JP2006075157A - Knockout nonhuman animal - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a knockout nonhuman animal by considering circumstances of the creation of an animal model by the identification of a new causative gene and deficiency of the gene being important for the development of a therapeutic method of allergic disease. <P>SOLUTION: The knockout nonhuman animal or a part thereof is the individual of the knockout nonhuman animal or a descendant animal or a part thereof, obtained by substituting the whole or one allele in a diploid of PHF3 gene with a function-deficient/reduced type mutant gene, or by breaking/recombining the function of the whole or one allele in the diploid of the genome gene. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、ノックアウト非ヒト動物等に関する。更に詳しくは、本発明は、ノックアウト非ヒト動物の個体又はその子孫動物或いはそれらの一部であって、ＰＨＦ３遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失・低下するように破壊・組換されてなることを特徴とする非ヒト動物又はその一部、当該非ヒト動物又はその一部の作成に不可欠なＥＳ細胞等の分化全能性細胞、及びそれらの利用等に関するものである。本発明は、アトピー性皮膚炎発症を伴う疾患等に対する医薬品・食品等の開発等の分野において有用である。   The present invention relates to a knockout non-human animal or the like. More specifically, the present invention relates to a knockout non-human animal individual or a progeny animal thereof or a part thereof, wherein all or one allele in the diploid of the PHF3 gene is a loss-of-function / decreasing mutant gene. A non-human animal or a part thereof, wherein the non-human animal or a part thereof is substituted or destroyed or recombined so that all or one allele in the diploid of the genomic gene lacks or reduces its function, The present invention relates to totipotent cells such as ES cells that are indispensable for the production of non-human animals or parts thereof, and their use. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is useful in fields such as the development of pharmaceuticals and foods for diseases associated with the development of atopic dermatitis.

アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎等のアレルギー疾患は、正常人が反応しない環境抗原等に対して過敏に反応を示し、イムノグロブリンＥを介した炎症機構により、各臓器に障害が現れる疾患である。現在、アレルギー疾患の治療には主として、抗原からの回避、ヒスタミン等のメディエーターの遊離抑制薬及びそれらメディエーターの受容体の結合に拮抗する抗ヒスタミン剤等や、抗炎症作用を有するステロイド剤又は免疫調整剤等によるものが知られているが、これらは当該疾患の対症療法であり、より根本的な治療方法が望まれている。
アレルギー疾患の発症に関与するゲノム領域は多岐に渡り、これらに対応する疾患原因遺伝子は多数存在する（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４参照）。更に発症に関与すると同定されるゲノム領域が報告により異なることから、この疾患が複雑なメカニズムにより成立することが示唆される。尚、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎等のアレルギー疾患と関連するゲノム領域は互いに重複しており、これらの疾患は少なくとも一部に共通したメカニズムが関与している。
当該アレルギー疾患に関与するゲノム領域のうち一部は、原因遺伝子やその生理的なメカニズムが明らかになっている。例えば、ゲノム領域5q31には、サイトカインIL-4遺伝子がコードされ、この遺伝子の変異がアトピー性皮膚炎の重症度と関連することが知られている（例えば、非特許文献４、非特許文献５参照）。IL-4,5,13等のいわゆるTh2サイトカイン遺伝子は、ヘルパーＴ2細胞が活性化されると分泌が促進され、これらサイトカインがＢ細胞を刺激することによって、イムノグロブリンＥの発現上昇を伴うアレルギー反応が起きる。
しかしながら、多くのゲノム領域については原因遺伝子が解明されていなかったり生理的なメカニズムが不明であり、アレルギー疾患の発症機構の全貌は十分には明らかにされていない。よって、アレルギー疾患に関わる遺伝子を新規に同定することは、発症機構の新たな側面を知ることに繋がり、アレルギー疾患の治療法を開発する上で極めて重要である。
尚、ＰＨＦ３タンパク質の遺伝子は、ヒト神経膠腫において発現が減少する遺伝子としてクローニングされた（例えば、非特許文献６参照）。当該タンパク質は、ＰＨＤドメイン（ジンクフィンガードメインの一種）を有するという特徴から、PHD finger domain 3と命名された。しかしながら、アトピー性皮膚炎又はそのアトピー性皮膚炎関連因子と、ＰＨＦ３タンパク質との関係は知られていなかった。 Allergic diseases such as atopic dermatitis, asthma, allergic rhinitis, and allergic conjunctivitis are sensitive to environmental antigens, etc. that normal people do not react with. It is a disease that manifests a disability. Currently, treatment of allergic diseases mainly includes avoidance from antigens, mediator release inhibitors such as histamine and antihistamines that antagonize the binding of these mediator receptors, steroids or immunomodulators with anti-inflammatory effects, etc. Although these are known, these are symptomatic treatments for the disease, and a more fundamental treatment method is desired.
There are a wide variety of genomic regions involved in the development of allergic diseases, and there are many disease-causing genes corresponding to these (see, for example, Non-Patent Document 1, Non-Patent Document 2, Non-Patent Document 3, and Non-Patent Document 4). Furthermore, the genomic region identified to be involved in the onset varies from report to report, suggesting that this disease is established by a complex mechanism. It should be noted that genomic regions related to allergic diseases such as atopic dermatitis, asthma, allergic rhinitis, and allergic conjunctivitis overlap with each other, and these diseases involve at least a common mechanism.
A part of the genomic region involved in the allergic disease has revealed the causative gene and its physiological mechanism. For example, the genomic region 5q31 encodes a cytokine IL-4 gene, and it is known that mutations in this gene are associated with the severity of atopic dermatitis (for example, Non-Patent Document 4 and Non-Patent Document 5). reference). So-called Th2 cytokine genes such as IL-4,5,13, etc., are secreted when helper T2 cells are activated, and these cytokines stimulate B cells to cause allergic reactions with increased expression of immunoglobulin E. Happens.
However, for many genomic regions, the causative gene has not been elucidated or the physiological mechanism is unknown, and the entire mechanism of the onset of allergic diseases has not been fully clarified. Therefore, new identification of genes related to allergic diseases leads to knowing new aspects of the onset mechanism and is extremely important in developing therapeutic methods for allergic diseases.
In addition, the gene of PHF3 protein was cloned as a gene whose expression decreases in human glioma (for example, refer nonpatent literature 6). The protein was named PHD finger domain 3 because it has a PHD domain (a kind of zinc finger domain). However, the relationship between atopic dermatitis or its atopic dermatitis-related factor and PHF3 protein has not been known.

一方、アレルギー疾患の治療薬の開発には動物実験が不可欠で、特にアトピー性皮膚炎のモデル動物が希求されている。近年、ＮＣ／Ｎｇａマウス、ＮＯＡマウス、C57BL/Ka cpdm/cpdmマウス、Ds-Nhマウスが自然発症によるアトピー性皮膚炎のモデル動物として注目されている（例えば、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０参照）。これらモデル動物は変異遺伝子が同定されていないという改善すべき点がある。
またアトピー性皮膚炎のモデル動物としては、遺伝子改変によるTNP-IgE トランスジェニックマウス、IL-18 トランスジェニックマウス、Caspase-1 トランスジェニックマウス、カテプシンＥノックアウトマウスも知られている（例えば、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４参照）。これらモデル動物は、アトピー性皮膚炎に関与することが既知である遺伝子を過剰発現したり欠損させることにより発症させているものであるため、前述の如く、更に新たな原因遺伝子の遺伝子欠損によるモデル動物が得られれば、アトピー性皮膚炎等の治療法、具体的には新規な薬剤、等を開発する上で極めて有用である。 On the other hand, animal experiments are indispensable for the development of therapeutic drugs for allergic diseases, and in particular, a model animal for atopic dermatitis is desired. In recent years, NC / Nga mice, NOA mice, C57BL / Ka cpdm / cpdm mice, and Ds-Nh mice have attracted attention as model animals for spontaneous atopic dermatitis (for example, Non-patent Document 7 and Non-Patent Document 8). Non-patent document 9 and Non-patent document 10). These model animals have an improvement point that the mutant gene has not been identified.
Further, as model animals for atopic dermatitis, TNP-IgE transgenic mice, IL-18 transgenic mice, Caspase-1 transgenic mice, and cathepsin E knockout mice by genetic modification are also known (for example, non-patent documents). 11, Non-Patent Document 12, Non-Patent Document 13, and Non-Patent Document 14). Since these model animals are developed by overexpression or deletion of a gene known to be involved in atopic dermatitis, as described above, a model based on a gene deletion of a new causative gene as described above. Once an animal is obtained, it is extremely useful in developing a therapeutic method for atopic dermatitis, specifically a new drug.

Halapi et al.、Curr Opin Pulm Med.、10:22-30、2004Halapi et al., Curr Opin Pulm Med., 10: 22-30, 2004 Lee et al.、Nat Genet.、26:470-473、2000Lee et al., Nat Genet., 26: 470-473, 2000 Cookson et al.、Lancet、1:1292-1295Cookson et al., Lancet, 1: 1292-1295 Bradley et al.、Hum. Mol. Genet.、11;1539-1548、2002Bradley et al., Hum. Mol. Genet., 11; 1539-1548, 2002 Novak et al.、J. Invest. Dermatol.、119:870-875、2002Novak et al., J. Invest. Dermatol., 119: 870-875, 2002 Fischer et al.、Cytogenet Cell Genet.、94：131-136、2001Fischer et al., Cytogenet Cell Genet., 94: 131-136, 2001 板倉敦子ら、最新医学、53巻:2848-2854、1998Kyoko Itakura et al., Latest Medicine, 53: 2848-2854, 1998 Mouse Genome、95:698-700、1997Mouse Genome, 95: 698-700, 1997 HogenEsch et al.、Am J Pathol.、143:972-982、1993HogenEsch et al., Am J Pathol., 143: 972-982, 1993 Hikita et al.、J Dermatol Sci.、 30:142-153、2002Hikita et al., J Dermatol Sci., 30: 142-153, 2002 Matsuoka et al.、Int Immunol.、11:987-994、1999Matsuoka et al., Int Immunol., 11: 987-994, 1999 Yoshimoto et al.、Nat Immunol.、1:132-137、2000Yoshimoto et al., Nat Immunol., 1: 132-137, 2000 Yamanaka et al.、J Immunol.、165:997-1003、2000Yamanaka et al., J Immunol., 165: 997-1003, 2000 Tsukuba et al.、J Biochem (Tokyo).、134:893-902、2003Tsukuba et al., J Biochem (Tokyo)., 134: 893-902, 2003.

以上のように、アレルギー疾患の治療法の開発には、新たな原因遺伝子の同定及び遺伝子欠損のよるモデル動物の作製が重要である。
本発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、上記のようなノックアウト非ヒト動物等を提供することを課題としている。 As described above, identification of a new causative gene and production of a model animal by gene deletion are important for the development of a treatment method for allergic diseases.
This invention is made | formed in view of the above situations, Comprising: It aims at providing the above knockout non-human animals.

本発明者らは、かかる状況のもと鋭意検討した結果、ＰＨＦ３遺伝子改変においては、当該ゲノム遺伝子改変をおこなう動物のＥＳ細胞等の分化全能性細胞の染色体上の目的とする遺伝子をプロモータトラップ法（例えば、選択マーカー遺伝子のプロモーター領域を取り除いたターゲティングベクター（選択マーカー遺伝子プロモーターレス組換えベクター））を用いて、染色体上の目的遺伝子の一部をターゲティングベクターに置き換える相同的組換え法）により破壊・組換し、これを親動物の胚盤胞に混入させた後、胚分化を継続させて出産させた仔であるキメラ原始マウスを作出することが可能になり効果的であることを見出した。
更に、前記キメラ原始マウスを繁殖させて作出した子孫（以下本明細書において、前記キメラ原始マウス及びその子孫を本発明ノックアウトマウスと称する場合がある。）を用いて鋭意検討した結果、
本発明ノックアウトマウスでは、痂皮形成、皮膚真皮層への細胞浸潤が高頻度で観察され、更に血中総イムノグロブリンＥ濃度が極めて高いことが判明したことから、本動物はアトピー性皮膚炎発症に類した病態を表すモデルマウスとなり得ることを見出した。
更に、ヒト組織由来cDNAを用いて発現解析をした結果、ＰＨＦ３遺伝子が白血球で高発現しており、かつ、マイトジェンによる刺激により発現低下することから、白血球の活性化状態と遺伝子発現とが密接な関係を有することも判明した。
従って、これらの遺伝子の発現は、本発明のノックアウト非ヒト動物又はその一部をモデル動物として用いた場合に、アトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果を有する物質をスクリーニングするために有用な指標となることを見出した。
本発明は上記の知見を元に完成するに至ったものである。
即ち、本発明は、
１．ノックアウト非ヒト動物の個体又はその子孫動物或いはそれらの一部であって、ＰＨＦ３遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失・低下するように破壊・組換されてなることを特徴とする非ヒト動物又はその一部（以下、本発明非ヒト動物と記すこともある。）；
２．ＰＨＦ３遺伝子が、下記のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつアレルギー疾患症状改善活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であることを特徴とする前項１記載の非ヒト動物又はその一部
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列と相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列；３．配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失・低下するように破壊・組換されてなることを特徴とするノックアウト非ヒト動物の個体又はその子孫動物或いはそれらの一部；
４．配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のゲノム遺伝子が、配列番号２で示される塩基配列上の塩基番号３１２及び３１３の間（エクソン１と２の間）、塩基番号５８２及び５８３の間（エクソン２と３の間）、塩基番号７４４及び７４５の間（エクソン３と４の間）、塩基番号２４６１及び２４６２の間（エクソン４と５の間）、塩基番号２７７１及び２７７２の間（エクソン５と６の間）、塩基番号２９５５及び２９５６の間（エクソン６と７の間）、塩基番号３１００及び３１０１の間（エクソン７と８の間）、塩基番号３２５７及び３２５８の間（エクソン８と９の間）、塩基番号３３７４及び３３７５の間（エクソン９と１０の間）、塩基番号３５０６及び３５０７の間（エクソン１０と１１の間）、塩基番号３６４２及び３６４３の間（エクソン１１と１２の間）、塩基番号３８３８及び３８３９の間（エクソン１２と１３の間）、塩基番号３９８４及び３９８５の間（エクソン１３と１４の間）、塩基番号４０７６及び４０７７の間（エクソン１４と１５の間）、塩基番号４２７２及び４２７３の間（エクソン１５と１６の間）に対応する箇所にイントロンを含有するものであることを特徴とする前項３記載の非ヒト動物又はその一部；
５．配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のゲノム遺伝子が、当該遺伝子の蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡの置換、欠失及び／又は付加によって破壊・組換されてなることを特徴とする前項３記載の非ヒト動物又はその一部。
６．蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡがエクソン３領域内の塩基であって、当該塩基が欠失・低下によって破壊・組換されてなることを特徴とする前項５記載の非ヒト動物又はその一部；
７．ＰＨＦ３遺伝子がその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子がその機能を欠失・低下するように破壊・組換される方法が、プロモーター領域が取り除かれている選択マーカー遺伝子を有する遺伝子カセットを含有し、かつ、ＰＨＦ３遺伝子のＤＮＡの一部に相同な塩基配列を有する選択マーカー遺伝子プロモーターレス組換えベクターを用いて、当該ベクターの一部又は全部でありかつ前記遺伝子カセットを含有するＤＮＡに、前記ゲノム遺伝子の蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡが置換されてなる方法であることを特徴とする前項１記載の非ヒト動物又はその一部；
８．遺伝子カセットが、マウスEN2由来のSA(splicing accepter)、 encephalomyocarditis Virus由来のIRES(internal ribosome entry site)、β-galactocidase及びneomycin耐性遺伝子を融合させてなるβgeoにSV40由来のpA(polyadenylation signal)を結合してなるＤＮＡ（SA−IRIS−βgeo−pA遺伝子カセット）であることを特徴とする前項７記載の非ヒト動物又はその一部；
９．蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡがエクソン３領域内の塩基であることを特徴とする前項７又は８記載の非ヒト動物又はその一部；
１０．ノックアウト非ヒト動物の個体又はその子孫動物或いはそれらの一部であって、ＰＨＦ３タンパク質遺伝子の発現量が同種の野生型非ヒト動物での同遺伝子の発現量よりも低減されてなることを特徴とする非ヒト動物又はその一部；
１１．ＰＨＦ３タンパク質が、下記のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつアレルギー疾患症状改善活性を有する蛋白質であることを特徴とする前項１０記載の非ヒト動物又はその一部
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列と相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
１２．以下の（ａ）〜（ｄ）の群より選択される１又は複数の性質を表現することを特徴とする前項１〜１１のいずれか記載の非ヒト動物又はその一部
（ａ）野生型非ヒト動物と比較して皮膚における痂皮形成が高頻度である。
（ｂ）野生型非ヒト動物と比較して皮膚真皮層への細胞浸潤が高頻度である。
（ｃ）野生型非ヒト動物と比較して高い血中総イムノグロブリンＥ濃度を示す。
（ｄ）野生型非ヒト動物と比較してアトピー性皮膚炎関連因子の発現量が変動する。
１３．非ヒト動物がマウスであることを特徴とする前項１〜１２のいずれか記載の非ヒト動物又はその一部；
１４．非ヒト動物の個体又はその子孫動物或いはそれらの一部における非ヒト動物の一部が、非ヒト動物由来の組織又は細胞であることを特徴とする前項１〜１３のいずれか記載の非ヒト動物又はその一部；
１５．ＰＨＦ３遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失・低下するように破壊・組換されてなることを特徴とする分化全能性細胞；１６．配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のゲノム遺伝子がその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子がその機能を欠失・低下するように破壊・組換されてなることを特徴とする前項１５記載の分化全能性細胞；
１７．非ヒト動物由来の組織又は細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞又は白血球由来細胞株であることを特徴とする前項１４記載の非ヒト動物又はその一部；
１８．配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失・低下するように破壊・組換されてなることを特徴とする初代培養又は株化された動物細胞；
１９．配列番号８で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列からなる蛋白質のゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失・低下するように破壊・組換されてなることを特徴とする初代培養又は株化された動物細胞；
２０．前項１〜１４記載の非ヒト動物からなる、アトピー性皮膚炎発症を伴う疾患の動物モデル；
２１．前項１〜１４に記載の非ヒト動物又はその一部について、胎生期から致死までの期間における、発育分化、発達、生活行動の観察、病理組織学的検査又は生化学的検査を行うことを特徴とする、ＰＨＦ３タンパク質が関与する疾患の病態解析方法；
２２．ＰＨＦ３タンパク質が関与する疾患がアトピー性皮膚炎発症を伴う疾患である、前項２１記載の病態解析方法；
２３．アトピー性皮膚炎制御能力の評価方法であって、
（１）前項１〜１４のいずれか記載の非ヒト動物又はその一部に被験物質を接触させる第一工程、
（２）前記被験物質を接触させた非ヒト動物又はその一部におけるアトピー性皮膚炎関連因子の発現量又は当該量に相関関係を有する指標値を測定し、対照と比較する第二工程、
（３）（２）の比較結果に基づき、被験物質のアトピー性皮膚炎制御能力を評価する第三工程
を有することを特徴とする評価方法；
２４．アトピー性皮膚炎制御能力がアトピー性皮膚炎関連因子発現制御能力である、前項２３記載の評価方法；
２５．アトピー性皮膚炎関連因子がIFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-18及びイムノグロブリンＥからなる群より選択される１又は複数の因子である、前項２４記載の評価方法；
２６．アトピー性皮膚炎関連因子の発現量又は当該量に相関関係を有する指標値が、アトピー性皮膚炎関連因子のＲＮＡ量若しくはタンパク質量である、前項２３〜２５のいずれか記載の評価方法；
２７．アトピー性皮膚炎関連因子がIFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-18及びイムノグロブリンＥからなる群より選択される１又は複数の因子である、前項２６に記載の評価方法；２８．アトピー性皮膚炎関連因子の発現量に相関関係を有する指標値が痂皮形成能である、前項２３〜２５のいずれか記載の評価方法；
２９．アトピー性皮膚炎関連因子の発現量に相関関係を有する指標値が皮膚真皮層への細胞浸潤能である、前項２３〜２５のいずれか記載の評価方法；
３０．アトピー性皮膚炎関連因子の発現量に相関関係を有する指標値がＰＨＦ３タンパク質の発現量である、前項２３〜２５のいずれか記載の評価方法；
３１．前項２３〜３０のいずれか記載の評価方法により評価されたアトピー性皮膚炎制御能力に基づき、アトピー性皮膚炎制御能力を有する被験物質を選抜することを特徴とするアトピー性皮膚炎制御物質のスクリーニング方法；
３２．前項３１記載のスクリーニング方法により得られるアトピー性皮膚炎発症を伴う疾患の治療剤又は発症予防剤；
３３．前項１〜１４のいずれか記載の非ヒト動物又はその一部、或いは、前項１５又は１６記載の分化全能性細胞を作成するための、プロモーター領域が取り除かれている選択マーカー遺伝子を有するＤＮＡ（遺伝子カセット）を含有し、かつ、ＰＨＦ３遺伝子のＤＮＡの一部に相同な塩基配列を有する選択マーカー遺伝子プロモーターレス組換えベクター；
３４．前項１〜１４のいずれか記載の非ヒト動物又はその一部、或いは、前項１５又は１６記載の分化全能性細胞を作成するための、マウスEN2由来のSA(splicing accepter)、 encephalomyocarditis Virus由来のIRES(internal ribosome entry site)、β-galactocidase及びneomycin耐性遺伝子を融合させてなるβgeoにSV40由来のpA(polyadenylation signal)を結合してなるＤＮＡ（SA−IRIS−βgeo−pA遺伝子カセット）を含有し、かつ、ＰＨＦ３遺伝子のＤＮＡの一部に相同な塩基配列を有する選択マーカー遺伝子プロモーターレス組換えベクター；
３５．アレルギー疾患のタンパク質・遺伝子治療法のための、下記から選ばれる物質の使用
（１）ＰＨＦ３タンパク質又はその部分領域
（２）上記（１）のタンパク質又はその部分領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチド
（３）上記（１）のタンパク質又はその部分領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ
（４）細胞における発現時に、ＰＨＦ３遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果に基づき抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ；
３６．ＰＨＦ３タンパク質が、下記のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつアレルギー疾患症状改善活性を有する蛋白質であることを特徴とする前項３５記載の使用
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２又は８で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２又は８で示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２又は８で示される塩基配列と相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号２又は８で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列；
３７．配列番号１又は７記載のアミノ酸配列又はその部分領域からなるタンパク質に免疫特異的な抗体；
３８．アトピー性皮膚炎の診断のための、下記から選ばれる物質の使用
（１）ＰＨＦ３タンパク質又はその部分領域
（２）上記（１）のタンパク質又はその部分領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチド
（３）ＰＨＦ３タンパク質の遺伝子；
３９．ＰＨＦ３タンパク質が、下記のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつアレルギー疾患症状改善活性を有する蛋白質であることを特徴とする前項３８記載の使用
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２又は８で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２又は８で示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２又は８で示される塩基配列と相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号２又は８で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
等を提供するものである。 As a result of intensive investigations under such circumstances, the present inventors have determined that in the PHF3 gene modification, a target gene on the chromosome of an pluripotent cell such as an ES cell of an animal undergoing the genomic gene modification is subjected to a promoter trap method. (For example, using a targeting vector from which the promoter region of the selectable marker gene has been removed (selectable marker gene promoter-less recombination vector)), disruption by homologous recombination method in which a part of the target gene on the chromosome is replaced with the targeting vector)・ After recombination and mixing this with the blastocyst of the parent animal, we found that it was possible and effective to produce a chimeric primitive mouse that was born by continuing embryo differentiation. .
Furthermore, as a result of intensive studies using progeny produced by breeding the chimeric primitive mouse (hereinafter, the chimeric primitive mouse and its offspring may be referred to as the knockout mouse of the present invention),
In the knockout mouse of the present invention, scab formation and cell infiltration into the skin dermis layer were frequently observed, and the total immunoglobulin E concentration in the blood was found to be extremely high. It has been found that it can be a model mouse that expresses a pathological condition similar to the above.
Furthermore, as a result of expression analysis using cDNA derived from human tissue, the PHF3 gene is highly expressed in leukocytes, and its expression is decreased by stimulation with mitogens, so the activation state of leukocytes and gene expression are closely related. It has also been found to have a relationship.
Therefore, the expression of these genes is a useful index for screening a substance having a therapeutic effect or prevention of onset of atopic dermatitis when the knockout non-human animal of the present invention or a part thereof is used as a model animal. I found out that
The present invention has been completed based on the above findings.
That is, the present invention
1. A knockout non-human animal individual or a progeny animal thereof or a part thereof, wherein all or one allele in the diploid of the PHF3 gene is replaced with its loss-of-function mutant gene or the genomic gene A non-human animal or a part thereof (hereinafter referred to as the non-human animal of the present invention), wherein all or one allele in the Sometimes.);
2. 2. The non-human animal according to item 1 or a part thereof <amino acid sequence>, wherein the PHF3 gene is a gene consisting of any of the following amino acid sequences and encoding a protein having an allergic disease symptom improving activity:
(A) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or more amino acids are deleted, added or substituted (c) Amino acid represented by SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence having 75% or more sequence identity to the sequence (d) a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (e) a DNA having a base sequence having 80% or more sequence identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 The amino acid sequence encoded by (f) The amino acid sequence encoded by the DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA consisting of the base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (g) SEQ ID NO: 2. an amino acid sequence encoded by DNA having the base sequence shown in 2; The allele or one allele in the diploid of the genomic gene of the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is replaced by the loss-of-function / lowering mutant gene, or all or in the diploid of the genomic gene A knockout non-human animal individual or a progeny animal thereof or a part thereof, wherein one allele is disrupted or recombined so as to lack or reduce its function;
4). The genomic gene of the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is located between base numbers 312 and 313 (between exons 1 and 2) on the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and between base numbers 582 and 583 ( Between exons 2 and 3), between base numbers 744 and 745 (between exons 3 and 4), between base numbers 2461 and 2462 (between exons 4 and 5), between base numbers 2771 and 2772 (exon 5) 6), between base numbers 2955 and 2956 (between exons 6 and 7), between base numbers 3100 and 3101 (between exons 7 and 8), between base numbers 3257 and 3258 (exons 8 and 9) Between base numbers 3374 and 3375 (between exons 9 and 10), between base numbers 3506 and 3507 (between exons 10 and 11), base number 3642 3643 (between exons 11 and 12), between base numbers 3838 and 3839 (between exons 12 and 13), between base numbers 3984 and 3985 (between exons 13 and 14), base numbers 4076 and 4077 4. The non-human animal according to item 3 above, which contains an intron at a position corresponding to between (exons 14 and 15) and between base numbers 4272 and 4273 (between exons 15 and 16). Or part of it;
5. The genomic gene of the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is destroyed or recombined by substitution, deletion and / or addition of at least a part of DNA in the protein coding region of the gene. The non-human animal or a part thereof according to item 3 above.
6). 6. The non-human animal according to item 5 above, wherein at least a part of the DNA in the protein coding region is a base in the exon 3 region, and the base is destroyed / recombined by deletion / reduction. part;
7). A selection marker in which the promoter region has been removed, wherein the PHF3 gene is replaced with its loss-of-function / reduced mutant gene or the genomic gene is disrupted / recombined so that its function is deleted / reduced A selectable marker gene promoter-less recombinant vector containing a gene cassette having a gene and having a base sequence homologous to a part of the DNA of the PHF3 gene, and the gene cassette A non-human animal or a part thereof according to item 1 above, wherein at least a part of the DNA in the protein coding region of the genomic gene is substituted with the DNA containing
8). Gene cassette binds SV40-derived pA (polyadenylation signal) to βgeo, which is a fusion of mouse EN2-derived SA (splicing accepter), encephalomyocarditis virus-derived IRES (internal ribosome entry site), β-galactocidase and neomycin resistance gene A non-human animal or a part thereof according to item 7 above, which is a DNA (SA-IRIS-βgeo-pA gene cassette);
9. 9. The non-human animal or the part thereof described in 7 or 8 above, wherein at least a part of DNA in the protein coding region is a base in the exon 3 region;
10. A knockout non-human animal individual or a progeny animal thereof or a part thereof, wherein the expression level of the PHF3 protein gene is reduced compared to the expression level of the gene in a wild-type non-human animal of the same species. Non-human animals or parts thereof;
11. 11. The non-human animal according to item 10 or a part thereof <amino acid sequence>, wherein the PHF3 protein is a protein comprising any of the following amino acid sequences and having allergic disease symptom improving activity:
(A) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or more amino acids are deleted, added or substituted (c) Amino acid represented by SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence having 75% or more sequence identity to the sequence (d) Amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (e) 80% or more sequence identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence encoded by the DNA having the base sequence (f) an amino acid encoded by the DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA having the base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 Sequence (g) amino acid sequence encoded by DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 The non-human animal or the part thereof according to any one of the preceding items 1 to 11, which expresses one or more properties selected from the following groups (a) to (d): Compared to human animals, scab formation in the skin is more frequent.
(B) Cell infiltration into the skin dermis layer is more frequent than in wild-type non-human animals.
(C) High total immunoglobulin E concentration in blood compared to wild type non-human animals.
(D) The expression level of atopic dermatitis-related factors varies as compared to wild-type non-human animals.
13. 13. The non-human animal or the part thereof according to any one of items 1 to 12, wherein the non-human animal is a mouse;
14 14. The non-human animal according to any one of items 1 to 13 above, wherein a part of the non-human animal in the individual of the non-human animal or its progeny animal or part thereof is a tissue or cell derived from the non-human animal. Or part of it;
15. All or one allele in the diploid of the PHF3 gene is replaced with its loss-of-function / reduced mutant gene, or all or one allele in the diploid of the genomic gene has its function deleted / reduced 15. Totipotent differentiation cells characterized by being destroyed and recombined as described above; The genomic gene of the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with its function-deficient / reduced mutant gene, or the genomic gene is destroyed / recombined so that its function is deleted / reduced 16. The totipotent cell according to item 15 above,
17. 15. The non-human animal or a part thereof according to 14 above, wherein the non-human animal-derived tissue or cell is a T cell, B cell or leukocyte-derived cell line;
18. All or one of the alleles in the diploid of the genomic gene of the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 is replaced with the loss-of-function / lowering mutant gene, or all or in the diploid of the genomic gene Primary cultured or established animal cells, wherein one allele is disrupted or recombined so as to lack or reduce its function;
19. All or one of the alleles in the diploid of the genomic gene of the protein consisting of the amino acid sequence encoded by the base sequence shown in SEQ ID NO: 8 is replaced with its function-deficient / reduced mutant gene, or two of the genomic gene A primary cultured or established animal cell, wherein all or one allele in a diploid is disrupted or recombined so that its function is lost or reduced;
20. An animal model of a disease associated with the onset of atopic dermatitis, comprising the non-human animal according to 1 to 14 above;
21. About the non-human animal or a part thereof according to the preceding items 1 to 14, characterized by performing developmental differentiation, development, observation of living behavior, histopathological examination or biochemical examination in a period from embryonic period to lethality A pathological analysis method for diseases involving PHF3 protein;
22. The disease state analysis method according to item 21 above, wherein the disease involving PHF3 protein is a disease associated with the development of atopic dermatitis;
23. A method for evaluating the ability to control atopic dermatitis,
(1) a first step of bringing a test substance into contact with the non-human animal or a part thereof according to any one of items 1 to 14;
(2) a second step of measuring an expression level of an atopic dermatitis-related factor in a non-human animal or a part thereof contacted with the test substance or a part of the index value having a correlation with the amount, and comparing it with a control;
(3) An evaluation method comprising a third step of evaluating the atopic dermatitis control ability of a test substance based on the comparison result of (2);
24. 24. The evaluation method according to item 23 above, wherein the atopic dermatitis control ability is an atopic dermatitis related factor expression control ability;
25. 25. The evaluation according to item 24 above, wherein the atopic dermatitis-related factor is one or more factors selected from the group consisting of IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-13, IL-18 and immunoglobulin E. Method;
26. The evaluation method according to any one of items 23 to 25, wherein the expression level of the atopic dermatitis-related factor or the index value correlated with the amount is the RNA amount or the protein amount of the atopic dermatitis-related factor;
27. 27. The atopic dermatitis-related factor is one or more factors selected from the group consisting of IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-13, IL-18, and immunoglobulin E, Evaluation method; 28. The evaluation method according to any one of items 23 to 25, wherein the index value having a correlation with the expression level of the atopic dermatitis-related factor is crust formation ability;
29. The evaluation method according to any one of the above items 23 to 25, wherein the index value having a correlation with the expression level of the atopic dermatitis-related factor is the ability to infiltrate cells into the dermal layer;
30. The evaluation method according to any one of items 23 to 25, wherein the index value correlated with the expression level of the atopic dermatitis-related factor is the expression level of the PHF3 protein;
31. A screening for atopic dermatitis control substances, wherein a test substance having an atopic dermatitis control ability is selected based on the atopic dermatitis control ability evaluated by the evaluation method according to any one of items 23 to 30 above Method;
32. A therapeutic or preventive agent for diseases associated with the development of atopic dermatitis obtained by the screening method according to item 31 above;
33. 15. A DNA (gene) having a selectable marker gene from which the promoter region has been removed for producing the non-human animal or a part thereof according to any one of 1 to 14 above, or the totipotent cell according to 15 or 16 above A selectable marker gene promoter-less recombination vector containing a cassette) and having a base sequence homologous to a part of the DNA of the PHF3 gene;
34. The non-human animal according to any one of 1 to 14 above or a part thereof, or the SA (splicing accepter) derived from mouse EN2 or the IRES derived from encephalomyocarditis virus for producing the totipotent cell according to 15 or 16 above (internal ribosome entry site), containing DNA (SA-IRIS-βgeo-pA gene cassette) obtained by binding SV40-derived pA (polyadenylation signal) to βgeo obtained by fusing β-galactocidase and neomycin resistance gene, And a selectable marker gene promoter-less recombinant vector having a base sequence homologous to part of the DNA of the PHF3 gene;
35. Use of a substance selected from the following for protein / gene therapy for allergic diseases: (1) PHF3 protein or a partial region thereof (2) Base sequence encoding the protein of (1) above or the amino acid sequence of the partial region or A polynucleotide having a base sequence complementary to the base sequence (3) a DNA encoding an RNA having a ribozyme activity that specifically cleaves the base sequence encoding the amino acid sequence of the protein of (1) above or a partial region thereof
(4) DNA encoding RNA that suppresses the expression of the PHF3 gene based on the RNAi effect during expression in cells;
36. 35. Use according to item 35 above, wherein the PHF3 protein is a protein comprising any of the following amino acid sequences and having an allergic disease symptom improving activity: <amino acid sequence>
(A) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 7 (b) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 7, wherein one or more amino acids are deleted, added or substituted (c) SEQ ID NO: 1 Or an amino acid sequence having 75% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by 7 (d) the amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 8 (e) the base represented by SEQ ID NO: 2 or 8 An amino acid sequence encoded by a DNA having a base sequence having 80% or more sequence identity to the sequence (f) a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 8, and a stringent An amino acid sequence encoded by DNA that hybridizes under conditions (g) DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 8 Amino acid sequence encoded;
37. An antibody immunospecific for a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 7 or a partial region thereof;
38. Use of a substance selected from the following for diagnosis of atopic dermatitis: (1) PHF3 protein or a partial region thereof (2) Base sequence encoding the protein of (1) above or the amino acid sequence of the partial region or the base A polynucleotide having a base sequence complementary to the sequence (3) a gene for PHF3 protein;
39. 39. Use according to item 38 above, wherein the PHF3 protein is a protein comprising any one of the following amino acid sequences and having an allergic disease symptom improving activity: <amino acid sequence>
(A) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 7 (b) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 7, wherein one or more amino acids are deleted, added or substituted (c) SEQ ID NO: 1 Or an amino acid sequence having 75% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by 7 (d) the amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 8 (e) the base represented by SEQ ID NO: 2 or 8 An amino acid sequence encoded by a DNA having a base sequence having 80% or more sequence identity to the sequence (f) a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 8, and a stringent An amino acid sequence encoded by DNA that hybridizes under conditions (g) DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 8 There is provided the encoded amino acid sequence, and the like.

本発明により、ノックアウト非ヒト動物の個体又はその子孫動物或いはそれらの一部であって、ＰＨＦ３遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失・低下するように破壊・組換されてなることを特徴とする非ヒト動物又はその一部、当該非ヒト動物又はその一部の作成に不可欠なＥＳ細胞等の分化全能性細胞、及びそれらの利用を提供可能にした。また、アトピー性皮膚炎に関連する疾患の治療剤又は発症予防剤として有用な、アトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果を有する物質をスクリーニングする方法を提供することが可能になった。   According to the present invention, whether or not all or one allele in the diploid of the PHF3 gene is replaced by the knockout non-human animal individual or its progeny animal or a part thereof, and its loss-of-function mutant gene. Or all or one of the alleles in the diploid of the genomic gene is disrupted / recombined so that its function is lost / reduced, or a part thereof, the non-human animal, It was made possible to provide totipotent cells such as ES cells that are indispensable for the production of some of them, and their use. In addition, it has become possible to provide a method for screening a substance having a therapeutic effect or preventive effect on atopic dermatitis that is useful as a therapeutic agent or preventive agent for diseases related to atopic dermatitis.

以下に本発明を詳細に説明する。   The present invention is described in detail below.

本発明におけるノックアウト非ヒト動物とは、生殖系列細胞を含む、非ヒト動物の生体内の細胞の中に存在するひとつの遺伝子座にあるアリル（対立遺伝子）の全部又は一方がその本来の機能を発揮しないような状態に破壊・組換されている非ヒト動物を意味する。
本発明が提供するノックアウト非ヒト動物は、非ヒト動物生体を構成する細胞内の染色体上のひとつの遺伝子座にあるＰＨＦ３遺伝子の全部又は一方のアリルが活性あるＰＨＦ３タンパク質を発現しないように破壊・組換されてなるものである。例えば、当該アリルが人為的に改変されることにより、遺伝子の発現能が抑制されていてもよいし、また当該アリルがコードしているＰＨＦ３タンパク質の活性が実質的に喪失又は低下していてもよい。
本発明におけるＰＨＦ３遺伝子は、上記の定義にしたがって、ＰＨＦ３タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するｍＲＮＡに対応する、イントロンを含むことのある非ヒト動物染色体上の領域であり、特定の構造、例えば、特定の塩基配列やイントロン−エクソン構造に限定されるものではない。 The knockout non-human animal in the present invention means that all or one of alleles (alleles) in one locus existing in cells in the living body of a non-human animal including germ line cells has its original function. It means a non-human animal that has been destroyed or recombined so that it does not perform.
The knockout non-human animal provided by the present invention is disrupted so that all or one allele of the PHF3 gene at one locus on a chromosome in a cell constituting a non-human animal organism does not express an active PHF3 protein. It is a recombination. For example, the allele of the allele may be artificially modified to suppress the gene expression ability, or the activity of the PHF3 protein encoded by the allele may be substantially lost or reduced. Good.
According to the above definition, the PHF3 gene in the present invention is a region on a non-human animal chromosome that may contain an intron and corresponds to mRNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of the PHF3 protein, and has a specific structure, For example, it is not limited to a specific base sequence or intron-exon structure.

本発明におけるＰＨＦ３タンパク質（以下、本タンパク質と記すこともある。）としては、例えば、（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつアレルギー疾患症状改善活性を有する蛋白質、（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアレルギー疾患症状改善活性を有する蛋白質、（ｄ）配列番号２で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質、（ｅ）配列番号２で示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつアレルギー疾患症状改善活性を有する蛋白質、（ｆ）配列番号２で示される塩基配列と相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなり、かつアレルギー疾患症状改善活性を有する蛋白質、（ｇ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質等を挙げることができる。
ここで、前記（ｃ）にある「アミノ酸の欠失、付加若しくは置換」や前記（ｅ）及び（ｇ）にある「７５％以上の配列同一性」又は「８０％以上の配列同一性」には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質が細胞内で受けるプロセシング、該蛋白質が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異や、人為的なアミノ酸の変異等が含まれる。
前記（ｂ）にある「アミノ酸の欠失、付加若しくは置換」（以下、総じてアミノ酸の改変と記すこともある。）を人為的に行う場合の手法としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするDNAに対して慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このDNAを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法、Nucleic Acids Res.,12,9441-9456(1984)）、変異導入用プライマーを用いたPCR法による方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には1若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、アレルギー疾患症状改善活性を見出すことのできる範囲であれば良い。
また前記欠失、付加又は置換のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。当該置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸への置換がより好ましい。このような置換としては、例えば、i)グリシン、アラニン；ii)バリン、イソロイシン、ロイシン；iii)アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、iv)セリン、スレオニン；v)リジン、アルギニン、ヒスチジン；vi)フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
本発明において「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つの蛋白質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又は蛋白質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、DNA Data Bank of Japan［国立遺伝学研究所生命情報・ＤＤＢＪ研究センター（Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan; CIB/DDBJ）内で運営される国際ＤＮＡデータバンク］のウェブサイト（http://www.ddbj.nig.ac.jp）等において、一般的に利用可能である。
本発明における配列同一性は、アミノ酸レベルの場合には７５％以上であればよいが、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上であり、核酸レベルの場合には８０％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。
前記（ｆ）にある「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×SSC（１．５M NaCl、０．１５M クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×SSCとする）、50％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、2×SSCで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×SSCで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×SSCで５０℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。 Examples of the PHF3 protein in the present invention (hereinafter sometimes referred to as the present protein) include (a) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and (b) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. A protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, added or substituted, and having an allergic disease symptom improving activity, (c) having 75% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A protein comprising an amino acid sequence and having an allergic disease symptom improving activity, (d) a protein comprising an amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, (e) a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and 80% It consists of an amino acid sequence encoded by DNA having a base sequence having the above sequence identity, and A protein having a rugi disease symptom ameliorating activity, (f) a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and an amino acid sequence encoded by the DNA that hybridizes under stringent conditions And (g) a protein having an amino acid sequence encoded by a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and the like.
Here, “deletion, addition or substitution of amino acids” in the above (c) and “75% or more sequence identity” or “80% or more sequence identity” in the above (e) and (g) Is, for example, processing that a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 undergoes in a cell, species variation of an organism from which the protein is derived, individual differences, differences between tissues, etc., or artificial amino acids Mutations and the like are included.
As a technique for artificially performing the “deletion, addition or substitution of amino acids” in the above (b) (hereinafter sometimes collectively referred to as amino acid modification), for example, the amino acid represented by SEQ ID NO: 1 is used. There is a technique in which conventional site-directed mutagenesis is performed on DNA encoding the sequence, and then this DNA is expressed by a conventional method. Here, as a site-specific mutagenesis method, for example, a method using an amber mutation (gapped duplex method, Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984)), or a PCR method using a primer for mutagenesis. Methods and the like.
The number of amino acids modified as described above is at least one residue, specifically one or several, or more. The number of such modifications may be in a range where allergic disease symptom improving activity can be found.
Of the deletions, additions or substitutions, the modification relating to amino acid substitution is particularly preferable. The substitution is more preferably substitution with an amino acid having similar properties such as hydrophobicity, charge, pK, and structural features. Such substitutions include, for example, i) glycine, alanine; ii) valine, isoleucine, leucine; iii) aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine, iv) serine, threonine; v) lysine, arginine, histidine; vi) Substitution within the group of phenylalanine and tyrosine.
In the present invention, “sequence identity” refers to sequence identity and homology between two DNAs or two proteins. The “sequence identity” is determined by comparing two sequences that are optimally aligned over the region of the sequence to be compared. Here, the DNA or protein to be compared may have an addition or a deletion (for example, a gap) in the optimal alignment of the two sequences. Such sequence identity can be calculated, for example, by creating an alignment using the ClustalW algorithm (Nucleic Acid Res., 22 (22): 4673-4680 (1994)) using Vector NTI. Sequence identity is measured using sequence analysis software, specifically, analysis tools provided by Vector NTI, GENETYX-MAC, and public databases, such as DNA Data Bank. of Japan [International DNA Data Bank operated within the Center for Information Biology and DNA Data Bank of Japan (CIB / DDBJ)] (http: // www. ddbj.nig.ac.jp) is generally available.
The sequence identity in the present invention may be 75% or more at the amino acid level, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and 80% or more at the nucleic acid level. Although it is good, it is preferably 90% or more, more preferably 95% or more.
Regarding “hybridize under stringent conditions” in (f) above, the hybridization used here is, for example, by Sambrook J., Frisch EF, Maniatis T., Molecular Cloning Second Edition (Molecular Cloning 2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory issuance (Cold Spring Harbor Laboratory press), etc. “Stringent conditions” means, for example, 6 × SSC (a solution containing 1.5M NaCl, 0.15M trisodium citrate is 10 × SSC), 45% in a solution containing 50% formamide. The conditions (Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6), etc., where a hybrid is formed at 50 ° C. and then washed with 2 × SSC at 50 ° C. it can. The salt concentration in the washing step can be selected, for example, from 2 × SSC at 50 ° C. (low stringency conditions) to 0.2 × SSC at 50 ° C. (high stringency conditions). The temperature in the washing step can be selected, for example, from room temperature (low stringency conditions) to 65 ° C. (high stringency conditions). It is also possible to change both the salt concentration and the temperature.

本発明におけるＰＨＦ３遺伝子のより詳細な具体例としては、例えば、（I）配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、（II）配列番号２又は８で示される塩基配列、を有する遺伝子を、含有するものが挙げられる。尚、これらの遺伝子は、通常の遺伝子工学的方法（例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載されている方法）に準じて取得すればよい。
配列番号２又は８で示される塩基配列は、配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡの塩基配列（即ち、配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するｍＲＮＡの塩基配列においてＵをＴに置換されてなる塩基配列）であって、５′末端及び３′末端に非翻訳領域の塩基配列を含んでいる。本発明におけるＰＨＦ３遺伝子は、通常、配列番号２で示される塩基配列を含有し、かつ、この塩基配列がイントロンにより分断された構造、即ち、イントロン−エクソン構造を有している。
イントロン−エクソン構造のより詳細な具体例としては、配列番号２で示される塩基配列の場合には、配列番号２で示される塩基配列上の塩基番号３１２及び３１３の間（エクソン１と２の間）、塩基番号５８２及び５８３の間（エクソン２と３の間）、塩基番号７４４及び７４５の間（エクソン３と４の間）、塩基番号２４６１及び２４６２の間（エクソン４と５の間）、塩基番号２７７１及び２７７２の間（エクソン５と６の間）、塩基番号２９５５及び２９５６の間（エクソン６と７の間）、塩基番号３１００及び３１０１の間（エクソン７と８の間）、塩基番号３２５７及び３２５８の間（エクソン８と９の間）、塩基番号３３７４及び３３７５の間（エクソン９と１０の間）、塩基番号３５０６及び３５０７の間（エクソン１０と１１の間）、塩基番号３６４２及び３６４３の間（エクソン１１と１２の間）、塩基番号３８３８及び３８３９の間（エクソン１２と１３の間）、塩基番号３９８４及び３９８５の間（エクソン１３と１４の間）、塩基番号４０７６及び４０７７の間（エクソン１４と１５の間）、塩基番号４２７２及び４２７３の間（エクソン１５と１６の間）に対応する箇所にイントロンを含有する構造が挙げられる。 Specific examples of the PHF3 gene in the present invention include (I) a base sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 7, and (II) a base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 8. The thing which contains the gene which has is mentioned. These genes can be obtained by conventional genetic engineering methods (for example, Sambrook J., Frisch EF, Maniatis T., Molecular Cloning 2nd edition), published by Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor Laboratory). press), etc.).
The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 8 is a cDNA nucleotide sequence corresponding to mRNA having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 7 (that is, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 7). In which the U is replaced with T in the base sequence of the mRNA having the base sequence encoding), and includes the base sequence of the untranslated region at the 5 'end and 3' end. The PHF3 gene in the present invention usually contains the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and has a structure in which this base sequence is divided by an intron, that is, an intron-exon structure.
As a more specific example of the intron-exon structure, in the case of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, between base numbers 312 and 313 (between exons 1 and 2) on the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 ), Between base numbers 582 and 583 (between exons 2 and 3), between base numbers 744 and 745 (between exons 3 and 4), between base numbers 2461 and 2462 (between exons 4 and 5), Between base numbers 2771 and 2772 (between exons 5 and 6), between base numbers 2955 and 2956 (between exons 6 and 7), between base numbers 3100 and 3101 (between exons 7 and 8), base number Between 3257 and 3258 (between exons 8 and 9), between base numbers 3374 and 3375 (between exons 9 and 10), between base numbers 3506 and 3507 (exon 10 and 1), between base numbers 3642 and 3643 (between exons 11 and 12), between base numbers 3838 and 3839 (between exons 12 and 13), between base numbers 3984 and 3985 (between exons 13 and 14) Between the base numbers 4076 and 4077 (between exons 14 and 15) and between base numbers 4272 and 4273 (between exons 15 and 16).

上記のＰＨＦ３遺伝子としては、マウスＰＨＦ３遺伝子（配列番号２：GenBankアクセッションナンバーXM_129836、これに対応するマウスＰＨＦ３タンパク質 配列番号１：GenBankアクセッションナンバーXP_129836）、ヒトＰＨＦ３遺伝子（配列番号８：GenBankアクセッションナンバーNM_015153、これに対応するヒトＰＨＦ３タンパク質 配列番号７：GenBankアクセッションナンバーNP_055968）を具体的に挙げることができるが、ＰＨＦ３遺伝子の由来はマウス及びヒト等に限られるものではない。因みに、マウス由来のＰＨＦ３遺伝子とヒト由来のＰＨＦ３遺伝子との配列同一性は、核酸レベルで82.0％、アミノ酸レベルで77.5％である。   Examples of the PHF3 gene include the mouse PHF3 gene (SEQ ID NO: 2: GenBank accession number XM_129836, the corresponding mouse PHF3 protein SEQ ID NO: 1: GenBank accession number XP_129836), and the human PHF3 gene (SEQ ID NO: 8: GenBank accession). No. NM — 015153, human PHF3 protein corresponding to this (SEQ ID NO: 7: GenBank accession number NP — 055968) can be specifically mentioned, but the origin of the PHF3 gene is not limited to mice and humans. Incidentally, the sequence identity between the mouse-derived PHF3 gene and the human-derived PHF3 gene is 82.0% at the nucleic acid level and 77.5% at the amino acid level.

本明細書において、「アレルギー疾患症状改善活性」としては、例えば、アトピー性皮膚炎の特徴的な症状である、痂皮形成、皮膚真皮層への細胞浸潤及び高濃度の血中総イムノグロブリンＥ濃度を改善する活性等を挙げることができる。この他として、サイトカイン類濃度異常やヒスタミン濃度異常等を改善する活性等が挙げられる。   In the present specification, the “allergic disease symptom improving activity” includes, for example, scab formation, cell infiltration into the skin dermis layer and high concentration of blood total immunoglobulin E, which are characteristic symptoms of atopic dermatitis. The activity which improves a density | concentration etc. can be mentioned. In addition, the activity etc. which improve cytokine concentration abnormality, histamine concentration abnormality, etc. are mentioned.

本発明における非ヒト動物としては、例えば、非ヒト哺乳動物（例、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、サル等）等が用いられ、なかでもマウス、ラット、モルモット等の齧歯目(Rodentia)の哺乳動物が好ましく、とりわけマウス、ラットが好適である。
本発明における非ヒト動物の一部とは、当該動物由来の組織又は細胞であれば特に制限は無く、例えば、精巣周囲脂肪組織、後腹膜脂肪組織、腸間膜脂肪組織、皮下脂肪組織、褐色脂肪組織等の各種の脂肪組織、更には心臓、肺、腎臓、胆嚢、肝臓、膵臓、脾臓、腸、精巣（睾丸）、卵巣、子宮、胎盤、筋肉、血管、脳、髄、甲状腺、胸腺、乳腺等の他の組織等の体の一部が挙げられる。また、当該動物由来の血液、リンパ液若しくは尿等の体液も本発明における非ヒト動物の一部に含まれる。
更に、上記組織、臓器又は体液に含まれる細胞を単離・培養して得られる培養細胞（採取した一代目の初代細胞及び該初代細胞を株化した細胞を含む）や抽出物、のみならず胎生期胚における発生段階の各器官、又は不随する細胞の培養物及びES細胞についても分化・増殖能の有無に関わらず非ヒト動物の一部に含まれる。
尚、このような非ヒト動物由来の組織又は細胞としては、具体的には例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞又は白血球由来細胞株等を挙げることもできる。 Examples of non-human animals in the present invention include non-human mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats, sheep, goats, pigs, horses, cows, monkeys, etc.) Of these, rodent mammals such as mice, rats and guinea pigs are preferred, and mice and rats are particularly preferred.
The part of the non-human animal in the present invention is not particularly limited as long as it is a tissue or cell derived from the animal. For example, peritesticular adipose tissue, retroperitoneal adipose tissue, mesenteric adipose tissue, subcutaneous adipose tissue, brown Various adipose tissues such as adipose tissue, heart, lung, kidney, gallbladder, liver, pancreas, spleen, intestine, testis (testis), ovary, uterus, placenta, muscle, blood vessel, brain, marrow, thyroid, thymus, Part of the body such as other tissues such as mammary gland. In addition, bodily fluids such as blood, lymph, or urine derived from the animal are also included as part of the non-human animal in the present invention.
In addition to cultured cells obtained by isolating and culturing cells contained in the tissues, organs or body fluids (including the collected primary cells and the cells in which the primary cells are established) and extracts, Each organ in the developmental stage of embryonic embryos, or a culture of non-associated cells and ES cells are also included in a part of non-human animals regardless of the presence or absence of differentiation / proliferation ability.
Specific examples of such tissues or cells derived from non-human animals include T cells, B cells, leukocyte-derived cell lines, and the like.

本発明の第一の態様は、ノックアウト非ヒト動物の個体、その子孫動物又はそれらの一部に関する。
本発明非ヒト動物は、体細胞染色体上のＰＨＦ３遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されているか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失・低下するように破壊・組換されているヘテロ接合体、又はホモ接合体として提供される。 The first aspect of the present invention relates to an individual of a knockout non-human animal, its progeny animal or part thereof.
In the non-human animal of the present invention, all or one of the alleles in the diploid of the PHF3 gene on the somatic chromosome is replaced with the loss-of-function / lowering mutant gene, or all or One allele is provided as a heterozygote or a homozygote in which the function is destroyed or recombined so as to delete or reduce its function.

本発明非ヒト動物は、公知の標的遺伝子組換え法（ジーンターゲティング法：例えば、村松正實、山本雅編集、『実験医学別冊 新訂 遺伝子工学ハンドブック 改訂第３版』（１９９９年、羊土社発行）、２３９頁〜２５６頁、Science 244:1288-1292, 1989）等の通常の方法に準じて、ＰＨＦ３遺伝子改変をおこなう非ヒト動物のES（embryonic stem）細胞の染色体上の目的とするゲノム遺伝子（即ち、当該ＰＨＦ３タンパク質のゲノム遺伝子）の二倍体における全部又は一方のアリルを、例えば、選択マーカー遺伝子のプロモーター領域を取り除いたターゲティングベクター（選択マーカー遺伝子プロモーターレス組換えベクター）を用いて、染色体上の目的遺伝子の一部がターゲティングベクターに置き換える相同的組換え法（即ち、プロモータートラップ法）により破壊・組換し、これを親動物の胚盤胞に混入させた後、胚分化を継続させて出産させた仔であるキメラ原始マウスを作出することが効果的である。この方法では、ＥＳ細胞等を分化全能性細胞として使用する。分化全能性細胞としては、マウス（Nature 292:154-156, 1981）、ラット（Dev. Biol. 163(1): 288-292, 1994）、サル（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(17):7844-7848, 1995）、ウサギ（Mol. Reprod. Dev. 45(4):439-443, 1996）についてはＥＳ細胞等が確立している。また、ブタについてはＥＧ（embryonic germ）細胞が確立している（Biol. Reprod 57(5):1089-1095, 1997）。従って本発明非ヒト動物は、これらの動物種を対象に作製することが好ましいが、特にノックアウト動物の作製に関して技術が整っているマウスが最適である。   The non-human animal of the present invention is a known target gene recombination method (gene targeting method: for example, Masatsugu Muramatsu, edited by Masaru Yamamoto, “Experimental Medicine Separate Volume, Genetic Engineering Handbook Revised 3rd Edition” (1999, published by Yodosha) ) Pages 239 to 256, Science 244: 1288-1292, 1989), etc., and the target genomic gene on the chromosome of a non-human animal ES (embryonic stem) cell in which PHF3 gene modification is performed In other words, all or one allele in the diploid of (ie, the genomic gene of the PHF3 protein), for example, using a targeting vector (selectable marker gene promoter-less recombinant vector) from which the promoter region of the selectable marker gene has been removed, Homologous recombination methods (ie, promoter It is effective to create a chimeric primitive mouse that is a pup that was born and continued to undergo embryo differentiation after being disrupted and recombined by the loop method) and mixed with the blastocyst of the parent animal. In this method, ES cells and the like are used as totipotent cells. Examples of totipotent cells include mouse (Nature 292: 154-156, 1981), rat (Dev. Biol. 163 (1): 288-292, 1994), monkey (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 ( 17): 7844-7848, 1995) and rabbits (Mol. Reprod. Dev. 45 (4): 439-443, 1996) have established ES cells and the like. In addition, EG (embryonic germ) cells have been established for pigs (Biol. Reprod 57 (5): 1089-1095, 1997). Therefore, it is preferable that the non-human animal of the present invention is produced for these animal species, but in particular, a mouse having a technique for producing a knockout animal is optimal.

本発明非ヒト動物の作製の具体的手続を以下に説明する。まず、ＰＨＦ３遺伝子のＤＮＡ断片を単離し、そのＤＮＡ断片を試験管内にて遺伝子操作し、当該ゲノム遺伝子がその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子がその機能を欠失・低下するように破壊・組換されるような変異ＤＮＡ断片を作製する。尚、ＰＨＦ３遺伝子をこのように人為的に改変する方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該遺伝子の塩基配列の一部又は全部を削除する方法、又は、他遺伝子の挿入若しくは置換を導入する方法等が挙げられる。これらの改変により、例えば、コドンの読み枠をずらすか、エキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させる塩基配列（例えば、ポリＡ付加シグナル等）を挿入するか、プロモーター若しくはエキソンの機能を破壊すること等により当該遺伝子の発現を妨げればよい。
当該ゲノム遺伝子のＤＮＡの単離は、例えば、公知のマウス由来のＰＨＦ３遺伝子のcＤＮＡ塩基配列等に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドプローブを用いてマウス等の非ヒト動物ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。また、このcＤＮＡの一部又は両端に相当する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法によっても目的とするゲノム遺伝子のＤＮＡを得ることができる。尚、マウス以外の非ヒト動物を対象とする場合にも、前記のcＤＮＡ塩基配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドをプローブ又はプライマーとする前記の方法により、各種非ヒト動物由来の当該遺伝子のＤＮＡを単離することができる。また更に前記のｃＤＮＡの塩基配列に基づいて、当該ゲノム遺伝子の構造を詳細に解析し、当該ゲノム遺伝子におけるイントロン−エクソン構造並びに、イントロンの塩基配列を解明する。解明された情報に基づいて、例えば、当該ゲノム遺伝子のＤＮＡ断片を含み、当該遺伝子の蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡの塩基配列とは異なるように置換、欠失及び／又は付加によって改変すれば、当該ゲノム遺伝子がその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子がその機能を欠失・低下するように破壊・組換されるような変異ＤＮＡ断片を作製することができる。 Specific procedures for producing the non-human animal of the present invention will be described below. First, a DNA fragment of the PHF3 gene is isolated, and the DNA fragment is genetically manipulated in a test tube, and the genomic gene is replaced with the loss-of-function / decreased mutant gene or the genomic gene lacks its function. A mutant DNA fragment that can be destroyed or recombined so as to be lost or reduced is prepared. In addition, as a method for artificially modifying the PHF3 gene in this way, for example, a method of deleting part or all of the base sequence of the gene by a genetic engineering technique, or insertion or substitution of another gene is introduced. Methods and the like. With these modifications, for example, the codon reading frame is shifted, the base sequence that terminates gene transcription (for example, a poly A addition signal) is inserted into the intron between exons, or the function of the promoter or exon is destroyed. The expression of the gene may be prevented by doing so.
For the isolation of the genomic gene DNA, for example, screening a non-human animal genomic DNA library such as a mouse using an oligonucleotide probe synthesized based on the cDNA base sequence of a known mouse-derived PHF3 gene. Is obtained. The DNA of the target genomic gene can also be obtained by PCR using a synthetic oligonucleotide corresponding to a part or both ends of this cDNA as a primer. In addition, even when targeting non-human animals other than mice, DNA of the gene derived from various non-human animals can be obtained by the above method using an oligonucleotide synthesized based on the cDNA base sequence as a probe or primer. Can be isolated. Furthermore, based on the base sequence of the cDNA, the structure of the genomic gene is analyzed in detail to elucidate the intron-exon structure and the base sequence of the intron in the genomic gene. Based on the elucidated information, for example, it contains a DNA fragment of the genomic gene and is modified by substitution, deletion and / or addition so that it differs from the base sequence of at least a part of the DNA in the protein coding region of the gene Then, a mutant DNA fragment is prepared in which the genomic gene is replaced with the loss-of-function / reduced mutant gene, or the genomic gene is disrupted / recombined so that the function is deleted / reduced. be able to.

このようにして単離されたＰＨＦ３遺伝子のＤＮＡ断片の一部を改変して作製された変異ＤＮＡ断片を用いて、ＥＳ細胞等の分化全能性細胞が有するＰＨＦ３遺伝子に変異を導入するためのターゲティングベクターを、公知の方法（例えば、Science 244:1288-1292, 1989）に準じて作製する。ここで「ターゲティングベクター」とは、相同的組換えによって目的の遺伝子を破壊・組換するためのＤＮＡ分子のことであり、ＥＳ細胞等の分化全能性細胞の選択をより容易にするために、選択マーカー遺伝子の塩基配列を通常含んでいる。陽性選択マーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子等を、陰性選択マーカー遺伝子としては単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素Ａフラグメント遺伝子等を挙げることができる。尚、ターゲティングベクターを構築する際に、ターゲティングベクター構築用として市販されているプラスミドベクターを利用することもできる。
本発明において好ましく用いられるターゲティングベクターを作製する方法としては、例えば、ＰＨＦ３遺伝子の蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡ［尚、ＰＨＦ３タンパク質が配列番号1で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質である場合には、当該ゲノム遺伝子の蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡがエクソン３領域内の塩基（ここで「エクソン３領域内の塩基」とは、例えば、エクソン３領域内の全塩基であってもよいし、エクソン３領域内の一部の塩基であってもよい。）であることが好ましく、エクソン３領域内の全塩基であることがより好ましい。但し、ここでのエクソン選択において、エクソン３の先頭からの領域の塩基数が２＋３ｎ（ｎはエクソン３の先頭からの領域のアミノ酸数）になる場合には、エクソン２から後に続く翻訳フレームがＰＨＦ３遺伝子の蛋白質コード領域の下流遺伝子と一致してしまい、下流領域を融合した蛋白質が産生される恐れがあるので好ましくない。］を、プロモーター領域が取り除かれている選択マーカー遺伝子を有する遺伝子カセット（より具体的には、マウスEN2由来のSA(splicing accepter)、 encephalomyocarditis Virus由来のIRES(internal ribosome entry site)、β-galactocidase及びneomycin耐性遺伝子を融合させてなるβgeoにSV40由来のpA(polyadenylation signal)（Mountford P.,et al.,PNAS 91 :4303-4307,1994）を結合してなるＤＮＡ等）を含有し、かつ、ＰＨＦ３遺伝子のＤＮＡの一部に相同な塩基配列を有する選択マーカー遺伝子プロモーターレス組換えベクターを用いて、当該ベクターの一部又は全部でありかつ前記遺伝子カセットを含有するＤＮＡに置換することにより、又は、当該ベクターの一部又は全部でありかつ前記遺伝子カセットを含有するＤＮＡを前記ゲノム遺伝子の蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡに挿入することにより、プロモーター領域が取り除かれている選択マーカー遺伝子を有する遺伝子カセットを含有し、かつ、ＰＨＦ３遺伝子のＤＮＡの一部に相同な塩基配列を前記遺伝子カセットの両端に有するような選択マーカー遺伝子プロモーターレス組換えベクターを作製する方法を挙げることができる。この場合、上記のように置換又は挿入される前のＤＮＡ断片が予め組み込まれたターゲティングベクター構築用プラスミドベクターに対して、当該置換又は挿入を実施してもよいし、また上記のように置換又は挿入されてなるＤＮＡ断片をターゲティングベクター構築用プラスミドベクターに組み込んでもよい。
勿論、前記遺伝子カセットは、プロモーター領域が取り除かれた選択マーカー遺伝子の前後領域にＰＨＦ３ゲノム遺伝子のＤＮＡの塩基配列に対して相同な塩基配列の一部を有していてもよい。
ここで「相同な塩基配列」とは、比較対象のＤＮＡの塩基配列に対して同一性又は相同性を有する塩基配列であって、相同的組換え法を実施する際にトラブルを生じないものであれば特に制限されるものではないが、例えば、３塩基以上連続して異ならない９０％以上の配列同一性を有する塩基配列、好ましくは、比較対象のＤＮＡの塩基配列に対して９５％以上の配列同一性を有する塩基配列、より好ましくは１００％の配列同一性を有する塩基配列が挙げられる。 Targeting for introducing a mutation into the PHF3 gene of a totipotent cell such as an ES cell using a mutant DNA fragment produced by modifying a part of the DNA fragment of the PHF3 gene isolated in this way The vector is prepared according to a known method (for example, Science 244: 1288-1292, 1989). Here, the “targeting vector” is a DNA molecule for destroying and recombining the target gene by homologous recombination, and in order to make selection of totipotent cells such as ES cells easier, It usually contains the base sequence of the selectable marker gene. Examples of the positive selection marker gene include neomycin resistance gene and β-galactosidase gene, and examples of the negative selection marker gene include herpes simplex virus thymidine kinase gene and diphtheria toxin A fragment gene. In constructing the targeting vector, a commercially available plasmid vector can also be used for constructing the targeting vector.
As a method for preparing a targeting vector preferably used in the present invention, for example, at least a part of DNA in the protein coding region of the PHF3 gene [in the case where the PHF3 protein is a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1] In this case, at least a part of DNA in the protein coding region of the genomic gene is a base in the exon 3 region (here, “base in the exon 3 region” means, for example, all bases in the exon 3 region, Or may be a part of the bases in the exon 3 region.), And more preferably all bases in the exon 3 region. However, in this exon selection, when the number of bases in the region from the beginning of exon 3 is 2 + 3n (n is the number of amino acids in the region from the beginning of exon 3), the translation frame following exon 2 is PHF3. This is not preferable because it coincides with the downstream gene of the protein coding region of the gene and a protein fused with the downstream region may be produced. ], A gene cassette having a selectable marker gene from which the promoter region has been removed (more specifically, SA (splicing accepter) derived from mouse EN2, IRES (internal ribosome entry site) derived from encephalomyocarditis virus, β-galactocidase and containing a SV40-derived pA (polyadenylation signal) (Mountford P., et al., PNAS 91: 4303-4307, 1994), etc., in βgeo fused with a neomycin resistance gene, and By using a selectable marker gene promoter-less recombinant vector having a base sequence homologous to a part of the DNA of the PHF3 gene, and replacing it with a part or all of the vector and containing the gene cassette, or A part or all of the vector and the DNA containing the gene cassette is at least a part of the protein coding region of the genomic gene A selectable marker containing a gene cassette having a selectable marker gene from which the promoter region has been removed by insertion into the DNA cassette, and having a base sequence homologous to part of the DNA of the PHF3 gene at both ends of the gene cassette A method for producing a gene promoter-less recombinant vector can be mentioned. In this case, the substitution or insertion may be carried out on a plasmid vector for constructing a targeting vector in which a DNA fragment before substitution or insertion as described above is previously incorporated, or as described above. The inserted DNA fragment may be incorporated into a targeting vector construction plasmid vector.
Of course, the gene cassette may have a part of the base sequence homologous to the DNA base sequence of the PHF3 genomic gene in the region before and after the selectable marker gene from which the promoter region has been removed.
Here, the “homologous base sequence” is a base sequence having identity or homology to the base sequence of the DNA to be compared, and does not cause trouble when performing the homologous recombination method. The base sequence is not particularly limited as long as it has, for example, a base sequence having 90% or more sequence identity that does not differ continuously by 3 bases or more, preferably 95% or more with respect to the base sequence of the DNA to be compared Examples include base sequences having sequence identity, more preferably base sequences having 100% sequence identity.

上記ターゲティングベクターでは、プロモーター領域が取り除かれている選択マーカー遺伝子（例えば、Ｇ４１８等の細胞毒に対する耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）を有する遺伝子カセットを含有し、かつ、ＰＨＦ３遺伝子のＤＮＡの一部に相同な塩基配列を有することが重要であって、それ以外の要素は相同的組換え法を実施する際にトラブルを生じないものであれば特に制限されるものではない。尚、本願では、このようなターゲティングベクターを、前述及び後述のように、選択マーカー遺伝子プロモーターレス組換えベクターと記すこともある。   The targeting vector contains a gene cassette having a selection marker gene from which the promoter region has been removed (for example, a resistance gene against a cytotoxin such as G418, for example, a neomycin resistance gene), and a part of the DNA of the PHF3 gene It is important to have a homologous base sequence, and other elements are not particularly limited as long as they do not cause trouble when performing homologous recombination. In the present application, such a targeting vector may be referred to as a selectable marker gene promoter-less recombinant vector as described above and below.

次に、上記ターゲティングベクターを、公知の方法に準じてマウス等の非ヒト動物由来のＥＳ細胞等の分化全能性細胞に導入する。このような遺伝子導入法としては、公知の電気パルス法、リポソーム法、リン酸カルシウム法等をあげることができるが、導入遺伝子の相同的組換えの効率を勘案した場合には、ＥＳ細胞等の分化全能性細胞への電気パルス法が好ましい。   Next, the targeting vector is introduced into totipotent cells such as ES cells derived from non-human animals such as mice according to a known method. Examples of such gene transfer methods include the known electric pulse method, liposome method, calcium phosphate method, etc., but taking into account the efficiency of homologous recombination of the transgene, it is possible to differentiate to the full potential of ES cells and the like. The electric pulse method for sex cells is preferred.

このようにして遺伝子導入されたＥＳ細胞等の分化全能性細胞のＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡをサザンブロット分析やPCR分析等により、染色体上に存在するＰＨＦ３タンパク質の野生型ゲノム遺伝子（具体的には、当該ゲノム遺伝子の蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡ）と、上記ターゲティングベクターのＤＮＡの一部でありかつ前記遺伝子カセットを含有するＤＮＡとの間で正しく相同的組換えが起こり、染色体上のＰＨＦ３タンパク質の野生型ゲノム遺伝子に当該変異が移った細胞を選択する。選択されたＥＳ細胞と野生型ＥＳ細胞について、ＰＣＲリアルタイム定量（RT-PCR法：Absolute Quantification Real-Time Analysis）等を実施してその結果を比較することによって、ＰＨＦ３タンパク質の遺伝子発現量の増減を調べることができる。
因みに、上述のような方法では、ＥＳ細胞等の分化全能性細胞内の染色体に相同的組換えが起こった後、ＰＨＦ３遺伝子のプロモーターを利用でき、かつES細胞内で発現している場合のみ、選択マーカー遺伝子が発現し、細胞毒に対する耐性機能等の選択マーカーとしての性質が付与される。ＰＨＦ３遺伝子を対象とする場合には、当該方法を用いることにより、目的の位置で相同的組換えが起こって遺伝子破壊・組換されているクローンの出現効率が他のゲノム遺伝子を対象とする場合に比較して飛躍的に高まるためと考えられる。 The DNA of totipotent cells such as ES cells thus introduced is extracted, and the extracted DNA is subjected to Southern blot analysis, PCR analysis, etc., to the wild type genomic gene (specifically, PHF3 protein present on the chromosome). Specifically, at least a part of the DNA in the protein coding region of the genomic gene) and a DNA which is a part of the targeting vector DNA and contains the gene cassette, correctly homologous recombination occurs. Then, a cell in which the mutation has been transferred to the wild type genomic gene of the PHF3 protein on the chromosome is selected. For selected ES cells and wild-type ES cells, PCR real-time quantification (RT-PCR: Absolute Quantification Real-Time Analysis) is performed and the results are compared to increase or decrease the gene expression level of PHF3 protein. I can investigate.
Incidentally, in the method as described above, after homologous recombination occurs in a chromosome in a totipotent cell such as an ES cell, the promoter of the PHF3 gene can be used and expressed only in the ES cell. A selectable marker gene is expressed, and a property as a selectable marker such as a resistance function against a cytotoxin is imparted. When targeting the PHF3 gene, when using this method, the appearance efficiency of clones that have undergone homologous recombination at the target position and the gene has been disrupted or recombined targets other genomic genes This is thought to be due to a dramatic increase compared to.

このようにして得られた変異型ゲノム遺伝子を持つＥＳ細胞等の分化全能性細胞を慣用のマイクロインジェクション法や凝集法に従って擬妊娠状態にある野生型雌性マウス等の野生型雌性非ヒト動物のブラストシスト（胚盤胞）に注入・混入し、次いでこのキメラ胚を仮親の子宮に移植する。胚分化を継続させると、例えば、非ヒト動物がマウスである場合には約２１日後に、仔である候補キメラ非ヒト動物として出産される。出生した候補キメラ非ヒト動物を里親につけて飼育させた後、ＰＨＦ３タンパク質の変異型ゲノム遺伝子が生殖系細胞に入ったキメラ非ヒト動物（F0）を選別する。
選別は毛色の違い（生まれたキメラ非ヒト動物の体毛色）を観察することにより実施すればよい。（この場合には、変異型ゲノム遺伝子が導入された組換えＥＳ細胞等の分化全能性細胞の占める割合の高いキメラ非ヒト動物の選択が容易となり結果として、変異型ゲノム遺伝子が生殖系細胞に入ったキメラ非ヒト動物の獲得効率を高めることができる。） 他の選別は、体の一部（例えば尾部先端）からＤＮＡを抽出し、サザンブロット分析やPCR分析等により実施してもよい。
ＰＨＦ３タンパク質の変異型ゲノム遺伝子が生殖系細胞に入ったキメラ非ヒト動物と同動物種である野生型非ヒト動物の交配により得られる子孫（F1）について、更に体の一部（例えば尾部先端）からの抽出ＤＮＡを材料とした、サザンブロット分析やPCR分析等を行うことにより、ＰＨＦ３タンパク質の変異型ゲノム遺伝子が導入されたヘテロ接合体（二倍体における一方のアリルが破壊・組換されたＰＨＦ３遺伝子を有する非ヒト動物）を同定する。また、例えば、皮膚、皮下筋肉等の皮膚組織、精巣周囲脂肪組織、後腹膜脂肪組織、腸間膜脂肪組織、皮下脂肪組織、褐色脂肪組織等の各種の脂肪組織、更には心臓、肺、腎臓、胆嚢、肝臓、膵臓、脾臓、腸、精巣（睾丸）、卵巣、子宮、胎盤、筋肉、血管、脳、髄、甲状腺、胸腺、乳腺等の他の組織一部又は胎生期胚からのＲＮＡ抽出物を材料とした、ＰＣＲリアルタイム定量解析又はノーザンブロット分析を実施してその結果を比較することによって、ＰＨＦ３タンパク質遺伝子の発現量の増減を調べることができる。更に、前記体の一部（磨り潰したもの、切片等）又は体液（血液、尿等）を材料としたELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay)法を実施してその結果を比較することによって、ＰＨＦ３タンパク質量の増減を調べることができる。
作出されたＰＨＦ３タンパク質の変異型ゲノム遺伝子を保有するヘテロ接合体は生殖細胞及び体細胞のすべてに安定的にＰＨＦ３タンパク質の変異型ゲノム遺伝子を保有しており、交配等により、効率よくその変異を子孫動物に伝達することができる。よってそれらＦ１以降の子孫動物についても同様に、上述のヘテロ接合体同定や遺伝子の発現量又は当該遺伝子の発現産物である蛋白質の量の増減を調べることができる。
尚、一般的には、破壊・組換された遺伝子が胎生期個体の発生や分化に影響して胎生致死を導かない場合には、F1以降の個体ではホモ接合体（二倍体における全部のアリルが破壊・組換されたＰＨＦ３遺伝子を有する非ヒト動物）・ヘテロ接合体・野生型の遺伝子型がメンデルの法則に則った確率で作出されるが、これに対して、用いた非ヒト動物の胎生期の発生・分化に必須な蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子を破壊・組換した場合には、ヘテロ接合体若しくはホモ接合体の非ヒト動物の生存及び出生は困難となり、胎生致死となる。またこれは、ヘテロ接合体が得られる場合においても、実際の出生率と予測される形質出現の確率とを比較することにより推測することができる。
一般的に、実験動物は、系統として確立された動物、即ち遺伝的にホモの状態の動物を用いることが望ましい。このような系統として確立されたホモの状態の動物では、遺伝的背景が詳細に調べられているため、かかる既知の遺伝的背景をもつ実験動物を用いた研究では、その実験動物に施した処置の効果が単一のものとなり、容易に特定することができることになる。一方、雑種動物においては種々の遺伝子がヘテロの状態で存在するため、その動物に対する処置の結果生じた効果が、個々の遺伝的背景を持つ個体の、その処置に対する個々反応の総和として現れるため極めて複雑である。したがってある処置の結果として起こる効果が、その処置の不均一性によるのか、遺伝的背景の不均一性によるのかを判別することは困難である。 Blasting of wild-type female non-human animals such as wild-type female mice in a pseudo-pregnant state according to conventional microinjection and aggregation methods using the thus obtained totipotent cells such as ES cells having a mutant genomic gene It is injected and mixed into a cyst (blastocyst), and then this chimeric embryo is transplanted into a temporary parent's uterus. If embryo differentiation is continued, for example, if the non-human animal is a mouse, it is born as a candidate chimeric non-human animal that is a pup after about 21 days. After breeding the candidate chimeric non-human animal as a foster parent, the chimeric non-human animal (F0) in which the mutant genomic gene of the PHF3 protein enters the germ line cell is selected.
The selection may be performed by observing the difference in hair color (the hair color of the born chimeric non-human animal). (In this case, selection of a chimeric non-human animal having a high proportion of totipotent cells such as recombinant ES cells into which the mutant genomic gene has been introduced becomes easy, and as a result, the mutant genomic gene is introduced into germline cells. The acquisition efficiency of the inserted chimeric non-human animal can be increased.) Other screening may be performed by extracting DNA from a part of the body (for example, the tip of the tail) and then performing Southern blot analysis, PCR analysis, or the like.
A progeny (F1) obtained by mating a non-human animal of the same species with a chimeric non-human animal in which a mutant genomic gene of the PHF3 protein has entered a germ line cell, further part of the body (eg, tail tip) A heterozygote into which a mutant genomic gene of PHF3 protein was introduced (one allele in the diploid was destroyed / recombined) by performing Southern blot analysis, PCR analysis, etc. using DNA extracted from Non-human animals carrying the PHF3 gene) are identified. In addition, for example, skin tissues such as skin, subcutaneous muscle, peritestal adipose tissue, retroperitoneal adipose tissue, mesenteric adipose tissue, subcutaneous adipose tissue, brown adipose tissue, and various other adipose tissues, as well as heart, lung, kidney RNA extraction from gallbladder, liver, pancreas, spleen, intestine, testis (testis), ovary, uterus, placenta, muscle, blood vessel, brain, marrow, thyroid, thymus, mammary gland, etc. By performing PCR real-time quantitative analysis or Northern blot analysis using the product as a material and comparing the results, the increase or decrease in the expression level of the PHF3 protein gene can be examined. Furthermore, by carrying out ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) method using a part of the body (ground or sliced) or body fluid (blood, urine, etc.) and comparing the results, the PHF3 protein You can examine the increase or decrease in quantity.
The heterozygote possessing a mutant genomic gene of PHF3 protein that has been produced possesses a stable mutant genomic gene of PHF3 protein in all germ cells and somatic cells. Can be transmitted to offspring animals. Accordingly, the progeny animals after F1 can be similarly examined for heterozygote identification and increase / decrease in the expression level of the gene or the amount of the protein that is the expression product of the gene.
In general, when the disrupted / recombined gene does not lead to embryonic lethality due to the development and differentiation of the embryonic individuals, homozygotes (all diploids in the diploid) Non-human animals with PHF3 gene in which alleles are disrupted / recombined), heterozygotes, and wild-type genotypes are created with a probability that complies with Mendel's law. When a gene consisting of a base sequence encoding the amino acid sequence of a protein essential for embryonic development and differentiation is disrupted or recombined, it becomes difficult to survive and birth a heterozygous or homozygous non-human animal. , Embryonic lethality. In addition, even when a heterozygote is obtained, this can be estimated by comparing the actual birth rate with the predicted probability of appearance of the trait.
In general, it is desirable to use experimental animals that have been established as strains, that is, genetically homozygous animals. In homozygous animals established as such strains, the genetic background has been examined in detail, so in studies using experimental animals with such a known genetic background, treatments performed on those experimental animals As a result, a single effect is obtained and can be easily identified. On the other hand, since various genes exist in a heterogeneous state in a hybrid animal, the effect resulting from the treatment on the animal appears as the sum of individual responses to the treatment of individuals with individual genetic backgrounds. It is complicated. Therefore, it is difficult to determine whether the effect resulting from a treatment is due to the heterogeneity of the treatment or the genetic background.

このようにして作製された非ヒト動物又はその子孫動物（即ち、ノックアウト非ヒト動物の個体又はその子孫動物）において、各種血液生化学検査、血球検査、尿検査、各種病理組織分析、血中総イムノグロブリンＥ量測定等を実施し、本発明のノックアウトマウスと野生型マウスの生理作用の違いを調べた。因みに、血中総イムノグロブリンＥ量測定はアトピー性皮膚炎を評価する際の指標となる代表的な試験である。
その結果、本明細書実施例に示すとおり、本発明のノックアウト非ヒト動物（例えば、８週齢）は、野生型非ヒト動物と比べて、痂皮形成、皮膚真皮層への細胞浸潤が高頻度で観察され、更に血中総イムノグロブリンＥ濃度が極めて高い所見（例えば４３週齢のマウス）を示した。これらの所見から本発明のノックアウト非ヒト動物は免疫系の機能に異常を呈し、アトピー性皮膚炎を発症するという特徴を有することが判明した。
上記の結果から、本発明のノックアウト非ヒト動物又はその一部と野生型非ヒト動物又はその一部を比較し、アトピー性皮膚炎発症を伴う疾患の発症状態の違いを知ることができる。
更に、本発明の非ヒト動物又はその一部の胎生期から致死までの期間における、発育分化、発達、生活行動の観察、病理組織学的検査又は生化学的検査を行うことによって、ＰＨＦ３タンパク質が関与する疾患についても病態解析を行うこともできる。 In the thus-produced non-human animal or its offspring animal (ie, knockout non-human animal individual or its offspring animal), various blood biochemical tests, blood cell tests, urinalysis, various histopathological analyzes, blood total The amount of immunoglobulin E was measured, and the difference in physiological action between the knockout mouse of the present invention and the wild type mouse was examined. Incidentally, measurement of the total amount of immunoglobulin E in the blood is a typical test that serves as an index when evaluating atopic dermatitis.
As a result, as shown in the Examples of the present specification, the knockout non-human animal (eg, 8 weeks old) of the present invention has higher crust formation and cell infiltration into the skin dermis layer than the wild-type non-human animal. It was observed at a high frequency, and also showed an extremely high blood total immunoglobulin E concentration (for example, a 43-week-old mouse). From these findings, it was found that the knockout non-human animal of the present invention has an abnormality in the function of the immune system and develops atopic dermatitis.
From the above results, the knockout non-human animal or part thereof of the present invention can be compared with the wild-type non-human animal or part thereof, and the difference in the onset state of the disease accompanied by the development of atopic dermatitis can be known.
Furthermore, the PHF3 protein can be obtained by performing developmental differentiation, development, observation of living behavior, histopathological examination or biochemical examination in the period from the embryonic period to lethality of the non-human animal of the present invention or a part thereof. Pathological analysis can also be performed for the diseases involved.

本発明は、更に、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失・低下するように破壊・組換されてなることを特徴とする初代培養又は株化された動物細胞、及び、配列番号８で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列からなる蛋白質のゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失・低下するように破壊・組換されてなることを特徴とする初代培養又は株化された動物細胞も提供する。   The present invention further provides that all or one allele in the diploid of the genomic gene of the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is substituted with the loss-of-function mutant-lowering mutant gene, or Primary culture or established animal cell characterized in that all or one allele in diploid is disrupted / recombined so that its function is lost / reduced, and shown by SEQ ID NO: 8 All or one of the alleles in the diploid of the genomic gene of the protein consisting of the amino acid sequence encoded by the base sequence is replaced by the loss-of-function / decreased mutant gene, or all or one in the diploid of the genomic gene Also provided is a primary cultured or established animal cell, characterized in that the allele of is destroyed or recombined so that its function is lost or reduced.

本発明の第２の態様は、上記本発明のノックアウト非ヒト動物からなる、アトピー性皮膚炎発症を伴う疾患のモデル動物に関する。
本発明のノックアウト非ヒト動物は、ＰＨＦ３タンパク質の発現量が野生型に比べて有意に低下しており、当該蛋白質が関与する疾患を表現することができる。即ち前述のとおり、具体的には以下の所見：
（ａ）皮膚における痂皮形成
（ｂ）皮膚真皮層への細胞浸潤
（ｃ）高い血中総イムノグロブリンＥ濃度
（ｄ）アトピー性皮膚炎関連因子の発現量変動
を示す。
従って、本発明のノックアウト非ヒト動物は、アトピー性皮膚炎発症を伴う疾患のモデル動物として、１）アトピー性皮膚炎発症を伴う疾患等の病態解析を行うため、２）医薬品・食品又は医薬品候補物質・食品候補物質等のアトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果を評価するために用いることができる。
本明細書において病態解析とは、アトピー性皮膚炎発症を伴う疾患により生ずる生体内のあらゆる変化を解析することを意味する。
即ち、本発明のノックアウト非ヒト動物と野生型非ヒト動物を比較し、胎生期から致死までの期間における、発育分化、発達、生活行動の観察、病理組織学的検査又は生化学的検査を行うことにより病態解析を実施することができる。これらの病態解析における観察及び検査については、当業者が通常用いる方法に従えばよく、「トランスジェニック動物」山村研一他 編（共立出版株式会社）」等を参照することができる。
例えば、本発明のノックアウト非ヒト動物の組織から抽出されるトータルRNAをＰＣＲリアルタイム定量解析又はノザンブロット解析等の方法で分析し、野性型非ヒト動物における値と比較することにより、当該組織において発現が誘導若しくは抑制されている遺伝子を同定することができる。その結果から、アトピー性皮膚炎発症を伴う疾患において発現が変動するマーカー遺伝子を探索することができ、延いては疾患の原因因子解明の指標とすることもできる。
実際に、本発明実施例に示すとおり、本発明のノックアウト非ヒト動物では、アトピー性皮膚炎関連因子の発現量が変動していることが判明した。即ち、血中におけるイムノグロブリンＥの発現が上昇しており、これの発現を指標としてアトピー性皮膚炎発症を伴う疾患モデル動物における、罹患の有無を判断できることがわかる。
一方、医薬品・食品又は医薬品候補物質・食品候補物質等のアトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果を評価する方法については、以下に詳細に説明する。 The second aspect of the present invention relates to a model animal of a disease associated with the development of atopic dermatitis, comprising the knockout non-human animal of the present invention.
In the knockout non-human animal of the present invention, the expression level of PHF3 protein is significantly lower than that of the wild type, and can express a disease involving the protein. That is, as mentioned above, specifically the following findings:
(A) Crust formation in skin (b) Cell infiltration into skin dermis layer (c) High blood total immunoglobulin E concentration (d) Variation in expression level of atopic dermatitis related factor.
Therefore, the knockout non-human animal of the present invention is used as a model animal for diseases associated with the development of atopic dermatitis. 1) To conduct pathological analysis of diseases associated with the development of atopic dermatitis, etc. 2) Drugs / foods or drug candidates It can be used to evaluate atopic dermatitis treatment effect or onset prevention effect of substances / food candidate substances.
In this specification, pathological analysis means analyzing all changes in a living body caused by a disease accompanied by the onset of atopic dermatitis.
That is, the knockout non-human animal of the present invention is compared with a wild-type non-human animal, and developmental differentiation, development, observation of living behavior, histopathological examination, or biochemical examination is performed during the period from embryonic period to lethality. It is possible to carry out pathological analysis. For observation and examination in these pathological conditions analysis, methods commonly used by those skilled in the art may be used, and reference can be made to “Transgenic Animals” Kenichi Yamamura et al. (Kyoritsu Publishing Co., Ltd.).
For example, the total RNA extracted from the tissue of the knockout non-human animal of the present invention is analyzed by a method such as PCR real-time quantitative analysis or Northern blot analysis, and the expression in the tissue is compared with the value in the wild-type non-human animal. Genes that are induced or suppressed can be identified. From the results, it is possible to search for a marker gene whose expression fluctuates in a disease associated with the development of atopic dermatitis.
Actually, as shown in the Examples of the present invention, it was found that the expression level of the atopic dermatitis-related factor varies in the knockout non-human animal of the present invention. That is, the expression of immunoglobulin E in the blood is increased, and it can be seen that the presence or absence of disease in a disease model animal associated with the development of atopic dermatitis can be determined using this expression as an index.
On the other hand, a method for evaluating the effect of treating or preventing the onset of atopic dermatitis such as a drug / food or drug candidate / food candidate will be described in detail below.

本発明の第３の態様は、本発明のノックアウト非ヒト動物又はその一部を用いる、被験物質におけるアトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果の評価方法に関する。
作製された非ヒト動物又はその子孫動物或いはその一部（即ち、ノックアウト非ヒト動物の個体又はその子孫動物或いはそれらの一部）は、アトピー性皮膚炎に関連する疾患等に対する医薬品・食品開発等の分野において有用である。また当該非ヒト動物又はその子孫動物或いはその一部は、アトピー性皮膚炎制御物質を評価するために使用することができる。 3rd aspect of this invention is related with the evaluation method of the atopic dermatitis therapeutic effect or onset prevention effect in a test substance using the knockout non-human animal of this invention, or its part.
The produced non-human animal or its progeny animal or part thereof (that is, the individual of knock-out non-human animal or its progeny animal or part thereof) is a drug / food development for diseases related to atopic dermatitis, etc. It is useful in the field of The non-human animal or its progeny animal or a part thereof can be used for evaluating an atopic dermatitis control substance.

本発明の評価方法は、
（１）本発明のノックアウト非ヒト動物又はその一部に被験物質を接触させる第一工程、（２）前記被験物質を接触させた非ヒト動物又はその一部におけるアトピー性皮膚炎関連因子の発現量又は当該量に相関関係を有する指標値を測定し、対照と比較する第二工程、
（３）（２）の比較結果に基づき、被験物質のアトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果を評価する第三工程からなる。 The evaluation method of the present invention is:
(1) First step of contacting a test substance with the knockout non-human animal or a part thereof of the present invention, (2) Expression of atopic dermatitis-related factor in the non-human animal or a part thereof contacted with the test substance A second step of measuring an amount or an index value correlated with the amount and comparing it to a control;
(3) Based on the comparison result of (2), it consists of a third step of evaluating the atopic dermatitis treatment effect or onset prevention effect of the test substance.

本明細書においてアトピー性皮膚炎制御物質とは、アトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果を有する物質を表す。
「アトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果」とは、例えば、アトピー性皮膚炎の特徴的な症状である、痂皮形成、皮膚真皮層への細胞浸潤及び高い血中総イムノグロブリンＥ濃度を改善する活性等に基づく当該疾患における治療効果又は発症予防効果を意味する。 In the present specification, an atopic dermatitis control substance represents a substance having a therapeutic effect or prevention of onset of atopic dermatitis.
“Atopic dermatitis treatment effect or onset prevention effect” means, for example, scab formation, cell infiltration into the dermal layer and high blood total immunoglobulin E concentration, which are characteristic symptoms of atopic dermatitis It means a therapeutic effect or an onset prevention effect in the disease based on the improving activity or the like.

本明細書において、被験物質としては特に限定は無く、核酸、ペプチド、タンパク質（本タンパク質に対する抗体を含む）、有機化合物、無機化合物等であり、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子有機化合物、合成ペプチド、合成核酸、天然化合物等が挙げられる。ここで「本タンパク質に対する抗体」としては、例えば、配列番号１又は７記載のアミノ酸配列又はその部分領域からなるタンパク質に免疫特異的な抗体等を挙げることができる。   In this specification, the test substance is not particularly limited, and includes nucleic acids, peptides, proteins (including antibodies to the protein), organic compounds, inorganic compounds, etc., cell extracts, gene library expression products, synthetic low Examples include molecular organic compounds, synthetic peptides, synthetic nucleic acids, natural compounds, and the like. Here, examples of the “antibody against the present protein” include an antibody immunospecific for a protein comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 or 7 or a partial region thereof.

本明細書において「本発明のノックアウト非ヒト動物又はその一部に被験物質を接触させる」とは、被験物質を当該非ヒト動物に投与すること、又は被験物質を当該非ヒト動物の一部に接触させることを表し、当業者に汎用されている方法で実施することができる。
被験物質を当該非ヒト動物に投与する場合、その投与方法には特に限定はなく、経口的若しくは非経口的に投与すればよい。非経口的投与方法としては、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与（ip）、直腸内投与、経皮投与（塗布）等を挙げることができる。
被験物質の形態に特に限定は無く、固体、液体、基剤との混合物、縣濁液又は溶液等として用いることができる。縣濁液若しくは溶液とする場合、水、pH緩衝液、メチルセルロース溶液、生理食塩水、有機溶媒水溶液（有機溶媒としては通常エタノールやジメチルスルホキシドが用いられる。）等を用いる。基剤としてはグリセリン、スクワラン等の油等が挙げられ主に塗布用の被験物質を調製するために用いられる。 As used herein, “contacting a test substance with the knockout non-human animal of the present invention or a part thereof” means that the test substance is administered to the non-human animal, or the test substance is applied to a part of the non-human animal. Represents contact, and can be carried out by methods commonly used by those skilled in the art.
When the test substance is administered to the non-human animal, the administration method is not particularly limited and may be administered orally or parenterally. Examples of parenteral administration methods include intravenous administration, subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration (ip), rectal administration, and transdermal administration (application).
There is no particular limitation on the form of the test substance, and the test substance can be used as a solid, liquid, mixture with a base, suspension or solution. In the case of a suspension or solution, water, pH buffer solution, methylcellulose solution, physiological saline, aqueous organic solvent solution (ethanol or dimethyl sulfoxide is usually used as the organic solvent) or the like is used. Examples of the base include oils such as glycerin and squalane, and are mainly used for preparing test substances for application.

「アトピー性皮膚炎関連因子の発現量」の測定方法としては、該蛋白質のRNA量を検出・測定する方法及び、該蛋白質量を検出・測定する方法が挙げられ、後述するアトピー性皮膚炎関連因子の発現量の測定方法、又は実施例に記載の方法と同様に行えばよい。
前記評価方法の第二工程における「アトピー性皮膚炎関連因子の発現量に相関関係を有する指標値」としては、
（ａ）皮膚における痂皮形成
（ｂ）皮膚真皮層への細胞浸潤
（ｃ）ＰＨＦ３タンパク質の発現量
を挙げることができる。
皮膚における痂皮形成の測定方法としては、例えば、肉眼による観察を挙げることができる。
皮膚真皮層への細胞浸潤の測定方法としては、例えば、皮膚又は骨髄切片を固定しＨＥ染色した標本を作製して観察する方法が挙げられる。
アトピー性皮膚炎関連因子の測定方法としては、当業者に良く知られたELISAキットによる方法等を用いることができる。
その他本発明のノックアウト非ヒト動物の生化学的解析手法については、当業者に良く知られた方法又は「 The Journal of Clinical Investigation ,April2002,vol.109,no.8（Robert V. Farese Jr.ら著）」又は「Ｎature Ｇenetics, vol.25, may 2000（Robert V. Farese Jr.ら著」等に記載された方法が挙げられる。 Examples of the method for measuring “expression amount of atopic dermatitis-related factor” include a method for detecting and measuring the RNA amount of the protein and a method for detecting and measuring the amount of the protein. What is necessary is just to carry out similarly to the measuring method of the expression level of a factor, or the method as described in an Example.
As the “index value having a correlation with the expression level of atopic dermatitis-related factors” in the second step of the evaluation method,
(A) Crust formation in skin (b) Cell infiltration into skin dermis layer (c) Expression level of PHF3 protein can be mentioned.
Examples of the method for measuring scab formation in the skin include observation with the naked eye.
Examples of the method for measuring cell infiltration into the skin dermis layer include a method in which a skin or bone marrow section is fixed and a HE-stained specimen is prepared and observed.
As a method for measuring an atopic dermatitis-related factor, an ELISA kit method well known to those skilled in the art can be used.
Other methods for biochemical analysis of the knockout non-human animal of the present invention are well known to those skilled in the art or “The Journal of Clinical Investigation, April 2002, vol. 109, no. 8 (Robert V. Farese Jr. et al. ”) Or“ Nature Genetics, vol. 25, may 2000 (Robert V. Farese Jr. et al. ”).

本明細書において「アトピー性皮膚炎関連因子」とは、例えば、抗原刺激によりＴ細胞が活性化される過程に関わる因子、Ｔ細胞によりＢ細胞が活性化される過程に関わる因子、炎症に関わる因子であり、具体的にはIFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-18又はイムノグロブリンＥ等から選択される１又は複数の因子が挙げられる。該アトピー性皮膚炎関連因子の発現量の測定を行う場合、測定対象としてRNAを用いる方法及び測定対象として蛋白質を用いる方法が挙げられる。尚、当該IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-18又はイムノグロブリンＥの量を低下させる被験物質をアレルギー疾患に対する治療剤又は発症予防剤の候補物質として選択することが好ましい。
以下それぞれについて詳細に述べる。
１）測定対象としてRNAを用いる場合
生体試料としてRNAを利用する場合において、該アトピー性皮膚炎関連因子の発現量を測定するには、生体試料に含まれるトータルRNA単位量当りのIFN-γ遺伝子、IL-4遺伝子、IL-5遺伝子、IL-13遺伝子又はIL-18遺伝子の発現レベルを検出し、これを測定すればよい。
アトピー性皮膚炎関連因子遺伝子の由来動物種は特に限定は無いが、通常、本発明非ヒト動物と同一種由来の遺伝子を用いる。 In the present specification, “atopic dermatitis-related factor” means, for example, a factor related to the process of T cell activation by antigen stimulation, a factor related to the process of B cell activation by T cell, and inflammation. Specific examples include one or more factors selected from IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-13, IL-18, immunoglobulin E and the like. When measuring the expression level of the atopic dermatitis-related factor, a method using RNA as the measurement target and a method using protein as the measurement target can be mentioned. In addition, a test substance that reduces the amount of IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-13, IL-18 or immunoglobulin E should be selected as a candidate substance for a therapeutic agent or preventive agent for allergic diseases. Is preferred.
Each is described in detail below.
1) When RNA is used as a measurement target When RNA is used as a biological sample, in order to measure the expression level of the atopic dermatitis-related factor, the IFN-γ gene per unit amount of total RNA contained in the biological sample The expression level of IL-4 gene, IL-5 gene, IL-13 gene or IL-18 gene may be detected and measured.
The animal species from which the atopic dermatitis-related factor gene is derived is not particularly limited, but usually a gene derived from the same species as the non-human animal of the present invention is used.

IFN-γ遺伝子としては、例えば、マウス由来のIFN-γ遺伝子（Genbank Accession No. NM_008337）やヒト由来のIFN-γ遺伝子（Genbank Accession No. NM_000619）等が挙げられる。
IL-4遺伝子としては、例えば、マウス由来のIL-4遺伝子（Genbank Accession No. NM_021283）やヒト由来のIL-4遺伝子（Genbank Accession No. NM_000589）等が挙げられる。
IL-5遺伝子としては、例えば、マウス由来のIL-5遺伝子（Genbank Accession No. NM_010558）やヒト由来のIL-5遺伝子（Genbank Accession No. NM_000879）等が挙げられる。
IL-13遺伝子としては、例えば、マウス由来のIL-13遺伝子（Genbank Accession No. NM_008355）や、ヒト由来のIL-13遺伝子（Genbank Accession No. NM_002188）等が挙げられる。
IL-18遺伝子としては、例えば、マウス由来のIL-18遺伝子（Genbank Accession No. NM_008360）や、ヒト由来のIL-18遺伝子（Genbank Accession No. NM_001562）等が挙げられる。

２）測定対象としてタンパク質を用いる場合
生体試料としてタンパク質を利用する場合においては、該アトピー性皮膚炎関連因子の発現量を測定するには、生体試料に含まれるトータルタンパク質単位量当りのIFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-18、イムノグロブリンEの発現レベルを検出し、これを測定すればよい。
アトピー性皮膚炎関連因子（タンパク質）の由来動物種は特に限定は無いが、通常、本発明非ヒト動物と同一種由来のタンパク質を用いる。
IFN-γとしては、例えば、マウス由来のIFN-γ（Genbank Accession No. NP_032363）や、ヒト由来のIFN-γ（Genbank Accession No. NP_000610）等が挙げられる。
IL-4としては、例えば、マウス由来のIFN-γ（Genbank Accession No. NP_067258）や、ヒト由来のIFN-γ（Genbank Accession No. NP_000580）等が挙げられる。
IL-5としては、例えば、マウス由来のIFN-γ（Genbank Accession No. NP_034688）や、ヒト由来のIFN-γ（Genbank Accession No. NP_000870）等が挙げられる。
IL-13としては、例えば、マウス由来のIFN-γ（Genbank Accession No. NP_032381）や、ヒト由来のIFN-γ（Genbank Accession No. NP_002179）等が挙げられる。
IL-18としては、例えば、マウス由来のIFN-γ（Genbank Accession No. NP_032386）や、ヒト由来のIFN-γ（Genbank Accession No. NP_001553）等が挙げられる。
イムノグロブリンＥとしては、例えば、ヒト由来のイムノグロブリンＥ（Genbank Accession No. XP_370782）等が挙げられる。 Examples of the IFN-γ gene include a mouse-derived IFN-γ gene (Genbank Accession No. NM_008337) and a human-derived IFN-γ gene (Genbank Accession No. NM_000619).
Examples of the IL-4 gene include mouse-derived IL-4 gene (Genbank Accession No. NM_021283) and human-derived IL-4 gene (Genbank Accession No. NM_000589).
Examples of the IL-5 gene include mouse-derived IL-5 gene (Genbank Accession No. NM_010558) and human-derived IL-5 gene (Genbank Accession No. NM_000879).
Examples of the IL-13 gene include mouse-derived IL-13 gene (Genbank Accession No. NM_008355), human-derived IL-13 gene (Genbank Accession No. NM_002188), and the like.
Examples of the IL-18 gene include mouse-derived IL-18 gene (Genbank Accession No. NM_008360) and human-derived IL-18 gene (Genbank Accession No. NM_001562).

2) When protein is used as a measurement target When protein is used as a biological sample, the expression level of the atopic dermatitis-related factor can be measured by measuring IFN-γ per unit amount of total protein contained in the biological sample. IL-4, IL-5, IL-13, IL-18, and immunoglobulin E expression levels may be detected and measured.
There is no particular limitation on the animal species from which the atopic dermatitis-related factor (protein) is derived, but usually a protein derived from the same species as the non-human animal of the present invention is used.
Examples of IFN-γ include mouse-derived IFN-γ (Genbank Accession No. NP_032363) and human-derived IFN-γ (Genbank Accession No. NP_000610).
Examples of IL-4 include mouse-derived IFN-γ (Genbank Accession No. NP_067258) and human-derived IFN-γ (Genbank Accession No. NP_000580).
Examples of IL-5 include mouse-derived IFN-γ (Genbank Accession No. NP_034688) and human-derived IFN-γ (Genbank Accession No. NP_000870).
Examples of IL-13 include mouse-derived IFN-γ (Genbank Accession No. NP_032381) and human-derived IFN-γ (Genbank Accession No. NP_002179).
Examples of IL-18 include mouse-derived IFN-γ (Genbank Accession No. NP_032386) and human-derived IFN-γ (Genbank Accession No. NP_001553).
Examples of the immunoglobulin E include human-derived immunoglobulin E (Genbank Accession No. XP_370782).

本発明の非ヒト動物、その子孫若しくはそれらの一部において、上記アトピー性皮膚炎関連因子遺伝子（或いは遺伝子産物）の発現の有無又はその程度を検出することによって、当該遺伝子発現の有無又はその程度を測定することができる。即ち、
１）測定対象としてＲＮＡを用いる場合
本発明のノックアウト非ヒト動物の各種組織から抽出されたＲＮＡを材料としたＰＣＲリアルタイム定量解析又はノザンブロット解析を実施することによって、アトピー性皮膚炎関連因子遺伝子の発現量の増減又はこれに連動する他の遺伝子の発現量の動向を調べることにより、アトピー性皮膚炎発症を伴う疾患の発症状態を知ることができ、延いては疾患の原因因子解明の指標とすることもできる。
即ち、本発明の非ヒト動物由来の生体試料とアトピー性皮膚炎関連因子遺伝子由来のプライマー若しくはプローブとを接触させ、該プライマー若しくはプローブと結合するRNA量を、ノーザンブロット法、ＲＴ-ＰＣＲ法、ＤＮＡチップ解析法、in situハイブリダイゼーション解析法等の公知の方法で測定することができる。該プライマー若しくはプローブとしては、アトピー性皮膚炎関連因子遺伝子の塩基配列において連続する少なくとも15塩基を有するポリヌクレオチド及び／又はその相補的なポリヌクレオチドが挙げられる。
プライマーとして用いる場合には、通常15bp〜100bp、好ましくは15bp〜50bp、より好ましくは15bp〜35bpの塩基長を有するポリヌクレオチドが例示できる。また検出プローブとして用いる場合には、通常15bp〜全配列の塩基数、好ましくは15bp〜1kb、より好ましくは100bp〜1kbの塩基長を有するポリヌクレオチドが例示できる。 By detecting the presence or absence of the expression of the atopic dermatitis-related factor gene (or gene product) in the non-human animal of the present invention, its progeny or a part thereof, the presence or absence of the gene expression or the degree thereof Can be measured. That is,
1) When RNA is used as a measurement target Expression of atopic dermatitis-related factor gene by performing PCR real-time quantitative analysis or Northern blot analysis using RNA extracted from various tissues of the knockout non-human animal of the present invention as a material By examining the trends in the amount of expression of other genes linked to the increase or decrease of the amount, it is possible to know the onset state of the disease accompanied by the onset of atopic dermatitis, and as an index for elucidating the cause of the disease You can also
That is, a non-human animal-derived biological sample of the present invention is contacted with a primer or probe derived from an atopic dermatitis-related factor gene, and the amount of RNA that binds to the primer or probe is determined by Northern blotting, RT-PCR, It can be measured by a known method such as a DNA chip analysis method or an in situ hybridization analysis method. Examples of the primer or probe include a polynucleotide having at least 15 bases continuous in the base sequence of the atopic dermatitis-related factor gene and / or a complementary polynucleotide thereof.
When used as a primer, a polynucleotide having a base length of usually 15 bp to 100 bp, preferably 15 bp to 50 bp, more preferably 15 bp to 35 bp can be exemplified. When used as a detection probe, a polynucleotide usually having a base length of 15 bp to the entire sequence, preferably 15 bp to 1 kb, more preferably 100 bp to 1 kb can be exemplified.

ノーザンブロット法を利用する場合には、具体的には、前記プローブを放射性同位元素（32P、33P等：RI）や蛍光物質等で標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーした被験者の生体組織由来のRNAとハイブリダイズさせた後、形成されたアトピー性皮膚炎関連因子由来のプライマー（DNA又はRNA）と生体試料由来の全RNAとの二重鎖を、前記プライマーの標識物（RI若しくは蛍光物質）に由来するシグナルを放射線検出器（BAS-1800II、富士フィルム社製）又は蛍光検出器で検出、測定する方法を例示することができる。また、AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham PharamciaBiotech社製)を用いて、該プロトコールに従ってプローブDNAを標識し、生体試料由来のRNAとハイブリダイズさせた後、プローブの標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージャーSTORM860（Amersham Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する方法を使用することもできる。   When using Northern blotting, specifically, the subject labeled with a radioactive isotope (32P, 33P, etc .: RI) or a fluorescent substance, and transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method After hybridization with RNA derived from a living tissue, a primer (DNA or RNA) derived from an atopic dermatitis-related factor formed and a total of RNA derived from a biological sample are labeled with the primer ( Examples thereof include a method of detecting and measuring a signal derived from RI or a fluorescent substance with a radiation detector (BAS-1800II, manufactured by Fuji Film) or a fluorescence detector. In addition, using the AlkPhos Direct Labeling and Detection System (Amersham Pharamcia Biotech), the probe DNA is labeled according to the protocol, hybridized with RNA derived from a biological sample, and then the signal derived from the probe label is converted into a multibioin signal. A method of detecting and measuring with Major STORM860 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) can also be used.

RT-PCR法を利用する場合には、生体試料由来のRNAと前記プライマーをハイブリダイズさせ、常法に従ってＰＣＲ法を行い、得られた増幅二本鎖ＤＮＡを検出する方法を例示することができる。尚、増幅された二本鎖ＤＮＡの検出は、上記ＰＣＲを予めRIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用いて行うことによって産生される標識二本鎖ＤＮＡを検出する方法、産生された二本鎖ＤＮＡを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した疾患マーカーをプローブとして使用してこれとハイブリダイズさせて検出する方法等を用いることができる。尚、生成された標識二本鎖ＤＮＡ産物はアジレント2100バイオアナライザ（横河アナリティカルシステムズ社製）等で測定することができる。また、SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems 社製)で該プロトコールに従ってRT-PCR反応液を調製し、ABI PRIME 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems 社製)で反応させて、該反応物を検出することもできる。   When using the RT-PCR method, a method of hybridizing RNA derived from a biological sample and the above primers, performing the PCR method according to a conventional method, and detecting the obtained amplified double-stranded DNA can be exemplified. . In addition, the detection of the amplified double-stranded DNA was performed by a method for detecting the labeled double-stranded DNA produced by performing the PCR using a primer previously labeled with RI or a fluorescent substance. For example, a method may be used in which double-stranded DNA is transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method, and a labeled disease marker is used as a probe to hybridize with this to detect it. The produced labeled double-stranded DNA product can be measured with an Agilent 2100 bioanalyzer (manufactured by Yokogawa Analytical Systems) or the like. Also, prepare an RT-PCR reaction solution with SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems) according to the protocol, and react with ABI PRIME 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems) to detect the reaction product. You can also.

また、ＤＮＡチップ解析を利用する場合には、本発明の前記プライマー若しくはプローブをＤＮＡプローブ（１本鎖又は２本鎖）として貼り付けたＤＮＡチップを用意し、これに生体組織由来のRNAから常法によって調製されたcRNAとハイブリダイズさせて、形成されたDNAとcRNAとの二本鎖を、本発明の前記プライマー若しくはプローブから調製される標識プローブと結合させて検出する方法を挙げることができる。また、上記DNAチップとして、IFN-γ遺伝子、IL-4遺伝子、IL-5遺伝子、IL-13遺伝子、IL-18遺伝子又はイムノグロブリンＥ遺伝子の遺伝子発現レベルの検出、測定が可能なＤＮＡチップを用いることもできる。   When DNA chip analysis is used, a DNA chip on which the primer or probe of the present invention is attached as a DNA probe (single strand or double strand) is prepared, and RNA is derived from RNA derived from living tissue. And a method of detecting a double strand of DNA and cRNA formed by hybridization with a cRNA prepared by the above method and binding to a labeled probe prepared from the primer or probe of the present invention. . In addition, a DNA chip capable of detecting and measuring the gene expression level of the IFN-γ gene, IL-4 gene, IL-5 gene, IL-13 gene, IL-18 gene or immunoglobulin E gene as the above DNA chip It can also be used.

２）測定対象として蛋白質を用いる場合
生体試料として蛋白質を含む溶液を利用する場合には、生体試料に含まれるアトピー性皮膚炎関連因子量を該アトピー性皮膚炎関連因子を認識し得る抗体と反応させることによって、該抗体と結合し得るアトピー性皮膚炎関連因子量を検出し、測定することによって実施される。
アトピー性皮膚炎関連因子を認識し得る抗体の由来動物種は特に限定は無いが、通常は本発明非ヒト動物と同一種由来のアトピー性皮膚炎関連因子を抗原として得られる抗体を用いる。
アトピー性皮膚炎関連因子として、具体的にはIFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-18又はイムノグロブリンＥが挙げられ、そのアミノ酸配列としては、それぞれ上述のアトピー性皮膚炎関連因子遺伝子によってコードされる蛋白質を挙げることができる。 2) When using a protein as a measurement target When using a solution containing a protein as a biological sample, react the amount of atopic dermatitis-related factor contained in the biological sample with an antibody capable of recognizing the atopic dermatitis-related factor. By detecting and measuring the amount of atopic dermatitis-related factor that can bind to the antibody.
There are no particular limitations on the animal species from which the antibody capable of recognizing the atopic dermatitis-related factor is used. Usually, an antibody obtained using the atopic dermatitis-related factor derived from the same species as the non-human animal of the present invention as an antigen is used.
Specific examples of atopic dermatitis-related factors include IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-13, IL-18, or immunoglobulin E. The amino acid sequences thereof are the above-mentioned atopic properties. Mention may be made of proteins encoded by dermatitis-related factor genes.

前記アトピー性皮膚炎関連因子の抗体は、その形態に特に制限はなく、前記アトピー性皮膚炎関連因子を免疫抗原とするポリクローナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよく、更には当該アトピー性皮膚炎関連因子を構成するアミノ酸配列のうち少なくとも連続する３アミノ酸、通常8アミノ酸、好ましくは15アミノ酸程度からなるポリペプチドに対して抗原結合性を有する抗体が、本発明の抗体に含まれる。   The antibody for the atopic dermatitis-related factor is not particularly limited in its form, and may be a polyclonal antibody using the atopic dermatitis-related factor as an immunizing antigen, or a monoclonal antibody thereof. The antibody of the present invention includes an antibody having an antigen binding property to a polypeptide consisting of at least 3 consecutive amino acids, usually 8 amino acids, preferably about 15 amino acids among the amino acid sequences constituting the atopic dermatitis-related factor. It is.

これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従って製造することができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12〜11.13）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したIFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-18又はイムノグロブリンＥを用いて、或いは常法に従って当該いずれかのタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドを合成して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌等で発現し精製したIFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-18又はイムノグロブリンＥ、或いはこれらタンパク質の部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドをマウス等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4〜11.11）。   Methods for producing these antibodies are already well known, and the antibodies of the present invention can also be produced according to these conventional methods (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12-11.13). Specifically, when the antibody of the present invention is a polyclonal antibody, IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-13, IL-18 or immunoglobulin E expressed and purified in Escherichia coli according to a conventional method. Or by synthesizing an oligopeptide having a partial amino acid sequence of any of the proteins according to a conventional method, and immunizing a non-human animal such as a rabbit and obtaining it from the serum of the immunized animal according to a conventional method It is. On the other hand, in the case of a monoclonal antibody, IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-13, IL-18 or immunoglobulin E expressed in E. coli or the like and purified according to a conventional method, or a partial amino acid sequence of these proteins Can be obtained from hybridoma cells prepared by immunizing non-human animals such as mice with non-human animals such as mice and fusing the obtained spleen cells and myeloma cells (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4-11.11).

また、抗体の作製に使用されるタンパク質は、本発明により提供されるアトピー性皮膚炎関連因子の遺伝子の配列情報に基づいて、ＤＮＡクローニング、発現プラスミドの構築、宿主へのトランスフェクション、形質転換体の培養及び培養物からのタンパク質の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、或いは文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)）等に準じて行うことができる。具体的にはアトピー性皮膚炎関連因子をコードする遺伝子を所望の宿主細胞中で発現できる組み換えDNA（発現ベクター）を作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転換体を培養して、得られる培養物から、目的タンパク質を回収することによって実施することができる。また、これらアトピー性皮膚炎関連因子は、本発明により提供されるアミノ酸配列の情報に従って、一般的な化学合成法（ペプチド合成）によって製造することもできる。具体的には、「ペプチド合成の基礎と実験」（泉屋信夫ら著、丸善、1987年発行）に記載された液相合成法や固相合成法を用いることができる。   The protein used for the production of the antibody is DNA cloning, expression plasmid construction, host transfection, transformant based on the sequence information of the gene for atopic dermatitis-related factor provided by the present invention. It can be obtained by the operation of culturing and recovering the protein from the culture. These operations are in accordance with methods known to those skilled in the art or methods described in the literature (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)), etc. Can be done. Specifically, a recombinant DNA (expression vector) capable of expressing a gene encoding an atopic dermatitis-related factor in a desired host cell is prepared, and this is introduced into a host cell for transformation. The target protein can be recovered from the culture obtained by culturing. These atopic dermatitis-related factors can also be produced by a general chemical synthesis method (peptide synthesis) in accordance with the amino acid sequence information provided by the present invention. Specifically, the liquid phase synthesis method and the solid phase synthesis method described in “Basics and Experiments of Peptide Synthesis” (Nobuo Izumiya et al., Maruzen, published in 1987) can be used.

尚、本発明のアトピー性皮膚炎関連因子には、上記のアミノ酸配列を有するタンパク質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、上記のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、上記のタンパク質の機能と同等の生物学的機能を有するか、及び／又は免疫学的活性において同等の活性を有するタンパク質を挙げることができる。ここで免疫学的活性において同等とは、アトピー性皮膚炎関連因子に対する抗体と特異的に結合能力を有する蛋白質を挙げることができる。   The atopic dermatitis-related factors of the present invention include not only proteins having the above amino acid sequences but also homologues thereof. The homologue is composed of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the protein, and has a biological function equivalent to the function of the protein. And / or proteins having equivalent activity in immunological activity. Here, equivalent in immunological activity can include a protein having a specific binding ability with an antibody against an atopic dermatitis-related factor.

本発明評価方法の第二工程における「対照」は、例えば、
（ａ）当該評価方法で使用される本発明非ヒト動物と同動物種である野生型非ヒト動物を対象として第一工程及び第二工程と同様な工程を実施した場合、又は
（ｂ）被験物質の代わりに対照物質（ポジティブコントロール、ネガティブコントロール）を用いて第一工程及び第二工程と同様な工程を実施した場合等を意味する。 The “control” in the second step of the evaluation method of the present invention is, for example,
(A) When a step similar to the first step and the second step is performed on a wild-type non-human animal that is the same species as the non-human animal of the present invention used in the evaluation method, or (b) a test It means a case where a control substance (positive control, negative control) is used instead of a substance and the same steps as the first step and the second step are performed.

前記（ａ）の場合、本発明の非ヒト動物におけるアトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果が野生型非ヒト動物における被験物質のアトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果と同等以上であれば、当該被験物質はアトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果を有すると評価することができる。一方、本発明の非ヒト動物におけるアトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果が野生型非ヒト動物における被験物質のアトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果よりも小さければ、当該被験物質はＰＨＦ３タンパク質に起因するアトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果を有さないと評価することができる。
前記（ｂ）の場合、対照物質としては、ポジティブコントロール又はネガティブコントロールが挙げられる。ポジティブコントロールとは、アトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果を有する任意の物質を表し、具体的にはコルチコステロイド等が例示される。また、ネガティブコントロールとしては、被験物質に含まれる溶媒、バックグランドとなる試験系溶液等が挙げられる。
対照物質をネガティブコントロールとする場合、被験物質のアトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果が対照物質のアトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果よりも大きければ、当該被験物質はアトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果を有すると評価することができる。一方、被験物質のアトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果が対照物質のアトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果と同程度若しくは小さければ、当該被験物質はアトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果を有さないと評価することができる。
また、対照物質をポジティブコントロールとする場合、被験物質のアトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果と対照物質のアトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果を比較することによって、被験物質のアトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果の程度を評価することができる。 In the case of (a), if the atopic dermatitis treatment effect or onset prevention effect in the non-human animal of the present invention is equal to or greater than the atopic dermatitis treatment effect or onset prevention effect of the test substance in the wild-type non-human animal The test substance can be evaluated as having an atopic dermatitis treatment effect or an onset prevention effect. On the other hand, if the atopic dermatitis therapeutic effect or the onset preventing effect in the non-human animal of the present invention is smaller than the atopic dermatitis therapeutic effect or the onset preventing effect of the test substance in the wild-type non-human animal, the test substance is PHF3 protein. It can be evaluated that it does not have a therapeutic effect or preventive effect on atopic dermatitis due to.
In the case of (b), the control substance includes a positive control or a negative control. A positive control represents an arbitrary substance having an atopic dermatitis treatment effect or onset prevention effect, and specific examples thereof include corticosteroids. Examples of the negative control include a solvent contained in the test substance, a test system solution as a background, and the like.
When the control substance is a negative control, the test substance is treated for atopic dermatitis if the test substance has a treatment effect or prevention effect on atopic dermatitis greater than the treatment effect or prevention effect of the control substance. It can be evaluated that it has an effect or an onset prevention effect. On the other hand, if the test substance has an atopic dermatitis therapeutic effect or preventive effect, the test substance has an atopic dermatitis therapeutic effect or preventive effect if the control substance has an atopic dermatitis therapeutic effect or preventive effect. It can be evaluated that it does not have.
In addition, when the control substance is a positive control, the atopic dermatitis treatment effect or onset prevention effect of the test substance is compared with the atopic dermatitis treatment effect or onset prevention effect of the control substance, so that the atopic skin of the test substance The degree of flame treatment effect or onset prevention effect can be evaluated.

本発明評価方法により得られる被験物質のアトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果に基づき、選択される物質（アトピー性皮膚炎制御物質）は、アトピー性皮膚炎治療効果又は発症予防効果を有するので、アトピー性皮膚炎発症を伴う疾患等に対する治療及び予防に効果のある医薬品・食品として使用することができる。更に、本発明スクリーニング方法により得られる物質から誘導される化合物も同様に用いることができる。
本発明スクリーニング方法により得られた物質は塩を形成していてもよく、当該物質の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）又は塩（例、アルカリ金属）等との塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、或いは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が用いられる。本発明スクリーニング方法により得られた物質は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等として経口的に、或いは水若しくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤等の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、当該物質を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤等に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン，コーンスターチ，トラガント，アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ，ゼラチン，アルギン酸等のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖，乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント，アカモノ油又はチェリーのような香味剤等が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料に更に油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油等のような天然産出植物油等を溶解又は懸濁させる等の通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水，ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール，Ｄ−マンニトール，塩化ナトリウム等）等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール，ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０TM，ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油，大豆油等が用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル，ベンジルアルコール等と併用してもよい。また、上記の治療・発症予防剤には、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム，塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン，ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール，フェノール等）、酸化防止剤等を配合してもよい。調製された注射液等の医薬組成物は、通常、適当なアンプルに充填される。 Since the substance (atopic dermatitis control substance) selected based on the atopic dermatitis therapeutic effect or onset prevention effect of the test substance obtained by the evaluation method of the present invention has an atopic dermatitis therapeutic effect or onset prevention effect It can be used as a pharmaceutical or food effective for the treatment and prevention of diseases associated with the development of atopic dermatitis. Furthermore, compounds derived from substances obtained by the screening method of the present invention can be used as well.
The substance obtained by the screening method of the present invention may form a salt, and as a salt of the substance, a physiologically acceptable acid (eg, inorganic acid, organic acid) or salt (eg, alkali metal) And the like, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferred. Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). Acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like. The substance obtained by the screening method of the present invention is orally acceptable, for example, as a tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like with sugar coating as required, or with water or other pharmaceutically acceptable substances. It can be used parenterally in the form of a sterile solution with a liquid or an injection such as a suspension. For example, by mixing the substance with physiologically recognized carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc., in a unit dosage form as required for generally accepted formulation practice. can do. The amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate volume within the indicated range can be obtained. Additives that can be mixed into tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth and gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. For example, a leavening agent, a lubricant such as magnesium stearate, a sweetening agent such as sucrose, lactose or saccharin, a flavoring agent such as peppermint, red oil, or cherry are used. When the dispensing unit form is a capsule, the material of the above type can further contain a liquid carrier such as fats and oils. Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. As an aqueous solution for injection, for example, isotonic solutions (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used, and appropriate solubilizing agents are used. For example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate 80 ™, HCO-50), etc. may be used in combination. As the oily liquid, for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol. Examples of the treatment / prevention preventive agent include a buffer (for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), a stabilizer ( For example, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc. may be blended. The prepared pharmaceutical composition such as an injection solution is usually filled in an appropriate ampoule.

このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。当該物質の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、当該化合物を経口投与する場合には、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき当該物質を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１〜５０ｍｇ、より好ましくは約１〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合には、当該物質の１回投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、当該物質を注射剤の形で通常成人（６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき当該物質を約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の非ヒト動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。   Since the preparation thus obtained is safe and has low toxicity, it can be administered to, for example, humans and mammals (for example, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.). . The dose of the substance varies depending on the target disease, administration subject, administration route, etc. For example, when the compound is administered orally, generally in adults (with a body weight of 60 kg) The substance is administered at about 0.1-100 mg, preferably about 1-50 mg, more preferably about 1-20 mg. When administered parenterally, the single dose of the substance varies depending on the subject of administration, the target disease, etc., for example, when the substance is usually administered to an adult (as 60 kg) in the form of an injection, It is convenient to administer about 0.1 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the substance per day by intravenous injection. In the case of other non-human animals, an amount converted per 60 kg can be administered.

本発明は、更に、アレルギー疾患のタンパク質・遺伝子治療法のための、
（１）ＰＨＦ３タンパク質又はその部分領域；
（２）上記（１）のタンパク質又はその部分領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（３）上記（１）のタンパク質又はその部分領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ；又は
（４）細胞における発現時に、ＰＨＦ３遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果に基づき抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ；
の使用も提供する。ここでＰＨＦ３タンパク質としては、下記のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつアレルギー疾患症状改善活性を有する蛋白質等を好ましく挙げることができる。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２又は８で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２又は８で示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２又は８で示される塩基配列と相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号２又は８で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列 The present invention further provides a protein / gene therapy method for allergic diseases.
(1) PHF3 protein or a partial region thereof;
(2) a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of the protein of (1) or a partial region thereof, or a base sequence complementary to the base sequence;
(3) DNA encoding an RNA having ribozyme activity that specifically cleaves the base sequence encoding the amino acid sequence of the protein of (1) or a partial region thereof; or (4) expression of the PHF3 gene during expression in a cell. DNA encoding RNA that suppresses RNAi based on RNAi effect;
The use of is also provided. Preferred examples of the PHF3 protein include proteins having any of the following amino acid sequences and having allergic disease symptom improving activity.
<Amino acid sequence>
(A) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 7 (b) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 7, wherein one or more amino acids are deleted, added or substituted (c) SEQ ID NO: 1 Or an amino acid sequence having 75% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by 7 (d) the amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 8 (e) the base represented by SEQ ID NO: 2 or 8 An amino acid sequence encoded by a DNA having a base sequence having 80% or more sequence identity to the sequence (f) a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 8, and a stringent An amino acid sequence (g) encoded by DNA that hybridizes under conditions (g) DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 8 The encoded amino acid sequence

後述の実施例に示されるとおり、ＰＨＦ３遺伝子はヒト白血球で高発現しており、かつ、マイトジェンによる刺激によりその発現が低下することから、白血球の活性化状態とＰＨＦ３遺伝子発現とが密接な関係を有する。よって、上記タンパク質等又はポリヌクレオチドを体内に導入することにより、ＰＨＦ３遺伝子の発現量が補われ、アレルギー疾患の症状の改善が期待される。
ＰＨＦ３タンパク質等を医薬品として使用する場合には、医薬組成物の有効成分としては、ＰＨＦ３タンパク質等の中でもヒトに対する抗原性が最も低く、ＰＨＦ３タンパク質のアミノ酸配列若しくは、少なくとも一部を有するタンパク質を使用することが好ましい。
ＰＨＦ３タンパク質は、天然に存在する生物体から抽出、精製等の操作により、天然タンパク質として調製することができるし、又は、遺伝子工学的手法を用いて組換えタンパク質として調製することもできる。例えば、ヒトの細胞、組織から粗抽出液を調製し、種々のカラムを使うことにより、精製タンパク質を調製することができる。ここでの細胞としては、ＰＨＦ３タンパク質を産生・発現しているものであれば特に限定されず、例えば、白血球由来細胞等を用いることができる。
更にＰＨＦ３遺伝子が有する塩基配列を基にアンチセンス医薬品を開発することもできる。即ち、ＰＨＦ３遺伝子の一部やその誘導体を、公知の方法で合成し、それらを使用してＰＨＦ３タンパク質の発現を調整したり、ＰＨＦ３遺伝子に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドやその誘導体を使用して、ＰＨＦ３タンパク質の発現を調節することができる。 As shown in the examples described later, the PHF3 gene is highly expressed in human leukocytes, and its expression is reduced by stimulation with mitogens. Therefore, there is a close relationship between the activated state of leukocytes and the expression of the PHF3 gene. Have. Therefore, by introducing the above protein or polynucleotide into the body, the expression level of the PHF3 gene is supplemented, and improvement of symptoms of allergic diseases is expected.
When the PHF3 protein or the like is used as a pharmaceutical, the active ingredient of the pharmaceutical composition is the lowest antigenicity to humans among the PHF3 protein and the like, and the protein having the amino acid sequence of the PHF3 protein or at least a part thereof is used. It is preferable.
The PHF3 protein can be prepared as a natural protein by operations such as extraction and purification from a naturally occurring organism, or can be prepared as a recombinant protein using genetic engineering techniques. For example, a purified protein can be prepared by preparing a crude extract from human cells and tissues and using various columns. The cells here are not particularly limited as long as they produce and express the PHF3 protein. For example, leukocyte-derived cells can be used.
Furthermore, an antisense drug can be developed based on the base sequence of the PHF3 gene. That is, a part of the PHF3 gene or a derivative thereof is synthesized by a known method and the expression of the PHF3 protein is adjusted using them, or an oligonucleotide or a derivative thereof containing a sequence complementary to the PHF3 gene is used. Thus, the expression of PHF3 protein can be regulated.

本発明は、更に、アトピー性皮膚炎の診断のための
（１）ＰＨＦ３タンパク質又はその部分領域；
（２）上記（１）のタンパク質又はその部分領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（３）ＰＨＦ３タンパク質の遺伝子；
の使用も提供する。ここでＰＨＦ３タンパク質としては、下記のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつアレルギー疾患症状改善活性を有する蛋白質等を好ましく挙げることができる。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２又は８で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２又は８で示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２又は８で示される塩基配列と相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号２又は８で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
また、ここでＰＨＦ３タンパク質の遺伝子とは、上記（１）のタンパク質をコードする塩基配列に加えてその上流に存在している転写調節領域をも包含するような広義なものを意味する。 The present invention further provides (1) PHF3 protein or a partial region thereof for the diagnosis of atopic dermatitis;
(2) a polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of the protein of (1) or a partial region thereof, or a base sequence complementary to the base sequence;
(3) PHF3 protein gene;
The use of is also provided. Preferred examples of the PHF3 protein include proteins having any of the following amino acid sequences and having allergic disease symptom improving activity.
<Amino acid sequence>
(A) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 7 (b) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 7, wherein one or more amino acids are deleted, added or substituted (c) SEQ ID NO: 1 Or an amino acid sequence having 75% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by 7 (d) the amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 8 (e) the base represented by SEQ ID NO: 2 or 8 An amino acid sequence encoded by a DNA having a base sequence having 80% or more sequence identity to the sequence (f) a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 8, and a stringent An amino acid sequence (g) encoded by DNA that hybridizes under conditions (g) DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 8 Amino acid sequence encoded In addition, the gene for PHF3 protein herein is a gene having a broad meaning including a transcriptional regulatory region existing upstream in addition to the base sequence encoding the protein of (1) above. means.

上記のように、ＰＨＦ３遺伝子はヒト白血球で高発現しており、かつ、マイトジェンによる刺激によりその発現が低下することから、白血球の活性化状態とＰＨＦ３遺伝子発現とが密接な関係を有する。従って、ＰＨＦ３遺伝子の発現量は、アトピー性皮膚炎の診断のための指標となる。上記のようなアトピー性皮膚炎の診断は、例えば、羅病性の検出のための、いわゆる遺伝子診断（例えば、mRNAレベル診断、ゲノムレベル診断等を含む。）を含むものであり、アレルギー疾患の感受性を診断するための手段として、ＰＨＦ３タンパク質の遺伝子若しくはその転写調節領域の遺伝的変異又は遺伝子多型を検出する方法をも含む技術に係る使用を提供している。
当該方法として、具体的には例えば、ＰＨＦ３タンパク質の遺伝子のＤＮＡをホースラデイッシュペルオキシダーゼ(HRP)等の酵素や放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質等で標識されたプローブを用いたハイブリダイゼーション法、又は、当該ＤＮＡの塩基配列に基づきデザインされたプライマーを用いたＰＣＲ法を挙げることができる。
ここでＰＨＦ３タンパク質の遺伝子の転写調節領域に係る生理活性は、例えば、上記転写調節領域の塩基配列を有するＤＮＡの下流に適当なレポーター遺伝子を接続した組換えＤＮＡ分子を作製し、これを用いて適当な宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体が産生するレポーター遺伝子産物を検出し、定量することからなるレポーター遺伝子アッセイ法や、標識された前記転写調節領域の塩基配列を有するＤＮＡを用いた公知のゲルシフトアッセイ法等によって評価すればよい。また、このようなアッセイ法は、ＰＨＦ３遺伝子の発現を阻害又は活性化する物質をスクリーニングするためにも応用することも可能である。 As described above, the PHF3 gene is highly expressed in human leukocytes, and its expression is reduced by stimulation with mitogens, so that the activated state of leukocytes and PHF3 gene expression have a close relationship. Therefore, the expression level of the PHF3 gene is an index for diagnosis of atopic dermatitis. Diagnosis of atopic dermatitis as described above includes, for example, so-called genetic diagnosis (including mRNA level diagnosis, genome level diagnosis, etc.) for detection of morbidity, and is used for allergic diseases. As a means for diagnosing susceptibility, the present invention provides use according to a technique including a method for detecting a genetic variation or gene polymorphism of a gene of PHF3 protein or a transcriptional regulatory region thereof.
Specifically, for example, a hybridization method using a DNA labeled with a gene of PHF3 protein using a probe labeled with an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP), a radioisotope, a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, or the like. Alternatively, a PCR method using primers designed based on the base sequence of the DNA can be mentioned.
Here, the physiological activity related to the transcriptional regulatory region of the gene of PHF3 protein is, for example, by preparing a recombinant DNA molecule in which an appropriate reporter gene is connected downstream of the DNA having the base sequence of the transcriptional regulatory region, and using this. A suitable host cell is transformed, a reporter gene product produced by the resulting transformant is detected and quantified, or a DNA having a base sequence of the labeled transcriptional regulatory region What is necessary is just to evaluate by the well-known gel shift assay method etc. which were used. Such an assay can also be applied to screen for substances that inhibit or activate the expression of the PHF3 gene.

以下に本発明を実施例で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。   EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

実施例１ （ＰＨＦ３遺伝子ノックアウトＥＳ細胞の作製）
トラップベクターpU-17及びこれを用いた遺伝子トラップ法（国際公開WO01/005987号公報）により、ＰＨＦ３遺伝子ノックアウトＥＳ細胞を作製した。
破壊・組換遺伝子がこのＰＨＦ３遺伝子のみであることを以下の方法に従い確認した。
即ち、使用されたES細胞について、ベクターが1コピーのみ導入されていることをPCR解析で確認し、また、ベクターの全長が導入されていることをサザンブロット解析で確認した。更に5’RACE法により、被トラップ遺伝子の部分配列（トラップベクター挿入位置の上流のｃＤＮＡ配列）を決定したところ、ＰＨＦ３遺伝子（GenBank Acc. No. XM_129836）の第１エキソン及び第２エキソンの塩基配列と一致した（図１参照）。マウスPHF3遺伝子は１６個のエキソンで構成され、2025アミノ酸からなるタンパク質をコードしている。当該遺伝子の翻訳開始コドンは第２エキソンに存在する。トラップベクターpU-17がPHF3遺伝子の第２エキソンの直後に挿入された細胞では、PHF3タンパク質が翻訳開始直後にβgeoと融合されたタンパク質が翻訳され、本来のPHF3タンパク質は作られない。更に、使用されたＥＳ細胞のゲノム遺伝子の塩基配列を分析した結果、第２エキソンと第３エキソンとの間にトラップベクターpU-17が挿入されていることが確認された。これにより該ＥＳ細胞が、染色体上のＰＨＦ３遺伝子の改変により当該遺伝子の発現が欠損した細胞であることが判明した。 Example 1 (Preparation of PHF3 gene knockout ES cells)
PHF3 gene knockout ES cells were prepared by the trap vector pU-17 and the gene trap method using the same (International Publication WO01 / 005987).
It was confirmed according to the following method that the disrupted / recombinant gene was only this PHF3 gene.
That is, for the used ES cells, it was confirmed by PCR analysis that only one copy of the vector was introduced, and it was confirmed by Southern blot analysis that the full length of the vector was introduced. Furthermore, when the partial sequence of the trapped gene (cDNA sequence upstream of the trap vector insertion position) was determined by the 5'RACE method, the nucleotide sequences of the first and second exons of the PHF3 gene (GenBank Acc. No. XM_129836) were determined. (See FIG. 1). The mouse PHF3 gene consists of 16 exons and encodes a protein consisting of 2025 amino acids. The translation initiation codon for the gene is present in the second exon. In cells in which the trap vector pU-17 is inserted immediately after the second exon of the PHF3 gene, the protein fused with βgeo is translated immediately after the translation is started, and the original PHF3 protein is not produced. Furthermore, as a result of analyzing the base sequence of the genomic gene of the used ES cell, it was confirmed that the trap vector pU-17 was inserted between the second exon and the third exon. As a result, it was found that the ES cell was a cell deficient in expression of the gene due to modification of the PHF3 gene on the chromosome.

実施例２ （ＰＨＦ３遺伝子ノックアウトマウスの作製）
ＰＨＦ３遺伝子がノックアウトされた細胞を持つキメラマウスを以下の方法に従い作製した。即ち、実施例１で作製されたＰＨＦ３遺伝子が破壊・組換されたＥＳ細胞を用い、アグリゲーション法（Nagy A., 1993, Oxford University Press, Oxford, pp147-179）にてＥＳ細胞とＩＣＲ系８細胞期胚とを凝集させた後、翌日桑実胚ないしは胚盤胞に発生したキメラ胚を偽妊娠誘起したＩＣＲ系雌マウス（偽妊娠誘起ｄａｙ３）の子宮へ移植した（相沢慎一：ジーンターゲティング・ES細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社，1995）。移植１７．５日後に該雌マウスを帝王切開して胎仔を取り出すことにより、キメラマウスを得た。
上記キメラマウスは４週まで、里親に保育させた（相沢慎一：ジーンターゲティング・ES細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社，1995）。該キメラマウスは４週で離乳し、６週で生殖系列伝達（Germline Transmission；ＧＴ）確認のため、ＩＣＲ系雌マウス２匹と交配を行った。キメラマウスとＩＣＲとの産子の組織を採取し、そのゲノムDNAを用いてＰＣＲ解析により導入遺伝子の有無を、サザン解析によりＥＳ細胞とマウスの遺伝子とが一致するか否かを確認した。ＧＴ判定が終了したキメラマウスにＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス２匹を自然交配させることにより、ＰＨＦ３遺伝子ノックアウトマウスのＦ１へテロを作製した。
作製されたＦ１へテロである雄ノックアウトマウスと過***処置が施されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスとの体外受精（ＩＶＦ）により得られた受精卵を、偽妊娠誘起処置が施されたＩＣＲ系雌マウス（レシピエント）に移植することにより、Ｆ２へテロであるノックアウトマウスを大量に作出した。作出されたＦ２ヘテロであるノックアウトマウスを用いてＩＶＦを行い、受精卵を作製した後、それら胚をレシピエントに移植することによりＦ３ホモであるノックアウトマウスを作製した。
このようにして作製されたＰＨＦ３遺伝子ホモノックアウトマウス（３３週齢）の外観を観察した。図２に示すように、背部に広範囲に渡る脱毛、痂皮の形成及び掻痒行動が認められ、アトピー性皮膚炎の症状を示した。 Example 2 (Preparation of PHF3 gene knockout mouse)
A chimeric mouse having cells in which the PHF3 gene was knocked out was prepared according to the following method. That is, ES cells and ICR system 8 produced by the aggregation method (Nagy A., 1993, Oxford University Press, Oxford, pp147-179) were used using ES cells in which the PHF3 gene prepared in Example 1 was disrupted and recombined. After agglutination with cell stage embryos, chimeric embryos developed in morula or blastocyst the next day were transplanted into the uterus of an ICR female mouse (pseudopregnancy-induced day 3) in which pseudopregnancy was induced (Shinichi Aizawa: Gene Targeting) Production of mutant mice using ES cells, Yodosha, 1995). Chimera mice were obtained by removing the fetus by cesarean section 17.5 days after transplantation.
The chimera mice were reared by foster parents for up to 4 weeks (Shinichi Aizawa: Gene targeting. Generating mutant mice using ES cells, Yodosha, 1995). The chimeric mice were weaned at 4 weeks and mated with 2 ICR female mice at 6 weeks to confirm germline transmission (GT). The offspring tissues of the chimeric mouse and ICR were collected, and the presence or absence of the transgene was determined by PCR analysis using the genomic DNA, and whether or not the ES cell and the mouse gene matched by Southern analysis was confirmed. F1 heterozygous of PHF3 gene knockout mouse was produced by naturally mating two C57BL / 6J female mice to the chimeric mouse for which GT determination was completed.
A fertilized egg obtained by in vitro fertilization (IVF) between the prepared F1 heterozygous male knockout mouse and C57BL / 6J female mouse treated with superovulation was treated with a pseudopregnancy-inducing treatment. A large number of F2 heterozygous knockout mice were created by transplanting to mice (recipients). IVF was performed using the produced F2 heterozygous knockout mouse to produce a fertilized egg, and then the embryo was transplanted into a recipient to produce a F3 homozygous knockout mouse.
The appearance of the PHF3 gene homo knockout mouse (33 weeks old) produced in this way was observed. As shown in FIG. 2, extensive hair loss, crust formation and pruritus behavior were observed on the back, indicating symptoms of atopic dermatitis.

実施例３ （ノックアウトマウスにおけるＰＨＦ３遺伝子の発現量の解析）
実施例２で作製されたＰＨＦ３遺伝子ホモノックアウトマウスにおいてＰＨＦ３遺伝子の転写が抑制されていることをPCR法により確認した。
ＰＨＦ３遺伝子ホモノックアウトマウス３匹（#3004〜3006）及び野生型マウス（#3024〜3026）の顎下リンパ節を摘出し、摘出された組織からRNeasy Miniキット（キアゲン社）を用いてtotal RNAを調製した。当該total RNA0.6μgからTaqMan Reverse Transcription Reagent（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、30μlの反応系でcDNAを合成した。PCRは25μｌの反応液量で行い、反応液中には1μｌ鋳型cDNA溶液，0.01units KOD plus DNA polymerase （東洋紡社）、エキソン２に相補的なセンスプライマーmPHF3 F2 (配列番号９ ：cccaatttcc agatgccttg) 0.5μM及びエキソン４に相補的なアンチセンスプライマーmPHF3 R2（配列番号１０：gcatgcatgt ttgggatcaa）0.5μMが含まれ、緩衝液は酵素に添付されたものを用いた。ＰＣＲ条件は、94℃で2分保温した後、94℃で15秒、59℃で30秒、及び68℃で45秒を１サイクルとし、36サイクル反応した。野生型マウスのリンパ節cDNAを用いた反応では501bpの長さのＤＮＡ断片が増幅されたのに対し、ＰＨＦ３遺伝子ホモノックアウトマウスのリンパ節cDNAを用いた反応ではＤＮＡ断片が増幅されなかった。その結果を図３に示した。この図３から明らかなように、ＰＨＦ３遺伝子ホモノックアウトマウスではトラップベクターのゲノムへの挿入により、ＰＨＦ３遺伝子の発現が抑制されていることが確認された。 Example 3 (Analysis of expression level of PHF3 gene in knockout mice)
It was confirmed by PCR that the transcription of the PHF3 gene was suppressed in the PHF3 gene homoknockout mouse prepared in Example 2.
The submandibular lymph nodes of 3 PHF3 gene homo-knockout mice (# 3004 to 3006) and wild type mice (# 3024 to 3026) were excised and total RNA was extracted from the excised tissue using the RNeasy Mini kit (Qiagen). Prepared. CDNA was synthesized from 0.6 μg of the total RNA in a 30 μl reaction system using TaqMan Reverse Transcription Reagent (Applied Biosystems). PCR is carried out in a 25 μl reaction volume. In the reaction liquid, 1 μl template cDNA solution, 0.01 units KOD plus DNA polymerase (Toyobo Co., Ltd.), sense primer complementary to exon 2 mPHF3 F2 (SEQ ID NO: 9: cccaatttcc agatgccttg) 0.5 An antisense primer mPHF3 R2 (SEQ ID NO: 10: gcatgcatgt ttgggatcaa) 0.5 μM complementary to μM and exon 4 was contained, and a buffer attached to the enzyme was used. PCR conditions were 94 ° C for 2 minutes, followed by 36 cycles of 94 ° C for 15 seconds, 59 ° C for 30 seconds, and 68 ° C for 45 seconds. In the reaction using the lymph node cDNA of the wild-type mouse, a DNA fragment having a length of 501 bp was amplified, whereas in the reaction using the lymph node cDNA of the PHF3 gene homo knockout mouse, the DNA fragment was not amplified. The results are shown in FIG. As is clear from FIG. 3, it was confirmed that the expression of the PHF3 gene was suppressed in the PHF3 gene homo knockout mouse by inserting the trap vector into the genome.

実施例４ （ＰＨＦ３遺伝子ホモノックアウトマウスの病理検査）
実施例２で作製されたＰＨＦ３遺伝子ホモノックアウトマウスにおけるアトピー性皮膚炎の症状について、以下の方法に従い病理組織学的に検査した。８週齢ＰＨＦ３遺伝子ホモノックアウトマウスをエーテル麻酔下で放血致死させた後、皮膚組織（腹部）の一部を採取し、これを10％中性緩衝ホルマリン液にて室温、１週間固定した。固定された皮膚組織をアルコール脱水した後、パラフィンに包埋し、ミクロスライサーを用いて2〜10μmの厚さで薄くスライスした。得られた薄切片をスライドグラスに載せた。更に、該薄切片をキシレンを用いて脱パラフィン（7分×3回）し、100％エタノール（30秒×1回、2分×2回）、蒸留水で洗浄した後、ヘマトキシリン・エオジン染色（以下、HE染色と記す。）を実施した。HE染色は、ヘマトキシリン溶液（ヘマトキシリン2g、硫酸カリウムアルミニウム75g、ヨウ素酸ナトリウム0.4g、クエン酸1g、抱水クロラール50gを１Lの蒸留水に溶解したもの）に10分間浸漬した後、蒸留水を用いて15分間水洗し、次いでエオジン溶液（1％エオジン水溶液200mL、1％フロキシンB水溶液5mL、80％エタノール615mLを混じた後、酢酸を用いてpH5.5に調整したもの）に2分浸漬し、次いで蒸留水で再度15秒すすいだ後、80％エタノール（15秒）、90％エタノール（15秒）、100％エタノール（2分×2回）、キシレン（5分×3回）で順次脱水処理を行うことにより実施した。その後、HE染色を行った皮膚組織について光学顕微鏡を用いた病理組織学的検査を実施した。その結果、図４に示すように、ＰＨＦ３遺伝子ホモノックアウトマウスでは棘細胞増生、痂皮の形成、皮膚真皮層への細胞浸潤、加えて皮下組織への細胞浸潤、皮筋の萎縮がそれぞれ認められた。これにより、ＰＨＦ３遺伝子ホモノックアウトマウスでは、アトピー性皮膚炎の症状を示すことが確認された。 Example 4 (Pathological examination of PHF3 gene homo knockout mice)
The symptoms of atopic dermatitis in the PHF3 gene homo knockout mouse prepared in Example 2 were examined histopathologically according to the following method. After 8-week-old PHF3 gene homo-knockout mice were exsanguinated under ether anesthesia, a part of the skin tissue (abdomen) was collected and fixed with 10% neutral buffered formalin solution at room temperature for 1 week. The fixed skin tissue was dehydrated with alcohol, then embedded in paraffin, and sliced thinly to a thickness of 2 to 10 μm using a micro slicer. The obtained thin section was placed on a slide glass. Further, the thin sections were deparaffinized with xylene (7 minutes × 3 times), washed with 100% ethanol (30 seconds × 1 time, 2 minutes × 2 times) and distilled water, and then stained with hematoxylin and eosin ( Hereinafter, this was referred to as HE staining.). For HE staining, hematoxylin solution (2 g of hematoxylin, 75 g of potassium aluminum sulfate, 0.4 g of sodium iodate, 1 g of citric acid, 50 g of chloral hydrate dissolved in 1 L of distilled water) is used for 10 minutes, and then distilled water is used. Wash with water for 15 minutes, then immerse in eosin solution (mixed with 1% eosin aqueous solution 200mL, 1% Phloxine B aqueous solution 5mL, 80% ethanol 615mL, adjusted to pH 5.5 with acetic acid) for 2 minutes, After rinsing again with distilled water for 15 seconds, 80% ethanol (15 seconds), 90% ethanol (15 seconds), 100% ethanol (2 minutes × 2 times), and xylene (5 minutes × 3 times) are sequentially dehydrated. It carried out by doing. Then, the histopathological examination using the optical microscope was implemented about the skin tissue which performed HE dyeing | staining. As a result, as shown in FIG. 4, in the PHF3 gene homo-knockout mouse, spine cell proliferation, crust formation, cell infiltration into the dermal layer, cell infiltration into the subcutaneous tissue, and atrophy of the cutaneous muscle were observed. . Thus, it was confirmed that PHF3 gene homo knockout mice exhibit symptoms of atopic dermatitis.

実施例５ （イムノグロブリンＥ測定）
ＰＨＦ３遺伝子ホモノックアウトマウスにおける血清中総イムノグロブリンＥ（IgE）レベルを検討した。マウス尾静脈から血液を約40μl採取し、定法により血清を分離した。血清中のIgE濃度をシバヤギ社製のレビスIgE-ELISA KIT（マウス）により、キットが推奨する方法に従って測定した。図５に示すように、43週齢のＰＨＦ３遺伝子ホモノックアウトマウス個体では、高濃度の総IgEが血清中で認められた。対照的に、ワイルドタイプマウスでは、血清中での総IgEの濃度は低かった。従って、ＰＨＦ３遺伝子の破壊・組換によって発症された皮膚炎は、IgEの増加というアトピー性皮膚炎における特有の症状を有することが判明した。 Example 5 (Immunoglobulin E measurement)
Serum total immunoglobulin E (IgE) levels in PHF3 gene homo knockout mice were examined. About 40 μl of blood was collected from the mouse tail vein, and serum was separated by a conventional method. The serum IgE concentration was measured with a Levis IgE-ELISA KIT (mouse) manufactured by Shiba-Yagi in accordance with the method recommended by the kit. As shown in FIG. 5, in the 43-week-old PHF3 gene homoknockout mouse individual, a high concentration of total IgE was observed in the serum. In contrast, in wild type mice, the concentration of total IgE in serum was low. Therefore, it has been found that dermatitis caused by disruption / recombination of the PHF3 gene has a characteristic symptom in atopic dermatitis that is an increase in IgE.

実施例６ （ＰＨＦ３遺伝子発現（白血球、in vitro））
ＰＨＦ３mRNAがヒト白血球検体のRNA中に存在するのかを、逆転写-PCR法により確認した。ＰＨＦ３タンパク質を特異的に増幅させるプライマーセット各12.5pmolを用い、かつ、クロンテック社製cDNAヒト正常白血球由来のcDNA（mononuclear cell、キラーT細胞、ヘルパーT細胞、単球、B細胞）1μlを鋳型に用いて、かつ、宝酒造社製ExTaq DNAポリメラーゼを用いて25μlの反応系で32サイクルのＰＣＲを行った。白血球サンプルのうち「resting」とされているものは、血液から分離処理のみ行われた血球由来cDNAであり、「activated」とされているものは、コンカナバリンＡ（ConA）とポークウィードマイトジェン（PWM）とで処理されたmononuclear cell、ConAで処理されたヘルパーＴ細胞、ファイトヘマグルチニンで処理されたキラーＴ細胞、PWMで処理されたＢ細胞等の由来のcDNAである。当該PCRにおいて、センスプライマーとしてhPHF3 F1(配列番号３：hPHF3 F1：gtggcaatga taccattgat ga)及びアンチセンスプライマーとしてhPHF3 R2（配列番号４：hPHF3 R2：cacttcatct acacaactag gca）を用いた。ＰＨＦ３mRNA由来の増幅ＤＮＡ断片は、821塩基対を有するＤＮＡとなる。また、同じ鋳型cDNAを用いてβアクチンmRNA量も測定した。プライマーはセンスプライマーとしてβactin F1（配列番号５：βactin F1：accaactggg acgacatgga gaa）及びアンチセンスプライマーとしてβactin R1（配列番号６：βactin R1：gtggtggtga agctgtagcc）を使用して、25サイクルのＰＣＲを行った。βアクチンmRNA由来の増幅ＤＮＡ断片は、380塩基対を有するＤＮＡとなる。結果を図６に示す。βアクチンは、各サンプルともにほぼ同程度の発現量であった。
図６から明らかなように、ＰＨＦ３mRNAは未処理（resting）の白血球で高発現していたが、コンカナバリンＡで処理されたヘルパーＴ細胞、ファイトヘマグルチニンで処理されたキラーＴ細胞、ポークウィードマイトジェンで処理されたＢ細胞では、その発現量が著しく低下していた。これらの結果から、ＰＨＦ３遺伝子は、活性化された白血球細胞では抑制されていることが明らかになった。 Example 6 (PHF3 gene expression (leukocytes, in vitro))
The presence of PHF3 mRNA in the RNA of human leukocyte specimens was confirmed by reverse transcription-PCR. Using 12.5 pmol of each primer set that specifically amplifies the PHF3 protein, and using 1 μl of cDNA (mononuclear cell, killer T cell, helper T cell, monocyte, B cell) derived from Clontech cDNA human normal leukocytes In addition, 32 cycles of PCR were performed in a 25 μl reaction system using ExTaq DNA polymerase manufactured by Takara Shuzo. Among the leukocyte samples, “resting” refers to cDNA derived from blood cells that have only been separated from blood, and “activated” refers to concanavalin A (ConA) and pork weed mitogen (PWM). From a mononuclear cell treated with, a helper T cell treated with ConA, a killer T cell treated with phytohemagglutinin, a B cell treated with PWM, and the like. In the PCR, hPHF3 F1 (SEQ ID NO: 3: hPHF3 F1: gtggcaatga taccattgat ga) was used as a sense primer and hPHF3 R2 (SEQ ID NO: 4: hPHF3 R2: cacttcatct acacaactag gca) was used as an antisense primer. The amplified DNA fragment derived from PHF3 mRNA becomes DNA having 821 base pairs. The amount of β-actin mRNA was also measured using the same template cDNA. PCR was performed for 25 cycles using βactin F1 (SEQ ID NO: 5: βactin F1: accaactggg acgacatgga gaa) as a sense primer and βactin R1 (SEQ ID NO: 6: βactin R1: gtggtggtga agctgtagcc) as an antisense primer. The amplified DNA fragment derived from β-actin mRNA becomes DNA having 380 base pairs. The results are shown in FIG. β-actin was expressed at almost the same level in each sample.
As is apparent from FIG. 6, PHF3 mRNA was highly expressed in resting leukocytes, but was treated with helper T cells treated with concanavalin A, killer T cells treated with phytohemagglutinin, and treated with pork weed mitogen. In the B cells, the expression level was significantly reduced. From these results, it was revealed that the PHF3 gene is suppressed in activated white blood cells.

図１は、ＰＨＦ３遺伝子ノックアウトマウスを作製するために使用されるES細胞を用いて、5'RACE法によりトラップされている遺伝子の塩基配列を解読した結果を示したものである。解読された塩基配列は、ＰＨＦ３遺伝子の第１エキソン及び第２エキソンに相当した。FIG. 1 shows the result of decoding the base sequence of a gene trapped by the 5′RACE method using ES cells used to produce a PHF3 gene knockout mouse. The decoded base sequence corresponded to the first exon and the second exon of the PHF3 gene. 図２は、ＰＨＦ３遺伝子がホモでノックアウトされたマウスの外観を撮影した図である。背部に広範囲に渡る脱毛及び痂皮の形成が観察された。FIG. 2 is a photograph of the appearance of a mouse in which the PHF3 gene is homozygous and knocked out. Extensive hair loss and crust formation was observed on the back. 図３は、ＰＨＦ３ホモノックアウトマウス及び野生型マウスのリンパ節におけるPHF３遺伝子の発現を逆転写PCR法により解析した結果を示す図である。野生型マウス（図中の「野生型」）ではPHF３遺伝子の発現が確認されたが、ホモノックアウトマウス（図中の「ホモ」）では当該遺伝子の発現が認められなかった。FIG. 3 is a diagram showing the results of analyzing the expression of the PHF3 gene in the lymph nodes of PHF3 homo knockout mice and wild type mice by reverse transcription PCR. Expression of the PHF3 gene was confirmed in wild type mice (“wild type” in the figure), but expression of the gene was not observed in homo knockout mice (“homo” in the figure). 図４は、皮膚及び皮下筋肉等の組織（腹部）がＨＥ染色された染色像である。図中の左上段部は正常マウスでの皮膚組織における薄切片の染色像であり、図中の左下段部は正常マウスでの皮下筋肉組織における薄切片の染色像である。これら対照に対して、図中の右上段部は本発明ノックアウトマウスでの皮膚組織における薄切片の染色像であり、図中の左下段部は本発明ノックアウトマウスでの皮下筋肉組織における薄切片の染色像である。本発明ノックアウトマウスの場合には、棘細胞増生、痂皮の形成、皮膚真皮層への細胞浸潤が認められ、加えて皮下組織への細胞浸潤、皮筋の萎縮も観察された。FIG. 4 is a stained image in which tissues (abdomen) such as skin and subcutaneous muscle are HE-stained. The upper left part in the figure is a stained image of a thin section of skin tissue in a normal mouse, and the lower left part in the figure is a stained image of a thin section in subcutaneous muscle tissue in a normal mouse. In contrast to these controls, the upper right part in the figure is a stained image of a thin section in the skin tissue of the knockout mouse of the present invention, and the lower left part in the figure is a thin section of the subcutaneous muscle tissue in the knockout mouse of the present invention. It is a stained image. In the case of the knockout mouse of the present invention, spine cell proliferation, crust formation and cell infiltration into the skin dermis layer were observed. In addition, cell infiltration into the subcutaneous tissue and skin muscle atrophy were also observed. 図５は、ＰＨＦ３遺伝子ノックアウトマウス及び野生型マウスにおける血清中の総イムノグロブリンＥ量の測定結果を示した図である。ＰＨＦ３遺伝子ホモノックアウトマウスの場合には１個体ずつ表記し、野生型マウスの場合には、４個体の測定値の平均を棒グラフで、その標準偏差を誤差線で表す。FIG. 5 is a graph showing the results of measuring the total amount of immunoglobulin E in serum in PHF3 gene knockout mice and wild type mice. In the case of a PHF3 gene homo-knockout mouse, one individual is indicated, and in the case of a wild-type mouse, the average of measured values of four individuals is represented by a bar graph, and the standard deviation thereof is represented by an error line. 図６は、ヒト各種組織におけるPHF3 mRNAの発現量を調べた図である。上段はＰＨＦ３遺伝子が、下段にβアクチン遺伝子がＰＣＲ法により増幅された結果を示した。白血球サンプルのうち「resting」とされているものは、血液から分離処理のみ行われた血球由来cDNAを鋳型としてＰＨＦ３遺伝子がＰＣＲ法により増幅された結果を示し、「activated」とされているものは、コンカナバリンＡ（ConA）とポークウィードマイトジェン（PWM）とで処理されたmononuclear cell、ConAで処理されたヘルパーＴ細胞、ファイトヘマグルチニンで処理されたキラーＴ細胞、PWMで処理されたＢ細胞等の由来のcDNAを鋳型としてＰＨＦ３遺伝子がＰＣＲ法により増幅された結果を示す。FIG. 6 is a graph showing the expression level of PHF3 mRNA in various human tissues. The upper row shows the result of amplification of the PHF3 gene and the lower row of the β-actin gene amplified by the PCR method. Among the leukocyte samples, those that are “resting” are the results of amplification of the PHF3 gene by the PCR method using blood cell-derived cDNA that has only been separated from blood as a template, and those that are “activated” , Mononuclear cells treated with Concanavalin A (ConA) and pork weed mitogen (PWM), helper T cells treated with ConA, killer T cells treated with phytohemagglutinin, B cells treated with PWM, etc. The results of amplification of the PHF3 gene by the PCR method using the above cDNA as a template are shown.

配列番号３
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号４
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号９
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド
配列番号１０
ＰＣＲのために設計されたプライマーであるオリゴヌクレトチド SEQ ID NO: 3
Oligonucleotide SEQ ID NO: 4 which is a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 5 is a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 6 which is a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 9 is a primer designed for PCR
Oligonucleotide SEQ ID NO: 10 which is a primer designed for PCR
Oligonucleotide, a primer designed for PCR

Claims (39)

ノックアウト非ヒト動物の個体又はその子孫動物或いはそれらの一部であって、ＰＨＦ３遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失・低下するように破壊・組換されてなることを特徴とする非ヒト動物又はその一部。   A knockout non-human animal individual or a progeny animal thereof or a part thereof, wherein all or one allele in the diploid of the PHF3 gene is replaced with its loss-of-function mutant gene or the genomic gene A non-human animal or a part thereof, wherein all or one allele in the diploid is destroyed or recombined so as to lack or reduce its function. ＰＨＦ３遺伝子が、下記のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつアレルギー疾患症状改善活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１記載の非ヒト動物又はその一部。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列と相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列 2. The non-human animal or a part thereof according to claim 1, wherein the PHF3 gene is a gene consisting of any of the following amino acid sequences and encoding a protein having an allergic disease symptom improving activity.
<Amino acid sequence>
(A) amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or more amino acids are deleted, added or substituted (c) amino acid represented by SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence having 75% or more sequence identity to the sequence (d) Amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (e) 80% or more sequence identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence encoded by a DNA having the base sequence (f) an amino acid encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 Sequence (g) amino acid sequence encoded by DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失・低下するように破壊・組換されてなることを特徴とするノックアウト非ヒト動物の個体又はその子孫動物或いはそれらの一部。   The allele or one allele in the diploid of the genomic gene of the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is replaced by the loss-of-function / lowering mutant gene, or all or in the diploid of the genomic gene A knockout non-human animal individual or a progeny animal thereof or a part thereof, wherein one allele is destroyed or recombined so that its function is lost or reduced. 配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のゲノム遺伝子が、配列番号２で示される塩基配列上の塩基番号３１２及び３１３の間（エクソン１と２の間）、塩基番号５８２及び５８３の間（エクソン２と３の間）、塩基番号７４４及び７４５の間（エクソン３と４の間）、塩基番号２４６１及び２４６２の間（エクソン４と５の間）、塩基番号２７７１及び２７７２の間（エクソン５と６の間）、塩基番号２９５５及び２９５６の間（エクソン６と７の間）、塩基番号３１００及び３１０１の間（エクソン７と８の間）、塩基番号３２５７及び３２５８の間（エクソン８と９の間）、塩基番号３３７４及び３３７５の間（エクソン９と１０の間）、塩基番号３５０６及び３５０７の間（エクソン１０と１１の間）、塩基番号３６４２及び３６４３の間（エクソン１１と１２の間）、塩基番号３８３８及び３８３９の間（エクソン１２と１３の間）、塩基番号３９８４及び３９８５の間（エクソン１３と１４の間）、塩基番号４０７６及び４０７７の間（エクソン１４と１５の間）、塩基番号４２７２及び４２７３の間（エクソン１５と１６の間）に対応する箇所にイントロンを含有するものであることを特徴とする請求項３記載の非ヒト動物又はその一部。   The genomic gene of the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is located between base numbers 312 and 313 (between exons 1 and 2) on the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and between base numbers 582 and 583 ( Between exons 2 and 3), between base numbers 744 and 745 (between exons 3 and 4), between base numbers 2461 and 2462 (between exons 4 and 5), between base numbers 2771 and 2772 (exon 5) 6), between base numbers 2955 and 2956 (between exons 6 and 7), between base numbers 3100 and 3101 (between exons 7 and 8), between base numbers 3257 and 3258 (exons 8 and 9) Between base numbers 3374 and 3375 (between exons 9 and 10), between base numbers 3506 and 3507 (between exons 10 and 11), base number 3642 3643 (between exons 11 and 12), between base numbers 3838 and 3839 (between exons 12 and 13), between base numbers 3984 and 3985 (between exons 13 and 14), base numbers 4076 and 4077 The non-human according to claim 3, which contains an intron at a position corresponding to between (exons 14 and 15) and between base numbers 4272 and 4273 (between exons 15 and 16). Animal or part thereof. 配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のゲノム遺伝子が、当該遺伝子の蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡの置換、欠失及び／又は付加によって破壊・組換されてなることを特徴とする請求項３記載の非ヒト動物又はその一部。   The genomic gene of the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is destroyed or recombined by substitution, deletion and / or addition of at least a part of DNA in the protein coding region of the gene. The non-human animal according to claim 3 or a part thereof. 蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡがエクソン３領域内の塩基であって、当該塩基が欠失・低下によって破壊・組換されてなることを特徴とする請求項５記載の非ヒト動物又はその一部。   6. The non-human animal according to claim 5, wherein at least a part of the DNA in the protein coding region is a base in the exon 3 region, and the base is destroyed / recombined by deletion / reduction. Part of it. ＰＨＦ３遺伝子がその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子がその機能を欠失・低下するように破壊・組換される方法が、プロモーター領域が取り除かれている選択マーカー遺伝子を有する遺伝子カセットを含有し、かつ、ＰＨＦ３遺伝子のＤＮＡの一部に相同な塩基配列を有する選択マーカー遺伝子プロモーターレス組換えベクターを用いて、当該ベクターの一部又は全部でありかつ前記遺伝子カセットを含有するＤＮＡに、前記ゲノム遺伝子の蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡが置換されてなる方法であることを特徴とする請求項１記載の非ヒト動物又はその一部。   A selection marker in which the promoter region has been removed, wherein the PHF3 gene is replaced with its loss-of-function / reduced mutant gene or the genomic gene is disrupted / recombined so that its function is deleted / reduced A selectable marker gene promoter-less recombinant vector containing a gene cassette having a gene and having a base sequence homologous to a part of the DNA of the PHF3 gene, and the gene cassette The non-human animal or a part thereof according to claim 1, wherein at least a part of the DNA in the protein coding region of the genomic gene is replaced with a DNA comprising 遺伝子カセットが、マウスEN2由来のSA(splicing accepter)、 encephalomyocarditis Virus由来のIRES(internal ribosome entry site)、β-galactocidase及びneomycin耐性遺伝子を融合させてなるβgeoにSV40由来のpA(polyadenylation signal)を結合してなるＤＮＡ（SA−IRIS−βgeo−pA遺伝子カセット）であることを特徴とする請求項７記載の非ヒト動物又はその一部。   Gene cassette binds SV40-derived pA (polyadenylation signal) to βgeo, which is a fusion of mouse EN2-derived SA (splicing accepter), encephalomyocarditis virus-derived IRES (internal ribosome entry site), β-galactocidase and neomycin resistance gene The non-human animal or a part thereof according to claim 7, wherein the non-human animal or a part thereof is a DNA (SA-IRIS-βgeo-pA gene cassette). 蛋白質コード領域内の少なくとも一部のＤＮＡがエクソン３領域内の塩基であることを特徴とする請求項７又は８記載の非ヒト動物又はその一部。   9. The non-human animal or a part thereof according to claim 7 or 8, wherein at least a part of the DNA in the protein coding region is a base in the exon 3 region. ノックアウト非ヒト動物の個体又はその子孫動物或いはそれらの一部であって、ＰＨＦ３タンパク質遺伝子の発現量が同種の野生型非ヒト動物での同遺伝子の発現量よりも低減されてなることを特徴とする非ヒト動物又はその一部。   A knockout non-human animal individual or a progeny animal thereof or a part thereof, wherein the expression level of the PHF3 protein gene is reduced compared to the expression level of the gene in a wild-type non-human animal of the same species. Non-human animals or parts thereof. ＰＨＦ３タンパク質が、下記のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつアレルギー疾患症状改善活性を有する蛋白質であることを特徴とする請求項１０記載の非ヒト動物又はその一部。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２で示される塩基配列と相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列 The non-human animal or a part thereof according to claim 10, wherein the PHF3 protein is a protein comprising any of the following amino acid sequences and having an allergy disease symptom improving activity.
<Amino acid sequence>
(A) amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, wherein one or more amino acids are deleted, added or substituted (c) amino acid represented by SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence having 75% or more sequence identity to the sequence (d) Amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 (e) 80% or more sequence identity to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence encoded by a DNA having the base sequence (f) an amino acid encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 Sequence (g) amino acid sequence encoded by DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 以下の（ａ）〜（ｄ）の群より選択される１又は複数の性質を表現することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか記載の非ヒト動物又はその一部。
（ａ）野生型非ヒト動物と比較して皮膚における痂皮形成が高頻度である。
（ｂ）野生型非ヒト動物と比較して皮膚真皮層への細胞浸潤が高頻度である。
（ｃ）野生型非ヒト動物と比較して高い血中総イムノグロブリンＥ濃度を示す。
（ｄ）野生型非ヒト動物と比較してアトピー性皮膚炎関連因子の発現量が変動する。 The non-human animal according to any one of claims 1 to 11 or a part thereof, wherein one or more properties selected from the following groups (a) to (d) are expressed.
(A) The formation of scabs in the skin is higher than in wild-type non-human animals.
(B) Cell infiltration into the skin dermis layer is more frequent than in wild-type non-human animals.
(C) High total immunoglobulin E concentration in blood compared to wild type non-human animals.
(D) The expression level of atopic dermatitis-related factors varies as compared to wild-type non-human animals. 非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか記載の非ヒト動物又はその一部。   The non-human animal or a part thereof according to any one of claims 1 to 12, wherein the non-human animal is a mouse. 非ヒト動物の個体又はその子孫動物或いはそれらの一部における非ヒト動物の一部が、非ヒト動物由来の組織又は細胞であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載の非ヒト動物又はその一部。   The non-human animal according to any one of claims 1 to 13, wherein a part of the non-human animal in the non-human animal individual or its progeny animal or a part thereof is a tissue or cell derived from a non-human animal. Animal or part thereof. ＰＨＦ３遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失・低下するように破壊・組換されてなることを特徴とする分化全能性細胞。   All or one allele in the diploid of the PHF3 gene is replaced with its loss-of-function / reduced mutant gene, or all or one allele in the diploid of the genomic gene has its function deleted / reduced Totipotent cells characterized by being destroyed and recombined. 配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のゲノム遺伝子がその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子がその機能を欠失・低下するように破壊・組換されてなることを特徴とする請求項１５記載の分化全能性細胞。   The genomic gene of the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with its function-deficient / reduced mutant gene, or the genomic gene is destroyed / recombined so that its function is deleted / reduced 16. A totipotent cell according to claim 15, wherein 非ヒト動物由来の組織又は細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞又は白血球由来細胞株であることを特徴とする請求項１４記載の非ヒト動物又はその一部。   The non-human animal or a part thereof according to claim 14, wherein the non-human animal-derived tissue or cell is a T cell, B cell, or leukocyte-derived cell line. 配列番号７で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質のゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失・低下するように破壊・組換されてなることを特徴とする初代培養又は株化された動物細胞。   All or one of the alleles in the diploid of the genomic gene of the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 is replaced with the loss-of-function / lowering mutant gene, or all or in the diploid of the genomic gene A primary cultured or established animal cell, wherein one allele is disrupted or recombined so that its function is lost or reduced. 配列番号８で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列からなる蛋白質のゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能欠失・低下型変異遺伝子に置換されるか又は前記ゲノム遺伝子の二倍体における全部又は一方のアリルがその機能を欠失・低下するように破壊・組換されてなることを特徴とする初代培養又は株化された動物細胞。   All or one of the alleles in the diploid of the genomic gene of the protein consisting of the amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 is replaced with the loss-of-function mutant-lowering mutant gene, or two of the genomic gene A primary cultured or established animal cell, wherein all or one allele in a ploidy is destroyed or recombined so as to lack or reduce its function. 請求項１〜１４記載の非ヒト動物からなる、アトピー性皮膚炎発症を伴う疾患のモデル動物。   A model animal of a disease associated with the onset of atopic dermatitis, comprising the non-human animal according to claim 1. 請求項１〜１４記載の非ヒト動物又はその一部について、胎生期から致死までの期間における、発育分化、発達、生活行動の観察、病理組織学的検査又は生化学的検査を行うことを特徴とする、ＰＨＦ３タンパク質が関与する疾患の病態解析方法。   The non-human animal according to any one of claims 1 to 14 or a part thereof, characterized by performing developmental differentiation, development, observation of living behavior, histopathological examination or biochemical examination in a period from embryonic period to lethality A pathological condition analysis method for a disease involving PHF3 protein. ＰＨＦ３タンパク質が関与する疾患がアトピー性皮膚炎発症を伴う疾患である、請求項２１記載の病態解析方法。   The disease state analysis method according to claim 21, wherein the disease associated with PHF3 protein is a disease associated with the development of atopic dermatitis. アトピー性皮膚炎制御能力の評価方法であって、
（１）請求項１〜１４のいずれか記載の非ヒト動物又はその一部に被験物質を接触させる第一工程、
（２）前記被験物質を接触させた非ヒト動物又はその一部におけるアトピー性皮膚炎関連因子の発現量又は当該量に相関関係を有する指標値を測定し、対照と比較する第二工程、
（３）（２）の比較結果に基づき、被験物質のアトピー性皮膚炎制御能力を評価する第三工程
を有することを特徴とする評価方法。 A method for evaluating the ability to control atopic dermatitis,
(1) A first step of bringing the test substance into contact with the non-human animal according to any one of claims 1 to 14 or a part thereof,
(2) a second step of measuring the expression level of an atopic dermatitis-related factor in a non-human animal or a part thereof contacted with the test substance or an index value having a correlation with the amount and comparing it with a control;
(3) An evaluation method comprising a third step of evaluating the atopic dermatitis control ability of a test substance based on the comparison result of (2). アトピー性皮膚炎制御能力がアトピー性皮膚炎関連因子発現制御能力である、請求項２３記載の評価方法。   24. The evaluation method according to claim 23, wherein the atopic dermatitis control ability is an atopic dermatitis related factor expression control ability. アトピー性皮膚炎関連因子がIFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-18及びイムノグロブリンＥからなる群より選択される１又は複数の因子である、請求項２４記載の評価方法。   25. The atopic dermatitis-related factor is one or more factors selected from the group consisting of IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-13, IL-18, and immunoglobulin E. Evaluation methods. アトピー性皮膚炎関連因子の発現量又は当該量に相関関係を有する指標値が、アトピー性皮膚炎関連因子のＲＮＡ量若しくはタンパク質量である、請求項２３〜２５のいずれか記載の評価方法。   The evaluation method according to any one of claims 23 to 25, wherein the expression level of the atopic dermatitis-related factor or the index value having a correlation with the amount is the RNA amount or the protein amount of the atopic dermatitis-related factor. アトピー性皮膚炎関連因子がIFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-18及びイムノグロブリンＥからなる群より選択される１又は複数の因子である、請求項２６に記載の評価方法。   27. The atopic dermatitis-related factor is one or more factors selected from the group consisting of IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-13, IL-18 and immunoglobulin E. Evaluation method. アトピー性皮膚炎関連因子の発現量に相関関係を有する指標値が痂皮形成能である、請求項２３〜２５のいずれか記載の評価方法。   The evaluation method according to any one of claims 23 to 25, wherein the index value having a correlation with the expression level of the atopic dermatitis-related factor is crust formation ability. アトピー性皮膚炎関連因子の発現量に相関関係を有する指標値が皮膚真皮層への細胞浸潤能である、請求項２３〜２５のいずれか記載の評価方法。   The evaluation method according to any one of claims 23 to 25, wherein the index value having a correlation with the expression level of the atopic dermatitis-related factor is the ability of cells to infiltrate into the skin dermis layer. アトピー性皮膚炎関連因子の発現量に相関関係を有する指標値がＰＨＦ３タンパク質の発現量である、請求項２３〜２５のいずれか記載の評価方法。   The evaluation method according to any one of claims 23 to 25, wherein the index value having a correlation with the expression level of the atopic dermatitis-related factor is the expression level of the PHF3 protein. 請求項２３〜３０のいずれか記載の評価方法により評価されたアトピー性皮膚炎制御能力に基づき、アトピー性皮膚炎制御能力を有する被験物質を選抜することを特徴とするアトピー性皮膚炎制御物質のスクリーニング方法。   A test substance having an atopic dermatitis control ability is selected based on the atopic dermatitis control ability evaluated by the evaluation method according to any one of claims 23 to 30. Screening method. 請求項３１記載のスクリーニング方法により得られるアトピー性皮膚炎発症を伴う疾患の治療剤又は発症予防剤。   A therapeutic or preventive agent for diseases associated with the development of atopic dermatitis obtained by the screening method according to claim 31. 請求項１〜１４のいずれか記載の非ヒト動物又はその一部、或いは、請求項１５又は１６記載の分化全能性細胞を作成するための、プロモーター領域が取り除かれている選択マーカー遺伝子を有するＤＮＡ（遺伝子カセット）を含有し、かつ、ＰＨＦ３遺伝子のＤＮＡの一部に相同な塩基配列を有する選択マーカー遺伝子プロモーターレス組換えベクター。   A DNA having a selectable marker gene from which the promoter region has been removed for producing the non-human animal according to any one of claims 1 to 14 or a part thereof, or the totipotent cell according to claim 15 or 16. A selection marker gene promoter-less recombination vector containing a (gene cassette) and having a base sequence homologous to part of the DNA of the PHF3 gene. 請求項１〜１４のいずれか記載の非ヒト動物又はその一部、或いは、請求項１５又は１６記載の分化全能性細胞を作成するための、マウスEN2由来のSA(splicing accepter)、 encephalomyocarditis Virus由来のIRES(internal ribosome entry site)、β-galactocidase及びneomycin耐性遺伝子を融合させてなるβgeoにSV40由来のpA(polyadenylation signal)を結合してなるＤＮＡ（SA−IRIS−βgeo−pA遺伝子カセット）を含有し、かつ、ＰＨＦ３遺伝子のＤＮＡの一部に相同な塩基配列を有する選択マーカー遺伝子プロモーターレス組換えベクター。   A non-human animal according to any one of claims 1 to 14 or a part thereof, or a mouse EN2-derived SA (splicing accepter) or encephalomyocarditis virus-derived for producing the totipotent cells according to claim 15 or 16. Contains DNA (SA-IRIS-βgeo-pA gene cassette) obtained by binding SV40-derived pA (polyadenylation signal) to βgeo fused with IRES (internal ribosome entry site), β-galactocidase and neomycin resistance gene And a selectable marker gene promoter-less recombination vector having a base sequence homologous to part of the DNA of the PHF3 gene. アレルギー疾患のタンパク質・遺伝子治療法のための、下記から選ばれる物質の使用。
（１）ＰＨＦ３タンパク質又はその部分領域
（２）上記（１）のタンパク質又はその部分領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチド
（３）上記（１）のタンパク質又はその部分領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ
（４）細胞における発現時に、ＰＨＦ３遺伝子の発現をＲＮＡｉ効果に基づき抑制するＲＮＡをコードするＤＮＡ Use of substances selected from the following for protein / gene therapy for allergic diseases.
(1) PHF3 protein or a partial region thereof (2) Polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of the protein of the above (1) or a partial region thereof or a base sequence complementary to the base sequence (3) above ( 1) DNA encoding RNA having ribozyme activity that specifically cleaves the base sequence encoding the amino acid sequence of the protein or partial region thereof
(4) DNA encoding RNA that suppresses the expression of PHF3 gene based on RNAi effect during expression in cells ＰＨＦ３タンパク質が、下記のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつアレルギー疾患症状改善活性を有する蛋白質であることを特徴とする請求項３５記載の使用。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２又は８で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２又は８で示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２又は８で示される塩基配列と相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号２又は８で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列 36. The use according to claim 35, wherein the PHF3 protein is a protein consisting of any of the following amino acid sequences and having an allergic disease symptom improving activity.
<Amino acid sequence>
(A) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 7 (b) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 7, wherein one or more amino acids are deleted, added or substituted (c) SEQ ID NO: 1 Or an amino acid sequence having 75% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by 7 (d) the amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 8 (e) the base represented by SEQ ID NO: 2 or 8 An amino acid sequence encoded by a DNA having a base sequence having 80% or more sequence identity to the sequence (f) a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 8, and a stringent An amino acid sequence (g) encoded by DNA that hybridizes under conditions (g) DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 8 The encoded amino acid sequence 配列番号１又は７記載のアミノ酸配列又はその部分領域からなるタンパク質に免疫特異的な抗体。   An antibody immunospecific for a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 7 or a partial region thereof. アトピー性皮膚炎の診断のための、下記から選ばれる物質の使用。
（１）ＰＨＦ３タンパク質又はその部分領域
（２）上記（１）のタンパク質又はその部分領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列又は当該塩基配列に相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチド
（３）ＰＨＦ３タンパク質の遺伝子 Use of a substance selected from the following for the diagnosis of atopic dermatitis.
(1) PHF3 protein or a partial region thereof (2) Polynucleotide having a base sequence encoding the amino acid sequence of the protein of the above (1) or a partial region thereof or a base sequence complementary to the base sequence (3) PHF3 protein Genes ＰＨＦ３タンパク質が、下記のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつアレルギー疾患症状改善活性を有する蛋白質であることを特徴とする請求項３８記載の使用。
＜アミノ酸配列＞
（ａ）配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されたアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１又は７で示されるアミノ酸配列と７５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２又は８で示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列
（ｅ）配列番号２又は８で示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２又は８で示される塩基配列と相補性を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列
（ｇ）配列番号２又は８で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列

The use according to claim 38, wherein the PHF3 protein is a protein consisting of any of the following amino acid sequences and having an allergic disease symptom improving activity.
<Amino acid sequence>
(A) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 7 (b) Amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 7, wherein one or more amino acids are deleted, added or substituted (c) SEQ ID NO: 1 Or an amino acid sequence having 75% or more sequence identity with the amino acid sequence represented by 7 (d) the amino acid sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 8 (e) the base represented by SEQ ID NO: 2 or 8 An amino acid sequence encoded by a DNA having a base sequence having 80% or more sequence identity to the sequence (f) a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 8, and a stringent An amino acid sequence (g) encoded by DNA that hybridizes under conditions (g) DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 8 The encoded amino acid sequence

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