(XD4断片)を共にグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質(GST-XD4)(61、62)として作成した。下記の実施例に記載される内在チロシンキナーゼを欠くことから良好な発現宿主である大腸菌中でこれらを作成した。無傷SH1触媒ドメインを含むが非触媒SH3及びSH2調節ドメインを欠き、全長v-Srcより比活性が高いことからv-SrcのXD4断片を用いた。
突然変異v-Srcについて直交性ATP類縁体を結合する能力を試験する
次に、各ATP結合部位に結合する能力の尺度である、[γ-32P]ATPによるRR-Srcの野生型及び突然変異キナーゼリン酸化を微分阻害するN 6 置換ATP類縁体(1〜12)の能力を評価した。50mMトリス、10mM MgCl2、1.6mMグルタチオン、1mg/ml BSA、GST-XD4(100nM)又はGST-XD4(V323A、I338A)(100nM)を含む1mM RR-Srcペプチド及び10μM[γ-32P]ATP(1000cpm/pmol)[Dupont NEN]を含むpH8.0の最終容量30μlの緩衝液中37℃で3回の実験で分析を行った。冷却ATP又はA*TP類縁体(100μM)(1〜12)を加えた後にキナーゼを加えた。30分後、25μlの反応容量をp81ホスホセルロースディスク(Whatman)上にスポットすることにより反応液を急冷し、これらを250mlの10%酢酸に>30分間浸漬し、続いて標準法(52)に従って洗浄及びシンチレーション計数を行った。
最適な直交性ATP類縁体による突然変異v-Srcの触媒効率を求める
類縁体8が野生型キナーゼ(図3、レーン12)でわずかに低いレベルのリン酸化を示したことから他の3種のATP類縁体5、9及び11について野生型GST-XD4とGST-XD4((V323A、I338A)変異体双方の触媒的にコンピネントな基質として働くN 6 -(シクロペンチル)ATP)8の能力を試験することが選ばれた。
タンパク質基質特異性の保持を確認する
下記の表2に示されるように、野生型GST-XD4キナーゼは、v-Srcの十分に確認されたペプチド基質、RR-Srcを文献と一致した速度論でリン酸化することがわかった。これにより、配列操作はタンパク質基質に対して酵素の触媒活性にほとんど影響しなかったことが示される。
操作したキナーゼは好ましい直交性基質を受容するが、野生型キナーゼはほとんど受容しないことを確認する
本実験の最後の目標は、合成基質類縁体に特異的な突然変異キナーゼを用いて全細胞又は細胞溶解物中の直接タンパク質基質を標識することである。このために、ser/thr特異的キナーゼを含む野生型キナーゼ(全てのホスホアミノ酸の0.03%だけがチロシンであるように細胞リン酸化の大部分を行う)(65)がほとんど合成基質を受容しないことが好ましい。[γ-32P]N6-(シクロペンチル)ATPが全ての野生型細胞キナーゼに対して実質的に"死んだ基質"であることを確かめるために、[γ-32P]ATP又は[γ-32P]N 6 -(シクロペンチル)ATPとの試験管内キナーゼ反応はマウスリンパ球溶解物で行った。
単一突然変異v-Src変異体の構築と分析
単一突然変異がN 6 -(シクロペンチル)ATPを基質として効率よく用いることを十分可能にするかを求めるために、実施例4にと同様の方法を用いて3種のv-Src由来変異体を更に調製した。しかしながら、338位に単一突然変異のみ有した。また、GST-XD4融合タンパク質として発現した。次に、これらの突然変異GST-XD4(I338A)、GST-XD4(I338S)及びGST-XD4(I338G)を実施例8に記載されるように試験した。
v-Src基質を同定する
v-Src基質を同定する実験法の概略を図8に示す。GST-XD4(V323A、I338A)のような操作したv-Srcを[γ-32P]N 6 -(シクロペンチル)ATPのような放射性標識した直交性基質と共に細胞抽出液又は透過性を上げた細胞に加える。典型的には、これは3回の実験で行われる。インキュベートした後、細胞を溶解(まだ溶解していない場合)、得られた試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。ゲルから取り抗ホスホチロシンで標識したウェスタンブロットは、試料中の全てのリン酸化タンパク質を示し、ゲルのオートラジオグラムからv-Srcによりリン酸化されたことが示される。
阻害剤の合成
最初の6種の阻害剤のピラゾロピリマジン骨格を図11Aに示す。"R"位置にフェニル基をもつ4-アミノ-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン、化合物1(図10に示されるPP1と同じ構造であるがフェニル環にパラメチル基を含まない)の合成をHanefeldら(76)の方法に従って行った。"R"位置に各々シクロブトイル、シクロペントイル、シクロヘキソイル、ベンゾイル、及び2-フロイル置換基をもつ化合物2〜6(図11B)は、1を各々塩化シクロブトイル、塩化シクロペントイル、塩化シクロヘキソイル、塩化ベンゾイル、又は塩化フロイルで乾燥ピリジン中室温で1時間処理することにより合成した。各置換基の構造を図11Bに示す。シリカゲルクロマトグラフィーで精製して純粋な生成物を収率16〜84%で得た。化合物1〜6を1H-NMRと質量スペクトル法で確認した。
野生型キナーゼに対して直交性の阻害剤のスクリーニング
既存の細胞キナーゼを阻害しない化合物を同定するために、Shahら(79)に記載されたキナーゼ活性の放射性標識トレーサーとして[γ-32P]ATPを用いたペプチドリン酸化分析において2つの密接に関連した精製チロシンキナーゼ、v-Src及びFynに対して合成ピラゾロピラミジン類縁体(1〜6)のパネルをスクリーニングした。
従来の遺伝子及び生化学法を用いてタンパク質キナーゼシグナリング経路を解析することは、密接に関連したキナーゼの圧倒的多数のために難しかった。各個々のキナーゼの細胞透過性阻害剤が設計された場合には、各タンパク質キナーゼ役割は系統的に評価される。
従って、成功した相補的設計により、操作したキナーゼ/阻害剤複合体においてのみ可能な好ましい結合相互作用がもたらされる。操作したキナーゼをコードしている遺伝子で細胞をトランスフェクションすると1種のキナーゼのみが設計した阻害剤によって遮断される細胞を生成する(図14参照)。
酵素操作
新規なATP特異性を有するキナーゼを操作する我々の前の努力から、キナーゼのホスホァクセプター特異性又は生物学的機能を修飾せずにグリシンに突然変異されるv-Src(Ile338)のATP結合ポケットの機能的保存残基が同定された。スペースを生じる突然変異は、kcatの適度な低下、ATPのKmの適度な増加のみ生じ、線維芽細胞形質転換レベルの定量的変化を引き起こさない(Shanh K、未発表の結果)。突然変異v-Srcの生物学的基質は変化せず、I338G v-Srcは野生型v-Srcと同じ生物学的機能を行う。ATP結合タンパク質キナーゼの全ての結晶構造により338(Srcの番号)に対応する残基とATP間の密接な接触相互作用が示された。タンパク質キナーゼ配列アラインメントの分析により、全ての既知の真核タンパク質キナーゼにおいて嵩のある側鎖(通常、Thr、Ile、Leu、Met、又はPhe)を含むことが確認された。従って、338位のグリシンの突然変異は、野生型キナーゼに存在しない新規なポケットをつくらねばならない。増大したATP結合部位のために、グリシン突然変異キナーゼは野生型キナーゼを結合しない嵩のある阻害剤を受容しなければならない。標準法を用いて前述のWT及びI338G v-Src触媒ドメインのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質がクローン化、発現及び精製された。WT Fyn、T339G Fyn(Srcの番号)、及びWT Ab1もGST融合タンパク質として発現及び精製された。
我々の基本的な設計戦略を試験するために、WT v-SrcよりI338G v-Srcの選択的に阻害するN-6置換アデノシン分子の以前に合成したパネルに対してWT及びI338G v-Src SH1ドメインがスクリーニングされた。アデノシンは単にsrcファミリーチロシンキナーゼの適度な阻害剤であることから、操作したキナーゼの強力な阻害剤を発見することは予想されなかった。予想したように、N-6アデノシン類縁体の全てがWT v-Srcより強力にI338G v-Srcを阻害した(データは示されていない)。このスクリーンに見られる最も強力な阻害剤は50%阻害濃度がI338G v-Srcに対して1mMのN-6シクロペンチルオキシアデノシン(1、図15a)であった。選択性を試験する次の実験により、WT v-Src又はFynの検出可能な試験管内阻害を400mMまでの濃度で示さないことが証明された。この最初のスクリーニングは、我々の設計が従来の阻害剤発見の主要な問題点である選択性バリアーを容易に克服させることができたのでI338G v-Srcの新規な阻害剤を開発するという戦略を追及するように我々を激励した。
ピラゾロ[3,4-d]ピリミジンのパネルをWT及びI338G v-Srcキナーゼに対してスクリーニングした(図13参照)。類縁体の全てが野生型に比べて操作したv-Srcの良好な阻害剤であり、キナーゼ活性部位における2の結合配向の我々の予測が確認された。2のN-4位での誘導体はWT v-Srcに対する阻害活性を破壊する(溶解度の限界、300mMで阻害が検出できない)。10種全ての類縁体は、I338G v-Srcの測定可能な阻害を示し、数種の化合物のIC50は低mM範囲である。N-4-(p-tert-ブチル)ベンゾイル類縁体(3g)は、パネル中最も強力なI338G v-Src阻害剤である(IC50=430nm)。この分子は300mMでWT v-Srcの阻害を示さず、3gが野生型に比べて突然変異v-Srcの少なくとも1000倍良好な阻害剤であることが示される。I338G v-Src活性部位にマイクロモル未満の効力を得ることを必要とする誘導体化の大きなサイズはどちらかといえば予想しなかった。ATP結合部位から4個の炭素原子だけを除去し、11個の炭素原子を有する親分子を誘導体化した。この違いは、我々の結合予想が不十分であることによるものである。また、Ile→Glyの突然変異は酸素活性部位に対して大きな可撓性を与え、突然変異キナーゼが予想されたものよりも大きな阻害剤類縁体を受容することを可能にする。3gがATP結合部位でI338G v-Srcを阻害することを確認するために、種々のATP濃度での阻害速度論を調べた。ラインウィーバー・バーク分析により、3gがATPに対して競合的にI338G v-Srcを阻害定数(K i )が約400nMで阻害することが確認された(データは示されていない)。
3gが野生型チロシンキナーゼを阻害しないことを更に証明するためにB細胞レセプター(BCR)仲介リン酸化カスケードに対する3g処理の影響を調べた。Srcファミリー(Fyn、Lyn、Lck、Blk)及び非srcファミリーチロシンキナーゼ(Btk、Syk)は、BCR架橋時に活性化されることが既知である。BCR仲介カスケードの増幅性のために、これらのキナーゼのいずれかの阻害は活性化後の細胞ホスホチロシンの分布と強度を劇的に変える。3gが野生型キナーゼの活性部位と立体的に適合しないように設計したことから、野生型B細胞におけるチロシンリン酸化依存性シグナリングを破壊してはならない。図17(レーン3)から抗原レセプター架橋マウスB細胞の100mM処理がB細胞刺激のホスホチロシンパターンに対して影響しないことが示される(レーン2と比較されたい)。主要バンド全てのシグナル強度は変化せず、重要でないバンドのごくわずかな消耗が検出でき、3gがBCR架橋によって活性化されるチロシンキナーゼのパネルをほとんど阻害しないことが確認される。しかしながら、B細胞を100mM2で処理すると、野生型srcファミリーキナーゼの強力な阻害と一致しているチロシンリン酸化(図4、レーン4)の顕著な低下を引き起こす。
Src仲介経路を実験する選択的阻害剤を用いるために、WT及びI338G v-Src双方をNIH3T3線維芽細胞にレトロウイルスで導入した。これらの細胞は、v-Src発現に依存する形質転換表現型を得ている。3gがWT形質転換細胞に影響せずにI338G v-Src形質転換細胞のSrc依存性シグナル導入経路を選択的に妨害することを示すことを探求した。WT v-Src感染細胞(100mM 3g)の処理は対照のDMSO処理レーン(図18)と比較してチロシンリン酸化のロスを引き起こさず、設計した阻害剤がWT v-Src又はv-Src仲介細胞形質転換によって活性化される他のチロシンキナーゼを阻害しないことが証明される。I338G v-Src形質転換細胞の同等処理は、推定v-Src基質のチロシンリン酸化の劇的な減少、及びホスホチロシンの細胞レベルの全体の適度な低下を生じる。以前に、v-Src形質転換細胞を一般的なチロシンキナーゼ阻害剤で処理すると36kDタンパク質のチロシンリン酸化の減少が生じることが示されている。p36は特定のホスホチロシンホスファターゼと結合すると考えられ、阻害剤処理細胞における急速な脱リン酸がたぶん説明される。I338G v-Src発現細胞(50mM)におけるp36ホスホチロシンシグナルの3g IC50は試験管内値の約100倍である(データは示されていない)。これは、おそらく阻害剤が細胞実験におけるキナーゼ活性部位のATPのミリモル濃度と競合しなければならない事実による。
v-Src活性は、哺乳動物細胞のラウス肉腫ウイルス形質転換に必要である。I338G v-Src発現NIH 3T3細胞を100mM 3gで処理すると、形質転換の逆反応と一致している細胞形態の劇的な変化が生じた(図19)。阻害剤3gで処理した変異細胞は扁平に見え、形質転換細胞の増殖特性を示さなかった(即ち、相互の上で増殖する能力)。同じ条件下で、WT v-Src感染細胞はプロトタイプの丸い形態及び形質転換細胞の重なっている増殖パターンを示した。
問題の酵素と他の全ての間のユニークな分子差を与える突然変異誘発を用いる利点は、保存キナーゼ重のために方法がキナーゼスーパーファミリー中に拡張できなければならないことである。ほとんど全ての既知のタンパク質キナーゼは、v-Srcの残基338に対応する位置に嵩のある側鎖を含む。従って、この位置に突然変異を生じるスペースは、選択的阻害に感受性のある多重キナーゼにしなければならない。これを試験するために、T339G Fynに対する類縁体の阻害を測定した(表1)。I338G v-SrcとT339G Fynの類縁体の構造活性関係に驚くべき類似性がある。I338G v-Srcのデータに従って、3gはT339G Fynに対して最も強力な阻害剤類縁体であり、IC50が830nMであった。これは、WT FynよりT339G Fynに対して300倍より大きい選択性に相当する。このデータの意味は、多重チロシンキナーゼが推定阻害剤の大きなライブラリーをスクリーニングすることを必要とせずに1つの阻害剤類縁体を優先的に受容するように系統的に操作されるということである。
この報告においては、化学感受性キナーゼと合理的に設計した阻害剤の相補的操作によって選択的タンパク質キナーゼ阻害の新規な方法が記載される。標的キナーゼの高選択性は全細胞で達成されること及びがん遺伝子チロシンキナーゼの活性部位阻害が形質転換細胞形態の破壊に十分であることが証明される。方法が容易に一般化されることから、シグナル導入経路の解析及び薬剤設計の標的としてキナーゼの確証には広域にわたる適用がなければならない。効果的な薬剤発見の速度は重要な薬剤標的の同定と確証によって制限される。これは、2000の相同タンパク質の環境においてささいな問題ではない。タンパク質キナーゼの化学感受性変異体の使用は、薬理的キナーゼ阻害の細胞及び生理的作用をプローブする能力を増大する。トランスフェクションした細胞系及び"ノックイン"マウスでさえ現在は速やかに作成することができるので、我々の方法は全細胞又は動物モデルにおいて一定のキナーゼの選択的阻害の影響を試験する方法を大いに効率よくしなければならない。阻害剤結合タンパク質キナーゼ結晶構造が利用できるようになるにつれて、この戦略は全シグナル導入カスケードの範囲で一定のキナーゼの時間及び用量依存性阻害の影響の系統的研究を可能にする。
化学合成
出発物質と合成試薬は全て特にことわらない限りAldrichから購入した。化合物は全て1H NMRと高分解能質量分析法で確認した。4-アミノ-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(2)をHanefeldらに従って合成した。
4-シクロブチルアミド-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(3a):収量0.0116g(16%),白色粉末;HRMS(EI)分子イオンC20H23N5Oの計算値349.19049,実測値349.18762; 1H NMR(300MHZ, CDCl3, ppm) d 1.86(9H, s), 1.89-2.27(6H, m), 3.58(1H, m), 7.26-7.67(5H, m), 8.69(1H, s).
4-シクロペンチルアミド-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(3b):収量0.0456g(68%),白色粉末;HRMS(EI)分子イオンC21H25N5Oの計算値363.20615,実測値363.20398; 1H NMR(270MHZ, CDCl3, ppm) d 1.41-1.91(8H, m), 1.87(9H, s), 2.97(1H, m), 7.51-7.67(5H, m), 8.70(1H, s).
4-シクロヘキシルアミド-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(3c):収量0.0575g(84%),白色粉末;HRMS(EI)分子イオンC22H27N5Oの計算値; 1H NMR(270MHZ, CDCl3, ppm) d 1.21-1.93(10H, m), 1.86(9H, s), 2.43(1H, m), 7.51-7.67(5H, m), 8.70(1H, s).
4,2'-フリルアミノ-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(3d):収量0.0342g(60%),白色粉末;HRMS(EI)分子イオンC20H19N5O2の計算値361.15407,実測値361.15254; 1H NMR(270MHZ, CDCl3, ppm) d 1.87(9H, s), 6.52(1H, d), 7.43-7.53(5H, m), 7.95(1H, s), 8.59(1H, s).
4-ベンズアミド-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(3e):収量0.1309g(56%),白色粉末;HRMS(EI)分子イオンC22H21N5Oの計算値371.17933,実測値371.17324; 1H NMR(270MHZ, CDCl3, ppm) d 1.41-1.91(8H, m), 7.22-8.11(10H, m), 8.48(1H, s).
4-(p-メチル)ベンズアミド-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(3f):収量0.0751g(33%),白色粉末;HRMS(EI)分子イオンC23H23N5Oの計算値385.19499,実測値385.18751; 1H NMR(270MHZ, CDCl3, ppm) d 1.88(9H, s), 2.42(3H, s), 7.19(2H, d), 7.41-8.11(7H, m), 8.49(1H, s).
4-(p-tert-ブチル)ベンズアミド-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(3g):収量0.1050g(42%),白色粉末;HRMS(EI)分子イオンC26H29N5Oの計算値427,23747,実測値427.23474; 1H NMR(270MHZ, CDCl3, ppm) d 1.35(9H, s), 1.88(9H, s), 7.38-7.99(9H, m), 8.50(1H, s).
4-シクロペンチルメチルアミノ-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(4b):収量0.0649g(75%),透明な油状物;HRMS(EI)分子イオンC21H27N5の計算値349.22691,実測値349.22420; 1H NMR(270MHZ, CDCl3, ppm) d 1.16-2.14(9H, m), 1.84(9H, s), 3.54(2H, d), 5.51(1H, s), 7.46-7.67(5H, m), 8.43(1H, s).
4,2-フリルメチルアミノ-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(4d):収量0.0620g(66%),ベージュ色の粉末;HRMS(EI)分子イオンC20H21N5Oの計算値347.17483,実測値347.17330; 1H NMR(270MHZ, CDCl3, ppm) d 1.83(9H, s), 4.75(2H, d), 5.64(1H, s), 6.25(2H, d), 7.34-7.63(6H, m), 8.45(1H, s).
4-ベンジルアミノ-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(4c):収量0.0520g(54%),白色粉末;HRMS(EI)分子イオンC22H23N5の計算値357.19559,実測値357.19303; 1H NMR(270MHZ, CDCl3, ppm) d 1.82(9H, s), 4.76(2H, d), 5.63(1H, s), 7.28-7.63(10H, m), 8.44(1H, s).
WTv-Src SH1ドメイン、I338 Gv-Src SH1、WT Fyn、T339G Fyn及びWT Ab1のグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質の遺伝子のpGEX-KTプラスミドへの部位特定変異誘発及びクローニングを前述のように行った。これらのキナーゼをDH5a E.coli中で発現し、固定化グルタチオンビーズ(Sigma)上で精製した。PKAを購入(Pierce)し、精製せずに用いた。PKCdをBac-to-Bac発現系(pFastBac Bベクター)を用いて6-His構築物として発現した。PKCdをQIAexpress(Ni-NTAアガロースカラム)を用いて精製した。
srcファミリーキナーゼ(IYGEFKKK)の最適化ペプチド基質に移った32Pの1分当たりの計数(cpm)を測定することにより推定キナーゼ阻害剤のIC50を求めた。種々の濃度の阻害剤を50mMトリス(pH8.0)、10mM MgCl2、1.6mMグルタチオン、1mg/ml BSA、133mM IYGEFKKK、3.3%DMSO、0.05mMキナーゼ及び11nM(2mCi)[g-32P]ATP(6000Ci/ミリモル,NEN)と全容量30mlで30分間インキュベートした。反応混合液(25ml)をホスホセルロースディスク上にスポットし、10%HOAcに浸漬し、0.5%H3PO4で洗浄した。32Pの移動を標準シンチレーション計数で測定した。cpmが対照ディスクの50%である阻害剤濃度であるようにIC50を定義した。IC50が2つの測定濃度の間に下がった場合、阻害剤濃度と2つのデータ間のcpmの間の逆比例の関係を前提として算出した。水溶液中の阻害剤類縁体の溶解限界が300μMであることから、250μMのIC50値は阻害上限までの完全な力価測定が試験されないので近似値である。非srcファミリーキナーゼのIC50は次を除いて同様に測定した。PKAの基質としてケンプチド(Pierce,133mg/ml)を用いた。Ab1分析に最適化Ab1基質(EAIYAAPFAKKK,133mg/ml)を用いた。17ng/mlのジアシルグリセロール(Sigma)と17ng/mlのホスファチジルセリン(Sigma)の存在下にキナーゼ基質として170ng/mlヒストン(Sigma)と共にPKCd分析を行った。
脾リンパ球を生後6〜20週のBalb/c又はC57/B6マウスから単離した。その細胞を脾臓から1mg/ml DNase Iを含むRPMI培地に洗い、赤血球を17mMトリス-塩化アンモニウム、pH7.2に溶解した。約4×106細胞を1.1%DMSO中100mMの3g又は2と37℃で30分間インキュベートした。2mgのヤギ抗マウスIgM(Jackson Immuno Research,cat#115-005-075)を添加し、次に37℃で5分間インキュベートすることによりB細胞刺激を開始した。細胞を遠心分離(13,000rpm、2分)により単離し、溶解した(溶解緩衝液:1%トリトンX-100、50mMトリスpH7.4、2mM EDTA、150mM NaCl、100mM PMSF、2mMオルトバナジン酸ナトリウム、10mg/mlロイペプチン、10mg/mlアポプロチン)。次に、細胞残渣を13,000rpmで15分間沈降させた。
細胞タンパク質を10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ウェスタンブロッティングでニトロセルロース膜に移した。ホスホチロシン含有タンパク質を抗ホスホチロシン抗体(Upstate Biotechnology社)でイムノブロッティングすることにより視覚化した。
WT及びI338G v-Srcをコードしている遺伝子をパッケージング細胞系にトランスフェクションし、pBabeレトロウイルスベクター及びピューロマイシン(2.5mg/ml)記載された選択可能なマーカー(Shah,K.,Liu,Y.,Shokat,K.M.,準備中)を用いてNIH 3T3線維芽細胞にレトロウイルス感染した。WT及びI338G v-Src形質転換細胞を2.5mg/mlのピューロマイシンを含有するDMEM/10%BCS中で培養した。
非形質転換NIH 3T3細胞、WT v-Src形質転換NIH 3T3細胞、及びI338G v-Src形質転換NIH-3T3細胞を1.1%DMSO又は1.1%DMSO中100mMの3gと37℃でインキュベートした。12時間後、細胞をPBSで洗浄し、溶解した(溶解緩衝液:1%トリトンX-100、50mMトリスpH7.4、2mM EDTA、150mM NaCl、100mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、2mMオルトバナジン酸ナトリウム、10mg/mlロイペプチン、10mg/mlアポプロチン)。溶解物を13,000rpmで15分間遠心分離することにより清澄化した。溶解物のタンパク質濃度を基準化し、同量の溶解物を電気泳動で分離し、上記のようにホスホチロシン含量を分析した。
非形質転換した、WT v-Src形質転換した、及びI338G v-Src形質転換したNIH 3T3細胞を組織培養処理スライド上のDMEM/10%BCS中で増殖した。v-Src発現細胞を1.1%DMSOか又は1.1%DMSO中100mM 3gで処理した。48時間後、ニコンTMS光学顕微鏡で400倍の写真をとった。光学顕微鏡法後直ちに細胞を3.7%ホルムアルデヒド/PBSに20分間固定し、0.2%トリトンX-100/PBSに60秒間透過性を上げた。透過性を上げた細胞を200ng/mlのファロイジン-FITC/PBSと20分間インキュベートした。スライドをPBSですすぎ、重合アクチンをツァイス蛍光顕微鏡により600倍の蛍光顕微鏡法で可視化した。
タンパク質基質特異性及び生物活性の保持を確認する
(79)に記載されたように行われる。更に、NIH 3T3細胞のがん遺伝子形質転換におけるv-Srcの型にはまった役割がv-Srcを発現する細胞の形態学的変化を観察することにより求められる。突然変異I338G v-Srcを発現するNIH 3T3細胞は、いずれのv-Srcキナーゼも発現しないNIH 3T3細胞と驚異的に異なる野生型v-Srcを発現する細胞の同じ形態学的特徴を示し、I338G突然変異が正常なv-Srcの生物学的機能の喪失又は獲得をまねかないことが確認される。更に、"接触阻害"をせずに増殖するNIH 3T3細胞の能力の分析は、アガロース、粘性増殖培地を含む細胞培養系分析において測定される。野生型v-Src及び突然変異v-Src発現NIH 3T3細胞は、この型にはまった分析においても大きな増殖コロニーを生じる厳密に同じ能力を示し、線維芽細胞においても同じ機能(基質特異性、速度論、細胞分布等を含む)が確認される。
直交性阻害剤が多重チロシンキナーゼを発現する細胞において野生型キナーゼを阻害しないことを確認する
実施例2に記載された精製キナーゼにおける化合物3の直交性に関する最初の分析を確認するために、全細胞を用いて阻害実験が行われた(図4、左の2つのレーン参照)。Coussensら(84)の方法に従って修飾したRIPA緩衝液に細胞を溶解することによりv-Srcキナーゼを発現するピラゾロピリミジン(2〜6)(25μM)処理NIH 3T3細胞の抗ホスホチロシンブロットを行った。溶解及び抗ホスホチロシン検出前に、種々の時間で細胞を処理した。タンパク質を12.5%SDS-PAGEで分離し、プロトランBA85(Schleicher-Schuell)に移した。ブロットを抗ホスホチロシンモノクローナル抗体4G10(Dr.Brian Drukerからの寄贈、オレゴンヘルスサイエンスセンター、オレゴン州ポートランド)でプローブし、製造業者の説明書に従ってHRP結合ヤギ抗マウス抗体(VWR cat.7101332)で処理した後に高化学発光(cat.34080,Pierce)により結合抗体を検出した。
基質の同定
v-Src基質を同定する実験法の図式を図1に示し、実験の確証を示すデータを図4に示す。Coussensら(84)の方法に従って細胞を修飾したRIPA緩衝液に溶解することにより行われるv-Srcか又はv-Src(I338G)キナーゼを発現するピラゾロピリミジン(2〜6)(25μM)処理NIH 3T3細胞の抗ホスホチロシンブロットをつくることにより分析を行った。溶解及び抗ホスホチロシン検出前に細胞を種々の時間で処理した(細胞培養Co2インキュベーター内で)。タンパク質を12.5%SDS-PAGEで分離し、プロトランBA85(Schleicher-Schuell)に移した。ブロットを抗ホスホチロシンモノクローナル抗体4G10(Dr.Brian Drukerからの寄贈、オレゴンヘルスサイエンスセンター、オレゴン州ポートランド)でプローブし、製造業者の説明書に従ってHRP結合ヤギ抗マウス抗体(VWR cat.7101332)で処理した後に高化学発光(cat.34080,Pierce)により結合抗体を検出した。実施例7で述べたように、図4の2つの左のレーンは同じリンタンパク質バンドパターンを示し、直交性阻害剤3が野生型v-Srcキナーゼを阻害しないことが示される。右のゲルの一連のレーンは、ゲルの下に目立ったバンドを示し(タンパク質分子量3キロダルトンに相当する)、100μMの化合物3で処理した後に消失する。1つのリンタンパク質のこの特異的阻害は、特定のキナーゼ阻害剤の特徴である。阻害の特異性は阻害剤が希釈されるケルの最後のレーンで確認され、36キロダルトンバンドのリン酸化は阻害剤濃度が5μMより低い場合に再び現れる(測定した試験管内IC50は5μMである、本文参照)。このタンパク質は、ユニークな分子量に基づいて未知の機能を有するアネキシンIIと呼ばれるタンパク質、アクチン結合タンパク質として暫定的に同定された。
(2) 配列番号1に関する情報
(i) 配列の記載の特徴
(A) 配列の長さ: 27 アミノ酸
(B) 配列の型: アミノ酸
(C) 鎖の数: 関係しない
(D) トポロジー: 関係しない
(ii) 配列の種類: ペプチド
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(v) フラグメント型: 中間部フラグメント
(vi) 起源:
(A) 生物名: ホモ サピエンス(Homo sapiens)
(xi) 配列の記載: 配列番号1
Asn Phe Pro Phe Leu Val Lys Leu Glu Phe Ser Phe Lys Asp Asn Ser
1 5 10 15
Asn Leu Tyr Met Val Met Glu Tyr Val Pro Gly
20 25
(2) 配列番号2に関する情報
(i) 配列の記載の特徴
(A) 配列の長さ: 27 アミノ酸
(B) 配列の型: アミノ酸
(C) 鎖の数: 関係しない
(D) トポロジー: 関係しない
(ii) 配列の種類: ペプチド
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(v) フラグメント型: 中間部フラグメント
(vi) 起源:
(A) 生物名: ホモ サピエンス(Homo sapiens)
(xi) 配列の記載: 配列番号2
Asn His Pro Asn Ile Val Lys Leu Leu Asp Val Ile His Thr Glu Asn
1 5 10 15
Lys Leu Tyr Leu Val Phe Glu Phe Leu His Gln
20 25
(2) 配列番号3に関する情報
(i) 配列の記載の特徴
(A) 配列の長さ: 26 アミノ酸
(B) 配列の型: アミノ酸
(C) 鎖の数: 関係しない
(D) トポロジー: 関係しない
(ii) 配列の種類: ペプチド
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: NO
(v) フラグメント型: 中間部フラグメント
(vi) 起源:
(A) 生物名: ラウス肉腫ウイルス(Rous sarcoma virus)
(xi) 配列の記載: 配列番号3
Arg His Glu Lys Leu Val Gln Leu Tyr Ala Val Val Ser Glu Glu Pro
1 5 10 15
Ile Tyr Ile Val Ile Glu Tyr Met Ser Lys
20 25
(2) 配列番号4に関する情報
(i) 配列の記載の特徴
(A) 配列の長さ: 30 塩基対
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: 他の核酸
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: YES
(vi) 起源:
(A) 生物名: ラウス肉腫ウイルス(Rous sarcoma virus)
(xi) 配列の記載: 配列番号4
TTTGGATCCA TGGGGAGTAG CAAGAGCAAG 30
(2) 配列番号5に関する情報
(i) 配列の記載の特徴
(A) 配列の長さ: 30 塩基対
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: 他の核酸
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: YES
(vi) 起源:
(A) 生物名: ラウス肉腫ウイルス(Rous sarcoma virus)
(xi) 配列の記載: 配列番号5
TTTGAATTCC TACTCAGCGA CCTCCAACAC 30
(2) 配列番号6に関する情報
(i) 配列の記載の特徴
(A) 配列の長さ: 26 塩基対
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: 他の核酸
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: YES
(vi) 起源:
(A) 生物名: ラウス肉腫ウイルス(Rous sarcoma virus)
(xi) 配列の記載: 配列番号6
TGAGAAGCTG GCTCAACTGT ACGCAG 26
(2) 配列番号7に関する情報
(i) 配列の記載の特徴
(A) 配列の長さ: 26 塩基対
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: 他の核酸
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: YES
(vi) 起源:
(A) 生物名: ラウス肉腫ウイルス(Rous sarcoma virus)
(xi) 配列の記載: 配列番号7
CTGCGTACAG TTGAGCCAGC TTCTCA 26
(2) 配列番号8に関する情報
(i) 配列の記載の特徴
(A) 配列の長さ: 24 塩基対
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: 他の核酸
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: YES
(vi) 起源:
(A) 生物名: ラウス肉腫ウイルス(Rous sarcoma virus)
(xi) 配列の記載: 配列番号8
CTACATCGTC GCTGAGTACA TGAG 24
(2) 配列番号9に関する情報
(i) 配列の記載の特徴
(A) 配列の長さ: 24 塩基対
(B) 配列の型: 核酸
(C) 鎖の数: 一本鎖
(D) トポロジー: 直鎖状
(ii) 配列の種類: 他の核酸
(iii) ハイポセティカル: NO
(iv) アンチセンス: YES
(vi) 起源:
(A) 生物名: ラウス肉腫ウイルス(Rous sarcoma virus)
(xi) 配列の記載: 配列番号9
CTCATGTACT CAGCGACGAT GTAG 24
Claims (59)
- 少なくとも1種の直交性基質類縁体を受容する突然変異多基質酵素であって、触媒活性が前記直交性基質の全部又は一部と前記酵素の少なくとも1種の他の基質との組合わせで生じる、前記突然変異酵素。
- 前記多基質酵素がトランスフェラーゼである、請求項1記載の突然変異酵素。
- 前記多基質酵素がシグナル導入伝達因子である、請求項1記載の突然変異酵素。
- リン酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する突然変異タンパク質キナーゼ。
- 前記突然変異タンパク質キナーゼが野生型タンパク質キナーゼの主要な細胞内リン酸供与基質であるヌクレオチド三リン酸に対する親和性より高い親和性で該直交性ヌクレオチド三リン酸に結合する、請求項4記載の突然変異タンパク質キナーゼ。
- 前記直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体がATPの直交性類縁体である、請求項4記載の突然変異タンパク質キナーゼ。
- 前記直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体が前記ATPのN6位に共有結合した少なくとも3個の炭素原子を含む置換基を有するATP誘導体である、請求項4記載の突然変異タンパク質キナーゼ。
- 前記直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体がN6‐(シクロペンチル)ATP、N6‐(シクロペンチルオキシ)ATP、N6‐(シクロヘキシル)ATP、N6‐(シクロヘキシルオキシ)ATP、N6‐(ベンジル)ATP、N6‐(ベンジルオキシ)ATP、N6‐(ピリジノ)ATP、及びN6‐(ピペリジノ)ATPからなる群より選ばれる、請求項7記載の突然変異タンパク質キナーゼ。
- 前記直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体がN6‐(シクロペンチル)ATPである、請求項4記載の突然変異タンパク質キナーゼ。
- 突然変異タンパク質チロシンキナーゼである、請求項4記載の突然変異タンパク質キナーゼ。
- Srcタンパク質チロシンキナーゼの突然変異体である、請求項10記載の突然変異タンパク質キナーゼ。
- ラウス肉腫ウイルスSrcタンパク質チロシンキナーゼの突然変異体である、請求項10記載の突然変異タンパク質キナーゼ。
- アミノ酸配列が野生型タンパク質キナーゼと異なり、v‐Srcの323位及びv‐Srcの338位からなる群より選ばれた位置に対応する位置の少なくとも1種のアミノ酸がアラニン及びグリシンからなる群より選ばれたアミノ酸で置換された、請求項4記載の突然変異タンパク質キナーゼ。
- v‐Srcの338位に対応する位置のアミノ酸がグリシンで置換された、請求項4記載の突然変異タンパク質キナーゼ。
- v‐Srcの323位に対応する位置のアミノ酸及びv‐Srcの338位に対応する位置のアミノ酸がアラニンで置換された、請求項4記載の突然変異タンパク質キナーゼ。
- 前記突然変異タンパク質キナーゼが融合タンパク質として発現した、請求項4記載の突然変異タンパク質キナーゼ。
- グルタチオン‐S‐トランスフェラーゼ融合タンパク質及びG‐ヒスチジン融合タンパク質からなる群より選ばれた融合タンパク質として発現した、請求項16記載の突然変異タンパク質キナーゼ。
- 少なくとも1種の直交性基質類縁体を受容する突然変異多基質酵素をコードしているヌクレオチド配列であって、前記酵素の触媒活性が前記直交性基質の全部又は一部と前記酵素の少なくとも1種の他の基質との組合わせで生じる、前記ヌクレオチド配列。
- リン酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する突然変異タンパク質キナーゼをコードしているヌクレオチド配列。
- 前記ヌクレオチド配列がmDNA、cDNA、gDNA、ミトコンドリアDNA、葉緑体DNA、サテライトDNA、プラスミドDNA、ウイルスRNA、及びウイルスDNAからなる群より選ばれる、請求項19記載のヌクレオチド配列。
- リン酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する突然変異タンパク質キナーゼをコードしている核酸配列の作製方法であって、
a.そのリン酸供与基質に結合した同一又は同種酵素の結晶構造から、前記直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体中の対応する原子に結合した直交性置換基を立体的に排除する前記結合したリン酸供与基質の原子に十分に近接したグリシン以外の1種以上のアミノ酸を同定する工程;及び
b.その同定したアミノ酸の1種以上をコードしているヌクレオチドトリプレットがその同定したアミノ酸より立体的に嵩のない側鎖を有するアミノ酸をコードしているヌクレオチドトリプレットに変換されるように野生型タンパク質キナーゼをコードしているヌクレ才チド配列を突然変異する工程
を含む、前記方法。 - 工程(a)の前記アミノ酸が前記結合したリン酸供与基質の前記原子の約5オングストローム以内にある、請求項21記載の方法。
- 前記リン酸供与基質がATPである、請求項21記載の方法。
- 前記原子がATPのN6アミノ基である、請求項23記載の方法。
- リン酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する突然変異タンパク質キナーゼを生産する方法であって、請求項21記載の突然変異配列を発現させ、よって前記突然変異タンパク質キナーゼを生産する工程を含む、前記方法。
- リン酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する突然変異タンパク質キナーゼをコードしている核酸配列の作製方法であって、
a.そのリン酸供与基質に結合した同一又は同種酵素の結晶構造から、前記直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体中の対応する原子に結合した直交性置換基を立体的に排除する前記結合したリン酸供与基質の原子に十分に近接したグリシン以外の1種以上のアミノ酸を同定する工程;及び
b.前記1種以上のアミノ酸の10個のアミノ酸内のアミノ酸をコードしている1種以上のヌクレオチドトリプレットに1以上の突然変異をアミノ末端及びカルボキシ末端の両方向に有する複数の突然変異タンパク質キナーゼをコードしているヌクレオチド配列を調製する工程;
c.前記複数の突然変異キナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現して複数の突然変異キナーゼを生産する工程;及び
d.前記複数の突然変異キナーゼを試験してリン酸供与基質としての前記直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を用いる能カをもつ1種以上を選ぶ工程
を含む、前記方法。 - リン酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する突然変異タンパク質キナーゼの生産方法であって、かかる突然変異タンパク質キナーゼを発現することがわかった請求項26記截の1種以上の突然変異配列を発現させ、よって前記突然変異タンパク質キナーゼを生産する、前記方法。
- 少なくとも1種の直交性供与基質類縁体を受容する突然変異多基質酵素をコードしている核酸配列の作製方法であって、触媒活性が前記直交性供与基質と前記酵素の少なくとも1種の他の受容基質との組合わせで生じ、
a.その供与基質に結合した同一又は同種酵素の結晶構造から、前記直交性供与基質類縁体中の対応する原子に結合した直交性置換基を立体的に排除する前記結合した供与基質の原子に十分に近接したグリシン以外の1種以上のアミノ酸を同定する工程;及び
b.その同定したアミノ酸の1種以上をコードしているヌクレオチドトリプレットがその同定したアミノ酸より立体的に嵩のない側鎖を有するアミノ酸をコードしているヌクレオチドトリプレットに変換されるように野生型の前記多基質酵素をコードしているヌクレオチド配列を突然変異する工程
を含む、前記方法。 - 工程(a)の前記アミノ酸が前記結合した供与基質の前記原子の約5オングストローム以内にある、請求項28記載の方法。
- 少なくとも1種の直交性供与基質類縁体を受容する多基質酵素の生産方法であって、請求項28記載の突然変異配列を発現させ、よって前記突然変異多基質酵素を生産する、前記方法。
- 少なくとも1種の直交性供与基質類縁体を受容する突然変異多基質酵素をコードしている核酸配列の作製方法であって、触媒活性が前記直交性供与基質の全部又は一部と前記酵素の少なくとも1種の他の受容基質との組合わせで生じ、
a.その供与基質に結合した同一又は同種酵素の結晶構造から、前記直交性基質類縁体中の対応する原子に結合した直交性置換基を立体的に排除する前記結合したリン酸供与基質の原子に十分に近接したグリシン以外の1種以上のアミノ酸を同定する工程;
b.前記1種以上のアミノ酸の10個のアミノ酸内のアミノ酸をコードしている1種以上のヌクレオチドトリプレットに1以上の突然変異がアミノ末端及びカルボキシ末端の両方向にある複数の突然変異多基質酵素をコードしているヌクレオチド配列を調製する工程;
c.前記複数の突然変異多基質酵素をコードしているヌクレオチド配列を発現させて複数の突然変異多基質酵素を生産する工程;及び
d.前記複数の突然変異多基質酵素を試験して供与基質として前記直交性供与基質類縁体を用いる能力をもつ1種以上を選ぶ工程
を含む、前記方法。 - 供与基質としての少なくとも1種の直交性供与基質類縁体を受容する突然変異多基質酵素を生産する方法であって、かかる変異体を発現することがわかった請求項31記載の1種以上の突然変異配列を発現させ、よって前記突然変異多基質酵素を生産する、前記方法。
- 供与基質の一部又は全部を受容基質に共有結合で導入する多基質酵素の受容基質である1種以上の細胞内成分を検出する方法であって、
I.(a)前記多基質酵素の突然変異体を発現し、その突然変異体が供与基質としての直交性供与基質類縁体を受容する、透過性を上げた細胞、溶解した細胞、及び前記直交性供写基質類縁体に天然に透過できる細胞からなる群より選ばれた細胞;及び
(b)前記多基質酵素によって受容基質に触媒で導入される部分に検出可能な部分を有する前記直交性基質類縁体を混合する工程;
II.該突然変異多基質酵素をその標識した直交性供与基質の一部又は全部を該受容基質に導入させるのに十分な条件下で前記細胞をインキュベートする工程;及び
III.細胞成分について前記検出可能な標識の有無を検出し、よって細胞成分について前記標識があることは前記成分が前記多基質酵素の受容基質であり、細胞成分について前記標識がないことは前記成分が前記多基質酵素の受容基質でないことを意味する工程
を含む、前記方法。 - タンパク質キナーゼの1種以上の細胞内タンパク質基質を検出する方法であって、
I.(a)前記タンパク質キナーゼの突然変異体を発現し、その突然変異体がリン酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する、透過性を上げた細胞、溶解した細胞、及び前記直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体に天然に透過できる細胞からなる群より選ばれた細胞;及び
(b)検出可能に標識した末端リン酸を有する前記直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を混合する工程;
II.該突然変異タンパク質キナーゼがリン酸供与体として該直交性ヌクレオチド三リン酸を用いて1種以上のタンパク質基質をリン酸化させるのに十分な条件下で前記細胞をインキュベートする工程;及び
III.細胞タンパク質について前記検出可能に標識したリン酸の有無を検出し、よって細胞タンパク質について前記標識があることは前記タンパク質が前記タンパク質キナーゼの基質であり、細胞成分について前記標識がないことは前記タンパク質が前記タンパク質キナーゼの基質でないことを意味する工程
を含む、前記方法。 - 前記突然変異体が野生型タンパク質キナーゼの主要な細胞内リン酸供与基質の親和性より高い親和性で前記基質に結合する、請求項34記截の方法。
- 試験化合物が多基質酵素の活性をモジュレートするかを求める方法であって、
I.(a)前記多基質酵素の突然変異体を発現し、その突然変異体が供与基質として直交性供与基質類縁体を受容する、透過性を上げた細胞、溶解した細胞、及び
前記直交性供与基質類縁体に天然に透過できる細胞からなる群より選ばれた細胞;
(b)前記多基質酵素によって受容基質に触媒で導入される部分に検出可能な部分を有する前記直交性基質類縁体;及び
(c)前記試験化合物
を混合する工程;
II.該突然変異多基質酵素がその標識した直交性供与基質の一部又は全部を該受容基質に導入させるのに十分な条件下で前記細胞をインキュベートする工程;
及び
III.前記試験化合物を取り除いた1回以上の対照実験で見出されたものに相対する細胞成分について前記検出可能な標識の有無の増減があるかを検出し、よって細胞成分について前記標識の存在するときの相対的増加は前記試験化合物がその成分に対する前記多基質酵素の作用をポジティブにモジュレートしたことを意味し、細胞成分について前記標識の存在するときの相対的減少は前記試験化合物がその成分に対する前記多基質酵素の作用をネガティブにモジュレートしたことを意味する工程
を含む、前記方法。 - 試験化合物がタンパク質キナーゼの活性をモジュレートするかを求める方法であって、
I.(a)前記タンパク質キナーゼの突然変異体を発現し、その突然変異体がリン酸供与基質として直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する、透過性を上げた細胞、溶解した細胞、及び前記直交性ヌクレオチド三リン酸基質類縁体に天然に透過できる細胞からなる群より選ばれた細胞;
(b)検出可能に標識した末端リン酸を有する前記直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体;及び
(c)前記試験化合物
を混合する工程;
II.該突然変異タンパク質キナーゼがリン酸供与体として直交性ヌクレオチド三リン酸を用いて1種以上のタンパク質基質をリン酸化させるのに十分な条件下で前記細胞をインキュベートする工程;及び
III.前記試験化合物を取り除いた1回以上の対照実験で見出されたものに相対する細胞成分について前記検出可能な標識の有無の増減があるかを検出し、よって細胞成分について前記標識の存在するときの相対的増加は前記試験化合物がその成分に対する前記タンパク質キナーゼの作用をポジティブにモジュレートしたことを意味し、細胞成分について前記標識の存在するときの相対的減少は前記試験化合物がその成分に対する前記タンパク質キナーゼの作用をネガティブにモジュレートしたことを意味する工程
を含む、前記方法。 - がん、HIV等の病態における薬剤分析、治療又は介入方法より選ばれた診断及び治療法双方に使用するための抑制性の操作したタンパク質キナーゼ又はそれに従って調製したキナーゼより選ばれた多基質酵素、その合成類縁体、その活性断片、その同族体、及びその組合わせ。
- 薬剤スクリーニングの“ノックアウト”モデルとして機能することができるトランスジェニック動物であって、具体的な病態と関連がある具体的なキナーゼに対応する野生型遺伝子が突然変異キナーゼをコードしている遣伝子で置換され、前記モデルとキナーゼ阻害剤との相互作用によって前記スクリーニングが用いられる、前記トランスジェニック動物。
- 動物における標的細胞の形質転換方法であって、請求項1記載の突然変異キナーゼ、キナーゼ阻害剤、その作動剤及び拮抗剤、その活性断片、その類縁体、その縮重変異体、その突然変異タンパク質、及びその組合わせからなる群より選ばれた物質の発現にコードするDNA分子を含むベクターを調製する、前記方法。
- 薬剤スクリーニング及び付随するスクリーニング法であって、請求項1記載の突然変異キナーゼ、その変異体、その阻害剤、その活性断片、その類縁体、及びその組合わせより選ばれた物質を用いる、前記方法。
- 請求項1の突然変異多基質酵素、その阻害剤、その作動剤、その活性断片、その対立遺伝子、その類縁体、その保存変異体より選ばれた活性物質、及び薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物。
- がん、HIV、アルツハイマー病より選ばれた疾患の治療のための請求項41記載の医薬組成物の使用。
- 野生型キナーゼの変異型に対する基質として役立つ放射性標識されたN6−置換ATP類縁体であって、該類縁体は野生型キナーゼに対する基質としては役立たないことを特徴とする類縁体。
- 該類縁体が放射性リンである32Pで放射性標識されている、請求項44に記載の類縁体。
- 該類縁体がN6部位に少なくとも3つの炭素を含んでいる、請求項44に記載の類縁体。
- 該類縁体が、N6−(ベンジル)ATP及びN6−(シクロペンチル)ATPからなる群より選ばれる、請求項44に記載の類縁体。
- N6−置換ADP類縁体であって、該類縁体がN6部位に少なくとも3つの炭素を含んでいることを特徴とする類縁体。
- N6−(エトキシ)ATP、N6−(アセチル)ATP、N6−(i−プロポキシ)ATP、N6−(ベンジルオキシ)ATP、N6−(ピロリジノ)ATP、N6−(シクロペンチルオキシ)ATP、N6−(ピペリジノ)ATP、N6−(シクロヘキシル)ATP及びN6−(シクロヘキシルオキシ)ATPからなる群より選ばれるATP類縁体。
- 該ATP類縁体がN6−(シクロペンチルオキシ)ATPである、請求項49に記載のATP類縁体。
- 該ATP類縁体がN6−(シクロヘキシル)ATPである、請求項49に記載のATP類縁体。
- 請求項49に記載の少なくとも1つの類縁体及び該類縁体の使用のための容器を含むキット。
- 請求項44に記載の1種以上の類縁体及び該類縁体の使用のための容器を含むキット。
- 変異体キナーゼに対するタンパク質基質を同定する方法であって、
変異体キナーゼを発現する浸透化処理した細胞を請求項44に記載の放射性標識した類縁体と共に適切な時間インキュベートする工程、
該細胞を溶解する工程、
SDS−PAGEにより溶解物を分離する工程、及び、
タンパク質基質を同定する工程
を含むことを特徴とする方法。 - 該タンパク質基質をオートラジオグラフィーにより同定する、請求項54に記載の方法。
- 変異体キナーゼに対するタンパク質基質を同定する方法であって、
細胞抽出物を請求項44に記載の放射性標識した類縁体と共に適切な時間インキュベートする工程、
SDS−PAGEにより溶解物を分離する工程、及び、
タンパク質基質を同定する工程
を含むことを特徴とする方法。 - 該タンパク質基質をオートラジオグラフィーにより同定する、請求項56に記載の方法。
- 野生型キナーゼの変異型に対する基質として役立つが、野生型キナーゼに対する基質としては役立たないATP類縁体を同定する方法であって、
請求項44に記載の類縁体を変異体キナーゼと共にインキュベートする工程、
同一のATP類縁体を野生型キナーゼと共にインキュベートする工程、及び、
該類縁体が変異体キナーゼ及びその野生型キナーゼに対する基質として役立つか否かを決定する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - ATP類縁体及び変異体キナーゼを、該変異体キナーゼに対する既知のタンパク質基質の存在下でインキュベートする、請求項58に記載の方法。
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