【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分子認識材料（分子認識能を有する成分）が固定化、もしくは担持された分子認識素子、これを用いたバイオセンサ、及びその製造方法に関し、より詳しくは、特定成分の存在/非存在、存在量又は存在濃度を検知するセンサ、及びその製造方法に関する。本発明のセンサは、特に生体由来の物質又はその類似物質を分子認識材料として利用したいわゆるバイオセンサに好適に応用できる。
【０００２】
【従来の技術】
バイオセンサは生体や生体分子の持つ優れた分子認識能を活用した計測デバイスであり、近年、医療分野のみならず、環境や食料品等への幅広い応用が期待されている。
【０００３】
一般的に、バイオセンサは測定対象とする化学物質（以下、特定物質）を認識する分子認識素子、及びその時発生する物理的、化学的な変化を検知し電気信号、光信号等の検出可能な信号へ変換する検知素子から構成される。生体内には、互いに親和性のある物質の組み合わせとして例えば酵素-基質、抗原-抗体、DNA-DNA等があり、バイオセンサはこれらの組み合わせの一方を基材に固定化もしくは担持し分子認識材料として用いることによって、もう一方の物質を選択的に計測できるという原理を利用している。また、検知素子としては、酸素電極、過酸化水素電極、イオン電極、ISFET、光ファイバ、サーミスタなど様々な形式のものが提案されており、最近ではナノグラムオーダー程度の質量変化が検知できる水晶振動子やSAW素子、表面プラズモン共鳴素子などが使われる場合もある。
【０００４】
近年では、このような化学分析システムを数センチ四方のガラスやプラスチックのような基板上に集積する研究、つまりマイクロ分析システムの研究が盛んになっている。例えば、チップ内部に反応物質を含む液体を流すために、内径１００μｍ程度のごく細い溝、つまり微小空間を作りこんだチップが研究されている。この微小空間のもつ利点には、（１）空間が狭く、物質拡散に要する時間を短縮できる、（２）試料体積に対して比表面積が大きく界面を利用した化学プロセスを迅速に行える、（３）熱容量が小さく急速な温度切り替えが可能になる、（４）分析に要する試料量、エネルギー量等が低減でき、システムの小型化も期待できる、といったことが上げられ、スケールを小さくすることで測定の短時間化、高精度化を図る試みがなされている。
【０００５】
バイオセンサにおいても、あらゆる場所に設置あるいは持ち運び可能な小型の装置で高性能な分析を短時間でできるものが期待されており、マイクロ分析システム化は重要な課題となっている。特に、分子認識素子においては前述の微小空間の利用は重要であり、これらの効果は大きい。つまり分子認識材料を基材に高濃度に固定又は担持し、この分子認識材料と特定物質の接触、認識を円滑に行うことのできる微小空間を分子認識素子に適用できれば、さらに高感度、高精度なバイオセンサが実現できると考えられているのである。
【０００６】
そして近年では、この数百μｍのオーダーの微小空間に対して、さらに小さな数十μｍ以下のオーダーの微小空間を適用しようという試みもなされている。
【０００７】
例えばこのような目的のために、基材として、ニトロセルロース膜、ナイロン膜などのミクロフィルター、紙、不織布、糸等の多孔質体を使用する方法が知られている。これらの多孔質体は、実質表面積がみかけの表面積より非常に大きく、表面に多くの分子認識材料を固定化、又は担持することで感度を上げることが出来る。
【０００８】
例えば、特許文献１には、平均孔径が０．１〜１０μｍで凝集粒子状、もしくは網目状の構造を有する多孔質層に分子認識材料を固定化又は担持する方法が開示されている。
【０００９】
また、特許文献２には、直径約２０μｍ程度のビーズに酵素を固定化し、微小流路内にこのビーズを充填して反応器を作製する方法が開示されている。
【００１０】
【特許文献１】
特開２０００−２７０５平号公報
【特許文献２】
特開２０００−２３０９１６号公報
【特許文献３】
特開平７−２６０７９０号公報
【非特許文献１】
Science, 262, 1706 (1993)
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これらの多孔質体の孔径はミクロンからサブミクロンオーダー程度であり、酵素や抗原、抗体等バイオセンサに用いる分子認識材料や特定物質の多くは、遥かに小さいサイズを有している。よって、さらに微細な構造、つまり超微小空間を持った基材を用いることができればさらに実質表面積を拡大し検出感度をさらに上げられる可能性があるのである。
【００１２】
また、前記特許文献１や特許文献２に示された基材には、その構造上、特定物質が到達できない閉塞した空間も多く存在していると思われる。これは基材の体積に対して反応に寄与できない無駄な空間となり、その分感度を低下させていることになる。
【００１３】
さらに、前記特許文献１では多孔質体における孔径の均一性が低いため、空間が狭い領域と広い領域が混在している。また、前記特許文献２においても、ビーズを完全に最密充填させることは難しく、空間のサイズに偏りが発生してしまう。そして、これらの構造上の偏りは基材中への反応物質の円滑な浸入、分散を妨げる可能性がある。このため、測定の初期の状態では、特定物質の濃度も基材中でムラとなり、位置によって反応を起こす時間にズレが生じ、本来の特定物質の濃度に応じた物理的、化学的な変化の発生（例えば酵素反応であればそれに応じて電極間に流れる電流量）が定常状態になるのに時間がかるという問題があった。さらには定量に対する精度も落ちるという問題も生じていた。
【００１４】
また、前記特許文献２では微小流路に長時間もしくは多量に検査溶液を注入して圧力をかけた場合、ビーズ自体も移動し、目詰まりを起こしてしまうという問題があった。
【００１５】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたもので、分子認識材料を高濃度で固定又は担持し、かつ特定物質が分子認識材料に短時間で円滑、均一に接触、反応することを可能とする高感度の分子認識素子、該分子認識素子を用いたバイオセンサ及びその製造方法を提供することを目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る分子認識素子の製造方法は、柱状の部材と該柱状の部材を取り囲む領域を含む構造体を用意する工程、該構造体から該柱状の部材を除去して多孔質体を形成する工程、該多孔質体に充填材料を導入する工程、及び該領域を除去する工程、該充填材料に分子認識材料を固定または担持させる工程を有することを特徴とする。
【００１７】
また、本発明に係る分子認識素子は、柱状の部材とそれを取り囲む領域を含み構成される構造体から、該柱状の部材を除去して得られる多孔質体に充填材料を導入した後、該領域を除去して得られる該充填材料に分子認識材料が固定または担持されていることを特徴とする。
ここで前記構造体は、第1の材料を含み構成される前記柱状の部材が、第２の材料を含み構成される前記領域に取り囲まれており、且つ該構造体には該第２の材料が、該第１の材料と第２の材料の全量に対して２０atomic％以上７０atomic％以下の割合で含まれているのがよい。
【００１８】
また、上記目的を達成するため、本発明に係る分子認識素子は、柱状構造体と、該柱状構造体に固定又は担持された分子認識能を有する分子認識材料とを有する分子認識素子であって、該柱状構造体は、第一の成分を含み構成される柱状物質が該第一の成分と共晶を形成し得る第二の成分を含み構成される部材中に分散している構造体から該柱状物質を除去して形成された柱状の空孔を有する多孔体を用いて該空孔内に材料を導入した後に該多孔体を除去して得られた該材料から構成される柱状の構造を有することを特徴とする。
【００１９】
前記構造体は薄膜状であることが望ましい。
【００２０】
前記多孔体に化学的処理を施した後、前記空孔内に前記材料を導入してもよく、該化学的処理は酸化処理が有用である。
【００２１】
前記柱状物質はアルミニウムであり、前記部材がシリコンであって、且つ前記構造体におけるシリコンの割合が２０atomic%以上７０atomic%以下の範囲にあること、もしくは前記柱状物質がアルミニウムであり、前記部材がゲルマニウムであって、且つ前記構造体におけるゲルマニウムの割合が２０atomic%以上７０atomic%以下であることが好ましい。
【００２２】
また、前記多孔体の主成分はシリコン、もしくはゲルマニウムであることが好ましい。
【００２３】
前記柱状構造体の柱状部分の直径は０．５ｎｍ以上１５ｎｍ未満であること、また、前記柱状構造体の柱状部分と隣合う柱状部分との間隔が５ｎｍ以上２０ｎｍ未満であることが望ましい。
【００２４】
前記柱状物質は結晶性物質であり、前記部材は非晶質物質であることが望ましい。
【００２５】
前記分子認識材料は生体物質であることが望ましい。この生体物質は、蛋白質、特に酵素や抗原、抗体であること、もしくは遺伝子であることが望ましい。
【００２６】
本発明に係るバイオセンサは、前記分子認識素子を備えることを特徴とする。
【００２７】
本発明に係る分子認識素子の製造方法は、第一の成分を含み構成される柱状物質が、第一の成分と共晶を形成し得る第二の成分を含み構成される部材中に分散している構造体を用意する工程、該柱状物質を除去する除去工程、及び該除去工程により得られる柱状の空孔を有する多孔体の該空孔内に材料を導入する導入工程、前記部材を除去し柱状構造体を用意する工程、前記柱状構造体に分子認識能を有する分子認識材料を固定又は担持する工程を有することを特徴とする。前記多孔体に化学的処理を施した後、前記空孔内に前記材料を導入してもよく、該化学的処理は酸化処理が有用である。 前記除去工程は、エッチングであることが望ましい。
【００２８】
前記導入工程は、電着、もしくは無電解析出であり、さらには、前記空孔の底部に触媒を形成した後に、触媒反応によって行う工程でも構わない。
【００２９】
以下、上記多孔体の母材となる構造体について説明を加える。
【００３０】
本発明で適用される構造体は、第１の成分と第２の成分を含み構成される構造体であって、該第１の成分を含み構成される柱状物質が、該第２の成分を含み構成される部材に取り囲まれているものである。この構成では、該構造体には該第２の成分が、該第１の成分と第２の成分の全量に対して２０atomic％以上７０atomic％以下の割合で含まれていることが望ましい。
【００３１】
上記割合は、前記構造体を構成する前記第１の成分と第２の成分の全量に対する前記第２の成分の割合のことであり、好ましくは２５atomic％以上６５atomic％以下、より好ましくは３０atomic％以上６０atomic％以下である。
【００３２】
なお、前記柱状物質は、実質的に柱状形状が実現していればよく、例えば柱状物質の成分として第２の成分が含まれていてもよいし、前記部材に第１の成分が含まれていてもよい。また、前記柱状物質やその周囲の部材に酸素、アルゴン、窒素、水素などが少量含まれていてもよい。
【００３３】
上記割合は、例えば誘導結合型プラズマ発光分析法で定量分析することにより得られる。
【００３４】
前記第１及び第２の成分としては、両者の成分系相平衡図において、共晶点を有する材料（いわゆる共晶系の材料）であることが好ましい。特に共晶点が３００℃以上好ましくは４００℃以上であるのがよい。なお、第１の成分と第２の成分として好ましい組み合わせとしては、第１の成分としてＡｌを用い、第２の成分としてＳｉを用いる形態、第１の成分としてＡｌを用い、第２の成分としてＧｅを用いる形態、あるいは第１の成分としてＡｌを用い、第２の成分としてＳｉxＧｅ1-x（０＜ｘ＜１）を用いるのが好ましい。
【００３５】
前記柱状物質の平面形状は、円形あるいは楕円形状である。前記構造体には、前記第２の成分を含み構成されるマトリックス中に複数の前記柱状物質が分散していることになる。柱状物質の径（平面形状が円の場合は直径）は、主として前記構造体の組成（即ち、前記第２の成分の割合）に応じて制御可能であるが、その平均径は、０．５ｎｍ以上５０ｎｍ以下、好ましくは０．５ｎｍ以上２０ｎｍ以下、さらに好ましくは０．５ｎｍ以上１５ｎｍ以下である。楕円等の場合は、最も長い外径部が、上記範囲内であればよい。ここで平均径とは、例えば、実際のＳＥＭ写真（約１００ｎｍ×７０ｎｍの範囲）で観察される柱状の部分を、その写真から直接、あるいはコンピュータで画像処理して、導出される値である。平均径の下限としては１ｎｍ以上、あるいは数ｎｍ以上であることが実用的な下限値である。
【００３６】
また、複数の柱状物質間の中心間距離２Ｒは、２ｎｍ以上３０ｎｍ以下、好ましくは５ｎｍ以上２０ｎｍ以下、更に好ましくは５ｎｍ以上１５ｎｍ以下である。勿論、中心間距離の下限として上記２Ｒは、柱状物質どうしが接触しない間隔は最低限備えている必要がある。
【００３７】
前記構造体は、膜状の構造体であることが好ましく、かかる場合、前記柱状の部材は膜の面内方向に対して略垂直になるように前記第２の成分を含み構成されるマトリックス中に分散していることになる。膜状構造体の膜厚としては、特に限定されるものではないが、１ｎｍ〜１００μｍの範囲で適用できる。プロセス時間等を考慮してより現実的な膜厚としては、１ｎｍ〜１μｍ程度である。特に３００ｎｍ以上の膜厚でも柱状構造が維持されていることが好ましい。
【００３８】
前記構造体は膜状の構造体であることが好ましく、基板上に当該構造体が設けられていてもよい。基板としては、特に限定されるものではないが、石英ガラスなどの絶縁性基板、シリコン基板、ガリウム砒素、あるいはインジウム燐などの半導体基板、アルミニウムなどの金属基板あるいは支持部材としての基板上に上記構造体が形成できるのであれば、フレキシブル基板（例えばポリイミド樹脂など）も用いることができる。
【００３９】
前記構造体は、非平衡状態で成膜する方法を利用して作製することができる。当該成膜方法としては、スパッタリング法が好ましいが、抵抗加熱蒸着、電子ビーム蒸着（ＥＢ蒸着）、イオンプレーティング法をはじめとする任意の非平衡状態で物質を形成する成膜法が適用可能である。スパッタリング法で行う場合には、マグネトロンスパッタリング、ＲＦスパッタリング、ＥＣＲスパッタリング、ＤＣスパッタリング法を用いることができる。スパッタリング法で行う場合は、アルゴンガス雰囲気中で反応装置内の圧力を０.２Ｐａから1Ｐａ程度にして成膜を行う。スパッタリングの際には、ターゲット原料として前記第１の材料と第２の材料をそれぞれ別途用意しても良いが、予め所望の割合で第１の材料と第２の材料が焼成されたターゲット材料を用いてもよい。
【００４０】
基板上に形成される前記構造体は、基板温度を２０℃以上３００℃以下、好ましくは２０℃以上２００℃以下で形成されることが好ましい。
【００４１】
前記構造体から前記柱状物質を除去（ウェットエッチングあるいはドライエッチングなど）することにより複数の柱状の孔を有する多孔体（多孔質体）が形成される。エッチングには、柱状の部材を選択的に除去できればよく、エッチング液としては例えば、燐酸、硫酸、塩酸、硝酸などの酸が好適である。当該除去により形成される多孔体の孔は、互いに連結せず独立していることが好適である。
【００４２】
上記構造体から多孔体を作製する方法として、第１の成分と第２の成分を含み構成される構造体であって、該第１の成分を含み構成される柱状の部材が、該第２の成分を含み構成される領域に取り囲まれており、且つ該構造体には該第２の成分が、該第１の成分と第２の成分の全量に対して２０atomic％以上７０atomic％以下の割合で含まれている該構造体を用意する工程、及び該構造体から該柱状の部材を除去する工程を有することが望ましい。
【００４３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に係る分子認識素子、これを用いたバイオセンサ、及びその製造方法の実施の形態を添付図面を参照して説明する。
【００４４】
本実施形態は、従来の多孔質体と比較して、細孔径、及び、細孔の配列間隔が非常に微小で、かつ基板に垂直でストレートな細孔を有する新規の多孔質体を用いて、図１に示すように基板１２上に超微細構造を持つ３次元柱状構造体１１を作製し、該３次元柱状構造体１１の表面に分子認識材料（後述参照）を固定、又は担持することで高感度分子認識素子を作製したものである。
【００４５】
まず、本実施形態による多孔質膜について説明する。
【００４６】
基板上に、例えばスパッタリング等の方法で、互いに共晶系にある複数の物質の膜を形成した場合、各々の成分は、膜中において混合することなく独立に存在する。そして、特定の材料系について、成膜条件と物質の組成が最適化された場合、図２に示すように、ある成分が微細な径をもつ柱状の形態、すなわち柱状物質２２となって、他成分のマトリックス２３中に分散して存在した構造が形成される。この構造は、本発明者らによって発見された新規な構造体であり、柱状物質２２は、基板２１との界面から膜表面まで貫通して存在する。形成される柱状物質２２の１本の柱の径は、０．５ｎｍから１５ｎｍの範囲である。また、柱状物質２２の中心間間隔は、５ｎｍから２０ｎｍの範囲にある。
【００４７】
具体例を用いて説明すると、スパッタリングでアルミニウムとシリコンの混合膜を基板上に作製した場合、条件が最適化されると、非晶質なシリコンのマトリクス中に結晶性の柱状アルミニウムが形成される。形成される柱状アルミニウムの１本の柱の径は、０．５ｎｍから１５ｎｍの範囲である。アルミニウムは、膜中において、基板界面から膜表面に至るまで、単一の柱として存在していることが走査型電子顕微鏡の観察によって示されている。同様の構造は、スパッタリングで作製したアルミニウムとゲルマニウムの混合膜に関しても、形成が確認されている。膜厚は、スパッタリング時間を調整することで制御することが可能であり、スパッタリングを中断しない限り、膜厚を厚くしても柱状構造が途切れることはない。
【００４８】
本実施形態は、図３に示すように、上記の柱状物質を含む膜から柱状物質を除去したものを多孔質膜３３として用い、その細孔３２に３次元柱状構造体の材料となる物質を導入し、該多孔質膜を除去することによって前述の図１の示す３次元柱状構造体１１を得て、さらに、その３次元柱状構造体１１に分子認識材料（後述参照）を固定、または担持することで高感度分子認識素子を作製し得たものである。
【００４９】
次に、本実施形態の製造方法について説明する。
【００５０】
以下の工程（Ａ）〜工程（Ｃ）により、図１のような非常に微細な構造を持った３次元柱状構造体に分子認識材料を固定または担持した分子認識素子を作製することができる。図４は、本実施形態による分子認識素子の製造方法を示した断面模式図である。
工程（Ａ）：多孔質膜の作製
まず、基板上に多孔質膜（図４（ｃ）参照）を形成する工程を説明する。
【００５１】
図４（ａ）に示すように、基板４１を用意する。この基板４１は、基本的に材質や厚さを限定されるものではなく、バイオセンサおける検知素子の方式にあわせて適宜決定すればよい。具体的にはガラス、金属、セラミックス、半導体、有機物等種々のものが使用可能である。ただし、後に説明する多孔質膜の空孔内に目的の３次元柱状構造体を形成する材料を導入する工程（Ｂ）において、導入する方法として電着法を用いる場合は導電性基板であるほうが望ましい。非導電性の基板で電着法を用いたい場合は、基板表面に導電性薄膜を形成すれば可能である。
【００５２】
次に、図４（ｂ）に示すように、互いに共晶径を形成する材料を適当な比率で含むターゲットを用いて、スパッタリング法等を用いて、柱状形態の第一の成分である柱状物質４２が他成分のマトリクス４３中に分散されている構造の薄膜を、基板４１上に作製する。この場合、使用するターゲットは、２つの成分の混合体に限定されるものではなく、一方の物質の上にもう一方の物質が置かれているようなものでも良く、また、２つの物質が所望の面積比を与えるように貼りあわせられているような構成のものでも良い。例示すると、アルミニウムターゲット上にシリコンウエハーを適当な量置いた状態でスパッタリングを行うことで上記構造の膜を基板上に作製することができる。
【００５３】
膜形成は、スパッタリングを例にとって説明するが、同様の構造が形成できる成膜法であれば、本発明に適用することができる。
【００５４】
形成される柱状物質４２の柱一本の平均径２ｒは、０．５ｎｍから１５ｎｍの範囲であり、また柱状物質の平均中心間間隔２Ｒは、５ｎｍから２０ｎｍの範囲にある（図４（ｂ）参照）。
【００５５】
次に、図４（ｃ）に示すように、作製した構造体から、柱状物質を除去して、細孔４４を有する多孔質膜４５を形成する。柱状物質の選択除去には、ウェットエッチングが好ましく用いられる。例えば、非晶質なシリコンのマトリクス中に形成された結晶性の柱状アルミニウムの場合には、リン酸や硫酸でエッチングすることによって、シリコンの形状を変化させることなく、アルミニウムのみを除去し細孔４４を形成することが可能である。
【００５６】
またここでは、その後のプロセスを簡便に行うため、形成された多孔質膜に対して化学処理を施し、多孔質膜の性質を変化させる工程を行うこともある。この場合の化学処理とは、具体的には酸化処理等を示す。
工程（Ｂ）：３次元柱状構造体の作製
図４（ｄ）に示すように、上記工程（Ａ）によって作製した多孔質膜４５の細孔４４内に目的の３次元柱状構造体を形成する材料46を導入する。この３次元柱状構造体形成材料46には、金、銀、銅、白金、パラジウム、ニッケル、鉄、チタン、シリコン等金属類の単体、あるいは合金や酸化シリコン、窒化シリコンなどの半導体、ポリアニリン等の高分子材料を用いることが出来るが、本発明はこれらに限るものではない。すなわち、後に説明する工程（Ｃ）において分子認識材料の固定化、又は担持を行うことが可能な材料であればよい。例えば、金はチオール基を介することで、またシリコンはシラノール基を介することで、種々の分子を担持、又は固定化することが可能であり、金等の貴金属類やシリコン、酸化シリコンは３次元柱状構造体材料に好適である。
【００５７】
導入方法については、基板が導電性を有していれば、電着プロセスによって金属等は簡単に導入することができる。また、電着プロセス等で空孔の底に触媒となる物質を形成し、その触媒の作用によって目的の材料を形成しても良い。また、細孔底部の触媒は、多孔質膜を形成する前に基板表面に蒸着等の方法によって形成しておいても良い。
【００５８】
この操作によって、図４（ｄ）に示すように、最初の膜において柱状物質を取り囲んでいたマトリクス中に、目的の３次元柱状構造体形成材料で構成される構造体が形成される。
【００５９】
次に、図４（ｅ）に示すように、３次元柱状構造体形成材料４６の周囲のマトリクス４３成分を除去する。この操作により、マトリクス４３成分のみを選択的に除去し、周りを何も取り囲まれていない３次元柱状構造体４７が基板４１上に配列した構造である３次元柱状構造体４７が形成される。
【００６０】
選択的にマトリクス成分を除去する方法としては、例えばエッチング等のプロセスを適用することが可能である。例えば、シリコンが最初の多孔質材料であり、工程（Ａ）において化学処理を施し酸化ケイ素に変化した場合には、希フッ酸によるエッチングが良好に適用可能である。
【００６１】
以上の工程により、図１に示すような３次元柱状構造体が基板上に形成される。また、形成される３次元柱状構造体の柱の平均径２ｒ´は、０．５ｎｍから１５ｎｍであり、その平均中心間隔２Ｒ´は５ｎｍから２０ｎｍの範囲にある（図４（ｅ）参照）。このサイズは、特に生体由来の物質又はその類似物質の担持、及び固定化に好適であり、バイオセンサ用の分子認識素子として非常に有用である。
工程（Ｃ）：３次元柱状構造体への分子認識材料の担持
本実施形態で使用する分子認識材料は、測定溶液中の特定成分の選択に係わる物質であり、例えば、測定溶液中の特定成分と選択的に直接反応する物質（いわゆるレセプター）、特定すべき成分の反応に係わる物質（例えば、特定成分の反応に選択的に触媒作用をもたらす物質）、測定溶液中の特定成分以外の物質を不活性化する物質等である。また、この分子認識材料は、検出の有無や程度の表示に係わる機能、例えば、レセプターが放出する物質や残余の物質と反応し発色する能等を兼ねるものであってもよい。
【００６２】
本実施形態に使用される分子認識材料には、特に制約はないが、例えば、酵素、糖鎖、触媒、抗体、抗原、遺伝子、呈色試薬、などが挙げられるが、本発明はこれに限るものではない。
【００６３】
これらの分子認識材料は、例えば、共有結合、イオン結合、吸着などによって、３次元柱状構造体に固定又は担持されるが、分子認識材料が良好に固定又は担持されれば、方法はこれに限らない。
【００６４】
結合による方式では、３次元柱状構造体表面に直接作用できる反応基を持った分子認識材料を直接反応させて結合させてもよいし、３次元柱状構造体表面に直接作用出来る架橋材料を反応させて、さらに該架橋材料に分子認識材料を反応させることで結合させても構わない。
【００６５】
吸着による方式では、分子認識機材料と、３次元柱状構造体の素材との組み合わせにおいて、適当な親和性を有する組み合わせを選択すればよい。また、３次元柱状構造体表面をいったん表面修飾することで、適当な親和性を有する表面を形成し、分子認識材料を固定化することも可能である。
【００６６】
以上のような操作で、図４（ｆ）に示すように、３次元柱状構造体表面に分子認識材料４８を固定化して分子認識素子４９を形成することができる。
【００６７】
以上の工程（Ａ）〜工程（Ｃ）によって、非常に微細な構造を持った３次元柱状構造体に分子認識材料を固定または担持した分子認識素子を作製することができる。
【００６８】
該分子認識素子は、基板上に形成した該多孔質膜を利用して作製した３次元柱状構造体を用いるものである。よって、該多孔質膜を基板上にパターニングすることにより、該分子認識素子も基板上に容易にパターニングすることが出来る。また、３次元柱状構造体の高さも均一に揃えることが可能で、かつこの高さをナノメートルオーダーまで微細にすることも出来る。センサのマイクロ分析システム化においては、基板上に素子を高密度に集積することが重要であり、この形態は非常に有利である。
【００６９】
次に、該分子認識素子を用いたセンサ、特にバイオセンサについて説明する。
【００７０】
前述のように、一般的に、バイオセンサは分子認識素子と検知素子から構成される。
【００７１】
検知素子は、分子認識素子が特定しようとする物質を認識したときに起こる反応を電流、電圧、光量、質量、熱量等の変化として捉えて表示する。現在でも、検知素子として酸素電極、過酸化水素電極、ISFET、光ファイバ、SAW、サーミスタ等数多くの検知素子が提案されているが、本発明のバイオセンサは高感度、高精度の分子認識素子を用いることが特徴であり、組み合わせる検知方式はこれらに限定されるものではない。
【００７２】
また、前記分子認識材料は、複合して使用することも可能であり、例えば、複合酵素センサ、抗体−酵素センサ、酵素−微生物ハイブリッドセンサ、などを構成することも可能である。
【００７３】
本発明のバイオセンサの測定対象は、直接分子認識材料が反応する特定物質である必要はなく、間接的に測定できるものでもよい。例えば、測定対象に特異的に存在する特定物質を検出することで測定が可能となる。よって、測定対象は、生体物質に限るものではなく、またそのサイズも限定されるものではない。ただし、特定物質は糖、蛋白質、アミノ酸、抗体、抗原や疑似抗原、ビタミン、遺伝子などの生物に含有される生体物質、及び、その関連物質や人工的に合成された擬似生体物質であることが望ましい。
【００７４】
以上説明した本発明の要旨は、互いに共晶系にある複数の物質の膜を最適条件で形成し、第一の成分を含む微細な径の柱状物質が、第二の成分を含む部材中に分散して存在した構造体を作製し、該柱状物質を除去して柱状の空孔を有する多孔質膜を形成し、該多孔質膜の空孔内に材料を導入した後に該多孔質膜を除去して得られた3次元柱状構造体に分子認識能を有する成分を高濃度で固定又は担持して分子認識素子を作製するというものである。
【００７５】
さらに該分子認識素子と検知素子を組み合わせる事で高感度、高精度、短時間測定可能なバイオセンサを提供するというものである。
【００７６】
【実施例】
（実施例１：第１の材料Ａｌ、第２の材料Ｓｉ）
本実施例では、多孔質膜として、シリコンに周囲を囲まれたアルミニウム構造体部分が円柱状構造であり、その径２ｒが３ｎｍであり、間隔２Ｒが７ｎｍ、長さＬが２００ｎｍであるアルミニウム細線を得た。
【００７７】
まず、アルミニウム細線の作製方法を説明する。
【００７８】
ガラス基板上に、ＲＦマグネトロンスパッタリング法を用いて、シリコンをアルミニウムとシリコンの全量に対して５５ａｔｏｍｉｃ％含んだアルミニウムシリコン混合膜を約２００ｎｍ形成する。ターゲットには、４インチのアルミニウムターゲット上に１５ｍｍ角のシリコンチップ１３を８枚おいたものを用いた。スパッタ条件は、ＲＦ電源を用いて、Ａｒ流量：５０ｓｃｃｍ、放電圧力：０．７Ｐａ、投入電力：１ｋＷとした。また、基板温度は室温とした。
【００７９】
なお、ここではターゲットとして、アルミニウムターゲット上にシリコンチップを８枚置いたものを用いたが、シリコンチップの枚数はこれに限定されるものではなく、スパッタ条件により変化し、アルミニウムシリコン混合膜の組成が約５５ａｔｏｍｉｃ％近辺になれば良い。また、ターゲットはアルミニウムターゲット上にシリコンチップを置いたものに限定したものではなく、シリコンターゲット上にアルミニウムチップを置いたものでも良いし、シリコンとアルミニウムの粉末を焼結したターゲットを用いても良い。
【００８０】
次に、このようにして得られたアルミニウムシリコン混合膜をＩＣＰ（誘導結合型プラズマ発光分析）にて、シリコンのアルミニウムとシリコンの全量に対する分量（ａｔｏｍｉｃ％）を分析した。その結果、シリコンのアルミニウムとシリコンの全量に対する分量は約５５ａｔｏｍｉｃ％であった。なお、ここでは測定の都合上、基板として、カーボン基板上に堆積したアルミニウムシリコン混合膜を用いた。
【００８１】
ＦＥ−ＳＥＭ（電界放出走査型電子顕微鏡）にて、アルミニウムシリコン混合膜を観察した。基板真上方向から見た表面の形状は、シリコンに囲まれた円形のアルミニウムナノ構造体が二次元的に配列していた。アルミニウムナノ構造体部分の孔径は３ｎｍであり、その平均中心間間隔は７ｎｍであった。また、断面をＦＥ−ＳＥＭにて観察した所、高さは２００ｎｍであり、それぞれのアルミニウムナノ構造体部分はお互いに独立していた。
【００８２】
また、Ｘ線回折法でこの試料を観察した所、結晶性を示すシリコンのピークは確認できず、シリコンは非晶質であった。
【００８３】
従って、シリコンに周囲を囲まれた間隔２Ｒが７ｎｍ、径２ｒが３ｎｍ、高さＬが２００ｎｍのアルミニウム細線を含んだアルミニウムシリコンナノ構造体を作製することができた。
【００８４】
（比較例）
上記実施例の比較試料Ａとして、ガラス基板上に、スパッタ法を用いて、シリコンをアルミニウムとシリコンの全量に対して１５ａｔｏｍｉｃ％含んだアルミニウムシリコン混合膜を約２００ｎｍ形成した。ターゲットには、４インチのアルミニウムターゲット上に１５ｍｍ角のシリコンチップ１３を２枚おいたものを用いた。スパッタ条件は、ＲＦ電源を用いて、Ａｒ流量：５０ｓｃｃｍ、放電圧力：０．７Ｐａ、投入電力：１ｋＷとした。また、基板温度は室温とした。
【００８５】
ＦＥ−ＳＥＭ（電界放出走査型電子顕微鏡）にて、比較試料Ａを観察した。基板真上方向から見た表面の形状は、アルミニウム部分は円形状にはなっておらず、縄状になっていた。即ち、アルミニウムの柱状構造体がシリコン領域内に均質に分散した微細構造体となっていなかった。さらに、その大きさは１０ｎｍを遥かに超えていた。また、断面をＦＥ−ＳＥＭにて観察した所、アルミニウム部分の幅は１５ｎｍを超えていた。なお、このようにして得られたアルミニウムシリコン混合膜をＩＣＰ（誘導結合型プラズマ発光分析）にて、シリコンのアルミニウムとシリコンの全量に対する分量（ａｔｏｍｉｃ％）を分析した。その結果、シリコンのアルミニウムとシリコンの全量に対する分量は約１５ａｔｏｍｉｃ％であった。
【００８６】
さらに、比較試料Ｂとして、ガラス基板上に、スパッタ法を用いて、シリコンをアルミニウムとシリコンの全量に対して７５ａｔｏｍｉｃ％含んだアルミニウムシリコン混合膜を約２００ｎｍ形成した。ターゲットには、４インチのアルミニウムターゲット上に１５ｍｍ角のシリコンチップ１３を１４枚おいたものを用いた。スパッタ条件は、ＲＦ電源を用いて、Ａｒ流量：５０ｓｃｃｍ、放電圧力：０．７Ｐａ、投入電力：１ｋＷとした。また、基板温度は室温とした。
【００８７】
ＦＥ−ＳＥＭ（電界放出走査型電子顕微鏡）にて、比較試料Ｂを観察した。基板真上方向から見た試料表面には、アルミニウム部分を観察することができなかった。また、断面をＦＥ−ＳＥＭにて観察しても、明確にアルミニウム部分を観察することができなかった。なお、このようにして得られたアルミニウムシリコン混合膜をＩＣＰ（誘導結合型プラズマ発光分析）にて、シリコンのアルミニウムとシリコンの全量に対する分量（ａｔｏｍｉｃ％）を分析した。その結果、シリコンのアルミニウムとシリコンの全量に対する分量は約７５ａｔｏｍｉｃ％であった。
【００８８】
また、比較試料Ａを作製した場合と、シリコンチップの枚数の条件のみを変え、アルミニウムシリコン混合体の全量に対するシリコンの割合が、２０ａｔｏｍｉｃ％、３５ａｔｏｍｉｃ％、５０ａｔｏｍｉｃ％、６０ａｔｏｍｉｃ％、７０ａｔｏｍｉｃ％である試料を作製した。アルミニウムの柱状構造体がシリコン領域内に均質に分散した微細構造体となっている場合を○、なっていない場合を×としたものを以下に示す。
【００８９】
【表１】
このように、アルミニウムとシリコンの全量に対するシリコン含有量を、２０ａｔｏｍｉｃ％以上７０ａｔｏｍｉｃ％以下に調整することで、作製されたアルミニウムナノ構造体の孔径の制御が可能であり、また、直線性に優れたアルミニウム細線の作製が可能になる。なお、構造の確認には、ＳＥＭの他にもＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）等を利用するのがよい。なお、上記含有量に関しては上記シリコンに代えてゲルマニウム、あるいはシリコンとゲルマニウムの混合物を用いても同様であった。
【００９０】
さらに、比較試料Ｃとして、ガラス基板上に、スパッタ法を用いて、シリコンをアルミニウムとシリコンの全量に対して５５ａｔｏｍｉｃ％含んだアルミニウムシリコン混合膜を約２００ｎｍ形成した。ターゲットには、４インチのアルミニウムターゲット上に１５ｍｍ角のシリコンチップ１３を８枚おいたものを用いた。スパッタ条件は、ＲＦ電源を用いて、Ａｒ流量：５０ｓｃｃｍ、放電圧力：０．７Ｐａ、投入電力：１ｋＷとした。また、基板温度は２５０℃とした。
【００９１】
ＦＥ−ＳＥＭ（電界放出走査型電子顕微鏡）にて、比較試料Ｃを観察した。基板真上方向から見た試料表面には、アルミニウムとシリコンの明瞭な境界を確認することができなかった。つまり、アルミニウムナノ構造体を確認することができなかった。即ち、基板温度が高すぎると、より安定な状態に変化してしまうため、このようなアルミニウムナノ構造体を形成する膜成長ができていないと思われる。
【００９２】
なお、柱状の部材が分散した構造体を得る為に、ターゲットの組成をＡｌ：Ｓｉ＝５５：４５などに設定することも好ましい形態である。
【００９３】
以下、実施例を用いてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、反応条件等は、同様な構造の分子認識素子、及びバイオセンサが得られる範囲で自由に変えることが可能である。
【００９４】
以下、実施例２、３、４に分子認識素子を作製した例、実施例５、６、７、８に該分子認識素子を用いてバイオセンサを作製した例を示す。
（実施例２）
本実施例は、共晶を形成する物質としてアルミニウムとシリコンを用い酸化シリコンの多孔質膜を作製し、該多孔質膜を用いて金の３次元柱状構造体を作製し、分子認識材料としてグルコースオキシターゼを３次元柱状構造体に固定して分子認識素子を作製した例である。なお、グルコースオキシターゼは、グルコースの酸化反応に対する触媒能を持った酵素であり、グルコースに対する代表的な分子認識材料である。
【００９５】
まず、シリコン多孔質膜の作製方法について説明する。
【００９６】
ＲＦマグネトロンスパッタリング法によって、タングステンを２０ｎｍ堆積したシリコン基板上に２００ｎｍのアルミニウム−シリコン混合膜を成膜した。ターゲットは、４インチのアルミニウムターゲット上に１５ｍｍ角のシリコンチップを６枚おいたものである。スパッタは、ＲＦ電源を用いて、Ａｒ流量：５０ｓｃｃｍ、放電圧力：０．７Ｐａ、投入電力：３００Ｗの条件で行った。また、基板温度は室温とした。
【００９７】
ここではターゲットとして、アルミニウムターゲット上にシリコンチップを６枚置いたものを用いたが、シリコンチップの枚数はスパッタ条件により変化するため、これに限定されるものではなく、後述するような、柱状のアルミウムがシリコン中に分散した所望の構造が形成できるものであればよい。また、ターゲットは、アルミニウムターゲット上にシリコンチップを置いたものに限定したものではなく、シリコンターゲット上にアルミニウムチップを置いたものでも良いし、シリコンとアルミニウムの粉末を焼結したターゲットを用いても良い。
【００９８】
さらに、ここではスパッタリング法としてＲＦスパッタリング法を用いたが、これに限定されるものではなく、ＥＣＲスパッタリング法、ＤＣスパッタリング法、イオンビームスパッタリング法でもよい。さらに、スパッタリング条件は装置に依存しており、これに限定されるものではない。また、スパッタ法以外の蒸着法であっても、所望の構造体が形成できる方法であれば、本発明に適用可能である。
【００９９】
次に、このようにして得られたアルミニウム−シリコン混合膜をＩＣＰ（誘導結合型プラズマ発光分析）にて、アルミニウムとシリコンの全量に対する該シリコンの分量（atomic％）を分析した。その結果、アルミニウムとシリコンの全量に対する該シリコンの分量は約３７atomic％であった。
【０１００】
電界放出走査型電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）にて、以上の様に作製されたアルミニウム−シリコン混合膜を観察したところ、シリコン部材に囲まれたほぼ円形の微細な柱状アルミニウムが二次元的に配列していた。柱状アルミニウム部分の画像処理より求めた平均径は２ｒは５ｎｍであり、その平均中心間隔２Ｒは１０ｎｍであった。また、断面をＦＥ−ＳＥＭにて観察したところ、膜の高さＬは、２００ｎｍであり、それぞれの柱状アルミニウムの部分は互いに独立していた。
【０１０１】
また、Ｘ線回折法でこの薄膜試料を分析したところ、シリコンの回折線は確認できず、シリコンは非晶質であることがわかった。一方、複数のアルミニウムの回折線が確認できたことより、アルミニウムは多結晶であることが分かった。
【０１０２】
以上のことから、非晶質シリコンに周囲を囲まれ、平均径５ｎｍ、平均高さ２００ｎｍの結晶性の柱状アルミニウムが平均間隔１０ｎｍで配列されたアルミニウム−シリコン構造体の作製が確認できた。
【０１０３】
このアルミニウム−シリコン構造体９８％硫酸中にて２４時間浸し、アルミニウム柱状構造部分のみを選択的にエッチングして細孔を形成した。エッチング後の膜をＦＥ−ＳＥＭで観察した結果、柱状のアルミニウムのみが除去され、多孔質膜になっていることが確認された。シリコン部の形状は、アルミニウム除去前と比較して実質的に変化していないことがわかった。この場合も断面をＦＥ−ＳＥＭで観察したところ、アルミニウムは基板界面まで完全に除去されていることが明らかとなった。
【０１０４】
以上の工程によって、基板上に基板に対して垂直な貫通孔を有するシリコンの多孔質膜を作製した。
【０１０５】
最後に、作製されたシリコン多孔質膜を酸素雰囲気中で加熱した。ここでは、大気圧で酸素を５０ｓｃｃｍ流しながら、８００℃で２時間加熱した。この結果、酸化ケイ素多孔質膜が作製された。酸化ケイ素の形成は、広域電子エネルギー損失構造解析（ＥＥＬＳ）により確認された。酸化処理を行った後の多孔質膜をＦＥ−ＳＥＭで観察した結果、細孔径にはほとんど変化が認められなかった。
【０１０６】
次に、作製した多孔質膜の細孔に３次元柱状構造体形成材料を導入し、３次元柱状構造体を作製する方法について説明する。
【０１０７】
まず、上記の工程で作製したシリコン多孔質膜を市販の電気メッキ液（高純度化学研究所製金用電気メッキ液、商品コードＫ−２４Ｅ）中に入れ、４０℃に保持した酸性浴（ｐＨ＝４．５）中において、０．５Ａ／ｄｍ2の電流密度で電着を行った。
【０１０８】
金の電着を行った後の膜は、純水で洗浄した後、ＦＥ−ＳＥＭで、表面及び断面の観察を行った。その結果、金が細孔中に均一に導入され、柱状構造を形成していることが確認された。
【０１０９】
この膜をさらに２％のフッ化水素酸中に浸漬し、金の周囲に存在する酸化ケイ素の除去を行った。酸化ケイ素の除去後のシリコン基板をＦＥ−ＳＥＭで観察した結果、表面に微細な柱状構造の金が高密度で配列された３次元柱状構造体が形成されていることが確認された。画像処理より求めた柱状の金の平均径２ｒ´は４ｎｍであり、その平均中心間隔２Ｒは１０ｎｍであった。
【０１１０】
次に、作製した金の３次元柱状構造体に分子認識材料としてグルコースオキシターゼを固定化して分子認識素子を作製する方法について説明する。
【０１１１】
本実施例では、グルコースオキシターゼをアルカンチオール分子を介して金の３次元柱状構造体表面に固定化した。
【０１１２】
チオール分子は、貴金属類と自発的に結合することが知られているが、さらにチオール分子にアルキル基が導入されているとチオール分子が貴金属表面で規則的に配列するようになる。よって、該チオール分子を介することで、グルコースオキシターゼの規則的な配位を可能とし、グルコースオキシターゼを密に、また、多量に固定化することが可能となる。
【０１１３】
また、本実施例では、チオール分子を３次元柱状構造体表面に結合させた後に架橋材料をチオール分子に結合させて、該架橋分子にグルコースオキシターゼを結合させた。該方法は、操作数は増えるが架橋分子を使うことで様々な分子認識材料を固定化することが可能となる。
【０１１４】
図５は、金の３次元柱状構造体表面におけるグルコースオキシターゼの固定化を模式的に示した図である。
【０１１５】
５ｍＭのメルカプトアルキルカルボン酸（図５（ａ）中の符号５２参照）、２５パーセントエタノール、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に３０分間、金の３次元柱状構造体５１を浸漬する（図５（ａ）から図５（ｂ）に示す３次元柱状構造体５１の表面変化参照）。
【０１１６】
次に、１０ｍＭ１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（図５（ｂ）中の符号５３参照）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に３０分間、金の３次元柱状構造体５１を浸漬し、引き続き、１０ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスルホフォコハク酸イミドナトリウム（図５（ｂ）中の符号５４参照）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に３０分間、金の３次元柱状構造体５１を浸漬する（図５（ｂ）から図５（ｃ）に示す３次元柱状構造体５１の表面変化参照）。
【０１１７】
最後に、予め５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析したグルコースオキシターゼ（図５（ｃ）中の符号５５参照）の溶液中に、金の３次柱状元構造体５１を浸漬する（図５（ｃ）から図５（ｄ）に示す３次元柱状構造体５１の表面変化参照）。
【０１１８】
なお、各工程後、緩衝溶液により基板洗浄を行い、未反応物等は除去した。
【０１１９】
以上の方法により、本実施例では、金の３次元柱状構造体表面にグルコースオキシターゼを固定化し、分子認識材料を高濃度に固定化した分子認識素子を作製した。
（実施例３）
本実施例は、共晶を形成する物質としてアルミニウムとゲルマニウムを用いゲルマニウムの多孔質膜を作製し、該多孔質膜を用いて金の３次元柱状構造体を作製し、分子認識材料としてビオチンを金の３次元柱状構造体に固定して分子認識素子を作製した例である。
【０１２０】
なお、ビオチンはアビジンと特異的に結合する補酵素であり、この強い結合を利用して多くの物質や構造を標識することが可能であり、有用な分子認識材料である。
【０１２１】
まず、ゲルマニウム多孔質膜の作製方法について説明する。
【０１２２】
ＲＦマグネトロンスパッタリング法によって、タングステンを２０ｎｍ堆積したシリコン基板上に２００ｎｍのアルミニウム−ゲルマニウム混合膜を成膜した。ターゲットは４インチのアルミニウムターゲット上に１５ｍｍ角のゲルマニウムチップを４枚おいたものである。スパッタは、ＲＦ電源を用いて、Ａｒ流量：５０ｓｃｃｍ、放電圧力：０．７Ｐａ、投入電力：１ｋＷの条件で行った。また、基板温度は室温とした。
【０１２３】
ここではターゲットとして、アルミニウムターゲット上にゲルマニウムチップを４枚置いたものを用いたが、ゲルマニウムチップの枚数はスパッタ条件により変化するため、これに限定されるものではなく、後述するような、柱状のアルミウムがゲルマニウム中に分散した所望の構造が形成できるものであればよい。また、ターゲットはアルミニウムターゲット上にゲルマニウムチップを置いたものに限定したものではなく、ゲルマニウムターゲット上にアルミニウムチップを置いたものでも良いし、ゲルマニウムとアルミニウムの粉末を焼結したターゲットを用いても良い。
【０１２４】
さらに、ここではスパッタリング法としてＲＦスパッタリング法を用いたが、これに限定されるものではなく、ＥＣＲスパッタリング法、ＤＣスパッタリング法、イオンビームスパッタリング法でよい。さらに、スパッタリング条件は装置に依存しており、これに限定されるものではない。また、スパッタ法以外の蒸着法であっても、所望の構造体が形成できる方法であれば、本発明に適用可能である。
【０１２５】
次に、このようにして得られたアルミニウム−ゲルマニウム混合膜をＩＣＰ（誘導結合型プラズマ発光分析）にて、アルミニウムとゲルマニウムの全量に対する該ゲルマニウムの分量（atomic％）を分析した。その結果、アルミニウムとゲルマニウムの全量に対する該ゲルマニウムの分量は約３７atomic％であった。
【０１２６】
電界放出走査型電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）にて、以上の様に作製されたアルミニウム−ゲルマニウム混合膜を観察したところ、ゲルマニウム部材に囲まれたほぼ円形の微細な柱状アルミニウムが二次元的に配列していた。柱状アルミニウム部分の画像処理より求めた平均径は２ｒは１０ｎｍであり、その平均中心間隔２Ｒは１５ｎｍであった。また、断面をＦＥ−ＳＥＭにて観察した所、膜の高さＬは２００ｎｍであり、それぞれの柱状アルミニウムの部分はお互いに独立していた。
【０１２７】
また、Ｘ線回折法でこの薄膜試料を分析したところ、ゲルマニウムの回折線は確認できず、ゲルマニウムは非晶質であることがわかった。一方、複数のアルミニウムの回折線が確認できたことより、アルミニウムは多結晶であることが分かった。
【０１２８】
以上のことから、非晶質シゲルマニウムに周囲を囲まれた間隔２Ｒが１５ｎｍ、径２ｒが１０ｎｍ、高さＬが２００ｎｍの結晶性の柱状アルミニウムを含んだアルミニウム−ゲルマニウム構造体の作製が確認できた。
【０１２９】
このアルミニウム−ゲルマニウム構造体を９８％硫酸中にて２４時間浸し、アルミニウム柱状構造部分のみを選択的にエッチングして細孔を形成した。エッチング後の膜をＦＥ−ＳＥＭで観察した結果、柱状のアルミニウムのみが除去され、多孔質膜になっていることが確認された。ゲルマニウム部の形状は、アルミニウム除去前と比較して実質的に変化していないことがわかった。この場合も断面をＦＥ−ＳＥＭで観察したところ、アルミニウムは基板界面まで完全に除去されていることが明らかとなった。以上の工程によって、基板上に基板に対して垂直な貫通孔を有するゲルマニウムの多孔質膜を作製できた。
【０１３０】
次に、作製した多孔質膜の細孔に３次元柱状構造体形成材料を導入し、３次元柱状構造体を作製する方法について説明する。
【０１３１】
まず、上記の工程で作製したゲルマニウム多孔質膜を市販の電気メッキ液（高純度化学研究所製金用電気メッキ液、商品コードＫ−２４Ｅ）中に入れ、４０℃に保持した酸性浴（ｐＨ＝４．５）中において、０．５Ａ／ｄｍ2の電流密度で電着を行った。
【０１３２】
金の電着を行った後の膜は、純水で洗浄した後、ＦＥ−ＳＥＭで、表面及び断面の観察を行った。その結果、金が細孔中に均一に導入され、柱状構造を形成していることが確認された。
【０１３３】
この膜をさらに５０％の硝酸中に浸漬し、金の周囲に存在するゲルマニウムの除去を行った。ゲルマニウムの除去後のシリコン基板をＦＥ−ＳＥＭで観察した結果、表面に微細な柱状構造の金が高密度で配列された３次元柱状構造体が形成されていることが確認された。画像処理より求めた柱状の金の平均径２ｒ´は９ｎｍであり、その平均中心間隔２Ｒは１５ｎｍであった。
【０１３４】
次に、作製した金の３次元柱状構造体に分子認識材料としてビオチンを固定化して分子認識素子を作製する方法について説明する。
【０１３５】
試薬には、非特許文献１に紹介されているようなビオチンチオールを用いた。該ビオチンチオールはビオチンにチオール基が結合されている物質であり、一度の浸漬操作で貴金属表面に、目的の分子認識材料、つまりビオチンを固定化することができ簡便である。類似な物質として、特許文献３にはビオチンシランが開示されており、該ビオチンシランも３次元柱状構造体が金属や金属酸化物である場合は有用である。
【０１３６】
該ビオチンチオールを０．５ｍＭの濃度でエタノールに溶解し、３０分間金の３次元柱状構造体が形成された基板を浸漬した。その後、エタノールで基板を３回洗浄し、乾燥した。
【０１３７】
以上の方法により、本実施例では、金の３次元柱状構造体表面にビオチンを固定化し、分子認識材料を高濃度に固定化した分子認識素子を作製した。
（実施例４）
本実施例は、共晶を形成する物質としてアルミニウムとシリコンを用い酸化シリコンの多孔質膜を作製し、該多孔質膜を用いてシリコンの３次元柱状 構造体を作製し、分子認識材料としてＤＮＡをシリコンの３次元柱状構造体に固定して分子認識素子を作製した例である。
【０１３８】
尚、標的核酸と特異的に結合し得る物質として核酸プローブを用いた遺伝子センサは現在盛んに開発が行われており、プローブDNAは代表的な分子認識材料のひとつである。
【０１３９】
まず、酸化シリコン多孔質膜の作製方法について説明する。
【０１４０】
ＲＦマグネトロンスパッタリング法によって、タングステンを２０ｎｍ堆積したシリコン基板上に２００ｎｍのアルミニウム−シリコン混合膜を成膜した。ターゲットは、４インチのアルミニウムターゲット上に実施例１のゲルマニウムチップのかわりに、１５ｍｍ角のシリコンチップを６枚おいたものである。スパッタは、ＲＦ電源を用いて、Ａｒ流量：５０ｓｃｃｍ、放電圧力：０．７Ｐａ、投入電力：３００Ｗの条件で行った。また、基板温度は室温とした。
【０１４１】
ここではターゲットとして、アルミニウムターゲット上にシリコンチップを６枚置いたものを用いたが、シリコンチップの枚数はスパッタ条件により変化するため、これに限定されるものではなく、後述するような、柱状のアルミウムがシリコン中に分散した所望の構造が形成できるものであればよい。また、ターゲットはアルミニウムターゲット上にシリコンチップを置いたものに限定したものではなく、シリコンターゲット上にアルミニウムチップを置いたものでも良いし、シリコンとアルミニウムの粉末を焼結したターゲットを用いても良い。
【０１４２】
さらに、ここではスパッタリング法としてＲＦスパッタリング法を用いたが、これに限定されるものではなく、ＥＣＲスパッタリング法、ＤＣスパッタリング法、イオンビームスパッタリング法でよい。さらに、スパッタリング条件は装置に依存しており、これに限定されるものではない。また、スパッタ法以外の蒸着法であっても、所望の構造体が形成できる方法であれば、本発明に適用可能である。
【０１４３】
次に、このようにして得られたアルミニウム−シリコン混合膜をＩＣＰ（誘導結合型プラズマ発光分析）にて、アルミニウムとシリコンの全量に対する該シリコンの分量（atomic％）を分析した。その結果、アルミニウムとシリコンの全量に対する該シリコンの分量は約３７atomic％であった。
【０１４４】
電界放出走査型電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）にて、以上のように作製されたアルミニウム−シリコン混合膜を観察したところ、シリコンに囲まれたほぼ円形の微細な柱状アルミニウムが二次元的に配列していた。柱状アルミニウム部分の画像処理より求めた平均孔径２ｒは５ｎｍであり、その平均中心間隔２Ｒは１０ｎｍであった。また、断面をＦＥ−ＳＥＭにて観察した所、膜の高さは２００ｎｍであり、それぞれの柱状アルミニウムの部分はお互いに独立していた。
【０１４５】
また、Ｘ線回折法でこの薄膜試料を分析したところ、シリコンの回折線は確認できず、シリコンは非晶質であることがわかった。一方、複数のアルミニウムの回折線が確認できたことより、アルミニウムは多結晶であることが分かった。
【０１４６】
以上のことから、非晶質シリコンに周囲を囲まれた間隔２Ｒが１０ｎｍ、径２ｒが５ｎｍ、高さＬが２００ｎｍの結晶性の柱状アルミニウムを含んだアルミニウム−シリコン構造体薄膜の作製が確認できた。
【０１４７】
このアルミニウム−シリコン構造体薄膜を９８％硫酸中にて２４時間浸し、アルミニウム柱状構造部分のみを選択的にエッチングして細孔を形成した。エッチング後の膜をＦＥ−ＳＥＭで観察した結果、柱状のアルミニウムのみが除去され、多孔質の膜になっていることが確認された。シリコン部の形状は、アルミニウム除去前と比較して実質的に変化していないことがわかった。この場合も断面をＦＥ−ＳＥＭで観察したところ、アルミニウムは基板界面まで完全に除去されていることが明らかとなった。以上の工程によって、基板上に基板に対して垂直な貫通孔を有するシリコンの多孔質膜を作製できた。
【０１４８】
最後に、作製されたシリコン多孔質膜を酸素雰囲気中で加熱した。ここでは、大気圧で酸素を５０ｓｃｃｍ流しながら、８００℃で２時間加熱した。この結果、酸化シリコン多孔質膜が作製された。酸化シリコンの形成は、広域電子エネルギー損失構造解析（ＥＥＬＳ）により確認された。酸化処理を行った後の多孔質膜をＦＥ−ＳＥＭで観察した結果、細孔径にはほとんど変化が認められなかった。
【０１４９】
次に、作製した多孔質膜の細孔に３次元柱状構造体形成材料を導入し、３次元柱状構造体を作製する方法について説明する。
【０１５０】
まず、酸化シリコン多孔質膜の細孔底部に、電着（電気メッキ）で金を導入した。電着は実施例１と同じメッキ液を用いて、０．３Ａ／ｄｍ2の電流密度で５秒間電着を行った。電着後の基板は、純水でよく洗浄した後、乾燥させた。
【０１５１】
続いて、細孔底部に金を担持したこの酸化シリコン膜の形成されたシリコン基板を石英管中に保持し、１３．３Ｐａ以下まで減圧した後に、Ａｒ気流中で４４０℃に加熱した。続いて、ヘリウムガスにシランガス１０％混合した混合ガスを５０ｓｃｃｍの流量で６０秒間供給した。試料基板は、シランガス供給を止めた後、室温まで徐冷した後に取り出した。
【０１５２】
以上の工程を行った後の試料薄膜の断面をＦＥ−ＳＥＭで評価した。その結果、細孔中にはシリコンの微細な柱状構造体が形成されていることが明らかとなった。Ｘ線回折分析等によって、このシリコンは高度に結晶化していることが確認された。この場合、細孔底部の金が触媒となって、ＶＬＳ（Vapor-Liquid-Solid）メカニズムによって、結晶性のシリコンが形成されたと考えられる。以上の工程によって、多孔質酸化シリコン中に結晶性のシリコンの柱状構造体を形成することができた。
【０１５３】
細孔内にシリコン形成を行った上記基板をさらに２％のフッ化水素酸中に浸漬し、シリコンの周囲に存在する酸化ケイ素の除去を行った。酸化ケイ素の除去後のシリコン基板をＦＥ−ＳＥＭで観察した結果、表面に微細な柱状構造のシリコンが高密度で配列された３次元柱状構造体が形成されていることが確認された。画像処理より求めた柱状のシリコンの平均径２ｒ´は４ｎｍであり、その平均中心間隔２Ｒは１０ｎｍであった。
【０１５４】
次に、作製したシリコンの３次元柱状構造体に分子認識材料としてプローブDNAを固定化して分子認識素子を作製する方法について説明する。
【０１５５】
プローブＤＮＡの合成にはＤＮＡ自動合成機を用いて配列番号１の一本鎖核酸を合成した。なお配列番号１の一本鎖ＤＮＡ末端にはＤＮＡ自動合成機での合成時にチオールモディファイア（Thiol-Modifier）を用いる事によってチオール基を導入した。続いて通常の脱保護を行いＤＮＡを回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、以下の実験に用いた。
【０１５６】
配列番号：１ 5'HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3'
まず、アミノ基を結合したシラン化合物（Ｎ−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメトキシシラン）[（ＣＨ3Ｏ）3ＳｉＣ3Ｈ6ＮＨＣ2Ｈ4ＮＨ2]を含むシランカップリング剤の１ｗｔ％水溶液を室温下で２時間攪拌し、上記シラン化合物の分子内のメトキシ基を加水分解した。
【０１５７】
次いで、この溶液に、３次元柱状構造体が形成された基板を室温（２５℃）で２０分間浸した後、引き上げて、乾燥させた。次に、基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークしてシランカップリング処理を完結させ、３次元柱状構造体表面にアミノ基を導入した。
【０１５８】
次いで、Ｎ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（以降ＥＭＣＳと略）を２．７ｍｇ秤量し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／エタノールの１：１溶液に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなる様に溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。シランカップリング処理を行った３次元柱状構造体をこのＥＭＣＳ溶液に室温で２時間浸して、シランカップリング処理によって３次元柱状構造体表面に担持されているアミノ基とＥＭＣＳ溶液のカルボキシル基を反応させた。この状態で３次元柱状構造体表面にはＥＭＣＳ由来のマレイミド基が表面に存在することになる。ＥＭＣＳ溶液から引き上げた３次元柱状構造体は、ＤＭＳＯ及びエタノールの混合溶媒及びエタノールで順次洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【０１５９】
上記配列番号１の一本鎖ＤＮＡを最終濃度が約４００ｍｇ／ｍｌになるようにＴＥ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）／１ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液）に溶解し、一本鎖ＤＮＡ溶液を調製した。
【０１６０】
次に、上記ＤＮＡ溶液蒸留水を加え、一本鎖ＤＮＡの最終濃度が８μＭとなるように調整し、前記３次元柱状構造体を形成した基板を３０分間該溶液に浸漬して、マレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。
【０１６１】
以上の方法により、本実施例では、シリコンの３次元柱状構造体表面にプローブＤＮＡを固定化し、分子認識材料を高濃度に固定化した分子認識素子を作製した。
（実施例５）
本実施例では、実施例２で作製したグルコースオキシターゼが固定化された分子認識素子を用いて作製したバイオセンサについて説明する。
【０１６２】
本実施例は、分子認識反応を電気的に検出するバイオセンサの一例である。
【０１６３】
図６は、本実施例におけるバイオセンサの断面を示す模式図である。
【０１６４】
図６に示すバイオセンサにおいて、実施例２で作製した分子認識素子６０４、及び、作用電極６０７、参照電極６０８、対向電極６０９を基板６０６上に配置した。各電極６０７〜６０９の配置はこれに限らないが、分子認識素子６０４上での反応により生成する過酸化水素を電極で検出するため、特に測定溶液をフロー系で流す場合は、各電極６０７〜６０９は分子認識素子６０４より測定溶液排出管６１０側に配置されることが好ましい。また、各電極６０７〜６０９の下地にはそれぞれの電極６０７〜６０９の短絡を防ぐために絶縁膜６１２を形成したが、基板６０６に絶縁基板を用いた構成でもよく、電極間の短絡を防げればこれに限らない。次に、この基板６０６上にスペーサー６０２を介して第二基板６０３を配置し、測定溶液６０１が導入される溶液用空間６１１を形成した。前記電極６０７〜６０９はこの第二基板６０３に形成しても構わない。この場合、下地やスペーサー等に絶縁材料を用いることで短絡を防げばよい。さらに、この溶液用空間６１１には、測定溶液６０１を導入、排出する細管、すなわち測定溶液導入管６０５、測定溶液排出管６１０が配置されている。電極６０７〜６０９は、図示しない電圧印加回路と電流測定回路に接続されている。
【０１６５】
次に、図６に示すバイオセンサを用いた測定方法について説明する。
【０１６６】
まず、０．１Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝溶液を流速４μｌ／ｍｉｎで測定溶液導入管６０５から溶液用空間６１１に導入し、図示しない電圧印加回路から電極６０７〜６０９を通して、０．７Ｖの電位を印加しベースラインを得る。次に、１０μＭの濃度のグルコースを含む測定溶液６０１を導入すると、分子認識素子６０４のグルコースオキシターゼと測定溶液６０１中のグルコースとの反応により過酸化水素が生成され、その過酸化水素を媒介にしてその生成量に応じて各電極６０７〜６０９を通じ酸化電流が流れ始め、図示しない電流測定回路により、１０秒後には５０ｎＡの酸化電流が観測された。
【０１６７】
これに対し、比較例として、みかけ上の面積が同一で３次元構造が形成されていない平滑な金表面に実施例２と同様にグルコースオキシターゼが固定化された素子を用いて、同様のバイオセンサを作製し同様の測定を行ったところ、２ｎＡ程度の酸化電流しか観測できず、また安定して観測されるまでの時間も長かった。
【０１６８】
以上の結果から、本実施例では、上記分子認識素子を用いることで、高感度な検出が短時間で行えるバイオセンサの作製が可能となることが確認された。
（実施例６）
本実施例では、実施例２で作製したグルコースオキシターゼが固定化された分子認識素子を用いて作製したバイオセンサの別の構成について説明する。
【０１６９】
本実施例は、分子認識反応を電気的に検出するバイオセンサの一例である。
【０１７０】
図７は本実施例におけるバイオセンサの断面を示す模式図である。
【０１７１】
図７に示すように、本実施例におけるバイオセンサは、実施例２で作製した分子認識素子が作用電極を兼ねて分子認識素子電極７０４として機能し、さらに参照電極７０８、対向電極７０９が溶液用空間７１１内に形成されたものである。実施例４と同様に各電極７０４、７０８、７０９が短絡しないように絶縁膜７１２が形成され、また、スペーサー７０２や第二基板７０３にも絶縁材料が使われている。ただし、電極間の短絡が防げれば絶縁膜７１２の配置や、基板７０６、第二基板７０３やスペーサー７０２の材料等はこれに限らない。電極７０４、７０８、７０９は、図示しない電圧印加回路と電流測定回路に接続されている。さらに、この溶液用空間７１１には、測定溶液７０１を導入、排出する細管、すなわち測定溶液導入管７０５、測定溶液排出管７１０が配置されている。
【０１７２】
本実施例では、分子認識素子を構成している３次元柱状構造体が金であり、また下地として基板７０６上に導電性薄膜（タングステン薄膜）７０７を形成しているため、図示ししない外部回路（電圧印加回路や電流印加回路）と導通させることが可能であり、分子認識素子と作用電極とを兼ねることが可能である。
【０１７３】
次に、図７に示すバイオセンサを用いた測定方法について説明する。
【０１７４】
実施例１と同様に、まず、０．１Ｍの濃度の塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝溶液を流速４μｌ／ｍｉｎで測定溶液導入管７０５から溶液用空間７１１に導入し、図示しない電圧印加回路から電極７０４、７０８、７０９を通して、０．７Ｖの電位を印加しベースラインを得る。次に、１０μＭの濃度のグルコースを含む測定溶液７０１を導入すると、分子認識素子電極７０４のグルコースオキシターゼと測定溶液７０１中のグルコースとの反応により過酸化水素が生成され、その過酸化水素の生成量に応じて各電極７０４、７０８、７０９を通じ酸化電流が流れ始め、図示しない電流測定回路により、１０秒後には４０ｎＡの酸化電流が観測された。
【０１７５】
これに対し、比較例として、みかけ上の面積が同一で３次元構造が形成されていない平滑な金表面に実施例２と同様にグルコースオキシターゼが固定化された素子を用いて、同様のバイオセンサを作製し同様の測定を行ったところ、２ｎＡ程度の酸化電流しか観測できず、また安定して観測されるまでの時間も長かった。
【０１７６】
本実施例におけるバイオセンサの構成では作用電極と分子認識素子を兼ねるため、実効電極面積を規定することは難しいが、センサ構成が簡素化され、小型化が可能になる。
【０１７７】
以上の結果から、本実施例では、上記分子認識素子を用いることで、小型であり、高感度な検出が短時間で行えるバイオセンサの作製が可能となることが確認された。
（実施例７）
本実施例では、実施例３で作製したビオチンが固定化された分子認識素子を用いて作製したバイオセンサについて説明する。本実施例は、分子認識反応を質量変化として検出するバイオセンサの一例である。
【０１７８】
図８は、本実施例におけるバイオセンサの断面を示す模式図である。
【０１７９】
図８に示すバイオセンサは、上記実施例３のビオチンが固定化された分子認識素子を水晶振動子電極上に形成したものである。具体的には、水晶振動子８３を挟んでその両面に一対の電極（プラス側電極とマイナス側電極）８２が配置され、その両電極８２間に所定電圧を印加しその水晶振動子８２を特定の周波数で発振させる発振器８４（外部回路８６）が接続された構成において、電極８２上に、実施例３と同様な方法で作製されたビオチンを固定化した分子認識素子８１が形成されたものである。
【０１８０】
本実施例に用いる水晶振動子８３は、特定の周波数に対して電気的インピーダンスが低下する。この特定の周波数は共振周波数とも呼ばれ、水晶振動子の密度や厚さによって以下の式：
Δf ＝ Δｍ／（Ａ・ρ・ｔ） ・ｆ （１）
［△ｆ：共振周波数の変化（Ｈｚ）、△ｍ：電極表面の重量変化（ｇ）、ｆ：基本共振周波数（Ｈｚ）、Ａ：電極の面積（ｃｍ2）、ρ：水晶の密度（g/cm3）、ｔ：水晶の厚さ（ｃｍ）］の関係を満たす。
【０１８１】
ここで、ｆ／（Ａ・ρ・ｔ） ＝ Ｋ ＝ 一定
とおくと、式（１）は
△ｆ＝Ｋ・△ｍ （２）
と表される。
【０１８２】
従って、電極表面に分子認識材料を固定化すれば、検出すべき特定物質との結合により重量が増加し、これが共振周波数の変化となって現れる。本バイオセンサはこの変化量を測定し、ビオチンと特異的に結合するアビジンを検出するものである。
【０１８３】
次に、図８に示すバイオセンサを用いた測定方法について説明する。
【０１８４】
まず、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌ中に、上記ビチオンが固定された分子認識素子８１と電極８２が配置された水晶振動子８３を浸漬する。この溶液中に１００μｌの１ｍｇ／ｍｌアビジン溶液を注入すると、ビオチンとアビジンは特異的に結合し、電極表面の重量が変化する。その質量変化に伴う水晶振動子８３の共振周波数の変化を測定した。
【０１８５】
これに対し、比較例として、みかけ上の面積が同一で３次元柱状構造体が形成されていない平滑な金表面に実施例３と同様な方法でビオチンの固定化処理を行い、これを電極として配置した水晶振動子に対しても同様に浸漬し共振周波数の変化を測定した。
【０１８６】
その結果、図９の水晶振動子の周波数変化を示すグラフ（横軸：時間、縦軸：周波数変化量）に示すように、本実施例の３次元構造を取り入れたバイオセンサ（図中の実線で示す変化曲線参照）のほうが比較例の平滑構造のバイオセンサ（図中の破線で示す変化曲線参照）よりも、アビジン溶液を注入前後での周波数の変化量が大きく、また定常化するまでの時間も短かった。
【０１８７】
以上の結果から、本実施例では、上記分子認識素子を用いることで、高感度な検出が短時間で行えるバイオセンサの作製が可能となることが確認された。
（実施例７）
本実施例では、実施例４で作製したＤＮＡが固定化された分子認識素子101を用いて作製したバイオセンサについて説明する。
【０１８８】
本実施例は分子認識反応を光学的に検出するバイオセンサの一例である。
【０１８９】
図１０（ａ）及び（ｂ）は、本実施例におけるバイオセンサの断面を示す模式図である。図１０（ａ）及び（ｂ）に示すバイオセンサでは、いずれも分子認識素子１０１としてＤＮＡが固定された３次元柱状構造体が基板１０２上に形成されている。
【０１９０】
このうち、図１０（ａ）に示すバイオセンサは、基板１０２上の分子認識素子１０１を挟む両端に液留め１０３を形成し、その基板１０２上の分子認識素子１０１に向けて滴下し使用する場合の構成例である。
【０１９１】
これに対し、図１０（ｂ）に示すバイオセンサは、前述の図６及び図７と同様に、フロー系使用する場合の構成例である。すなわち、このバイオセンサでは、分子認識素子１０１が形成された基板１０２と、第二基板１０４との間にスペーサー１０５を介して溶液用空間を形成し、その上流側に測定溶液導入管１０７、その下流側に測定溶液排出管１０８を設け、測定溶液導入管１０７から溶液用空間内に測定溶液１０６を導入し、基板１０２上の分子認識素子１０１を通して測定溶液排出管１０８から排出するようになっている。ただし、測定は、図示しない蛍光測定器で行うため、第二基板１０４には、蛍光発光の観察を阻害しない基板を用いている。
【０１９２】
次に、図１０（ａ）に示す構成のバイオセンサを用いた測定方法について説明する。
【０１９３】
まず、配列番号１のＤＮＡと相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡをＤＮＡ自動合成機で合成し、５’末端にローダミンを結合させて標識化した一本鎖ＤＮＡを得た。この標識化一本鎖ＤＮＡを１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に最終濃度１μＭとなるように溶解した。この溶液を測定溶液とし、図１０（ａ）の分子認識素子１０１上に滴下して、室温（２５℃）で３時間反応を行った。その後、１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液で洗浄して未反応の一本鎖ＤＮＡを洗い流した。
【０１９４】
次に、該分子認識素子１０１上の蛍光発光を、ローダミンＢに適するフィルターセットを装着した倒立型蛍光顕微鏡を用いて観察したところ、強い蛍光が確認された。
【０１９５】
これに対し、比較例として、みかけ上の面積が同一で３次元柱状構造体が形成されていない平滑なシリコン表面に実施例４と同様にＤＮＡの固定化処理を行った素子を用いて同様のセンサを作製し同様の測定を行ったところ、弱い蛍光しか観察されなかった。
【０１９６】
以上の結果から、本実施例では、上記分子認識素子を用いることで、測定溶液が小量の場合でも高感度な検出が行えるバイオセンサの作製が可能となったことが確認された。
【０１９７】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、超微細構造を持った多孔質膜を形成し、該多孔質膜から超微小空間を有する3次元柱状構造体を形成して分子認識材料を固定する基材として用いることで、分子認識材料を高濃度に固定又は担持し、また、分子認識材料と特定物質の接触、認識を円滑に行うことのできる分子認識素子を作製することが可能となる。また、該分子認識素子を用いることにより、少量の測定溶液に対しても高感度、高精度で測定ができ、さらに測定の短時間化を可能とするバイオセンサを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施形態に係る３次元柱状構造体の構造を示す模式図である。
【図２】本発明の実施形態に係る柱状物質が形成された膜の構造を示す模式図である。
【図３】本発明の実施形態に係る多孔質膜の構造を示す模式図である。
【図４】本発明の実施形態に係る分子認識素子の作製工程を示す断面模式図である。
【図５】実施例２の分子認識材料の３次元柱状構造体への固定化を説明する模式図である。
【図６】実施例５のバイオセンサの断面を示す模式図である。
【図７】実施例６のバイオセンサの断面を示す模式図である。
【図８】実施例７のバイオセンサの断面を示す模式図である。
【図９】実施例７のバイオセンサを用いた測定結果を示す模式図である。
【図１０】実施例８のバイオセンサの断面を示す模式図である。
【符号の説明】
１１ ３次元柱状構造体
１２ 基板
２１ 基板
２２ 柱状物質
２３ 他成分のマトリックス
３１ 基板
３２ 細孔
３３ 多孔質膜
４１ 基板
４２ 柱状物質
４３ 他成分のマトリクス
４４ 細孔
４５ 多孔質膜
４６ ３次元柱状構造体形成材料４７ ３次元柱状構造体
４８ 分子認識材料
４９ 分子認識素子
５１ 金の３次元柱状構造体
５２ メルカプトアルキルカルボン酸
５３ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩
５４ Ｎ−ヒドロキシスルホフォコハク酸イミドナトリウム
５５ グルコースオキシターゼ
６０１ 測定溶液
６０２ スペーサ
６０３ 第二基板
６０４ 分子認識素子
６０５ 測定溶液導入管
６０６ 基板
６０７ 作用電極
６０８ 参照極
６０９ 対向電極
６１０ 測定溶液排出管
６１１ 溶液用空間
６１２ 絶縁膜
７０１ 測定溶液
７０２ スペーサ
７０３ 第二基板
７０４ 分子認識素子電極
７０５ 測定溶液導入管
７０６ 基板
７０７ 下地となった導電性薄膜
７０８ 参照極
７０９ 対向電極
７１０ 測定溶液排出管
７１１ 溶液用空間
７１２ 絶縁膜
８１ 分子認識素子
８２ 電極
８３ 水晶振動子
８４ 発振器
８５ 発振周波数測定器
１０１ 分子認識素子
１０２ 基板
１０３ 液留め
１０４ 第二基板
１０５ スペーサー
１０６ 測定溶液
１０７ 測定溶液導入管
１０８ 測定溶液排出管[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a molecular recognition element on which a molecular recognition material (a component having a molecular recognition ability) is immobilized or supported, a biosensor using the same, and a method for producing the same. The present invention relates to a sensor for detecting presence, presence amount, or presence concentration, and a method for manufacturing the sensor. The sensor of the present invention can be suitably applied particularly to a so-called biosensor using a substance derived from a living body or a similar substance as a molecular recognition material.
[0002]
[Prior art]
A biosensor is a measurement device that utilizes the excellent molecular recognition ability of a living body or a biomolecule, and is expected to be widely applied to not only the medical field but also the environment and food products in recent years.
[0003]
In general, a biosensor is a molecular recognition element that recognizes a chemical substance to be measured (hereinafter, a specific substance), and is capable of detecting a physical or chemical change occurring at that time and detecting an electric signal, an optical signal, and the like. It consists of a sensing element that converts it into a signal. In the living body, there are combinations of substances having affinity for each other, for example, enzyme-substrate, antigen-antibody, DNA-DNA, and the like.A biosensor immobilizes or carries one of these combinations on a base material and a molecular recognition material. Utilizes the principle that the other substance can be selectively measured. Various types of sensing elements, such as oxygen electrodes, hydrogen peroxide electrodes, ion electrodes, ISFETs, optical fibers, and thermistors, have been proposed.Recently, quartz resonators that can detect changes in mass on the order of nanograms In some cases, a SAW element, a surface plasmon resonance element, or the like is used.
[0004]
In recent years, research on integrating such a chemical analysis system on a substrate such as glass or plastic measuring several centimeters square, that is, research on a micro analysis system has been actively conducted. For example, a chip in which a very small groove having an inner diameter of about 100 μm, that is, a minute space is formed in order to flow a liquid containing a reactant inside the chip has been studied. The advantages of this micro space include (1) the space is narrow, the time required for material diffusion can be reduced, (2) the specific surface area is large relative to the sample volume, and the chemical process using the interface can be performed quickly, (3) ) The heat capacity is small and rapid temperature switching is possible. (4) The amount of sample and energy required for analysis can be reduced and the system can be downsized. Attempts have been made to shorten the time and increase the accuracy.
[0005]
Biosensors are also expected to be small-sized devices that can be installed or carried anywhere, and that can perform high-performance analysis in a short time. A microanalysis system is an important issue. In particular, in the molecular recognition element, the use of the above-mentioned minute space is important, and these effects are large. In other words, if the molecular recognition material is fixed or supported on the base material at a high concentration, and if a small space capable of smoothly contacting and recognizing the molecular recognition material and the specific substance can be applied to the molecular recognition element, higher sensitivity and higher precision can be achieved. It is thought that a new biosensor can be realized.
[0006]
In recent years, attempts have been made to apply a small space of the order of several tens of μm or less to the minute space of the order of several hundred μm.
[0007]
For example, for such a purpose, a method of using a microfilter such as a nitrocellulose membrane or a nylon membrane, or a porous body such as paper, nonwoven fabric, or thread as a substrate is known. These porous bodies have a substantial surface area that is much larger than the apparent surface area, and can increase the sensitivity by immobilizing or supporting many molecular recognition materials on the surface.
[0008]
For example, Patent Literature 1 discloses a method in which a molecular recognition material is immobilized or supported on a porous layer having an average pore diameter of 0.1 to 10 μm and having an aggregated particle or network structure.
[0009]
Patent Literature 2 discloses a method in which an enzyme is immobilized on beads having a diameter of about 20 μm, and the beads are filled in a microchannel to prepare a reactor.
[0010]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-2705
[Patent Document 2]
JP 2000-230916 A
[Patent Document 3]
JP-A-7-260790
[Non-patent document 1]
Science, 262, 1706 (1993)
[0011]
[Problems to be solved by the invention]
However, the pore diameter of these porous bodies is on the order of microns to submicrons, and many of the molecular recognition materials and specific substances used for biosensors such as enzymes, antigens, and antibodies have much smaller sizes. Therefore, if a substrate having an even finer structure, that is, a substrate having an ultra-small space can be used, there is a possibility that the substantial surface area can be further increased and the detection sensitivity can be further increased.
[0012]
Further, it is considered that the base materials disclosed in Patent Document 1 and Patent Document 2 have many closed spaces where a specific substance cannot reach due to their structures. This becomes a useless space that cannot contribute to the reaction with respect to the volume of the base material, and the sensitivity is reduced accordingly.
[0013]
Further, in Patent Document 1, since the uniformity of the pore diameter in the porous body is low, a narrow space region and a wide space region are mixed. Also, in the above-mentioned Patent Document 2, it is difficult to completely and tightly fill the beads, and the size of the space is uneven. These structural deviations may hinder the smooth penetration and dispersion of the reactants into the substrate. For this reason, in the initial state of the measurement, the concentration of the specific substance also becomes uneven in the base material, the time for initiating the reaction varies depending on the position, and physical and chemical changes corresponding to the original concentration of the specific substance occur. There is a problem that it takes time for the generation (for example, the amount of current flowing between the electrodes in the case of an enzyme reaction) to reach a steady state. Further, there has been a problem that the accuracy of the quantification is reduced.
[0014]
Further, in Patent Document 2, when a test solution is injected into a microchannel for a long time or in a large amount and pressure is applied, the beads themselves also move and cause clogging.
[0015]
The present invention has been made in view of the above problems, and enables a molecular recognition material to be fixed or supported at a high concentration, and enables a specific substance to smoothly and uniformly contact and react with a molecular recognition material in a short time. It is an object of the present invention to provide a highly sensitive molecule recognition element, a biosensor using the molecule recognition element, and a method for manufacturing the same.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
The method for producing a molecular recognition element according to the present invention includes a step of preparing a structure including a columnar member and a region surrounding the columnar member, and forming the porous body by removing the columnar member from the structure. A step of introducing a filling material into the porous body, a step of removing the region, and a step of fixing or supporting a molecular recognition material on the filling material.
[0017]
Further, the molecular recognition element according to the present invention, after introducing a filling material into a porous body obtained by removing the columnar member from a structure including a columnar member and a region surrounding the columnar member, A molecular recognition material is fixed or supported on the filling material obtained by removing the region.
Here, in the structure, the columnar member configured to include the first material is surrounded by the region configured to include the second material, and the structure includes the second material. Is preferably contained at a ratio of 20 atomic% or more and 70 atomic% or less with respect to the total amount of the first material and the second material.
[0018]
In order to achieve the above object, a molecular recognition element according to the present invention is a molecular recognition element having a columnar structure and a molecular recognition material having molecular recognition ability fixed or supported on the columnar structure. The columnar structure is composed of a columnar material including a first component and a second component capable of forming a eutectic with the first component dispersed in a member including a second component. A columnar structure composed of the material obtained by introducing a material into the holes using a porous body having columnar holes formed by removing the columnar substance and then removing the porous body. It is characterized by having.
[0019]
The structure is desirably in the form of a thin film.
[0020]
After subjecting the porous body to a chemical treatment, the material may be introduced into the pores, and oxidation treatment is useful as the chemical treatment.
[0021]
The columnar substance is aluminum, the member is silicon, and the proportion of silicon in the structure is in a range of 20 atomic% or more and 70 atomic% or less, or the columnar substance is aluminum, and the member is germanium. Preferably, the ratio of germanium in the structure is 20 atomic% or more and 70 atomic% or less.
[0022]
Preferably, the main component of the porous body is silicon or germanium.
[0023]
It is desirable that the diameter of the columnar portion of the columnar structure be 0.5 nm or more and less than 15 nm, and that the distance between the columnar portion of the columnar structure and an adjacent columnar portion be 5 nm or more and less than 20 nm.
[0024]
Preferably, the columnar material is a crystalline material, and the member is an amorphous material.
[0025]
The molecular recognition material is desirably a biological substance. The biological material is desirably a protein, particularly an enzyme, an antigen, an antibody, or a gene.
[0026]
A biosensor according to the present invention includes the molecular recognition element.
[0027]
In the method for producing a molecular recognition element according to the present invention, the columnar material including the first component is dispersed in a member including the second component capable of forming a eutectic with the first component. A step of preparing a structure having a structure, a removing step of removing the columnar substance, a step of introducing a material into the pores of the porous body having columnar pores obtained by the removing step, and removing the member. A step of preparing a columnar structure; and a step of fixing or supporting a molecular recognition material having molecular recognition ability on the columnar structure. After subjecting the porous body to a chemical treatment, the material may be introduced into the pores, and oxidation treatment is useful as the chemical treatment. Preferably, the removing step is etching.
[0028]
The introduction step may be electrodeposition or electroless deposition, and may be a step of performing a catalytic reaction after forming a catalyst at the bottom of the hole.
[0029]
Hereinafter, a structure serving as a base material of the porous body will be described.
[0030]
The structure applied in the present invention is a structure configured to include the first component and the second component, and the columnar material configured to include the first component is configured to include the second component. It is surrounded by members that are included and configured. In this configuration, it is desirable that the structure contains the second component at a ratio of 20 atomic% to 70 atomic% with respect to the total amount of the first component and the second component.
[0031]
The ratio is a ratio of the second component to the total amount of the first component and the second component constituting the structure, and is preferably 25 atomic% or more and 65 atomic% or less, more preferably 30 atomic% or more. It is 60 atomic% or less.
[0032]
Note that the columnar substance only needs to have a substantially columnar shape. For example, the columnar substance may include a second component as a component of the columnar substance, or the member may include a first component. You may. Further, the columnar substance and its surrounding members may contain a small amount of oxygen, argon, nitrogen, hydrogen and the like.
[0033]
The above ratio can be obtained, for example, by quantitative analysis using inductively coupled plasma emission spectrometry.
[0034]
The first and second components are preferably a material having a eutectic point (a so-called eutectic material) in both component system phase equilibrium diagrams. In particular, the eutectic point is 300 ° C. or higher, preferably 400 ° C. or higher. As a preferred combination of the first component and the second component, Al is used as the first component, Si is used as the second component, Al is used as the first component, and the second component is used as the second component. Ge is used, or Al is used as the first component, and Si is used as the second component. x Ge 1-x It is preferable to use (0 <x <1).
[0035]
The planar shape of the columnar material is circular or elliptical. In the structure, a plurality of the columnar substances are dispersed in a matrix including the second component. The diameter of the columnar substance (the diameter when the plane shape is a circle) can be controlled mainly according to the composition of the structure (that is, the ratio of the second component), and the average diameter is 0.5 nm. The thickness is at least 50 nm, preferably at least 0.5 nm and at most 20 nm, more preferably at least 0.5 nm and at most 15 nm. In the case of an ellipse or the like, the longest outer diameter portion may be within the above range. Here, the average diameter is a value derived, for example, from a columnar portion observed in an actual SEM photograph (in a range of about 100 nm × 70 nm), directly from the photograph or by image processing using a computer. A practical lower limit of 1 nm or more or several nm or more is the lower limit of the average diameter.
[0036]
The center-to-center distance 2R between the plurality of columnar substances is 2 nm or more and 30 nm or less, preferably 5 nm or more and 20 nm or less, and more preferably 5 nm or more and 15 nm or less. Of course, as the lower limit of the center-to-center distance, 2R needs to have at least an interval at which the columnar materials do not contact each other.
[0037]
The structure is preferably a film-like structure, and in such a case, the column-shaped member includes a matrix including the second component so as to be substantially perpendicular to an in-plane direction of the film. Will be dispersed. The thickness of the film-like structure is not particularly limited, but can be applied in the range of 1 nm to 100 μm. In consideration of the process time and the like, a more realistic film thickness is about 1 nm to 1 μm. In particular, it is preferable that the columnar structure is maintained even at a film thickness of 300 nm or more.
[0038]
The structure is preferably a film-like structure, and the structure may be provided on a substrate. Examples of the substrate include, but are not limited to, an insulating substrate such as quartz glass, a silicon substrate, a semiconductor substrate such as gallium arsenide or indium phosphide, a metal substrate such as aluminum, or a substrate serving as a support member. If a body can be formed, a flexible substrate (for example, a polyimide resin or the like) can also be used.
[0039]
The structure can be manufactured using a method of forming a film in a non-equilibrium state. As the film formation method, a sputtering method is preferable, but a film formation method for forming a substance in an arbitrary non-equilibrium state, such as resistance heating evaporation, electron beam evaporation (EB evaporation), or ion plating, is applicable. is there. When the sputtering is performed, magnetron sputtering, RF sputtering, ECR sputtering, or DC sputtering can be used. When the sputtering method is used, the film is formed in an argon gas atmosphere with the pressure in the reactor set at about 0.2 Pa to 1 Pa. At the time of sputtering, the first material and the second material may be separately prepared as target materials, but a target material in which the first material and the second material are fired in a desired ratio in advance is used. May be used.
[0040]
The structure formed on the substrate is preferably formed at a substrate temperature of 20 ° C to 300 ° C, preferably 20 ° C to 200 ° C.
[0041]
By removing the columnar substance (wet etching or dry etching, etc.) from the structure, a porous body (porous body) having a plurality of columnar holes is formed. It is sufficient that the columnar member can be selectively removed for etching, and an acid such as phosphoric acid, sulfuric acid, hydrochloric acid, or nitric acid is preferable as the etching solution. The pores of the porous body formed by the removal are preferably independent of each other without being connected to each other.
[0042]
As a method of producing a porous body from the above-mentioned structure, there is provided a structure including a first component and a second component, wherein the columnar member including the first component is formed of the second member. And the structure contains the second component in a ratio of 20 atomic% to 70 atomic% with respect to the total amount of the first component and the second component. It is desirable to have a step of preparing the structure included in the above, and a step of removing the columnar member from the structure.
[0043]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of a molecular recognition element, a biosensor using the same, and a method for manufacturing the same according to the present invention will be described with reference to the accompanying drawings.
[0044]
This embodiment uses a novel porous body having pore diameters, and a very small arrangement interval of the pores, and straight pores perpendicular to the substrate, as compared with the conventional porous body. As shown in FIG. 1, a three-dimensional columnar structure 11 having an ultrafine structure is formed on a substrate 12, and a molecular recognition material (see below) is fixed or carried on the surface of the three-dimensional columnar structure 11. A high-sensitivity molecular recognition element was produced in the above.
[0045]
First, the porous film according to the present embodiment will be described.
[0046]
When a film of a plurality of eutectic substances is formed on a substrate by, for example, a method such as sputtering, the components exist independently without being mixed in the film. When the film forming conditions and the composition of the substance are optimized for a specific material system, as shown in FIG. 2, a certain component becomes a columnar form having a fine diameter, that is, a columnar substance 22, A structure is formed which is dispersed in the matrix 23 of the components. This structure is a novel structure discovered by the present inventors, and the columnar substance 22 extends from the interface with the substrate 21 to the film surface. The diameter of one pillar of the pillar-shaped material 22 to be formed is in the range of 0.5 nm to 15 nm. The center-to-center spacing of the columnar substance 22 is in the range of 5 nm to 20 nm.
[0047]
To explain using a specific example, when a mixed film of aluminum and silicon is formed on a substrate by sputtering, when the conditions are optimized, crystalline columnar aluminum is formed in an amorphous silicon matrix. . The diameter of one pillar of pillar aluminum formed is in the range of 0.5 nm to 15 nm. Scanning electron microscope observations have shown that aluminum exists as a single column in the film from the substrate interface to the film surface. The formation of a similar structure has been confirmed for a mixed film of aluminum and germanium produced by sputtering. The film thickness can be controlled by adjusting the sputtering time. As long as the sputtering is not interrupted, the columnar structure is not interrupted even if the film thickness is increased.
[0048]
In this embodiment, as shown in FIG. 3, a material obtained by removing the columnar substance from the above-mentioned film containing the columnar substance is used as a porous film 33, and a substance to be a material of a three-dimensional columnar structure is used in the pores 32. By introducing and removing the porous film, the above-described three-dimensional columnar structure 11 shown in FIG. 1 is obtained, and a molecular recognition material (see below) is fixed to or supported on the three-dimensional columnar structure 11. By doing so, a highly sensitive molecular recognition element was produced.
[0049]
Next, the manufacturing method of the present embodiment will be described.
[0050]
By the following steps (A) to (C), a molecular recognition element in which a molecular recognition material is fixed or supported on a three-dimensional columnar structure having a very fine structure as shown in FIG. 1 can be manufactured. FIG. 4 is a schematic sectional view illustrating the method for manufacturing the molecular recognition element according to the present embodiment.
Step (A): Preparation of porous membrane
First, a step of forming a porous film (see FIG. 4C) on a substrate will be described.
[0051]
As shown in FIG. 4A, a substrate 41 is prepared. The material and thickness of the substrate 41 are not basically limited, and may be determined as appropriate according to the type of the detecting element in the biosensor. Specifically, various materials such as glass, metal, ceramics, semiconductor, and organic material can be used. However, in the step (B) of introducing a material for forming the target three-dimensional columnar structure into the pores of the porous film, which will be described later, when the electrodeposition method is used as the introducing method, the conductive substrate is better. desirable. When it is desired to use the electrodeposition method on a non-conductive substrate, it is possible to form a conductive thin film on the substrate surface.
[0052]
Next, as shown in FIG. 4B, a columnar material which is a first component in a columnar form is formed by sputtering or the like using a target containing materials forming eutectic diameters at an appropriate ratio to each other. A thin film having a structure in which 42 is dispersed in a matrix 43 of another component is formed on the substrate 41. In this case, the target to be used is not limited to a mixture of the two components, but may be such that one substance is placed on top of another substance. It is also possible to adopt a configuration in which the components are bonded so as to give an area ratio of. For example, a film having the above structure can be formed on a substrate by performing sputtering with an appropriate amount of a silicon wafer placed on an aluminum target.
[0053]
The film formation will be described by taking sputtering as an example, but any film formation method capable of forming a similar structure can be applied to the present invention.
[0054]
The average diameter 2r of one pillar of the columnar substance 42 to be formed is in the range of 0.5 nm to 15 nm, and the average center-to-center spacing 2R of the columnar substance is in the range of 5 nm to 20 nm (FIG. 4B). reference).
[0055]
Next, as shown in FIG. 4C, the columnar substance is removed from the manufactured structure to form a porous film 45 having pores 44. For selective removal of the columnar material, wet etching is preferably used. For example, in the case of crystalline columnar aluminum formed in an amorphous silicon matrix, etching with phosphoric acid or sulfuric acid removes only aluminum without changing the shape of the silicon and removes the pores. 44 can be formed.
[0056]
Here, in order to easily perform the subsequent process, a step of performing a chemical treatment on the formed porous film to change the properties of the porous film may be performed. The chemical treatment in this case specifically means an oxidation treatment or the like.
Step (B): Production of three-dimensional columnar structure
As shown in FIG. 4D, a material 46 for forming a desired three-dimensional columnar structure is introduced into the pores 44 of the porous film 45 produced in the step (A). The three-dimensional columnar structure forming material 46 includes metals such as gold, silver, copper, platinum, palladium, nickel, iron, titanium, and silicon, or alloys, semiconductors such as silicon oxide and silicon nitride, and polyaniline. Although a polymer material can be used, the present invention is not limited to these. That is, any material can be used as long as it can fix or support the molecular recognition material in the step (C) described later. For example, gold can carry or immobilize various molecules by way of a thiol group and silicon by way of a silanol group. Precious metals such as gold, silicon, and silicon oxide can be three-dimensional. It is suitable for a columnar structure material.
[0057]
Regarding the introduction method, if the substrate has conductivity, metals and the like can be easily introduced by the electrodeposition process. Alternatively, a substance serving as a catalyst may be formed at the bottom of the hole by an electrodeposition process or the like, and a target material may be formed by the action of the catalyst. Further, the catalyst at the bottom of the pores may be formed on the substrate surface by a method such as vapor deposition before forming the porous film.
[0058]
By this operation, as shown in FIG. 4D, a structure composed of the target three-dimensional columnar structure forming material is formed in the matrix surrounding the columnar substance in the first film.
[0059]
Next, as shown in FIG. 4E, the matrix 43 component around the three-dimensional columnar structure forming material 46 is removed. By this operation, only the components of the matrix 43 are selectively removed, and the three-dimensional columnar structure 47 in which the three-dimensional columnar structures 47 having no surroundings are arranged on the substrate 41 is formed.
[0060]
As a method for selectively removing matrix components, for example, a process such as etching can be applied. For example, in the case where silicon is the first porous material and is subjected to a chemical treatment in the step (A) to change to silicon oxide, etching with dilute hydrofluoric acid can be favorably applied.
[0061]
Through the above steps, a three-dimensional columnar structure as shown in FIG. 1 is formed on the substrate. The average diameter 2r 'of the columns of the formed three-dimensional columnar structure is 0.5 nm to 15 nm, and the average center interval 2R' is in the range of 5 nm to 20 nm (see FIG. 4E). This size is particularly suitable for supporting and immobilizing a substance derived from a living body or a substance similar thereto, and is very useful as a molecular recognition element for a biosensor.
Step (C): Loading of molecular recognition material on three-dimensional columnar structure
The molecular recognition material used in the present embodiment is a substance relating to the selection of a specific component in the measurement solution. For example, a substance (so-called receptor) that selectively reacts directly with the specific component in the measurement solution, a component to be specified. (For example, a substance that selectively catalyzes the reaction of a specific component), a substance that inactivates substances other than the specific component in the measurement solution, and the like. The molecular recognition material may also have a function of indicating the presence or absence and the degree of detection, for example, the ability to react with a substance released by the receptor or the remaining substance to form a color.
[0062]
The molecular recognition material used in the present embodiment is not particularly limited, and includes, for example, enzymes, sugar chains, catalysts, antibodies, antigens, genes, color reagents, and the like, but the present invention is not limited thereto. Not something.
[0063]
These molecular recognition materials are fixed or supported on the three-dimensional columnar structure by, for example, covalent bonding, ionic bonding, adsorption, or the like. However, the method is not limited to this as long as the molecular recognition material is well fixed or supported. Absent.
[0064]
In the bonding method, a molecular recognition material having a reactive group capable of directly acting on the surface of the three-dimensional columnar structure may be directly reacted and bonded, or a crosslinked material capable of directly acting on the surface of the three-dimensional columnar structure may be reacted. Alternatively, the cross-linking material may be further reacted with a molecular recognition material to bond the cross-linking material.
[0065]
In the method using adsorption, a combination having an appropriate affinity may be selected as a combination of the molecular recognizer material and the material of the three-dimensional columnar structure. Further, by once modifying the surface of the three-dimensional columnar structure, it is possible to form a surface having an appropriate affinity and immobilize the molecular recognition material.
[0066]
By the operation as described above, the molecular recognition element 49 can be formed by fixing the molecular recognition material 48 on the surface of the three-dimensional columnar structure, as shown in FIG.
[0067]
Through the above steps (A) to (C), a molecular recognition element in which a molecular recognition material is fixed or supported on a three-dimensional columnar structure having a very fine structure can be manufactured.
[0068]
The molecular recognition element uses a three-dimensional columnar structure manufactured using the porous film formed on a substrate. Therefore, by patterning the porous film on the substrate, the molecular recognition element can also be easily patterned on the substrate. Also, the height of the three-dimensional columnar structure can be made uniform, and the height can be reduced to the order of nanometers. In the development of a sensor microanalysis system, it is important to integrate elements on a substrate at high density, and this configuration is very advantageous.
[0069]
Next, a sensor using the molecular recognition element, particularly a biosensor will be described.
[0070]
As described above, a biosensor generally includes a molecular recognition element and a detection element.
[0071]
The sensing element displays a reaction that occurs when the molecular recognition element recognizes the substance to be specified as a change in current, voltage, light amount, mass, calorie, and the like. At present, many sensing elements such as an oxygen electrode, a hydrogen peroxide electrode, an ISFET, an optical fiber, a SAW, and a thermistor have been proposed as sensing elements, but the biosensor of the present invention has a high-sensitivity, high-precision molecular recognition element. The feature is that it is used, and the detection method to be combined is not limited to these.
[0072]
In addition, the molecular recognition material can be used in combination, and for example, can constitute a composite enzyme sensor, an antibody-enzyme sensor, an enzyme-microorganism hybrid sensor, and the like.
[0073]
The measurement target of the biosensor of the present invention does not need to be a specific substance to which the molecular recognition material directly reacts, but may be an indirect measurement target. For example, the measurement can be performed by detecting a specific substance specifically present in the measurement target. Therefore, the measurement target is not limited to the biological substance, and the size is not limited. However, the specific substance may be a biological substance contained in living organisms such as sugars, proteins, amino acids, antibodies, antigens and pseudoantigens, vitamins and genes, and related substances and artificially synthesized pseudo biological substances. desirable.
[0074]
The gist of the present invention described above is to form a film of a plurality of substances in a eutectic system under optimum conditions, and to form a columnar substance having a fine diameter including the first component in a member including the second component. A dispersed structure was produced, the columnar substance was removed to form a porous film having columnar pores, and after introducing a material into the pores of the porous film, the porous film was removed. A component having molecular recognition ability is fixed or supported at a high concentration on the three-dimensional columnar structure obtained by the removal to produce a molecular recognition element.
[0075]
It is another object of the present invention to provide a biosensor capable of performing high-sensitivity, high-accuracy, and short-time measurement by combining the molecular recognition element and the detection element.
[0076]
【Example】
(Example 1: First material Al, second material Si)
In this embodiment, as a porous film, an aluminum structure portion surrounded by silicon has a columnar structure, the diameter 2r is 3 nm, the interval 2R is 7 nm, and the length L is 200 nm. Got.
[0077]
First, a method for manufacturing an aluminum thin wire will be described.
[0078]
An aluminum-silicon mixed film containing silicon at 55 atomic% with respect to the total amount of aluminum and silicon is formed to a thickness of about 200 nm on a glass substrate by RF magnetron sputtering. The target used was one in which eight 15 mm square silicon chips 13 were placed on a 4-inch aluminum target. The sputtering conditions were as follows: Ar flow rate: 50 sccm, discharge pressure: 0.7 Pa, and input power: 1 kW using an RF power source. The substrate temperature was room temperature.
[0079]
Here, a target in which eight silicon chips were placed on an aluminum target was used as the target, but the number of silicon chips is not limited to this, and changes according to sputtering conditions, and the composition of the aluminum silicon mixed film is changed. Should be about 55 atomic%. The target is not limited to a silicon chip placed on an aluminum target, but may be an aluminum chip placed on a silicon target or a target obtained by sintering silicon and aluminum powder. .
[0080]
Next, the aluminum-silicon mixed film thus obtained was analyzed by ICP (inductively coupled plasma emission spectrometry) for the amount (atomic%) of silicon with respect to the total amount of aluminum and silicon. As a result, the amount of silicon with respect to the total amount of aluminum and silicon was about 55 atomic%. Here, for the sake of measurement, an aluminum silicon mixed film deposited on a carbon substrate was used as the substrate.
[0081]
The aluminum silicon mixed film was observed by FE-SEM (field emission scanning electron microscope). The shape of the surface viewed from directly above the substrate was such that circular aluminum nanostructures surrounded by silicon were two-dimensionally arranged. The pore diameter of the aluminum nanostructure portion was 3 nm, and the average center-to-center spacing was 7 nm. When the cross section was observed by FE-SEM, the height was 200 nm, and the respective aluminum nanostructure portions were independent of each other.
[0082]
Further, when this sample was observed by an X-ray diffraction method, no silicon peak showing crystallinity could be confirmed, and silicon was amorphous.
[0083]
Therefore, an aluminum silicon nanostructure including a thin aluminum wire with a spacing 2R of 7 nm, a diameter 2r of 3 nm, and a height L of 200 nm surrounded by silicon could be produced.
[0084]
(Comparative example)
As a comparative sample A of the above example, an aluminum-silicon mixed film containing silicon and 15 atomic% with respect to the total amount of aluminum and silicon was formed to a thickness of about 200 nm on a glass substrate by a sputtering method. The target used was one in which two 15-mm square silicon chips 13 were placed on a 4-inch aluminum target. The sputtering conditions were as follows: Ar flow rate: 50 sccm, discharge pressure: 0.7 Pa, and input power: 1 kW using an RF power source. The substrate temperature was room temperature.
[0085]
Comparative sample A was observed with an FE-SEM (field emission scanning electron microscope). The shape of the surface viewed from directly above the substrate was such that the aluminum portion was not in a circular shape but in a rope shape. That is, the aluminum columnar structure was not a microstructure uniformly dispersed in the silicon region. Furthermore, its size was well over 10 nm. Also, when the cross section was observed by FE-SEM, the width of the aluminum portion exceeded 15 nm. The aluminum-silicon mixed film thus obtained was analyzed by ICP (inductively coupled plasma emission spectrometry) for the amount (atomic%) of silicon with respect to the total amount of aluminum and silicon. As a result, the amount of silicon with respect to the total amount of aluminum and silicon was about 15 atomic%.
[0086]
Further, as a comparative sample B, an aluminum-silicon mixed film containing silicon at 75 atomic% with respect to the total amount of aluminum and silicon was formed to a thickness of about 200 nm on a glass substrate by a sputtering method. The target used was a 14-inch aluminum target with 14 silicon chips 13 of 15 mm square. The sputtering conditions were as follows: Ar flow rate: 50 sccm, discharge pressure: 0.7 Pa, and input power: 1 kW using an RF power source. The substrate temperature was room temperature.
[0087]
Comparative sample B was observed by FE-SEM (field emission scanning electron microscope). No aluminum portion could be observed on the sample surface as viewed from directly above the substrate. Further, even when the cross section was observed with the FE-SEM, the aluminum portion could not be clearly observed. The aluminum-silicon mixed film thus obtained was analyzed by ICP (inductively coupled plasma emission spectrometry) for the amount (atomic%) of silicon with respect to the total amount of aluminum and silicon. As a result, the amount of silicon with respect to the total amount of aluminum and silicon was about 75 atomic%.
[0088]
Further, only the condition of the number of silicon chips was changed from that of the comparative sample A, and the ratio of silicon to the total amount of the aluminum-silicon mixture was 20 atomic%, 35 atomic%, 50 atomic%, 60 atomic%, and 70 atomic%. Was prepared. A case where the aluminum columnar structure is a fine structure uniformly dispersed in the silicon region is indicated by “○”, and a case where the aluminum columnar structure is not formed is indicated by “×”.
[0089]
[Table 1]
As described above, by adjusting the silicon content relative to the total amount of aluminum and silicon to 20 atomic% or more and 70 atomic% or less, it is possible to control the pore size of the manufactured aluminum nanostructure and to have excellent linearity. It becomes possible to produce aluminum thin wires. In order to confirm the structure, it is preferable to use a TEM (transmission electron microscope) or the like in addition to the SEM. In addition, about the said content, it was the same even if it used germanium or the mixture of silicon and germanium instead of the said silicon.
[0090]
Further, as a comparative sample C, an aluminum-silicon mixed film containing silicon at 55 atomic% with respect to the total amount of aluminum and silicon was formed to a thickness of about 200 nm on a glass substrate by a sputtering method. The target used was one in which eight 15 mm square silicon chips 13 were placed on a 4-inch aluminum target. The sputtering conditions were as follows: Ar flow rate: 50 sccm, discharge pressure: 0.7 Pa, and input power: 1 kW using an RF power source. The substrate temperature was set to 250 ° C.
[0091]
Comparative sample C was observed with an FE-SEM (field emission scanning electron microscope). No clear boundary between aluminum and silicon could be confirmed on the sample surface viewed from directly above the substrate. That is, the aluminum nanostructure could not be confirmed. That is, if the substrate temperature is too high, the state changes to a more stable state, and it is considered that the film growth for forming such an aluminum nanostructure has not been performed.
[0092]
In addition, in order to obtain a structure in which the columnar members are dispersed, it is also a preferable embodiment to set the composition of the target to Al: Si = 55: 45.
[0093]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the present invention is not limited to these Examples, and materials, reaction conditions, and the like may be the same. It can be changed freely within the range where the sensor can be obtained.
[0094]
Hereinafter, Examples 2, 3, and 4 show examples in which a molecular recognition element was manufactured, and Examples 5, 6, 7, and 8 show examples in which a biosensor was manufactured using the molecule recognition element.
(Example 2)
In this example, a porous film of silicon oxide was prepared using aluminum and silicon as substances forming a eutectic crystal, a three-dimensional columnar structure of gold was prepared using the porous film, and glucose was used as a molecular recognition material. This is an example in which oxytase is immobilized on a three-dimensional columnar structure to produce a molecular recognition element. Glucose oxidase is an enzyme having a catalytic ability for an oxidation reaction of glucose, and is a typical molecular recognition material for glucose.
[0095]
First, a method for manufacturing a silicon porous film will be described.
[0096]
A 200 nm aluminum-silicon mixed film was formed on a silicon substrate on which 20 nm of tungsten was deposited by RF magnetron sputtering. The target is obtained by placing six 15 mm square silicon chips on a 4-inch aluminum target. Sputtering was performed using an RF power source under the conditions of an Ar flow rate of 50 sccm, a discharge pressure of 0.7 Pa, and an input power of 300 W. The substrate temperature was room temperature.
[0097]
Here, a target in which six silicon chips were placed on an aluminum target was used. However, the number of silicon chips varies depending on sputtering conditions, and is not limited thereto. Any material can be used as long as a desired structure in which aluminum is dispersed in silicon can be formed. The target is not limited to a silicon chip placed on an aluminum target, but may be an aluminum chip placed on a silicon target, or a target obtained by sintering silicon and aluminum powder. good.
[0098]
Further, although the RF sputtering method is used here as the sputtering method, the present invention is not limited to this, and may be an ECR sputtering method, a DC sputtering method, or an ion beam sputtering method. Furthermore, sputtering conditions depend on the apparatus, and are not limited to these. Further, the present invention can be applied to a vapor deposition method other than the sputtering method as long as a desired structure can be formed.
[0099]
Next, the aluminum-silicon mixed film thus obtained was analyzed by ICP (inductively coupled plasma emission spectrometry) for the amount (atomic%) of silicon with respect to the total amount of aluminum and silicon. As a result, the amount of silicon with respect to the total amount of aluminum and silicon was about 37 atomic%.
[0100]
Observation of the aluminum-silicon mixed film produced as described above with a field emission scanning electron microscope (FE-SEM) revealed that fine columnar aluminum having a substantially circular shape surrounded by silicon members was two-dimensionally arranged. Was. The average diameter 2r of the columnar aluminum portion determined by image processing was 5 nm, and the average center distance 2R was 10 nm. When the cross section was observed by FE-SEM, the height L of the film was 200 nm, and the columnar aluminum portions were independent of each other.
[0101]
When the thin film sample was analyzed by the X-ray diffraction method, no diffraction line of silicon could be confirmed, and it was found that silicon was amorphous. On the other hand, a plurality of diffraction lines of aluminum could be confirmed, indicating that aluminum was polycrystalline.
[0102]
From the above, it was confirmed that an aluminum-silicon structure surrounded by amorphous silicon and having crystalline columnar aluminum having an average diameter of 5 nm and an average height of 200 nm arranged at an average interval of 10 nm was obtained.
[0103]
The aluminum-silicon structure was immersed in 98% sulfuric acid for 24 hours, and only the aluminum columnar structure was selectively etched to form pores. As a result of observing the film after the etching by FE-SEM, it was confirmed that only the columnar aluminum was removed and the film became a porous film. It was found that the shape of the silicon portion was not substantially changed as compared with before the removal of aluminum. Also in this case, when the cross section was observed by FE-SEM, it was found that aluminum was completely removed to the substrate interface.
[0104]
Through the above steps, a porous silicon film having a through-hole perpendicular to the substrate was formed on the substrate.
[0105]
Finally, the manufactured silicon porous film was heated in an oxygen atmosphere. Here, heating was performed at 800 ° C. for 2 hours while flowing oxygen at 50 sccm at atmospheric pressure. As a result, a silicon oxide porous film was produced. The formation of silicon oxide was confirmed by wide area electron energy loss structural analysis (EELS). As a result of observing the porous membrane after the oxidation treatment by FE-SEM, almost no change was observed in the pore diameter.
[0106]
Next, a method for producing a three-dimensional columnar structure by introducing a three-dimensional columnar structure forming material into the pores of the produced porous membrane will be described.
[0107]
First, the silicon porous film prepared in the above step was placed in a commercially available electroplating solution (electroplating solution for gold manufactured by Kojundo Chemical Laboratory, product code K-24E), and an acidic bath (pH: 40 ° C.) maintained at 40 ° C. = 4.5), 0.5 A / dm Two Electrodeposition was performed at a current density of
[0108]
After the electrodeposited gold film was washed with pure water, the surface and the cross section were observed by FE-SEM. As a result, it was confirmed that gold was uniformly introduced into the pores and formed a columnar structure.
[0109]
The film was further immersed in 2% hydrofluoric acid to remove silicon oxide present around gold. As a result of observing the silicon substrate from which the silicon oxide had been removed by FE-SEM, it was confirmed that a three-dimensional columnar structure in which gold having a fine columnar structure was arranged at a high density was formed on the surface. The average diameter 2r 'of the columnar gold determined by the image processing was 4 nm, and the average center distance 2R was 10 nm.
[0110]
Next, a method for producing a molecular recognition element by immobilizing glucose oxidase as a molecular recognition material on the produced gold three-dimensional columnar structure will be described.
[0111]
In this example, glucose oxidase was immobilized on the surface of a gold three-dimensional columnar structure via an alkanethiol molecule.
[0112]
It is known that thiol molecules spontaneously bond to noble metals, but when an alkyl group is further introduced into the thiol molecules, the thiol molecules are regularly arranged on the surface of the noble metal. Therefore, through the thiol molecule, regular coordination of glucose oxidase becomes possible, and glucose oxidase can be immobilized densely and in a large amount.
[0113]
In this example, the thiol molecule was bonded to the surface of the three-dimensional columnar structure, and then the cross-linking material was bonded to the thiol molecule, and glucose oxidase was bonded to the cross-linked molecule. In this method, although the number of operations is increased, various molecular recognition materials can be immobilized by using a cross-linking molecule.
[0114]
FIG. 5 is a diagram schematically illustrating immobilization of glucose oxidase on the surface of a three-dimensional columnar structure of gold.
[0115]
The gold three-dimensional columnar structure 51 is immersed in 5 mM mercaptoalkylcarboxylic acid (see reference numeral 52 in FIG. 5A), 25% ethanol, 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) for 30 minutes. (Refer to the surface change of the three-dimensional columnar structure 51 shown in FIGS. 5A and 5B).
[0116]
Next, gold was placed in 10 mM 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (see reference numeral 53 in FIG. 5B) and 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) for 30 minutes. Of the three-dimensional columnar structure 51 is then immersed in 10 mM sodium N-hydroxysulfosulfosuccinate (see reference numeral 54 in FIG. 5 (b)) and 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). The three-dimensional columnar structure 51 made of gold is immersed for a minute (see the surface change of the three-dimensional columnar structure 51 shown in FIGS. 5B to 5C).
[0117]
Finally, the gold tertiary columnar element structure 51 is immersed in a solution of glucose oxidase (see reference numeral 55 in FIG. 5C) dialyzed in advance with a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) ( FIG. 5C to FIG. 5D show changes in the surface of the three-dimensional columnar structure 51).
[0118]
After each step, the substrate was washed with a buffer solution to remove unreacted substances and the like.
[0119]
According to the method described above, in this example, a glucose oxidase was immobilized on the surface of the gold three-dimensional columnar structure, and a molecular recognition element in which the molecular recognition material was immobilized at a high concentration was produced.
(Example 3)
In this example, a porous film of germanium was prepared using aluminum and germanium as substances forming a eutectic crystal, a three-dimensional columnar structure of gold was prepared using the porous film, and biotin was used as a molecular recognition material. This is an example in which a molecular recognition element is manufactured by fixing to a three-dimensional gold columnar structure.
[0120]
Biotin is a coenzyme that specifically binds to avidin, and it is possible to label many substances and structures using this strong bond, and is a useful molecular recognition material.
[0121]
First, a method for manufacturing a germanium porous film will be described.
[0122]
A 200 nm aluminum-germanium mixed film was formed on a silicon substrate on which 20 nm of tungsten was deposited by RF magnetron sputtering. The target is a 4-inch aluminum target on which four 15 mm square germanium chips are placed. Sputtering was performed using an RF power source under the conditions of an Ar flow rate of 50 sccm, a discharge pressure of 0.7 Pa, and an input power of 1 kW. The substrate temperature was room temperature.
[0123]
Here, a target in which four germanium chips were placed on an aluminum target was used as a target. However, the number of germanium chips changes according to sputtering conditions, and is not limited thereto. What is necessary is just to be able to form a desired structure in which aluminum is dispersed in germanium. Further, the target is not limited to a target in which a germanium chip is placed on an aluminum target, and may be a target in which an aluminum chip is placed on a germanium target, or a target obtained by sintering a powder of germanium and aluminum may be used. .
[0124]
Furthermore, although the RF sputtering method is used here as the sputtering method, the present invention is not limited to this, and may be an ECR sputtering method, a DC sputtering method, or an ion beam sputtering method. Furthermore, sputtering conditions depend on the apparatus, and are not limited to these. Further, the present invention can be applied to a vapor deposition method other than the sputtering method as long as a desired structure can be formed.
[0125]
Next, the aluminum-germanium mixed film thus obtained was analyzed by ICP (inductively coupled plasma emission spectrometry) for the amount (atomic%) of the germanium relative to the total amount of aluminum and germanium. As a result, the amount of germanium with respect to the total amount of aluminum and germanium was about 37 atomic%.
[0126]
When the aluminum-germanium mixed film manufactured as described above was observed by a field emission scanning electron microscope (FE-SEM), almost circular fine columnar aluminum surrounded by germanium members was two-dimensionally arranged. Was. The average diameter 2r obtained by image processing of the columnar aluminum portion was 10 nm, and the average center distance 2R was 15 nm. When the cross section was observed by FE-SEM, the height L of the film was 200 nm, and the columnar aluminum portions were independent of each other.
[0127]
Further, when this thin film sample was analyzed by the X-ray diffraction method, no diffraction line of germanium was confirmed, and it was found that germanium was amorphous. On the other hand, a plurality of diffraction lines of aluminum could be confirmed, indicating that aluminum was polycrystalline.
[0128]
From the above, it can be confirmed that an aluminum-germanium structure including crystalline columnar aluminum having an interval 2R of 15 nm, a diameter 2r of 10 nm, and a height L of 200 nm surrounded by amorphous sigermanium is provided. Was.
[0129]
The aluminum-germanium structure was immersed in 98% sulfuric acid for 24 hours, and only the aluminum columnar structure was selectively etched to form pores. As a result of observing the film after the etching by FE-SEM, it was confirmed that only the columnar aluminum was removed and the film became a porous film. It was found that the shape of the germanium portion was not substantially changed as compared with before the removal of aluminum. Also in this case, when the cross section was observed by FE-SEM, it was found that aluminum was completely removed to the substrate interface. Through the above steps, a germanium porous film having a through-hole perpendicular to the substrate was formed on the substrate.
[0130]
Next, a method for producing a three-dimensional columnar structure by introducing a three-dimensional columnar structure forming material into the pores of the produced porous membrane will be described.
[0131]
First, the germanium porous film prepared in the above step was placed in a commercially available electroplating solution (electroplating solution for gold manufactured by Kojundo Chemical Laboratory, product code K-24E), and an acidic bath (pH: 40 ° C.) maintained at 40 ° C. = 4.5), 0.5 A / dm Two Electrodeposition was performed at a current density of
[0132]
After the electrodeposited gold film was washed with pure water, the surface and the cross section were observed by FE-SEM. As a result, it was confirmed that gold was uniformly introduced into the pores and formed a columnar structure.
[0133]
This film was further immersed in 50% nitric acid to remove germanium around gold. As a result of observing the silicon substrate from which germanium was removed by FE-SEM, it was confirmed that a three-dimensional columnar structure in which fine columnar gold was arranged at a high density on the surface was formed. The average diameter 2r 'of the columnar gold determined by the image processing was 9 nm, and the average center distance 2R was 15 nm.
[0134]
Next, a method of manufacturing a molecular recognition element by immobilizing biotin as a molecular recognition material on the manufactured three-dimensional columnar structure of gold will be described.
[0135]
As a reagent, biotinthiol as introduced in Non-Patent Document 1 was used. The biotin thiol is a substance in which a thiol group is bonded to biotin, and can easily immobilize a target molecular recognition material, that is, biotin, on the surface of a noble metal by a single immersion operation. As a similar substance, Patent Document 3 discloses biotin silane, which is also useful when the three-dimensional columnar structure is a metal or metal oxide.
[0136]
The biotin thiol was dissolved in ethanol at a concentration of 0.5 mM, and the substrate on which the gold three-dimensional columnar structure was formed was immersed for 30 minutes. Thereafter, the substrate was washed three times with ethanol and dried.
[0137]
According to the above method, in this example, biotin was immobilized on the surface of the gold three-dimensional columnar structure, and a molecular recognition element in which the molecular recognition material was immobilized at a high concentration was manufactured.
(Example 4)
In this example, a porous film of silicon oxide was prepared using aluminum and silicon as materials for forming a eutectic, a three-dimensional columnar structure of silicon was prepared using the porous film, and DNA was used as a molecular recognition material. Is an example in which a molecular recognition element is manufactured by fixing the element to a three-dimensional columnar structure made of silicon.
[0138]
Gene sensors using a nucleic acid probe as a substance capable of specifically binding to a target nucleic acid are being actively developed at present, and probe DNA is one of the typical molecular recognition materials.
[0139]
First, a method for manufacturing a porous silicon oxide film will be described.
[0140]
A 200 nm aluminum-silicon mixed film was formed on a silicon substrate on which 20 nm of tungsten was deposited by RF magnetron sputtering. The target is obtained by placing six 15 mm square silicon chips on a 4-inch aluminum target instead of the germanium chips of the first embodiment. Sputtering was performed using an RF power source under the conditions of an Ar flow rate of 50 sccm, a discharge pressure of 0.7 Pa, and an input power of 300 W. The substrate temperature was room temperature.
[0141]
Here, a target in which six silicon chips were placed on an aluminum target was used. However, the number of silicon chips varies depending on sputtering conditions, and is not limited thereto. Any material can be used as long as a desired structure in which aluminum is dispersed in silicon can be formed. The target is not limited to a silicon chip placed on an aluminum target, but may be an aluminum chip placed on a silicon target or a target obtained by sintering silicon and aluminum powder. .
[0142]
Furthermore, although the RF sputtering method is used here as the sputtering method, the present invention is not limited to this, and may be an ECR sputtering method, a DC sputtering method, or an ion beam sputtering method. Furthermore, sputtering conditions depend on the apparatus, and are not limited to these. Further, the present invention can be applied to a vapor deposition method other than the sputtering method as long as a desired structure can be formed.
[0143]
Next, the aluminum-silicon mixed film thus obtained was analyzed by ICP (inductively coupled plasma emission spectrometry) for the amount (atomic%) of silicon with respect to the total amount of aluminum and silicon. As a result, the amount of silicon with respect to the total amount of aluminum and silicon was about 37 atomic%.
[0144]
When the aluminum-silicon mixed film manufactured as described above was observed with a field emission scanning electron microscope (FE-SEM), almost circular fine columnar aluminum surrounded by silicon was two-dimensionally arranged. I was The average pore diameter 2r determined by image processing of the columnar aluminum portion was 5 nm, and the average center distance 2R was 10 nm. When the cross section was observed by FE-SEM, the height of the film was 200 nm, and the columnar aluminum portions were independent of each other.
[0145]
When the thin film sample was analyzed by the X-ray diffraction method, no diffraction line of silicon could be confirmed, and it was found that silicon was amorphous. On the other hand, a plurality of diffraction lines of aluminum could be confirmed, indicating that aluminum was polycrystalline.
[0146]
From the above, it was confirmed that an aluminum-silicon structure thin film containing crystalline columnar aluminum and having a spacing 2R of 10 nm, a diameter 2r of 5 nm, and a height L of 200 nm surrounded by amorphous silicon was obtained. Was.
[0147]
The aluminum-silicon structure thin film was immersed in 98% sulfuric acid for 24 hours, and only the aluminum columnar structure was selectively etched to form pores. As a result of observing the film after etching by FE-SEM, it was confirmed that only columnar aluminum was removed and the film was porous. It was found that the shape of the silicon portion was not substantially changed as compared with before the removal of aluminum. Also in this case, when the cross section was observed by FE-SEM, it was found that aluminum was completely removed to the substrate interface. Through the above steps, a porous silicon film having a through-hole perpendicular to the substrate on the substrate was produced.
[0148]
Finally, the manufactured silicon porous film was heated in an oxygen atmosphere. Here, heating was performed at 800 ° C. for 2 hours while flowing oxygen at 50 sccm at atmospheric pressure. As a result, a silicon oxide porous film was produced. The formation of silicon oxide was confirmed by wide area electron energy loss structure analysis (EELS). As a result of observing the porous membrane after the oxidation treatment by FE-SEM, almost no change was observed in the pore diameter.
[0149]
Next, a method for producing a three-dimensional columnar structure by introducing a three-dimensional columnar structure forming material into the pores of the produced porous membrane will be described.
[0150]
First, gold was introduced into the bottom of the pores of the porous silicon oxide film by electrodeposition (electroplating). The electrodeposition was performed using the same plating solution as in Example 1 and 0.3 A / dm. Two At a current density of 5 seconds. The substrate after electrodeposition was thoroughly washed with pure water and then dried.
[0151]
Subsequently, the silicon substrate on which the silicon oxide film supporting gold at the bottom of the pores was formed was held in a quartz tube, depressurized to 13.3 Pa or lower, and then heated to 440 ° C. in an Ar gas stream. Subsequently, a mixed gas obtained by mixing helium gas and silane gas at 10% was supplied at a flow rate of 50 sccm for 60 seconds. The sample substrate was taken out after the supply of the silane gas was stopped and then gradually cooled to room temperature.
[0152]
The cross section of the sample thin film after performing the above steps was evaluated by FE-SEM. As a result, it became clear that a fine columnar structure of silicon was formed in the pores. X-ray diffraction analysis and the like confirmed that the silicon was highly crystallized. In this case, it is considered that crystalline silicon was formed by the VLS (Vapor-Liquid-Solid) mechanism using gold at the bottom of the pores as a catalyst. Through the above steps, a crystalline silicon columnar structure could be formed in the porous silicon oxide.
[0153]
The substrate having silicon formed in the pores was further immersed in 2% hydrofluoric acid to remove silicon oxide present around silicon. As a result of observing the silicon substrate from which the silicon oxide was removed by FE-SEM, it was confirmed that a three-dimensional columnar structure in which silicon having a fine columnar structure was arranged at a high density was formed on the surface. The average diameter 2r 'of the columnar silicon determined by image processing was 4 nm, and the average center-to-center distance 2R was 10 nm.
[0154]
Next, a method of manufacturing a molecular recognition element by immobilizing probe DNA as a molecular recognition material on the manufactured silicon three-dimensional columnar structure will be described.
[0155]
For the synthesis of the probe DNA, a single-stranded nucleic acid of SEQ ID NO: 1 was synthesized using an automatic DNA synthesizer. A thiol group was introduced into the end of the single-stranded DNA of SEQ ID NO: 1 by using a thiol-modifier at the time of synthesis using an automatic DNA synthesizer. Subsequently, the DNA was recovered by ordinary deprotection, purified by high performance liquid chromatography, and used in the following experiments.
[0156]
SEQ ID NO: 1 5'HS- (CH2) 6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3 '
First, a 1 wt% aqueous solution of a silane coupling agent containing a silane compound (N-β- (aminoethyl) -γ-aminopropyltrimethoxysilane) [(CH 3 O) 3 SiC 3 H 6 NHC 2 H 4 NH 2] having an amino group bonded thereto is stirred at room temperature for 2 hours. Then, the methoxy group in the molecule of the silane compound was hydrolyzed.
[0157]
Next, the substrate on which the three-dimensional columnar structure was formed was immersed in the solution at room temperature (25 ° C.) for 20 minutes, then pulled up and dried. Next, the substrate was baked in an oven heated to 120 ° C. for 1 hour to complete the silane coupling treatment, and amino groups were introduced on the surface of the three-dimensional columnar structure.
[0158]
Next, 2.7 mg of N-maleimidocaproyloxysuccinimide (hereinafter abbreviated as EMCS) was weighed, and dissolved in a 1: 1 solution of dimethylsulfoxide (DMSO) / ethanol to a final concentration of 0.3 mg / ml. A solution was prepared. The three-dimensional columnar structure subjected to the silane coupling treatment is immersed in this EMCS solution at room temperature for 2 hours, and the amino group carried on the surface of the three-dimensional columnar structure reacts with the carboxyl group of the EMCS solution by the silane coupling treatment. I let it. In this state, a maleimide group derived from EMCS exists on the surface of the three-dimensional columnar structure. The three-dimensional columnar structure pulled out of the EMCS solution was sequentially washed with a mixed solvent of DMSO and ethanol and ethanol, and then dried under a nitrogen gas atmosphere.
[0159]
The single-stranded DNA of SEQ ID NO: 1 was dissolved in a TE solution (10 mM Tris-HCl (pH 8) / 1 mM EDTA aqueous solution) to a final concentration of about 400 mg / ml to prepare a single-stranded DNA solution.
[0160]
Next, the DNA solution was added with distilled water to adjust the final concentration of the single-stranded DNA to 8 μM, and the substrate on which the three-dimensional columnar structure was formed was immersed in the solution for 30 minutes to form a maleimide group. The nucleic acid was reacted with a thiol group at the end of the probe.
[0161]
According to the above method, in this example, a probe DNA was immobilized on the surface of a silicon three-dimensional columnar structure, and a molecular recognition element in which a molecular recognition material was immobilized at a high concentration was manufactured.
(Example 5)
In the present example, a biosensor manufactured using the molecular recognition element to which glucose oxidase manufactured in Example 2 is immobilized will be described.
[0162]
The present embodiment is an example of a biosensor that electrically detects a molecular recognition reaction.
[0163]
FIG. 6 is a schematic diagram illustrating a cross section of the biosensor according to the present embodiment.
[0164]
In the biosensor shown in FIG. 6, the molecular recognition element 604 manufactured in Example 2, the working electrode 607, the reference electrode 608, and the counter electrode 609 were arranged on the substrate 606. The arrangement of the electrodes 607 to 609 is not limited to this. However, since hydrogen peroxide generated by the reaction on the molecular recognition element 604 is detected by the electrodes, the electrodes 607 to 609 are particularly required when the measurement solution is flowed in a flow system. 609 is preferably arranged on the measurement solution discharge pipe 610 side with respect to the molecular recognition element 604. Further, the insulating film 612 is formed on the base of each of the electrodes 607 to 609 in order to prevent a short circuit between the electrodes 607 to 609. However, a structure using an insulating substrate for the substrate 606 may be used. Not limited to this. Next, a second substrate 603 was arranged on the substrate 606 via a spacer 602, and a solution space 611 into which the measurement solution 601 was introduced was formed. The electrodes 607 to 609 may be formed on the second substrate 603. In this case, a short circuit may be prevented by using an insulating material for the base, the spacer, and the like. Further, in this solution space 611, a thin tube for introducing and discharging the measuring solution 601, that is, a measuring solution introducing tube 605 and a measuring solution discharging tube 610 are arranged. The electrodes 607 to 609 are connected to a voltage application circuit and a current measurement circuit (not shown).
[0165]
Next, a measurement method using the biosensor shown in FIG. 6 will be described.
[0166]
First, a phosphate buffer solution containing sodium chloride at a concentration of 0.1 M is introduced into the solution space 611 from the measuring solution introducing tube 605 at a flow rate of 4 μl / min. Apply a 7V potential to obtain a baseline. Next, when a measurement solution 601 containing glucose at a concentration of 10 μM is introduced, a reaction between glucose oxidase of the molecular recognition element 604 and glucose in the measurement solution 601 generates hydrogen peroxide, and the hydrogen peroxide is used as a medium. Oxidation current began to flow through each of the electrodes 607 to 609 according to the amount of generation, and an oxidation current of 50 nA was observed after 10 seconds by a current measurement circuit (not shown).
[0167]
On the other hand, as a comparative example, a biosensor similar to that in Example 2 was used, in which glucose oxidase was immobilized on a smooth gold surface having the same apparent area but no three-dimensional structure. Was prepared, and the same measurement was performed. As a result, only an oxidation current of about 2 nA could be observed, and the time required for stable observation was long.
[0168]
From the above results, in this example, it was confirmed that the use of the above-described molecular recognition element enables the production of a biosensor capable of performing highly sensitive detection in a short time.
(Example 6)
In the present embodiment, another configuration of a biosensor manufactured using the molecular recognition element to which glucose oxidase manufactured in Embodiment 2 is immobilized will be described.
[0169]
The present embodiment is an example of a biosensor that electrically detects a molecular recognition reaction.
[0170]
FIG. 7 is a schematic diagram illustrating a cross section of the biosensor according to the present embodiment.
[0171]
As shown in FIG. 7, in the biosensor of the present embodiment, the molecular recognition element manufactured in Example 2 also functions as a working electrode and functions as a molecular recognition element electrode 704, and a reference electrode 708 and a counter electrode 709 are used for a solution. It is formed in the space 711. Similarly to the fourth embodiment, an insulating film 712 is formed so that the electrodes 704, 708, and 709 are not short-circuited, and an insulating material is used for the spacer 702 and the second substrate 703. Note that the arrangement of the insulating film 712 and the materials of the substrate 706, the second substrate 703, the spacer 702, and the like are not limited thereto as long as a short circuit between the electrodes can be prevented. The electrodes 704, 708, 709 are connected to a voltage application circuit and a current measurement circuit (not shown). Further, in this solution space 711, a thin tube for introducing and discharging the measurement solution 701, that is, a measurement solution introduction tube 705 and a measurement solution discharge tube 710 are arranged.
[0172]
In this embodiment, the three-dimensional columnar structure constituting the molecular recognition element is made of gold, and a conductive thin film (tungsten thin film) 707 is formed on a substrate 706 as a base. (A voltage application circuit or a current application circuit), and can also serve as a molecular recognition element and a working electrode.
[0173]
Next, a measurement method using the biosensor shown in FIG. 7 will be described.
[0174]
As in Example 1, first, a phosphate buffer solution containing 0.1 M sodium chloride was introduced into the solution space 711 from the measurement solution introduction tube 705 at a flow rate of 4 μl / min. A potential of 0.7 V is applied through 704, 708, and 709 to obtain a baseline. Next, when a measurement solution 701 containing glucose at a concentration of 10 μM is introduced, a reaction between glucose oxidase of the molecular recognition element electrode 704 and glucose in the measurement solution 701 generates hydrogen peroxide, and the amount of the generated hydrogen peroxide Then, an oxidation current began to flow through each of the electrodes 704, 708, and 709, and an oxidation current of 40 nA was observed after 10 seconds by a current measurement circuit (not shown).
[0175]
On the other hand, as a comparative example, a biosensor similar to that in Example 2 was used, in which glucose oxidase was immobilized on a smooth gold surface having the same apparent area but no three-dimensional structure. Was prepared, and the same measurement was performed. As a result, only an oxidation current of about 2 nA could be observed, and the time required for stable observation was long.
[0176]
In the configuration of the biosensor according to the present embodiment, it is difficult to define the effective electrode area because it serves as both the working electrode and the molecular recognition element, but the sensor configuration is simplified and the size can be reduced.
[0177]
From the above results, it was confirmed that in the present example, the use of the molecular recognition element described above makes it possible to manufacture a biosensor that is small and capable of performing highly sensitive detection in a short time.
(Example 7)
In the present embodiment, a biosensor manufactured using the molecular recognition element to which biotin manufactured in Embodiment 3 is immobilized will be described. The present embodiment is an example of a biosensor that detects a molecular recognition reaction as a change in mass.
[0178]
FIG. 8 is a schematic diagram illustrating a cross section of the biosensor according to the present embodiment.
[0179]
The biosensor shown in FIG. 8 is one in which the biotin-immobilized molecular recognition element of Example 3 is formed on a crystal resonator electrode. Specifically, a pair of electrodes (a plus side electrode and a minus side electrode) 82 are arranged on both sides of the quartz oscillator 83, and a predetermined voltage is applied between the two electrodes 82 to specify the quartz oscillator 82. In the configuration in which the oscillator 84 (external circuit 86) that oscillates at the frequency is connected to the electrode 82, the biotin-immobilized molecular recognition element 81 manufactured by the same method as in the third embodiment is formed. is there.
[0180]
The electrical impedance of the crystal unit 83 used in this embodiment is reduced at a specific frequency. This particular frequency is also called the resonance frequency, and depends on the density and thickness of the crystal unit, the following equation:
Δf = Δm / (A · ρ · t) · f (1)
[Δf: change in resonance frequency (Hz), Δm: change in weight of electrode surface (g), f: basic resonance frequency (Hz), A: electrode area (cm 2), ρ: density of crystal (g / cm3), t: thickness of crystal (cm)].
[0181]
Here, f / (A · ρ · t) = K = constant
Equation (1) is
Δf = K △ m (2)
It is expressed as
[0182]
Therefore, if the molecular recognition material is immobilized on the electrode surface, the weight increases due to the binding to the specific substance to be detected, which appears as a change in the resonance frequency. The present biosensor measures this change and detects avidin that specifically binds to biotin.
[0183]
Next, a measurement method using the biosensor shown in FIG. 8 will be described.
[0184]
First, the crystal oscillator 83 on which the molecular recognition element 81 having the above-mentioned bition fixed and the electrode 82 are arranged is immersed in 10 ml of a 20 mM phosphate buffer (pH 7.4). When 100 μl of a 1 mg / ml avidin solution is injected into this solution, biotin and avidin specifically bind, and the weight of the electrode surface changes. A change in the resonance frequency of the crystal unit 83 due to the change in the mass was measured.
[0185]
On the other hand, as a comparative example, biotin was immobilized on a smooth gold surface having the same apparent area and no three-dimensional columnar structure formed thereon in the same manner as in Example 3, and this was used as an electrode. The immersed quartz oscillator was similarly immersed, and the change in resonance frequency was measured.
[0186]
As a result, as shown in the graph (horizontal axis: time, vertical axis: frequency change amount) of the frequency change of the crystal unit shown in FIG. 9, a biosensor incorporating the three-dimensional structure of the present embodiment (solid line in the figure) The change in the frequency before and after the injection of the avidin solution is larger in the biosensor having the smooth structure of the comparative example (see the change curve indicated by the broken line in the figure) in the biosensor having the smooth structure of the comparative example (see the change curve indicated by). Time was short.
[0187]
From the above results, in this example, it was confirmed that the use of the above-described molecular recognition element enables the production of a biosensor capable of performing highly sensitive detection in a short time.
(Example 7)
In this embodiment, a biosensor manufactured using the molecular recognition element 101 to which the DNA manufactured in Embodiment 4 is immobilized will be described.
[0188]
The present embodiment is an example of a biosensor that optically detects a molecular recognition reaction.
[0189]
FIGS. 10A and 10B are schematic diagrams illustrating a cross section of the biosensor according to the present embodiment. In each of the biosensors shown in FIGS. 10A and 10B, a three-dimensional columnar structure to which DNA is fixed is formed on a substrate 102 as a molecular recognition element 101.
[0190]
Among them, the biosensor shown in FIG. 10A has a structure in which liquid stoppers 103 are formed at both ends of a molecule recognition element 101 on a substrate 102, and is dropped toward the molecule recognition element 101 on the substrate 102 for use. Is a configuration example of
[0191]
On the other hand, the biosensor shown in FIG. 10B is a configuration example in the case of using a flow system, as in FIGS. That is, in this biosensor, a solution space is formed between the substrate 102 on which the molecular recognition element 101 is formed and the second substrate 104 via the spacer 105, and the measurement solution introduction tube 107 is provided on the upstream side thereof. A measurement solution discharge pipe 108 is provided on the downstream side, the measurement solution 106 is introduced into the solution space from the measurement solution introduction pipe 107, and discharged from the measurement solution discharge pipe 108 through the molecular recognition element 101 on the substrate 102. I have. However, since the measurement is performed by a fluorescence meter (not shown), a substrate that does not hinder the observation of fluorescence emission is used as the second substrate 104.
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Next, a measuring method using the biosensor having the configuration shown in FIG.
[0193]
First, a single-stranded DNA having a base sequence complementary to the DNA of SEQ ID NO: 1 was synthesized by an automatic DNA synthesizer, and a single-stranded DNA labeled with rhodamine bound to the 5 ′ end was obtained. This labeled single-stranded DNA was dissolved in 1 M NaCl / 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) to a final concentration of 1 μM. This solution was used as a measurement solution, and was dropped onto the molecular recognition element 101 shown in FIG. 10A, and reacted at room temperature (25 ° C.) for 3 hours. Then, the unreacted single-stranded DNA was washed away by washing with a 1 M NaCl / 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) solution.
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Next, when fluorescence emission on the molecular recognition element 101 was observed using an inverted fluorescence microscope equipped with a filter set suitable for rhodamine B, strong fluorescence was confirmed.
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On the other hand, as a comparative example, a similar device was used using a device in which DNA was immobilized on a smooth silicon surface having the same apparent area and no three-dimensional columnar structure formed thereon in the same manner as in Example 4. When a sensor was prepared and the same measurement was performed, only weak fluorescence was observed.
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From the above results, in this example, it was confirmed that the use of the molecular recognition element enabled the production of a biosensor capable of performing highly sensitive detection even when the amount of the measurement solution was small.
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【The invention's effect】
As described above, according to the present invention, a porous film having an ultrafine structure is formed, and a three-dimensional columnar structure having an ultrafine space is formed from the porous film to fix a molecular recognition material. By using as a base material, it becomes possible to fix or carry the molecular recognition material at a high concentration, and to manufacture a molecular recognition element capable of smoothly performing contact and recognition between the molecular recognition material and a specific substance. In addition, by using the molecular recognition element, it is possible to provide a biosensor that can perform measurement with high sensitivity and high accuracy even for a small amount of a measurement solution and that can shorten the measurement time.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram illustrating a structure of a three-dimensional columnar structure according to an embodiment of the present invention.
FIG. 2 is a schematic diagram showing a structure of a film on which a columnar substance is formed according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3 is a schematic diagram illustrating a structure of a porous film according to an embodiment of the present invention.
FIG. 4 is a schematic cross-sectional view showing a step of manufacturing the molecular recognition element according to the embodiment of the present invention.
FIG. 5 is a schematic diagram illustrating immobilization of the molecular recognition material of Example 2 on a three-dimensional columnar structure.
FIG. 6 is a schematic diagram showing a cross section of a biosensor of Example 5.
FIG. 7 is a schematic diagram showing a cross section of a biosensor of Example 6.
FIG. 8 is a schematic diagram showing a cross section of the biosensor of Example 7.
FIG. 9 is a schematic diagram showing measurement results using the biosensor of Example 7.
FIG. 10 is a schematic diagram showing a cross section of a biosensor of Example 8.
[Explanation of symbols]
11 Three-dimensional columnar structure
12 Substrate
21 Substrate
22 Pillar substances
23 Other component matrix
31 substrate
32 pores
33 Porous membrane
41 substrate
42 Pillar material
43 Matrix of other components
44 pores
45 Porous membrane
46 three-dimensional columnar structure forming material 47 three-dimensional columnar structure
48 Molecular Recognition Material
49 Molecular recognition element
51 Gold three-dimensional columnar structure
52 Mercaptoalkylcarboxylic acid
53 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
54 sodium N-hydroxysulfofosuccinimide
55 Glucose oxidase
601 Measurement solution
602 spacer
603 Second substrate
604 molecular recognition element
605 Measurement solution introduction tube
606 substrate
607 Working electrode
608 Reference electrode
609 Counter electrode
610 Measurement solution discharge pipe
611 Space for solution
612 insulating film
701 Measurement solution
702 spacer
703 Second substrate
704 Molecular recognition element electrode
705 Measurement solution introduction tube
706 substrate
707 Underlying conductive thin film
708 Reference pole
709 Counter electrode
710 Measurement solution discharge pipe
711 Space for solution
712 insulating film
81 Molecular recognition device
82 electrodes
83 crystal unit
84 oscillator
85 Oscillation frequency measuring instrument
101 Molecular recognition device
102 substrate
103 Liquid Retainer
104 Second substrate
105 Spacer
106 Measurement solution
107 Measurement solution introduction tube
108 Measurement solution discharge pipe
