JP2004154135A - Knockout non-human animal - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ノックアウト非ヒト動物等に関する。さらに詳しくは、本発明は、ノックアウト非ヒト動物の個体又はその子孫動物或いはそれらの一部であって、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失するように破壊されてなることを特徴とする非ヒト動物又はその一部、当該非ヒト動物又はその一部の作成に不可欠なＥＳ細胞等の分化全能性細胞、及びそれらの利用等に関するものである。本発明は、糖脂質代謝機能異常を伴う疾患等に対する医薬品開発等の分野において有用である。 The present invention relates to knockout non-human animals and the like. More specifically, the present invention relates to a knockout non-human animal or a progeny thereof, or a part thereof, wherein the genomic gene of a fat accumulation-promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more is all or one or more in a diploid. A non-human animal, wherein the allele is replaced by a mutant gene having a loss of function or all or one allele in a diploid of the genomic gene is destroyed so as to lose its function; or The present invention relates to a part thereof, totipotent cells such as ES cells and the like which are indispensable for producing the non-human animal or a part thereof, and uses thereof. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful in fields such as drug development for diseases associated with glycolipid metabolic dysfunction.
同じ特許出願人は、特開２０００−３５６６３７号公報の明細書において分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質、特に配列番号1で示されるアミノ酸配列からなり、かつ脂肪蓄積促進活性を有する蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ等を開示した。当該開示は、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質、特に配列番号1で示されるアミノ酸配列からなり、かつ脂肪蓄積促進活性を有する蛋白質、を用いた脂肪細胞における蓄積脂肪量の分析方法等に関しており、当該脂肪蓄積促進蛋白質の利用や分子レベルでの解析等を容易にするものである（特許文献１及び２を参照）。しかしながら、哺乳類の個体レベルにおける当該脂肪蓄積促進蛋白質の利用や生理学的意義を詳細に解析できるような実験動物は十分に確立されているとは必ずしも言えない。
さらに詳しくは、これまでに分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質、特に配列番号1で示されるアミノ酸配列からなり、かつ脂肪蓄積促進活性を有する蛋白質の血液中濃度が、腹部横断面の腹腔内脂肪組織面積値と正の相関関係にあり、当該脂肪蓄積促進蛋白質の濃度から腹腔内脂肪組織量を求めることができることが見出されている。分子レベル・細胞レベル等での実験から当該脂肪蓄積促進蛋白質は内臓脂肪（蓄積）症候群に関わる因子のひとつであると考えられている。
哺乳類の個体レベルにおける他の脂肪蓄積促進蛋白質の利用や生理学的意義を詳細に解析できるような実験動物としては、DGAT遺伝子破壊マウスや11β-HSD１遺伝子破壊マウス等が知られており、これらの実験動物では、まず、遺伝子改変をおこなう動物のＥＳ細胞等の分化全能性細胞の染色体上の目的とする遺伝子をポジネガ法（例えば、染色体上の目的遺伝子の一部が選択マーカー遺伝子のプロモーター領域を有するターゲティングベクター（選択マーカー遺伝子プロモーター含有組換えベクター）を用いて、染色体上の目的遺伝子の一部をターゲティングベクターに置き換える相同的組換え法）等の特定な方法により破壊し、これを親動物の胚盤胞に混入させた後、胚分化を継続させて出産させた仔であるキメラ原始マウスを作出することにより、生体内における当該脂肪蓄積促進蛋白質の濃度を低下又は消失させることに成功している。
一方、PEPCK(phosphoenolpyruvae carboxykinase)、G6P（G6Pase；glucose-6-phosphatase)、UCP1（uncoupling protein 1）、FAS（fatty acid synthase）及びACO（acylCoA oxidase）は、いずれも糖脂質代謝に関連する蛋白質として公知である（以下本明細書ではまとめて糖脂質代謝関連因子と称する場合がある。）。
具体的には、PEPCK(phosphoenolpyruvae carboxykinase)及びG6P（G6Pase；glucose-6-phosphatase)は、肝臓細胞においてピルビン酸からグルコースを産生する糖新生の２段階の反応をそれぞれ触媒する酵素であることが知られている。UCP1（uncoupling protein 1）は、遊離脂肪酸からのATP産生を促進する蛋白質であることが知られている。FAS（fatty acid synthase）は、脂肪酸生合成であることが知られている。ACO（acylCoA oxidase）は、脂肪酸代謝酵素であることが知られている。
しかしながら、糖脂質代謝又はこれらの糖脂質代謝関連因子と、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質との関係は知られていなかった。
More specifically, the blood concentration of a fat accumulation-promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more, particularly a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a fat accumulation-promoting activity, is determined in the abdominal cavity of the abdominal cross section It has been found that there is a positive correlation with the internal fat tissue area value, and that the amount of adipose tissue in the abdominal cavity can be determined from the concentration of the fat accumulation promoting protein. From experiments at the molecular level, the cellular level, and the like, it is considered that the fat accumulation promoting protein is one of the factors related to the visceral fat (accumulation) syndrome.
DGAT gene-disrupted mice and 11β-HSD1 gene-disrupted mice are known as experimental animals capable of analyzing in detail the utilization and physiological significance of other fat accumulation-promoting proteins at the mammalian individual level. In an animal, first, a target gene on the chromosome of a totipotent cell such as an ES cell of an animal to be genetically modified is subjected to a positive-negative method (for example, a part of the target gene on the chromosome has a promoter region of a selectable marker gene). Using a targeting vector (recombinant vector containing a selectable marker gene promoter), it is disrupted by a specific method such as a homologous recombination method in which part of the target gene on the chromosome is replaced with the targeting vector, and this is disrupted into the embryo of the parent animal Creation of chimeric primitive mice, which are pups born after blastocyst contamination and continued embryo differentiation More it has succeeded in reducing or eliminating the concentration of the fat accumulation promoting protein in vivo.
On the other hand, PEPCK (phosphoenolpyruvae carboxykinase), G6P (G6Pase; glucose-6-phosphatase), UCP1 (uncoupling protein 1), FAS (fatty acid synthase) and ACO (acylCoA oxidase) are all proteins related to glycolipid metabolism. It is known (hereinafter, may be collectively referred to as glycolipid metabolism-related factor in the present specification).
Specifically, it is known that PEPCK (phosphoenolpyruvae carboxykinase) and G6P (G6Pase; glucose-6-phosphatase) are enzymes that respectively catalyze the two-stage reaction of gluconeogenesis that produces glucose from pyruvate in liver cells. Have been. UCP1 (uncoupling protein 1) is known to be a protein that promotes ATP production from free fatty acids. FAS (fatty acid synthase) is known to be a fatty acid biosynthesis. ACO (acylCoA oxidase) is known to be a fatty acid metabolizing enzyme.
However, the relationship between glycolipid metabolism or these glycolipid metabolism-related factors and fat accumulation promoting proteins having a molecular weight of about 6,000 or more was not known.
このような状況下、個体レベルでの当該脂肪蓄積促進蛋白質の詳細な機能解析（即ち、ノックアウト非ヒト動物と野生型非ヒト動物とを比較することによって、当該脂肪蓄積促進蛋白質が哺乳動物に及ぼす生理作用に関する詳細な解析等）は特に重要なものになりつつある。そこで、当該脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子を相同的組換え法によって一部又は全て破壊し、当該脂肪蓄積促進蛋白質の血中レベル及び／又は発現レベル自体を変化させた、あるいは、当該脂肪蓄積促進蛋白質を消失させたノックアウト非ヒト動物の作出を試みた。
本発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、上記のようなノックアウト非ヒト動物を提供すること、及び、当該ノックアウト非ヒト動物を簡便かつ迅速に作出するための、当該脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子の一部又は全ての破壊を目的とした相同的組換え方法の開発等を課題としている。
Under such circumstances, a detailed functional analysis of the fat accumulation promoting protein at the individual level (that is, by comparing a knockout non-human animal with a wild-type non-human animal, the fat accumulation promoting protein exerts an effect on the mammal. Detailed analysis of physiological effects, etc.) is becoming particularly important. Therefore, a part or all of the genomic gene of the fat accumulation promoting protein is disrupted by homologous recombination to change the blood level and / or expression level of the fat accumulation promoting protein itself, or An attempt was made to produce a knockout non-human animal in which the protein was lost.
The present invention has been made in view of the circumstances described above, and provides a knockout non-human animal as described above, and a method for easily and quickly producing the knockout non-human animal. It is an object of the present invention to develop a homologous recombination method for disrupting a part or all of a genomic gene of a fat accumulation promoting protein.
本発明者らは、かかる状況のもと鋭意検討した結果、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子改変においては、当該ゲノム遺伝子改変をおこなう動物のＥＳ細胞等の分化全能性細胞の染色体上の目的とする遺伝子をプロモータトラップ法（例えば、選択マーカー遺伝子のプロモーター領域を取り除いたターゲティングベクター（選択マーカー遺伝子プロモーターレス組換えベクター））を用いて、染色体上の目的遺伝子の一部をターゲティングベクターに置き換える相同的組換え法）により破壊し、これを親動物の胚盤胞に混入させた後、胚分化を継続させて出産させた仔であるキメラ原始マウスを作出することが可能になり効果的であることを見出した。
更に、前記キメラ原始マウスを繁殖させて作出した子孫（以下本明細書において、前記キメラ原始マウス及びその子孫を本発明ノックアウトマウスと称する場合がある。）を用いて鋭意検討した結果、本発明ノックアウトマウスでは、野生型マウスに比べて空腹時の血糖値が上昇しており、さらに耐糖能低下が見られている、すなわちインシュリン感受性が低下することがわかった。また、本発明ノックアウトマウスでは、高脂肪・高蔗糖食摂取時の肝臓におけるトリグリセライド量も有意に増加することから、本動物は糖脂質代謝制御異常に類した病態を表すモデルマウスとなり得ることを見出した。
更に、本発明ノックアウトマウス由来組織を用いて、糖脂質代謝関連因子：PEPCK遺伝子、G6P遺伝子、UCP１遺伝子、FAS遺伝子又はACO遺伝子などの発現について種々検討した結果、（１）肝臓細胞において糖新生を促進する酵素であるPEPCK及びG6Pの発現が上昇し；（２）脂肪（褐色または白色）細胞においてエネルギー（ATP）産生を亢進するUCP1の発現及び脂肪酸生合成酵素であるFAS、さらに脂肪酸代謝酵素であるACOの発現が上昇したことから、糖脂質代謝において重要な働きを担っている肝臓細胞や脂肪細胞において、本発明の分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質がこれらの糖脂質代謝関連因子の発現制御に関わる作用を有することがわかった。従って、これらの遺伝子の発現は、本発明のノックアウト非ヒト動物又はその一部をモデル動物として用いた場合に、糖脂質代謝制御能力を有する物質をスクリーニングするために有用な指標となることを見出した。
本発明は上記の知見を元に完成するに至ったものである。
即ち、本発明は、
〔１〕 ノックアウト非ヒト動物の個体又はその子孫動物或いはそれらの一部であって、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失するように破壊されてなることを特徴とする非ヒト動物又はその一部；
〔２〕 分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質が、下記のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつ脂肪蓄積促進活性を有する蛋白質であることを特徴とする〔１〕記載の非ヒト動物又はその一部；
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号1で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号1で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号1で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸が欠失してなる部分アミノ酸配列、
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されてなるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号1で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列における第１番目のヌクレオチドから第１４７６番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号２で示される塩基配列における第１番目のヌクレオチドから第１４７６番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号２で示される塩基配列における第１番目のヌクレオチドから第１４７６番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｉ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列；
〔３〕 配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失するように破壊されてなることを特徴とするノックアウト非ヒト動物の個体又はその子孫動物或いはそれらの一部；
〔４〕 配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のゲノム遺伝子が、配列番号２で示される塩基配列上の塩基番号５７及び５８の間（エクソン１と２の間）、塩基番号２３２及び２３３の間（エクソン２と３の間）、塩基番号３１８及び３１９の間（エクソン３と４の間）、塩基番号４４７及び４４８の間（エクソン４と５の間）、塩基番号５０６及び５０７の間（エクソン５と６の間）に対応する箇所にイントロンを含有するものであることを特徴とする〔３〕記載の非ヒト動物又はその一部；
〔５〕 配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のゲノム遺伝子が、当該遺伝子の構造蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡの置換、欠失及び／又は付加によって破壊されてなることを特徴とする〔３〕記載の非ヒト動物又はその一部；
〔６〕 構造蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡがエクソン３及び４領域内の塩基であって、当該塩基が欠失によって破壊されてなることを特徴とする〔５〕記載の非ヒト動物又はその一部；
〔７〕 分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子がその機能欠失型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子がその機能を欠失するように破壊される方法が、プロモーター領域が取り除かれている選択マーカー遺伝子を有する遺伝子カセットを含有し、かつ、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子のＤＮＡの一部に相同な塩基配列を有する選択マーカー遺伝子プロモーターレス組換えベクターを用いて、当該ベクターの一部又は全部でありかつ前記遺伝子カセットを含有するＤＮＡに、前記ゲノム遺伝子の構造蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡが置換されてなる方法であることを特徴とする〔１〕記載の非ヒト動物又はその一部；
〔８〕 遺伝子カセットが、マウスEN2由来のSA(splicing accepter)、 encephalomyocarditis Virus由来のIRES(internal ribosome entry site)、β-galactocidase及びneomycin耐性遺伝子を融合させてなるβgeoにSV40由来のpA(polyadenylation signal)を平滑末端化処理してなるＤＮＡ（SA−IRIS−βgeo−pA遺伝子カセット）であることを特徴とする〔７〕記載の非ヒト動物又はその一部；
〔９〕 構造蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡがエクソン３及び４領域内の塩基であることを特徴とする〔７〕又は〔８〕記載の非ヒト動物又はその一部；
〔１０〕 ノックアウト非ヒト動物の個体又はその子孫動物或いはそれらの一部であって、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質遺伝子の発現量が同種の野生型非ヒト動物での同遺伝子の発現量よりも低減されてなることを特徴とする非ヒト動物又はその一部；
〔１１〕 分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質が、下記のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつ脂肪蓄積促進活性を有する蛋白質であることを特徴とする〔１０〕記載の非ヒト動物又はその一部；
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号1で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号1で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号1で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸が欠失してなる部分アミノ酸配列、
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されてなるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号1で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列における第１番目のヌクレオチドから第１４７６番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号２で示される塩基配列における第１番目のヌクレオチドから第１４７６番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号２で示される塩基配列における第１番目のヌクレオチドから第１４７６番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｉ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列；
〔１２〕 以下の（ａ）〜（ｅ）の群より選択される１又は複数の性質を表現することを特徴とする〔１〕〜〔１１〕のいずれか記載の非ヒト動物又はその一部；
（ａ）通常飼育もしくは高カロリー食餌での飼育により野生型非ヒト動物と比較して高血糖値を示す
（ｂ）標準食又は高カロリー食餌での飼育により、野生型非ヒト動物と比較して、耐糖能が低下する
（ｃ）高カロリー食餌での飼育により野生型非ヒト動物と比較して高血中コレステロール量を示す
（ｄ）高カロリー食餌での飼育により野生型非ヒト動物と比較して肝臓において高トリグリセライド量を示す
（ｅ）野生型非ヒト動物と比較して、糖脂質代謝関連因子の発現量が変動する
〔１３〕 非ヒト動物がマウスであることを特徴とする〔１〕〜〔１２〕のいずれか記載の非ヒト動物又はその一部；
〔１４〕 非ヒト動物の個体又はその子孫動物或いはそれらの一部における非ヒト動物の一部が、非ヒト動物由来の組織又は細胞であることを特徴とする〔１〕〜〔１３〕のいずれか記載の非ヒト動物又はその一部；
〔１５〕 分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失型変異遺伝子に置換されか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失するように破壊されてなることを特徴とする分化全能性細胞；
〔１６〕 配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のゲノム遺伝子がその機能欠失型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子がその機能を欠失するように破壊されてなることを特徴とする〔１５〕記載の分化全能性細胞；
〔１７〕 〔１〕〜〔１４〕記載の非ヒト動物からなる、糖脂質代謝機能異常を伴う疾患のモデル動物；
〔１８〕 〔１〕〜〔１４〕に記載の非ヒト動物又はその一部について、胎生期から致死までの期間における、発育分化、発達、生活行動の観察、病理組織学的検査又は生化学的検査を行うことを特徴とする、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質が関与する疾患の病態解析方法；
〔１９〕 分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質が関与する疾患が糖脂質代謝機能異常を伴う疾患である、〔１８〕に記載の病態解析方法；
〔２０〕 糖脂質代謝制御能力の評価方法であって、
（１）請求項１〜１４のいずれか記載の非ヒト動物又はその一部に被験物質を接触させる第一工程、
（２）前記被験物質を接触させた非ヒト動物又はその一部における分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の発現量又は当該量に相関関係を有する指標値を測定し、対照と比較する第二工程、
（３）（２）の比較結果に基づき、被験物質の糖脂質代謝制御能力を評価する第三工程
を有することを特徴とする評価方法；
〔２１〕 糖脂質代謝制御能力がコレステロール産生制御能力である、〔２０〕に記載の評価方法；
〔２２〕 糖脂質代謝制御能力が脂肪酸合成及び／又は脂肪酸代謝制御能力である、〔２０〕に記載の評価方法；
〔２３〕 糖脂質代謝制御能力が糖代謝制御能力である、〔２０〕に記載の評価方法；
〔２４〕 糖脂質代謝制御能力が糖脂質代謝関連因子発現制御能力である、〔２０〕に記載の評価方法；
〔２５〕 糖脂質代謝関連因子がPEPCK、G６P、UCP1、FAS及びACOからなる群より選択される１又は複数の因子である、〔２４〕記載の評価方法；
〔２６〕 分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の発現量に相関関係を有する指標値が、糖脂質代謝関連因子の発現量である、〔２０〕〜〔２５〕のいずれか記載の評価方法；
〔２７〕 糖脂質代謝関連因子がPEPCK、G６P、UCP1、FAS及びACOからなる群より選択される１又は複数の因子である、〔２６〕に記載の評価方法；
〔２８〕 分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の発現量に相関関係を有する指標値が血糖値である、〔２０〕〜〔２５〕のいずれか記載の評価方法；
〔２９〕 分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の発現量に相関関係を有する指標値が耐糖能である、〔２０〕〜〔２５〕のいずれか記載の評価方法；
〔３０〕 分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の発現量に相関関係を有する指標値が、血中コレステロール量である、〔２０〕〜〔２５〕のいずれか記載の評価方法；
〔３１〕 分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の発現量に相関関係を有する指標値が、トリグリセライド（中性脂肪）量である、〔２０〕〜〔２５〕のいずれか記載の評価方法；
〔３２〕 〔２０〕〜〔３１〕のいずれか記載の評価方法により評価された糖脂質代謝制御能力に基づき、糖脂質代謝制御能力を有する被験物質を選抜することを特徴とする糖脂質代謝制御物質のスクリーニング方法；
〔３３〕 〔３２〕に記載のスクリーニング方法により得られる糖脂質代謝機能異常を伴う疾患の治療剤又は予防剤；
〔３４〕 糖脂質代謝機能異常を伴う疾患が、耐糖能低下、糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞又は心血管障害である〔３３〕記載の治療剤又は予防剤；
〔３５〕 〔１〕〜〔１４〕のいずれか記載の非ヒト動物又はその一部、或いは、〔１５〕又は〔１６〕記載の分化全能性細胞を作成するための、プロモーター領域が取り除かれている選択マーカー遺伝子を有するＤＮＡ（遺伝子カセット）を含有し、かつ、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子のＤＮＡの一部に相同な塩基配列を有する選択マーカー遺伝子プロモーターレス組換えベクター；
〔３６〕 〔１〕〜〔１４〕のいずれか記載の非ヒト動物又はその一部、或いは、〔１５〕又は〔１６〕記載の分化全能性細胞を作成するための、マウスEN2由来のSA(splicing accepter)、 encephalomyocarditis Virus由来のIRES(internal ribosome entry site)、β-galactocidase及びneomycin耐性遺伝子を融合させてなるβgeoにSV40由来のpA(polyadenylation signal)を平滑末端化処理してなるＤＮＡ（SA−IRIS−βgeo−pA遺伝子カセット）を含有し、かつ、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子のＤＮＡの一部に相同な塩基配列を有する選択マーカー遺伝子プロモーターレス組換えベクター；
等を提供するものである。
The present inventors have conducted intensive studies under such circumstances, and as a result, in the genomic gene modification of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more, totipotent cells such as ES cells of an animal performing the genomic gene modification. Using a promoter trap method (for example, a targeting vector (selective marker gene promoterless recombination vector) from which the promoter region of the selectable marker gene has been removed), a part of the target gene on the chromosome Homozygous recombination method that replaces the targeting vector), and then injects it into the blastocyst of the parent animal. It was found to be effective.
Furthermore, as a result of intensive studies using progeny produced by breeding the chimeric primitive mouse (hereinafter, the chimeric primitive mouse and its progeny may be referred to as the knockout mouse of the present invention), the knockout of the present invention was found. In mice, fasting blood glucose levels were higher than in wild-type mice, and glucose tolerance was further reduced, that is, insulin sensitivity was found to decrease. Further, in the knockout mouse of the present invention, the amount of triglyceride in the liver when a high-fat, high-sucrose diet was ingested was also significantly increased, and thus it was found that this animal could be a model mouse showing a pathological condition similar to abnormal glycolipid metabolism control. Was.
Furthermore, as a result of various studies on the expression of glycolipid metabolism-related factors: PEPCK gene, G6P gene, UCP1 gene, FAS gene or ACO gene using the tissue derived from the knockout mouse of the present invention, (1) gluconeogenesis in liver cells (2) expression of UCP1, which promotes energy (ATP) production in fat (brown or white) cells, and FAS, which is a fatty acid biosynthetic enzyme; Since the expression of a certain ACO increased, the fat accumulation promoting protein of the present invention having a molecular weight of about 6,000 or more was found to be associated with these glycolipid metabolism-related factors in liver cells and adipocytes that play an important role in glycolipid metabolism. It was found to have an action related to the regulation of the expression of. Therefore, it has been found that the expression of these genes is a useful index for screening a substance having a glycolipid metabolism controlling ability when the knockout non-human animal of the present invention or a part thereof is used as a model animal. Was.
The present invention has been completed based on the above findings.
That is, the present invention
[1] All or one allele in a diploid of a genomic gene of a fat accumulation-promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more, which is a knockout non-human animal individual or a progeny animal or a part thereof, lacks its function. A non-human animal or a part thereof, wherein the non-human animal is substituted with an aberrant mutant gene or all or one allele in a diploid of the genomic gene is destroyed so as to lose its function;
[2] The non-human animal or the non-human animal according to [1], wherein the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more is a protein having any of the following amino acid sequences and having fat accumulation promoting activity: Part of it;
<Amino acid sequence>
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in which one or more amino acids have been deleted, added or substituted,
(C) a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(D) an amino acid sequence obtained by adding methionine to the amino terminus of the amino acid sequence of (c);
(E) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(F) an amino acid sequence encoded by a DNA having a nucleotide sequence represented by the first nucleotide to the 1476th nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2,
(G) encoded by a DNA having a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with a DNA having a nucleotide sequence represented by
(H) hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence from the first nucleotide to the 1476th nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under stringent conditions Amino acid sequence encoded by DNA (i) Amino acid sequence encoded by DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 2;
[3] All or one allele in the diploid of the genomic gene of the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with the mutant gene with a loss of function, or all in the diploid of the genomic gene Or a knockout nonhuman animal individual or progeny animal or a part thereof, wherein one allele is destroyed so as to lose its function;
[4] The genomic gene of the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is between nucleotides 57 and 58 (between
[5] A genomic gene of a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is destroyed by substitution, deletion and / or addition of at least a part of DNA in the structural protein coding region of the gene. The non-human animal or a part thereof according to [3];
[6] the non-human animal according to [5], wherein at least a part of the DNA in the structural protein coding region is a base in
[7] A method in which a genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more is replaced with a deficient mutant gene or the genomic gene is destroyed so as to lose its function. A promoter-less selectable marker gene containing a gene cassette having a selectable marker gene from which a region has been removed and having a base sequence homologous to a part of the DNA of a genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more. A method in which at least a part of the DNA in the structural protein coding region of the genomic gene is replaced with a DNA containing the gene cassette, which is a part or the whole of the vector, using a recombinant vector. [1] The non-human animal or a part thereof according to [1];
[8] SV40-derived pA (polyadenylation signal) to βgeo obtained by fusing a gene cassette with SA (splicing accepter) derived from mouse EN2, IRES (internal ribosome entry site) derived from encephalomyocarditis virus, β-galactocidase and neomycin resistance gene ) Is a DNA (SA-IRIS-βgeo-pA gene cassette) obtained by blunt-ending the non-human animal or a part thereof according to [7];
[9] the non-human animal or a part thereof according to [7] or [8], wherein at least a portion of the DNA in the structural protein coding region is a base in
[10] a knockout non-human animal or a progeny thereof or a part thereof, wherein the expression level of a fat accumulation promoting protein gene having a molecular weight of about 6,000 or more is the same in a wild-type non-human animal of the same species A non-human animal or a part thereof, wherein the non-human animal is reduced in expression level;
[11] the non-human animal or the non-human animal according to [10], wherein the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more is a protein having any of the following amino acid sequences and having fat accumulation promoting activity: Part of it;
<Amino acid sequence>
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in which one or more amino acids have been deleted, added or substituted,
(C) a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(D) an amino acid sequence obtained by adding methionine to the amino terminus of the amino acid sequence of (c);
(E) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(F) an amino acid sequence encoded by a DNA having a nucleotide sequence represented by the first nucleotide to the 1476th nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2,
(G) encoded by a DNA having a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with a DNA having a nucleotide sequence represented by
(H) hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence from the first nucleotide to the 1476th nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under stringent conditions Amino acid sequence encoded by DNA (i) Amino acid sequence encoded by DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 2;
[12] The non-human animal or a part thereof according to any one of [1] to [11], which expresses one or more properties selected from the following groups (a) to (e): ;
(A) shows higher blood sugar levels compared to wild-type non-human animals when bred on a normal diet or on a high-calorie diet; (b) when bred on a standard diet or on a high-calorie diet, compared to wild-type non-human animals (C) shows high blood cholesterol levels compared to wild-type non-human animals when bred on a high calorie diet; and (d) shows higher blood cholesterol levels when bred on a high-calorie diet compared to wild-type non-human animals. (E) exhibit a high triglyceride level in the liver, and the expression level of the glycolipid metabolism-related factor fluctuates as compared to a wild-type non-human animal [13] The non-human animal is a mouse [1] The non-human animal of any one of to [12] or a part thereof;
[14] Any of [1] to [13], wherein the non-human animal individual or its progeny animal or a part of the non-human animal in the part thereof is a non-human animal-derived tissue or cell. A non-human animal or a part thereof as described above;
[15] All or one allele in a diploid of a genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more is replaced with a mutant gene lacking its function or all or one in a diploid of the genomic gene A totipotent cell characterized in that one allele has been destroyed so as to lose its function;
[16] A genomic gene of a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is replaced with a mutant gene having a loss of function, or the genome gene is disrupted so as to lose its function. [15] The totipotent cell according to [15];
[17] a model animal of a disease associated with glycolipid metabolic dysfunction, comprising the non-human animal according to [1] to [14];
[18] The non-human animal or a part thereof according to [1] to [14], observation of development, differentiation, development, living behavior, histopathological examination or biochemical analysis during the period from embryonic to lethal. A method for analyzing a disease state of a disease associated with a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more, which comprises conducting a test;
[19] the method of [18], wherein the disease associated with a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more is a disease accompanied by abnormal glycolipid metabolism;
[20] A method for evaluating glycolipid metabolism controlling ability,
(1) a first step of bringing the test substance into contact with the non-human animal or a part thereof according to any one of
(2) The expression level of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more in a non-human animal or a part thereof contacted with the test substance or an index value having a correlation with the amount is measured and compared with a control. The second step,
(3) an evaluation method comprising a third step of evaluating the ability of the test substance to control glycolipid metabolism based on the comparison result of (2);
[21] the evaluation method of [20], wherein the glycolipid metabolism controlling ability is cholesterol production controlling ability;
[22] the evaluation method of [20], wherein the glycolipid metabolism controlling ability is fatty acid synthesis and / or fatty acid metabolism controlling ability;
[23] the evaluation method of [20], wherein the glycolipid metabolism control ability is a sugar metabolism control ability;
[24] the evaluation method of [20], wherein the glycolipid metabolism controlling ability is a glycolipid metabolism-related factor expression controlling ability;
[25] the method of [24], wherein the glycolipid metabolism-related factor is one or more factors selected from the group consisting of PEPCK, G6P, UCP1, FAS, and ACO;
[26] The evaluation according to any one of [20] to [25], wherein the index value having a correlation with the expression level of the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more is the expression level of a glycolipid metabolism-related factor. Method;
[27] the evaluation method of [26], wherein the glycolipid metabolism-related factor is one or more factors selected from the group consisting of PEPCK, G6P, UCP1, FAS, and ACO;
[28] the evaluation method of any one of [20] to [25], wherein the index value having a correlation with the expression level of the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more is a blood glucose level;
[29] the evaluation method of any one of [20] to [25], wherein the index value having a correlation with the expression level of the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more is glucose tolerance;
[30] the evaluation method according to any one of [20] to [25], wherein the index value having a correlation with the expression level of the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more is a blood cholesterol level;
[31] The evaluation method according to any one of [20] to [25], wherein the index value having a correlation with the expression level of the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more is a triglyceride (neutral fat) level. ;
[32] A glycolipid metabolism control characterized by selecting a test substance having a glycolipid metabolism control ability based on the glycolipid metabolism control ability evaluated by the evaluation method according to any one of [20] to [31]. Substance screening method;
[33] a therapeutic or prophylactic agent for a disease associated with glycolipid metabolic dysfunction obtained by the screening method according to [32];
[34] The treatment according to [33], wherein the disease associated with glycolipid metabolic dysfunction is impaired glucose tolerance, diabetes, hyperlipidemia, hypertension, arteriosclerosis, coronary artery disease, angina pectoris, myocardial infarction or cardiovascular disorder. Agent or prophylactic agent;
[35] a non-human animal or a part thereof according to any one of [1] to [14], or a promoter region for producing a totipotent cell according to [15] or [16], wherein the promoter region has been removed; Promoterless recombination of a selectable marker gene having a base sequence homologous to a part of DNA of a genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a DNA (gene cassette) having a selectable marker gene and having a molecular weight of about 6,000 or more vector;
[36] A non-human animal or a part thereof according to any one of [1] to [14], or SA derived from mouse EN2 for producing a totipotent cell according to [15] or [16] ( splicing accepter), DNA (SA- A promoter-less recombination vector containing a selectable marker gene having a base sequence homologous to a part of the DNA of a genomic gene of a fat accumulation promoting protein having an IRIS-βgeo-pA gene cassette) and having a molecular weight of about 6,000 or more;
Etc. are provided.
本発明により、ノックアウト非ヒト動物の個体又はその子孫動物或いはそれらの一部であって、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失するように破壊されてなることを特徴とする非ヒト動物又はその一部、当該非ヒト動物又はその一部の作成に不可欠なＥＳ細胞等の分化全能性細胞、及びそれらの利用を提供可能にした。また、耐糖能低下、糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞又は心血管障害等の糖脂質代謝に関連する疾患の治療剤又は予防剤として有用な、糖脂質代謝制御能力を有する物質をスクリーニングする方法を提供することが可能になった。 According to the present invention, all or one allele in a diploid of a genomic gene of a fat accumulation promoting protein, which is an individual of a knockout non-human animal or a progeny animal or a part thereof, and has a molecular weight of about 6,000 or more, has its function. A non-human animal or a part thereof, wherein the non-human animal is replaced by a deletion mutant gene or all or one allele in a diploid of the genomic gene is destroyed so as to lose its function, The present invention has made it possible to provide totipotent cells such as ES cells and the like, which are indispensable for producing the non-human animal or a part thereof, and their use. Further, glucose intolerance, diabetes, hyperlipidemia, hypertension, arteriosclerosis, coronary artery disease, angina, useful as a therapeutic or prophylactic agent for diseases related to glycolipid metabolism such as myocardial infarction or cardiovascular disorders, It has become possible to provide a method for screening a substance having glycolipid metabolism controlling ability.
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明におけるノックアウト非ヒト動物とは、生殖系列細胞を含む、非ヒト動物の生体内の細胞の中に存在するひとつの遺伝子座にあるアリル（対立遺伝子）の全部又は一方がその本来の機能を発揮しないような状態に破壊されている非ヒト動物を意味する。本発明が提供するノックアウト非ヒト動物は、非ヒト動物生体を構成する細胞内の染色体上のひとつの遺伝子座にある分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子の全部又は一方のアリルが活性ある分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質を発現しないように破壊されてなるものである。
本発明における分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子は、上記の定義にしたがって、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するｍＲＮＡに対応する、イントロンを含むことのある非ヒト動物染色体上の領域であり、特定の構造、例えば、特定の塩基配列やイントロン−エクソン構造に限定されるものではない。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The knockout non-human animal in the present invention means that all or one of alleles (alleles) at one locus present in cells in a living body of a non-human animal, including germ-line cells, has its original function. A non-human animal that has been destroyed in a state where it does not exert its effect. The knockout non-human animal provided by the present invention may be all or one allele of a genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more at one locus on a chromosome in a cell constituting a living body of the non-human animal. Are destroyed so as not to express an active fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more.
The genomic gene of the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more in the present invention corresponds to mRNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more according to the above definition. , A region on a chromosome of a non-human animal that may contain an intron, and is not limited to a specific structure, for example, a specific base sequence or an intron-exon structure.
本発明における分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質としては、例えば、（ａ）配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、（ｂ）配列番号1で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪蓄積促進活性を有する蛋白質、（ｃ）配列番号1で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列からなる蛋白質（即ち、配列番号１で示されるアミノ酸配列における第２７番目から第４９１番目までのアミノ酸で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質）、（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質（即ち、配列番号１で示されるアミノ酸配列における第２７番目から第４９１番目までのアミノ酸で示されるアミノ酸配列のアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質）、（ｅ）配列番号1で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪蓄積促進活性を有する蛋白質、（ｆ）配列番号２で示される塩基配列における第１番目のヌクレオチドから第１４７６番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質、（ｇ）配列番号２で示される塩基配列における第１番目のヌクレオチドから第１４７６番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつ脂肪蓄積促進活性を有する蛋白質、（ｈ）配列番号２で示される塩基配列における第１番目のヌクレオチドから第１４７６番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつ脂肪蓄積促進活性を有する蛋白質、（ｉ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質等を挙げることができる。
ここで、前記（ｂ）にある「アミノ酸の欠失、付加もしくは置換」や前記（ｅ）及び（ｇ）にある「８０％以上の配列同一性」には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が細胞内で受けるプロセシング、該蛋白質が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。
前記（ｂ）にある「アミノ酸の欠失、付加もしくは置換」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res.,12,9441-9456(1984)）、変異導入用プライマーを用いたPCR法による方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には1若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、脂肪蓄積促進活性を見出すことのできる範囲であれば良い。
また前記欠失、付加又は置換のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、i)グリシン、アラニン；ii)バリン、イソロイシン、ロイシン；iii)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、iv)セリン、スレオニン；v)リジン、アルギニン、ヒスチジン；vi)フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
本発明において「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
本発明における配列同一性は、８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。
前記（ｈ）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×SSC（１．５M NaCl、０．１５M クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×SSCとする）、50％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、2×SSCで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×SSCで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×SSCで５０℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質は、細胞膜外へ分泌される蛋白質であることが好ましい。また、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質は、分子量約６千以上である腹腔内脂肪蓄積促進蛋白質であることが好ましい。
The fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more in the present invention includes, for example, (a) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (b) one or more proteins in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (C) a protein comprising an amino acid sequence in which the amino acid of SEQ ID NO: 1 has been deleted, added or substituted, and having a fat accumulation promoting activity; (I.e., a protein consisting of the amino acid sequence represented by amino acids 27 to 491 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1), and (d) the amino acid sequence represented by (c). A protein consisting of an amino acid sequence having a methionine added to its amino terminal (ie, a protein represented by SEQ ID NO: 1) (E) a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acids 27 to 491 in the amino acid sequence with methionine added to the amino terminus of the amino acid sequence), (e) 80% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (F) a protein consisting of an amino acid sequence having sequence identity of and having an activity to promote fat accumulation, (f) a nucleotide sequence represented by the first nucleotide to the 1476th nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2; A protein consisting of an amino acid sequence encoded by a DNA having (a) a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides from the first nucleotide to the 1476th nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a sequence of 80% or more; Amino acid sequence encoded by DNA having an identical nucleotide sequence And (h) a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence from the first nucleotide to the 1476th nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2. A protein comprising a DNA and an amino acid sequence encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions and having an activity to promote fat accumulation; (i) an amino acid encoded by a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 Examples of the protein include a sequence.
Here, “deletion, addition or substitution of amino acid” in the above (b) and “80% or more sequence identity” in the above (e) and (g) include, for example, SEQ ID NO: 1. It includes the processing that a protein having an amino acid sequence undergoes in a cell, a mutation naturally occurring due to a species difference, an individual difference, a difference between tissues, and the like of an organism from which the protein is derived, an artificial amino acid mutation, and the like.
As a technique for artificially performing the “deletion, addition or substitution of an amino acid” (hereinafter sometimes also referred to as amino acid modification in general) in the above (b), for example, the amino acid represented by SEQ ID NO: 1 Conventionally, site-directed mutagenesis is performed on the DNA encoding the sequence, and then the DNA is expressed by a conventional method. Examples of the site-directed mutagenesis method include a method using an amber mutation (gapped duplex method, Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984)) and a PCR method using a primer for mutagenesis. Method and the like.
The number of amino acids to be modified as described above is at least one residue, specifically one or several, or more. The number of such modifications may be within a range in which fat accumulation promoting activity can be found.
In addition, among the above-mentioned deletions, additions or substitutions, modifications relating to amino acid substitutions are particularly preferred. The substitution is more preferably an amino acid having similar properties such as hydrophobicity, charge, pK, and steric structure. Such substitutions include, for example, i) glycine, alanine; ii) valine, isoleucine, leucine; iii) aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine, iv) serine, threonine; v) lysine, arginine, histidine; vi) Substitution within the group of phenylalanine, tyrosine.
In the present invention, “sequence identity” refers to sequence identity and homology between two DNAs or two proteins. The “sequence identity” is determined by comparing two optimally aligned sequences over the region of the sequence to be compared. Here, the DNA or protein to be compared may have an addition or a deletion (for example, a gap or the like) in the optimal alignment of the two sequences. For such sequence identity, for example, using Vector NTI, ClustalW algorithm (Nucleic Acid Res., 22 (22): 4673-4680 (1994) to calculate by creating an alignment using The sequence identity can be measured using sequence analysis software, specifically, an analysis tool provided by Vector NTI, GENETYX-MAC or a public database. It is generally available at http://www.ddbj.nig.ac.jp.
The sequence identity in the present invention may be 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more.
Regarding "hybridize under stringent conditions" in the above (h), the hybridization used herein is described, for example, in Sambrook J., Frisch EF, Maniatis T., Molecular Cloning, Second Edition (Molecular Cloning). 2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory press (Cold Spring Harbor Laboratory press) and the like. The “stringent conditions” are, for example, a condition in which a solution containing 6 × SSC (a solution containing 1.5 M NaCl and 0.15 M trisodium citrate is referred to as 10 × SSC) and a solution containing 50% formamide are used. After forming a hybrid at 20 ° C., conditions such as washing with 2 × SSC at 50 ° C. (Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6) may be mentioned. it can. The salt concentration in the washing step can be selected, for example, from the condition of 2 × SSC at 50 ° C. (low stringency condition) to the condition of 0.2 × SSC up to 50 ° C. (high stringency condition). The temperature in the washing step can be selected, for example, from room temperature (low stringency conditions) to 65 ° C. (high stringency conditions). Also, both the salt concentration and the temperature can be varied.
The fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more is preferably a protein secreted out of the cell membrane. The fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more is preferably an intraperitoneal fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more.
本発明における分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子のより詳細な具体例としては、例えば、（I）配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、（II）配列番号1で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸を欠失させた部分アミノ酸配列をコードする塩基配列（即ち、配列番号１で示されるアミノ酸配列における第２７番目から第４９１番目までのアミノ酸で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列）、（III）前記（II）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列、（IV）配列番号２で示される塩基配列における第１番目のヌクレオチドから第１４７６番目までのヌクレオチドで示される塩基配列、（V）配列番号２で示される塩基配列、（VI）配列番号２で示される塩基配列における第７９番目のヌクレオチドから第１４７６番目までのヌクレオチドで示される塩基配列、（VII）前記（VI）の塩基配列において、その5'末端にATGが付加された塩基配列等の塩基配列を有する遺伝子を、含有するものが挙げられる。尚、これらの遺伝子は、通常の遺伝子工学的方法（例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載されている方法）に準じて取得すればよい。
配列番号２で示される塩基配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡの塩基配列であって、５′末端及び３′末端に非翻訳領域の塩基配列を含んでいる。本発明における分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子は、通常、配列番号２の塩基配列を含有し、かつ、この塩基配列がイントロンにより分断された構造、即ち、イントロン−エクソン構造を有している。
イントロン−エクソン構造のより詳細な具体例としては、配列番号２で示される塩基配列上の塩基番号５７及び５８の間（エクソン１と２の間）、塩基番号２３２及び２３３の間（エクソン２と３の間）、塩基番号３１８及び３１９の間（エクソン３と４の間）、塩基番号４４７及び４４８の間（エクソン４と５の間）、塩基番号５０６及び５０７の間（エクソン５と６の間）に対応する箇所にイントロンを含有する構造が挙げられる
More specific examples of the genomic gene of the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more in the present invention include, for example, (I) a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (II) a SEQ ID NO: In the amino acid sequence represented by 1, a base sequence encoding a partial amino acid sequence in which 26 amino acids have been deleted from the amino terminus (that is, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 from the 27th position to the 491th position) (III) a base sequence coding for an amino acid sequence represented by an amino acid, (III) a base sequence coding for an amino acid sequence in which methionine is added to the amino terminal of the amino acid sequence of (II), and (IV) a base sequence coding for SEQ ID NO: 2. A nucleotide sequence represented by nucleotides from the first nucleotide to the 1476th nucleotide in the nucleotide sequence to be represented, (V) SEQ ID NO: 2, (VI) a nucleotide sequence represented by nucleotides from nucleotide 79 to nucleotide 1476 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, (VII) a nucleotide sequence represented by (VI), Those containing a gene having a base sequence such as a base sequence with ATG added to the 5 ′ end are included. In addition, these genes can be prepared by a conventional genetic engineering method (eg, Sambrook J., Frisch EF, Maniatis T., Molecular Cloning 2nd edition, published by Cold Spring Harbor Laboratory). press)).
The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is the nucleotide sequence of cDNA corresponding to mRNA having the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the nucleotide sequence of the untranslated region is located at the 5 'end and 3' end. Contains an array. The genomic gene of the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more in the present invention usually contains the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and a structure in which this nucleotide sequence is separated by introns, that is, an intron-exon structure. have.
More specific examples of the intron-exon structure include, between base numbers 57 and 58 (between
本明細書において、「脂肪蓄積促進活性」とは、脂肪細胞における脂肪蓄積促進活性を表す。ここで用いられる脂肪細胞は哺乳動物の腹腔内脂肪細胞であり、以下の方法で調製できる。すなわち、動物から腹腔内脂肪組織を摘出、細断した後、これをコラゲナーゼ等の組織分解性酵素で消化して細胞懸濁液を調製する。得られた細胞懸濁液をShillabeer G et al., International Journal of Obesity 20, S77-S83等に記載される方法に準じて、遠心分離等により分画し沈殿を回収することにより、前駆脂肪細胞に富む画分を調製する。これをコンフレントになるように培養した後、プロスタグランジンJ2活性を有する分化誘導物質を加え、成熟脂肪細胞へと分化させ、脂肪蓄積促進活性の測定に用いることができる。該成熟脂肪細胞に測定対象の分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質を添加し、数日間培養した後、イソプロパノールでトリグリセライドを抽出して定量し、該蛋白質非存在下でのトリグリセライド量と比較することにより脂肪蓄積促進活性を測定することができる。
具体的には、国際公開パンフレット第０２／１０７７２号中の実施例４もしくは５に記載された方法で測定することができる。すなわち、脂肪蓄積促進活性を有する蛋白質としては脂肪蓄積促進率１１０％以上の蛋白質が挙げられ、好ましくは脂肪蓄積促進率１２０％以上の蛋白質が挙げられる。
As used herein, the term “fat accumulation promoting activity” refers to fat accumulation promoting activity in adipocytes. The adipocytes used here are intraperitoneal adipocytes of mammals and can be prepared by the following method. That is, an abdominal adipose tissue is excised from an animal, cut into small pieces, and digested with a tissue-degrading enzyme such as collagenase to prepare a cell suspension. According to the method described in Shillabeer G et al., International Journal of
Specifically, it can be measured by the method described in Example 4 or 5 in International Publication Pamphlet No. 02/10772. That is, examples of the protein having a fat accumulation promoting activity include a protein having a fat accumulation promoting rate of 110% or more, and preferably a protein having a fat accumulation promoting rate of 120% or more.
本発明における非ヒト動物としては、例えば、非ヒト哺乳動物（例、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、サル等）等が用いられ、なかでもマウス、ラット、モルモット等の齧歯目(Rodentia)の哺乳動物が好ましく、とりわけマウス、ラットが好適である。
本発明における非ヒト動物の一部とは、当該動物由来の組織又は細胞であれば特に制限は無く、例えば、精巣周囲脂肪組織、後腹膜脂肪組織、腸間膜脂肪組織、皮下脂肪組織、褐色脂肪組織等の各種の脂肪組織、さらには心臓、肺、腎臓、胆嚢、肝臓、膵臓、脾臓、腸、精巣（睾丸）、卵巣、子宮、胎盤、筋肉、血管、脳、髄、甲状腺、胸腺、乳腺等の他の組織等の体の一部が挙げられる。また、当該動物由来の血液、リンパ液もしくは尿等の体液も本発明における非ヒト動物の一部に含まれる。
更に、上記組織、臓器又は体液に含まれる細胞を単離・培養して得られる培養細胞（採取した一代目の初代細胞及び該初代細胞を株化した細胞を含む）や抽出物、のみならず胎生期胚における発生段階の各器官、または不随する細胞の培養物およびES細胞についても分化・増殖能の有無に関わらず非ヒト動物の一部に含まれる。
Examples of the non-human animal in the present invention include non-human mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats, sheep, goats, pigs, horses, cows, monkeys, etc.), and the like. Above all, rodent (Rodentia) mammals such as mice, rats, and guinea pigs are preferable, and mice and rats are particularly preferable.
The part of the non-human animal in the present invention is not particularly limited as long as it is a tissue or a cell derived from the animal.For example, peritesticular adipose tissue, retroperitoneal adipose tissue, mesenteric adipose tissue, subcutaneous adipose tissue, brown Various adipose tissues such as adipose tissue, as well as heart, lung, kidney, gall bladder, liver, pancreas, spleen, intestine, testis (testis), ovary, uterus, placenta, muscle, blood vessels, brain, marrow, thyroid, thymus, Part of the body such as other tissues such as the mammary gland. In addition, body fluids such as blood, lymph or urine derived from the animal are also included in the part of the non-human animal in the present invention.
Furthermore, not only cultured cells (including collected primary primary cells and cells in which the primary cells have been established) and extracts obtained by isolating and culturing cells contained in the above tissues, organs or body fluids, but also extracts Cultures of embryonic embryos at various stages of development or associated cells and ES cells are also included in some non-human animals, regardless of their ability to differentiate and proliferate.
本発明の第一の態様は、ノックアウト非ヒト動物の個体、その子孫動物又はそれらの一部に関する。
本発明非ヒト動物は、体細胞染色体の分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失型変異遺伝子に置換されているか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失するように破壊されているヘテロ接合体、又はホモ接合体として提供される。
The first aspect of the present invention relates to a knockout non-human animal individual, a progeny animal thereof, or a part thereof.
The non-human animal of the present invention may have all or one allele in a diploid of a genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of a somatic chromosome of about 6,000 or more, wherein the allele in the diploid has been substituted with a mutant gene having a loss of function, or All or one allele in the diploid of the genomic gene is provided as a heterozygote or homozygote in which the allele has been disrupted to lose its function.
本発明非ヒト動物は、公知の標的遺伝子組換え法（ジーンターゲティング法：例えば、村松正實、山本雅編集、『実験医学別冊 新訂 遺伝子工学ハンドブック 改訂第３版』（１９９９年、羊土社発行）、２３９頁〜２５６頁、Science 244:1288-1292, 1989）等の通常の方法に準じて、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子改変をおこなう非ヒト動物のES（embryonic stem）細胞の染色体上の目的とするゲノム遺伝子（即ち、当該脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子）の二倍体における全部又は一方のアリルを、例えば、選択マーカー遺伝子のプロモーター領域を取り除いたターゲティングベクター（選択マーカー遺伝子プロモーターレス組換えベクター）を用いて、染色体上の目的遺伝子の一部がターゲティングベクターに置き換える相同的組換え法（即ち、プロモータートラップ法）により破壊し、これを親動物の胚盤胞に混入させた後、胚分化を継続させて出産させた仔であるキメラ原始マウスを作出することが効果的である。この方法では、ＥＳ細胞等を分化全能性細胞として使用する。分化全能性細胞としては、マウス（Nature 292:154-156, 1981）、ラット（Dev. Biol. 163(1): 288-292, 1994）、サル（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(17):7844-7848, 1995）、ウサギ（Mol. Reprod. Dev. 45(4):439-443, 1996）についてはＥＳ細胞等が確立している。また、ブタについてはＥＧ（embryonic germ）細胞が確立している（Biol. Reprod 57(5):1089-1095, 1997）。従って本発明非ヒト動物は、これらの動物種を対象に作製することが好ましいが、特にノックアウト動物の作製に関して技術が整っているマウスが最適である。 The non-human animal of the present invention can be prepared by a known target gene recombination method (gene targeting method: for example, Masanori Muramatsu, Masaru Yamamoto, "Experimental Medicine Separate Volume, New Edition, Genetic Engineering Handbook, Third Edition," published by Yodosha in 1999. 239-256, Science 244: 1288-1292, 1989), etc., ES (embryonic) of non-human animals in which the genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more is modified. stem) All or one allele in the diploid of the target genomic gene on the chromosome of the cell (ie, the genomic gene of the fat accumulation promoting protein) is, for example, a targeting vector (for which the promoter region of the selectable marker gene is removed) Replacement of target gene on chromosome with targeting vector Disruption by a homologous recombination method (ie, promoter trapping method), mixing this into a blastocyst of a parent animal, and then continuing embryo differentiation to produce a chimeric primordial mouse that is delivered. Is effective. In this method, ES cells or the like are used as totipotent cells. As totipotent cells, mice (Nature 292: 154-156, 1981), rats (Dev. Biol. 163 (1): 288-292, 1994), monkeys (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 ( 17): 7844-7848, 1995) and rabbits (Mol. Reprod. Dev. 45 (4): 439-443, 1996) have established ES cells and the like. For pigs, EG (embryonic germ) cells have been established (Biol. Reprod 57 (5): 1089-1095, 1997). Therefore, the non-human animal of the present invention is preferably produced using these animal species, but a mouse having a technique for producing a knockout animal is most suitable.
本発明非ヒト動物の作製の具体的手続を以下に説明する。まず、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子のＤＮＡ断片を単離し、そのＤＮＡ断片を試験管内にて遺伝子操作し、当該ゲノム遺伝子がその機能欠失型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子がその機能を欠失するように破壊されるような変異ＤＮＡ断片を作製する。当該ゲノム遺伝子のＤＮＡの単離は、例えば、公知のヒト由来の分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子のcＤＮＡ塩基配列等に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドプローブを用いてマウス等の非ヒト動物ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。また、このcＤＮＡの一部又は両端に相当する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法によっても目的とするゲノム遺伝子のＤＮＡを得ることができる。尚、マウス以外の非ヒト動物を対象とする場合にも、前記のcＤＮＡ塩基配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドをプローブ又はプライマーとする前記の方法により、各種非ヒト動物由来の当該遺伝子のＤＮＡを単離することができる。またさらに前記のｃＤＮＡの塩基配列に基づいて、当該ゲノム遺伝子の構造を詳細に解析し、当該ゲノム遺伝子におけるイントロン−エクソン構造並びに、イントロンの塩基配列を解明する。解明された情報に基づいて、例えば、当該ゲノム遺伝子のＤＮＡ断片を含み、当該遺伝子の構造蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡの塩基配列とは異なるように置換、欠失及び／又は付加によって改変すれば、当該ゲノム遺伝子がその機能欠失型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子がその機能を欠失するように破壊されるような変異ＤＮＡ断片を作製することができる。 The specific procedure for producing the non-human animal of the present invention will be described below. First, a DNA fragment of a genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more is isolated, and the DNA fragment is genetically manipulated in a test tube, whereby the genomic gene is replaced with a mutant gene having a loss of function. Alternatively, a mutant DNA fragment is prepared in which the genomic gene is destroyed so as to lose its function. Isolation of the DNA of the genomic gene is performed, for example, using a known human-derived oligonucleotide probe synthesized based on the cDNA base sequence or the like of the genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more. By screening a non-human animal genomic DNA library. The DNA of the target genomic gene can also be obtained by PCR using a synthetic oligonucleotide corresponding to a part or both ends of the cDNA as a primer. When targeting non-human animals other than mice, the DNA of the gene derived from various non-human animals can be obtained by the above-described method using the oligonucleotide synthesized based on the cDNA base sequence as a probe or primer. Can be isolated. Furthermore, based on the nucleotide sequence of the cDNA, the structure of the genomic gene is analyzed in detail, and the intron-exon structure and the nucleotide sequence of the intron in the genomic gene are clarified. Based on the elucidated information, for example, by substituting, deleting and / or adding a DNA fragment of the genomic gene so as to differ from the base sequence of at least a part of the DNA in the structural protein coding region of the gene, If modified, a mutated DNA fragment can be produced in which the genomic gene is replaced with a mutant gene with a loss of function or the genomic gene is destroyed so as to lose its function.
このようにして単離された分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子のＤＮＡ断片の一部を改変して作製された変異ＤＮＡ断片を用いて、ＥＳ細胞等の分化全能性細胞が有する分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子に変異を導入するためのターゲティングベクターを、公知の方法（例えば、Science 244:1288-1292, 1989）に準じて作製する。ここで「ターゲティングベクター」とは、相同的組換えによって目的の遺伝子を破壊するためのＤＮＡ分子のことであり、ＥＳ細胞等の分化全能性細胞の選択をより容易にするために、選択マーカー遺伝子の塩基配列を通常含んでいる。陽性選択マーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子等を、陰性選択マーカー遺伝子としては単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子等をあげることができる。尚、ターゲティングベクターを構築する際に、ターゲティングベクター構築用として市販されているプラスミドベクターを利用することもできる。
本発明において好ましく用いられるターゲティングベクターを作製する方法としては、例えば、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子の構造蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡ［尚、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質が配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質である場合には、当該ゲノム遺伝子の構造蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡがエクソン３及び４領域内の塩基（ここで「エクソン３及び４領域内の塩基」とは、例えば、エクソン３及び４領域内の全塩基であってもよいし、エクソン３及び４領域内の一部の塩基であってもよい。）であることが好ましく、エクソン３領域内の全塩基及びエクソン４領域内の一部の塩基であることがより好ましく、エクソン３及び４領域内の全塩基であることが特に好ましい。但し、ここでのエクソン選択において、エクソン３の先頭からの領域の塩基数が２＋３ｎ（ｎはエクソン３の先頭からの領域のアミノ酸数）になる場合には、エクソン２から後に続く翻訳フレームが分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子の構造蛋白質コード領域の下流遺伝子と一致してしまい、下流領域を融合した蛋白質が産生される恐れがあるので好ましくない。］を、プロモーター領域が取り除かれている選択マーカー遺伝子を有する遺伝子カセット（より具体的には、マウスEN2由来のSA(splicing accepter)、 encephalomyocarditis Virus由来のIRES(internal ribosome entry site)、β-galactocidase及びneomycin耐性遺伝子を融合させてなるβgeoにSV40由来のpA(polyadenylation signal)（Mountford P.,et al.,PNAS 91 :4303-4307,1994）を平滑末端化処理してなるＤＮＡ等）を含有し、かつ、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子のＤＮＡの一部に相同な塩基配列を有する選択マーカー遺伝子プロモーターレス組換えベクターを用いて、当該ベクターの一部又は全部でありかつ前記遺伝子カセットを含有するＤＮＡに置換することにより、又は、当該ベクターの一部又は全部でありかつ前記遺伝子カセットを含有するＤＮＡを前記ゲノム遺伝子の構造蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡに挿入することにより、プロモーター領域が取り除かれている選択マーカー遺伝子を有する遺伝子カセットを含有し、かつ、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子のＤＮＡの一部に相同な塩基配列を前記遺伝子カセットの両端に有するような選択マーカー遺伝子プロモーターレス組換えベクターを作製する方法をあげることができる。この場合、上記のように置換又は挿入される前のＤＮＡ断片が予め組み込まれたターゲティングベクター構築用プラスミドベクターに対して、当該置換又は挿入を実施してもよいし、また上記のように置換又は挿入されてなるＤＮＡ断片をターゲティングベクター構築用プラスミドベクターに組み込んでもよい。
勿論、前記遺伝子カセットは、プロモーター領域が取り除かれた選択マーカー遺伝子の前後領域にゲノム遺伝子のＤＮＡの塩基配列に対して相同な塩基配列の一部を有していてもよい。
ここで「相同な塩基配列」とは、比較対象のＤＮＡの塩基配列に対して同一性又は相同性を有する塩基配列であって、相同的組換え法を実施する際にトラブルを生じないものであれば特に制限されるものではないが、例えば、３塩基以上連続して異ならない９０％以上の配列同一性を有する塩基配列、好ましくは、比較対象のＤＮＡの塩基配列に対して９５％以上の配列同一性を有する塩基配列、より好ましくは１００％の配列同一性を有する塩基配列があげられる。
Using the thus isolated mutant DNA fragment prepared by modifying a part of the DNA fragment of the genomic gene of fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more, totipotent cells such as ES cells A targeting vector for introducing a mutation into a genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more is prepared according to a known method (for example, Science 244: 1288-1292, 1989). Here, the term "targeting vector" refers to a DNA molecule for destroying a target gene by homologous recombination. In order to facilitate selection of totipotent cells such as ES cells, a selection marker gene is used. Usually contains the base sequence of Examples of the positive selection marker gene include a neomycin resistance gene, a β-galactosidase gene and the like, and examples of the negative selection marker gene include a herpes simplex virus thymidine kinase gene and a diphtheria toxin A fragment gene. In constructing the targeting vector, a plasmid vector that is commercially available for constructing the targeting vector can also be used.
As a method for preparing a targeting vector preferably used in the present invention, for example, at least a part of DNA in the structural protein coding region of a genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more [here, a molecular weight of about 6,000 When the fat accumulation promoting protein described above is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, at least a part of the DNA in the structural protein coding region of the genomic gene has bases in the
Of course, the gene cassette may have a part of the base sequence homologous to the base sequence of the DNA of the genomic gene in the region before and after the selectable marker gene from which the promoter region has been removed.
Here, the term "homologous nucleotide sequence" refers to a nucleotide sequence having identity or homology to the nucleotide sequence of the DNA to be compared, which does not cause trouble when performing the homologous recombination method. Although there is no particular limitation as long as it is not limited, for example, a base sequence having a sequence identity of 90% or more that does not differ continuously by 3 bases or more, preferably 95% or more with respect to the base sequence of the DNA to be compared A base sequence having sequence identity, more preferably a base sequence having 100% sequence identity, can be mentioned.
上記ターゲティングベクターでは、プロモーター領域が取り除かれている選択マーカー遺伝子（例えば、Ｇ４１８等の細胞毒に対する耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）を有する遺伝子カセットを含有し、かつ、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子のＤＮＡの一部に相同な塩基配列を有することが重要であって、それ以外の要素は相同的組換え法を実施する際にトラブルを生じないものであれば特に制限されるものではない。尚、本願では、このようなターゲティングベクターを、前述及び後述のように、選択マーカー遺伝子プロモーターレス組換えベクターと記すこともある。 The targeting vector contains a gene cassette having a selectable marker gene from which the promoter region has been removed (for example, a gene resistant to cytotoxicity such as G418, for example, a neomycin resistance gene), and has a molecular weight of about 6,000 or more. It is important to have a base sequence homologous to a part of the DNA of the genomic gene of the fat accumulation promoting protein, and the other elements are not particularly limited as long as they do not cause trouble when performing the homologous recombination method. There is no restriction. In the present application, such a targeting vector may be referred to as a selectable marker gene promoterless recombinant vector as described above and below.
次に、上記ターゲティングベクターを、公知の方法に準じてマウス等の非ヒト動物由来のＥＳ細胞等の分化全能性細胞に導入する。このような遺伝子導入法としては、公知の電気パルス法、リポソーム法、リン酸カルシウム法等をあげることができるが、導入遺伝子の相同的組換えの効率を勘案した場合には、ＥＳ細胞等の分化全能性細胞への電気パルス法が好ましい。 Next, the targeting vector is introduced into a totipotent cell such as an ES cell derived from a non-human animal such as a mouse according to a known method. Examples of such a gene transfer method include a known electric pulse method, a liposome method, a calcium phosphate method, and the like. In consideration of the efficiency of homologous recombination of a transgene, the differentiation potential of ES cells and the like is considered. The electric pulse method for sexual cells is preferred.
このようにして遺伝子導入されたＥＳ細胞等の分化全能性細胞のＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡをサザンブロット分析やPCR分析等により、染色体上に存在する分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の野生型ゲノム遺伝子（具体的には、当該ゲノム遺伝子の構造蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡ）と、上記ターゲティングベクターのＤＮＡの一部でありかつ前記遺伝子カセットを含有するＤＮＡの間で正しく相同的組換えが起こり、染色体上の分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の野生型ゲノム遺伝子に当該変異が移った細胞を選択する。選択されたＥＳ細胞と野生型ＥＳ細胞について、ＰＣＲリアルタイム定量（RT-PCR法：Absolute Quantification Real-Time Analysis）などを実施してその結果を比較することによって、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の遺伝子発現量の増減を調べることができる。
因みに、上述のような方法では、ＥＳ細胞等の分化全能性細胞内の染色体に相同的組換えが起こった後、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子のプロモーターを利用でき、かつES細胞内で発現している場合のみ、選択マーカー遺伝子が発現し、細胞毒に対する耐性機能等の選択マーカーとしての性質が付与される。分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子を対象とする場合には、当該方法を用いることにより、目的の位置で相同的組換えが起こって遺伝子破壊されているクローンの出現効率が他のゲノム遺伝子を対象とする場合に比較して飛躍的に高まるためと考えられる。
The DNA of the totipotent cells such as ES cells into which the gene has been introduced in this way is extracted, and the extracted DNA is subjected to Southern blot analysis, PCR analysis, or the like, to detect fat accumulation on the chromosome having a molecular weight of about 6,000 or more. A wild-type genomic gene of the facilitating protein (specifically, at least a part of the DNA in the structural protein coding region of the genomic gene) and a DNA that is part of the DNA of the targeting vector and contains the gene cassette A cell in which the homologous recombination occurs correctly between the cells and the mutation is transferred to the wild-type genomic gene of the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more on the chromosome is selected. By performing PCR real-time quantification (RT-PCR method: Absolute Quantification Real-Time Analysis) on the selected ES cells and wild-type ES cells and comparing the results, fat accumulation having a molecular weight of about 6,000 or more is obtained. It is possible to examine the increase or decrease in the gene expression level of the facilitating protein.
By the way, in the method as described above, after homologous recombination occurs in chromosomes in totipotent cells such as ES cells, the promoter of the genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more can be used. In addition, only when expressed in ES cells, the selectable marker gene is expressed, and properties as a selectable marker such as a cytotoxic resistance function are imparted. When targeting a genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more, by using this method, the appearance efficiency of clones in which homologous recombination has occurred at the target position and the gene has been disrupted can be reduced. This is considered to be due to a dramatic increase as compared with the case of targeting other genomic genes.
このようにして得られた変異型ゲノム遺伝子を持つＥＳ細胞等の分化全能性細胞を慣用のマイクロインジェクション法や凝集法に従って擬妊娠状態にある野生型雌性マウス等の野生型雌性非ヒト動物のブラストシスト（胚盤胞）に注入・混入し、次いでこのキメラ胚を仮親の子宮に移植する。胚分化を継続させると、例えば、非ヒト動物がマウスである場合には約２１日後に、仔である候補キメラ非ヒト動物として出産される。出生した候補キメラ非ヒト動物を里親につけて飼育させた後、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の変異型ゲノム遺伝子が生殖系細胞に入ったキメラ非ヒト動物（F0）を選別する。
選別は毛色の違い（生まれたキメラ非ヒト動物の体毛色）を観察することにより実施すればよい。（この場合には、変異型ゲノム遺伝子が導入された組換えＥＳ細胞等の分化全能性細胞の占める割合の高いキメラ非ヒト動物の選択が容易となり結果として、変異型ゲノム遺伝子が生殖系細胞に入ったキメラ非ヒト動物の獲得効率を高めることができる。）
他の選別は、体の一部（例えば尾部先端）からＤＮＡを抽出し、サザンブロット分析やPCR分析等により実施してもよい。
分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の変異型ゲノム遺伝子が生殖系細胞に入ったキメラ非ヒト動物と同動物種である野生型非ヒト動物の交配により得られる子孫（F1）について、さらに体の一部（例えば尾部先端）からの抽出ＤＮＡを材料とした、サザンブロット分析やPCR分析等を行うことにより、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の変異型ゲノム遺伝子が導入されたヘテロ接合体（二倍体における一方のアリルが破壊された分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子を有する非ヒト動物）を同定する。また、例えば、精巣周囲脂肪組織、後腹膜脂肪組織、腸間膜脂肪組織、皮下脂肪組織、褐色脂肪組織等の各種の脂肪組織、さらには心臓、肺、腎臓、胆嚢、肝臓、膵臓、脾臓、腸、精巣（睾丸）、卵巣、子宮、胎盤、筋肉、血管、脳、髄、甲状腺、胸腺、乳腺等の他の組織一部または胎生期胚からのＲＮＡ抽出物を材料とした、ＰＣＲリアルタイム定量解析又はノザンブロット分析を実施してその結果を比較することによって、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質遺伝子の発現量の増減を調べることができる。さらに、前記体の一部（磨り潰したもの、切片等）又は体液（血液、尿等）を材料としたELAISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)法を実施してその結果を比較することによって、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質量の増減を調べることができる。
作出された分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の変異型ゲノム遺伝子を保有するヘテロ接合体は生殖細胞及び体細胞のすべてに安定的に分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の変異型ゲノム遺伝子を保有しており、交配等により、効率よくその変異を子孫動物に伝達することができる。よってそれらＦ１以降の子孫動物についても同様に、上述のヘテロ接合体同定や遺伝子の発現量又は当該遺伝子の発現産物である蛋白質の量の増減を調べることができる。
尚、一般的には、破壊された遺伝子が胎生期個体の発生や分化に影響して胎生致死を導かない場合には、F1以降の個体ではホモ接合体（二倍体における全部のアリルが破壊された分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子を有する非ヒト動物）・ヘテロ接合体・野生型の遺伝子型がメンデルの法則に則った確率で作出されるが、これに対して、用いた非ヒト動物の胎生期の発生・分化に必須な蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子を破壊した場合には、ヘテロ接合体若しくはホモ接合体の非ヒト動物の生存及び出生は困難となり、胎生致死となる。またこれは、ヘテロ接合体が得られる場合においても、実際の出生率と予測される形質出現の確率とを比較することにより推測することができる。
The blast of a wild-type female non-human animal such as a wild-type female mouse in a pseudopregnancy state according to a conventional microinjection method or agglutination method is performed on the thus obtained totipotent cells such as ES cells having a mutant genomic gene. The cyst (blastocyst) is injected and mixed, and then the chimeric embryo is transplanted into the uterus of a foster mother. When the embryo differentiation is continued, for example, when the non-human animal is a mouse, a baby is delivered as a candidate chimeric non-human animal after about 21 days. After birth, the candidate chimeric non-human animal is reared and reared, and a chimeric non-human animal (F0) in which a mutant genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more has entered germline cells is selected.
The selection may be performed by observing the difference in coat color (body color of the born chimeric non-human animal). (In this case, it becomes easy to select a chimeric non-human animal having a high percentage of totipotent cells such as recombinant ES cells into which the mutant genomic gene has been introduced, and as a result, the mutant genomic gene is transferred to germline cells. The efficiency of obtaining chimeric non-human animals can be increased.)
Another selection may be performed by extracting DNA from a part of the body (for example, the tip of the tail) and performing Southern blot analysis, PCR analysis, or the like.
For a progeny (F1) obtained by crossing a chimeric non-human animal having a mutant genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more into germline cells and a wild-type non-human animal of the same species, A mutant genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more was introduced by performing Southern blot analysis, PCR analysis, or the like using DNA extracted from a part of the body (for example, tail tip) as a material. A heterozygote (a non-human animal having a genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more in which one allele in a diploid has been destroyed) is identified. Further, for example, peritesticular adipose tissue, retroperitoneal adipose tissue, mesenteric adipose tissue, subcutaneous adipose tissue, various adipose tissues such as brown adipose tissue, further heart, lung, kidney, gallbladder, liver, pancreas, spleen, PCR real-time quantification using RNA extract from other tissue parts such as intestine, testis (testis), ovary, uterus, placenta, muscle, blood vessels, brain, marrow, thyroid, thymus, mammary gland or embryo embryo By performing analysis or Northern blot analysis and comparing the results, it is possible to examine the increase or decrease in the expression level of the fat accumulation promoting protein gene having a molecular weight of about 6,000 or more. Further, by performing an ELAISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) method using a part of the body (ground, sliced, etc.) or a body fluid (blood, urine, etc.) as a material and comparing the results, the molecular weight is reduced. It is possible to examine the increase or decrease of the fat accumulation promoting protein amount of 6,000 or more.
The heterozygote having the mutant genomic gene of the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more is stably mutated in all germ cells and somatic cells in the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more. It possesses a genomic gene, and its mutation can be efficiently transmitted to progeny animals by crossing or the like. Therefore, the progeny animals after F1 can be similarly examined for the identification of the above-mentioned heterozygote and the increase or decrease of the expression level of the gene or the amount of the protein which is the expression product of the gene.
In general, when the disrupted gene does not induce embryonic lethality by affecting the development and differentiation of the embryonic individual, homozygotes (all alleles in the diploid are destroyed in individuals after F1) Non-human animals having a genomic gene of fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more), heterozygotes, and wild-type genotypes are created with a probability according to Mendel's law. If the gene consisting of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the protein essential for embryonic development and differentiation of the non-human animal used is disrupted, the survival and birth of the heterozygous or homozygous non-human animal Becomes difficult and the embryo becomes lethal. This can also be estimated by comparing the actual birth rate with the predicted probability of appearance of the trait, even when a heterozygote is obtained.
このようにして作製された非ヒト動物又はその子孫動物（即ち、ノックアウト非ヒト動物の個体又はその子孫動物）において、普通食、高脂肪食、高蔗糖食又はこれらを組み合わせた食餌負荷飼育（例えば本明細書実施例の高脂肪高蔗糖（HH）食等が例示される。）を実施した後、OGTT（糖負荷試験：一定量の糖を負荷した後の血糖値やインスリン値の変動を見る）/ ITT（インスリン負荷試験：一定量のインスリンを負荷した後の血糖値やインスリン値の変動を見る）、各種血液/尿検査（糖や脂肪の代謝パラメータの解析）、各種病理組織分析（各種脂肪組織、肝臓、腎臓、膵臓、筋肉、血管などの重量変化、またこれらの組織切片を染色し、脂肪細胞、肝臓細胞又はランゲルハンスβ細胞の状態のほか、インスリン量やグリコーゲン量などを観察する）等を実施し、本発明のノックアウトマウスと野生型マウスの生理作用の違いを調べた。因みに、OGTT、ITTはともに血糖調節能力（耐糖能）を客観的に評価することができ、インスリン（分泌・代謝）異常や膵臓β細胞機能を評価する際の指標となる代表的な試験である。
その結果、本明細書実施例に示すとおり、本発明のノックアウト非ヒト動物は、野生型非ヒト動物と比べて、空腹時血糖値上昇、及び耐糖能低下を示した。また、高カロリー食餌での飼育により肝臓におけるトリグリセリセライド量や血中コレステロール量が上昇する所見を示した。これらの所見から本発明のノックアウト非ヒト動物は糖脂質代謝系の機能に異常を呈するという特徴を有することがわかった。
上記の結果から、本発明のノックアウト非ヒト動物又はその一部と野生型非ヒト動物又はその一部を比較し、糖脂質代謝機能異常を伴う疾患（耐糖能低下、糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化等の代謝性疾患や、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、心血管障害等の疾患等を含む概念である。）の発症状態の違いを知ることができる。
更に、本発明の非ヒト動物又はその一部の胎生期から致死までの期間における、発育分化、発達、生活行動の観察、病理組織学的検査又は生化学的検査を行うことによって、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質が関与する疾患についても病態解析を行うこともできる。
In the non-human animal or its progeny produced in this manner (ie, a knockout non-human animal or its progeny), a normal diet, a high-fat diet, a high-sucrose diet, or a combination of these diets is fed (for example, After performing a high-fat high-sucrose (HH) diet or the like in the examples of the present specification, the OGTT (sugar tolerance test: change in blood glucose level and insulin level after loading a certain amount of sugar) is observed. ) / ITT (Insulin tolerance test: See changes in blood glucose and insulin levels after loading a certain amount of insulin), various blood / urine tests (analysis of glucose and fat metabolic parameters), various pathological tissue analysis (various Changes in the weight of adipose tissue, liver, kidney, pancreas, muscle, blood vessels, etc., and staining of these tissue sections, as well as the status of fat cells, liver cells or Langerhans β cells, and the amount of insulin and glycogen, etc. Conduct observation to), etc. was examined differences in physiological activity of the wild-type mice and knockout mice of the present invention. By the way, both OGTT and ITT can be used to objectively evaluate blood glucose regulation ability (glucose tolerance) and are representative tests that serve as indicators when evaluating insulin (secretion / metabolism) abnormalities and pancreatic β-cell function. .
As a result, as shown in the Examples of the present specification, the knockout non-human animal of the present invention showed an increase in fasting blood glucose level and a decrease in glucose tolerance as compared with the wild-type non-human animal. In addition, breeding on a high calorie diet showed an increase in triglyceride and blood cholesterol levels in the liver. From these findings, it was found that the knockout non-human animal of the present invention has a feature that the function of the glycolipid metabolic system is abnormal.
From the above results, the knockout non-human animal of the present invention or a part thereof is compared with a wild-type non-human animal or a part thereof, and a disease associated with glycolipid metabolism dysfunction (reduced glucose tolerance, diabetes, hyperlipidemia, This is a concept that includes metabolic diseases such as hypertension and arteriosclerosis, and diseases such as coronary artery disease, angina pectoris, myocardial infarction, and cardiovascular disorders.)
Further, the non-human animal of the present invention or a part thereof is subjected to development, differentiation, development, observation of living behavior, histopathological examination or biochemical examination during the period from the embryonic stage to the lethal period to obtain a molecular weight of about 6%. Pathological analysis can also be performed on diseases involving more than a thousand fat accumulation promoting proteins.
すなわち、本発明の第２の態様は、上記本発明のノックアウト非ヒト動物からなる、糖脂質代謝機能異常を伴う疾患（例えば、耐糖能低下、糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化等の代謝性疾患や、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、心血管障害等の疾患等疾患が挙げられる）のモデル動物に関する。
本発明のノックアウト非ヒト動物は、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の発現量が野生型に比べて有意に低下しており、当該蛋白質が関与する疾患を表現することができる。すなわち前述のとおり、糖脂質代謝機能の異常により、具体的には以下の所見：
（ａ）標準食又は高カロリー食餌での飼育により、野生型非ヒト動物と比較して、空腹時血糖値が上昇する
（ｂ）標準食又は高カロリー食餌での飼育により、野生型非ヒト動物と比較して、耐糖能が低下する
（ｃ）高カロリー食餌での飼育により、野生型非ヒト動物と比較して、血中コレステロール量が上昇する
（ｄ）高カロリー食餌での飼育により、野生型非ヒト動物と比較して、肝臓トリグリセライド量が上昇する
を示す。
従って、本発明のノックアウト非ヒト動物は、糖脂質代謝機能異常を伴う疾患のモデル動物として、１）糖脂質代謝機能異常を伴う疾患等の病態解析を行うため、２）医薬品又は医薬品候補物質などの糖脂質代謝制御能力を評価するために用いることができる。
本明細書において病態解析とは、糖脂質代謝機能異常を伴う疾患により生ずる生体内のあらゆる変化を解析することを意味する。
すなわち、標準食餌条件もしくは食餌性肥満誘導条件（食餌負荷試験）において飼育された本発明のノックアウト非ヒト動物と野生型非ヒト動物を比較し、胎生期から致死までの期間における、発育分化、発達、生活行動の観察、病理組織学的検査又は生化学的検査を行うことにより実施することができる。これらの病態解析における観察及び検査については、当業者が通常用いる方法に従えばよく、「トランスジェニック動物」山村研一他 編（共立出版株式会社）」等を参照することができる。
例えば、本発明のノックアウト非ヒト動物の組織から抽出されるトータルRNAをＰＣＲリアルタイム定量解析又はノザンブロット解析等の方法で分析し、野性型非ヒト動物における値と比較することにより、当該組織において発現が誘導もしくは抑制されている遺伝子を同定することができる。その結果から、糖脂質代謝機能異常を伴う疾患において発現が変動するマーカー遺伝子を探索することができ、延いては疾患の原因因子解明の指標とすることもできる。
実際に、本発明実施例に示すとおり、本発明のノックアウト非ヒト動物では、糖脂質代謝関連因子の発現量が変動していることがわかった。すなわち、肝臓におけるPEPCK及びG6P、褐色脂肪細胞におけるUCP1及びFAS、白色脂肪細胞におけるACOの発現がそれぞれ上昇しており、これらの発現を指標として糖脂質代謝機能異常を伴う疾患モデル動物における、罹患の有無を判断できることがわかる。
一方、医薬品又は医薬品候補物質などの糖脂質代謝制御能力を評価する方法については、以下に詳細に説明する。
That is, the second aspect of the present invention relates to a disease associated with a glycolipid metabolic dysfunction comprising the knockout non-human animal of the present invention (eg, decreased glucose tolerance, diabetes, hyperlipidemia, hypertension, arteriosclerosis, etc.). Metabolic disease, diseases such as coronary artery disease, angina pectoris, myocardial infarction, and cardiovascular disorders).
The knockout non-human animal of the present invention has a significantly reduced expression level of the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more as compared with the wild type, and can express a disease associated with the protein. That is, as described above, due to abnormalities in glycolipid metabolism, specific findings are as follows:
(A) A fasting blood glucose level is increased by breeding on a standard diet or a high-calorie diet, compared to a wild-type non-human animal. (B) A wild-type non-human animal is raised by breeding on a standard diet or a high-calorie diet. (C) Increased blood cholesterol level by raising on a high calorie diet as compared to wild type non-human animals. 2 shows that liver triglyceride levels are increased as compared to type non-human animals.
Therefore, the knockout non-human animal of the present invention is used as a model animal for a disease associated with a glycolipid metabolic dysfunction. Can be used to evaluate the glycolipid metabolism control ability of the compound.
As used herein, the term "pathological analysis" means to analyze all changes in a living body caused by a disease associated with glycolipid metabolic dysfunction.
That is, a comparison was made between a knockout non-human animal of the present invention and a wild-type non-human animal bred under standard dietary conditions or dietary obesity induction conditions (dietary load test). It can be carried out by observing living behavior, performing histopathological examination or biochemical examination. Observation and examination in the analysis of these pathological conditions may be performed according to a method commonly used by those skilled in the art, and reference may be made to “Transgenic animals”, edited by Kenichi Yamamura et al. (Kyoritsu Shuppan Co., Ltd.).
For example, by analyzing the total RNA extracted from the tissue of the knockout non-human animal of the present invention by a method such as PCR real-time quantitative analysis or Northern blot analysis and comparing the value with the value in a wild-type non-human animal, the expression in the tissue can be determined. Genes that are induced or suppressed can be identified. From the results, it is possible to search for a marker gene whose expression fluctuates in a disease associated with glycolipid metabolism dysfunction, and it can also be used as an index for elucidating the causative factors of the disease.
In fact, as shown in Examples of the present invention, it was found that the expression level of the glycolipid metabolism-related factor was fluctuated in the knockout non-human animal of the present invention. That is, the expression of PEPCK and G6P in the liver, UCP1 and FAS in brown adipocytes, and the expression of ACO in white adipocytes, respectively, are increased. It can be seen that the presence or absence can be determined.
On the other hand, a method for evaluating the ability to control glycolipid metabolism of a drug or a drug candidate substance will be described in detail below.
本発明の第３の態様は、本発明のノックアウト非ヒト動物又はその一部を用いる、被験物質における糖脂質代謝制御能力の評価方法に関する。
作製された非ヒト動物又はその子孫動物或いはその一部（即ち、ノックアウト非ヒト動物の個体又はその子孫動物或いはそれらの一部）は、糖脂質代謝に関連する疾患等に対する医薬品開発等の分野において有用である。また当該非ヒト動物又はその子孫動物或いはその一部は、糖脂質代謝制御物質を評価するために使用することができる。
A third aspect of the present invention relates to a method for evaluating a glycolipid metabolism controlling ability of a test substance using the knockout non-human animal of the present invention or a part thereof.
The produced non-human animal or its progeny animal or a part thereof (ie, a knockout non-human animal individual or its progeny animal or a part thereof) is used in the field of drug development for diseases related to glycolipid metabolism and the like. Useful. The non-human animal or its progeny or a part thereof can be used for evaluating a glycolipid metabolism regulator.
本発明の評価方法は、
（１）本発明のノックアウト非ヒト動物又はその一部に被験物質を接触させる第一工程、
（２）前記被験物質を接触させた非ヒト動物又はその一部における分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の発現量又は当該量に相関関係を有する指標値を測定し、対照と比較する第二工程、
（３）（２）の比較結果に基づき、被験物質の糖脂質代謝制御能力を評価する第三工程からなる。
Evaluation method of the present invention,
(1) a first step of bringing a test substance into contact with the knockout non-human animal of the present invention or a part thereof;
(2) The expression level of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more in a non-human animal or a part thereof contacted with the test substance or an index value having a correlation with the amount is measured and compared with a control. The second step,
(3) The method comprises the third step of evaluating the ability of the test substance to control glycolipid metabolism based on the comparison result of (2).
本明細書において糖脂質代謝制御物質とは、糖脂質代謝制御能力を有する物質を表す。
「糖脂質代謝制御能力」とは、筋肉、肝臓もしくは脂肪組織において解糖や糖新生および糖取り込みを制御する能力（糖代謝制御能力）、又は脂質合成もしくは脂質分解を制御する能力（脂肪酸合成及び／又は脂肪酸代謝制御能力）を表す。さらには、前記脂肪酸を原料にしたコレステロール合成代謝（コレステロール産生制御能力）、エネルギー（ＡＴＰ）の産生消費、生体のインスリン感受性を制御する能力もまた、糖脂質代謝制御能力の概念に含まれる。
In the present specification, a glycolipid metabolism controlling substance refers to a substance having a glycolipid metabolism controlling ability.
"Glycolipid metabolism control ability" refers to the ability to control glycolysis, gluconeogenesis and glucose uptake in muscle, liver or adipose tissue (sugar metabolism control ability) or the ability to control lipid synthesis or lipolysis (fatty acid synthesis and And / or the ability to control fatty acid metabolism). Furthermore, the concept of glycolipid metabolism control ability includes the ability to control cholesterol synthesis metabolism (cholesterol production control ability), energy (ATP) production and living body insulin sensitivity using the fatty acid as a raw material.
本明細書において、被験物質としては特に限定は無く、核酸、ペプチド、タンパク質（本発明タンパク質に対する抗体を含む）、有機化合物、無機化合物などであり、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子有機化合物、合成ペプチド、合成核酸、天然化合物などが挙げられる。 In the present specification, the test substance is not particularly limited, and includes nucleic acids, peptides, proteins (including antibodies against the protein of the present invention), organic compounds, inorganic compounds, etc., cell extracts, expression products of gene libraries, Examples include low molecular organic compounds, synthetic peptides, synthetic nucleic acids, natural compounds, and the like.
上記評価方法において、本発明のノックアウト非ヒト動物を用いる場合、当該非ヒト動物は、標準的な食餌による通常の飼育条件又は高カロリー食餌を与える飼育条件により飼育される。食餌の摂食方法については特に限定は無く、自由摂食させるか、又は一定量を一定時間に摂食させる。ここで標準的な食餌としては、各々の動物種に応じて適宜当業者に汎用されている食餌を用いればよい。
本明細書において、「高カロリー食餌」とは、高脂肪食、高蔗糖食又はこれらを組み合わせた高脂肪高蔗糖（HH）食を表すが、その組成や摂食の条件をコントロールすることで、より効果的に食餌性の糖脂質代謝異常疾患の発症を誘導することが可能である。具体的には単位食餌成分の脂肪分を10-60kcal％（標準食約35kcal％）の幅で選択し、さらに植物性脂質に比して動物性脂質を0.5−10倍に調整できる。また、単位食餌成分の炭水化物成分から蔗糖を0-35kcal%の幅で選択することができる。
本明細書において、「高カロリー食摂取（負荷飼育）時」とは、一定期間の調整食条件下の飼育期間中の任意の時点を示し、胎生期から致死までの期間において時期および期間、回数や量を限定するものではなく、また、期間中に一時的に2-24時間程度の絶食を実施し、生化学的検査を実施することで病態の変化を観察することができる。さらに好ましくは、食餌条件の異なる動物群にわけて飼育を実施し、常に生活行動や糖脂質代謝異常に伴う病態に関わるパラメータ（体重、運動量、血圧、摂食状態、生化学的検査）について各群を経時的に比較観察した上で病理組織学的検査を行う。生化学的検査における項目としては、血糖値、コレステロール量、リン脂質量、トリグリセライド量、遊離脂肪酸、インスリン値、レプチン値及び糖脂質代謝関連因子の発現量等が例示されるが、これに限定されるものではない。
本明細書において「本発明のノックアウト非ヒト動物又はその一部に被験物質を接触させる」とは、被験物質を当該非ヒト動物に投与すること、又は被験物質を当該非ヒト動物の一部に接触させることを表し、当業者に汎用されている方法で実施することができる。被験物質を当該非ヒト動物に投与する場合、その投与方法には特に限定はなく、経口的もしくは非経口的に投与すればよい。非経口的投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与（ip）、直腸内投与、経皮投与（塗布）等を挙げることができる。
被験物質の形態に特に限定は無く、固体、液体、基剤との混合物、縣濁液又は溶液等として用いることができる。縣濁液もしくは溶液とする場合、水、pH緩衝液、メチルセルロース溶液、生理食塩水、有機溶媒水溶液（有機溶媒としては通常エタノールやジメチルスルホキシドが用いられる。）等を用いる。基剤としてはグリセリン、スクワラン等の油等が挙げられ主に塗布用の被験物質を調製するために用いられる。
When the knockout non-human animal of the present invention is used in the above evaluation method, the non-human animal is bred under normal breeding conditions using a standard diet or breeding conditions that provide a high calorie diet. There is no particular limitation on the method of ingesting food, and the animals are allowed to eat freely or to eat a certain amount in a certain time. Here, as a standard diet, a diet widely used by those skilled in the art may be appropriately used according to each animal species.
As used herein, the term "high-calorie diet" refers to a high-fat diet, a high-sucrose diet, or a high-fat high-sucrose (HH) diet obtained by combining these diets. By controlling the composition and feeding conditions, It is possible to more effectively induce the onset of dietary glycolipid metabolism disorder. Specifically, the fat content of the unit diet component is selected in the range of 10-60 kcal% (standard diet about 35 kcal%), and the animal lipid can be adjusted 0.5 to 10 times more than the vegetable lipid. Also, sucrose can be selected from the carbohydrate component of the unit diet component in a range of 0-35 kcal%.
In the present specification, “at the time of high-calorie diet intake (load breeding)” refers to any time during the breeding period under adjusted dietary conditions for a certain period, and the period, period, and number of times during the period from embryonic to lethal The amount is not limited, and the patient can be fasted for about 2 to 24 hours temporarily during the period, and a change in the condition can be observed by conducting a biochemical test. More preferably, the animals are bred in groups of animals with different dietary conditions, and parameters related to living behavior and pathological conditions associated with abnormalities in glycolipid metabolism (weight, exercise, blood pressure, eating state, biochemical tests) Histopathological examination is performed after comparative observation of the groups over time. Examples of the items in the biochemical test include, but are not limited to, blood sugar levels, cholesterol levels, phospholipid levels, triglyceride levels, free fatty acids, insulin levels, leptin levels, and expression levels of glycolipid metabolism-related factors. Not something.
As used herein, "contacting a test substance with the knockout non-human animal of the present invention or a part thereof" means that the test substance is administered to the non-human animal, or the test substance is administered to a part of the non-human animal. The term “contact” means that it can be carried out by a method commonly used by those skilled in the art. When the test substance is administered to the non-human animal, the administration method is not particularly limited, and may be administered orally or parenterally. Parenteral administration methods include intravenous administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration (ip), rectal administration, transdermal administration (application), and the like.
There is no particular limitation on the form of the test substance, and it can be used as a solid, liquid, mixture with a base, suspension or solution. When a suspension or solution is used, water, a pH buffer, a methylcellulose solution, physiological saline, an organic solvent aqueous solution (ethanol or dimethyl sulfoxide is usually used as an organic solvent), or the like is used. Examples of the base include oils such as glycerin and squalane, and are mainly used for preparing test substances for application.
「分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の発現量」の測定方法としては、該蛋白質のRNA量を検出・測定する方法及び、該蛋白質量を検出・測定する方法が挙げられ、後述する糖脂質代謝関連因子の発現量の測定方法、又は実施例に記載の方法と同様に行えばよい。
前記評価方法の第二工程における「分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の発現量に相関関係を有する指標値」としては、
（ａ）通常飼育もしくは高カロリー食餌での飼育における空腹時の血糖値、
（ｂ）通常飼育もしくは高カロリー食餌での飼育における耐糖能、
（ｃ）高カロリー食餌での飼育時の血中コレステロール量、
（ｄ）高カロリー食餌での飼育時の肝臓トリグリセリセライド量、
（ｅ）糖脂質代謝関連因子の発現量
を挙げることができる。
血糖値の測定方法としては、当業者に良く知られた、GOD（Glucose oxidase）固定化酵素電極による最大反応加速方法（Glucoroder-NX株式会社A＆T製造）や本明細書実施例に記載の方法などを用いることができる。
耐糖能の測定方法としては、OGTT（糖負荷試験）又はITT（インスリン負荷試験）等が挙げられ、好ましくは、これらの結果から曲線下面積値（AUC：area under the curve)を算出し、その増加をもって耐糖能低下の指標とすることができ、具体的には本明細書実施例に記載された方法を用いることができる。
血中コレステロール量の測定方法としては、当業者に良く知られた酵素的免疫吸着分析法キット（Roche Dianostics）による方法などを用いることができる。
又は肝臓トリグリセリセライド量の測定方法としては、当業者に良く知られた、アセチルアセトン法（Fletcher,M.J.:Clin. Chim. Acta,22,339-397(1968)およびSardesai,V.M.:Clin. Chim. Acta,14,156-161(1968)）に記載された方法や本明細書実施例に記載の方法などを用いることができる。
その他本発明のノックアウト非ヒト動物の生化学的解析手法については、当業者に良く知られた方法又は「 The Journal of Clinical Investigation ,April2002,vol.109,no.8（Robert V. Farese Jr.ら著）」又は「Ｎature Ｇenetics, vol.25, may 2000（Robert V. Farese Jr.ら著」等に記載された方法が挙げられる。
Examples of a method for measuring the “expression amount of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more” include a method for detecting and measuring the RNA amount of the protein and a method for detecting and measuring the amount of the protein, which will be described later. The measurement may be performed in the same manner as the method for measuring the expression level of the glycolipid metabolism-related factor or the method described in Examples.
As the "index value having a correlation with the expression level of fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more" in the second step of the evaluation method,
(A) fasting blood glucose levels in normal or high calorie diets;
(B) glucose tolerance in normal breeding or breeding on a high calorie diet;
(C) blood cholesterol level when bred on a high calorie diet,
(D) liver triglyceride content when bred on a high calorie diet,
(E) The expression level of glycolipid metabolism-related factors can be mentioned.
As a method for measuring the blood glucose level, there are well known to those skilled in the art, such as a maximum reaction acceleration method using a GOD (Glucose oxidase) immobilized enzyme electrode (manufactured by A & T Co., Ltd., Glucoroder-NX Co.) Can be used.
Examples of the method for measuring glucose tolerance include OGTT (sugar tolerance test) and ITT (insulin tolerance test). Preferably, the area under the curve (AUC) is calculated from these results. An increase can be used as an indicator of a decrease in glucose tolerance, and specifically, the method described in Examples of the present specification can be used.
As a method for measuring the blood cholesterol level, a method using an enzymatic immunosorbent assay kit (Roche Dianostics) well known to those skilled in the art can be used.
Alternatively, as a method for measuring the amount of liver triglyceride, an acetylacetone method (Fletcher, MJ: Clin. Chim. Acta, 22, 339-397 (1968) and Sardesai, VM: Clin. Chim. , 14, 156-161 (1968)) and the methods described in the Examples of the present specification.
Other techniques for biochemical analysis of knockout non-human animals of the present invention include methods well known to those skilled in the art or “The Journal of Clinical Investigation, April 2002, vol. 109, no. 8 (Robert V. Farese Jr. et al.). Authors) "or" Nature Genetics, vol. 25, may 2000 (by Robert V. Farese Jr. et al.) "And the like.
本明細書において糖脂質代謝関連因子とは、解糖や糖新生、及び糖取り込みに関わる酵素、脂質の代謝もしくは生合成等の制御に関わる因子、また、これを原料にしたコレステロール合成代謝、エネルギーの産生消費についての制御にもかわる因子、さらに生体のインスリン感受性に関与する因子であり、具体的にはPEPCK、G6P、UCP1、FAS及びACOなどから選択される１又は複数の因子が挙げられる。該糖脂質代謝関連因子の発現量の測定を行う場合、測定対象としてRNAを用いる方法及び測定対象として蛋白質を用いる方法が挙げられる。以下それぞれについて詳細に述べる。
１）測定対象としてRNAを用いる場合
生体試料としてRNAを利用する場合は、該糖脂質代謝関連因子の発現量は、生体試料に含まれるトータルRNA単位量当りのPEPCK遺伝子、G6P遺伝子、UCP1遺伝子、FAS遺伝子又はACO遺伝子の発現レベルを検出し、測定することによって実施される。
糖脂質代謝関連因子遺伝子の由来動物種は特に限定は無いが、通常は本発明非ヒト動物と同一種由来の遺伝子を用いる。
In the present specification, glycolipid metabolism-related factors include enzymes involved in glycolysis, gluconeogenesis, and sugar uptake, factors involved in the control of lipid metabolism or biosynthesis, and cholesterol synthesis metabolism and energy It is a factor that is also involved in the control of the production and consumption of insulin, and a factor that is involved in the insulin sensitivity of the living body. Specific examples include one or more factors selected from PEPCK, G6P, UCP1, FAS, and ACO. When measuring the expression level of the glycolipid metabolism-related factor, there are a method using RNA as a measurement target and a method using protein as a measurement target. Each is described in detail below.
1) When RNA is used as a measurement target When RNA is used as a biological sample, the expression level of the glycolipid metabolism-related factor is determined by the PEPCK gene, G6P gene, UCP1 gene, It is performed by detecting and measuring the expression level of the FAS gene or ACO gene.
The animal species from which the glycolipid metabolism-related factor gene is derived is not particularly limited, but usually a gene derived from the same species as the non-human animal of the present invention is used.
本明細書において、PEPCK遺伝子は特に言及しない限り、マウス由来のPEPCK遺伝子（Genbank Accession No.AF009605又は配列番号２６）や、そのホモログを包含する趣旨で用いられる。ホモログとしてはアイソフォームやオルソログ［例えばヒト由来のPEPCK遺伝子（Genbank Accession No.AI635748,BC023978,BM768055）］等が挙げられる。
本明細書において、G6P遺伝子は特に言及しない限り、マウス由来のG6P遺伝子（Genbank Accession No.BC013448又は配列番号２８）や、そのホモログを包含する趣旨で用いられる。ホモログとしてはアイソフォームやオルソログ［例えばヒト由来のG6P遺伝子（Genbank Accession No.U01120）等が挙げられる。
本明細書において、UCP1遺伝子は特に言及しない限り、マウス由来のUCP1遺伝子（Genbank Accession No.BC012701又は配列番号３０）や、そのホモログを包含する趣旨で用いられる。ホモログとしてはアイソフォームやオルソログ［例えばヒト由来のUCP1遺伝子（Genbank Accession No.U28480,X51952）等が挙げられる。
本明細書において、FAS遺伝子は特に言及しない限り、マウス由来のFAS遺伝子（Genbank Accession No. AF127033又は配列番号３２）や、ヒト由来のFAS遺伝子（Genbank Accession No. U29344,U52428）等が挙げられる。
本明細書において、ACO遺伝子は特に言及しない限り、マウス由来のACO遺伝子（Genbank Accession No. AF006688又は配列番号３４）や、ヒト由来のACO遺伝子（Genbank Accession No. AH000843,BC008767）等が挙げられる。
In the present specification, the PEPCK gene is used to include the mouse-derived PEPCK gene (Genbank Accession No. AF009605 or SEQ ID NO: 26) and homologs thereof, unless otherwise specified. Homologs include isoforms and orthologs [eg, human-derived PEPCK gene (Genbank Accession No. AI635748, BC023978, BM768055)] and the like.
In the present specification, the G6P gene is used to include a mouse-derived G6P gene (Genbank Accession No. BC013448 or SEQ ID NO: 28) and homologs thereof, unless otherwise specified. Homologs include isoforms and orthologs [eg, human-derived G6P gene (Genbank Accession No. U01120)].
In the present specification, the UCP1 gene is used for the purpose of including a mouse-derived UCP1 gene (Genbank Accession No. BC012701 or SEQ ID NO: 30) and homologs thereof, unless otherwise specified. Homologs include isoforms and orthologs [eg, human-derived UCP1 gene (Genbank Accession No. U28480, X51952)].
In the present specification, the FAS gene includes a mouse-derived FAS gene (Genbank Accession No. AF127033 or SEQ ID NO: 32) and a human-derived FAS gene (Genbank Accession No. U29344, U52428) unless otherwise specified.
In the present specification, the ACO gene includes a mouse-derived ACO gene (Genbank Accession No. AF006688 or SEQ ID NO: 34) and a human-derived ACO gene (Genbank Accession No. AH000843, BC008767) unless otherwise specified.
本発明の非ヒト動物、その子孫もしくはそれらの一部において、上記糖脂質代謝関連因子遺伝子（あるいは遺伝子産物）の発現の有無又はその程度を検出することによって、当該遺伝子発現の有無又はその程度を測定することができる。すなわち、食餌負荷飼育を実施した後の各種組織から抽出されたＲＮＡを材料としたＰＣＲリアルタイム定量解析又はノザンブロット解析を実施することによって、糖脂質代謝関連因子遺伝子の発現量の増減又はこれに連動する他の遺伝子の発現量の動向を調べることにより、糖脂質代謝機能異常を伴う疾患の発症状態を知ることができ、延いては疾患の原因因子解明の指標とすることもできる。
すなわち、本発明の非ヒト動物由来の生体試料と糖脂質代謝関連因子遺伝子由来のプライマーもしくはプローブとを接触させ、該プライマーもしくはプローブと結合するRNA量を、ノーザンブロット法、ＲＴ-ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、in situハイブリダイゼーション解析法などの公知の方法で測定することができる。該プライマーもしくはプローブとしては、糖脂質代謝関連因子遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチドが挙げられる。プライマーとして用いる場合には、通常15bp〜100bp、好ましくは15bp〜50bp、より好ましくは15bp〜35bpの塩基長を有するものが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常15bp〜全配列の塩基数、好ましくは15bp〜1kb、より好ましくは100bp〜1kbの塩基長を有するものが例示できる。
In the non-human animal of the present invention, its progeny, or a part thereof, the presence or absence or the degree of the expression of the glycolipid metabolism-related factor gene (or gene product) is detected to determine the presence or absence or the degree of the expression of the gene. Can be measured. That is, by performing PCR real-time quantitative analysis or Northern blot analysis using RNA extracted from various tissues after feeding load breeding, the expression level of the glycolipid metabolism-related factor gene is increased or decreased or linked to this. By examining the trends in the expression levels of other genes, it is possible to know the onset state of a disease associated with glycolipid metabolic dysfunction, and it can also be used as an index for elucidating the causative factors of the disease.
That is, a biological sample derived from a non-human animal of the present invention is brought into contact with a primer or probe derived from a glycolipid metabolism-related factor gene, and the amount of RNA bound to the primer or probe is determined by Northern blotting, RT-PCR, DNA It can be measured by a known method such as a chip analysis method and an in situ hybridization analysis method. Examples of the primer or probe include a polynucleotide having at least 15 consecutive nucleotides in the base sequence of a glycolipid metabolism-related factor gene and / or a polynucleotide complementary thereto. When used as a primer, those having a base length of usually 15 bp to 100 bp, preferably 15 bp to 50 bp, more preferably 15 bp to 35 bp can be exemplified. When used as a detection probe, those having a base length of usually 15 bp to the entire sequence, preferably 15 bp to 1 kb, more preferably 100 bp to 1 kb can be exemplified.
ノーザンブロット法を利用する場合は、具体的には、前記プローブを放射性同位元素（32P、33Pなど：RI）や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせた後、形成された糖脂質代謝関連因子由来のプライマー（DNA又はRNA）と生体試料由来の全RNAとの二重鎖を、前記プライマーの標識物（RI若しくは蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）又は蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham PharamciaBiotech社製)を用いて、該プロトコールに従ってプローブDNAを標識し、生体試料由来のRNAとハイブリダイズさせた後、プローブの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。 When using the Northern blot method, specifically, the probe is labeled with a radioisotope (32P, 33P, etc .: RI) or a fluorescent substance, and the probe is transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method. After hybridizing with RNA derived from a biological tissue, a duplex of a formed primer (DNA or RNA) derived from a glycolipid metabolism-related factor and total RNA derived from a biological sample is labeled with a labeled product of the primer (RI or A method of detecting and measuring a signal derived from a fluorescent substance with a radiation detector (BAS-1800II, manufactured by Fuji Film Co., Ltd.) or a fluorescent detector can be exemplified. Further, using the AlkPhos Direct Labeling and Detection System (manufactured by Amersham Pharamcia Biotech), the probe DNA is labeled according to the protocol and hybridized with RNA derived from a biological sample. A method of detecting and measuring with Major STORM860 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) can also be used.
RT-PCR法を利用する場合は、生体試料由来のRNAと前記プライマーをハイブリダイズさせ、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、上記ＰＣＲを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した疾患マーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法などを用いることができる。なお、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）などで測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRIME 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。 When the RT-PCR method is used, a method in which RNA derived from a biological sample is hybridized with the primer, a PCR method is performed according to a conventional method, and the obtained amplified double-stranded DNA is detected can be exemplified. The amplified double-stranded DNA was detected by a method for detecting labeled double-stranded DNA produced by performing the PCR using primers previously labeled with RI or a fluorescent substance. A method in which double-stranded DNA is transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method, and a labeled disease marker is used as a probe, hybridized with the probe, and detected can be used. The generated labeled double-stranded DNA product can be measured using an Agilent 2100 bioanalyzer (manufactured by Yokogawa Analytical Systems). Further, an RT-PCR reaction solution is prepared according to the protocol using SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems) and reacted with the ABI PRIME 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems) to detect the reaction product. You can also.
また、ＤＮＡチップ解析を利用する場合は、本発明の前記プライマーもしくはプローブをＤＮＡプローブ（１本鎖又は２本鎖）として貼り付けたＤＮＡチップを用意し、これに生体組織由来のRNAから常法によって調製されたcRNAとハイブリダイズさせて、形成されたDNAとcRNAとの二本鎖を、本発明の前記プライマーもしくはプローブから調製される標識プローブと結合させて検出する方法を挙げることができる。また、上記DNAチップとして、PEPCK遺伝子、G6P遺伝子、UCP1遺伝子、ACO遺伝子又はFAS遺伝子の遺伝子発現レベルの検出、測定が可能なＤＮＡチップを用いることもできる。 When DNA chip analysis is used, a DNA chip on which the primer or the probe of the present invention is affixed as a DNA probe (single- or double-stranded) is prepared. And a double-stranded DNA and cRNA formed by hybridizing with the cRNA prepared by the above method and binding to a labeled probe prepared from the primer or probe of the present invention to detect. Further, a DNA chip capable of detecting and measuring the gene expression level of the PEPCK gene, G6P gene, UCP1 gene, ACO gene or FAS gene can also be used as the DNA chip.
２）測定対象として蛋白質を用いる場合
生体試料として蛋白質を含む溶液を利用する場合は、生体試料に含まれる糖脂質代謝関連因子量を該糖脂質代謝関連因子を認識し得る抗体と反応させることによって、該抗体と結合し得る糖脂質代謝関連因子量を検出し、測定することによって実施される。
糖脂質代謝関連因子を認識し得る抗体の由来動物種は特に限定は無いが、通常は本発明非ヒト動物と同一種由来の抗体を用いる。
糖脂質代謝関連因子として具体的にはPEPCK、G6P、UCP1、FAS又はACO、が挙げられ、そのアミノ酸配列としては、それぞれ上述の糖脂質代謝関連因子遺伝子によってコードされる蛋白質を挙げることができる。
2) When a protein is used as a measurement target When a solution containing a protein is used as a biological sample, the amount of glycolipid metabolism-related factor contained in the biological sample is reacted with an antibody capable of recognizing the glycolipid metabolism-related factor. , By detecting and measuring the amount of glycolipid metabolism-related factor that can bind to the antibody.
The animal species from which the antibody capable of recognizing the glycolipid metabolism-related factor is not particularly limited, but usually an antibody derived from the same species as the non-human animal of the present invention is used.
Specific examples of glycolipid metabolism-related factors include PEPCK, G6P, UCP1, FAS and ACO, and examples of the amino acid sequence thereof include proteins encoded by the above-described glycolipid metabolism-related factor genes.
前記糖脂質代謝関連因子の抗体は、その形態に特に制限はなく、前記糖脂質関連因子を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよく、さらには当該糖脂質関連因子を構成するアミノ酸配列のうち少なくとも連続する３アミノ酸、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸程度からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体が、本発明の抗体に含まれる。 The antibody of the glycolipid metabolism-related factor is not particularly limited in its form, and may be a polyclonal antibody using the glycolipid-related factor as an immunogen or a monoclonal antibody thereof. Antibodies of the present invention include antibodies having an antigen-binding property to a polypeptide consisting of at least three consecutive amino acids, usually eight amino acids, and preferably about 15 amino acids in the amino acid sequence constituting the relevant factor.
これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したPEPCK、G6P、UCP1、FAS又はACOを用いて、あるいは常法に従って当該いずれかの本発明タンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したPEPCK、G6P、UCP1、FAS又はACO、あるいはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。 Methods for producing these antibodies are already well known, and the antibodies of the present invention can also be produced according to these conventional methods (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Sections 11.12-11.13). Specifically, when the antibody of the present invention is a polyclonal antibody, PEPCK, G6P, UCP1, FAS or ACO expressed and purified in E. coli or the like according to a conventional method, or any of the present invention according to a conventional method It is possible to synthesize an oligopeptide having a partial amino acid sequence of a protein, immunize a non-human animal such as a rabbit, and obtain from a serum of the immunized animal according to a conventional method. On the other hand, in the case of a monoclonal antibody, non-human animals such as mice are immunized with PEPCK, G6P, UCP1, FAS or ACO expressed and purified in E. coli or the like according to a conventional method, or an oligopeptide having a partial amino acid sequence of these proteins. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section, which is prepared by fusing the obtained spleen cells and myeloma cells. 11.4-11.11).
また、抗体の作製に使用されるタンパク質は、本発明により提供される糖脂質代謝関連因子の遺伝子の配列情報（配列番号27,29,31,33又は35）に基づいて、ＤＮＡクローニング、各プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養及び培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるいは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）などに準じて行うことができる。具体的には糖脂質代謝関連因子をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって実施することができる。また、これら糖脂質代謝関連因子は、本発明により提供されるアミノ酸配列の情報（配列番号27,29,31,33又は35）に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。具体的には、「ペプチド合成の基礎と実験」（泉屋信夫ら著、丸善、1987年発行）に記載された液相合成法や固相合成法を用いることができる。 In addition, the protein used for preparing the antibody can be obtained by DNA cloning, using each plasmid, based on the sequence information of the glycolipid metabolism-related factor gene provided by the present invention (SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33 or 35). , Transfection into a host, culturing a transformant, and recovering a protein from the culture. These operations are carried out according to methods known to those skilled in the art or methods described in the literature (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)) and the like. Can be done. Specifically, a recombinant DNA (expression vector) capable of expressing a gene encoding a glycolipid metabolism-related factor in a desired host cell is prepared, introduced into a host cell and transformed, and the transformant is cultured. Then, the target protein can be recovered from the obtained culture to carry out the method. In addition, these glycolipid metabolism-related factors may be produced by a general chemical synthesis method (peptide synthesis) in accordance with the amino acid sequence information (SEQ ID NOs: 27, 29, 31, 33 or 35) provided by the present invention. it can. Specifically, a liquid-phase synthesis method or a solid-phase synthesis method described in “Basics and Experiments of Peptide Synthesis” (Nobuo Izumiya et al., Published by Maruzen, 1987) can be used.
なお、本発明の糖脂質代謝関連因子には、配列番号27,29,31,33又は35に示すタンパク質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記配列番号で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ上記配列番号で示されるタンパク質の機能と同等の生物学的機能を有するか、及び／又は免疫学的活性において同等の活性を有するタンパク質を挙げることができる。ここで免疫学的活性において同等とは、糖脂質代謝関連因子に対する抗体と特異的に結合能力を有する蛋白質を挙げることができる。 The glycolipid metabolism-related factor of the present invention includes not only the protein represented by SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33 or 35, but also homologues thereof. The homologues include a deletion, substitution, or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: and a biological equivalent to the function of the protein represented by SEQ ID NO: And / or proteins having an equivalent function in immunological activity. Here, the term "equivalent in immunological activity" refers to a protein having a specific binding ability to an antibody against a glycolipid metabolism-related factor.
本発明評価方法の第二工程における「対照」は、例えば、
（ａ）当該評価方法で使用される本発明非ヒト動物と同動物種である野生型非ヒト動物を対象として第一工程及び第二工程と同様な工程を実施した場合、又は
（ｂ）被験物質の代わりに対照物質（ポジティブコントロール、ネガティブコントロール）を用いて第一工程及び第二工程と同様な工程を実施した場合等を意味する。
"Control" in the second step of the evaluation method of the present invention, for example,
(A) when a step similar to the first step and the second step is performed on a wild-type non-human animal of the same species as the non-human animal of the present invention used in the evaluation method, or (b) test This means the case where the same steps as the first step and the second step are performed using a control substance (positive control, negative control) instead of the substance.
前記（ａ）の場合、本発明の非ヒト動物における糖脂質代謝制御能力が野生型非ヒト動物における被験物質の糖脂質代謝制御能力と同等以上であれば、当該被験物質は糖脂質代謝制御能力を有すると評価することができる。一方、本発明の非ヒト動物における糖脂質代謝制御能力が野生型非ヒト動物における被験物質の糖脂質代謝制御能力よりも小さければ、当該被験物質は分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質に起因する糖脂質代謝制御能力を有さないと評価することができる。
前記（ｂ）の場合、対照物質としては、ポジティブコントロール又はネガティブコントロールが挙げられる。ポジティブコントロールとは、糖脂質代謝制御能力を有する任意の物質を表し、具体的にはインシュリン等が例示される。また、ネガティブコントロールとしては、被験物質に含まれる溶媒、バックグランドとなる試験系溶液等が上げられる。
対照物質をネガティブコントロールとする場合、被験物質の糖脂質代謝制御能力が対照物質の糖脂質代謝制御能力よりも大きければ、当該被験物質は糖脂質代謝制御能力を有すると評価することができる。一方、被験物質の糖脂質代謝制御能力が対照物質の糖脂質代謝制御能力と同程度もしくは小さければ、当該被験物質は糖脂質代謝制御能力を有さないと評価することができる。
また、対照物質をポジティブコントロールとする場合、被験物質の糖脂質代謝制御能力と対照物質の糖脂質代謝制御能力を比較することによって、被験物質の糖脂質代謝制御能力の程度を評価することができる。
In the case of the above (a), if the ability of the non-human animal of the present invention to control glycolipid metabolism is equal to or greater than the ability of the wild-type non-human animal to control the glycolipid metabolism of the test substance, Can be evaluated. On the other hand, if the glycolipid metabolism-controlling ability of the non-human animal of the present invention is smaller than the glycolipid metabolism-controlling ability of the test substance in a wild-type non-human animal, the test substance is converted into a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more. Can be evaluated as having no ability to control glycolipid metabolism.
In the case of the above (b), the control substance may be a positive control or a negative control. The positive control refers to any substance having a glycolipid metabolism controlling ability, and specific examples include insulin and the like. Examples of the negative control include a solvent contained in the test substance and a test system solution serving as a background.
When the control substance is used as a negative control, if the glycolipid metabolism control ability of the test substance is greater than the glycolipid metabolism control ability of the control substance, the test substance can be evaluated as having the glycolipid metabolism control ability. On the other hand, when the glycolipid metabolism control ability of the test substance is equal to or smaller than the glycolipid metabolism control ability of the control substance, it can be evaluated that the test substance has no glycolipid metabolism control ability.
When the control substance is used as a positive control, the degree of the glycolipid metabolism control ability of the test substance can be evaluated by comparing the glycolipid metabolism control ability of the test substance with the glycolipid metabolism control ability of the control substance. .
本発明評価方法により得られる被験物質の糖脂質代謝制御能力に基づき、選択される物質（糖脂質代謝制御物質）は、糖脂質代謝制御能力を有するので、糖脂質代謝機能異常を伴う疾患（耐糖能低下、糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化、冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞又は心血管障害）等に対する治療及び予防に効果のある医薬品として使用することができる。さらに、本発明スクリーニング方法により得られる物質から誘導される化合物も同様に用いることができる。
本発明スクリーニング方法により得られた物質は塩を形成していてもよく、当該物質の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）又は塩（例、アルカリ金属）等との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が用いられる。本発明スクリーニング方法により得られた物質は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等として経口的に、或いは水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤等の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、当該物質を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤等に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン，コーンスターチ，トラガント，アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ，ゼラチン，アルギン酸等のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖，乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント，アカモノ油又はチェリーのような香味剤等が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油等のような天然産出植物油等を溶解又は懸濁させる等の通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水，ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール，Ｄ−マンニトール，塩化ナトリウム等）等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール，ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０TM，ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油，大豆油等が用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル，ベンジルアルコール等と併用してもよい。また、上記の治療・予防剤には、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム，塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン，ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール，フェノール等）、酸化防止剤等を配合してもよい。調製された注射液等の医薬組成物は、通常、適当なアンプルに充填される。
The substance (glycolipid metabolism controlling substance) selected based on the glycolipid metabolism controlling ability of the test substance obtained by the evaluation method of the present invention has glycolipid metabolism controlling ability. It can be used as a medicament effective for treatment and prevention of impaired function, diabetes, hyperlipidemia, hypertension, arteriosclerosis, coronary artery disease, angina pectoris, myocardial infarction or cardiovascular disorder). Furthermore, a compound derived from a substance obtained by the screening method of the present invention can also be used.
The substance obtained by the screening method of the present invention may form a salt, and as the salt of the substance, a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid, organic acid) or salt (eg, alkali metal) And the like, and especially preferred are physiologically acceptable acid addition salts. Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid) Acids, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used. The substance obtained by the screening method of the present invention can be, for example, orally as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, or water or other pharmaceutically acceptable, if necessary. It can be used parenterally in the form of injections, such as sterile solutions with liquid or suspensions. For example, manufactured by mixing the substance with physiologically acceptable carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. in the unit dosage form generally required for the practice of formulations. can do. The amount of the active ingredient in these preparations is such that an appropriate dose in the specified range can be obtained. Examples of additives that can be mixed with tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth and acacia, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. Suitable leavening agents, lubricating agents such as magnesium stearate, sweetening agents such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, reddish oil or cherry are used. When the preparation unit form is a capsule, a liquid carrier such as oil and fat can be further contained in the above-mentioned type of material. Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As the aqueous solution for injection, for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used. For example, alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg,
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。当該物質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、当該化合物を経口投与する場合には、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき当該物質を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１〜５０ｍｇ、より好ましくは約１〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合には、当該物質の１回投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、当該物質を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき当該物質を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の非ヒト動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。 Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it can be administered to, for example, humans and mammals (eg, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). . The dose of the substance may vary depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like. For example, when the compound is orally administered, generally, in an adult (with a body weight of 60 kg), the amount of About 0.1 to 100 mg, preferably about 1 to 50 mg, more preferably about 1 to 20 mg of the substance is administered. When administered parenterally, the single dose of the substance may vary depending on the administration subject, target disease, etc. For example, when the substance is administered to an adult (as 60 kg) in the form of an injection, It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the substance per day by intravenous injection. In the case of other non-human animals, the dose can be administered per 60 kg.
以下に本発明を実施例で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
（本遺伝子の単離及び構造解析）
本実施例において対象とされたマウス由来の分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、GenBank AF234625（ｍRNA、2664bp）等に記載されている。当該ゲノム遺伝子のＤＮＡ断片を含むクローンを取得するために、マウス由来の染色体遺伝子ライブラリー（CITB Mouse BAC（bacterial artifical chromosome Library）Cell line DJ7(129SV)DNA pools (Research Genetics 社製)を対象にしたＰＣＲ法によるスクリーニングを実施した。この際に用いたＰＣＲ法は、プライマーGE-U7（配列番号３：GGC CAC AAA TTC CAG AGA ACA G）とGE-L7（配列番号４：CCA AAT GAG CAG ATG CCC CTA T）との一対のプライマーを用いる標準的なTaq polymerase (Toyobo, Japan)反応法であった。尚、当該ＰＣＲのプログラムは、DNA変性（94℃、１分間）に続き、40サイクルの変性（94℃、１分間）−アニ−リング（55℃、30秒間）−伸長（72℃、２分間）、さらに最終伸長（72℃、1分間）であった。その結果、マウス由来の分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子のＤＮＡ断片のうち、エクソン５からエクソン６までの領域に相当する塩基配列を有するＤＮＡ断片（850bp）を増幅する１個の陽性クローンを得た。
(Isolation and structural analysis of this gene)
The nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the fat accumulation-promoting protein derived from the mouse and having a molecular weight of about 6,000 or more in the present example is described in GenBank AF234625 (mRNA, 2664 bp) and the like. In order to obtain a clone containing a DNA fragment of the genomic gene, a mouse-derived chromosome gene library (CITB Mouse BAC (bacterial artifical chromosome Library) Cell line DJ7 (129SV) DNA pools (manufactured by Research Genetics) was targeted. Screening by PCR was performed using primers GE-U7 (SEQ ID NO: 3: GGC CAC AAA TTC CAG AGA ACA G) and GE-L7 (SEQ ID NO: 4: CCA AAT GAG CAG ATG CCC). This was a standard Taq polymerase (Toyobo, Japan) reaction method using a pair of primers with CTT.) The PCR program involved 40 cycles of denaturation following DNA denaturation (94 ° C, 1 minute). (94 ° C, 1 minute)-annealing (55 ° C, 30 seconds)-elongation (72 ° C, 2 minutes) and final elongation (72 ° C, 1 minute). Genomic residue of fat accumulation promoting protein of more than 6,000 Of DNA fragments of the child to obtain a single positive clone for amplifying the DNA fragment (850 bp) having a base sequence corresponding to the region from
（ターゲティングベクターの構築）
実施例１で得られたクローン（BACクローン）から、マウス由来の分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子のＤＮＡ断片のうち、エクソン２からエクソン６までの領域に相当する塩基配列を有するＤＮＡ断片（約9kbp）単離し、これをベクターpCR-XL(Invitrogen社製)にクローニングすることによりpCR-085を調製した。この際に用いたＰＣＲ法は、プライマーU8ClaI-2（配列番号５：ATC GAT TCC TAC TTT GAA TGC CGT GAA）と、プライマーL15SalI（配列番号６：GCT GTC GAC TGG AAC AGA ATA GCC TGG AA）との一対のプライマーを用いる、baffer1を使用したExpand Long Template PCR system (Loche)反応法であった。尚、当該ＰＣＲのプログラムは、DNA変性（94℃、10秒間）に続き、36サイクルの変性（94℃、5秒間）−アニ−リング（60℃、5秒間）−伸長（68℃、10分間）、さらに最終伸長（68℃、20分間）であった。
次に、pGT1.8IresBgeoベクター（Grossler, A.,Joyner, A.L.,Rossant, J., Skarnes,W.C.:Science,244,443-465(1989), Peter S. Nountford and Austin G. Smith:TIG May 1995, Vol.11 No.5等に記載される公知なベクター）からSalIで切り出されたSA−IRIS−βgeo−pA遺伝子カセット(マウスEN2由来のSA(splicing accepter)、 encephalomyocarditis Virus由来のIRES(internal ribosome entry site)、β-galactocidase及びneomycin耐性遺伝子を融合させてなるβgeoにSV40由来のpA(polyadenylation signal)を平滑末端化処理してなるＤＮＡ)を用いて、ｐCR-085からMunIで切り出されるマウス由来の分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子のＤＮＡ断片のうち、エクソン３からエクソン４までの領域に相当する塩基配列を有するＤＮＡ断片を入れ替えることによりターゲティングベクターを構築した。このようにして構築されたターゲティングベクターを用いてＥＳ細胞内の分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子を相同的組換えする。このような相同的組換えにより、当該ゲノム遺伝子が本来有する独自のプロモーターの下流で、前記ターゲティングベクターが有する、エクソン２−前記SA−IRIS−βgeo−pA遺伝子カセット−エクソン６からなるＤＮＡに置換され、結果的にエクソン３からエクソン４の一部までの領域に相当する構造蛋白質コード領域が欠失する。また同時に、当該遺伝子カセットの下流に続くエクソン４以降ではフレームシフトが生じ、結果的に当該ゲノム遺伝子の翻訳産物が誤って産生されることはない。さらにまた、当該ゲノム遺伝子が本来有する独自のプロモーターの下流に挿入された当該遺伝子カセットでは、当該遺伝子カセットが有する選択マーカー遺伝子のプロモーター領域が取り除かれているために、細胞本来の前記ゲノム遺伝子における発現制御と同様な発現制御を受けることになり、ノックアウト非ヒト動物又はその一部において、例えば、β-geoにより付与されるＧ４１８等の細胞毒に対する耐性能力や、X-Gal染色による発色によって、簡単に当該ゲノム遺伝子からの発現を調べることができる。
(Construction of targeting vector)
From the clone (BAC clone) obtained in Example 1, a nucleotide sequence corresponding to a region from
Next, the pGT1.8IresBgeo vector (Grossler, A., Joyner, AL, Rossant, J., Skarnes, WC: Science, 244, 443-465 (1989), Peter S. Nountford and Austin G. Smith: TIG May 1995, Vol. .11 SA-IRIS-βgeo-pA gene cassette (SA (splicing acceptor) derived from mouse EN2, IRES (internal ribosome entry site) derived from encephalomyocarditis Virus) ), Using β-geo obtained by fusing β-galactocidase and neomycin resistance gene to a blunt-ended pA (polyadenylation signal) derived from SV40 to βgeo, and a mouse-derived molecular weight cut out from pCR-085 with MunI. A targeting vector was constructed by replacing a DNA fragment having a base sequence corresponding to a region from
〈ターゲティングベクターのＥＳ細胞への導入と相同的組換え〉
実施例２で構築されたターゲティングベクターを、XhoIで切断、直線化してからエレクトロポレーション（0.25kV、0.5μF×1000）法を用いて、トリプシン処理したRF8 ＥＳ細胞（Meiner VL et al., Proc Natl Acad Sci USA.93:14041,1996等に記載される129Sv/Jaeマウス由来細胞：Robertson, E.J., Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cell: A Practical Approach (1987)等に記載される方法により調製可能）へ導入した。
ターゲティングベクターが導入されたRF8 ＥＳ細胞を、シャーレの底一面に培養された支持細胞であるSNL細胞（線維芽細胞（STO細胞）にネオマイシン耐性遺伝子と白血病阻害因子（LIF）の発現ベクターとを組み込んだもの：McMahon AP and Bradley A, Cell 62:1073,1990）上で37℃、24時間培養した後、さらにネオマイシン含有培地（G418：250μg/ml含有）にて37℃、７〜１５日間培養した。培養後、コロニーが形成されたＧ４１８耐性のクローンを選抜した。このように選抜されたクローン（ＥＳ細胞）を分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子上での相同的組換えが起こったＥＳ細胞とし、これを拡大培養した後、得られたＥＳ細胞の一部については前記ゲノム遺伝子に関するＰＣＲ法によるDNA解析に供し、他の一部については冷凍保存（-80℃）に供した。この際に用いた上記DNA解析は、エクソン２に位置する正向きプライマーSU-screening3（配列番号７：AAC AAT ACC CAC CCA ACA CAA GCA）と、βgeo遺伝子カセット内のSAに位置する逆向きプライマーSA-screening AS2（配列番号８：CGC ACG CCA TAC AGT CCT CTT CAC）との一対のプライマーを用いる、Expand Long Template PCR systemの反応法であった。尚、当該ＰＣＲのプログラムは、DNA変性（94℃、5秒間）に続き、36サイクルの変性（94℃、2秒間）−アニ−リング（60℃、2秒間）−伸長（68℃、2分間）、さらに最終伸長（68℃、3分間）であった。
このようにして、上記ＥＳ細胞の目的位置において正確に相同的組換えが起こっていること（即ち、約1.3kbpのＤＮＡ断片の増幅があること）を確認した。
尚、一般的なゲノム遺伝子を標的としたポジネガ法を採用した場合には、ポジ選択されたＥＳ細胞等の分化全能性細胞のうち、通常、約10〜50％の割合で相同的組換えが確認されるＥＳ細胞等の分化全能性細胞が存在するにもかかわらず、本実施例において対象とされた分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子を標的にした場合には、約1200のＥＳ細胞をスクリーニングしたが、当該ゲノム遺伝子が相同的組換えされたＥＳ細胞は得られなかった。これに対して、上記のようなプロモータートラップ法を採用した場合には、選抜されたクローンのうち１割程度が目的とする相同的組換えＥＳ細胞であった。
<Transduction of targeting vector into ES cells and homologous recombination>
The targeting vector constructed in Example 2 was digested with XhoI, linearized, and then subjected to trypsin-treated RF8 ES cells (Meiner VL et al., Proc) using electroporation (0.25 kV, 0.5 μF × 1000). Natl Acad Sci USA. 93: 14041, 1996 and other 129Sv / Jae mouse-derived cells: can be prepared by the method described in Robertson, EJ, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cell: A Practical Approach (1987), etc. did.
RF8 ES cells into which the targeting vector has been introduced are integrated with neomycin resistance gene and leukemia inhibitory factor (LIF) expression vector into SNL cells (fibroblasts (STO cells)) as supporting cells cultured on the entire bottom of a Petri dish. After culturing for 24 hours at 37 ° C. on McMahon AP and Bradley A, Cell 62: 1073, 1990), the cells were further cultured for 7 to 15 days at 37 ° C. in a neomycin-containing medium (G418: 250 μg / ml). . After the culture, a G418-resistant clone in which a colony was formed was selected. The clones (ES cells) selected in this manner were used as ES cells in which homologous recombination occurred on a genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more, and these cells were obtained after expanded culture. A part of the ES cells was subjected to DNA analysis by PCR for the genomic gene, and the other part was subjected to cryopreservation (−80 ° C.). The above DNA analysis used at this time was performed using a forward primer SU-screening3 (SEQ ID NO: 7: AAC AAT ACC CAC CCA ACA CAA GCA) located in
In this way, it was confirmed that homologous recombination had occurred exactly at the target position of the ES cell (that is, there was amplification of a DNA fragment of about 1.3 kbp).
In addition, when a positive negative method targeting a general genomic gene is adopted, homologous recombination is usually performed at a rate of about 10 to 50% of positively selected totipotent cells such as ES cells. Despite the existence of totipotent cells such as ES cells to be confirmed, when a genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more was targeted in the present example, about Screening of 1200 ES cells did not yield ES cells in which the genomic gene was homologously recombined. On the other hand, when the promoter trap method described above was employed, about 10% of the selected clones were the target homologous recombinant ES cells.
（相同的組換えＥＳ細胞が有するゲノム遺伝子のサザンブロッティング分析）
実施例３で得られた相同的組換えＥＳ細胞の染色体DNAをEcoRVで制限酵素消化した。制限酵素消化された染色体DNA断片を、0.8％アガロースゲル電気泳動に供し、分離された染色体DNA断片をナイロンメンブレン（アマシャム社製、ハイボンドN）へターボブロッター(Schneider&Shunel社製ターボブロッターシステム)を用いて転写した。
分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子のイントロン６（即ち、エクソン６とエクソン７との間に位置するイントロン）に由来するプローブを取得するために、エクソン６からエクソン８までのまでの領域に相当する塩基配列を有するＤＮＡ断片を増幅する、エクソン６に位置する正向きプライマーGE-U12 (配列番号９：GGG CAT CTG CTC ATT TGG TTA)と、エクソン８に位置する逆向きプライマーGE-L12（配列番号１０：CTC TTG TAA AGT ATT GAT ATC CAC G）を用い、かつ鋳型として前記BACクローンを用いてExpand Long Template PCR system 反応を実施した。尚、当該ＰＣＲのプログラムは、DNA変性（94℃、5秒間）に続き、36サイクルの変性（94℃、2秒間）−アニ−リング（60℃、2秒間）−伸長（68℃、4分間）、さらに最終伸長（68℃、5分間）であった。
増幅されたＤＮＡ断片（3.5kbp）をpCR2.1(Invitrogen)にクローニングした後、当該プラスミドからEcoRVでＤＮＡ断片（1.6kbp）を切り出し、これをゲル精製に供した。
このようにして得られたＤＮＡ断片をプローブとして用いて、上記の分離された染色体DNA断片（即ち、相同的組換えＥＳ細胞が有するゲノム遺伝子由来のＤＮＡ断片）のサザンブロッティング分析を実施した。尚、相同的組換えＥＳ細胞の場合には10kbpのＤＮＡ断片を、非相同的組換えＥＳ細胞（野生型ＥＳ細胞）の場合には16kbpのＤＮＡ断片を検出することができる。
その結果を図２に示した。図から明らかなように、本実施例において対象とされたマウス由来の分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子における相同的組換えが確認できるクローン２個が見出された。
(Southern blotting analysis of genomic genes of homologous recombinant ES cells)
The chromosomal DNA of the homologous recombinant ES cells obtained in Example 3 was digested with EcoRV with restriction enzymes. The chromosomal DNA fragment digested with the restriction enzyme is subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and the separated chromosomal DNA fragment is transferred to a nylon membrane (Amersham, Hibond N) using a turbo blotter (Schneider & Shunel Turbo Blotter System). Transcribed.
In order to obtain a probe derived from
After cloning the amplified DNA fragment (3.5 kbp) into pCR2.1 (Invitrogen), a DNA fragment (1.6 kbp) was cut out from the plasmid with EcoRV and subjected to gel purification.
Using the thus obtained DNA fragment as a probe, Southern blot analysis of the separated chromosomal DNA fragment (that is, a DNA fragment derived from a genomic gene of a homologous recombinant ES cell) was performed. In the case of a homologous recombinant ES cell, a 10 kbp DNA fragment can be detected, and in the case of a non-homologous recombinant ES cell (wild type ES cell), a 16 kbp DNA fragment can be detected.
The result is shown in FIG. As is apparent from the figure, two clones were found in which homologous recombination was confirmed in the genomic gene of the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more derived from the mouse targeted in this example.
（ヘテロ接合性ノックアウト非ヒト動物（マウス）の作製）
このようにして確認された相同的組換えＥＳ細胞（即ち、変異型ゲノム遺伝子を持つＥＳ細胞）を、A.L. Joyner、「Gene Targeting - A Practical Approach」２nd edition 、Oxford UNIV等に記載される方法に準じて擬妊娠状態にある野生型雌性マウス57BL/6Ｊ（日本クレア社製）のブラストシスト（胚盤胞）に注入し、次いでこのキメラ胚を仮親の子宮に移植した。胚分化を継続させると、約２１日後に、候補キメラマウスが出産された。出生した候補キメラマウスを里親につけて飼育させた後、本実施例において対象とされた分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の変異型ゲノム遺伝子が生殖系細胞に入ったキメラマウス（F0）を選別した。選別は毛色の違いを観察する方法を利用し、アグーチの毛色からキメラ率約90％以上のキメラマウスをF0マウスとして４個体を選択した。
選択されたキメラマウスと同動物種（即ち、C57BL/6Jマウス）である野生型マウスを交配し、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の変異型ゲノム遺伝子が導入されたヘテロ接合体F1マウス（二倍体における一方のアリルが破壊された分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子を有するマウス）３８個体を作出した。さらに、これらのF1マウス同士を交配することによりヘテロ接合体F2マウスを作製した。一部の、ヘテロ接合体F1マウスについては、当該ヘテロ接合体F1マウスと同動物種（即ち、C57BL/6Jマウス）である野生型マウスとのかけ戻し交配を実施した。
(Production of heterozygous knockout non-human animal (mouse))
The homologous recombinant ES cells (that is, ES cells having a mutated genomic gene) confirmed in this manner were transformed into a method described in AL Joyner, "Gene Targeting-A Practical Approach" 2nd edition, Oxford UNIV, etc. Similarly, blastocysts (blastocysts) of wild-type female mice 57BL / 6J (manufactured by CLEA Japan) in a pseudopregnant state were injected, and the chimeric embryos were transplanted into the uterus of a foster parent. When embryo differentiation was continued, candidate chimeric mice were delivered about 21 days later. A chimeric mouse (F0) in which a mutated genomic gene of a fat accumulation-promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more, which was targeted in the present example, was introduced into a germ-line cell after fostering a candidate chimeric mouse that was born. Was sorted out. For the selection, a method of observing a difference in coat color was used, and four chimeric mice having a chimera rate of about 90% or more were selected as F0 mice from the agouti coat color.
A heterozygous F1 in which a wild-type mouse of the same animal species (ie, C57BL / 6J mouse) as the selected chimeric mouse is bred, and a mutant genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more is introduced. Thirty-eight mice (mouse having a genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more in which one allele in a diploid was destroyed) were produced. Furthermore, heterozygous F2 mice were prepared by crossing these F1 mice. For some heterozygous F1 mice, backcrossing was performed between the heterozygous F1 mice and wild-type mice of the same animal species (ie, C57BL / 6J mice).
（ノックアウト非ヒト動物（マウス）の遺伝子型解析）
キメラマウスの遺伝子型解析には、マウス尾部先端からの抽出DNAを鋳型とし、かつ、下記の３種類のプライマー［（１）イントロン２に位置する野生型及び相同的組換え型に共通の正向きプライマーSumi-S6（配列番号１１：TAA TGG TGG GTT GTT TGT TTG TCA AGG C）、（２）野生型のイントロン２のみに相補する逆向きプライマーSumi-AS2（配列番号１２：GCA GTA CTC TAA AGT AGG CAA CCA ATG T ）、及び（３）βgeo遺伝子カセット内のIRISに位置しかつ相同的組換え型のみに相補する逆向きプライマーβgeo-screening AS2（配列番号１３：GAC CTT GCA TTC CTT TGG CGA GAG ）］を用いる、baffer1を使用したExpand Long Template PCR system (Loche)反応法を用いた。尚、当該ＰＣＲのプログラムは、DNA変性（94℃、5秒間）に続き、40サイクルの変性（94℃、2秒間）−アニ−リング（55℃、2秒間）−伸長（68℃、2分間）、さらに最終伸長（68℃、5分間）であった。尚、相同的組換えＥＳ細胞の染色体を鋳型とする場合には2kbpのＤＮＡ断片を、非相同的組換えＥＳ細胞（野生型ＥＳ細胞）の染色体を鋳型とする場合には0.5kbpのＤＮＡ断片の増幅を検出することができる。
このようにしてキメラマウスの遺伝子型解析を実施した結果、本実施例において対象とされたマウス由来の分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子が破壊されたF1マウス以降の個体の遺伝子型は、ヘテロ接合体（0.5kbpのDNA断片と2kbpのDNA断片との両者の増幅有り）又は野生型マウス(0.5kbp断片のみ増幅有り)であった。尚、ヘテロ接合体の出現率は予測される確率の半数程度であった。
(Genotyping of knockout non-human animals (mouse))
For the genotyping of chimeric mice, the DNA extracted from the tip of the mouse tail was used as a template, and the following three primers [(1) forward direction common to the wild-type and homologous recombination types located in intron 2] Primer Sumi-S6 (SEQ ID NO: 11: TAA TGG TGG GTT GTT TGT TTG TCA AGG C), (2) Reverse primer Sumi-AS2 complementary to
As a result of the genotyping analysis of the chimeric mouse in this manner, the F1 mouse and subsequent individuals in which the genomic gene of the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more derived from the mouse targeted in this example was disrupted. The genotype was a heterozygote (amplification of both a 0.5 kbp DNA fragment and a 2 kbp DNA fragment) or a wild-type mouse (only a 0.5 kbp fragment was amplified). The appearance rate of the heterozygote was about half of the predicted probability.
（ｍRNA抽出並びにPCR法又はRT-PCR分析法による、ＥＳ細胞における分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質遺伝子の発現確認）
野生型のマウスＥＳ細胞、及び、実施例３で冷凍保存されたマウスＥＳ細胞（分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子上での相同的組換えが起こったＥＳ細胞）を、各々別々に、TRIzol RNA reagent(GIBCO-BRL社製)中でホモジナイズし、同社の標準的な方法に従って全RNAを抽出した。抽出された全RNA（溶解物）をＵＶスペクトロメータ（260nm、280nm）で吸光度測定することにより定量した。
逆転写反応はAMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（LIFE SCIENCES社製）を使用して実施され、得られたｃDNAを鋳型として、含まれる分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質遺伝子の発現量に反映してＤＮＡ断片の増幅が認められる条件でＰＣＲ法、またはＲＴ−ＰＣＲ法を行うことにより、各々のＥＳ細胞における当該遺伝子の発現の有無及びその発現量を確認した。
この際に用いたＰＣＲ法は、プライマーGE-U7（配列番号１４：GGC CAC AAA TTC CAG AGA ACA G）とプライマーGE-L7（配列番号１５：CCA AAT GAG CAG ATG CCC CTA T）との一対のプライマーを用いる、KODプラス (Toyobo社製, Japan)反応法であった。尚、当該ＰＣＲのプログラムは、DNA変性（94℃、１分間）に続き、30サイクルの変性（94℃、10秒間）−アニ−リング（55℃、30秒間）−伸長（68℃、1分間）、さらに最終伸長（68℃、5分間）であった。その結果、各々のＥＳ細胞において前記遺伝子の発現が確認された。
一方、ＲＴ−ＰＣＲ法は、同プライマーを用いるSYBR Green PCR Master MIX(ABI社製)を使用して実施され、試験結果をPRISM 7900HT Sequence Detection System 2.0 （ABI社製）を用いて解析した。その結果、前記ゲノム遺伝子のヘテロ接合型ＥＳ細胞においては野生型ＥＳ細胞に比して、前記遺伝子の発現量が約半分に減少していることが確認された。
(Confirmation of expression of fat accumulation promoting protein gene having a molecular weight of about 6,000 or more in ES cells by mRNA extraction and PCR or RT-PCR analysis)
Wild-type mouse ES cells and mouse ES cells cryopreserved in Example 3 (ES cells in which homologous recombination has occurred on a genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more) were used. Each was separately homogenized in TRIzol RNA reagent (GIBCO-BRL), and total RNA was extracted according to the company's standard method. The total RNA (lysate) extracted was quantified by measuring absorbance with a UV spectrometer (260 nm, 280 nm).
The reverse transcription reaction was carried out using an AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (manufactured by LIFE SCIENCES), and using the obtained cDNA as a template, expression of a fat accumulation promoting protein gene having a molecular weight of about 6,000 or more was included. By performing a PCR method or an RT-PCR method under the condition that the amplification of the DNA fragment was recognized in the amount, the presence or absence of the gene and the amount of the expression in each ES cell were confirmed.
The PCR method used at this time was a pair of primer GE-U7 (SEQ ID NO: 14: GGC CAC AAA TTC CAG AGA ACA G) and primer GE-L7 (SEQ ID NO: 15: CCA AAT GAG CAG ATG CCC CTAT). This was a KOD plus (Toyobo, Japan) reaction method using primers. In addition, the program of the said PCR is 30 cycles of denaturation (94 degreeC, 10 second)-annealing (55 degreeC, 30 second)-extension (68 degreeC, 1 minute) following DNA denaturation (94 degreeC, 1 minute). ) And a final extension (68 ° C., 5 minutes). As a result, the expression of the gene was confirmed in each ES cell.
On the other hand, the RT-PCR method was performed using SYBR Green PCR Master MIX (ABI) using the same primers, and the test results were analyzed using PRISM 7900HT Sequence Detection System 2.0 (ABI). As a result, it was confirmed that the expression level of the gene in heterozygous ES cells of the genomic gene was reduced to about half that in the wild-type ES cell.
（RT-PCR分析法による、各組織における分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質遺伝子の発現量の確認）
野生型のマウス組織、及び、ヘテロ接合型のマウス組織（分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のゲノム遺伝子上での相同的組換えが起こったES細胞から創製したＦ１以降の子孫動物の個体（約18週齢）から採取した組織）を、各々別々に、TRIzol RNA reagent(GIBCO-BRL社製)中でホモジナイズし、同社の標準的な方法に従って全RNAを抽出した。抽出された全RNA（溶解物）を用いて、実施例７に記載した方法に従ってＲＴ−ＰＣＲ法を行うことにより、各種組織における当該遺伝子の発現量を確認した。
その結果、ヘテロ接合型マウス個体の各種の脂肪組織（精巣周囲脂肪組織、後腹膜脂肪組織、腸間膜脂肪組織、皮下脂肪組織、褐色脂肪組織）及びその他の組織（血管、肝臓、筋肉組織）では、野生型マウス個体の同組織に比して、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質遺伝子の発現量が減少していることが確認された（表１参照）。尚、表１中の各種組織における当該遺伝子の発現量は、マウス３６Ｂ４遺伝子（acidic ribosomal phosphoprotein PO (Arbp)）の発現量を基準として補正された値である。
(Confirmation of the expression level of fat accumulation promoting protein gene having a molecular weight of about 6,000 or more in each tissue by RT-PCR analysis)
A wild-type mouse tissue and a heterozygous mouse tissue (progeny animals of F1 or later created from ES cells in which homologous recombination has occurred on a genomic gene of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more). Tissues collected from an individual (about 18 weeks old) were separately homogenized in TRIzol RNA reagent (GIBCO-BRL), and total RNA was extracted according to the standard method of the same. Using the extracted total RNA (lysate), RT-PCR was performed according to the method described in Example 7 to confirm the expression level of the gene in various tissues.
As a result, various adipose tissues (peritesticular adipose tissue, retroperitoneal adipose tissue, mesenteric adipose tissue, subcutaneous adipose tissue, brown adipose tissue) and other tissues (blood vessels, liver, muscle tissue) of heterozygous mouse individuals As a result, it was confirmed that the expression level of a fat accumulation promoting protein gene having a molecular weight of about 6,000 or more was reduced as compared to the same tissue of a wild-type mouse individual (see Table 1). The expression level of the gene in various tissues in Table 1 is a value corrected based on the expression level of the mouse 36B4 gene (acidic ribosomal phosphoprotein PO (Arbp)).
（ＤＩＯ（食餌性肥満誘導）試験条件下における病態観察と解析）
1) ES細胞から創製したＦ１以降の子孫動物の雄のヘテロ接合型マウス個体、および野生型マウス個体について、それぞれを体重平均値が同程度になるように普通食群（Std食群）と高脂肪・高蔗糖食群（ＨＨ食群）に分け、約８週齢以降からは約３０週間、普通食（D12328(Research Diets社製)）若しくは、高脂肪食（D12331(Research Diets社製)）を自由に摂取させた。
2) マウスを飼育し、状態観察および剖検（採材）を行った。飼育する際の環境条件は室温20〜26℃、湿度40〜70%、明暗各12時間（照明：午前6時〜午後6時）、換気回数12回／時に維持された飼育室にてステンレス製六連ケージ（W：750×D：100×H：100mm）内での個別飼育を実施した。表２に各条件のマウスの群わけを示した。
(Observation and analysis of pathological conditions under DIO (dietary obesity induction) test conditions)
1) Male heterozygous mouse individuals and wild-type mouse individuals of F1 or later progeny animals created from ES cells were higher in the normal diet group (Std diet group) so that the average body weight was almost the same. Divided into a fat / high sucrose diet group (HH diet group), and after about 8 weeks of age, for about 30 weeks, a normal diet (D12328 (Research Diets)) or a high fat diet (D12331 (Research Diets)) Was given ad libitum.
2) The mice were bred, and their condition observation and necropsy (collection) were performed. Environmental conditions for rearing are room temperature 20-26 ° C, humidity 40-70%, light and dark for 12 hours each (lighting: 6:00 am to 6:00 pm), stainless steel in a breeding room maintained at a ventilation rate of 12 times / hour. Individual breeding was carried out in six cages (W: 750 x D: 100 x H: 100 mm). Table 2 shows the groups of mice under each condition.
3) 病態観察試験方法及び結果を以下に示す。
(1) 体重測定について食餌負荷期間中は、2週間に1回実施した。
(2) 血糖値測定について食餌負荷期間中は、5時間絶食後の測定を2週間に1度実施した。また、食餌負荷前(８週齢)および２７週間食餌負荷後（３７週齢）については、24時間絶食後の測定を実施した。採血日に摂水下にて絶食した動物の眼窩静脈叢からヘパリン加キャピラリーを用いて、約50μL血液を採取し、アントセンスII（ダイキン工業株式会社）を用いて酸素電極法にて全血の血糖値を測定した。
(結果）
以上の結果、ヘテロ接合型マウス群は野生型マウス群に比して、食餌性肥満誘導の有無に因らず、血糖値が高い傾向があり、特にHH食群の24時間絶食条件においては有意な高血糖であった（図３）。
3) The pathological observation test method and results are shown below.
(1) The body weight was measured once every two weeks during the diet load period.
(2) Blood glucose measurement During the diet load period, measurement after a 5-hour fast was performed once every two weeks. In addition, before the food loading (8 weeks old) and after the food loading for 27 weeks (37 week old), the measurement after a 24-hour fast was performed. Approximately 50 μL of blood was collected from the orbital venous plexus of an animal fasted under water on the day of blood collection using a heparinized capillary, and whole blood was collected by an oxygen electrode method using Antsense II (Daikin Industries, Ltd.). Blood glucose was measured.
(result)
As a result, the heterozygous mice group tended to have higher blood glucose levels than the wild-type mice group, regardless of the presence or absence of dietary obesity induction, and were significantly significant especially in the HH diet group under the 24-hour fasting condition. High blood sugar (Fig. 3).
4) 耐糖能試験については以下の方法で行った。
（1）糖負荷試験（OGTT）：長期間食餌負荷を実施した後（約２５週間）、前日から摂水下で18〜24時間絶食した動物にグルコース溶液（1g/kg、10mL/kg）を経口投与（ディスポーザブル金属性ゾンデを装着したポリプロピレン製ディスポーザブル注射筒）した。グルコース投与前、グルコース投与後20、60および120分後に上記（2）の方法にて全血の血糖値を測定した。なお、各測定時間における血糖値から曲線下面積値（AUC(area under the curve)）を算出した。
（2）インスリン負荷試験（ipITT）：上記OGTTを実施後、2週間程度間隔をおいて実施した。前日から摂水下で18〜24時間絶食した動物にインスリン溶液（0.35U/kg、10mL/kg）を腹腔内投与（注射針を装着したポリプロピレン製ディスポーザブル注射筒）した。インスリン負荷直前、30、60および120分後に上記-1）の方法にて血糖値を測定した。なお、各測定時間における血糖値から曲線下面積値（AUC(area under the curve)）を算出した。
（結果）
OGTTではヘテロ接合型マウス群は野生型マウス群に比して、Std食飼育群のグルコース投与60分後、またＨＨ食飼育群のグルコース投与120分後に有意な高血糖であった（表３）。また、ipITTを実施し同様に比較したところ、Std食飼育群のグルコース投与30、120分後に高血糖が認められた（表４）。これらの結果から食餌性肥満誘導の有無に因らず、ヘテロ接合型マウス群はインスリン感受性（耐糖能）が低下していた。
4) The glucose tolerance test was performed by the following method.
(1) Glucose tolerance test (OGTT): After a long-term dietary load (about 25 weeks), a glucose solution (1 g / kg, 10 mL / kg) was given to animals fasted for 18 to 24 hours under water from the day before. Oral administration (a disposable syringe made of polypropylene equipped with a disposable metallic sonde) was performed. The blood glucose level of whole blood was measured by the method (2) before glucose administration, and at 20, 60 and 120 minutes after glucose administration. The area under the curve (AUC) was calculated from the blood glucose level at each measurement time.
(2) Insulin tolerance test (ipITT): The OGTT was performed at intervals of about two weeks after the OGTT was performed. Animals that had been fasted for 18 to 24 hours under water from the day before were administered an insulin solution (0.35 U / kg, 10 mL / kg) intraperitoneally (a disposable polypropylene syringe with a needle attached). Immediately before, after 30, 60 and 120 minutes after the insulin load, the blood glucose level was measured by the above-mentioned method -1). The area under the curve (AUC) was calculated from the blood glucose level at each measurement time.
(result)
In OGTT, the heterozygous mouse group had significant hyperglycemia 60 minutes after glucose administration in the Std diet-fed group and 120 minutes after glucose administration in the HH diet-fed group as compared to the wild-type mouse group (Table 3). . In addition, when ipITT was performed and compared in the same manner, hyperglycemia was observed 30 and 120 minutes after administration of glucose in the Std diet-fed group (Table 4). These results indicate that the heterozygous group of mice had reduced insulin sensitivity (glucose tolerance) regardless of the presence or absence of dietary obesity induction.
5）剖検：上記4)-1）及び2)を実施した後、2週間程度間隔をおいて剖検を実施した。摂水下で約5時間絶食後、ペントバルビタール（30mg/mL、2mL/kg）麻酔下にて、腹部大動脈から全採血（約0.6〜0.8mL）行った。採取した血液（全血）を用いて3)(2)の方法にて血糖値を測定し、残りの血液は採血後30分以内に遠心分離（14〜20℃、3000rpm、15分間）して血清と血餅を分離した後、血清部分を氷冷チューブに分注・凍結(-80℃)保存した。採血後、肝臓、腎臓、腸間膜脂肪、精巣周囲脂肪、皮下脂肪、背部褐色脂肪、胸部大動脈、右側大腿部筋肉、精巣もしくは卵巣・子宮および膵臓を摘出した。摘出後の操作については以下に記載する。
肝臓、腸間膜脂肪および背部褐色脂肪は重量測定後、一部を液体窒素にて凍結、残りを10％中性緩衝ホルマリンで固定した。精巣周囲脂肪、皮下脂肪および腎臓は重量測定後、同様に凍結した。胸部大動脈および生殖器は同様に凍結した。大腿部筋肉は一部を同様に凍結し、残りをホルマリンで固定した。膵臓はホルマリンで固定した。
5) Necropsy: After performing the above 4) -1) and 2), necropsy was performed at intervals of about two weeks. After fasting under water for about 5 hours, whole blood was collected from the abdominal aorta (about 0.6 to 0.8 mL) under pentobarbital (30 mg / mL, 2 mL / kg) anesthesia. The blood glucose level is measured using the collected blood (whole blood) by the method of 3) (2), and the remaining blood is centrifuged (14-20 ° C, 3000 rpm, 15 minutes) within 30 minutes after blood collection. After separating the serum and the clot, the serum portion was dispensed into an ice-cold tube and stored frozen (-80 ° C). After blood collection, liver, kidney, mesenteric fat, peritesticular fat, subcutaneous fat, back brown fat, thoracic aorta, right thigh muscle, testis or ovary / uterus and pancreas were removed. The operation after the extraction is described below.
After weighing the liver, mesenteric fat and back brown fat, a part was frozen with liquid nitrogen, and the rest was fixed with 10% neutral buffered formalin. Peritesticular fat, subcutaneous fat and kidney were similarly frozen after weighing. The thoracic aorta and genitals were frozen as well. A portion of the thigh muscle was similarly frozen and the rest was fixed with formalin. The pancreas was fixed with formalin.
6)血清パラメータの解析： 前記5）で野生型マウス、及び、ヘテロ接合型マウスから採取し冷凍保存した血清はグルコース濃度（Glu(mg/100ml)）、総コレステロール濃度（T-Cho(mg/100ml)）、HDLコレステロール(HDL-Cho(mg/100ml))、リン脂質（PL(mg/100ml)の測定に供した。その結果、Std食、HH食条件に関わらず、ヘテロ接合型マウス群は野生型マウス群に比して血中コレステロール（T-Cho,HDL-Cho）量、およびリン脂質値が上昇していた（図４、図５および図６）。 6) Analysis of serum parameters: Serum collected from wild-type mice and heterozygous mice and frozen and stored in 5) was glucose concentration (Glu (mg / 100 ml)) and total cholesterol concentration (T-Cho (mg / 100ml)), HDL cholesterol (HDL-Cho (mg / 100ml)), and phospholipid (PL (mg / 100ml). As a result, regardless of the conditions of the Std diet and the HH diet, the heterozygous mice group Showed increased blood cholesterol (T-Cho, HDL-Cho) levels and phospholipid levels as compared to the wild-type mouse group (FIGS. 4, 5 and 6).
7）RT-PCR分析法による、各組織 (2μg単位あたり)における配列番号１で表される脂肪蓄積促進蛋白質遺伝子の発現量の確認は、４）で採材し冷凍保存した、Std食またはHH食負荷条件下で長期飼育した 約38週齢の野生型マウス群、及び、ヘテロ接合型マウス群の組織を用いて、実施例８と同じ方法で実施した。
その結果、配列番号１で表される脂肪蓄積促進因子の遺伝子発現は褐色脂肪組織で最も高く、かつ遺伝子型を反映していた、すなわち野生型と比較して、発現量がほぼ半分であった。一方、肝臓における発現量は顕著に低く、褐色脂肪組織における発現量の約1/30-50倍であり、かつ遺伝子型を反映しないものであった。また、HH食負荷によって野生型マウス群の腸間膜脂肪組織と肝臓では有意な発現増加が認められた。褐色脂肪には食餌負荷による影響は無かった（表５）。
7) RT-PCR analysis was used to confirm the expression level of the fat accumulation promoting protein gene represented by SEQ ID NO: 1 in each tissue (per 2 μg unit). The procedure was performed in the same manner as in Example 8 using the tissues of a wild-type mouse group and a heterozygous mouse group of about 38 weeks of age that were reared for a long time under food load conditions.
As a result, the gene expression of the fat accumulation promoting factor represented by SEQ ID NO: 1 was highest in brown adipose tissue and reflected the genotype, that is, the expression level was almost half as compared with the wild type. . On the other hand, the expression level in the liver was remarkably low, about 1 / 30-50 times that in brown adipose tissue, and did not reflect the genotype. In addition, the HH diet load significantly increased the expression in the mesenteric adipose tissue and liver of the wild-type mouse group. Brown fat was not affected by dietary load (Table 5).
（肝臓中の中性脂肪蓄積量測定）
肝臓組織からの中性脂肪抽出については、実施例９の5）で野生型マウス、及び、ヘテロ接合型マウスから採材し、冷凍保存した肝臓の約0.2g（実測値をXｇとする）を切り取り1.5mlのPBS(phosphate buffered saline,GIBCO社)内で、各々別々にポリトロン(KINEMATICA社製PT10/35型)を用いてホモジナイズ(出力メモリ７、10秒間)し、これに10mlのクロロホルム・メタノール（２：１）を添加して激しく攪拌した。さらに4℃にて2時間以上放置した後、遠心分離（2500rpm、１０分間）を実施して、浮き上がった固形層を除去した。これに4mMのMgCl2を３ｍｌ添加して攪拌し、室温にて30分間放置後、遠心分離（2500rpm、１０分間）を実施したものの下層液の容量を読み取り（実測値をYｍｌとする）、このうち0.1mlをエッペンに分取した。分取した下層液の溶媒をスピードバックにて揮発させ、残った溶質に0.2mlのイソプロパノールを加えて溶解し、これを中性脂肪抽出液とした。
中性脂肪抽出液に含まれる中性脂肪量の測定については、トリグリセライド−テストワコー（和光純薬社製）を用い、同社の標準的な方法に従って実施したが、肝臓からの抽出液を検体とする場合の容量と中性脂肪量の概算方法を以下に記す。
中性脂肪抽出液0.2mlに耳掻き1杯程度の吸着剤を添加、５秒間攪拌後、5分間静置する操作を３回繰り返した後、遠心分離（室温、10,000rpm、5分間）した上清の0.1mlを新しいエッペンに分取した。分取した中性脂肪抽出液と検量線作成用基準液希釈列(0‐200mg/dl,各0.1ml)に5%KOHを45μl添加し、５秒間攪拌後、37℃にて15分間静置、次いで緩衝液0.1mlと酸化剤0.01mlの混合液を添加し、5秒間攪拌後、37℃にて15分間静置、さらに発色試薬を0.2ml添加し、５秒間攪拌後、37℃にて40分間静置した後、3分間冷却して発色反応を止めた。発色反応後のサンプルの内0.2mlをコースター96穴プレート（黒）に分取し、405nmの吸光度を測定した（実測値をOD405nmとする）。反応後の基準液希釈列サンプルの吸光度（OD405nm）から検量線を作成して、中性脂肪抽出液における中性脂肪量を換算した（換算値をZmg/dlとする）。上記X、Y、Zの実測値から、それぞれの肝臓組織に含まれていた中性脂肪量(mg/g組織)＝２YZ/100Xを換算することができた。ただし、著しく中性脂肪が多いサンプルについては中性脂肪抽出液の段階で約16倍程度まで希釈することによって、本系に対応するように調整して測定を実施した。
その結果、野生型マウス群についてはStd食飼育に比してHH食飼育条件下では肝臓中の中性脂肪量が約２倍に増加し、ヘテロ接合型マウス群については約３倍に増加した（図７）。
すなわち、食事性肥満誘導条件下において、分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質のヘテロ接合型マウスは野生型に比して、肝臓中性脂肪の蓄積が有意に１．６倍増加しており、脂肪肝様病態の亢進が認められた。
(Measurement of triglyceride accumulation in liver)
Regarding the extraction of neutral fat from liver tissue, about 0.2 g of the liver, which was collected from wild-type mice and heterozygous mice in Example 9-5) and stored frozen, (the measured value is Xg). In 1.5 ml of PBS (phosphate buffered saline, GIBCO), each was separately homogenized (output memory 7, 10 seconds) using Polytron (PT10 / 35 manufactured by KINEMATICA), and 10 ml of chloroform / methanol was added thereto. (2: 1) was added and stirred vigorously. After leaving at 4 ° C. for 2 hours or more, centrifugation (2500 rpm, 10 minutes) was performed to remove the floating solid layer. To this, 3 ml of 4 mM MgCl2 was added, stirred, left at room temperature for 30 minutes, centrifuged (2500 rpm, 10 minutes), and the volume of the lower layer solution was read (the measured value was Yml). 0.1 ml was dispensed into an eppen. The solvent of the fractionated lower layer solution was volatilized by a speed bag, and 0.2 ml of isopropanol was added to the remaining solute to dissolve it. This was used as a neutral fat extract.
The amount of neutral fat contained in the neutral fat extract was measured using triglyceride-Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) according to the company's standard method. The method for estimating the amount of triglyceride and the amount of triglyceride are described below.
Add about 1 cup of adsorbent to the neutral fat extract (0.2 ml), stir for 5 seconds, stir for 5 minutes,
As a result, the amount of triglyceride in the liver of the wild-type mouse group increased about 2-fold under the HH diet-raising condition compared to that of the Std diet-raising, and about 3-fold increased in the heterozygous mouse group. (FIG. 7).
That is, under the conditions of inducing dietary obesity, the heterozygous mice of the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more showed a significant 1.6-fold increase in hepatic triglyceride accumulation as compared with the wild type. And increased fatty liver-like pathology was observed.
（RT-PCR分析法による、各組織における病態関連因子の発現レベル解析）
各組織 (2μg単位あたり)における病態関連因子の発現レベル解析は実施例10‐７）と同じ方法で実施した。ＰＣＲ用のプライマーとしては、表６に記載されたものを用いた。
(Analysis of expression levels of disease-related factors in each tissue by RT-PCR analysis)
The analysis of the expression level of the pathological condition-related factor in each tissue (per 2 μg unit) was performed in the same manner as in Example 10-7). As the primers for PCR, those described in Table 6 were used.
腸間膜脂肪組織ではStd食およびHH食飼育野生型マウス群に比しヘテロ接合型マウス群ではACO（acyl-CoA oxidase）の有意な発現亢進が認められた（図８）。これは分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の遺伝子型と相反するものであった。精巣周囲脂肪における発現も同様のパターン（図９）を示した。
また、肝臓においてはヘテロ接合型マウス群では、食餌条件に関わらず 肝臓のＰＥＰＣＫ(phosphoenolpyruvate carboxykinase)の発現亢進が認められた（図１０）。またStd食飼育条件下ではＧ６Ｐ( glucose-6-phosphatase)の発現亢進が認められた（図１０）。
さらに褐色脂肪組織でも食餌条件に関わらずＵＣＰ１(uncoupling protein 1)とＦＡＳ( fatty acid synthase)に有意な発現亢進が認められた（図１１）。これらは分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の遺伝子型と相反するものであった。
In the mesenteric adipose tissue, the expression of ACO (acyl-CoA oxidase) was significantly increased in the heterozygous mouse group as compared with the wild-type mouse group bred on the Std diet and the HH diet (FIG. 8). This was inconsistent with the genotype of the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more. Expression in peritesticular fat showed a similar pattern (FIG. 9).
In the liver, in the group of heterozygous mice, increased expression of hepatic PEPCK (phosphoenolpyruvate carboxykinase) was observed regardless of the dietary conditions (FIG. 10). Further, under the conditions of Std diet breeding, increased expression of G6P (glucose-6-phosphatase) was observed (FIG. 10).
Further, even in brown adipose tissue, significant increase in expression of UCP1 (uncoupling protein 1) and FAS (fatty acid synthase) was observed regardless of dietary conditions (FIG. 11). These were incompatible with the genotype of the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more.
〔統計学的方法〕
上記各実施例において、統計的解析は群ごとに平均値±標準誤差を算出し、有意差検定は、市販の統計プログラムを用いて、Std食またはHH食についてヘテロ接合型マウス群と野生型群の2群間で行い、ｔ検定の値は10%未満（P＜0.10）についてのみ併記した。
(Statistical method)
In each of the above examples, the statistical analysis calculates the average value ± standard error for each group, and the significance test is performed using a commercially available statistical program, using a heterozygous mouse group and a wild type group for the Std diet or the HH diet. And t-test values are less than 10% (P <0.10) only.
配列番号３
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号４
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号８
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号９
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１０
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１１
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１３
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１４
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１５
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１６
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１７
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１８
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１９
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号２０
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号２１
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号２２
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号２３
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号２４
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号２５
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
SEQ ID NO: 3
Oligonucleotide SEQ ID NO: 4, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 5, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 6, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 7, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 8, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 9, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 10, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 11, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 12, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 13, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 14, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 15, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 16, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 17, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 18, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 19, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 20, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 21, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 22, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 23, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 24, a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 25, a primer designed for PCR
Oligonucleotides, primers designed for PCR
Claims (36)
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号1で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号1で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号1で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸が欠失してなる部分アミノ酸配列、
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されてなるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号1で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列における第１番目のヌクレオチドから第１４７６番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号２で示される塩基配列における第１番目のヌクレオチドから第１４７６番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号２で示される塩基配列における第１番目のヌクレオチドから第１４７６番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｉ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列； The non-human animal or a part thereof according to claim 1, wherein the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more is a protein having any of the following amino acid sequences and having fat accumulation promoting activity. .
<Amino acid sequence>
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in which one or more amino acids have been deleted, added or substituted,
(C) a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(D) an amino acid sequence obtained by adding methionine to the amino terminus of the amino acid sequence of (c);
(E) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(F) an amino acid sequence encoded by a DNA having a nucleotide sequence represented by the first nucleotide to the 1476th nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2,
(G) encoded by a DNA having a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides 1 to 1476 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence,
(H) hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence from the first nucleotide to the 1476th nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under stringent conditions Amino acid sequence encoded by DNA (i) Amino acid sequence encoded by DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 2;
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号1で示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号1で示されるアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、付加もしくは置換されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号1で示されるアミノ酸配列において、そのアミノ末端から２６個のアミノ酸が欠失してなる部分アミノ酸配列、
（ｄ）前記（ｃ）のアミノ酸配列において、そのアミノ末端にメチオニンが付加されてなるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号1で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列における第１番目のヌクレオチドから第１４７６番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号２で示される塩基配列における第１番目のヌクレオチドから第１４７６番目までのヌクレオチドで示される塩基配列を有するＤＮＡと８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号２で示される塩基配列における第１番目のヌクレオチドから第１４７６番目までのヌクレオチドで示される塩基配列と相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｉ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列； The non-human animal or a part thereof according to claim 10, wherein the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more is a protein having any one of the following amino acid sequences and having a fat accumulation promoting activity. .
<Amino acid sequence>
(A) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in which one or more amino acids have been deleted, added or substituted,
(C) a partial amino acid sequence obtained by deleting 26 amino acids from the amino terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(D) an amino acid sequence obtained by adding methionine to the amino terminus of the amino acid sequence of (c);
(E) an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(F) an amino acid sequence encoded by a DNA having a nucleotide sequence represented by the first nucleotide to the 1476th nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2,
(G) encoded by a DNA having a nucleotide sequence having 80% or more sequence identity with a DNA having a nucleotide sequence represented by nucleotides 1 to 1476 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence,
(H) hybridizes with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence from the first nucleotide to the 1476th nucleotide in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under stringent conditions Amino acid sequence encoded by DNA (i) Amino acid sequence encoded by DNA having the base sequence of SEQ ID NO: 2;
（ａ）通常飼育もしくは高カロリー食餌での飼育により、野生型非ヒト動物と比較して高血糖値を示す
（ｂ）通常飼育もしくは高カロリー食餌での飼育により、野生型非ヒト動物と比較して耐糖能低下を示す
（ｃ）高カロリー食餌での飼育により野生型非ヒト動物と比較して高血中コレステロール量を示す
（ｄ）高カロリー食餌での飼育により野生型非ヒト動物と比較して肝臓において高トリグリセライド量を示す
（ｅ）野生型非ヒト動物と比較して、糖脂質代謝関連因子の発現量が変動する The non-human animal according to any one of claims 1 to 11, or a part thereof, which expresses one or more properties selected from the following groups (a) to (e).
(A) shows higher blood sugar levels compared to wild-type non-human animals when bred normally or bred on a high calorie diet; (b) compared to wild-type non-human animals when bred normally or bred on a high calorie diet (C) shows higher blood cholesterol levels compared to wild-type non-human animals when bred on a high calorie diet; (d) shows higher cholesterol levels compared to wild-type non-human animals when bred on a high calorie diet (E) shows high triglyceride levels in the liver, and the expression level of glycolipid metabolism-related factors fluctuates compared to wild-type non-human animals
（１）請求項１〜１４のいずれか記載の非ヒト動物又はその一部に被験物質を接触させる第一工程、
（２）前記被験物質を接触させた非ヒト動物又はその一部における分子量約６千以上である脂肪蓄積促進蛋白質の発現量又は当該量に相関関係を有する指標値を測定し、対照と比較する第二工程、
（３）（２）の比較結果に基づき、被験物質の糖脂質代謝制御能力を評価する第三工程
を有することを特徴とする評価方法。 A method for evaluating glycolipid metabolism controlling ability,
(1) a first step of bringing the test substance into contact with the non-human animal or a part thereof according to any one of claims 1 to 14,
(2) The expression level of a fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more in a non-human animal or a part thereof contacted with the test substance or an index value having a correlation with the amount is measured and compared with a control. The second step,
(3) An evaluation method comprising a third step of evaluating the ability of the test substance to control glycolipid metabolism based on the comparison result of (2).
A non-human animal or a part thereof according to any one of claims 1 to 14, or a SA (splicing accepter) derived from mouse EN2, from encephalomyocarditis Virus to create a totipotent cell according to claim 15 or 16. DNA (SA-IRIS-βgeo-pA gene cassette) obtained by blunt-ending SV40-derived pA (polyadenylation signal) to βgeo obtained by fusing IRES (internal ribosome entry site), β-galactocidase and neomycin resistance gene And a promoterless recombinant vector having a base sequence homologous to a part of the DNA of the genomic gene of the fat accumulation promoting protein having a molecular weight of about 6,000 or more.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
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- 2003-10-17 JP JP2003357443A patent/JP2004154135A/en active Pending
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|---|---|---|---|---|
| JP2007124983A (en) * | 2005-11-07 | 2007-05-24 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Standard gene for standardizing amount of gene expression |
| JP2013015479A (en) * | 2011-07-06 | 2013-01-24 | Kao Corp | Method for evaluating adipose tissue |
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