JP2002503953A - 変性ヌクレオチド三燐酸基質を利用できる組み換えタンパクキナーゼ - Google Patents

変性ヌクレオチド三燐酸基質を利用できる組み換えタンパクキナーゼ

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Abstract

(57)【要約】 野生型の酵素によって容易に用いられない修飾したヌクレオチド三リン酸基質を用いることができる操作したタンパク質キナーゼ、及びその製造及び使用方法。修飾したヌクレオチド三リン酸基質及びその製造及び使用方法。キナーゼが作用するタンパク質基質を同定するために、その作用の程度を測定するために、及び試験化合物がその作用をモジュレートすることができるかを求めるためにその操作したキナーゼ及びその修飾した基質を用いる方法。また、操作した形が野生型の酵素によって容易に用いられない修飾した基質を受容する、少なくとも１種の(供与)基質の一部又は全部を少なくとも１種の他の(受容)基質に共有結合する操作した形の多基質酵素。その操作した酵素の製造及び使用方法。修飾した基質及びその製造及び使用方法。酵素が作用する受容基質を同定するために、その作用の程度を測定するために、及び試験化合物がその作用をモジュレートするかを測定するためにその操作した酵素及びその修飾した基質を用いる方法。

Description

【発明の詳細な説明】 変性ヌクレオチド三燐酸基質を利用できる組み換えタンパクキナーゼ 米国政府は、この発明のライセンス契約費用を支払っており、NSFグラントNo. MCB9506929およびDHHS NCIグラントNo.RO1 CA70331-01の協定に規定されている ように、本特許権者が他の者とライセンス契約を結ぶことを請求する権利を持つ 。 I．発明の分野 本発明は、バイオテクノロジーの分野に関する。より詳細には、本発明はしば しば酵素工学とも呼ばれる分野に関連し、そこでは遺伝子改変またはその他の手 段を利用して、対象とする酵素のアミノ酸配列を変更し、結果としてその触媒性 能を変更または改良する。以下に記載される本発明の態様は、遺伝子操作および 酵素学の分野における方法論を包含し、またより具体的にはタンパクキナーゼお よび他の多重基質性酵素(このような酵素の阻害性物質を含む)の設計並びに関連 物質、技術および利用を包含する。 II．発明の背景 多細胞生物における細胞間の連絡は、迅速でなければならず、かつ該連絡は多 様かつ複雑な様式で、細胞同士の相互の応答を可能とするものである必要がある 、ことのみが論理にかなったものである。典型的には、利用される細胞内シグナ ルは、「リガンド」と呼ばれる分子であり、与えられたリガンドは、このシグナル を受け取ることになる該細胞表面上の、特定の型のレセプタと結合することがで きる。しかしながら、この簡単なリガンド結合のみでは、該受容細胞が行う必要 のある、該複雑な応答のためには不十分である。従って、細胞は、このシグナル を増幅し、かつ該細胞内での触媒活性の迅速な調節に導く、複雑な、時としてカ スケード的な機構を介して、複雑性を付与し、結果として複雑な、時として劇的 な細胞内応答をもたらすことができる。概して、初期のリガンド結合から、該細 胞内応答の完了に至るこの過程は、「シグナル伝達」と呼ばれる。 シグナル伝達は、しばしば他の酵素に作用して、その触媒活性を変更すること を可能とする、細胞内酵素の活性化によって達成される。これは、幾つかの代謝 経路の活性における増加または減少をもたらす可能性があり、あるいは大きな細 胞内変化、例えば特殊なパターンの遺伝子発現の開始等を引き起こす可能性さえ もつ。ある酵素の、他の酵素の活性を変更する能力は、一般的に該酵素が細胞シ グナル伝達に関与していることを示す。 シグナル伝達過程で利用される、最も一般的な共有結合性の変性は、ホスホリ ル化であり、これはホスホリル化されたこれら酵素の活性の変更をもたらす。こ のホスホリル化は、タンパクキナーゼとして知られている酵素によって触媒され 、該タンパクキナーゼはしばしば単に「キナーゼ」と呼ばれている。 これらキナーゼの幾つかの重要な特徴のために、該キナーゼはシグナルタンパ クとして理想的なものとなっている。その一つは、これらがしばしば重複ターゲ ット基質特異性をもつことにあり、これは種々のシグナル経路の中で、「クロス トーク」を可能とし、結果として種々のシグナルの統合を可能とする(1)。これは 、応答が誘導される前に、各キナーゼが幾つかの基質をホスホリル化する必要が あり、その結果として多くの型の多様なシグナル発生をもたらすものと考えられ ている。例えば、ある所定のキナーゼは、該細胞表面に結合している、細胞外リ ガンドの構造に依存して、一例においては成長阻害シグナルを伝達し、また他の 例では成長促進シグナルを伝達する(2)。 第二の重要な特徴は、該キナーゼが、幾つかの分子状の機能的領域または「ド メイン」に統合されることにある(3)。「SH3」として知られる一つの領域は、長さ がアミノ酸55−70個分に相当する、プロリンに富む領域であり、「SH2」として知 られるもう一つのドメインは、長さがアミノ酸約100個に相当するホスホチロシ ン結合領域である。これら二つのドメインは、該タンパク基質の認識およびこれ との結合に関与するものと考えられている。第三のドメイン「SH1」は、約270個の アミノ酸で構成され、触媒反応に応答性のドメインである。これは、またエネル ギー源および燐酸塩ドナーとして利用される、ヌクレオシド三燐酸に対する結合 サイトをも含む(3)。SH2およびSH3に沿った、ミリスチル化およびパルミチル化 サイトを包含する他のドメインは、多重タンパク複合体の構成に 応答し、該複合体は、該触媒ドメインを正しいターゲットに導く(3，22，23)。 これら種々のドメインによる分子の識別は、X−線回折法およびNMR法を利用する ことによって研究されている(24−28)。 これらのドメインは、進化を介して交配しかつ適合して、大きなタンパクキナ ーゼ「群」を生成したものと思われる。1000個ものキナーゼが、哺乳動物のケノム においてコードされ(4)、かつ250個を越えるキナーゼが、すでに同定されている 。細胞内部に存在することが知られている、該多数のホスホリル化によって調節 された酵素および該多数のキナーゼが、迅速なシグナル増幅および多数の点にお ける調節を可能とする。 該キナーゼの第三の重要な特徴は、その応答の迅速さである。ホスホリル化お よび脱ホスホリル化の速度は、多くの細胞において極めて迅速であり(ミリセカ ンドのオーダー)、その結果迅速な応答および短時間の回復時間をもたらし、結 果として反復的なシグナル伝達を可能とする(5)。 該キナーゼのこれら特徴のために、該キナーゼは、極めて多岐に渡る細胞内シ グナル伝達メカニズムにおいて利用されている。例えば、成長因子、転写因子、 ホルモン、細胞周期調節タンパク、および多くの他の群に属する細胞レギュレー タが、そのシグナルカスケードにおいてチロシンキナーゼを利用している(12、1 3)。チロシンキナーゼは、そのタンパク基質上の一種以上のチロシン残基に、接 触的に燐酸塩を付着する。該チロシンキナーゼは、該細胞周期制御エレメントc- abl(14-16)、細胞質チロシンキナーゼドメインc-srcを含む表皮成長因子レセプ ター(12)、多くの免疫細胞機能に関与している非-レセプターチロシンキナーゼ( 13)、およびTyk2即ち該p91タンパクのホスホリル化に関与する細胞質チロシンキ ナーゼを包含する、多くの多岐に渡る機能を持つタンパクを含み、該p91タンパ クは、レセプター刺激の際にその核に転移され、転写因子として機能する(17)。 セリン/スレオニンキナーゼは、該キナーゼ群の残りの全てではないにしても、 その多くを構成し、これらはそのタンパク基質中のセリンおよびスレオニン残基 を接触的にホスホリル化し、かつこれらは同様に多岐に渡る役割を有する。これ らは、その270アミノ酸の触媒ドメインにおいて、チロシンキナーゼとの相同性 をもつ。このように、以下の議論は、より具体的にはチロシンキナーゼに 着眼しているが、該議論は、一般的にセリン/スレオニンキナーゼにも当てはま る。 不幸にも、シグナル伝達において、キナーゼをこれほどに有用なものとしてお り、かつ殆どの細胞機能に対して中心的なものとしているこれらの特徴は、その 研究並びに理解を、不可能ではないにしても、極めて困難なものとしている。該 キナーゼの重複タンパク特異性、その構造並びに触媒的な類似性、その数の多さ 、およびその応答の迅速性は、従来の遺伝学的および生化学的な技術を利用した 、そのインビボタンパク基質の具体的な同定を、不可能ではないにしても、極め て困難なものとしている。このことが、チロシンキナーゼ-媒介シグナル伝達に 関与する、該シグナルカスケードの解読にとって、主な障害となっている(4，6- 8)。 シグナル伝達カスケードにおける特定のチロシンキナーゼの関与を、詳しく調 べる努力は、インビボおよびインビトロでの、タンパク基質特異性の欠如のため に徒労に終わっている(4，8)。チロシンキナーゼの該触媒ドメインは、ドメイン 交換実験によって証明されているように(18−23)、固有の基質特異性を全くまた は殆どもたない。一つのチロシンキナーゼ由来の該触媒ドメインは、異なるチロ シンキナーゼのタンパク基質特異性を殆ど変化させずに、その中のドメインと置 換することができる(22)。 このキナーゼのインビトロでの貧弱な特異性は、所定のキナーゼのインビボで の機能がどうなっているかを推定することをも、不可能ではないにしても、困難 にしている。対象とする単離されたチロシンキナーゼは、しばしば多くのテスト タンパク基質を、同等の効率でホスホリル化するであろう(29)。この見かけ上の 貧弱な基質特異性は、またインビボでも見出されており、例えば遺伝子ノックア ウト実験等の多くの研究が、他の細胞チロシンキナーゼによる補償のために、解 釈可能な表現型を与えることはない(30，31)。 もう一つの複雑さは、多くのチロシンキナーゼが、それ自身もチロシンキナー ゼである、下流側および上流側のタンパクをホスホリル化することが報告されて いることであり、これは複雑な正のフィードバックループを可能とするかに思わ れるが、これによって、該カスケードの詳細な検査は、更に一層困難なものとな っている(1)。 インビボおよびインビトロ両者における、該酵素の役割を解読し、かつその機 能を理解するための、一つの重要な方法は、特異的な酵素阻害剤の使用である。 一種以上の化合物が該酵素を阻害することが明らかとなった場合、該阻害剤は、 該酵素の活性を調節するのに利用でき、またその低下作用を観測することができ る。このような方法は、介在する多くの代謝経路を解読する際の手段であり、ま た酵素速度論を学ぶ上で、また触媒メカニズムを決定する上で重要であった。 更に、このような阻害剤は、最も重要な薬理化合物として公知である。例えば 、アスピリン(アセチルサリチル酸)がこのような阻害剤である。これは、プロス タグランジン合成の第一段階を触媒する酵素を阻害し、結果として疾病の発症に 関与するプロスタグランジンの生成を阻害する(72)。伝統的な薬物の発見は、疾 患-原因タンパクと特異的に結合し、かつこれを不活性化するように工夫された 、化合物の設計並びに修飾として特徴付けられ、このような努力の相対的な成功 は、該ターゲットタンパクに対する該薬物の選択性および同様な酵素活性をもつ 非-疾患関連酵素に対する阻害性の欠如に依存している。 このような方法は、多くのヒト癌が、(例えば、原癌遺伝子が、遺伝子転座を 介して、癌遺伝子に転化された場合には)正常なタンパクの非調節性に起因して いるので、癌に対する治療法を開発するための有力な方法であると思われる。ま た、キナーゼは、有力なレギュレータであるので、該キナーゼは、極めて一般的 な原癌遺伝子となり、従って理想的なドラッグデザインのターゲットとなってい る。 選択的な阻害剤の設計法は、少数の類似酵素のみが該ターゲット生物中に存在 するに過ぎない場合、例えばバクテリアに対して特有のタンパクの阻害剤が、タ ーゲットとなり得る場合には、比較的単純である。しかしながら、不幸なことに 、該キナーゼ間の類似性とその数の多さとが、特定の阻害剤の開発および設計を 殆ど完全に無効にしており、また原癌遺伝子レベルでの、目的とする特定の薬理 的治療法を開発する多くの望みを阻んでいる。大多数の候補阻害剤が、特定の精 製されたキナーゼを、まず阻害するものとして同定される可能性があるものの、 多数のキナーゼを阻害するであろう。 しかしながら、このことは、少なくとも幾分かのキナーゼ特異性をもつ阻害剤 が発見できないことを意味するものではない。幾つかの天然生成物が、特定のキ ナーゼ群に対して比較的特異的であることが同定されているが、これらに基いて 、キナーゼ阻害に関する一般的な規則を導き出す試みは、成功していない。更に 、以下の実施例で示すように、多くの場合における特異性は、極めて制限されて いる。例えば、化合物ダムナカンタール(Damnacanthal)が、第2A図に示すように 、キナーゼp561ck(73)の「高活性の選択的阻害剤」であることを報告しており、こ の化合物は、該キナーゼに対する阻害定数(IC50)を有し、これはキナーゼsrcに 対する値よりも殆ど数倍低いものである（該IC50は、触媒活性を50％だけ減ずる のに添加する必要のある阻害剤の濃度である）。化合物PPI(第2B図）は、極めて 強力な(IC50=0.005μM)、該キナーゼlckに対する結合アフィニティーをもつが、 不幸なことに、該src群に属する他のキナーゼの阻害は、極めて類似している。 これは、殆ど同等のIC50(0.006μM)をもつキナーゼfynを阻害し、しかもキナー ゼhckに対して約４倍高いIC50をもつ(IC50=0.020μM)に過ぎない。該化合物CGP5 7148(第2C図)は、キナーゼabl(IC50=0.025μM)およびPDGFR(IC50=0.030μM)に対 して、「半-選択性」であることが報告されている(74)。それにも拘らず、莫大な 数のキナーゼおよびその関連する細胞の重要性を考慮し、また上記阻害剤がここ ２年間においてのみ報告されているに過ぎないことを考慮すると、選択的キナー ゼ阻害剤の発見もしくは設計の成功は、著しく制限される。 上記したこれら困難さは、科学者の単なる挫折感をはるかに越える意味を持ち 、科学者は該キナーゼカスケードおよびこれらカスケードおよびその他の細胞メ カニズムにおける個々のキナーゼの機能を解明する努力を無にした。キナーゼ活 性および機能のこのような理解は、幾つかのヒト疾患が、効果的に治療され、予 防されもしくは治癒される以前に本質的なことである可能性がある。例えば、30 年以上に渡り、該癌遺伝子bcr-ablが、重要なドラッグデザインのターゲットと なり得る、慢性骨髄性白血病の原因となるタンパクキナーゼであることが知られ ており、依然として明確に同定されていない(11)。この欠点にも拘らず、楽観す れば、上記の阻害剤CGP 57148は、報告されたことによれば、骨髄性白血病の 治療で使用するための、臨床的な試みの最中であるとされている。但し、インビ ボでのホスホリル化を遮断できる基質は、未知である。 これら難点の医学的意味は、更にラウス肉腫(RSV)によって示され、これは発 癌におけるキナーゼの役割を研究するための重要なモデル系になっている。繊維 芽細胞のRSV形質転換は、シグナルウイルス遺伝子生成物、上記タンパクチロシ ンキナーゼv-src(32)によって制御される。RSVを、あらゆる細胞中の、発癌活性 研究のための模範としているのは、繊維芽細胞のRSV形質転換中の、迅速な時間 的過程および顕著な形態的変化である。V-Srcの起源(33)、調節(3，8，34，35) 、および構造(25,27,36)は、活発に研究され、また十分に理解されている(8,37, 38)。しかしながら、この広範に研究されたキナーゼに関する中心的な問題は、 未解決のままである。即ち、その直接的な細胞基質が何であるのか。その触媒活 性の阻害は、形質転換を効果的に阻害するのか、あるいはその逆なのか。このよ うな阻害は、RSV形質転換に対する有効な治療法または予防法であるのか。不幸 なことに、上記のように、これらの疑問に対する回答は、容易には与えられない 。というのは、細胞性キナーゼの数が莫大であり(哺乳動物ゲノムの2％が、タン パクキナーゼをコードするものと予想されている(4))、かつチロシンキナーゼが 重複基質特異性を示し(8，39)、しかも触媒ドメインを分け合っていて、特異的 な阻害剤の設計を著しく困難にしている、ことと大いに関連している。 繊維芽細胞におけるv-Srcの発現は、50個に及ぶ細胞タンパクの、チロシンホ スホリル化をもたらす(37)。これら同一の基質は、また形質転換されていない繊 維芽細胞中の他のキナーゼによってもホスホリル化される(40)。形質転換された 繊維芽細胞の抗−ホスホチロシンタンパクブロット、繊維芽細胞の形質転換−欠 損v−Src突然変異体によるトランスフェクション、温度感受性v−Src突然変異体 、細胞性Srcの遺伝子のノックアウト研究、宿主−レンジ依存性Src突然変異体抗 −v−Src免疫沈殿法およびキナーゼ特異的阻害剤の使用を包含する、最も洗練さ れた生化学的かつ遺伝学的な技術さえも、v−Srcの直接的な基質の明確な同定に 導くことはなかった(包括的な概論については、参考文献(38)を参照のこと)。し かしながら、この状況は固有のものではなく、事実大多数の細胞性キナーゼに対 する該直接的な基質は、同定されないままである(8)。その上、 上で論じたように、個々のキナーゼを選択的に、あるいは関連する一群のキナー ゼさえも、選択的に阻害する化合物は、殆ど知られていない。 上記困難には威圧されるが、合理的なドラッグデザインの新規方法および組み 合わせによる有機合成は、十分な資源が与えられれば、キナーゼ特異的な阻害剤 の設計または発見を、実行可能なものとする。しかしながら、該キナーゼネット ワークが高度に縮退しており、かつ未知の様式で相互に関連しているので、キナ ーゼが攻撃して阻害すべき、多くの疾患に関するかなりの不確定さが存在する。 その上、所定のキナーゼの特異的阻害剤が、インビボまたはインビトロの何れか において、該疾患に何等かの影響を与えるであろうことについては、決して明ら かとはいえない。キナーゼは、著しく混然としているので、あるキナーゼの阻害 が、単にもう一つのキナーゼに「その位置を占めさせる」であろう、有意な機会が 存在する。従って、特定の阻害剤を設計しもしくは発見するための非常に困難な 努力がなされる前に、所定のキナーゼを阻害する、生化学的並びに細胞的作用を 決定するための、単純かつ直接的な方法に対する需要がある。 上記のことから、永きに渡り必要性が感じられていたものの、不十分であった 、どの細胞タンパクが個々のタンパクキナーゼによる作用を受けるかを同定する 方法に対する需要があった。このような方法は、また理想的には所定のキナーゼ の、そのタンパク基質に及ぼす相対的な活性の、定量的な測定をも可能とするも のであり、該方法は、例えば実際のまたは有力な薬物化合物がキナーゼ活性を調 節するか否か、あるいは如何にして調節するかを検出するのに使用できるもので ある。更に、個々のキナーゼまたはキナーゼ群の特異的阻害剤に対する需要もあ り、これらは(どのタンパクが、該阻害剤の存在下でホスホリル化されず、また より軽度にホスホリル化されるかを、探求することによって)タンパク基質を同 定し、キナーゼ媒介疾患を治療する薬物として使用するための、所定のキナーゼ 活性を迅速にダウンレギュレーションする、生化学的効果および表現型の効果を 研究するために、またより伝統的な阻害剤を設計しまたは開発するための多大な 努力が、妥当であることを確認するために利用することができる。以下で、より 一層詳細に説明するように、本発明は、第一に個々のキナーゼを高度に特異的に 阻害するための方法を提供し、ここで該キナーゼは、当該キナーゼの野生型また は他の組 み換え操作されていないキナーゼよりも一層迅速に、該阻害剤と結合するように 操作されている。本発明は、また該操作されたキナーゼおよび該キナーゼが適合 する阻害剤をも提供する。 更に、以下で明らかになるように、この方法は、該キナーゼと同様に、ある基 質の少なくとも一部を少なくとも一つの他の基質に、共有結合的に付着させる、 他の酵素の研究についても同様な利点を与えることから、より一層広範囲に渡り 適用できる。 本発明は、キナーゼおよび他の多重基質型酵素を組み換えて、野生型によって は容易に結合されない、阻害剤と結合できるようにすることを含む。これらと結 合できる変性基質および変異酵素を使用して、延長因子(41)およびシクロフィリ ンA(42)に対するレセプターを研究する。しかしながら、本発明以前には、少な くとも幾分かの触媒活性、および該阻害剤の不在下で、該レシピエント基質に対 する少なくとも幾分かの特異性を依然として維持したままで、ドナー基質の一部 または全てを、レシピエント基質に共有結合的に結合する多重基質型酵素が如何 にして阻害剤と結合するように組み換えできるか、あるいはこのような組み換え が可能であるか否かについては知られていなかった。本発明は、以下に説明する ように、これを実施することを可能とし、また本発明は最初に個々のキナーゼの 選択的な阻害に関する扉を開放し、これは該キナーゼカスケードおよび他の複雑 な触媒細胞メカニズムを理解するための重要な手段であるばかりか、これらのメ カニズムが作用し始める疾患における、治療法を提供することをも可能とする。 III．発明の概要 本発明は、単一のタンパクキナーゼを特異的に阻害することができ、しかも他 のタンパクキナーゼを同時に阻害することのない、物質並びに方法を提供するこ とによって、上記問題点に対する解決策を提供する。 第一の局面において、本発明はキナーゼおよび他の多重基質型酵素を、その野 生型によっては容易に利用されない変性基質を利用できるように、組み換え操作 することを含む。本発明は、更にこのように化学的に修飾されたヌクレオチド三 燐酸基質、これらの製法、およびこれらの利用法をも提供する。本発明の方法は 、 該組み換え操作されたキナーゼと共に、該変成された基質を使用して、どのタン パク基質が該キナーゼに作用するかを同定し、このような作用の程度を測定し、 かつテスト化合物が、このような作用を調節するか否かを、決定する方法を含む 。 更なる局面において、本発明は組み換え操作されたタンパクキナーゼを提供し 、該キナーゼは、これら酵素の野生型とは容易に結合することのない、阻害剤と 結合することができる。このような組み換え操作されたキナーゼ全てを製造し、 かつ使用する方法をも提供する。本発明は、更にこのような阻害剤、その製造方 法、およびその使用方法をも提供する。本発明のこれらの方法は、該組み換え操 作されたキナーゼと共に該阻害剤を使用して、どのタンパク基質が該キナーゼに 作用するかを同定し、このような作用の速度を測定し、かつこのような阻害の生 化学的および細胞的効果を決定する方法を含む。これらは、またこのような阻害 剤および組み換え操作されたキナーゼを使用して、どのキナーゼが疾患に関与す るかを評価することにも関連する。従って、これらキナーゼは、その野生型のよ り伝統的な特異的阻害剤を設計し、もしくは発見するための努力の課題となり得 、該特異的阻害剤は、該キナーゼ関連疾患または障害を治療する上で価値あるも のであることが立証されている。 更に、該方法では、また該組み換え操作されたキナーゼを、細胞または完全な 動物中に、好ましくは対応する野生型のキナーゼの代わりに挿入し、次いで該キ ナーゼに適合する該阻害剤を、該キナーゼと疾患との関連性を研究するための手 段として使用し、かつ最終的に該疾患の治療用の薬物として使用する。 本発明は、またより一般的には多重基質型酵素の組み換え操作された型にも関 連し、該酵素は、少なくとも一つの(ドナー)基質の一部または全体を、少なくと も一つの他の(レシピエント)基質に共有結合的に結合する。これらの組み換え型 は、これら酵素の野生型によっては容易に結合されない、変性された基質および 阻害剤を受け取る。 本発明は、またこのような組み換え酵素並びに該変性されたドナー基質を製造 し、使用する方法にも関連する。本発明のこの方法は、該組み換え酵素と共に、 該変性された基質および阻害剤を使用して、どの基質が該酵素に作用するかを同 定し、このような作用の速度を測定し、該変性された基質の場合には、該ドナー 基質の一部または全部が結合する、該レシピエント基質を決定し、このような作 用の程度を測定し、かつテスト化合物によるその調節の程度を同定しかつ測定す るための方法をも包含する。 阻害剤の場合には、該方法はこのような阻害を測定するためのものである。該 方法はまた、このような阻害剤および組み換え酵素を使用して、どの酵素が疾患 に関与する可能性があるかを評価することにも及び、従ってこれらの酵素は、そ の野生型の特異的阻害剤を設計し、もしくは発見するための努力の課題となり得 、該特異的阻害剤は、該キナーゼ関連疾患または障害を治療する上で価値あるも のであることが立証されている。更に、該方法では、また該組み換え操作された 酵素を、細胞または完全な動物中に、好ましくは対応する野生型酵素の代わりに 挿入し、次いで該酵素に適合する該阻害剤を、該酵素と疾患との関連性を研究す るための手段として使用し、かつ最終的に該疾患の治療用の薬物として使用する 。 本発明によれば、酵素の組み換えを通して、ある対象とするタンパクキナーゼ のヌクレオチド結合サイトと、他のキナーゼのヌクレオチド結合サイトとの間の 、構造上の識別を行うことを可能とする。この識別は、該組み換えられたキナー ゼが、ヌクレオチド三燐酸または該キナーゼの野生型または他のキナーゼとは容 易に結合しない阻害剤を利用することを可能とする。該阻害剤と関連する好まし い態様においては、使用される該阻害剤は、該キナーゼに対する「天然」のヌクレ オチド三燐酸基質に対して「オルソゴナル(orthogonal)な」、あるいは特異性の低 い阻害剤(例えば、該キナーゼの野生型と容易に結合するもの)に対してオルソゴ ナルなものである。以下でさらに議論するように、この用語「オルソゴナル(orth ogonal)」とは、該基質または阻害剤が構造の点では類似する(以下に説明するよ うに、幾何学的には類似するが、化学的には非類似であるものを含む)が、該野 生型と結合する能力を規定する様式において異なっていることを意味する。 本発明によって作成された組み換えキナーゼは、細胞中に存在する他の組み換 え操作されていないキナーゼによっては容易に利用されない、オルソゴナルなヌ クレオチド三燐酸基質を利用できるであろう。好ましくは、これは他のキナーゼ によっては実質的に利用されない、オルソゴナルなヌクレオチド三燐酸基質を利 用することができ、また最も好ましくは、該キナーゼは、他のキナーゼによって は全く利用され得ない、オルソゴナルなヌクレオチド三燐酸基質を利用すること ができるであろう。例えば放射性燐(P32)を使用して、該オルソゴナル基質上の 該燐酸基を標識し、次いで該標識した基質を、透過性とされた細胞または細胞抽 出物に添加することによって、該組み換えられたキナーゼの該タンパク基質が標 識され、一方で他のキナーゼのタンパク基質は、少なくとも低度に標識され、好 ましくは他のキナーゼのタンパク基質は実質的に標識されず、最も好ましくは、 これらは全く標識されない。 以下に与えられる説明および実施例は、始原型のチロシンキナーゼv−Srcの直 接的な基質をユニークに標識するための、この方法の利用について記載する。タ ンパクの組み換えによって、アミノ酸配列内に化学的相違が形成され、これは該 変性されたv−Srcのヌクレオチド結合サイトと、他のあらゆるキナーゼのヌクレ オチド結合サイトとの間に、新たな構造上の識別を与える。我々が組み換えを行 ったこのv−Srcキナーゼは、野生型キナーゼのヌクレオチド基質に対してオルソ ゴナルである、ATP類似体(A★TP)、即ちN6 -(シクロペンチル)ATPを認識する。オ ルソゴナルA★TP基質に対する特異性をもつ、v−Src変異体の生成は、[γ-32P]N 6 -(シクロペンチル)ATPを使用して、v−Srcの直接的な基質をユニークに放射性 標識することを可能とする。というのは、これは該組み換えられたv−Srcキナー ゼに対する基質として機能し得るが、実質的に他の細胞キナーゼに対する基質と して機能することはできないからである。 以下に与えられる詳細な説明および実施例は、始原型のチロシンキナーゼv−S rcの直接的な基質をユニークに同定するための、この方法の利用について記載す る。タンパクの組み換えによって、アミノ酸配列内に化学的相違が形成され、こ れは該変性されたv−Srcのヌクレオチド結合サイトと、他のあらゆるキナーゼの ヌクレオチド結合サイトとの間に、新たな構造上の識別を与える。作成されかつ ここに提示される、この組み換えられたv−Srcキナーゼは、より一般的なキナー ゼ阻害剤PP3：化合物NO4シクロペントイルPP3のオルソゴナル類似体と結合する 。このような阻害剤に対して特異性をもつv−Src変異体の生成によって、該変異 体を阻害することが可能となり、一方で同一のテスト系における他のキナーゼは 、実質的に阻害されず、またこの同一のキナーゼの野生型も阻害さ れない。 上記説明から明らかなごとく、本発明の目的の一つは、燐酸基ドナー基質とし て、オルソゴナルヌクレオチド三燐酸類似体を受け取る、変異タンパクキナーゼ を提供することにある。 本発明のもう一つの目的は、このような変異タンパクキナーゼをコードするヌ クレオチド配列を提供することにあり、また本発明の更なる目的は、このような 核酸配列の製法を提供することにある。 本発明の目的は、またこのような変異タンパクキナーゼを、例えばかかる核酸 配列を発現することによって、製造する方法を提供することにある。 同様に本発明の目的は、このようなオルソゴナルヌクレオチド三燐酸およびそ の合成法を提供するものであり、該三燐酸はN6-(シクロペンチル)ATP、N6-(シク ロペンチルオキシ)ATP、N6-(シクロヘキシル)ATP、N6-(シクロヘキシルオキシ)A TP、N6-(ベンジル)ATP、N6-(ベンジルオキシ)ATP、N6-(ピロリジノ)ATPおよびN6 -(ピペリジノ)ATP(27)を包含する。 更に別の本発明の目的は、あるテスト化合物が、一またはそれ以上のタンパク 基質に関して、タンパクキナーゼの活性を正または負に調節するか否かを決定す る方法を提供することにある。 より具体的に、かつ本発明の更なる局面によれば、本発明の主な目的は、阻害 剤と結合し、かつこれによって阻害される変異タンパクキナーゼを提供すること にあり、該阻害剤は、対応する野生型のキナーゼとはそれ程容易には結合せず、 あるいはこれによって容易には阻害されない。 本発明の他の目的は、このような変異タンパクキナーゼをコードする核酸配列 を提供することにあり、またこのような核酸配列の製法を提供することも本発明 のもう一つの目的である。 また、本発明の目的は、このような変異タンパクキナーゼを、例えばかかる核 酸配列を発現することによって、製造する方法を提供することにある。 更に、上記の如き阻害剤、例えば化合物N−4シクロペントイルPP3およびその 合成法を提供することも本発明の目的の一つである。 他の本発明の目的は、与えられたタンパクキナーゼに対する基質が何であるか を決定する方法を提供することである。 更に別の本発明の目的は、ある特定のキナーゼの特異的な阻害が、あるテスト 系、例えば細胞を含まない抽出物、細胞培養物、または生きた多細胞生物におけ る、生化学的効果または表現型の効果を発生するか否かを決定する方法を提供す ることにある。 本発明の更なる目的は、特定のキナーゼの阻害が、疾患の治療において、治療 価値を持つか否かを、決定する方法を提供することにある。 更に別の本発明の目的は、あるキナーゼの活性、速度論および触媒的なメカニ ズムに関する研究を、本発明の対応する変異体の阻害を研究することによって、 行う方法を提供することにある。 本発明の更に別の目的は、キナーゼ−関連疾患を、野生型の酵素をもつ生物を 好ましくは減少させ、最も好ましくは枯渇させた、罹患した細胞に、本発明の阻 害剤−適合性変異キナーゼを導入し、次いで該阻害剤を投与して、該疾患を媒介 する変異キナーゼの活性を、該疾患の原因または症状を軽減または排除するよう に調節することによって、予防しかつ治療する方法を提供することにある。 上記のおよび以下に与えられる本発明の詳細な説明に基いて、当業者は、本発 明がより一般的に、該キナーゼが行っているように、共有結合的にドナー基質ま たはその一部を、レシピエント基質に伝達する、多重基質型酵素を研究するため に利用できることを、容易に認識するであろう。本発明のこのような用途は、以 下の詳細な説明の項において更に記載される。 従って、本発明の更なる目的は、阻害剤と結合する、変異多重基質型酵素を提 供することにあり、該阻害剤は、その野生型の酵素または同様な活性をもつ他の 酵素と、それ程容易に結合する訳ではない。 本発明の他の目的は、このような変異多重基質型酵素をコードするヌクレオチ ド配列を提供することにあり、またこのような核酸配列の製法を提供することも 本発明の目的の一つである。 また、本発明の目的は、このような多重基質型酵素を、上記のような核酸配列 を発現させることによって、製造する方法を提供することにある。 本発明の目的は、更に上記のような阻害剤およびその製法を提供することにあ る。 もう一つの目的は、ある与えられた多重基質型酵素に対する基質がなんである かを決定する方法を提供することにある。 更に、本発明の目的は、特定の多重基質型酵素の特異的阻害が、テスト系、例 えば細胞を含まない抽出物、細胞培養物、または生きた多細胞生物等において、 生化学的効果または表現型の効果を発生するか否かを決定する方法を提供するこ とにある。 更なる本発明の目的は、特定の多重基質型酵素の阻害が、治療中の疾患におい て治療的価値を持つか否かを決定する方法を提供することにある。 更に別の本発明の目的は、ある多重基質型酵素の活性、速度論および触媒的な メカニズムに関する研究を、本発明の対応する変異体の阻害を研究することによ って、行う方法を提供することにある。 本発明の更なる目的は、多重基質型酵素媒介疾患を、野生型の酵素をもつ生物 を、好ましくは減少させ、最も好ましくは枯渇させた、罹患した細胞に、本発明 の阻害剤−適合性多重基質型酵素を導入し、次いで該阻害剤を投与して、該疾患 を媒介する変異酵素を、該疾患の原因または症状を軽減または排除するように調 節することによって、予防しかつ治療する方法を提供することにある。 本発明のこれらおよびその他の目的は、詳細な説明、実施例、および以下に示 す請求の範囲から、当業者には明らかとなろう。 IV．図面の簡単な説明 第１図は、v−Src、XD4(残基77−225の欠損をもつ)、グルタチオンS-ランスフ ェラーゼ(GST)-XD4融合タンパク、およびGST-XD4融合タンパク二重変異体(V323A ，I338A)のタンパクドメイン構造を、模式的に示した図である。 第２図は、N6位に結合した一個の「X」をもつアデノシン三燐酸(ATP)の模式的な 図であり、また下方のボックスにおいては、実施例に記載した、オルソゴナルAT P類似体各々の「X」の位置を占めている12個の側鎖(これらは常に太文字で示され る数値1−12で表される)を、模式的に示すものである。 第３図は、ATPまたはATP類似体(A★TPs)の一種により、マウスリンパ細胞 の細胞溶解物を処理した後の、タンパクチロシンホスホリル化のレベルを示した 、抗−ホスホチロシン免疫ブロットである。 第４図は、cAMP依存性タンパクキナーゼ(1ATP)中の、ATP結合ドメインを示す 、X−線モデルの詳細な図である。 第５図は、(a)XD4およびGST-XD4(V323A，I338A)を表す、細胞溶解物の抗−ホ スホチロシンブロット、(b)細胞溶解物が、放射性標識されたATPのみまたは放射 性標識されたN6(シクロペンチル)ATPのみを与える場合の、ホスホリル化のレベ ルを示すオートラジオグラム、および(c)放射性標識されたATPおよび放射性標識 されたN6(シクロペンチル)ATP(A★TP(8))による、GST-XD4およびGST-XD4(V323A ，I338A)の自己ホスホリル化を示すオートラジオグラムである。 第６図は、ATPおよび該12個のATP類似体各々が、放射性標識されたATPによる 、GST-XD4およびGST-XD4(V323A，I338A)によって触媒されたホスホリル化を阻害 する相対的な度合いを示す、棒グラフである。 第７図は、燐酸基ドナー基質として、放射性標識されたATPおよび放射性標識 されたN6(シクロペンチル)ATPの何れかが与えられた場合の、幾つかのv−Src位 置338における単一変異体による自己ホスホリル化のレベルを示す、オートラジ オグラムである。 第８図は、細胞内のどのホスホリル化基質が、特定のキナーゼ(ここではv−sr c)によってホスホリル化されたかを決定するための、本発明の方法を示す模式的 な図である。 第９図は、本発明の組み換えられたキナーゼが、他のキナーゼの存在下におい ても、どのようにして本発明の阻害剤によって阻害されるか、および該キナーゼ のタンパク基質を明らかにするのに使用できるかを示す、模式的な図である。 第10図は、３種の公知のキナーゼ阻害剤、ダムナカンタール、PPIおよびCGP57 148に関する化学的構造を、いくつかのキナーゼに関する阻害定数(IC50)の該略 と共に示す図である。 第11A図は、アデノシンおよびPP3のコア構造を示す図であり、また 第11B図は、PP3のN4窒素に付加して、IC50値を第１表に示した、該阻害 剤候補化合物を製造することのできる、幾つかの嵩高い置換基の構造を示す図で ある。 第12図は、N−4シクロペントイルPP3の化学構造および野生型のv−Srcまたは その変異体(I338G)の何れかの存在下で、N−4シクロペントイルPP3の存在によっ て放射性標識された、泳動タンパクのオートラジオグラムを示す図である。 第13A−C図は、本発明に従って調製されかつテストされた、付随的な阻害剤類 似体を示す図である。 第14A図：a)細胞シグナル発生をデコンボリューション(deconvolute)するため に、小分子タンパクキナーゼ阻害剤を使用したことに関連する特異性の問題を、 模式的に示す図である。キナーゼ触媒ドメイン(赤い卵型)が、高度に保存されて いる。かくして、有力な阻害剤の大部分は、密接に関連したキナーゼの活性を遮 断し、かつキナーゼ活性によって媒介される経路を広範にダウンレギュレートす る。b）本明細書に記載する、選択的にタンパクキナーゼを阻害する方法を模式 的に示す図である。変異を形成する空間は、選択されたキナーゼ(Src)のATP結合 サイトに導入される。この変異は、Src内に活性サイトのポケット(ノッチ)を生 成し、これは合理的に設計された小分子阻害剤によって、固有の様式で認識でき る。この阻害剤は、嵩高い化学基(突起)を含み、該基はこの阻害剤を、野生型タ ンパクキナーゼに対してオルソゴナルにする。該相補的キナーゼ/阻害剤の設計 は、この状況で全細胞の該ターゲットキナーゼの高度に選択的な阻害を可能とす る。 第15図:a)N-6シクロペンチルオキシアデノシン(1)の構造。b）ピラゾロ[3,4-d ]ピリミジン阻害剤類似体の構造。２は、Hanefeld等の方法に従って製造した。( I)RCOCl(10当量)、ピリジン、5℃で１時間、次いで22℃で１時間加温、(ii)LiAl H4(3.0当量)、アルゴン雰囲気下で乾燥THF、0℃にて30分間、次いで30分間加熱 還流。全ての化合物は、1H NMR(300MHz)および高解像度のマススペクトル法(EI) によって特徴付けした。 第16図：a）クエルセチン(5)およびAMP PNP(6)の化学構造。b)src群のキナー ゼ活性サイトにおける、２の予想された結合配向。AMP PNP(赤)と結合し たHckおよびクエルセチン(青)と結合したHckの結晶構造は、該Hckタンパク骨格( 白)に従って重ねられた。引き続き、2(黄色)の構造は、２のピラゾロ[3,4-d]ピ リミジンリング系を、該AMP PNPのアデニンリングと重ねあわせることによって 、該キナーゼの活性サイトに結合された。C)２のN-4とsrc群のキナーゼにおける 残基338の側鎖との間の予想された密接な接触。分子２は、第3b図におけるよう に、該src群のキナーゼHckの該ATP結合サイトに係留されている。該スレオニン3 38側鎖および２の原子は、その基本的な構成に従って色分けされており(緑=炭素 、青=窒素、赤=酸素、白=水素)、また該Hck骨格は、紫で示されている。該スレ オニン側鎖のメチル水素は、図示されていない。この像は、プログラムInsight IIを使用して作成した。 第17図：阻害剤類似体3gは、B細胞レセプター媒介チロシンホスホリル化を阻 害しない。マウス脾臓細胞を、1.1％ DMSO(レーン1-2)、100mMの3gの1.1％DMSO 溶液(レーン3)、または100mMの２の1.1％DMSO溶液(レーン4)と共にインキュベー トした。B細胞刺激(レーン2−4)を、10mM/mlのヤギ抗−マウスIgMの添加によっ て開始させた。細胞タンパクを、10％PAGEによって解像し、ニトロセルロースに 転写し、ホスホチロシン(4G10)に対するモノクローナル抗体により免疫ブロット 処理した。 第18図：阻害剤3gは、I338G v−Src中のp36ホスホリル化を遮断するが、WT v −Src形質転換NIH3T3繊維芽細胞のホスホリル化を遮断しない。形質転換されて いないNIH3T3細胞(レーン1)、WT v−Src形質転換NIH3T3細胞(レーン2−3)、およ びI338G v−Src形質転換NIH3T3細胞(レーン4−5)を、1.1％DMSO(レーン1，2およ び4)または100mMの3gの1.1％DMSO溶液(レーン３および5)と共にインキュベート した。12時間後に、該細胞を溶解した。ホスホリル化レベルを、第４図に示すよ うに測定した。 第19図：I338G v−Src形質転換繊維芽細胞は、選択的に平坦な形態を獲得し、 かつ3gと共にインキュベートした際に、選択的にアクチンストレス繊維を再度獲 得する。形質転換されていない(a-b)、WT v−Src形質転換(c,d,g,h)およびI338G v−Src形質転換(e,f,I,j)NIH3T3繊維芽細胞を、1.1％DMSO(a-c,e,g.I)または10 0mMの3gの1.1％DMSO溶液(d,f,h.j)の何れかによって処理 した。48時間後に、細胞を写真撮影し(a，c-f)ファロイジン(phalloidin)-FITC で染色し、また蛍光顕微鏡によって可視化(b,g-j)した。 V．発明の詳細な説明 第９図： 本図は、以下においてSrcタンパタキナーゼの基質を発見するために、本発明 で使用する、キナーゼ基質を同定するための実験を模式的に示す図である。本図 の上部における卵型は、矢印に隣接するタンパクキナーゼによってホスホリル化 される、タンパクキナーゼ基質を表す。線で結ばれた数個の卵型を含む該タンパ クキナーゼは、タンパクキナーゼ(Src，Fyn，Lck)の「Src−群」の構成員である。 一つのキナーゼ(Src)は、切り取られたノッチを含み、これはこのキナーゼのア デニン結合ポケットに余分の空間を生成する、I338G変異を表す。このキナーゼ 上の記号は、そのオルソゴナル阻害剤を表し、該阻害剤は、突起を含み、該突起 はその固有の阻害によって生ずる、該Src I338Gキナーゼにおける該変異を補充 する。一個の大きな丸い卵型と二つの突出する針状の部分をもつこのキナーゼは 、F-アクチン依存性タンパクキナーゼ(FAK)である。ただ一つの卵型をもつタン パクキナーゼは、セリンまたはスレオニン特異的タンパクキナーゼ群の構成員で ある。小さなPを含む、矢印の下方の卵型は、該タンパクキナーゼによる作用後 の、ホスホリル化された(P)基質を表す。本図の下部のシミュレートされたゲル は、野生型のSrcの代わりに、全ての野生型キナーゼまたは一つの変異キナーゼ( Src−I338G)の何れかを発現する細胞を、該オルソゴナル阻害剤で処理した場合 に、予想される結果を表す。該阻害剤は、該細胞中に存在するリンタンパクに何 等の作用も及ぼさないはずであり、該細胞は該変異Srcキナーゼを発現せず(ゲル の左側の同等なパターン)、また幾つかのリンタンパクは、該阻害剤による、該 変異体発現細胞の処理後には、存在しないはずである(右側のゲル)。 本発明の阻害剤 第11Aおよび11B図は、種々の嵩高い置換基を持つ構造を示す図であり、該置換 基は、PP3のN−4またはアデノシン二燐酸のN6、もしくはアデノシン一 燐酸のN6、またはアデノシン(特に、N6シクロペンチルオキシアデノシン)に付加 して、本発明の組み換えられたキナーゼである、該変異キナーゼv−Src(T120G) の阻害剤を生成する場合に使用される。これら阻害剤の合成並びに阻害定数は、 以下の実施例12で議論する。 このような阻害剤は、該キナーゼおよび他のキナーゼの、他の有用な変異体を 開発するための研究において、および本明細書の至る個所に記載されている幾つ かの方法にとって有用である。しかしながら、本発明の範囲は、これら特定の阻 害剤の使用に制限されず、また当業者は多くの他の可能な構造が、本明細書に記 載のものと置換でき、また代替品となり得ることに気付くであろう。 例えば、種々の、簡単な、およびより複雑な脂肪族または芳香族基が、ADPのN6 位置またはPP3のN4位置に付加できる。さらに、本発明の阻害剤は、該N6位置に おけるヌクレオチドの変性または該N4位置におけるPP3の変性に制限されない。 このような化合物の種々の位置で変性するための化学的手段は、公知であり、得 られる誘導体の全ては、本発明の範囲内に入り、またそのリング構造における変 更または置換を行うことさえ可能である。例示的な変異体をここに与え、また第 13図を特に参照するが、該図には類似体およびその活性に関連するデータ両者を 示す。勿論、このような阻害剤の使用は、該キナーゼのタンパク配列の、種々の 位置を変更して、これらと結合するであろう組み換えキナーゼを生成することが 必要とされる可能性があるが、このような種々の変更も、本発明の範囲内にある 。 更に、本発明の阻害剤が、ADPおよびPP3誘導体に制限されるものではないこと に注意することも重要である。例えば、このような阻害剤として、他の天然ヌク レオチド燐酸ドナー基質の誘導体を利用することも可能であるはずである。幾つ かのキナーゼを研究するためには、種々の類似の塩基が、実際に好ましい可能性 がある。例えば、いくつかのキナーゼが、燐酸基ドナーとしておよびエネルギー 源としてGTPを利用して、このようなキナーゼの組み換え型に対する阻害剤を生 成することは公知であり、グアノシン二燐酸の類似体が適している。更に、該天 然基質と関連する化合物(例えば、他の塩基)および該基質に対して化学的には無 関係の化合物が、予想に反して、活性サイトに結合し、かつ(本発明の目的 にとっては不要であるが)該酵素による化学的触媒作用を通して、他の基質に作 用され、またはこれに作用する可能性がある。しばしばこれらは、該天然基質と 同様に、またしばしば異なる様式で触媒反応に関与する。このような化合物およ びその誘導体は、これらに対してオルソゴナルである阻害剤を設計するための適 当な出発点であり、これらも本発明の範囲内にある。同様に、他の公知のキナー ゼ阻害剤を、構造を第10図に見ることができるような、本発明の阻害剤の合成の ための開始点として使用することができる。勿論、一般的には未知の阻害剤の誘 導体でさえも、一旦同定されれば、本明細書に記載し、その一部となっているよ うに、本発明の阻害剤を設計するための、適当なコア構造である。 更に、本発明の阻害剤は、化学的な合成手段によって製造されるものばかりか 、天然に見られ、かつ該役割(その幾つかについては、上で論じた)を果たし得る 化合物をも包含する。更に、当業者は、ここに記載するもの以外の他の変形も存 在し、またそれらも本発明の範囲内にあることを理解するであろう。 本発明で使用するための候補である、該阻害剤は、有利にスクリーニングして 、これらが野生型のキナーゼによって受け取られる程度を決定することができ、 該スクリーニングは、以下の実施例13に示すような手順によって、あるいは本明 細書の実施例９に示すような、タンパクキナーゼに富む細胞または細胞群の使用 を含む手順によって実施される。このようなアッセイによって、各阻害剤が、該 組み換えキナーゼよりも低い程度に、野生型キナーゼと結合するか否か、あるい は好ましくは該野生型キナーゼが、該阻害剤と実質的に結合しないかどうか、あ るいは最も好ましくは該阻害剤と全く結合しないかどうかを決定することができ る。全く容易には結合しないこれらの基質に関連して、対象とする該キナーゼを 、これらにより容易に結合するように組み換える試みは有益である。勿論、該組 み換えキナーゼをまず製造し、次いでこれを該野生型キナーゼと共にアッセイし て、これが該野生型よりも良好に、所定のオルソゴナル基質を利用するか否かを 決定することができる。これは、実施例13で使用した方法である。しかしながら 、多くの状況の下では、上記のように予備スクリーニングすることが好ましい。 勿論、他のアッセイ法も当業者には明らかであり、またこのようなアッセイの利 用は、本発明の範囲内にある。 組み換えキナーゼ キナーゼを再度組み換えして、野生型のチロシンおよびセリン/スレオニンキ ナーゼの存在下で、その真正の基質をユニークに標識する上で満たすべき、いく つかの基準がある。該組み換えキナーゼは、（1）野生型タンパクキナーゼによ ってはさほど容易に利用されない、ATP類似体(A★TP)を受け取り、好ましくは野 生型キナーゼによっては実質的に利用されないA★TPを受け取り、最も好ましく は野生型キナーゼによっては全く利用されないA★TPを受け取り、（2）好ましく は、高い触媒効率をもつA★TP類似体を利用し、かつ(3)好ましくは、天然のヌク レオチド基質(ATP)に対して低い触媒活性をもち、結果として細胞レベルのATP(1 −2mM)の存在下で、該突然変異キナーゼは、該燐酸基ドナーとして、優先的にA★ TPを利用する。このような組み換えキナーゼを、該野生型キナーゼのタンパク 基質特異性の研究で使用する場合には、これらの基準は、該キナーゼのタンパク ターゲット特異性を実質的に変えること無しに満たす必要がある。 同様に、キナーゼを再度組み換えして、本発明の阻害剤によって阻害されるよ うにするためには、いくつかの基準を満たす必要がある。該組み換えキナーゼは 、（1）野生型キナーゼとはさほど容易に結合しない、阻害剤と結合し、好まし くは該阻害剤は野生型のキナーゼと実質的に結合せず、また最も好ましくは野生 型キナーゼとは全く結合せず、（2）好ましくは該組み換えキナーゼは、高いア フィニティー(即ち、低いIC50)で該阻害剤と結合する。該阻害剤が、該組み換え キナーゼに対応する該キナーゼの野生型と結合するか否かは、一般的には特に重 要である訳ではない。というのは、このような結合並びに結果としての阻害が、 該組み換えキナーゼの阻害を増大するからである。しかしながら、該キナーゼの 野生型が、他の野生型のキナーゼよりも良好に該阻害剤と結合しないことが、最 も可能性が高い。阻害性の組み換えキナーゼを、該野生型のキナーゼのタンパク 基質特異性を研究するのに使用し、あるいは以下で更に議論するように、遺伝子 療法または他の手段によって、該キナーゼの野生型を置換するのに使用する場合 には、対応する野生型と比較して、該組み換えキナーゼのタンパクターゲット特 異性を変更すること無しに、上記の基準を満たすことが好ましい。 本発明を開発した際の技術の視点から見ると、これら基準を同時に満たすこと が可能であるか否かを、予測することはできなかった。事実、このことは疑問で あった。というのは、組み換えられたATP結合サイトが、第二の基質結合サイト と極めて近接しているからである。しかし、以下の実施例に示すように、好まし い基準を含む、これら基準の全てが、記載されたv−Src変異体を作成し、これら にN6(シクロペンチル)ATPを与え、かつこれらをN4−シクロペンチルPP3を用いて 阻害した場合には、同時に満足された。 実施例１は、12個のATP類似体を記載し、これらは、変異体v−Srcに関する研 究で使用され、以下の実施例において説明される。これらのオルソゴナルATP類 似体は、このおよび他のキナーゼの、その他の有用な変異体を開発することを目 的とする研究において、また本明細書の至る部分に記載されている、いくつかの 方法にとって有用である。しかし、本発明の範囲は、これら特定のATP類似体に 制限されることはなく、また当業者は多くの他の可能なオルソゴナル基質が、本 明細書に記載の、置換でき、もしくはその代用品となり得ることを認識するであ ろう。例えば、異なる、及びより複雑な脂肪族または芳香族基を、ATPのN6位に 付加することができる。更に、本発明のオルソゴナル基質は、N6位におけるヌク レオチドの変性に制限されない。アデノシン上の種々の位置における変性のため の化学的手段は公知であり、これらのいずれも本発明の範囲内にあり、またヌク レオチドのリング構造を変更し、置換することさえ可能である。勿論、このよう なオルソゴナル基質の使用は、該キナーゼのタンパク配列の、種々の位置を変性 して、これらに結合する組み替えキナーゼを製造することが必要となる可能性が あるが、このような種々の変性も、本発明の範囲内にある。 更に、本発明のオルソゴナル基質がATP誘導体に限定されないことに注目する ことは重要である。種々のキナーゼを研究するためには、実際に種々の類似体塩 基が好ましい。例えば、いくつかのキナーゼが、燐酸基ドナー基質およびエネル ギー源として、GTPを利用することは、公知であり、このようなキナーゼの研究 のためには、グアノシン三燐酸の類似体が好ましいであろう。それにも拘らず、 該天然基質とは化学的に無関係の化合物が、しばしば活性サイトと結合すること が出来、かつ該酵素による、化学的触媒反応を介して、他の基質によって作用さ れ、もしくは該基質に作用し得ることは、周知である。しばしば、これらは、 該天然の基質と同一の様式で、またしばしば異なる様式で、該触媒反応に関与す る。このような化合物およびその誘導体も、また本明細書で使用する、用語「天 然基質」及び「オルソゴナル基質」の範囲内にある。 更に、本発明のオルソゴナル基質は、化学的合成手段によって製造されるもの に制限されず、天然において見出すことが出来、かつそのような役割を演じるこ とのできる化合物をも包含する。当業者は、ここに記載したもの以外の変法が存 在し、かつこれら全てが本発明の範囲内に入ることを理解するであろう。 本発明で使用するための候補である、該オルソゴナルヌクレオチドを、有利に スクリーニングに付して、以下の実施例２に記載のような、スクリーニング法を 利用して、これらが野生型のキナーゼによって受け取られる程度を決定すること ができる。このようなアッセイによって、各オルソゴナル基質が、このようなキ ナーゼに対する正常な基質よりも低い程度にて、野生型キナーゼによって受け取 られるか否かを、あるいは好ましくは、該基質を実質的に受け取らず、あるいは 最も好ましくは、これを全く受け取らないことを、決定することができる。容易 に受け取られることのない、これらの基質に関連して、対象とする該キナーゼを 、より一層容易にこれらを受け取るように組み替える試みを行うことは価値ある ことであり得る。勿論、まず組み替えキナーゼを製造し、次いで野生型の酵素と 共にこれをアッセイして、これが、該野生型のキナーゼよりも良好に、所定のオ ルソゴナル基質を利用するか否かを、決定することができる。しかし、多くの状 況のもとでは、実施例２に記載したような、予備スクリーニングが好ましいであ ろう。勿論、他のアッセイ法も、当業者には明らかであり、このようなアッセイ の利用も、本発明の範囲内にある。 組み替えv−Srcの設計は、以下の実施例３で説明する。記載されるように、該 組み換え型は、全部ではないが、殆どのキナーゼに見られるものと相同である、 ドメインを持つ、他のキナーゼの結晶構造を参照して、設計される。明らかなご とく、ここに記載される、例示的な変異キナーゼは、タンパクキナーゼの全配列 を含むのではなく、そのフラグメントとして構成されている。しかし、完全な配 列を使用した場合の性能と、実質的な差はない。勿論、概念および実施可能性は 、フラグメントまたは全キナーゼの何れを使用したかとは無関係に、同一であり 、 これら両者は、本発明の範囲内にある。それ故に、該用語「キナーゼ」とは、請求 の範囲を解釈する場合を含めて、全酵素またはそのフラグメントを包含するもの と理解すべきである。 この方法を利用して、殆ど全ての他のキナーゼの、同様な変異体を設計するこ とが可能である。これを実施する方法は、以下の工程：(a)同等なまたは同種の 酵素の燐酸ドナー基質、または公知のキナーゼ阻害剤(これは、キナーゼに対し て非―特異的であり得、一般的にキナーゼに対して特異的であり得るが、該キナ ーゼに対しては特異的でなくてもよく、あるいは該キナーゼに対して特異的であ ってもよい)と結合した該酵素の結晶構造から、グリシン以外の一種以上のアミ ノ酸を同定し、ここで該アミノ酸は、該結合燐酸ドナー基質または阻害剤上のあ る置換基と十分に近接していて、椎定上のオルソゴナル阻害剤中の、該置換基と 結合した嵩高い置換基の侵入を、立体的に制限しており、および(b)該野生型の タンパクキナーゼをコードするヌクレオチド配列を、該同定されたアミノ酸の一 種以上をコードする、該ヌクレオチドトリプレットが、該同定されたアミノ酸よ りも立体的に嵩高くない側鎖をもつ、アミノ酸をコードするヌクレオチドトリプ レットに転化するように、変異形成する工程を含む。 上記の方法は、導入の立体的制限、または排除を、どのアミノ酸が変更される か、および如何にこれらを変更するかを決定するための基準として利用する。し かし、本発明は、このようには制限されない。また、キナーゼのオルソゴナル基 質と結合する能力を、他の因子、例えば疎水性、親水性、イオン結合または反発 、水素結合、該酵素とオルソゴナル基質上の求電子基との間の共有結合形成等を 考慮して、該キナーゼを組み換えすることも可能である。 本発明を利用したタンパクキナーゼの研究は、多くの異なるキナーゼのドメイ ン構造、およびその一般的な相同配列に関連する莫大な知見によって、大幅に簡 単化される。"The Protein Kinase Fact Book"(71)は、まさに数百のタンパクキ ナーゼの３つの機能的ドメインに関するタンパク配列データを与え、これと共に 、主な文献において入手できる配列情報は、本発明の該キナーゼに対する、更な る応用を更に一層容易にするはずである。同様な情報は、他の多重基質型酵素に ついて入手でき、これはその研究および本発明によるその利用を、容易にする 本発明の好ましい方法は、基質類似体および変異タンパクキナーゼの合理的な 設計を包含するが、これら両者は、また組み合わせ法として知られている方法を 利用することによって製造することも可能である。有機化合物を合成するための 、多数の組み合わせ法がある。このような方法の一つを利用すれば、逐次的な化 学的工程を使用して、樹脂ビーズ上でヌクレオシド類似体を合成し、次いでホス ホリル化に付して、そのヌクレオチド三燐酸を製造する前に、該樹脂から該類似 体を遊離させる。このような方法を利用して、v−Srcキナーゼ、他のタンパクキ ナーゼ、または他の多重基質型酵素の変異体に対する、推定上のオルソゴナル基 質のライブラリーまたは集団を形成した後に、該集団またはライブラリーを、特 に好ましい結合または触媒特性について、スクリーニングすることができる。こ れは、このような推定的オルソゴナル基質の構造、形状および電子的特徴の、よ り一層十分な研究を可能とする。更に、所定の基質の多数の類似体を検討した場 合に、予想外のことに、有効な基質または阻害剤が見出されることがしばしばあ る。その上、該最良の化合物を具体的に設計するのに、十分に理解されたパラメ ータのみを使用した場合に、しばしば最も望ましい化合物が、選択されないこと もある。 また、タンパク変異体を製造するための、当分野で公知の多数の組み合わせ法 がある。これらは、「エラープローン(error prone)」ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) 、「セクシュアル(sexual)」PCR，または該タンパク配列における固定位置にラン ダムなヌクレオチドをもつプライマーを使用するPCR法を含む。他の配列ランダ ム化法は、cDNAまたはプラスミドDNAまたはバクテリアのMutD型の菌株の化学的 な変異形成体を使用する方法を含み、これらは発現するタンパク中に、ランダム に変異を誘発することが知られている。ランダムに変異形成されたタンパクキナ ーゼまたは他の多重基質型の酵素を製造するために、このような方法を利用し、 次いで特定の高い活性をもつ、特定のオルソゴナル基質をもつ、あるいは上記の 章において記載したように、組み合わせ合成法を利用して製造した、該推定的な オルソゴナル基質の幾分かまたはその全部を持つものについて、スクリーニング することによって、本発明を実施することができる。以下の実施例に記 載するアッセイ法は、この目的にとって適しており、また当業者は容易に別の方 法を工夫することができよう。 小さな有機分子の構造的空間およびタンパク配列の空間を探求するために開発 された、これらの方法および他の方法は、ここに記載した技術的応用のために特 に有用であり、ここでは我々は、該タンパク御階推定上の阻害剤両者を変更また は改変して、最良の可能な非−天然(即ち、オルソゴナル)適合を見出す。任意の これらの方法またはここに記載した任意の他の方法を利用することも、本発明の 範囲内にある。 一個の組み換えキナーゼの合成を、実施例４に記載する。この努力の着眼は、 ATPの該N6の約４オングストローム内の、アミノ側鎖にあるが、この距離につい て不思議なことは何もない。約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10オングストロー ム、またはそれ以下、それ以上、またはその中間の距離内にある側鎖をもつ残基 も、変性のターゲットと考えるべきである。約3〜約６オングストロームの側鎖 をもつアミノ酸は、好ましいターゲットであろう。一般的に、密接した側鎖をも つこれらのアミノ酸は、より間隔の大きな側鎖をもつものよりも好ましい。とい うのは、これらが、該阻害剤上の該オルソゴナル置換基に、最大の立体障害また は他の障害を与えるものと予想されるからである。また、極めて近接した側鎖を もつものが、最も好ましい。 勿論、実施例で使用する方法以外にも、今日ではサイト特異的変異形成等の、 遺伝子配列を変更しかつ発現するための、他の多くの方法があり、我々は、将来 において他の方法が開発されるであろうことを期待する。これらの任意の方法ま たは全ての方法の利用が、本発明の範囲内に入る。更に、今日では恐らく遺伝子 操作法の利用が、このような変異体の調製のための好ましい方法であるが、これ が唯一の方法ではない。例えば、ある組み替えられたキナーゼを設計し、次いで 化学的なペプチド合成のための、公知の方法によって、該タンパクを合成するこ とができた。あるいは、一又はそれ以上の側鎖が、サイズ、疎水性、または他の 特徴を変化させ、より容易にオルソゴナル基質を利用するように、特定の位置に おいて所定の酵素を化学的に変性することができる。このような方法の利用全て が、本発明の範囲内に入る。 実施例７は、該組み換えキナーゼが、そのタンパク基質特異性を保持するか否 かを決定するために実施することのできるテストを記載する。該野生型タンパク 基質特異性は、実施例におけるように、該キナーゼがどの基質に作用するか、あ るいはその作用がどの程度であるかを研究するために、該組み換えキナーゼを使 用することが最終目標である場合には、実質的に維持されることが好ましく、ま た例えば遺伝子操作によって、インビボで対応する野生型のキナーゼと置換する のに、あるいはその代用品として、該キナーゼを使用する。しかし、このような 目的にとっては、該キナーゼが依然としてその野生型キナーゼと同一の基質を識 別することが重要であり、これが同一の速度でこれを識別することは重要ではな い。即ち、該キナーゼが、緩慢に、迅速に、あるいは高率でもしくは低率で識別 を行う場合には、該組み換えキナーゼは、依然としてこのような目的にとって実 質的な価値を持つ可能性がある。該組み換えキナーゼが、該野生型酵素と同一の タンパク基質を認識しない場合には、これは野生型酵素の研究の際の価値は低い が、依然としてタンパクのホスホリル化および一般的なキナーゼの研究における 実質的な価値を持つ可能性があり、また依然として本発明の範囲内にある。 勿論、実施例７で使用する特定のアッセイは、有用ではあるが、必ずしも利用 する必要はない。当業者は、容易に匹敵する情報を与えることのできる、他のア ッセイを開発し、もしくは採用することができよう。 一旦、所定のオルソゴナル基質類似体を受け取る、あるいは所定の阻害剤によ って阻害される、変異キナーゼを製造すれば、実施例５および６に記載したよう な、古典的な酵素の運動学的分析を利用して、特徴付けすることができる。また 、実施例８に示すように、該変異体が該類似体によって阻害される、あるいはこ れを利用することのできる程度、および該類似体が、野生型の該酵素に対する、「 死んだ」(即ち、完全に不活性な)阻害剤であるか否か、を研究することができる 。勿論、実施例で使用する該方法が、唯一の方法ではなく、これらの研究は、別 の方法を利用して行うことが出来、また当業者は、容易に別法を工夫することが できる。 実施例10に示すように、本発明の阻害剤によって阻害される変異体を提供する ためには、多数のアミノ酸置換を行う必要はない。変異体GST−XD4(I338A) およびGST−XD4(I338G)の場合におけるように、単一のアミノ酸変化を行うこと のみが必要である。 キナーゼ基質を同定するためのアッセイ 本発明の極めて簡単な態様を、以下に示す。まず、該オルソゴナル阻害剤を、 該組み換えキナーゼに対して付加された遺伝子を発現するか、あるいは対象とす る該キナーゼの正常な複製体を発現する、対象とする２種のサンプルに添加する 。この阻害剤は、シグナルカスケード(例えば、透過性にされた細胞、細胞抽出 物、または自然な状態でこれらに対して透過性である細胞)の活性化の前、後ま たはその間に、添加することができる。次に、細胞または細胞画分中のホスホリ ル化されたタンパク全ての検出を、放射性燐[γ−32P]ATPを使用することによっ て、またはホスホリル化されたアミノ酸に対して特異的なモノクローナル抗体を 使用することによって可能とする方法を、対象とする該キナーゼの特異的阻害の 結果を明らかにするために使用する。対象とする該キナーゼの正常な複製物を発 現する細胞において、元のキナーゼの該タンパク基質が、該阻害剤の存在下にお いてさえ標識され、一方で該組み換えキナーゼの該タンパク基質は、少なくとも 低度に標識され、好ましくは該組み換えキナーゼの該タンパク基質は、実質的に 標識されず、また最も好ましくはこれらは全く標識されない。 該変異体に相当する野生型キナーゼが、該細胞から、例えばそのための細胞遺 伝子の「ノックアウト」によって除去される場合も好ましい。このようなアッセイ の該標識されたタンパクを、該野生型キナーゼを含むが、該変異キナーゼを含ま ないコントロールサンプルと共に検査した場合には、いくつかのバンドにおいて 、該変異体で処理したサンプルの強度が、該コントロールと比較して、低下する 。好ましくは、強度におけるこの差は高く、最も好ましくは、該阻害剤で処理し た、変異体含有サンプルにおいて消失するバンドが存在する。このことは、該キ ナーゼの野生型が、これらの特異的に標識されたタンパクをホスホリル化し、該 キナーゼが阻害された場合には、これらのバンドは、標識されない。 実施例10は、本発明の変異体キナーゼを、どれが、該タンパクキナーゼに対す る細胞内タンパク基質であるかを検出する場合には、そのオルソゴナル基質類 似体またはその阻害剤と共に使用する方法の一例を与える。このようなテストの 開発は、本発明に至る研究の主な目的の一つである。 一般的に、実施例10および第８図に記載した方法は、一般的に適用可能である が、使用できる他の多くの方法があり、オルソゴナル基質類似体または阻害剤を 受け取る変異体が、調製される。例えば、該燐酸塩を[γ-32P]燐酸塩で置換する ことによって、末端燐酸塩上に標識された部分を含むように、まず該天然の燐酸 ドナー基質を調製する。次いで、該類似体または阻害剤と共に、この基質を、溶 解した細胞、細胞抽出物、透過性にされた細胞、または該オルソゴナルヌクレオ チド三燐酸基質類似体または該阻害剤に対して元々透過性であり、該変異キナー ゼを発現し、もしくは該変異キナーゼが外因的に(例えば、微量注入によって)添 加された、細胞のサンプルに添加する。該変異キナーゼが阻害され、および/ま たは阻害されない程度まで、そのタンパク基質をホスホリル化することができる 条件下にてインキュベートした後、該標識された生成物を抽出し、かつコントロ ールサンプルについて得られるものとの比較において、分析する。該コントロー ルサンプルは、実質的に同一の方法で処理されているが、夫々該類似体または阻 害剤は添加されていない。標識されたタンパクの検出法は周知であり、また定量 的および定性的方法両者を含む。更に、タンパクを特徴付けし、かつ同定するた めの全ての方法を、特異性を持つ該タンパク基質が何であるか、およびその機能 がなんであるかを決定するために使用できる。最終的に、該種々のタンパクキナ ーゼ各々がどのタンパク基質に作用するかに関する理解を発展させ、および細胞 シグナル伝達の不思議さを極めて詳細に明らかにすることが可能となるはずであ る。 一旦、一以上の細胞タンパク基質が同定されると、同様なアッセイを利用して 、所定のタンパクキナーゼの、一以上の基質に及ぼす活性を調節することのでき る、薬物または他の化合物を、同定することが可能となる。例えば、種々のこの ような化合物の溶液を、少量添加して、細胞を含まない抽出物、変異キナーゼを 、標識されたオルソゴナル基質類似体および/または阻害剤と共に含有するサン プルを、テストすることができた。次いで、該標識されたタンパクを、例えばオ ートラジオグラフィーを伴うゲル電気泳動法によって同定し、同様に処理された が、 薬物または他の化合物は添加されていない一対のテストサンプルの結果と比較す ることができる。 添加された化合物+該類似体および/または該阻害剤によって処理されたサンプ ル中で標識される、基質類似体および/または阻害剤を含有するサンプル内で、 タンパクが標識されない場合、この事実は、該添加された化合物によって、該キ ナーゼがあるタンパクをホスホリル化することを意味しており、該タンパクは、 該化合物の不在下では作用しない、即ち該化合物は、該タンパクに対する該キナ ーゼの活性を高めるように調節する。また、標識タンパクが、該化合物または薬 物を添加したテストサンプル中に出現するが、該化合物または薬物を添加してい ないテストサンプル中には出現しない場合、この事実は、該添加された化合物が 、該キナーゼによるタンパクのホスホリル化を阻害し、ここで該タンパクは、該 化合物の不在下では作用せず、即ち該化合物は、該タンパク基質に対する該キナ ーゼの活性を低下するように調節する。 更に、例えばオートラジオグラムを走査し、データを積分することによって、 各標識タンパクについて定量的測定を行った場合、より微妙なキナーゼ活性に及 ぼす作用を検出できる。例えば、あるタンパクが、所定の化合物の存在下または 不在下で、より完全にまたはより不十分にホスホリル化されること(即ち、殆ど 顕著な調節が見られない)を、理解することが可能である。また、いくつかの化 合物は、いくつかのタンパクに対するキナーゼ活性を高めるように調節し、かつ 同時に他のタンパクに対するキナーゼ活性を低下するように調節するものと、予 想することができる。 ドラッグデザインターゲットキナーゼのスクリーニングにおける利用 上記のように、キナーゼは種々の疾患において、重要な役割を演じているので 、単一の野生型キナーゼまたは一群の野生型キナーゼを、特異的に阻害すること のできる阻害剤を開発することは、極めて興味深いことである。これらの疾患関 連キナーゼの活性をダウンモジュレーションすることによって、該疾患の症状を 軽減し、もしくは該疾患を治癒することさえ可能となるはずである。 しかしながら、上で簡単に記載したように、野生型のキナーゼの阻害剤を製造 する際に経験する大きな難点が、この方法の能力を制限している。その主な難点 は、特異的であり、かつ意図したターゲット以外の他のキナーゼを阻害しない、 阻害剤を見出すことである。このような非―特異性に関する理由は、（i）キナ ーゼのヌクレオチド三燐酸結合サイトが、進化において高度に保存されており、 また(ii)多くのキナーゼが、「縮退」状態にあり、即ち十分に類似する活性と特異 性とを有しており、その結果該キナーゼは、遺伝子欠損または他の利用から、細 胞内には不在でありまたはその濃度が減少する、他のキナーゼと置換可能である 。該結合サイトの類似性の問題は、多くの例において、例えば注意深い合理的な 阻害剤の設計、または特異性に基く、組み合わせライブラリーからの阻害剤の選 択によって、解消することができる。しかしながら、別のキナーゼと、真に縮退 しているキナーゼを使用した、そのための努力は、同様に成功しなかった。共に 縮退関係にある全てのキナーゼの何れも、最良の候補化合物によっても阻害され 、あるいは該ターゲットが阻害されたとしても、縮退したキナーゼが「取って代 わる」ために、該阻害されたものの活性を求めることは不可能であろう。 そのために、キナーゼをスクリーニングして、どの野生型キナーゼが縮退して いるか、即ち特異的阻害にとっては恐らく貧弱な候補がどれであるか、どれが縮 退していないか、即ち特異的阻害にとって好ましい候補がどれであるかを、決定 するための方法に対する需要がある。本発明は、このような方法を提供する。本 発明は、対象とする任意のキナーゼの、特異的で固有のキナーゼを、選択された 候補阻害剤によって阻害されるように特異的に設計された、キナーゼの変異体を 製造し、次いでその阻害の効果を検討することによって、生成する手段を提供す る。 これを達成する一つの手段は、細胞または細胞抽出物をインビトロでテストす ることである。例えば、末端燐酸基に、ある種のラベル(「第一のラベル」)をもつ 、このようなサンプルに、ATPを添加し、該末端燐酸基において様々に標識され た(「第二の標識」)、該特異的な阻害剤を添加することができる。所定のタンパク 基質上の該第二の標識の出現率における低下は、(例えば、ゲル電気泳動によっ てみられるように)該変異キナーゼの特異的阻害を示し、またその同一の基質上 の該第一の標識の出現率は、該他のキナーゼが、そのホスホリル化の役割を果た していることを示し、その程度は、このような標識化の相対的な度合いによって 示される。該組み換えキナーゼが、特異的に阻害されることが明らかになり、ま た他のキナーゼが、該組み換えキナーゼが阻害された場合に、その基質のホスホ リル化を行わない、あるいは少なくとも完全にはホスホリル化を行わない場合に は、該キナーゼは縮退しておらず、あるいは少なくとも完全には縮退しておらず 、従ってこれは恐らく、これが関連する疾患を治療するための薬剤として使用す るための、該野生型の特異的な阻害剤の開発のための良好な候補ではない。しか しながら、該変異キナーゼの、本発明の阻害剤による阻害が、他のキナーゼによ って補償されない場合には、これは該野生型キナーゼの阻害剤を開発するための 、好ましい候補物質である。 このようなスクリーニングのためのもう一つの好ましい方法は、対象とする疾 患の動物モデルを生成し、次にその野生型遺伝子を「ノックアウト」し、更に遺伝 子操作によって、本発明の変異キナーゼをコードする遺伝子をそのゲノムに挿入 する(「ノックイン」)ことである。次に、本発明の阻害剤、好ましくはインビトロ で該変異体を阻害することが示されたものは、この変異キナーゼをダウンレギュ レーションするのに利用できる。ダウンレギュレーションが、該モデル動物内で の該疾患の症状または病状を軽減し、もしくは該疾患を治癒した場合には、該キ ナーゼは、該野生型の特異的阻害剤を開発するための好ましい候補である。 遺伝子療法的応用 本発明の変異キナーゼおよび阻害剤は、またヒト並びに動物における疾患を治 療するために、直接利用することもできる。動物モデル系について、すぐ前に記 載したように、これらのキナーゼが媒介する疾患に罹った患者に、遺伝子置換法 を利用することもできる。一種以上のこのような野生型のキナーゼに対する、こ の野生型の遺伝子は、例えば当分野で公知の「ノックアウト法」によって除去し、 次いでこれら一以上のキナーゼの、特異的に阻害可能な変異体を、例えば「ノッ クイン法」または当分野で公知の遺伝子療法により、動物のゲノムに添加する。 従って、該阻害剤は、これら一以上の変異キナーゼをダウンモジュレートし、結 果として該疾患を、少なくともある程度まで改善することを可能とする、薬物と して使用できるが、正常な細胞機能のために必要であることが知られている、こ れらキナーゼの活性の程度を、維持することができる。勿論、該キナーゼは、治 療上有効であることが明らかである場合には、強力に阻害することによって、本 質的に活性低下させることも可能である。更に、該疾患が、ダウンレギュレーシ ョンまたは活性低下期間中に、大幅に改善または治癒されることが明らかとなっ た場合、該阻害剤の投与を中断することができ、また該疾患は再発または悪化す ることは、殆どない。そうでなくとも、阻害を長期間に渡り、あるいは永続的に 中断し、外患者の残りの人生では、該野生型のキナーゼの代わりに、該変異体を 機能状態に維持することも可能である。本発明のこの特異的な阻害剤は、環境中 には存在しないので、該変異キナーゼは、正に野生型と同様に挙動するはずであ る(但し、該組み換え操作が、その活性または速度を変更する可能性があること を除く)。また、該疾患が、将来において再発または突発した場合には、該遺伝 子交換を繰り返すこと無しに、外患者を該阻害剤で、再度治療することができる 。 他の多重基質型酵素 上記のように、本発明は変異キナーゼ、オルソゴナル阻害剤、およびその合成 並びに使用に制限されない。本発明は、他の多重基質型酵素に対しても、同様に 良好に機能し、該酵素は、本明細書でドナーと呼ぶ一基質の一部または全体を、 本明細書でレシピエントと呼ぶ他の基質に伝達する。また、これから発見される であろう多くのこのような酵素が存在する。このような例の何れかにおいて、本 明細書を検討した当業者は、本発明のこのような酵素に対する適用性を、十分に 理解するであろう。このような例において利用できる作業は、上記のキナーゼに ついてここに詳細に記載したものと、全く同一である。まず、該ドナー基質が何 であるかを同定し、および/または該キナーゼを阻害できる化合物(たとえ該化合 物が該キナーゼに対して特異的ではないにしても)を同定する必要がある。 第二に、嵩高な置換基が、該基質または該阻害剤に付加され、結果として該野 生型のキナーゼとは容易に結合せず、あるいは好ましくは実質的に該野生型のキ ナーゼとは結合せず、また好ましくは全く結合しない可能性がある場合を、考慮 する必要がある。キナーゼの場合または上記のような他の多重基質型酵素の場合 には、これらの内のどの類似体に対して制限性とすべきかについては、実際には 必要なく、理想的とは思えない幾つかを包含する、その種々のものを製造し、ス クリーニングによって、何れのものが最良であるかを決定することができる。如 何にしてこれを実施するかに関する更なる手引きは、以下の実施例から得ること ができる。結果を第16図に示した、この阻害アッセイは、このようなスクリーニ ングに特に適した、非−限定的なアッセイの例である。 第三の工程は、該類似体が結合している場合に、該嵩高い基が存在すると予想 される三次元位置における一以上のアミノ酸が、あまり嵩高くない側鎖をもつア ミノ酸で置換されるように、該キナーゼを組み換え操作に付して、該阻害剤の該 嵩高い部分に対して、「空間を形成する」ことである。勿論、工程２および３を逆 の順序で実施することも可能である。 例えば、トランスフェラーゼ酵素が、本発明を利用する研究に対する最も興味 深い候補である。本明細書に与えられる教示にしたがって、オルソゴナル阻害剤 を受け取る変異トランスフェラーゼを調製することができ、またこれらを一緒に 使用して、該キナーゼについて上記した方法によって、相同トランスフェラーゼ の大きな群内の、一つの特定のトランスフェラーゼに関する、直接的な基質を同 定することができる。メチルトランスフェラーゼの該群は、全く興味深いもので あり、本明細書に与えた方法を利用して、全く容易に研究することができる。こ れら酵素は、すべて同一のヌクレオチドを基本とするコファクター、S-アデノシ ルメチオニン(AdoMet)を、メチル基(CH3)ドナーとして利用する。この群の種々 の構成員は、AdoMetの該メチル基を、広範に及ぶ細胞成分、例えばタンパク(こ の場合、該メチル基はアルギニン、アスパラギン、およびグルタミン側鎖に付加 される)、DNA(この場合、該メチル基はシトシンのC-5位、またはグアニンのN-7 位に付加される)、細胞膜成分、例えば燐脂質、およびホルモンを包含する小さ なアミンの多くに伝達できる。多くの新たなターゲットも、この酵素の多様な群 に関して同定されている。本発明は、これらの酵素が行っている、著しく複雑な 細胞メカニズムを解明する機会を与える。 例えば、N-6位に、または他のリング位置に、付随的な嵩高い疎水性の基を含 む、一群のAdoMet類似体を合成することが出来、これらの位置は該類似体を オルソゴナルとし、天然の基質と同様に、野生型のメチルトランスフェラーゼに よって容易に受け取られることはない。また、該転移されたメチル基の領域にお ける該構造は、該メチル基が転移に対してより化学的に耐性となるように、ある いは例えばS-アデノシルシステインが、代わりの出発化合物として使用できるよ うに、変更される。DNAメチルトランスフェラーゼ、M.HhaIおよびカテコールメ チルトランスフェラーゼ、カテコールO-メチルトランスフェラーゼ(COMT)の結晶 構造を利用して、タンパクキナーゼについて我々が行ったように、変異に対する 候補である、アデニン結合ポケット中のこれらのアミノ酸を同定することが出来 、また当業者は変異形成される一群の残基を同定して、一種以上の該オルソゴナ ル基質の、該嵩高い疎水性の基を容易に蓄積できるはずである。 例えば、大きな疎水性の基を変異させて、より小さなアラニンまたはグリシン 残基とし、あるいは水素結合しているアミノ酸を、AdoMetの該オルソゴナルプリ ン類似体を与える他のものに置換することができる。勿論、無数の他の可能な変 異も良好に機能する可能性があり、これらすべては本発明の範囲内にある。また 、メチルトランスフェラーゼの配列整合性および結晶構造から、これらが、共通 の触媒ドメイン構造を持つことが知られており(70)、従ってこの方法は、M.HhaI およびCOMTに制限されないが、同様に他のメチルトランスフェラーゼにも適用で きるはずである。 オルソゴナル阻害剤を受け取る、メチルトランスフェラーゼ変異体を同定した 後、AdoMetの硫黄原子に結合したC-14標識メチル基を含む、放射性標識されたAd oMetを合成することができる。この放射性標識された類似体を、一個の変異メチ ルトランスフェラーゼを発現する細胞に添加した場合、該サンプル中の全メチル トランスフェラーゼの直接的な基質(例えば、タンパク、DNAまたはポリアミン) を、該C-14メチル基によって特異的に放射性標識する。しかし、これを該オルソ ゴナル阻害剤の存在下で行った場合には、対象とする該メチルトランスフェラー ゼに対する特異的な基質は、該阻害剤を含まないサンプルと比較して、あまり標 識されず、好ましくはこれらは実質的に標識されず、また最も好ましくは全く標 識されないであろう。このように、あるいは該キナーゼの研究に関連してここに 記載した、他の方法の使用を通して、メチルトランスフェラーゼの直接 的な基質を同定することができる。癌、胚の発生、多形核性白血球の走化性、ま たは神経学的諸疾患において重要である。更に、次いで本発明の方法を利用して 、該酵素の活性を調節する化合物が同定できるか否かを決定することができる。 恐らくここでは説明しない、本発明の幾つかの他の局面は、該メチルトランスフ ェラーゼに適用でき、また他の多重基質型酵素にも適用できる。 該メチルトランスフェラーゼに対する本発明の適用に関する上記の議論は、本 発明の範囲を限定するものではなく、本発明の、該タンパクキナーゼ以外の多重 基質型酵素に対する適用を例示するものである。当業者には理解されるように、 本発明は同様に、同様な方法を使用して、他の多重基質型酵素に対して適用する ことができる。 用語 生物工学において一般的であるように、本明細書における本発明の説明は、多 数の技術的用語の使用を必要としている。完全に説明し尽くすことは実際的では ないが、これら用語の幾つかに関する定義を、照会を容易にする目的でここに与 える。他の用語に関する定義も、本明細書の至る部分に見られるが、これらにつ いて、ここでは繰り返さない。ここに定義する、あるいは本明細書の至る部分で 定義する用語は、当業者が当分野で使用する際にもつものと理解しているであろ う以上の意味を与える意図はない、ことに注意することは重要である。従って、 これら用語のおよび本明細書の至る部分で定義された用語の意味を解釈する上で 、他の原典をも参考とすべきことを主張するものである。しかし、ここでおよび 本明細書の至る部分で与えられた定義は、該定義された用語の意図された範囲並 びに意味を決定する上で、常に考慮すべきである。 ここで使用する用語「オルソゴナル」とは、構造的におよび/または幾何学的に 、所定の酵素に対する天然物質、または該酵素の野生型の阻害剤に対して、類似 するが、該天然物質に対するよりも、該酵素の野生型に対する、化合物の結合能 力を低いものとする、化学的構造における差をもつ、該化合物を意味する。「天 然」基質とは、該酵素の野生型によって利用される基質を意味する。本発明の該 オルソゴナル阻害剤は、ここでは種々の様式で言及され、例えばしばしばこれら は、「 変性された基質」、「変性された阻害剤」、「類似体」、「誘導体」、正に「基質」また は「阻害剤」、および恐らく他の用語によっても言及される。しかしながら、各例 において、同一の意味が意図されている。勿論、「オルソゴナル」およびその同義 語は、更に上記本発明の説明において説明されている。 ここに記載される発明の態様の、推定的オルソゴナル基質および阻害剤は、夫 々天然の基質または既知のキナーゼ阻害剤上のある原子に、嵩高い置換基を付加 することによって製造される。しかし、本発明はこのようには限定されない。例 えば、既知の阻害剤または該天然の基質よりも小さな、オルソゴナル基質を、例 えば該天然の基質中に存在する一以上の原子または置換基を失っている類似体を 調製することによって、製造することができる。このような推定上のオルソゴナ ル基質または阻害剤を使用して、該酵素を、その野生型のアミノ酸配列に見られ るものよりも、大きな側鎖をもつ、一以上のアミノ酸を含むように、変異形成す ることができる。従って、該オルソゴナル基質または阻害剤が、結合した場合に 、これらのより嵩高いアミノ酸側鎖は、該失われた原子または置換基によって形 成される余分の空間を満たし、あるいはその一部を満たす。このように、該変異 体は、該オルソゴナル基質または阻害剤と結合し、および/またはこれによって 阻害されるが、実質的に該正常な基質を利用しないことが予想される。というの は、該付加された嵩高いアミノ酸が、その結合に対する立体障害を及ぼすからで ある。このような方法は、該得られる変異体の、高度の選択的制御を可能とする 。 本発明の実施例の該基質および阻害剤は、非−競合型のものであるが、これが 本発明の範囲の限定であると考えるべきではないことを、記憶にとどめておくこ とは重要である。多くの異なる型の酵素基質および阻害剤が公知であり、例えば 競合型、非−競合型、不競合型、「スイサイド」阻害剤等がある。競合型阻害剤は 、その結合サイトに対する基質と競合する。しかし、該阻害剤は、該酵素が行う 触媒反応に関与できないので、これは触媒反応の速度を低下する。非−競合型阻 害剤は、該活性サイトと結合するが、結果として該酵素のタンパク構造と、共有 結合的にまたはイオン的に結合して、分離できなくなる。従って、これらは、該 反応から酵素分子を完全に取り去ることによって、触媒反応を阻害する。これら のおよび他の競合的メカニズムのより詳細な説明は、様々な源に見出すことがで き る(例えば、72)。このようなメカニズムに関する技術の理解を、本発明の阻害剤 の設計に適用することによって、この種の全ての阻害剤を製造することができた 。 例えば、結合できるが、反応はしない類似体は、競合的阻害をもたらし、また 結合の際に該酵素と共有結合的に付着する類似体は、非−競合的阻害剤、即ち毒 素である。このような型の全ての阻害剤は、本発明の範囲内にある。 本発明において、用語「相同」とは、ある酵素を変性する方法に関する情報が、 如何にして他の関連する酵素の三次元構造に関する情報から、推定できるかを記 載するのに使用する。当分野で周知であるように、第二の酵素の一部に対して「 相同」である、ある酵素の一部は、該第二の酵素に関連するタンパク配列を持つ 。この関係は、これらが、相互に対して同一の相対的位置に、多数のアミノ酸を 含むことにある。例えば、想像上の配列：Asp-Met-Phe-Arg-Asp-Lys-Gluおよび 想像上の配列：Asp-Met-Ile-Arg-Glu-Lys-Aspは、同一の相対的な位置に４つの アミノ酸および３つの異なるアミノ酸を有している。また、これらは相同配列を 持つと言われる。これら鎖間で異なっている該３つのアミノ酸は、第一の配列に 相対的な該第二の配列における該置換が、その側鎖上の類似の官能性をもつアミ ノ酸によるものである点において、「保存性の」差であることに注意すべきである 。例えば、GluおよびArg両者は、カルボン酸基で終端している脂肪族側鎖をもち 、またPheおよびIle両者は、疎水性である。これは、しばしば相同タンパク配列 に関する場合であるが、必ずしもそうである必要はなく、これら２つの想像上の 配列は、その差が保存性でなかったとしても、依然として相同であると考えられ る。 ある特定の配列またはドメインが、相互に相同であるか否かは、任意の特異性 によって、例えば％を使用して表すことはできない。というのは、このような絶 対的なものさしは存在しないからであり、どの配列が「相同」であり、かつ相同で ないかの定義を、当分野に任せる必要がある。参考文献71は、既知のキナーゼの どのドメインが、当分野により「相同」であると考えられているかに関する優れた 概説を与えている。更に、当分野では、一般的には同意できないが、相互に同一 の配列も、互に相同であると考えることにする。「ドメイン」なる用語も、当分野で周知のものであり、また特定の官能性を持つ ものとして同定されている、あるタンパクの一領域を意味する。例えば、タンパ クキナーゼの３つのドメインが、本明細書のいたる部分で議論されており、また その機能的役割も、議論されている。しばしば、該キナーゼの場合と同様に、同 一の群の異なる酵素は、各々同一の機能を果たす、同一の数のドメインを有し、 かつこれらはしばしば(しかし、常にではない)、該タンパク配列に沿って、同一 の順序で配列されている。興味深いことに、該キナーゼに場合と同様に、ある酵 素は、他のものとは異なる、そのドメイン間のタンパク配列長をもつことができ る。しかし、２つの関連する酵素の該ドメインは、一般的に(しかし、常にでは ない)相互に相同であり、このことは一般的に対応するドメインの同定を妨害す ることはない。 本発明のより広い局面を説明する際に、「多重基質型」なる用語を使用する。こ れは、２またはそれ以上の基質と結合する酵素を意味する。ここで最も興味深い これらの多重基質型酵素は、ある基質の少なくとも一部および少なくとも一つの 他の基質と、接触的に結合するものである。該キナーゼおよび該トランスフェラ ーゼは、このような多重基質型酵素の２群を構成し、また当業者は、他のこのよ うな酵素および酵素群が存在することを認識するであろう。 「認識」なる用語は、ある基質がある酵素上の活性サイトと特異的に結合する、 基質の能力を記載するのに、本明細書でしばしば使用する。これは、単にある酵 素の基質(あるいはしばしば基質誘導体もしくは該基質を模倣する完全に異なる 化合物であってもよい)が、接触し、かつ該酵素の活性サイトと結合できるが、 他の化合物とは結合しないという事実を意味する。この概念は、当分野では周知 である。酵素学者は、しばしば該酵素はその基質に対してアフィニティーをもつ 、あるいは該基質は該酵素に対してアフィニティーを持つという。彼らは、更に ある酵素が、「基質特異性」をもつともいう。実際に、これらはすべて同一の現象 を記載するものである。 関連する用語は、「結合」である。ある阻害剤は、一般的に一以上の疎水性、親 水性、水素および/またはイオン結合、あるいは非−競合的阻害剤の場合には共 有結合を介して、活性サイトに結合または付着させる。 阻害剤の結合および阻害の理由に関する当分野における複雑な理解は、興味深 いことであるが、このような理解は、本発明を理解する上で必須ではない。単に 、阻害剤による結合が、該触媒反応の阻害を生ずることを明記することで十分で ある。 本発明の酵素を記載するのに使用した場合、「変異体(mutant)」および「組み換 え型(engineered form)」とは、単に、その野生型酵素の配列と比較した場合に、 これらが一以上の位置において、異なるアミノ酸を持つ配列を有することを意味 する。このような変異体を記載する場合、数値によって分離された二つの文字は 、行われたアミノ酸変異を表す。これらの文字は、単一文字アミノ酸コードであ り、また該数値は完全な野生型酵素内の、アミノ酸残基の位置である。例えば、 GST-XD4は、野生型のv−Srcの特定の部分として同一の配列を持つフラグメントX D4を含有する、融合タンパクである。表記GST-XD4(V323A，I338A)において、完 全な野生型v-Src配列中の位置323を表す、v-SrcフラグメントXD4の配列中の該バ リンは、アラニンによって置換されており、該完全な野生型v-Src配列中の位置3 38を表す、該XD4中のイソロイシンも、アラニンによって置換されている。 以下の実施例に記載するように、本発明を利用して、我々は、v-Srcキナーゼ を設計し、作成し、かつその有用性を立証した。該キナーゼは、合成阻害剤に対 して高い特異性を示し、一方でチロシン含有ペプチドおよびタンパクに対する、 その野生型の特異性を維持し、かくして我々の初期の研究目標を満足する。該キ ナーゼの超群(superfamily)全体に渡る、該ATP結合サイトの高度に保存された特 徴および他のタンパクキナーゼからの構造に関する情報の入手性を利用して、v- Src自体に関する如何なる詳しい構造上の情報をも必要とすること無しに、v-Src に対する新規な阻害特異性を組み換えによって得ることができた。かくして、我 々は、オルソゴナルATP類似体を設計するための青写真として、無関係のキナー ゼを使用して、v-srcの該直接的な細胞基質を標識し、また同様な起源の阻害剤 を調製したことは、この方法が他のキナーゼに対しても、同様に作用することを 立証している。 実施例 下記の実施例は、本発明を具体的に説明するためのものである。それだけで本 発明の範囲を制限するものと解釈してはならない。当業者は、他の多くの実施態 様が上記及び請求の範囲の本発明の範囲内に包含することを十分理解するであろ う。 実施例１ ATP類縁体の合成 12種類の異なる直交性ATP類縁体を合成した。図２は、それらの構造の図式で ある。図は、アデノシン三リン酸(ATP)を示し、“X”は６位に結合し、下の枠内 の図式は実施例に記載された各直交性ATP類縁体の“X”の場所に用いる12の側鎖 を示す(常に太字の数字1-12で表される)。それらの類縁体は下記の通りである。 1-N6(メトキシ)ATP 7-N6(ピロリジノ)ATP 2-N6(エトキシ)ATP 8-N6(シクロペンチル)ATP 3-N6(アセチル)ATP 9-N6(シクロペンチルオキシ)ATP 4-N6(i-プロポキシ)ATP 10-N6(ピペリジノ)ATP 5-N6(ベンジル)ATP 11-N6(シクロヘキシル)ATP 6-N6(ベンジルオキシ)ATP 12-N6(シクロヘキシルオキシ)ATP 類縁体1、2、4、6、9及び12をFujiiら(43)の方法に従ってアデノシンから出発 して４工程で対応するN1 アルコキシアデニン誘導体のジムロー転位により合成し た。類縁体５をN1 ベンジルアデノシン(44)のジムロー転位により同様に合成した 。類縁体３は、McLaughlinら(45)に従ってトリメチルシリルエーテルとしてアデ ノシンヒドロキシル基のその場保護に続いて塩化アセチルで処理することにより 調製した。類縁体7、8、10及び11は、6-クロロプリンリボシド(Aldrich)を各々 ピロリジン、シクロペンチルアミン、ピペリジン及びシクロヘキシルアミンで処 理することにより合成した(46)。 三リン酸の合成は、ピロリン酸の調製を除いてLudwig(47)の方法に従って行っ た。従って、ビス-トリ-N-ブチルアンモニウムピロリン酸は、１当量のピロリン 酸と２当量のトリブチルアミンとを(1:1)の水:エタノール混合液に均一な溶液 が得られるまで混合することにより調製した。溶媒を減圧下で除去して乾固し、 ピロリン酸をP2O5上で一晩保存した。 全ての非放射性ヌクレオチドを1H-NMR、質量スペクトル分析及び強陰イオン交 換(SAX)HPLC(Rainin # 83-E03-ETI)で確認した。 [γ-32P]N6 -(シクロペンチル)ATPをHecht & Kozarich(48)の方法に従って合成 した。放射性標識類縁体をDEAE(A-25)セファデックス(Pharmacia)カラムクロマ トグラフィーで精製し、放射性標識物質をN6 -(シクロペンチル)ATPの基準試料と 共にSAX陰イオン交換HPLCカラム(Rainin)(5〜750mMリン酸アンモニウムpH3.9、1 0分、0.5ml/分)に同時注入することにより三リン酸を同定した。反応液の化学収 率は70〜80％に変動した。 実施例２ ヌクレオチド類縁体のスクリーニング 既存の細胞キナーゼ(53)が基質として受容しない化合物を同定するために、タ ンパク質チロシンキナーゼ(13)を多く含むマウスリンパ球溶解物(CF)において合 成A*TP類縁体のパネルをスクリーニングした。 単離し、5％ウシ胎仔血清(BCS)、1％Hepes及びDNAseI(1μg/ml)を含有するRPM I-1640培養液で洗浄した脾細胞(プリンストン大学動物施設より生後8〜30週の雄 と雌のC57/B6マウス)を用いて分析を行った。赤血球を17mMトリス塩化アンモニ ウムpH7.2で処理することにより４℃で溶解した。その細胞をFukazawaら(51)の 方法に従って1mM Hepesp H7.4、5mM MgCl2、ロイペプチン(10μg/ml)、アプロチ ニン(10μg/ml)及び100μM PMSFに10分間氷上で低浸透的に溶解した。撹拌し、5 00×gで遠心分離した後、上清を集めた。細胞を4℃で20分間保存して基礎タンパ ク質リン酸化レベルを減弱させた後に緩衝液を20mM Hepesp H7.4、10mM MgCl2及 び1mM NaFに調整した。次に、バナジン酸ナトリウム(100μM)を添加してホスホ チロシンホスファターゼの活性を阻害した。 各ヌクレオチド三リン酸を5×106細胞等価物に最終濃度100μMまで添加し、37 ℃で５分間でインキュベートした後に細胞溶解物に4×レミリケルローディング バッファーを加えて反応液を急冷した。タンパク質を12.5％SDS-PAGEで分離し、 プロトランBA85(Schleicher-Schuell)に移した。ブロットを抗ホスホチロ シンモノクローナル抗体4G10(Upstate Biotechnology)でプローブし、高化学発 光(cat.34080 Pierce)に続いてHRP結合ヤギ抗マウス抗体(VWR cat.7101332)で処 理することにより製造業者の説明書に従って結合抗体を検出した。 結果を図３に示す。マウスリンパ球細胞溶解物(CF)を100μMのATP又はA*TP(1- 12)で処理した後のタンパク質チロシンリン酸化レベルを示す抗ホスホチロシン タンパク質イムノブロットである。使用した細胞溶解物は、チロシンキナーゼSr c、Fyn、Lck、Lyn、Yes、Fgr、Hck、Zap、Syk、Btk、Blk、及びB及びTリンパ球 、マクロファージ及び濾胞樹枝状細胞(13)が含まれる。分子サイズ標準(キロダ ルトン)を示す。最少のN6 置換基、1(メトキシ)、2(エトキシ)及び3(アセチル)を 含むA*TPは細胞チロシンキナーゼ基質として働く能力を示した(レーン3-5)。N6 置換基、4(i-プロポキシ)、5(ベンジル)及び6(ベンジルオキシ)、及び環状脂肪 族置換基を含む全ての類縁体(7〜12)は、ほとんど又は全くリン酸化を示さなか った(図3、レーン6-8、11-16)。A*DP及びATPを得る直交性A*TP(7-12)と細胞ADP との起こりうるメタセシスを試験するために、1mM ADPを図３に示されるもの同 じ細胞溶解物キナーゼ反応液に加えた;(データは示されていない);リンタンパク 質のパターンは同じであり、A*TPの有意なメタセシスは完全な細胞溶解物系に生 じないことが示された。 これらの結果に基づいて、類縁体(7〜12)は野生型チロシンキナーゼの“死ん だ基質”であると思われる。即ち、野生型基質はリン酸供与基質としてのこれら をほとんど又は全く受容しない。従って、これらの類縁体は、v-Srcのヌクレオ チド結合を再操作する最も好ましい標的として使用される。 実施例３ 突然変異v-Srcの設計 不活性キナーゼのいくつかの構造は解析されているが、チロシンキナーゼの活 性コンホメーションの結晶構造は解析されていない(54、55)。しかしながら、触 媒活性ser/thrキナーゼの２つの結晶構造は解析されている(56、57)。双方のキ ナーゼファミリー(cAMP依存性キナーゼのK72、v-SrcのK295)(58、58)中の同じ触 媒活性リシン残基を親和性標識することにより示されるようにser/thrとチロシ ンキナーゼ触媒ドメイン間に高程度の機能相同性がある。PKA(56)とサイクリ ン依存性キナーゼ-2(CDK2)-サイクリンA(57)結晶構造から結合ATPのN6 アミノ基 の4Å範囲内に２つのアミノ酸側鎖:V104/M120(PKA)及びV64/F80(CDK2)(60)が示 された。 図４は、ATPに結合するcAMP依存性タンパク質キナーゼ(PKA)のATP結合部位を 示すクローズアップ図である。ATPのN6 アミンの4Å範囲内に３つの残基(Val104 、Met120及びGlu121)と触媒に不可欠なリシン残基(Lys72)が球と棒の形に示され ている。タンパク質の残りは、リボンの形に示されている。この図は、ラスター 3Dを与えるプログラムにモルスクリプト出力を加えることによりつくった(68、6 9)。このモデルにおいては、Glu121の側鎖がアデニン環結合領域から離れるので Glu121は修飾の候補ではなかったことに留意されたい。 PKA(配列番号1)、CDK2(配列番号2)、及びv-Src(配列番号3)のATP結合領域の配 列アラインメントを下に示す。太字で示した残基は、キナーゼ結合ATPのN6 アミ ノ基の5Å範囲内に側鎖を有するアミノ酸に対応する。サブドメイン 上記キナーゼ間の機能類似性に基づいて、PKAのV104/M120及びCDK2のV64/F80 に対応するv-Src触媒ドメイン内の位置V323と1338を突然変異することに決定し た。これらの残基をアラニンに突然変異することにより、更にv-Srcのヌクレオ チド結合部位に“ポケット”をつくって好ましい直交性A*TP(4〜12)の１種の結 合を可能にすることが望まれる。 実施例４ 突然変異体の合成、発現及び精製 突然変異体(V323A、I338A)を下記のように作成した。v-Src触媒ドメインの野 生型と二重アラニン変異体(XD4断片)を共にグルタチオンS-トランスフェラーゼ( GST)融合タンパク質(GST-XD4)(61、62)として作成した。下記の実施例に記載さ れる内在チロシンキナーゼを欠くことから良好な発現宿主である大腸菌中でこれ らを作成した。無傷SH1触媒ドメインを含むが非触媒SH3及びSH2調節ドメイン を欠き、全長v-Srcより比活性が高いことからv-SrcのXD4断片を用いた。 オーバーラップ拡張PCRを用いてGST-XD4(V323A、I338A)(49)を作成した。Pfu ポリメラーゼ(Stratagene)を製造業者のプロトコールに従ってPCR反応に用いた 。６個の合成オリゴヌクレオチドを用いた。 プライマー配列番号４はBamHI部位を含み、プライマー配列番号５はEcoRI部位 を含む(イタリック体で示されている)。プライマー配列番号６と配列番号７は、 V323A突然変異を導入するヌクレオチド配列変化を含む(突然変異をコードしてい るヌクレオチドは太字で示されている)。プライマー配列番号８と配列番号９は 、I338Aミスマッチを含む。 YEp51-XD4プラスミド(タフツメディカルスクールのB．Cochranからの寄贈)由 来のXD4遺伝子をプライマー配列番号４と配列番号５で増幅した。PCR産物をBamH IとEcoRIで消化し、BamHI及びEcoRI消化pGEX-KTに結合してからE．coli株DH5α に形質転換した。 プライマー配列番号、配列番号５、配列番号６及び配列番号７を鋳型としての GST-XD4プラスミドと共に用いてGST-XD4(V323A)を構築した。２段階方法からのP CR産物をBamHIとEcoRIで消化し、BamHI及びEcoRI消化pGEX-KTに結合し、DH5αE ．coli細胞に形成転換した。プライマー配列番号８と配列番号９を鋳型としての GST-XD4(V323A)と共に用いて同様の方法でGST-XD4(V323A、I338A)を作成した。 GST融合キナーゼの発現及び精製は、細胞を4℃で一晩保存した後に遠心分離し フレンチプレスで溶解する以外はXuら(50)に記載されたE．coli株DH5α中で行っ た(一晩保存することは高度に活性なキナーゼを生産するために不可欠である)。 Sf9昆虫細胞における6-His-XD4と6-His-XD4(V323A、I338A)の発現は、ライフ テクノロジーBAC-to-BACシステムを用いて達成した。概要としては、6-His-XD4 と6-His-XD4(V323A、I338A)遺伝子を鋳型として対応するpGEXベクターをプライ マー配列番号４と配列番号５と共に用いてPCRにより作成し、続いてBamHIとEcoR Iで消化した。得られたPCR断片をBamHIとEcoRIで消化したpFASTBACの中へクロー ン化した。HB10BAC細胞の形質転換、次のXD4又はXD4(V323A、I338A)を含むBacmi dによるSf9細胞のトランスフェクションは、製造業者によって示されるように行 った。 ここで行われた代替的方法においては、pGEX-v-Srcベクター(4)由来のv-src遺 伝子をNIH 3T3細胞において高レベルの発現のためのプロモーターを含むpBabeベ クター(5)の中へクローン化することによりv-src又はv-src(I338G)突然変異キナ ーゼのトランスフェクションを行った。pBabev-Src(I338G)プラスミドをウイル スパッケージング細胞系BOSC 23(6)にトランスフェクションし、(6)に記載され たように２日後にウイルス粒子を収集した。NIH 3T3細胞に(7)に記載されたよう にウイルス粒子を感染し、(5)に記載されたようにピューロマイシン含有培養液 に安定なタランスフェクタントを選択した。安定なトランスフェクタントをピュ ーロマイシンを含む培養液中で維持してv-Srcの発現のロスを行わせなかった。 最終結果を図１に示す。Src相同3、2及び1(SH3、SH2及びSH1)を含むv-Srcのド メイン構造を示す図であり、ドメイン境界は枠をした各ドメインの上に示された アミノ酸残基数によって示した。XD4のドメイン構造も示され、残基77-225の欠 失を含む(Δ77-225)。XD4(v-Srcからの番号)とのグルタチオンSトランスフェラ ーゼ(GST)融合物、及び二重に突然変異したGST-XD4(V323A、I338A及びI338Gと共 に示している)のドメイン構築も概略図で示す。 実施例５ 突然変異v-Srcについて直交性ATP類縁体を結合する能力を試験する 次に、各ATP結合部位に結合する能力の尺度である、[γ-32P]ATPによるRR-Src の野生型及び突然変異キナーゼリン酸化を微分阻害するN6 置換ATP類縁体(1〜12) の能力を評価した。50mMトリス、10mM MgCl2、1.6mMグルタチオン、 1mg/ml BSA、GST-XD4(100nM)又はGST-XD4(V323A、I338A)(100nM)を含む1mM RR-S rcペプチド及び10μM[γ-32P]ATP(1000cpm/pmol)[Dupont NEN]を含むpH8.0の最 終容量30μlの緩衝液中37℃で３回の実験で分析を行った。冷却ATP又はA*TP類縁 体(100μM)(1〜12)を加えた後にキナーゼを加えた。30分後、25μlの反応容量を p81ホスホセルロースディスク(Whatman)上にスポットすることにより反応液を急 冷し、これらを250mlの10％酢酸に>30分間浸漬し、続いて標準法(52)に従って洗 浄及びシンチレーション計数を行った。 結果を図１に示す。GST-XD4の相対的阻害は黒いバーで示され、GST-XD4(V323A 、I338A)による相対的阻害は対角線の黒いバーで示される。阻害％(1-v1/v0)は 、v1(100μMの指定した三リン酸及び10pM[γ-32P]ATP(1000cpm/pmol)の存在下の cpm)/v0(10μM[γ-32P]ATP(1000cpm/pmol)のみ-ホスホセルロースディスクに結 合する非特異的10μM[γ-32P]ATPに基づくバックグラウンドcpm(<0.1％の全入力 カウント)の比として示される。S.D.を示す誤差バーは、３種類の複製物を用い た４回の別個の実験により求めた。 野生型キナーゼGST-XD4は、リンパ球キナーゼ分析(図3)から予想されるように ほとんどのA*TP類縁体(図６、黒いバー)に対して結合親和性が不十分であった。 対照的に、二重に突然変異したGST-XD4(V323A、I338A)は立体を必要とするN6 置 換ATP類縁体(図６、斜線バー)により優れた阻害を示す。最も顕著には、GST-XD4 (V323A、I338A)変異体はATP類縁体5、8、9及び11によってほとんど阻害され、野 生型キナーゼ、GST-XD4は天然基質ATPによって阻害される。GST-XD4(V323A、I33 8A)及び全長GST-v-Src((V323A、I338A)はA*TP(1〜12)と同じ阻害パターンを示す ことが確認された(データは示されていない)。 野生型キナーゼ特異性(図3)のスクリーンに確認した９種の“死んだ”基質の うち４種は、突然変異キナーゼに十分に結合する。野生型キナーゼによって受容 されない突然変異v-Srcの新規な基質を同定する点でこの高い成功率は、v-Srcヌ クレオチド結合部位の重要な特徴、即ち、ATPのN6 アミノ基の周りに密接に適合 する残基を同定したことを示している。v-SrcのI338(PKAの120位)に対応する位 置にアラニンを含む野生型タンパク質キナーゼでないことについて知っているこ とは注目すべきことである。この位置に立体的に必要とするアミノ酸側鎖が キナーゼの特異性を求めるのに重要な役割を果たす場合には、ここに記載された ものと非常に似た方法を用いて直交性基質を受容するように操作することが十分 可能でなければならず、かかる操作したキナーゼは十分本発明の範囲内である。 実施例６ 最適な直交性ATP類縁体による突然変異v-Srcの触媒効率を求める 類縁体８が野生型キナーゼ(図3、レーン12)でわずかに低いレベルのリン酸化 を示したことから他の３種のATP類縁体5、9及び11について野生型GST-XD4とGST- XD4((V323A、I338A)変異体双方の触媒的にコンピネントな基質として働くN6 -(シ クロペンチル)ATP）８の能力を試験することが選ばれた。 GST-XD4((V323A、I338A)及びGST-XD4によるATP及びN6 -(シクロペンチル)ATP依 存性RR-Srcリン酸化(1mM)を３回の実験において低基質転化率(<5％)で行った。 速度データ(64)のラインウィーバー・バークプロットの分析によって速度定数を 求めた。50mMトリス、10mM MgCl2、1.6mMグルタチオン、1mg/ml BSA、GST-XD4(1 00nM)か又はGST-XD4(V323A、I338A)(100nM)を含む1mM RR-Srcペプチド及び指定 した10μM[γ-32P]ATP(1000cpm/pmol)又は[γ-32P]N6 -(シクロペンチル)ATP(500 0cpm/pmol)を含むpH8.0の最終容量30μlの緩衝液中37℃で３回の実験で分析を行 った。 表１ リン酸供与基質の速度論 上記表１に示されるように、野生型キナーゼGST-XD4は［γ-32P]N6 -(シクロペ ンチル)ATPでRR-Srcペプチドをほとんどリン酸化せず、この類縁体が野生型キナ ーゼの重要な基質でないという我々の前の所見が確認された。対照的に、GST- XD4(V323A、I338A)は、直交性A*TP、[γ-32P]N6 -(シクロペンチル)ATPでミカエ リス・メンテン速度論を示した。直交性基質に対する変異体のKMは、ATPに対す るGST-XD4のKMに非常に近かった。一方、変異体のATPに対するKMは、GST-XD4のA TPに対するKMの10倍を超える。 相対する基質に対する触媒を位置付けるために用いられるパラメーターは、ミ カエリス・メンテン定数Kcat/KMに対する代謝回転数の比（“特異性定数"）(64) である。直交性基質[γ-32P]N6 -(シクロペンチル)ATPによる操作した突然変異GS T-XD4(V323A、I338A)のKcat/KMは、天然基質による野生型キナーゼのKcat/KM値 のわずか1/50である。野生型に比べた場合にATPによる突然変異キナーゼの低い 触媒効率と相まって直交性A*TP基質によるこの触媒効率は上記２つの設計基準を 満たしている。 GST-XD4が自己リン酸化のリン酸化供与体としてこの類縁体を全く用いること ができないことが明らかであるように;これは図５・レーン３に示されいる、新 規な基質、[γ-32P]N6 -(シクロペンチル)ATPが野生型GST-XD4によってほとんど 用いられないことは重要である。図５・は、GST-XD4の[γ-32P]ATP依存性自己リ ン酸化、レーン1、又はGST-XD4(V323A、I338A)、レーン2;及びGST-XD4の[γ-32P ]N6 -(シクロペンチル)ATP依存性リン酸化、レーン3、又はGST-XD4(V323A、I338A )リン酸化、レーン４を示すオートラジオグラムである。GST-XD4に対照的に、操 作したキナーゼは[γ-32P]N6 -(シクロペンチル)ATPで効率よく自己リン酸化され る(図5(c)、レーン4)。 実施例７ タンパク質基質特異性の保持を確認する 下記の表２に示されるように、野生型GST-XD4キナーゼは、v-Srcの十分に確認 されたペプチド基質、RR-Srcを文献と一致した速度論でリン酸化することがわか った。これにより、配列操作はタンパク質基質に対して酵素の触媒活性にほとん ど影響しなかったことが示される。表２ タンパク質基質RR-Srcの速度論 50mMトリス、10mM MgCl2、1.6mMグルタチオン、1mg/ml BSA、GST-XD4(100nM) か又はGST-XD4(V323A、I338A)(100nM)を含む1mM RR-Srcペプチド及び10μM[γ-3 2 P]ATP(1000cpm/pmol)[Dupont NEN]を含むpH8.0の最終容量30μlの緩衝液中37℃ で３回の実験でRR-SrcのGST-XD4及びGST-XD4(V323A、I338A)リン酸化の分析を行 った。 アラニン突然変異はタンパク質基質特異性に対して影響するかを求めるために 、RR-Srcペプチドの野生型及び突然変異融合タンパク質双方のKMを測定した。[ γ-32P]ATPの飽和濃度で、野生型及び突然変異体はRR-Srcの実質的に同じKM、各 々2.6±0.9mM及び3.1±0.9mM(63)を示す。更に、直交性基質の飽和量の存在下に タンパク質基質の変異体のKMは、実質的に同じ、2.1±0.9mMであった。これらの 知見から隣接のホスホアクセプター結合部位に近接するATP結合ポケットのアラ ニン突然変異はタンパク質標的特異性に影響しないことが示される。 これを支持して、操作したキナーゼは各々がSf9昆虫細胞中で発現される場合 に野生型XD4によってリン酸化される幅広い同じ設定のタンパク質をリン酸化す る。これを図5(a)に示す。6-His-XD4、レーン２又は6-His-XD4(V323A、I338A)、 レーン３を発現するSf9昆虫細胞からの細胞溶解物(108細胞等価物/レーン)の抗 ホスホチロシンタンパク質ブロットを示す。実施例２のブロットと同様の手順を 用いて0.1％トリトン-X-100、50mMトリス、pH8.0を含む緩衝液中で106細胞の溶 解後にこれらのブロットを行った。 Sf9昆虫細胞系は、これらの細胞が哺乳動物細胞に見られるものと活性がより 似ているキナーゼを生じるタンパク質に転写後修飾を行うことが必要な同じ機構 のほとんどを含むことから少量のチロシンキナーゼを発現する良好な宿主である 。更に、図5(a)、レーン１に示されるように感染していないSf9細胞は内在チロ シンキナーゼ活性を欠くので、図5(a)のレーン２及び３のホスホチロシン含有タ ンパク質は発現した6-His-XD4又は6-His-XD4キナーゼの基質である。具体的なタ ンパク質のリン酸化レベルの小さな差は野生型キナーゼに比べて突然変異XD4(V3 23A、I338A)の触媒活性が低いことによるものであると我々は考える。 纏めると、これらのデータから操作したキナーゼのペプチド特異性は野生型v- Srcとほとんど同じであることが示される。 実施例８ 操作したキナーゼは好ましい直交性基質を受容するが、野生型キナーゼはほとん ど受容しないことを確認する 本実験の最後の目標は、合成基質類縁体に特異的な突然変異キナーゼを用いて 全細胞又は細胞溶解物中の直接タンパク質基質を標識することである。このため に、ser/thr特異的キナーゼを含む野生型キナーゼ(全てのホスホアミノ酸の0.03 ％だけがチロシンであるように細胞リン酸化の大部分を行う)(65)がほとんど合 成基質を受容しないことが好ましい。[γ-32P]N6-(シクロペンチル)ATPが全ての 野生型細胞キナーゼに対して実質的に“死んだ基質”であることを確かめるため に、[γ-32P]ATP又は[γ-32P]N6 -(シクロペンチル)ATPとの試験管内キナーゼ反 応はマウスリンパ球溶解物で行った。 放射性標識[γ-32P]ATP又は[γ-32P]N6 -(シクロペンチル)ATP(5000cpm/pmol) を5×106細胞等価物による最終濃度100μMまで添加し、37℃で10分間インキュベ ートしてから4×レミリゲルローディングバッファーを細胞溶解物に添加して反 応液を急冷したものを用いることを除いて実施例２に示された方法と同様の方法 でこれらの分析を行った。タンパク質を12.5％SDS-PAGEで分離した。ゲルを10％ 酢酸、10％イソプロパノールに１時間浸漬した後、ゲルドライヤで乾燥し、バイ オマックスMS膜(Kodak # 111-1681)に１時間暴露した。 結果を図5(b)に示す。[γ-32P]ATP、レーン１又は[γ-32P]N6 -(シクロペンチ ル)ATP)、レーン２による低浸透的に溶解したマウスリンパ球のリン酸化レベル を 示すオートラジオグラムである。[γ-32P]N6 -(シクロペンチル)ATPの添加後の細 胞溶解物に放射性リンタンパク質がなく、全ての野生型タンパク質キナーゼに対 してN6 -(シクロペンチル)ATPの直交性の真の性質が確認される。新たに単離した マウスリンパ球の代わりに[γ-32P]ATP又は[γ-32P]N6 -(シクロペンチル)ATP及 びNIH 3T3細胞溶解物との試験管内キナーゼ反応を用いた場合に同じ結果が見ら れた(示されていない)。 原則として、他の全ての細胞キナーゼの存在下にタンパク質キナーゼの活性を 行う能力は具体的な細胞型における直接キナーゼ標的の同定を可能にする。これ を達成するために、現在、我々は膜浸透化処理(66)と細胞透過性のA*TPを用いて [γ-32P]ATPを細胞に導入している(67)。 実施例９ 単一突然変異v-Src変異体の構築と分析 単一突然変異がN6 -(シクロペンチル)ATPを基質として効率よく用いることを十 分可能にするかを求めるために、実施例４にと同様の方法を用いて３種のv-Src 由来変異体を更に調製した。しかしながら、338位に単一突然変異のみ有した。 また、GST-XD4融合タンパク質として発現した。次に、これらの突然変異GST-XD4 (I338A)、GST-XD4(I338S)及びGST-XD4(I338G)を実施例８に記載されるように試 験した。 結果を図７に示す。図７の左上に示されたゲルレーンは、338位にアラニンを 含む変異体が同じ位置にセリンを含む変異体より容易に天然基質、ATPを用いる ことができたことを示している。図７の左下に示されるゲルレーンは、338位に アラニンを含む変異体がその位置にグリシンを含む変異体より基質としてATPを 用いるほうがよいことを示している。 図７の右側のパネルは、より興味深いストリーを知らせている。右上のパネル からは、338位にセリンを有する変異体がほとんどN6 -(シクロペンチル)ATPを用 いることができないこと及びその位置にアラニンを有する変異体であることが明 らかである。しかしながら、下のパネルは、338位にグリシンを有する変異体が その位置にアラニンを含む変異体より基質としてN6 -(シクロペンチル)ATPを用い る方がよいことを示している。 これらの結果は、最も有望である。単一突然変異はこの直交性基質の使用を十 分可能にすると思われる。特に、338位にグリシンを含む変異体はこれまで作製 した最良の操作したv-Src変異体であると思われる。 更に、グリシン置換がここで実験することは非常に驚くべきことである。一般 的には、グリシン置換は、酵素構造にあまり多くの可撓性を導入するので所望の 成果に悪影響を及ぼすことからかかる状態で実験することは予想されない。 実施例11 v-Src基質を同定する v-Src基質を同定する実験法の概略を図８に示す。GST-XD4(V323A、I338A)のよ うな操作したv-Srcを[γ-32P]N6 -(シクロペンチル)ATPのような放射性標識した 直交性基質と共に細胞抽出液又は透過性を上げた細胞に加える。典型的には、こ れは３回の実験で行われる。インキュベートした後、細胞を溶解(まだ溶解して いない場合)、得られた試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。ゲ ルから取り抗ホスホチロシンで標識したウェスタンブロットは、試料中の全ての リン酸化タンパク質を示し、ゲルのオートラジオグラムからv-Srcによりリン酸 化されたことが示される。 実施例12 阻害剤の合成 最初の６種の阻害剤のピラゾロピリマジン骨格を図11Aに示す。“R”位置にフ ェニル基をもつ4-アミノ-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン 、化合物1(図10に示されるPP1と同じ構造であるがフェニル環にパラメチル基を 含まない)の合成をHanefeldら(76)の方法に従って行った。“R”位置に各々シク ロブトイル、シクロペントイル、シクロヘキソイル、ベンゾイル、及び2-フロイ ル置換基をもつ化合物2〜6(図11B)は、１を各々塩化シクロブトイル、塩化シク ロペントイル、塩化シクロヘキソイル、塩化ベンゾイル、又は塩化フロイルで乾 燥ピリジン中室温で１時間処理することにより合成した。各置換基の構造を図11 Bに示す。シリカゲルクロマトグラフィーで精製して純粋な生成物を収率16〜84 ％で得た。化合物1〜6を1H-NMRと質量スペクトル法で確認した。 実施例13 野生型キナーゼに対して直交性の阻害剤のスクリーニング 既存の細胞キナーゼを阻害しない化合物を同定するために、Shahら(79)に記載 されたキナーゼ活性の放射性標識トレーサーとして[γ-32P]ATPを用いたペプチ ドリン酸化分析において２つの密接に関連した精製チロシンキナーゼ、v-Src及 びFynに対して合成ピラゾロピラミジン類縁体(1〜6)のパネルをスクリーニング した。 結果から、化合物2〜6の各々のIC50値がSrcの阻害に対して400μMを超えこと がわかり、化合物３及び５は野生型Fynの阻害に対して400μMを超えるIC50値で 示され、これらの類縁体(2及び5)は代表的な野生型キナーゼに直交性である(阻 害しない)ことが示された。 実施例14〜16 従来の遺伝子及び生化学法を用いてタンパク質キナーゼシグナリング経路を解 析することは、密接に関連したキナーゼの圧倒的多数のために難しかった。各個 々のキナーゼの細胞透過性阻害剤が設計された場合には、各タンパク質キナーゼ 役割は系統的に評価される。 結果:がん遺伝子タンパク質チロシンキナーゼ、v-Srcの最初のユニークな特異 的細胞透過性阻害剤を開発するために化学及び遺伝学を合わせた方法を考えた。 機能的なサイレント活性部位突然変異をv-Srcにつくり他の全ての細胞キナーゼ から区別した。野生型キナーゼを阻害しないこの突然変異キナーゼの強固に結合 している(IC50=430nM)細胞を設計し合成した。試験管内及び全細胞分析により突 然変異v-Src/阻害剤対のユニークな特異性が確立された。この阻害剤は操作した v-Srcの細胞発現の形質転換作用を逆転するが、野生型v-Src仲介細胞形質転換を 破壊しない。これらの細胞系は単一のタンパク質キナーゼ中単一アミノ酸によっ てのみ異なり、細胞シグナリングの劇的な変化は操作したキナーゼの特異的阻害 に直接起因するものであることが確立された。対応するサイレント突然変異を含 む他のチロシンキナーゼ、Fynを操作することによりこの方法の一般性を試験し た。同じ化合物もこの突然変異キナーゼの強力な阻害剤(IC50=830nM)であること がわかり、多重チロシンキナーゼの対立遺伝子特異的阻害剤を作成する戦略 の一般性が確認された。 結論:個々のSrcファミリーキナーゼの対立遺伝子細胞透過性阻害剤は化学と遺 伝学を合わせた方法を用いて迅速に開発される。突然変異v-Src形質転換NIH3T3 線維芽細胞をユニークな特異的v-Srcで処理すると形質転換の形態学的特徴が戻 る。阻害剤は、野生型v-Src対立遺伝子によって形質転換された細胞に対して効 果を示さず、阻害剤処理によって誘導された表現型が単一阻害因子の結果である ことが強く示される。一般的な方法でキナーゼ特異的阻害剤を迅速に生成する能 力は、キナーゼ仲介細胞経路の解析及び試験管内及び生体内双方の薬剤発見の良 好な標的として新規なキナーゼを確証するのに有効である。 前述のように、合理的に設計された小分子阻害剤によってユニークに阻害され る“化学感受性”突然変異キナーゼの生成を可能にする化学と遺伝学を合わせた 戦略が考えられた。我々の方法は機能的サイレント突然変異で問題のキナーゼの 活性部位にユニークなポケットを操作することを含む。次に、操作したキナーゼ の特異的阻害剤は、新規な活性部位ポケットに適合するように設計された嵩のあ る基を含む既知のキナーゼ阻害剤を誘導体化することにより合成される。嵩のあ る基は、野生型キナーゼの阻害剤の効力を失わせる。従って、成功した相補的設 計により、操作したキナーゼ/阻害剤複合体においてのみ可能な好ましい結合相 互作用がもたらされる。操作したキナーゼをコードしている遺伝子で細胞をトラ ンスフェクションすると１種のキナーゼのみが設計した阻害剤によって遮断され る細胞を生成する(図14参照)。 重要なことに、突然変異キナーゼが野生型キナーゼと同じ機能を働くので、変 異体の阻害剤は非トランスフェクション細胞において野生型の選択的阻害剤と同 様の方法で細胞シグナリングに影響する。タンパク質キナーゼの選択的阻害後に 細胞の表現型を見出す能力は、シグナル形質導入カスケードにおける個々のキナ ーゼのユニークな役割を求める迅速な方法を与える。 細胞機能を仲介するのに偏在する重要性のために阻害剤設計に特異的なsrcフ ァミリータンパク質チロシンキナーゼを標的にした。激しい研究にもかかわらず 、個々のsrcファミリー部分の役割は細胞同時局在及び高配列同一性のために評 価することが難しかった。src ファミリーキナーゼの強力な阻害剤は既知である が、 密接に関連した酵素間で効果的に区別することができる(1つのsrcファミリー部 分に対して20倍の選択性)分子は同定されなかった。 ２種の機能的に重要なsrcキナーゼ、v-Src及びFynを突然変異キナーゼ/阻害剤 対設計の主要な標的として選んだ。Srcキナーゼは乳がん、肺がん及び結腸がん のがん遺伝子を含むことから主導的な薬剤標的として出てきた。v-Srcはがん遺 伝子のチロシンキナーゼの表現型であるが、このキナーゼに対して高度に選択的 な小分子阻害剤は発見されていない。Fynは、T細胞レセプター仲介リンパ球活性 化に重要なsrcファミリーチロシンキナーゼである。SrcとFynは、類似のドメイ ン構造を共有し、触媒ドメインにおいて約85％のアミノ酸同一性を有する。src ファミリー部分の密接な構造関係は、高度な相同なキナーゼ間の酵素/阻害剤特 異性を操作する能力の理想的な試験を与える。細胞透過性阻害剤を用いて密接に 関係したsrc部分間で区別することができる場合には、他のタンパク質キナーゼ ファミリーの部分に対する特異性が類似の方法を用いて達成されると思われる。 結果及び検討 酵素操作 新規なATP特異性を有するキナーゼを操作する我々の前の努力から、キナーゼ のホスホァクセプター特異性又は生物学的機能を修飾せずにグリシンに突然変異 されるv-Src(Ile338)のATP結合ポケットの機能的保存残基が同定された。スペー スを生じる突然変異は、kcatの適度な低下、ATPのKmの適度な増加のみ生じ、線 維芽細胞形質転換レベルの定量的変化を引き起こさない(Shanh K、未発表の結果 )。突然変異v-Srcの生物学的基質は変化せず、I338G v-Srcは野生型v-Srcと同じ 生物学的機能を行う。ATP結合タンパク質キナーゼの全ての結晶構造により338(S rcの番号)に対応する残基とATP間の密接な接触相互作用が示された。タンパク質 キナーゼ配列アラインメントの分析により、全ての既知の真核タンパク質キナー ゼにおいて嵩のある側鎖(通常、Thr、Ile、Leu、Met、又はPhe)を含むことが確 認された。従って、338位のグリシンの突然変異は、野生型キナーゼに存在しな い新規なポケットをつくらねばならない。増大したATP結合部位のために、グリ シン突然変異キナーゼは野生型キナーゼを結合しない嵩のある阻害剤 を受容しなければならない。標準法を用いて前述のWT及びI338G v-Src触媒ドメ インのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質がクローン化、 発現及び精製された。WT Fyn、T339G Fyn(Srcの番号)、及びWT Ab1もGST融合タ ンパク質として発現及び精製された。 阻害剤の設計及び合成 我々の基本的な設計戦略を試験するために、WT v-SrcよりI338G v-Srcの選択 的に阻害するN-6置換アデノシン分子の以前に合成したパネルに対してWT及びI33 8G v-Src SH1ドメインがスクリーニングされた。アデノシンは単にsrcファミリ ーチロシンキナーゼの適度な阻害剤であることから、操作したキナーゼの強力な 阻害剤を発見することは予想されなかった。予想したように、N-6アデノシン類 縁体の全てがWT v-Srcより強力にI338G v-Srcを阻害した(データは示されていな い)。このスクリーンに見られる最も強力な阻害剤は50％阻害濃度がI338G v-Src に対して1mMのN-6シクロペンチルオキシアデノシン(1、図15a)であった。選択性 を試験する次の実験により、WT v-Src又はFynの検出可能な試験管内阻害を400mM までの濃度で示さないことが証明された。この最初のスクリーニングは、我々の 設計が従来の阻害剤発見の主要な問題点である選択性バリアーを容易に克服させ ることができたのでI338G v-Srcの新規な阻害剤を開発するという戦略を追及す るように我々を激励した。 阻害剤としてアデノシン類縁体は、多くの細胞機能がアデノシンとアデノシン を結合する多くの細胞タンパク質によって行われることから理想的ではない。N- 6アデノシン類縁体は、アデノシンレセプター作動体及び拮抗体として作用する ことがわかっており、ヌクレオシドキナーゼの基質として作用するN-6アデノシ ン類縁体を想像することができる。このために生物学的に既知の分子の直接類縁 体でない既知のチロシンキナーゼ阻害剤の種類を調べた。我々の設計戦略は、多 重野生型キナーゼの強力な阻害を示しかつ容易に合成されるコア構造を求めた。 また、酵素活性部位における分子の結合配向は既知であるか容易に予想できなけ ればならない。更に、分子はle338を示す部位が容易に修飾される方法で結合し なければならない。コア阻害剤構造として4-アミノ-1-tert-ブチル-3-フェニル ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(2、図15b)を使用した。この分子は、強力なsrcフ ァミリーキナーゼ阻害剤としてHankeと共同研究者によって報告された4-アミノ- 1-tert−ブチル-3-(p-メチルフェニル)ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(PP1)の誘導 体である。一般キナーゼ阻害剤、クエルセチン(5、図16)に結合したsrcファミリ ーキナーゼ、Hckの同時結晶構造に基づいて、２がATPと同様のコンホメーション でsrcファミリーキナーゼに結合すると我々は仮定した。Hck中の２の予想した結 合配向は、ATP PNP(6)とクエルセチン(図16b)の既知のHck同時結晶構造を重ねて 示されている。このコンホメーションにおいては、２の容易に誘導可能なN-4位 がATPのN-6(残基338と密接に接触、図16c)に対応し、tert-ブチル部分はATPのリ ボースにほぼ対応する。この配向において、２のC-3フェニル環がHck/クエルセ チン同時結晶構造に見られるようにATPのN-7を取り囲むポケットに結合すること ができると我々は仮定した。この分析により２のN-4誘導体化類縁体の小さなパ ネルを合成することが導かれた。 ユニークな選択的阻害剤の同定 ピラゾロ[3,4-d]ピリミジンのパネルをWT及びI338G v-Srcキナーゼに対してス クリーニングした(図13参照）。類縁体の全てが野生型に比べて操作したv-Srcの 良好な阻害剤であり、キナーゼ活性部位における２の結合配向の我々の予測が確 認された。２のN-4位での誘導体はWT v-Srcに対する阻害活性を破壊する(溶解度 の限界、300mMで阻害が検出できない)。10種全ての類縁体は、I338G v-Srcの測 定可能な阻害を示し、数種の化合物のIC50は低mM範囲である。N-4-(p-tert-ブチ ル)ベンゾイル類縁体(3g)は、パネル中最も強力なI338G v-Src阻害剤である(IC5 0 =430nm)。この分子は300mMでWT v-Srcの阻害を示さず、3gが野生型に比べて突 然変異v-Srcの少なくとも1000倍良好な阻害剤であることが示される。I338G v-S rc 活性部位にマイクロモル未満の効力を得ることを必要とする誘導体化の大きな サイズはどちらかといえば予想しなかった。ATP結合部位から４個の炭素原子だ けを除去し、11個の炭素原子を有する親分子を誘導体化した。この違いは、我々 の結合予想が不十分であることによるものである。また、Ile→Glyの突然変異は 酸素活性部位に対して大きな可撓性を与え、突然変異キナーゼが予想されたもの よりも大きな阻害剤類縁体を受容することを可能にする。3gがATP結合部位でI33 8G v-Srcを阻害することを確認するために、種々のATP 濃度での阻害速度論を調べた。ラインウィーバー・バーク分析により、3gがATPに 対して競合的にI338G v-Srcを阻害定数(Ki)が約400nMで阻害することが確認され た(データは示されていない)。 次に、このキナーゼと交差反応する可能性を調べるためにWT Fynに対する阻害 剤類縁体のパネルをスクリーニングした。発表された親分子、PP1及びPP2が非常 に強力な(低nM)Fyn阻害剤であることから野生型キナーゼの“悪い例”の対照と して使用した。10種の類縁体の多くは、標的キナーゼに高選択性を示さなかった (図13参照)。飽和環系を有するN-アシル類縁体(3a〜3c)は野生型Fynを効果的に 阻害する。N-メチレン化合物(4b、4d、4e)はWT Fynに十分直交性であるが操作し たv-Srcの適度な阻害には不十分である。重要なことに、3g、突然変異v-Srcの最 も強力な阻害剤はWT Fynを非常に弱く阻害した(IC50=300mM)。従って、3gはWT F ynより操作したv-Srcを700倍を超えて効果的に阻害し、分子を最も結合すること ができる野生型細胞キナーゼであると思われる。 他の非srcファミリーキナーゼが試験管内で3gによって偶然に阻害されるかを 試験した。セリン/トレオニンキナーゼ、PKCd及びPKAは300mMまでの濃度で検出 可能に阻害しなかった。同様に、3gはAb1チロシンキナーゼの弱い阻害しか示さ なかった(IC50>300mM)。従って、3gは１つの操作したキナーゼの強力な選択的阻 害に要求される最初の設計の全てを満たした。 全細胞における選択性 3gが野生型チロシンキナーゼを阻害しないことを更に証明するためにB細胞レ セプター(BCR)仲介リン酸化カスケードに対する3g処理の影響を調べた。Src ファ ミリー(Fyn、Lyn、Lck、Blk)及び非srcファミリーチロシンキナーゼ(Btk、Syk) は、BCR架橋時に活性化されることが既知である。 BCR仲介カスケードの増幅性の ために、これらのキナーゼのいずれかの阻害は活性化後の細胞ホスホチロシンの 分布と強度を劇的に変える。3gが野生型キナーゼの活性部位と立体的に適合しな いように設計したことから、野生型B細胞におけるチロシンリン酸化依存性シグ ナリングを破壊してはならない。図17(レーン3)から抗原レセプター架橋マウスB 細胞の100mM処理がB細胞刺激のホスホチロシンパターンに対して影響しないこと が示される(レーン２と比較されたい)。主要バンド全てのシグ ナル強度は変化せず、重要でないバンドのごくわずかな消耗が検出でき、3gがBC R架橋によって活性化されるチロシンキナーゼのパネルをほとんど阻害しないこ とが確認される。 しかしながら、B細胞を100mM２で処理すると、野生型srcファ ミリーキナーゼの強力な阻害と一致しているチロシンリン酸化(図4、レーン4)の 顕著な低下を引き起こす。 NIH3T3細胞におけるI338 Gv-Srcの選択的阻害 Src仲介経路を実験する選択的阻害剤を用いるために、WT及びI338G v-Src双方 をNIH3T3線維芽細胞にレトロウイルスで導入した。これらの細胞は、v-Src発現 に依存する形質転換表現型を得ている。3gがWT形質転換細胞に影響せずにI338G v-Src形質転換細胞のSrc依存性シグナル導入経路を選択的に妨害することを示す ことを探求した。WT v-Src感染細胞(100mM 3g)の処理は対照のDMSO処理レーン( 図18)と比較してチロシンリン酸化のロスを引き起こさず、設計した阻害剤がWT v-Src又はv-Src仲介細胞形質転換によって活性化される他のチロシンキナーゼを 阻害しないことが証明される。I338G v-Src形質転換細胞の同等処理は、推定v-S rc基質のチロシンリン酸化の劇的な減少、及びホスホチロシンの細胞レベルの全 体の適度な低下を生じる。以前に、v-Src形質転換細胞を一般的なチロシンキナ ーゼ阻害剤で処理すると36kDタンパク質のチロシンリン酸化の減少が生じること が示されている。p36は特定のホスホチロシンホスファターゼと結合すると考え られ、阻害剤処理細胞における急速な脱リン酸がたぶん説明される。I338G v-Sr c発現細胞(50mM)におけるp36ホスホチロシンシグナルの3g IC50は試験管内値の 約100倍である(データは示されていない)。これは、おそらく阻害剤が細胞実験 におけるキナーゼ活性部位のATPのミリモル濃度と競合しなければならない事実 による。 I338G突然変異v-Srcの選択的阻害は形質転換細胞形態を逆転する v-Src活性は、哺乳動物細胞のラウス肉腫ウイルス形質転換に必要である。I33 8G v-Src発現NIH 3T3細胞を100mM 3gで処理すると、形質転換の逆反応と一致し ている細胞形態の劇的な変化が生じた(図19)。阻害剤3gで処理した変異細胞は扁 平に見え、形質転換細胞の増殖特性を示さなかった(即ち、相互の上で増殖する 能力)。同じ条件下で、WT v-Src感染細胞はプロトタイプの丸い形態及 び形質転換細胞の重なっている増殖パターンを示した。 細胞形態の選択的逆転を更に証明するために、蛍光顕微鏡を用いて細胞重合ア クチンをファロイジン-FITC(図19)で染色した後の3g処理細胞を見た。非形質転 換NIH3T3細胞は、細胞中に生じる長いアクチン紡錘体を示している。v-Src形質 転換細胞(WT及びI338G共に)は円く見え、アクチン形成の識別できるパターンは なかった。光学顕微鏡データに従って、阻害剤処理WT v-Src発現細胞は未処理WT 細胞から区別できないように見える。しかしながら、3g処理I338G v-Src発現細 胞は特定の重合アクチンの線をもち、非形質転換NIH3T3線維芽細胞のアクチン形 成と極めて似ている。これらの阻害剤処理細胞は、肥大した扁平形態をもち、非 形質転換NIH3T3細胞に存在しない周辺アクチン染色を示す。 このデータから、3g が問題のキナーゼの単一のアミノ酸変化を含むように操作する細胞においてユニ ークな形態学的変化を誘導することができることが示される。これは、チロシン キナーゼがん遺伝子産物に選択的な小分子阻害剤が細胞形質転換と関連がある形 態学的変化を戻すことができる最初の証明である。ヘルビマイシンA(及び他のベ ンゾキノンアンサマイシン)による形質転換の形態学的逆転の以前の例は、最近 、プロテアソームに対するがん遺伝子チロシンキナーゼの熱ショック(hsp90)仲 介標的からなるキナーゼ阻害に関係しないメカニズムにより作用することがわか った。 他のキナーゼに対する総括 問題の酵素と他の全ての間のユニークな分子差を与える突然変異誘発を用いる 利点は、保存キナーゼ重のために方法がキナーゼスーパーファミリー中に拡張で きなければならないことである。ほとんど全ての既知のタンパク質キナーゼは、 v-Srcの残基338に対応する位置に嵩のある側鎖を含む。従って、この位置に突然 変異を生じるスペースは、選択的阻害に感受性のある多重キナーゼにしなければ ならない。これを試験するために、T339G Fynに対する類縁体の阻害を測定した( 表1)。I338G v-SrcとT339G Fynの類縁体の構造活性関係に驚くべき類似性がある 。I338G v-Srcのデータに従って、3gはT339G Fynに対して最も強力な阻害剤類縁 体であり、IC50が830nMであった。これは、WT FynよりT339G Fynに対して300倍 より大きい選択性に相当する。このデータの意味は、多重チロシンキ ナーゼが推定阻害剤の大きなライブラリーをスクリーニングすることを必要とせ ずに１つの阻害剤類縁体を優先的に受容するように系統的に操作されるというこ とである。 結論 この報告においては、化学感受性キナーゼと合理的に設計した阻害剤の相補的 操作によって選択的タンパク質キナーゼ阻害の新規な方法が記載される。標的キ ナーゼの高選択性は全細胞で達成されること及びがん遺伝子チロシンキナーゼの 活性部位阻害が形質転換細胞形態の破壊に十分であることが証明される。方法が 容易に一般化されることから、シグナル導入経路の解析及び薬剤設計の標的とし てキナーゼの確証には広域にわたる適用がなければならない。効果的な薬剤発見 の速度は重要な薬剤標的の同定と確証によって制限される。これは、2000の相同 タンパク質の環境においてささいな問題ではない。タンパク質キナーゼの化学感 受性変異体の使用は、薬理的キナーゼ阻害の細胞及び生理的作用をプローブする 能力を増大する。トランスフェクションした細胞系及び“ノックイン”マウスで さえ現在は速やかに作成することができるので、我々の方法は全細胞又は動物モ デルにおいて一定のキナーゼの選択的阻害の影響を試験する方法を大いに効率よ くしなければならない。阻害剤結合タンパク質キナーゼ結晶構造が利用できるよ うになるにつれて、この戦略は全シグナル導入カスケードの範囲で一定のキナー ゼの時間及び用量依存性阻害の影響の系統的研究を可能にする。 材料及び方法 化学合成 出発物質と合成試薬は全て特にことわらない限りAldrichから購入した。化合 物は全て1H NMRと高分解能質量分析法で確認した。4-アミノ-1-tert-ブチル-3- フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(2)をHanefeldらに従って合成した。 ２のN-4アシル化の一般手順(3a〜3g)．2mlのピリジンに溶解した2(100mg)の溶 液に10当量の所望のアシル塩化物を0℃で加えた。反応混合液を室温まで温め、1 2時間撹拌した。反応液を25mlの水を加えることにより急冷した。得られた混合 液をEt2Oで抽出し、合わせたEt2O抽出液を1N HClと５％NaHCO3で洗浄した。Et2O 層をMgSO4で乾燥し、蒸発した。残留物を1:1のEt2O/ヘキサンで溶離 することによる25gのシリカゲルによりフラッシュクロマトグラフィーで精製し て純粋な3a〜3gを得た。 4-シクロブチルアミド-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン (3a):収量0.0116g(16％)，白色粉末;HRMS(EI)分子イオンC20H23N5Oの計算値349. 19049，実測値349.18762; 4-シクロペンチルアミド-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン (3b):収量0.0456g(68％)，白色粉末；HRMS(EI)分子イオンC21H25N5Oの計算値363 .20615，実測値363.20398; 4-シクロヘキシルアミド-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン (3c):収量0.0575g(84％)，白色粉末;HRMS(EI)分子イオンC22H27N5Oの計算値; 4,2'-フリルアミノ-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(3d): 収量0.0342g(60％)，白色粉末;HRMS(EI)分子イオンC20H19N5O2の計算値361.1540 7，実測値361.15254; 4-ベンズアミド-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(3e):収 量0.1309g(56％)，白色粉末;HRMS(EI)分子イオンC22H21N5Oの計算値371.17933， 実測値371.17324; 4-(p-メチル)ベンズアミド-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジ ン(3f):収量0.0751g(33％)，白色粉末;HRMS(EI)分子イオンC23H23N5Oの計算値38 5.19499，実測値385.18751; 4-(p-tert-ブチル)ベンズアミド-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピ リミジン(3g):収量0.1050g(42％)，白色粉末;HRMS(EI）分子イオンC26H29N5Oの 計算値427,23747，実測値427.23474; N-4アシル化合物をN-4メチレン化合物に小さくする一般手順(4b、4d、4e)．丸 底フラスコに30ｍｇのLiAlH4を充填した。そのフラスコに均圧滴下漏斗を取り付 け、乾燥アルゴンでフラッシュした。LiAlH4を3mlのTHFに氷浴上で懸濁した。約 100mgの対応するN-4アシル２類縁体を5mlのTHFに溶解し、LiAlH4の懸濁液に滴下 した。反応混合液を30分間氷上で撹拌し、次に30分間加熱還流した。反応液を1m lのEtOAc、1mlの水、及び1mlの6N NaOHで順次滴下することにより急冷した。５ 分間撹拌した後、反応混合液をセライトパッドでろ過し、水で希釈し、Et2Oで抽 出した。Et2O抽出液を合わせ、MgSO4で乾燥し、蒸発した。残留物を4:1のヘキサ ン/EtOAcで溶離することによる10gのシリカゲルによりフラッシュクロマトグラ フィーで精製した。 4-シクロペンチルメチルアミノ-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリ ミジン(4b):収量0.0649g(75％)，透明な油状物;HRMS(EI)分子イオンC21H27N5の 計算値349.22691，実測値349.22420; 4,2-フリルメチルアミノ-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン (4d):収量0.0620g(66％)，ベージュ色の粉末;HRMS(EI)分子イオンC20H21N5Oの計 算値347.17483，実測値347.17330; 4-ベンジルアミノ-1-tert-ブチル-3-フェニルピラゾロ[3,4-d]ピリミジン(4c): 収量0.0520g(54％)，白色粉末;HRMS(EI)分子イオンC22H23N5の計算値357.19559 ，実測値357.19303; タンパク質の発現と精製 WTv-Src SH1ドメイン、I338 Gv-Src SH1、WT Fyn、T339G Fyn及びWT Ab1のグ ルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質の遺伝子のpGEX-KTプラスミド への部位特定変異誘発及びクローニングを前述のように行った。これらのキ ナーゼをDH5a E．coli中で発現し、固定化グルタチオンビーズ(Sigma)上で精製 した。PKAを購入(Pierce)し、精製せずに用いた。PKCdをBac-to-Bac発現系(pFas tBac Bベクター)を用いて6-His構築物として発現した。PKCdをQIAexpress(Ni-NT Aアガロースカラム)を用いて精製した。 試験管内キナーゼ阻害分析 srcファミリーキナーゼ(IYGEFKKK)の最適化ペプチド基質に移った32Pの１分当 たりの計数(cpm)を測定することにより椎定キナーゼ阻害剤のIC50を求めた。種 々の濃度の阻害剤を50mMトリス(pH8.0)、10mM MgCl2、1.6mMグルタチオン、1mg/ ml BSA、133mM IYGEFKKK、3.3％DMSO、0.05mMキナーゼ及び11nM(2mCi)[g-32P]AT P(6000Ci/ミリモル，NEN)と全容量30mlで30分間インキュベートした。反応混合 液(25ml)をホスホセルロースディスク上にスポットし、10％HOAcに浸漬し、0.5 ％H3PO4で洗浄した。32Pの移動を標準シンチレーション計数で測定した。cpmが 対照ディスクの50％である阻害剤濃度であるようにIC50を定義した。IC50が２つ の測定濃度の間に下がった場合、阻害剤濃度と２つのデータ間のcpmの間の逆比 例の関係を前提として算出した。水溶液中の阻害剤類縁体の溶解限界が300μMで あることから、250μMのIC50値は阻害上限までの完全な力価測定が試験されない ので近似値である。非srcファミリーキナーゼのIC50は次を除いて同様に測定し た。PKAの基質としてケンプチド(Pierce，133mg/ml)を用いた。Ab1分析に最適化 Ab1基質(EAIYAAPFAKKK，133mg/ml)を用いた。17ng/mlのジアシルグリセロール(S igma)と17ng/mlのホスファチジルセリン(Sigma)の存在下にキナーゼ基質として1 70ng/mlヒストン(Sigma)と共にPKCd分析を行った。 マウスB細胞分析 脾リンパ球を生後6〜20週のBalb/c又はC57/B6マウスから単離した。その細胞 を脾臓から1mg/ml DNase Iを含むRPMI培地に洗い、赤血球を17mMトリス-塩化ア ンモニウム、pH7.2に溶解した。約4×106細胞を1.1％DMSO中100mMの3g又は２と3 7℃で30分間インキュベートした。2mgのヤギ抗マウスIgM(Jackson Immuno Resea rch，cat#115-005-075)を添加し、次に37℃で５分間インキュベートすることに よりB細胞刺激を開始した。細胞を遠心分離(13,000rpm、２分)により単離し、溶 解した(溶解緩衝液:1％トリトンX-100、50mMトリスpH7.4、 2mM EDTA、150mM NaCl、100mM PMSF、2mMオルトバナジン酸ナトリウム、10mg/ml ロイペプチン、10mg/mlアポプロチン)。次に、細胞残渣を13,000rpmで15分間沈 降させた。細胞タンパク質を10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ウ ェスタンブロッティングでニトロセルロース膜に移した。ホスホチロシン含有タ ンパク質を抗ホスホチロシン抗体(Upstate Biotechnology社)でイムノブロッテ ィングすることにより視覚化した。 NIH 3T3線維芽細胞のレトロウイルス感染 WT及びI338G v-Srcをコードしている遺伝子をパッケージング細胞系にトラン スフェクションし、pBabeレトロウイルスベクター及びピューロマイシン(2.5mg/ ml)記載された選択可能なマーカー(Shah，K.，Liu，Y.，Shokat，K.M.，準備中) を用いてNIH 3T3線維芽細胞にレトロウイルス感染した。WT及びI338G v-Src形質 転換細胞を2.5mg/mlのピューロマイシンを含有するDMEM/10％BCS中で培養した。 NIH 3T3線維芽細胞におけるv-Srcの阻害 非形質転換NIH 3T3細胞、WT v-Src形質転換NIH 3T3細胞、及びI338G v-Src形 質転換NIH -3T3細胞を1.1％DMSO又は1.1％DMSO中100mMの3gと37℃でインキュベ ートした。12時間後、細胞をPBSで洗浄し、溶解した(溶解緩衝液:1％トリトンX- 100、50mMトリスpH7.4、2mM EDTA、150mM NaCl、100mMフェニルメチルスルホニ ルフルオリド、2mMオルトバナジン酸ナトリウム、10mg/mlロイペプチン、10mg/m lアポプロチン)。溶解物を13,000rpmで15分間遠心分離することにより清澄化し た。溶解物のタンパク質濃度を基準化し、同量の溶解物を電気泳動で分離し、上 記のようにホスホチロシン含量を分析した。 顕微鏡法 非形質転換した、WT v-Src形質転換した、及びI338G v-Src形質転換したNIH 3 T3細胞を組織培養処理スライド上のDMEM/10％BCS中で増殖した。v-Src発現細胞 を1.1％DMSOか又は1.1％DMSO中100mM 3gで処理した。48時間後、ニコンTMS光学 顕微鏡で400倍の写真をとった。光学顕微鏡法後直ちに細胞を3.7％ホルムアルデ ヒド/PBSに20分間固定し、0.2％トリトンX-100/PBSに60秒間透過性を上げた。透 過性を上げた細胞を200ng/mlのファロイジン-FITC/PBSと20分 間インキュベートした。スライドをPBSですすぎ、重合アクチンをツァイス蛍光 顕微鏡により600倍の蛍光顕微鏡法で可視化した。実施例６ タンパク質基質特異性及び生物活性の保持を確認する (79)に記載されたように行われる。更に、NIH 3T3細胞のがん遺伝子形質転換 におけるv-Srcの型にはまった役割がv-Srcを発現する細胞の形態学的変化を観察 することにより求められる。突然変異I338G v-Srcを発現するNIH 3T3細胞は、い ずれのv-Srcキナーゼも発現しないNIH 3T3細胞と驚異的に異なる野生型v-Srcを 発現する細胞の同じ形態学的特徴を示し、I338G突然変異が正常なv-Srcの生物学 的機能の喪失又は獲得をまねかないことが確認される。更に、“接触阻害”をせ ずに増殖するNIH 3T3細胞の能力の分析は、アガロース、粘性増殖培地を含む細 胞培養系分析において測定される。野生型v-Src及び突然変異v-Src発現NIH 3T3 細胞は、この型にはまった分析においても大きな増殖コロニーを生じる厳密に同 じ能力を示し、線維芽細胞においても同じ機能(基質特異性、速度論、細胞分布 等を含む)が確認される。実施例７ 直交性阻害剤が多重チロシンキナーゼを発現する細胞において野生型キナーゼを 阻害しないことを確認する 実施例２に記載された精製キナーゼにおける化合物３の直交性に関する最初の 分析を確認するために、全細胞を用いて阻害実験が行われた(図４、左の２つの レーン参照)。Coussensら(84)の方法に従って修飾したRIPA緩衝液に細胞を溶解 することによりv-Srcキナーゼを発現するピラゾロピリミジン(2〜6)(25μM)処理 NIH 3T3細胞の抗ホスホチロシンブロットを行った。溶解及び抗ホスホチロシン 検出前に、種々の時間で細胞を処理した。タンパク質を12.5％SDS-PAGEで分離し 、プロトランBA85(Schleicher-Schuell)に移した。ブロットを抗ホスホチロシン モノクローナル抗体4G10(Dr．Brian Drukerからの寄贈、オレゴンヘルスサイエ ンスセンター、オレゴン州ポートランド)でプローブし、製造業者の説明書に従 ってHRP結合ヤギ抗マウス抗体(VWR cat．7101332)で処理した後に高化学発光(ca t．34080，Pierce)により結合抗体を検出した。実施例８ 基質の同定 v-Src基質を同定する実験法の図式を図１に示し、実験の確証を示すデータを 図４に示す。Coussensら(84)の方法に従って細胞を修飾したRIPA緩衝液に溶解す ることにより行われるv-Srcか又はv-Src(I338G)キナーゼを発現するピラゾロピ リミジン(2〜6)(25μM)処理NIH 3T3細胞の抗ホスホチロシンブロットをつくるこ とにより分析を行った。溶解及び抗ホスホチロシン検出前に細胞を種々の時間で 処理した(細胞培養Co2インキュベーター内で)。タンパク質を12.5％SDS-PAGEで 分離し、プロトランBA85(Schleicher-Schuell)に移した。ブロットを抗ホスホチ ロシンモノクローナル抗体4G10(Dr．Brian Drukerからの寄贈、オレゴンヘルス サイエンスセンター、オレゴン州ポートランド)でプローブし、製造業者の説明 書に従ってHRP結合ヤギ抗マウス抗体(VWR cat．7101332)で処理した後に高化学 発光(cat．34080，Pierce)により結合抗体を検出した。実施例７で述べたように 、図４の２つの左のレーンは同じリンタンパク質バンドパターンを示し、直交性 阻害剤３が野生型v-Srcキナーゼを阻害しないことが示される。右のゲルの一連 のレーンは、ゲルの下に目立ったバンドを示し(タンパク質分子量３キロダルト ンに相当する)、100μMの化合物３で処理した後に消失する。１つのリンタンパ ク質のこの特異的阻害は、特定のキナーゼ阻害剤の特徴である。阻害の特異性は 阻害剤が希釈されるケルの最後のレーンで確認され、36キロダルトンバンドのリ ン酸化は阻害剤濃度が５μMより低い場合に再び現れる(測定した試験管内IC50は 5μMである、本文参照)。このタンパク質は、ユニークな分子量に基づいて未知 の機能を有するアネキシンIIと呼ばれるタンパク質、アクチン結合タンパク質と して暫定的に同定された。 本発明は、その真意又は実質的な特徴から逸脱することなく他の形に具体化さ れ、他の方法でも行われる。従って、本発明の開示は、全ての点で例示であり限 定するものとしてみなされるべきでなく、本発明の範囲は下記の請求の範囲によ って示され、等価な意味及び範囲内に入る全ての変更が包含されるものである。
【手続補正書】 【提出日】平成１２年６月１６日（２０００．６．１６） 【補正内容】 １．請求の範囲を別紙の通り補正する。 ２．明細書48頁18〜20行の、「最も顕著には、GST-XD4(V323A、I338A)変異体はAT P類縁体5、8、9及び11によってほとんど阻害され、野性型キナーゼ、GST-XD4は 天然基質ATPによって阻害される。」を『最も顕著には、GST-XD4(V323A、I338A) 変異体はATP類縁体5、8、9及び11によって32P-ATPによるRR-Srcのリン酸化がほ とんど阻害され、野性型キナーゼ、GST-XD4は天然基質ATPによって32P-ATPによ るRR-Srcのリン酸化が阻害される。』と補正する。 請求の範囲 １．少なくとも１種の直交性基質類縁体を受容する突然変異多基質酵素であって 、触媒活性が前記直交性基質の全部又は一部と前記酵素の少なくとも１種の他 の基質との組合わせで生じる、前記突然変異酵素。 ２．前記多基質酵素がトランスフェラーゼである、請求項１記載の突然変異酵素 。 ３．前記多基質酵素がシグナル導入伝達因子である、請求項１記載の突然変異酵 素。 ４．リン酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する突然 変異タンパク質キナーゼ。 ５．前記突然変異タンパク質キナーゼが野生型タンパク質キナーゼの主要な細胞 内リン酸供与基質であるヌクレオチド三リン酸に対する親和性より高い親和性 で該直交性ヌクレオチド三リン酸に結合する、請求項４記載の突然変異タンパ ク質キナーゼ。 ６．前記直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体がＡＴＰの直交性類縁体である、請 求項４記載の突然変異タンパク質キナーゼ。 ７．前記直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体が前記ＡＴＰのＮ6位に共有結合し た少なくとも３個の炭素原子を含む置換基を有するＡＴＰ誘導体である、請求 項４記載の突然変異タンパク質キナーゼ。 ８．前記直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体がＮ6-（シクロペンチル）ＡＴＰ、 Ｎ6-（シクロペンチルオキシ）ＡＴＰ、Ｎ6-（シクロヘキシル）ＡＴＰ、Ｎ6- （シクロヘキシルオキシ）ＡＴＰ、Ｎ6-（ベンジル）ＡＴＰ、Ｎ6-（ベンジル オキシ）ＡＴＰ、Ｎ6-（ピリジノ）ＡＴＰ、及びＮ6-（ピペリジノ）ＡＴＰか らなる群より選ばれる、請求項７記載の突然変異タンパク質キナーゼ。 ９．前記直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体がＮ6-（シクロペンチル）ＡＴＰで ある、請求項４記載の突然変異タンパク質キナーゼ。 10．突然変異タンパク質チロシンキナーゼである、請求項４記載の突然変異タン パク質キナーゼ。 11．Ｓｒｃタンパク質チロシンキナーゼの突然変異体である、請求項１０記載の 突然変異タンパク質キナーゼ。 12.ラウス肉腫ウイルスＳｒｃタンパク質チロシンキナーゼの突然変異体である 、請求項１０記載の突然変異タンパク質キナーゼ。 13．アミノ酸配列が野生型タンパク質キナーゼと異なり、ｖ−Ｓｒｃの３２３位 及びｖ−Ｓｒｃの３３８位からなる群より選ばれた位置に対応する位置の少な くとも１種のアミノ酸がアラニン及びグリシンからなる群より選ばれたアミノ 酸で置換された、請求項４記載の突然変異タンパク質キナーゼ。 14．ｖ−Ｓｒｃの３３８位に対応する位置のアミノ酸がグリシンで置換された、 請求項４記載の突然変異タンパク質キナーゼ。 15．ｖ−Ｓｒｃの３２３位に対応する位置のアミノ酸及びｖ−Ｓｒｃの３３８位 に対応する位置のアミノ酸がアラニンで置換された、請求項４記載の突然変異 タンパク質キナーゼ。 16．前記突然変異タンパク質キナーゼが融合タンパク質として発現した、請求項 ４記載の突然変異タンパク質キナーゼ。 17．グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ融合タンパク質及びＧ‐ヒスチジン 融合タンパク質からなる群より選ばれた融合タンパク質として発現した、請求 項１６記載の突然変異タンパク質キナーゼ。 18．少なくとも１種の直交性基質類縁体を受容する突然変異多基質酵素をコード しているヌクレオチド配列であって、前記酵素の触媒活性が前記直交性基質の 全部又は一部と前記酵素の少なくとも１種の他の基質との組合わせで生じる、 前記ヌクレオチド配列。 19．リン酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する突然 変異タンパク質キナーゼをコードしているヌクレオチド配列。 20．前記ヌクレオチド配列がｍＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ミトコンドリアＤ ＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、サテライトＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ 、及びウイルスＤＮＡからなる群より選ばれる、請求項１９記載のヌクレオチ ド配列。 21．リン酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する突然 変異タンパク質キナーゼをコードしている核酸配列の作製方法であって、 ａ．そのリン酸供与基質に結合した同一又は同種酵素の結晶構造から、前記直 交性ヌクレオチド三リン酸類縁体中の対応する原子に結合した直交性置換基を 立体的に排除する前記結合したリン酸供与基質の原子に十分に近接したグリシ ン以外の１種以上のアミノ酸を同定する工程；及び ｂ．その同定したアミノ酸の１種以上をコードしているヌクレオチドトリプレ ットがその同定したアミノ酸より立体的に嵩のない側鎖を有するアミノ酸をコ ードしているヌクレオチドトリプレットに変換されるように野生型タンパク質 キナーゼをコードしているヌクレ才チド配列を突然変異する工程 を含む、前記方法。 22．工程（ａ）の前記アミノ酸が前記結合したリン酸供与基質の前記原子の約５ オングストローム以内にある、請求項２１記載の方法。 23．前記リン酸供与基質がＡＴＰである、請求項２１記載の方法。 24．前記原子がＡＴＰのＮ6アミノ基である、請求項２３記載の方法。 25．リン酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する突然 変異タンパク質キナーゼを生産する方法であって、請求項２１記載の突然変異 配列を発現させ、よって前記突然変異タンパク質キナーゼを生産する工程を含 む、前記方法。 26．リン酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する突然 変異タンパク質キナーゼをコードしている核酸配列の作製方法であって、 ａ．そのリン酸供与基質に結合した同一又は同種酵素の結晶構造から、前記直 交性ヌクレオチド三リン酸類縁体中の対応する原子に結合した直交性置換基を 立体的に排除する前記結合したリン酸供与基質の原子に十分に近接したグリシ ン以外の１種以上のアミノ酸を同定する工程；及び ｂ．前記１種以上のアミノ酸の１０個のアミノ酸内のアミノ酸をコードしてい る１種以上のヌクレオチドトリプレットに１以上の突然変異をアミノ末端及び カルボキシ末端の両方向に有する複数の突然変異タンパク質キナーゼをコード しているヌクレオチド配列を調製する工程； ｃ．前記複数の突然変異キナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現し て複数の突然変異キナーゼを生産する工程；及び ｄ．前記複数の突然変異キナーゼを試験してリン酸供与基質としての前記直交 性ヌクレオチド三リン酸類縁体を用いる能力をもつ１種以上を選ぶ工程 を含む、前記方法。 27．リン酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する突然 変異タンパク質キナーゼの生産方法であって、かかる突然変異タンパク質キナ ーゼを発現することがわかった請求項２６記截の１種以上の突然変異配列を発 現させ、よって前記突然変異タンパク質キナーゼを生産する、前記方法。 28．少なくとも１種の直交性供与基質類縁体を受容する突然変異多基質酵素をコ ードしている核酸配列の作製方法であって、触媒活性が前記直交性供与基質と 前記酵素の少なくとも１種の他の受容基質との組合わせで生じ、 ａ．その供与基質に結合した同一又は同種酵素の結晶構造から、前記直交性供 与基質類縁体中の対応する原子に結合した直交性置換基を立体的に排除する前 記結合した供与基質の原子に十分に近接したグリシン以外の１種以上のアミノ 酸を同定する工程三及び ｂ．その同定したアミノ酸の１種以上をコードしているヌクレオチドトリプレ ットがその同定したアミノ酸より立体的に嵩のない側鎖を有するアミノ酸をコ ードしているヌクレオチドトリプレットに変換されるように野生型の前記多基 質酵素をコードしているヌクレオチド配列を突然変異する工程 を含む、前記方法。 29．工程（ａ）の前記アミノ酸が前記結合した供与基質の前記原子の約５オング ストローム以内にある、請求項２８記載の方法。 30．少なくとも１種の直交性供与基質類縁体を受容する多基質酵素の生産方法で あって、請求項２８記載の突然変異配列を発現させ、よって前記突然変異多基 質酵素を生産する、前記方法。 31．少なくとも１種の直交性供与基質類縁体を受容する突然変異多基質酵素をコ ードしている核酸配列の作製方法であって、触媒活性が前記直交性供与基質の 全部又は一部と前記酵素の少なくとも１種の他の受容基質との組合わせで生じ 、 ａ．その供与基質に結合した同一又は同種酵素の結晶構造から、前記直交性基 質類縁体中の対応する原子に結合した直交性置換基を立体的に排除する前記結 合したリン酸供与基質の原子に十分に近接したグリシン以外の１種以上のアミ ノ酸を同定する工程； ｂ．前記１種以上のアミノ酸の１０個のアミノ酸内のアミノ酸をコードしてい る１種以上のヌクレオチドトリプレットに１以上の突然変異がアミノ末端及び カルボキシ末端の両方向にある複数の突然変異多基質酵素をコードしているヌ クレオチド配列を調製する工程； ｃ．前記複数の突然変異多基質酵素をコードしているヌクレオチド配列を発現 させて複数の突然変異多基質酵素を生産する工程；及び ｄ．前記複数の突然変異多基質酵素を試験して供与基質として前記直交性供与 基質類縁体を用いる能力をもつ１種以上を選ぶ工程 を含む、前記方法。 32．供与基質としての少なくとも１種の直交性供与基質類縁体を受容する突然変 異多基質酵素を生産する方法であって、かかる変異体を発現することがわかっ た請求項３１記載の１種以上の突然変異配列を発現させ、よって前記突然変異 多基質酵素を生産する、前記方法。 33．供与基質の一部又は全部を受容基質に共有結合で導入する多基質酵素の受容 基質である１種以上の細胞内成分を検出する方法であって、 Ｉ．（ａ）前記多基質酵素の突然変異体を発現し、その突然変異体が供与基質 としての直交性供与基質類縁体を受容する、透過性を上げた細胞、溶解した細 胞、及び前記直交性供写基質類縁体に天然に透過できる細胞からなる群より選 ばれた細胞；及び （ｂ）前記多基質酵素によって受容基質に触媒で導入される部分に検出可能な 部分を有する前記直交性基質類縁体を混合する工程； ＩＩ．該突然変異多基質酵素をその標識した直交性供与基質の一部又は全部を 該受容基質に導入させるのに十分な条件下で前記細胞をインキュベートする工 程；及び ＩＩＩ．細胞成分について前記検出可能な標識の有無を検出し、よって細胞成 分について前記標識があることは前記成分が前記多基質酵素の受容基質であり 、細胞成分について前記標識がないことは前記成分が前記多基質酵素の受容基 質 でないことを意味する工程 を含む、前記方法。 34．タンパク質キナーゼの１種以上の細胞内タンパク質基質を検出する方法であ って、 Ｉ．（ａ）前記タンパク質キナーゼの突然変異体を発現し、その突然変異体が リン酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する、透過 性を上げた細胞、溶解した細胞、及び前記直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体 に天然に透過できる細胞からなる群より選ばれた細胞；及び （ｂ）検出可能に標識した末端リン酸を有する前記直交性ヌクレオチド三リン 酸類縁体を混合する工程； ＩＩ．該突然変異タンパク質キナーゼがリン酸供与体として該直交性ヌクレオ チド三リン酸を用いて１種以上のタンパク質基質をリン酸化させるのに十分な 条件下で前記細胞をインキュベートする工程；及び ＩＩＩ．細胞タンパク質について前記検出可能に標識したリン酸の有無を検出 し、よって細胞タンパク質について前記標識があることは前記タンパク質が前 記タンパク質キナーゼの基質であり、細胞成分について前記標識がないことは 前記タンパク質が前記タンパク質キナーゼの基質でないことを意味する工程 を含む、前記方法。 35．前記突然変異体が野生型タンパク質キナーゼの主要な細胞内リン酸供与基質 の親和性より高い親和性で前記基質に結合する、請求項３４記截の方法。 36.試験化合物が多基質酵素の活性をモジュレートするかを求める方法であって 、 Ｉ．（ａ）前記多基質酵素の突然変異体を発現し、その突然変異体が供与基質 として直交性供与基質類縁体を受容する、透過性を上げた細胞、溶解した細胞 、及び前記直交性供与基質類縁体に天然に透過できる細胞からなる群より選ば れた細胞； （ｂ）前記多基質酵素によって受容基質に触媒で導入される部分に検出可能な 部分を有する前記直交性基質類縁体；及び （ｃ）前記試験化合物 を混合する工程； ＩＩ．該突然変異多基質酵素がその標識した直交性供与基質の一部又は全部を 該受容基質に導入させるのに十分な条件下で前記細胞をインキュベートする工 程；及び ＩＩＩ．前記試験化合物を取り除いた１回以上の対照実験で見出されたものに 相対する細胞成分について前記検出可能な標識の有無の増減があるかを検出し 、よって細胞成分について前記標識の存在するときの相対的増加は前記試験化 合物がその成分に対する前記多基質酵素の作用をポジティブにモジュレートし たことを意味し、細胞成分について前記標識の存在するときの相対的減少は前 記試験化合物がその成分に対する前記多基質酵素の作用をネガティブにモジュ レートしたことを意味する工程 を含む、前記方法。 37．試験化合物がタンパク質キナーゼの活性をモジュレートするかを求める方法 であって、 Ｉ．（ａ）前記タンパク質キナーゼの突然変異体を発現し、その突然変異体が リン酸供与基質として直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する、透過性 を上げた細胞、溶解した細胞、及び前記直交性ヌクレオチド三リン酸基質類縁 体に天然に透過できる細胞からなる群より選ばれた細胞； （ｂ）検出可能に標識した末端リン酸を有する前記直交性ヌクレオチド三リン 酸類縁体；及び （ｃ）前記試験化合物 を混合する工程； ＩＩ．該突然変異タンパク質キナーゼがリン酸供与体として直交性ヌクレオチ ド三リン酸を用いて１種以上のタンパク質基質をリン酸化させるのに十分な条 件下で前記細胞をインキュベートする工程；及び ＩＩＩ．前記試験化合物を取り除いた１回以上の対照実験で見出されたものに 相対する細胞成分について前記検出可能な標識の有無の増減があるかを検出し 、よって細胞成分について前記標識の存在するときの相対的増加は前記試験化 合物がその成分に対する前記タンパク質キナーゼの作用をポジティブにモジュ レートしたことを意味し、細胞成分について前記標識の存在するときの相対的 減 少は前記試験化合物がその成分に対する前記タンパク質キナーゼの作用をネガ ティブにモジュレートしたことを意味する工程 を含む、前記方法。 38．がん、ＨＩＶ等の病態における薬剤分析、治療又は介入方法より選ばれた診 断及び治療法双方に使用するための抑制性の操作したタンパク質キナーゼ又は それに従って調製したキナーゼより選ばれた多基質酵素、その合成類縁体、そ の活性断片、その同族体、及びその組合わせ。 39．薬剤スクリーニングの“ノックアウト”モデルとして機能することができる トランスジェニック動物であって、具体的な病態と関連がある具体的なキナー ゼに対応する野生型遺伝子が突然変異キナーゼをコードしている造伝子で置換 され、前記モデルとキナーゼ阻害剤との相互作用によって前記スクリーニング が用いられる、前記トランスジェニック動物。 40．動物における標的細胞の形質転換方法であって、請求項１記載の突然変異キ ナーゼ、キナーゼ阻害剤、その作動剤及び拮抗剤、その活性断片、その類縁体 、その縮重変異体、その突然変異タンパク質、及びその組合わせからなる群よ り選ばれた物質の発現にコードするＤＮＡ分子を含むベクターを調製する、前 記方法。 41．薬剤スクリーニング及び付随するスクリーニング法であって、請求項１記載 の突然変異キナーゼ、その変異体、その阻害剤、その活性断片、その類縁体、 及びその組合わせより選ばれた物質を用いる、前記方法。 42．請求項１の突然変異多基質酵素、その阻害剤、その作動剤、その活性断片、 その対立遺伝子、その類縁体、その保存変異体より選ばれた活性物質、及び薬 学的に許容しうる担体を含む医薬組成物。 43．がん、ＨＩＶ、アルツハイマー病より選ばれた疾患の治療のための請求項４ １記載の医薬組成物の使用。 44．野生型キナーゼの変異型に対する基質として役立つ放射性標識されたＮ6− 置換ＡＴＰ類縁体であって、該類縁体は野生型キナーゼに対する基質としては 役立たないことを特徴とする類縁体。 45．該類縁体が放射性リンである32Ｐで放射性標識されている、請求項４４に 記載の類縁体。 46．該類縁体がＮ6部位に少なくとも３つの炭素を含んでいる、請求項４４に記 載の類縁体。 47．該類縁体が、Ｎ6−（ベンジル）ＡＴＰ及びＮ6−（シクロペンチル）ＡＴＰ からなる群より選ばれる、請求項４４に記載の類縁体。 48．Ｎ6−置換ＡＤＰ類縁体であって、該類縁体がＮ6部位に少なくとも３つの炭 素を含んでいることを特徴とする類縁体。 49．Ｎ6−（エトキシ）ＡＴＰ、Ｎ6−（アセチル）ＡＴＰ、Ｎ6−（ｉ−プロポ キシ）ＡＴＰ、Ｎ6−（ベンジルオキシ）ＡＴＰ、Ｎ6−（ピロリジノ）ＡＴＰ 、Ｎ6−（シクロペンチルオキシ）ＡＴＰ、Ｎ6−（ピペリジノ）ＡＴＰ、Ｎ6 −（シクロヘキシル）ＡＴＰ及びＮ6−（シクロヘキシルオキシ）ＡＴＰから なる群より選ばれるＡＴＰ類縁体。 50．該ＡＴＰ類縁体がＮ6−（シクロペンチルオキシ）ＡＴＰである、請求項４ ９に記載のＡＴＰ類縁体。 51．該ＡＴＰ類縁体がＮ6−（シクロヘキシル）ＡＴＰである、請求項４９に記 載のＡＴＰ類縁体。 52．請求項４９に記載の少なくとも１つの類縁体及び該類縁体の使用のための容 器を含むキット。 53．請求項４４に記載の１種以上の類縁体及び該類縁体の使用のための容器を含 むキット。 54．変異体キナーゼに対するタンパク質基質を同定する方法であって、 変異体キナーゼを発現する浸透化処理した細胞を請求項４４に記載の放射性 標識した類縁体と共に適切な時間インキュベートする工程、 該細胞を溶解する工程、 ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶解物を分離する工程、及び、 タンパク質基質を同定する工程 を含むことを特徴とする方法。 55．該タンパク質基質をオートラジオグラフィーにより同定する、請求項５４に 記載の方法。 56．変異体キナーゼに対するタンパク質基質を同定する方法であって、 細胞抽出物を請求項４４に記載の放射性標識した類縁体と共に適切な時間イ ンキュベートする工程、 ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶解物を分離する工程、及び、 タンパク質基質を同定する工程 を含むことを特徴とする方法。 57．該タンパク質基質をオートラジオグラフィーにより同定する、請求項５６に 記載の方法。 58．野生型キナーゼの変異型に対する基質として役立つが、野生型キナーゼに対 する基質としては役立たないＡＴＰ類縁体を同定する方法であって、 請求項４４に記載の類縁体を変異体キナーゼと共にインキュベートする工程 、 同一のＡＴＰ類縁体を野生型キナーゼと共にインキュベートする工程、及び 、 該類縁体が変異体キナーゼ及びその野生型キナーゼに対する基質として役立 つか否かを決定する工程、 を含むことを特徴とする方法。 59．ＡＴＰ類縁体及び変異体キナーゼを、該変異体キナーゼに対する既知のタン パク質基質の存在下でインキュベートする、請求項５８に記載の方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 31/18 Ａ６１Ｐ 25/28 35/00 31/18 Ｃ１２Ｎ 9/12 35/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 9/12 1/48 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/68 1/48 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/68 Ａ６１Ｋ 37/52 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＥＥ，ＧＥ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも１種の直交性基質類縁体を受容する突然変異多基質酵素であって 、触媒活性が前記直交性基質の全部又は一部と前記酵素の少なくとも１種の他の 基質との組合せで生じる、前記突然変異酵素。 ２．前記多基質酵素がトランスフェラーゼである、請求項１記載の突然変異酵素 。 ３．前記多基質酵素がシグナル導入伝達因子である、請求項１記載の突然変異酵 素。 ４．リン酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する突然 変異タンパク質キナーゼ。 ５．前記突然変異タンパク質キナーゼが野生型タンパク質キナーゼの主要な細胞 内リン酸供与基質であるヌクレオチド三リン酸に対する親和性より高い親和性で 該直交性ヌクレオチド三リン酸に結合する、請求項４記載の突然変異タンパク質 キナーゼ。 ６．前記直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体がATPの直交性類縁体である、請求 項４記載の突然変異タンパク質キナーゼ。 ７．前記直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体が前記ATPのN6位に共有結合した少 なくとも３個の炭素原子を含む置換基を有するATP誘導体である、請求項４記載 の突然変異タンパク質キナーゼ。 ８．前記直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体がN6-(シクロペンチル)ATP、N6-(シ クロペンチルオキシ)ATP、N6-(シクロヘキシル)ATP、N6-(シクロヘキシルオキシ )ATP、N6-(ベンジル)ATP、N6-(ベンジルオキシ)ATP、N6-(ピリジノ)ATP）及びN6 -(ピペリジノ)ATPからなる群より選ばれる、請求項７記載の突然変異タンパク質 キナーゼ。 ９．前記直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体がN6-(シクロペンチル)ATPである、 請求項４記載の突然変異タンパク質キナーゼ。 10．突然変異タンパク質チロシンキナーゼである、請求項４記載の突然変異タン パク質キナーゼ。 11．Srcタンパク質チロシンキナーゼの突然変異体である、請求項10記載の突然 変異タンパク質キナーゼ。 12．ラウス肉腫ウイルスSrcタンパク質チロシンキナーゼの突然変異体である、 請求項10記載の突然変異タンパク質キナーゼ。 13．アミノ酸配列が野生型タンパク質キナーゼと異なり、v-Srcの323位及びv-Sr cの338位からなる群より選ばれた位置に対応する位置の少なくとも１種のアミノ 酸がアラニン及びグリシンからなる群より選ばれたアミノ酸で置換された、請求 項４記載の突然変異タンパク質キナーゼ。 14．v-Srcの338位に対応する位置のアミノ酸がグリシンで置換された、請求項４ 記載の突然変異タンパク質キナーゼ。 15．v-Srcの323位に対応する位置のアミノ酸及びv-Srcの338位に対応する位置の アミノ酸がアラニンで置換された、請求項４記載の突然変異タンパク質キナーゼ 。 16．前記突然変異タンパク質キナーゼが融合タンパク質として発現した、請求項 ４記載の突然変異タンパク質キナーゼ。 17．グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質及びG-ヒスチジン融合 タンパク質からなる群より選ばれた融合タンパク質として発現した、請求項16記 載の突然変異タンパク質キナーゼ。 18．少なくとも１種の直交性基質類縁体を受容する突然変異多基質酵素をコード しているヌクレオチド配列であって、前記酵素の触媒活性が前記直交性基質の全 部又は一部と前記酵素の少なくとも１種の他の基質との組合わせで生じる、前記 ヌクレオチド配列。 19．リン酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する突然 変異タンパク質キナーゼをコードしているヌクレオチド配列。 20．前記ヌクレオチド配列がmRNA、cDNA、gDNA、ミトコンドリアDNA、葉緑体DNA 、サテライトDNA、プラスミドDNA、ウイルスRNA、及びウイルスDNAからなる群よ り選ばれる、請求項19記載のヌクレオチド配列。 21．リン酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する突然 変異タンパク質キナーゼをコードしている核酸配列の作製方法であって、 a．そのリン酸供与基質に結合した同一又は同種酵素の結晶構造から、前記直交 性ヌクレオチド三リン酸類縁体中の対応する原子に結合した直交性置換基を立体 的に排除する前記結合したリン酸供与基質の原子に十分に近接したグリシン以外 の１種以上のアミノ酸を同定する工程;及び b．その同定したアミノ酸の１種以上をコードしているヌクレオチドトリプレッ トがその同定したアミノ酸より立体的に嵩のない側鎖を有するアミノ酸をコード しているヌクレオチドトリプレットに変換されるように野生型タンパク質キナー ゼをコードしているヌクレオチド配列を突然変異する工程 を含む、前記方法。 22．工程(a)の前記アミノ酸が前記結合したリン酸供与基質の前記原子の約５オ ングストローム以内にある、請求項21記載の方法。 23．前記リン酸供与基質がATPである、請求項21記載の方法。 24．前記原子がATPのN6アミノ基である、請求項23記載の方法。 25．リン酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する突然 変異タンパク質キナーゼを生産する方法であって、請求項21記載の突然変異配列 を発現させ、よって前記突然変異タンパク質キナーゼを生産する工程を含む、前 記方法。 26．リン酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する突然 変異タンパク質キナーゼをコードしている核酸配列の作製方法であって、 a．そのリン酸供与基質に結合した同一又は同種酵素の結晶構造から、前記直交 性ヌクレオチド三リン酸類縁体中の対応する原子に結合した直交性置換基を立体 的に排除する前記結合したリン酸供与基質の原子に十分に近接したグリシン以外 の１種以上のアミノ酸を同定する工程;及び b．前記１種以上のアミノ酸の10個のアミノ酸内のアミノ酸をコードしている１ 種以上のヌクレオチドトリプレットに１以上の突然変異をアミノ末端及びカルボ キシ末端の両方向に有する複数の突然変異タンパク質キナーゼをコードしている ヌクレオチド配列を調製する工程; c．前記複数の突然変異キナーゼをコードしているヌクレオチド配列を発現して 複数の突然変異キナーゼを生産する工程;及び d．前記複数の突然変異キナーゼを試験してリン酸供与基質としての前記直交性 ヌクレオチド三リン酸類縁体を用いる能力をもつ１種以上を選ぶ工程 を含む、前記方法。 27．リン酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する突然 変異タンパク質キナーゼの生産方法であって、かかる突然変異タンパク質キナー ゼを発現することがわかった請求項26記載の１種以上の突然変異配列を発現させ 、よって前記突然変異タンパク質キナーゼを生産する、前記方法。 28．少なくとも１種の直交性供与基質類縁体を受容する突然変異多基質酵素をコ ードしている核酸配列の作製方法であって、触媒活性が前記直交性供与基質と前 記酵素の少なくとも１種の他の受容基質との組合わせで生じ、 a．その供与基質に結合した同一又は同種酵素の結晶構造から、前記直交性供与 基質類縁体中の対応する原子に結合した直交性置換基を立体的に排除する前記結 合した供与基質の原子に十分に近接したグリシン以外の１種以上のアミノ酸を同 定する工程;及び b．その同定したアミノ酸の１種以上をコードしているヌクレオチドトリプレッ トがその同定したアミノ酸より立体的に嵩のない側鎖を有するアミノ酸をコード しているヌクレオチドトリプレットに変換されるように野生型の前記多基質酵素 をコードしているヌクレオチド配列を突然変異する工程 を含む、前記方法。 29．工程(a)の前記アミノ酸が前記結合した供与基質の前記原子の約５オングス トローム以内にある、請求項28記載の方法。 30．少なくとも１種の直交性供与基質類縁体を受容する多基質酵素の生産方法で あって、請求項28記載の突然変異配列を発現させ、よって前記突然変異多基質酵 素を生産する、前記方法。 31．少なくとも１種の直交性供与基質類縁体を受容する突然変異多基質酵素をコ ードしている核酸配列の作製方法であって、触媒活性が前記直交性供与基質の全 部又は一部と前記酵素の少なくとも１種の他の受容基質との組合わせで生じ、 a．その供与基質に結合した同一又は同種酵素の結晶構造から、前記直交性基質 類縁体中の対応する原子に結合した直交性置換基を立体的に排除する前記結合し たリン酸供与基質の原子に十分に近接したグリシン以外の１種以上のアミノ酸を 同定する工程; b．前記１種以上のアミノ酸の10個のアミノ酸内のアミノ酸をコードしている１ 種以上のヌクレオチドトリプレットに１以上の突然変異がアミノ末端及びカルボ キシ末端の両方向にある複数の突然変異多基質酵素をコードしているヌクレオチ ド配列を調製する工程; c．前記複数の突然変異多基質酵素をコードしているヌクレオチド配列を発現さ せて複数の突然変異多基質酵素を生産する工程;及び d．前記複数の突然変異多基質酵素を試験して供与基質として前記直交性供与基 質類縁体を用いる能力をもつ１種以上を選ぶ工程 を含む、前記方法。 32．供与基質としての少なくとも１種の直交性供与基質類縁体を受容する突然変 異多基質酵素を生産する方法であって、かかる変異体を発現することがわかった 請求項31記載の１種以上の突然変異配列を発現させ、よって前記突然変異多基質 酵素を生産する、前記方法。 33．供与基質の一部又は全部を受容基質に共有結合で導入する多基質酵素の受容 基質である１種以上の細胞内成分を検出する方法であって、 I．（a）前記多基質酵素の突然変異体を発現し、その突然変異体が供与基質とし ての直交性供与基質類縁体を受容する、透過性を上げた細胞、溶解した細胞、及 び前記直交性供与基質類縁体に天然に透過できる細胞からなる群より選ばれた細 胞;及び （b）前記多基質酵素によって受容基質に触媒で導入される部分に検出可能 な部分を有する前記直交性基質類縁体 を混合する工程; II．該突然変異多基質酵素をその標識した直交性供与基質の一部又は全部を該受 容基質に導入させるのに十分な条件下で前記細胞をインキュベートする工程;及 び III．細胞成分について前記検出可能な標識の有無を検出し、よって細胞成分に ついて前記標識があることは前記成分が前記多基質酵素の受容基質であり、細胞 成分について前記標識がないことは前記成分が前記多基質酵素の受容基質でない ことを意味する工程 を含む、前記方法。 34．タンパク質キナーゼの１種以上の細胞内タンパク質基質を検出する方法であ って、 I．（a）前記タンパク質キナーゼの突然変異体を発現し、その突然変異体がリン 酸供与基質としての直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する、透過性を上 げた細胞、溶解した細胞、及び前記直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体に天然に 透過できる細胞からなる群より選ばれた細胞;及び （b）検出可能に標識した末端リン酸を有する前記直交性ヌクレオチド三リ ン酸類縁体 を混合する工程； II．該突然変異タンパク質キナーゼがリン酸供与体として該直交性ヌクレオチド 三リン酸を用いて１種以上のタンパク質基質をリン酸化させるのに十分な条件下 で前記細胞をインキュベートする工程;及び III．細胞タンパク質について前記検出可能に標識したリン酸の有無を検出し、 よって細胞タンパク質について前記標識があることは前記タンパク質が前記タン パク質キナーゼの基質であり、細胞成分について前記標識がないことは前記タン パク質が前記タンパク質キナーゼの基質でないことを意味する工程 を含む、前記方法。 35．前記突然変異体が野生型タンパク質キナーゼの主要な細胞内リン酸供与基質 の親和性より高い親和性で前記基質に結合する、請求項34記載の方法。 36．試験化合物が多基質酵素の活性をモジュレートするかを求める方法であって 、 I．（a）前記多基質酵素の突然変異体を発現し、その突然変異体が供与基質とし て直交性供与基質類縁体を受容する、透過性を上げた細胞、溶解した細胞、及び 前記直交性供与基質類縁体に天然に透過できる細胞からなる群より選ばれた細胞 ; （b）前記多基質酵素によって受容基質に触媒で導入される部分に検出可能 な部分を有する前記直交性基質類縁体;及び （c）前記試験化合物 を混合する工程; II．該突然変異多基質酵素がその標識した直交性供与基質の一部又は全部を該受 容基質に導入させるのに十分な条件下で前記細胞をインキュベートする工程;及 び III．前記試験化合物を取り除いた１回以上の対照実験で見出されたものに相対 する細胞成分について前記検出可能な標識の有無の増減があるかを検出し、よっ て細胞成分について前記標識の存在するときの相対的増加は前記試験化合物がそ の成分に対する前記多基質酵素の作用をポジティブにモジュレートしたことを意 味し、細胞成分について前記標識の存在するときの相対的減少は前記試験化合物 がその成分に対する前記多基質酵素の作用をネガティブにモジュレートしたこと を意味する工程 を含む、前記方法。 37．試験化合物がタンパク質キナーゼの活性をモジュレートするかを求める方法 であって、 I．（a）前記タンパク質キナーゼの突然変異体を発現し、その突然変異体がリン 酸供与基質として直交性ヌクレオチド三リン酸類縁体を受容する、透過性を上げ た細胞、溶解した細胞、及び前記直交性ヌクレオチド三リン酸基質類縁体に天然 に透過できる細胞からなる群より選ばれた細胞; （b）検出可能に標識した末端リン酸を有する前記直交性ヌクレオチド三リ ン酸類縁体;及び （c）前記試験化合物 を混合する工程; II．該突然変異タンパク質キナーゼがリン酸供与体として直交性ヌクレオチド三 リン酸を用いて１種以上のタンパク質基質をリン酸化させるのに十分な条件下で 前記細胞をインキュベートする工程;及び III．前記試験化合物を取り除いた１回以上の対照実験で見出されたものに相対 する細胞成分について前記検出可能な標識の有無の増減があるかを検出し、よっ て細胞成分について前記標識の存在するときの相対的増加は前記試験化合物がそ の成分に対する前記タンパク質キナーゼの作用をポジティブにモジュレートした ことを意味し、細胞成分について前記標識の存在するときの相対的減少は前記試 験化合物がその成分に対する前記タンパク質キナーゼの作用をネガティブにモジ ュレートしたことを意味する工程 を含む、前記方法。 38．がん、HIV等の病態における薬剤分析、治療又は介入方法より選ばれた診断 及び治療法双方に使用するための抑制性の操作したタンパク質キナーゼ又はそれ に従って調製したキナーゼより選ばれた多基質酵素、その合成類縁体、その活性 断片、その同族体、及びその組合わせ。 39．薬剤スクリーニングの“ノックアウト”モデルとして機能することができる トランスジェニック動物であって、具体的な病態と関連がある具体的なキナーゼ に対応する野生型遺伝子が突然変異キナーゼをコードしている遺伝子で置換され 、前記モデルとキナーゼ阻害剤との相互作用によって前記スクリーニングが用い られる、前記トランスジェニック動物。 40．動物における標的細胞の形質転換方法であって、請求項１記載の突然変異キ ナーゼ、キナーゼ阻害剤、その作動剤及び拮抗剤、その活性断片、その類縁体、 その縮重変異体、その突然変異タンパク質、及びその組合わせからなる群より選 ばれた物質の発現にコードするDNA分子を含むベクターを調製する、前記方法。 41．薬剤スクリーニング及び付随するスクリーニング法であって、請求項１記載 の突然変異キナーゼ、その変異体、その阻害剤、その活性断片、その類縁体、及 びその組合わせより選ばれた物質を用いる、前記方法。 42．請求項１の突然変異多基質酵素、その阻害剤、その作動剤、その活性断片、 その対立遺伝子、その類縁体、その保存変異体より選ばれた活性物質、及び薬学 的に許容しうる担体を含む医薬組成物。 43．がん、HIV、アルツハイマー病より選ばれた疾患の治療のための請求項41記 載の医薬組成物の使用。
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