JP2004113186A - タンパク質相互作用検出方法およびタンパク質のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】簡便かつ再現性のよいタンパク質相互作用解析法、スクリーニング法を提供する。
【解決手段】一種以上のレポータータンパク質を用いて他の物質との相互作用を検出することを特徴とするタンパク質相互作用の検出方法において、該レポータータンパク質と相互作用の予想される一種以上の候補物質の存在下で該レポータータンパク質を無細胞タンパク質合成により合成することにより、該レポータータンパク質と相互作用する物質をスクリーニングする方法。
【解決手段】一種以上のレポータータンパク質を用いて他の物質との相互作用を検出することを特徴とするタンパク質相互作用の検出方法において、該レポータータンパク質と相互作用の予想される一種以上の候補物質の存在下で該レポータータンパク質を無細胞タンパク質合成により合成することにより、該レポータータンパク質と相互作用する物質をスクリーニングする方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、無細胞タンパク質合成されたタンパク質を用いてタンパク質と物質間の相互作用を検出する方法に関し、より詳細には、無細胞タンパク合成されたタンパク質を用いるタンパク質間相互作用解析およびその応用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞は外界からの刺激に対し、増殖、分化、形態変化、細胞死等の応答を示す。外界からの刺激は、主にストレス刺激、細胞増殖因子、細胞分化因子などがあるが、これらの刺激を情報として伝達し、細胞応答へ結びつけるのが、細胞内シグナル伝達機構である。シグナル伝達機構が正常に機能することにより、細胞の増殖や分化は、極めて厳密な制御の下に置かれているが、この機構がひとたび破壊されると、細胞は制御されることなく成長***することとなる。そのような細胞は無限に増殖を続け、ときに腫瘍を形成するに至る。このようなことから、シグナル伝達機構の研究は、腫瘍形成のメカニズムを解明するのに必要不可欠であるとされてきた。
【０００３】
細胞内でこれらのシグナルを伝達する手段としては、タンパク質のアセチル化や、サイクリックＡＭＰ等の二次メッセンジャーによる機構、また、そのなかでも特に主要なシステムとして、タンパク質のリン酸化／脱リン酸化による機構があげられる。細胞は、ある一つの刺激に対して、いくつもの伝達機構を活性化させる。そのシグナル伝達経路は、ときに枝分かれし、あるいは合流し、ときにはある特定の因子が、一見関係のみられない複数の経路の情報伝達に関わっていたりと、極めて複雑な様相を呈している。そのため、この分野は古くから研究がなされ、非常に多くの知見が得られているにもかかわらず、未だ不明な点が数多く残されている。
【０００４】
シグナル伝達に関与するタンパク質は、それぞれ単独あるいは複数の特定の因子と相互作用することにより、情報の伝達を行っている。一例を挙げると、タンパク質リン酸化酵素の一種であるＭＡＰキナーゼは、別のタンパク質リン酸化酵素ＭＡＰキナーゼキナーゼによるリン酸化を受ける。ＭＡＰキナーゼはＭＡＰキナーゼキナーゼによるリン酸化を受けて初めて活性化し、ＭＡＰキナーゼの標的タンパク質であるＭＡＰＫＡＰＫ（ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）をリン酸化して活性化させたり、あるいは転写因子をリン酸化して活性化させ、その転写因子が関わる遺伝子の発現制御を行ったりしている。ＭＡＰキナーゼをリン酸化する責任タンパク質、あるいはＭＡＰキナーゼがリン酸化する標的タンパク質の特異性は厳密であり、ＭＡＰキナーゼは他種のタンパク質リン酸化酵素による制御を受けることはなく、またあるいはＭＡＰキナーゼ自身が特定の標的タンパク質以外をリン酸化して活性を制御することもない。
【０００５】
ＭＡＰキナーゼを活性化する経路を上流にたどると、さらにＭＡＰキナーゼキナーゼをリン酸化して活性を制御する、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼが存在している。ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼもまた、上流の因子により制御を受けている存在であり、その活性化にはＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼキナーゼと呼ばれるタンパク質や、低分子量Ｇタンパク質と呼ばれるタンパク質が関与していると言われているが、その機構は未だ完全には解明されていない。
【０００６】
ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼの活性化に関わっているタンパク質の一種として、プロテインキナーゼＣが挙げられているが、このプロテインキナーゼＣは元々別の研究によりその存在が明らかになったタンパク質であり、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼとの関連は後の研究により判明したものである。ＭＡＰキナーゼも、プロテインキナーゼＣも、シグナル伝達の分野では比較的古くから知られていたものではあるが、このように、個々の分子がどのような経路でお互いに関与しているのかについては、未解明な点が多い。
【０００７】
シグナル伝達に関わるタンパク質は、現在までにその機能がある程度判明しているとされるものに限定しても、その数は膨大なものにのぼっている。それぞれのタンパク質のシグナル伝達経路における関連性を探索する研究が、これまでにも数多く行われてきた。しかしながら、未解明な伝達経路が多いばかりか、シグナル伝達系に関与するとされる新規な因子が、現在もなお続々と同定されており、それらの関連性の全貌を明らかにする容易ではなく、今後も多大なる労力が必要とされると推測される。
【０００８】
シグナル伝達系のタンパク質の研究には、そのタンパク質が発現している生体組織から抽出精製、あるいは大腸菌や動物細胞等の他の宿主に遺伝子を導入してタンパク質を大量合成し、それを抽出精製して試験管内でその特性を検討するといった方法が用いられてきた。しかしながら、タンパク質の抽出、精製には、時間、労力ともに多大に費やされ、当然ながら検討できるタンパク質の数も限定されてしまう。
【０００９】
また、大腸菌を用いたタンパク質合成法の一般的な特徴として、タンパク合成時に凝集しやすいタンパク質は、インクルージョンボディを形成して不溶化してしまい、タンパク質としての活性を失ってしまうことや、宿主細胞に対して毒性を示すようなタンパク質は合成が困難であったことなどの欠点があった。
【００１０】
さらに、シグナル伝達系のタンパク質を合成するに際しては、特に発現しようとするタンパク質の由来する生物種と同一または近縁の細胞を用いる場合においては、宿主細胞に固有に発現している他のシグナル伝達系タンパク質による望ましくない影響、例えばリン酸化や脂肪酸付加などの影響が不可避であり、合成されたタンパク質を、いわゆるインタクトな状態で回収するには、信頼性が低いと言わざるを得ない状況であった。またこれは、生体組織から目的タンパク質を単離精製する場合にも同じことが言える。
【００１１】
また、目的の遺伝子をその由来する細胞において過剰発現させ、その表現型を観察することによって目的遺伝子の機能を解析するといった方法が一般に用いられている。ただ、この方法では、そのタンパク質の関与の効果がシグナル伝達経路の末端に影響が現れることが多いため、そのタンパク質自体が他のタンパク質と直接的にどのように相互作用するかを解析する目的には不向きであるといえる。その上、過剰発現することによって、生体内では本来起こり得ないような影響が現れることも多々あり、本来の機能を解析するのに支障をきたすこともある。
【００１２】
逆に、目的遺伝子を欠失させる遺伝子ノックアウト法と呼ばれる方法もあり、細胞レベルではなく、実際にその遺伝子型を持つ個体を生育させて表現形を観察するといった方法をとるが、過剰発現法と同じような問題点があった。
【００１３】
更に、Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムも近年盛んに使用される相互作用の解析方法である。ただ、この方法にも様々な制限があり、相互作用が測定できない場合や、偽陽性が生じやすいなどの問題点が多くあった。
【００１４】
前述のような細胞の系を用いたタンパク質の合成法の欠点を克服する方法として、近年、無細胞タンパク質合成系によるタンパク質合成法が注目を浴びるようになってきた。現在、無細胞タンパク質合成系は、生体細胞からの抽出液を用いたものが主流であり、その中でも、大腸菌、コムギ胚芽、ウサギ網状赤血球に由来するものが特に広く用いられている。特に大腸菌に由来する系は、原料の供給が比較的容易であることもあり、他の二つの系と比較してもより一般的に用いられている。しかしながら、大腸菌は原核細胞であり、真核細胞由来のタンパク質、特にヒト由来のタンパク質を合成しようとした場合、合成システムがうまく適合せずに合成に失敗する例が数多く見られる。特に、シグナル伝達に関与するタンパク質の合成は、経験則的に大腸菌由来の無細胞系では合成が困難であるとされてきた。
【００１５】
一方、大腸菌由来の無細胞タンパク質合成系と比較して、コムギ由来のタンパク質合成系は、コムギが真核生物であることから、ヒトのタンパク質合成により適しているとされている。また、ウサギ網状赤血球と比較しても、材料が遥かに容易に供給されることもあり、無細胞タンパク合成系の中でも特に期待が持たれていた。しかしながらこれまで、内在性のタンパク質合成阻害物質の混入により、その合成効率は芳しいものではなかった。最近、”トリチン”と呼ばれるＲＮＡグリコシダーゼがタンパク質の合成を阻害していることが明らかになり、また、この”トリチン”はコムギ種子の胚乳成分に大量に局在していることが分かった。そこで、コムギ胚芽抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系における効率を上昇させる手段として、胚芽より胚乳成分を洗浄によってほぼ完全に除去することにより、タンパク質合成効率を飛躍的に向上させることが出来るようになることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【００１６】
【非特許文献１】
Ｍａｄｉｎら、 （２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９７， ５５９−５６４
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
上に述べたような理由から、シグナル伝達に係わるタンパク質を中心として、簡便かつ再現性の良い、相互作用パートナーをスクリーニングする方法が求められていた。すなわち、本発明の目的は簡便かつ再現性のよいタンパク質と物質の相互作用解析法、スクリーニング法を提供することである。また、不純物が少なく、状態の変化、特に活性の変化に伴う構造変化や化学的修飾の測定を容易にかつ正確に行うことができるタンパク質と物質との相互作用検出用タンパク質を提供することである。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
前記の目的を達成するために、本発明者らは鋭意研究を重ね、相互作用の予想される一種以上の候補物質を加えた条件下で、無細胞タンパク質合成系でシグナル伝達系タンパク質を合成して相互に反応させることにより、該候補物質と無細胞タンパク質合成系で合成された該シグナル伝達系タンパク質の相互作用により該シグナル伝達系タンパク質を活性化または不活性化させ、活性化または不活性化された該シグナル伝達系タンパク質の活性を測定することにより、各物質間の相互作用の有無を判定する方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１９】
すなわち本発明は以下の項目よりなる。
（１）一種以上のレポータータンパク質を用いて他の物質との相互作用を検出することを特徴とするタンパク質相互作用の検出方法において、該レポータータンパク質と相互作用の予想される一種以上の候補物質の存在下で該レポータータンパク質を無細胞タンパク質合成により合成することにより、該レポータータンパク質と相互作用する物質をスクリーニングする方法。
【００２０】
（２）相互作用の予想される一種以上の候補物質がタンパク質（候補タンパク質）であることを特徴とする（１）記載の方法。
【００２１】
（３）候補タンパク質が無細胞タンパク合成により得られたタンパク質であることを特徴とする（２）に記載の方法
【００２２】
（４）レポータータンパク質が酵素またはレセプターであることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【００２３】
（５）レポータータンパク質がシグナル伝達に関与するタンパク質であることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
【００２４】
（６）無細胞タンパク質合成が、コムギ胚芽抽出液、大腸菌抽出液および、網状赤血球抽出液の少なくとも１つを用いることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００２５】
（７）タンパク質を該タンパク質と相互作用する物質の存在下で無細胞タンパク質合成方法にて合成することにより、不活性化もしくは活性化された該タンパク質を取得する方法。
【００２６】
（８）タンパク質と相互作用する物質がタンパク質であることを特徴とする（７）に記載のタンパク質を取得する方法。
【００２７】
（９）タンパク質と相互作用するタンパク質が変異導入により活性化されたタンパク質であることを特徴とする（８）に記載の方法。
【００２８】
（１０）活性型もしくは不活性型のタンパク質であって、該活性型もしくは不活性型のタンパク質は、該タンパク質と相互作用する物質の存在下で無細胞タンパク質合成方法にて合成されたものであることを特徴とする活性型もしくは不活性型のタンパク質。
【００２９】
（１１）該タンパク質と相互作用する物質がタンパク質であることを特徴とする（１０）に記載の活性型もしくは不活性型のタンパク質。
【００３０】
（１２）活性型もしくは不活性型のタンパク質および、該タンパク質の存在下で合成されたタンパク質がシグナル伝達系タンパク質であることを特徴とする（１１）に記載のタンパク質。
【００３１】
（１３）シグナル伝達系タンパク質が、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、レセプターおよび、転写因子であることを特徴とする（１２）に記載のタンパク質。
【００３２】
【発明の実施の形態】
まず本発明は、一種以上のタンパク質（レポータータンパク質）を用いて、該レポータータンパク質と他の物質（候補物質）、好ましくは他のタンパク質（候補タンパク質）とのタンパク質間相互作用を検出することを特徴とするタンパク質の相互作用の検出方法である。ここで、レポータータンパク質とは候補タンパク質によって相互作用を受けるタンパク質を意味し、また、候補物質もしくは候補タンパク質とはレポータータンパク質に対して相互作用を与えることを期待する物質もしくはタンパク質を意味する。
【００３３】
本発明におけるレポータータンパク質としては特に限定されないが、何らかの形で状態の変化が測定可能であるものが好ましい。
ここで言う状態の変化とは、会合し、結合による複合体形成、タンパク質の立体構造の変化等の物理学的変化、タンパク質分子の修飾、脱修飾等の化学的変化、活性の変化等の他の物質との相互作用の度合いの変化などが挙げられる。
これら状態の変化を測定することにより、レセプタータンパク質と他の物質との相互作用の有無を検出する。
【００３４】
本発明でいう相互作用とは、上記のようにレポータータンパク質が他の物質から何らかの形で状態の変化を受けることを言う。
相互作用の検出は、簡便性の面からタンパク質としての活性の変化により検出することが好ましい。
【００３５】
上記のことから、レポータータンパク質としては、測定の簡便さから、活性測定可能なタンパク質が好ましく、具体的には酵素もしくはレセプターが好ましい。酵素としては特に限定されないが、プロテインキナーゼやプロテインホスファターゼなどのシグナル伝達系酵素、プロテアーゼなどを挙げることが出来る。また、レセプターとしては、相互作用によって、酵素活性の増減がみられるものが好ましく用いられる。例えば、ＡＴＰａｓｅ活性を有するレセプターなどが好ましい。
【００３６】
また、本発明における無細胞タンパク質合成系とは、細胞を用いずに核酸類内に含まれる情報を元にタンパク質やポリペプチドを合成する技術を言い、具体的にはｍＲＮＡを添加してタンパク質やポリペプチド鎖を合成する無細胞翻訳系、あるいはＤＮＡからの情報を元にしてｍＲＮＡを合成し、さらにタンパク質やポリペプチド鎖を合成する無細胞転写翻訳共役系のいずれでもよい。
【００３７】
さらに、本発明における無細胞タンパク質合成系においては、コムギ胚芽抽出液、大腸菌細胞抽出液、網状赤血球抽出液が好適に使用される。
【００３８】
更に好ましくはコムギ胚芽抽出液が使用される。最近、タンパク質合成阻害物質を除去することによりタンパク質合成効率を飛躍的に向上させることが出来るようになることが報告されており（Ｍａｄｉｎ Ｋ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９７， ５５９−５６４）、その原理を用いた製品が販売されていることから（ＰＲＯＴＥＩＯＳ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ：東洋紡製）、それを用いることが好ましいといえる。
【００３９】
無細胞タンパク質合成方法を用いてタンパク質を合成する方法としては公知の方法をそのまま用いることができ、市販キットを用いる場合にはその説明書に従って合成することができる。
【００４０】
本発明に用いる候補物質は、レポータータンパク質の活性化等に何らかの影響を与えると推測されるものであれば、低分子、高分子の有機化合物、糖類、タンパク質、無機イオン類、金属イオン類など特に限定されるものではないが、生態系のタンパク質の複雑な相互作用を解析する目的では、候補物質としてはタンパク質（候補タンパク質）であることが好ましい。
【００４１】
本発明にもちいる候補タンパク質は、天然物からの抽出物、合成物いずれでも良い。合成物の場合、いかなる方法を用いて合成してもよいが、好ましくは無細胞タンパク質合成方法が用いられる。また、無細胞タンパク質合成により得られたタンパク質は不純物が少ないため、レポータータンパク質の状態の変化、特に活性の変化の測定を容易にかつ正確に行うことができる。
【００４２】
また、本発明に用いるタンパク質間相互作用検出用タンパク質はシグナル伝達系タンパク質であることが好ましい。
ここでいうシグナル伝達系タンパク質とは、細胞内シグナル伝達経路に関与する一連のタンパク質の総称またはその一部を指す。具体的には、プロテインキナーゼ、プロテインフォスファターゼ、レセプター、転写因子などが好ましく、さらに具体的には、プロテインキナーゼとしては、ＭＡＰキナーゼ、ＭＡＰキナーゼキナーゼ、プロテインキナーゼＣ、非受容体型チロシンキナーゼなど、プロテインフォスファターゼとして、カルシニューリン、ＭＡＰキナーゼフォスファターゼなど、レセプターとして、ＥＧＦレセプター、ＰＤＧＦレセプターなど、転写因子として、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎなどを用いることができる。
【００４３】
また、本発明では、これらのレセプタータンパク質の活性変化を測定することにより、容易に候補タンパク質をスクリーニングすることができる。
【００４４】
一方で、本発明でいう候補タンパク質としては、特に限定されず、レポータータンパク質に相互作用すると思われるタンパク質全般を含む。スクリーニングの際には、候補タンパク質を単独であっても良いし、複数の候補タンパク質を同時に作用させても良く、さらには候補タンパク質が含まれるであろうライブラリーなどからさまざまなタンパク質を共発現させた混合物のようなものでも良い。
【００４５】
また、具体的にスクリーニングする方法としては、ライブラリーをいくつかのグループに分け、無細胞タンパク質合成系で個々のグループのタンパク質を発現させ、それぞれグループ毎に発現させたタンパク質のプールを加えた条件下でレポータータンパク質を無細胞合成し、レポータータンパク質の活性を測定し、まずどのグループに目的の候補タンパク質が含まれるかを推定し、更にグループを分割して解析して行く方法が挙げられる。
【００４６】
後述する実施例では、ＭＡＰキナーゼをレポータータンパク質として、候補タンパク質としてＭＡＰキナーゼキナーゼの構成的活性型変異体（Ｂｒｕｎｅｔ Ａ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９， ３３７９−３３８７）を用いて行ったが、ＭＡＰキナーゼキナーゼの構成的活性型変異体が候補タンパク質のグループのうち約１／１００存在するだけでも、レポータータンパク質（ＭＡＰキナーゼ）の活性化を測定することが可能であったことから、本発明はスクリーニングに非常に有効であることが示された。
【００４７】
また、本発明は、タンパク質を該タンパク質と相互作用の予想される候補物質質の存在下で無細胞タンパク質合成方法を用いて合成し、相互に反応させることにより、不活性化または活性化されたタンパク質を取得する方法を提供する。
【００４８】
ここで言う候補物質とは、活性型もしくは不活性型のタンパク質と相互作用するタンパク質とは、活性型もしくは不活性化のタンパク質と相互作用し、活性状態のタンパク質であれば不活性化させ、不活性状態のタンパク質であれば活性化させる物質である。
【００４９】
活性型もしくは不活性型のタンパク質と相互作用するタンパク質としては、野生型タンパク質を用いても良いが、そのタンパク質自身も活性化が必要な場合があり、必要に応じて変異を導入して、活性化して用いることができる。変異としては、点突然変異、欠失などを挙げることができる。実際本発明の有意性を示す実施例には、プロテインキナーゼの一種であるＭＥＫ１に、２箇所のアミノ酸置換と１箇所の欠失を導入することにより、ＭＥＫ１を他のタンパク質からの制御を受けない構成的活性型変異体を作成し、これを用いてプロテインキナーゼの一種であるＥＲＫ２の活性化を示した。 ＥＲＫ２は変異型のＭＥＫ１により活性化され、本発明の有意性が示された。
【００５０】
また、本発明は、上記方法に従って活性化または不活性化されたタンパク質である。タンパク質としてはシグナル伝達系タンパク質が好ましい。
この方法を用いることにより、従来法では非常に煩雑であった活性化もしくは不活性化タンパク質の調整を非常に短時間で終わらせることができ、また、不純物が少なく、解析に用いるのに適したタンパク質を容易に得ることができる。
従って、このタンパク質を用いることにより、タンパク質の活性、不活性状態での構造変化、修飾変化などの解析を行うことも容易となる。
【００５１】
以下、本発明におけるタンパク質相互作用のスクリーニング法について詳細に説明する。
本発明に使用される無細胞抽出液は、通常のいかなる組成のものを用いてもよい。しかし、タンパク合成効率や、取扱の簡便さを考慮すると、コムギ胚芽由来抽出液を用いるのが望ましい。無細胞タンパク質合成反応液には、無細胞抽出液のほか、目的のタンパク質をコードするＤＮＡあるいはＲＮＡ、ＤＮＡを用いる場合にはＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸、緩衝液、ＡＴＰまたはＧＴＰなどのエネルギー源、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ等のＡＴＰ再生系、安定化剤、ＲＮａｓｅ阻害剤等を適量加える。反応温度は、２３−２６℃が適している。
【００５２】
タンパク質合成の鋳型となるｍＲＮＡは、ＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼによる転写反応により提供される。本発明に用いられるＲＮＡポリメラーゼは、通常のいかなる構造の物を用いてもよい。しかし、ｍＲＮＡ転写効率や、取扱の簡便さを考慮すると、市販のＴ７、ＳＰ６等のウィルス由来のＲＮＡポリメラーゼが望ましい。
【００５３】
本発明に用いられる鋳型ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼが結合するプロモータ配列と、その下流に目的遺伝子のオープンリーディングフレームが配置される構造を持つ。望ましくは、プロモータとオープンリーディングフレームとの間に翻訳増強配列が含まれるものが良い。また、適当なベクター上に配置されたプラスミドＤＮＡの形態であることが望ましい。本発明におけるＤＮＡの転写は、合成するタンパク質をコードするＤＮＡを全て混合した状態で一反応系で行ってもよいし、もちろん、各タンパク質をコードする遺伝子から別個にＲＮＡを合成し、合成後に任意の割合で各ＲＮＡを混合しても良い。
【００５４】
本発明に用いられる候補タンパク質の遺伝子は、レポータータンパク質に対して相互作用する可能性が示唆される既知タンパク質の遺伝子もしくは構造的に作用を及ぼす可能性が高い機能的に未知なタンパク質の遺伝子を任意に選択したものであってもよいし、ランダムもしくは網羅的にあらゆる遺伝子を包含したものであってもよい。
【００５５】
【実施例】
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００５６】
実施例１
ヒト由来ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）遺伝子のクローニング
ＨｅＬａ細胞由来のｍＲＮＡを単離精製し、これを鋳型として逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。逆転写反応には、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（Ｒ）（東洋紡績製）を用いた。合成したｃＤＮＡを鋳型として、センスプライマーＭＡＰＫ１−Ｆ（配列番号１）とアンチセンスプライマーＭＡＰＫ１−Ｒ（配列番号２）を用い、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応には、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）を使用し、各プライマー５０ｐｍｏｌ、硫酸マグネシウム１ｍＭ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ各０．２ｍＭ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ− 専用バッファーを１ｘ濃度、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ− ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット、最終液量５０μｌの反応系で、９４℃２分、［９４℃１５秒、６０℃２０秒、６８℃１分］ｘ２５サイクルの温度で反応を行った。ＰＣＲ産物を精製し、無細胞タンパク質合成キット「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属の専用ベクターｐＥＵ３−ＮＩＩのＥｃｏＲＶサイトにサブクローニングを行い、プラスミドｐＥＵ−ＭＡＰＫ１を構築した。
【００５７】
実施例２
ヒト由来ＭＥＫ１遺伝子の構成的活性型変異体のクローニング
ＨｅＬａ細胞由来のｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡを鋳型として、５ステップのｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行うことにより、ＭＥＫ１遺伝子の増幅と構成的活性型変異の導入を同時に行った。
具体的には、ＨｅＬａ細胞由来のｍＲＮＡを単離精製し、これを鋳型として逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。逆転写反応には、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（Ｒ）（東洋紡績製）を用いた。合成したｃＤＮＡを鋳型として、センスプライマーＭＥＫ１−Ｆ（配列番号３）とアンチセンスプライマーＭＥＫ１−Ｒ（配列番号４）を用い、ＰＣＲ反応を行った（第一ステップ）。ＰＣＲ反応には、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ− ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）を使用し、各プライマー５０ｐｍｏｌ、硫酸マグネシウム１ｍＭ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ各０．２ｍＭ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ− 専用バッファーを１ｘ濃度、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ− ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット、最終液量５０μｌの反応系で、９４℃２分、［９４℃１５秒、６０℃２０秒、６８℃１分］ｘ２０サイクルの温度で反応を行った。増幅したＰＣＲ産物を鋳型として、センスプライマーＭＥＫ１−ＦとアンチセンスプライマーＭＥＫ１−ＣＡＲ（配列番号５）およびセンスプライマーＭＥＫ１−ＣＡＦ（配列番号６）とアンチセンスプライマーＭＥＫ１−Ｒの二種の組み合わせのプライマーを用いて、前記と同じ反応条件でＰＣＲ反応を行った（第二ステップ）。ＭＥＫ１−ＣＡＦとＭＥＫ１−ＣＡＲには、アミノ酸置換（Ｓｅｒ２１８Ｇｌｕ、Ｓｅｒ２２２Ｇｌｕ）を導入する塩基配列を含んでいる。二種のＰＣＲ産物を鋳型として、センスプライマーＭＥＫ１−ＦとアンチセンスプライマーＭＥＫ１−Ｒを用いて、前記と同じ反応条件でＰＣＲ反応を行った（第三ステップ）。増幅したＰＣＲ産物を鋳型として、センスプライマーＭＥＫ１−ＦとアンチセンスプライマーＭＥＫ１−ＡａＲ（配列番号７）およびセンスプライマーＭＥＫ１−ＡａＦ（配列番号８）とアンチセンスプライマーＭＥＫ１−Ｒの二種の組み合わせのプライマーを用いて、前記と同じ反応条件でＰＣＲ反応を行った（第四ステップ）。ＭＥＫ１−ＡａＦとＭＥＫ１−ＡａＲには、５２５位のＡａｔ Ｉ切断部位を破壊するサイレント変異を導入する塩基配列を含んでいる。二種のＰＣＲ産物を鋳型として、センスプライマーＭＥＫ１−ＦとアンチセンスプライマーＭＥＫ１−Ｒを用いて、前記と同じ反応条件でＰＣＲ反応を行った（第五ステップ）。増幅したＰＣＲ産物を、前述のｐＥＵ３−ＮＩＩベクターのＥｃｏＲＶサイトにサブクローニングし、中間体プラスミドｐＥＵ−ＭＥＫ１−ＸＥを構築した。このプラスミドを２箇所のＡａｔ Ｉサイトで切断し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応で再び連結することによって、その間のＤＮＡ断片を欠失させ、ｐＥＵ−ＭＥＫ１−ＣＡを構築した。
【００５８】
実施例３
ＭＥＫ１構成的活性型変異体の無細胞タンパク質合成系による合成
上記のプラスミドｐＥＵ−ＭＥＫ１−ＣＡを鋳型として、Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）によりｍＲＮＡの合成をそれぞれ行った。合成したｍＲＮＡをＧ−２５マイクロスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて精製、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファーミックス溶液にバッファー置換し、重層法による無細胞タンパク質合成を行った。
重層法反応は、９６穴プレートにおいて、滅菌水１．８μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファー＃２ ２．０μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のクレアチンキナーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）１．７μｌ、ＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／μｌ、東洋紡績製）１．０μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のコムギ胚芽抽出液１０．０μｌ、バッファー置換したｐＥＵ−ＭＡＰＫ１由来の精製ｍＲＮＡ液（０．３〜０．４μｇ／μｌ）３３．５μｌからなるリアクションミックス溶液を、あらかじめ９６穴プレートに分注したバッファーミックス溶液２５０μｌの下に重層することにより行った。反応は、２６℃で１６時間行った。合成したＥＲＫ２タンパク質をＧ−２５マイクロスピンカラムを用いて精製、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファーミックス溶液にバッファー置換した。
【００５９】
実施例４
ＭＥＫ１構成的活性型変異体存在下でのＥＲＫ２の無細胞タンパク質合成系による合成
上記のプラスミドｐＥＵ−ＭＡＰＫ１を鋳型として、Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）によりｍＲＮＡの合成をそれぞれ行った。合成したｍＲＮＡをＧ−２５マイクロスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて精製、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファーミックス溶液にバッファー置換し、重層法による無細胞タンパク質合成を行った。
重層法反応は、９６穴プレートにおいて、滅菌水１．８μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファー＃２ ２．０μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のクレアチンキナーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）１．７μｌ、ＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／μｌ、東洋紡績製）１．０μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のコムギ胚芽抽出液１０．０μｌ、バッファー置換したｐＥＵ−ＥＲＫ２由来の精製ｍＲＮＡ溶液（０．３〜０．４μｇ／μｌ）１３．４μｌ、バッファー置換したＭＥＫ１構成的活性型変異体の精製タンパク質溶液２０．１μｌからなるリアクションミックス溶液を、あらかじめ９６穴プレートに分注したバッファーミックス溶液２５０μｌの下に重層することにより行った。反応は、２６℃で１６時間行った。
【００６０】
実施例５
ＥＲＫ２の酵素活性測定
無細胞タンパク質合成により合成したＥＲＫ２の活性測定を行った。
具体的には、無細胞タンパク質合成反応終了液を、Ｇ−２５マイクロスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて、ＭＡＰキナーゼバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ７．５、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）にバッファー置換を行った。このバッファー置換後のタンパク質溶液をサンプル液として活性測定を行った。活性測定には、ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いた。
その結果を図１に示す。ＭＥＫ１構成的活性型変異体を加えずに合成反応を行った際のＥＲＫ２に比べ、ＭＥＫ１構成的活性型変異体を加えて無細胞タンパク合成反応を行った際のＥＲＫ２は、１０００倍を超える活性の増強が確認された。この結果はＥＲＫ２がＭＥＫ１により活性化されたことを強く示唆しており、この２種類のタンパク質が相互作用する関係にあることが改めて証明されるに至った。この結果は、本発明が、相互の関係が不明確である２種類のタンパク質の相互作用の有無を証明するのに有効な手段であることを示す好例であると考えられ、他の種類のシグナル伝達系タンパク質への応用が可能になると期待される。
【００６１】
実施例６
ＭＥＫ１構成的活性型変異体と他のタンパク質との無細胞タンパク質合成系による同時合成
上記のプラスミドｐＥＵ−ＭＡＰＫ１と、同じくｐＥＵ３−ＮＩＩベクターにクローニングした無関係の遺伝子９９種類と上記のｐＥＵ−ＭＥＫ１−ＣＡをそれぞれ等量混合したプラスミド混合液（以下、ライブラリ）を、１：１の割合で混合したものを鋳型として、Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）によりｍＲＮＡの合成を行った。合成したｍＲＮＡをＧ−２５マイクロスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて精製、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファーミックス溶液にバッファー置換し、重層法による無細胞タンパク質合成を行った。
重層法反応は、９６穴プレートにおいて、滅菌水１．８μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファー＃２ ２．０μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のクレアチンキナーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）１．７μｌ、ＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／μｌ、東洋紡績製）１．０μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のコムギ胚芽抽出液１０．０μｌ、バッファー置換したライブラリ由来の精製ｍＲＮＡ等量混合液（０．３〜０．４μｇ／μｌ）３３．５μｌからなるリアクションミックス溶液を、あらかじめ９６穴プレートに分注したバッファーミックス溶液２５０μｌの下に重層することにより行った。反応は、２６℃で１６時間行った。
【００６２】
実施例７
ＭＥＫ１構成的活性型変異体および他のタンパク質存在下でのＥＲＫ２の無細胞タンパク質合成系による合成
上記のプラスミドｐＥＵ−ＭＡＰＫ１を鋳型として、Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）によりｍＲＮＡの合成をそれぞれ行った。合成したｍＲＮＡをＧ−２５マイクロスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて精製、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファーミックス溶液にバッファー置換し、重層法による無細胞タンパク質合成を行った。
重層法反応は、９６穴プレートにおいて、滅菌水１．８μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファー＃２ ２．０μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のクレアチンキナーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）１．７μｌ、ＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／μｌ、東洋紡績製）１．０μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のコムギ胚芽抽出液１０．０μｌ、バッファー置換したｐＥＵ−ＥＲＫ２由来の精製ｍＲＮＡ溶液（０．３〜０．４μｇ／μｌ）１３．４μｌ、バッファー置換したライブラリ由来の精製タンパク質溶液２０．１μｌからなるリアクションミックス溶液を、あらかじめ９６穴プレートに分注したバッファーミックス溶液２５０μｌの下に重層することにより行った。反応は、２６℃で１６時間行った。
【００６３】
実施例８
ＥＲＫ２の酵素活性測定
無細胞タンパク質合成系により合成したＥＲＫ２の活性測定を行った。
具体的には、無細胞タンパク質合成反応終了液を、Ｇ−２５マイクロスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて、ＭＡＰキナーゼバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ７．５、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）にバッファー置換を行った。このバッファー置換後のタンパク質溶液をサンプル液として活性測定を行った。活性測定には、ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いた。
その結果を図２に示す。あらかじめ加えたタンパク質をＭＥＫ１構成的活性型変異体のみで構成された場合のＥＲＫ２の活性を１００とした場合、ライブラリ由来のタンパク質を加えた場合の活性は、１８となった。ＭＥＫ１の発現量はＥＲＫ２の１／１００前後と推察されるが、等量で発現させた場合には及ばないものの、明らかにＭＥＫ１がＥＲＫ２に作用していることが示された。この結果から、１プールあたり１００クローンからなる遺伝子発現ライブラリを用いて、ＥＲＫ２に相互作用を及ぼす未知または既知のタンパク質の遺伝子を同定することができることは容易に推察される。またこの結果を応用して、ある特定のシグナル伝達系タンパク質に影響を及ぼす未知または既知のタンパク質の遺伝子を同定することができることは容易に推察される。
【００６４】
【発明の効果】
本発明により、あるタンパク質の活性を制御する物質のハイスループットなスクリーニングが可能となった。さらに本発明の方法を用いることにより、活性化または不活性化されたタンパク質を効率的かつ簡便に調整できるようになった。従って本発明によれば、目的タンパク質を活性化または不活性化するうような物質を容易にスクリーニングすることができ、また、活性化または不活性化さらたタンパク質を簡便に調整できる。また、さまざまな物質がタンパクに与える影響を調べることができ、物質の毒性や生体に与える影響の解明、疾患の解明、医薬品の開発などに寄与することができる。
【００６５】
【配列表】
配列番号１
配列の長さ：２１
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
ＣＴＴＣＣＴＴＣＣＴ ＣＴＣＣＣＧＧＴＣＡ Ｇ
【００６６】
配列番号２
配列の長さ：２１
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
ＣＣＴＣＴＧＡＧＣＣ ＣＴＴＧＴＣＣＴＧＡ Ｃ
【００６７】
配列番号３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
ＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡ ＡＧＡＡＧＣＣＧＡＣ
【００６８】
配列番号４
配列の長さ：２０
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
ＴＴＡＧＡＣＧＣＣＡ ＧＣＡＧＣＡＴＧＧＧ
【００６９】
配列番号５
配列の長さ：３０
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
ＧＡＡＣＴＣＧＴＴＧ ＧＣＣＡＴＣＴＣＧＴ ＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧ
【００７０】
配列番号６
配列の長さ：２９
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
ＧＡＣＧＡＧＡＴＧＧ ＣＣＡＡＣＧＡＧＴＴ ＣＧＴＧＧＧＣＡＣ
【００７１】
配列番号７
配列の長さ：２２
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
ＡＣＡＴＡＴＧＴＣＡ ＧＴＣＣＴＴＴＴＡＴ ＴＡ
【００７２】
配列番号８
配列の長さ：２２
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
ＴＡＡＴＡＡＡＡＧＧ ＡＣＴＧＡＣＡＴＡＴ ＣＴ
【図面の簡単な説明】
【図１】ＥＲＫ２の存在下でＭＥＫ１構成的活性型変異体を発現させた場合と発現させなかった場合のＥＲＫ２タンパク質の酵素活性を示す図。
縦軸にＥＲＫ２の活性（基質ペプチドへの３２Ｐの付加活性）を、横軸にサンプルの希釈率を示す。（単独）： ｍＲＮＡを加えずに反応を行った場合、（発現）：ｐＥＵ−ＭＥＫ１−ＣＡ由来のｍＲＮＡを加えてＭＥＫ１−ＣＡを発現させた場合、（コントロール）：ＥＲＫ２を反応系に添加しなかった場合。
【図２】ＭＥＫ１構成的活性型変異体遺伝子を含むライブラリをＥＲＫ２タンパク質存在下で発現させた場合のＥＲＫ２タンパク質の酵素活性を示す図。
横軸にＥＲＫ２の相対活性を示す。ｐＥＵ−ＭＥＫ１−ＣＡ由来のもののみで構成されるｍＲＮＡを添加した場合のＥＲＫ２の活性値を１００とし、ライブラリ由来のｍＲＮＡを添加した場合 （ライブラリ）、ＥＲＫ２単独で発現させた場合（コントロール）の相対値を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、無細胞タンパク質合成されたタンパク質を用いてタンパク質と物質間の相互作用を検出する方法に関し、より詳細には、無細胞タンパク合成されたタンパク質を用いるタンパク質間相互作用解析およびその応用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞は外界からの刺激に対し、増殖、分化、形態変化、細胞死等の応答を示す。外界からの刺激は、主にストレス刺激、細胞増殖因子、細胞分化因子などがあるが、これらの刺激を情報として伝達し、細胞応答へ結びつけるのが、細胞内シグナル伝達機構である。シグナル伝達機構が正常に機能することにより、細胞の増殖や分化は、極めて厳密な制御の下に置かれているが、この機構がひとたび破壊されると、細胞は制御されることなく成長***することとなる。そのような細胞は無限に増殖を続け、ときに腫瘍を形成するに至る。このようなことから、シグナル伝達機構の研究は、腫瘍形成のメカニズムを解明するのに必要不可欠であるとされてきた。
【０００３】
細胞内でこれらのシグナルを伝達する手段としては、タンパク質のアセチル化や、サイクリックＡＭＰ等の二次メッセンジャーによる機構、また、そのなかでも特に主要なシステムとして、タンパク質のリン酸化／脱リン酸化による機構があげられる。細胞は、ある一つの刺激に対して、いくつもの伝達機構を活性化させる。そのシグナル伝達経路は、ときに枝分かれし、あるいは合流し、ときにはある特定の因子が、一見関係のみられない複数の経路の情報伝達に関わっていたりと、極めて複雑な様相を呈している。そのため、この分野は古くから研究がなされ、非常に多くの知見が得られているにもかかわらず、未だ不明な点が数多く残されている。
【０００４】
シグナル伝達に関与するタンパク質は、それぞれ単独あるいは複数の特定の因子と相互作用することにより、情報の伝達を行っている。一例を挙げると、タンパク質リン酸化酵素の一種であるＭＡＰキナーゼは、別のタンパク質リン酸化酵素ＭＡＰキナーゼキナーゼによるリン酸化を受ける。ＭＡＰキナーゼはＭＡＰキナーゼキナーゼによるリン酸化を受けて初めて活性化し、ＭＡＰキナーゼの標的タンパク質であるＭＡＰＫＡＰＫ（ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）をリン酸化して活性化させたり、あるいは転写因子をリン酸化して活性化させ、その転写因子が関わる遺伝子の発現制御を行ったりしている。ＭＡＰキナーゼをリン酸化する責任タンパク質、あるいはＭＡＰキナーゼがリン酸化する標的タンパク質の特異性は厳密であり、ＭＡＰキナーゼは他種のタンパク質リン酸化酵素による制御を受けることはなく、またあるいはＭＡＰキナーゼ自身が特定の標的タンパク質以外をリン酸化して活性を制御することもない。
【０００５】
ＭＡＰキナーゼを活性化する経路を上流にたどると、さらにＭＡＰキナーゼキナーゼをリン酸化して活性を制御する、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼが存在している。ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼもまた、上流の因子により制御を受けている存在であり、その活性化にはＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼキナーゼと呼ばれるタンパク質や、低分子量Ｇタンパク質と呼ばれるタンパク質が関与していると言われているが、その機構は未だ完全には解明されていない。
【０００６】
ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼの活性化に関わっているタンパク質の一種として、プロテインキナーゼＣが挙げられているが、このプロテインキナーゼＣは元々別の研究によりその存在が明らかになったタンパク質であり、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼとの関連は後の研究により判明したものである。ＭＡＰキナーゼも、プロテインキナーゼＣも、シグナル伝達の分野では比較的古くから知られていたものではあるが、このように、個々の分子がどのような経路でお互いに関与しているのかについては、未解明な点が多い。
【０００７】
シグナル伝達に関わるタンパク質は、現在までにその機能がある程度判明しているとされるものに限定しても、その数は膨大なものにのぼっている。それぞれのタンパク質のシグナル伝達経路における関連性を探索する研究が、これまでにも数多く行われてきた。しかしながら、未解明な伝達経路が多いばかりか、シグナル伝達系に関与するとされる新規な因子が、現在もなお続々と同定されており、それらの関連性の全貌を明らかにする容易ではなく、今後も多大なる労力が必要とされると推測される。
【０００８】
シグナル伝達系のタンパク質の研究には、そのタンパク質が発現している生体組織から抽出精製、あるいは大腸菌や動物細胞等の他の宿主に遺伝子を導入してタンパク質を大量合成し、それを抽出精製して試験管内でその特性を検討するといった方法が用いられてきた。しかしながら、タンパク質の抽出、精製には、時間、労力ともに多大に費やされ、当然ながら検討できるタンパク質の数も限定されてしまう。
【０００９】
また、大腸菌を用いたタンパク質合成法の一般的な特徴として、タンパク合成時に凝集しやすいタンパク質は、インクルージョンボディを形成して不溶化してしまい、タンパク質としての活性を失ってしまうことや、宿主細胞に対して毒性を示すようなタンパク質は合成が困難であったことなどの欠点があった。
【００１０】
さらに、シグナル伝達系のタンパク質を合成するに際しては、特に発現しようとするタンパク質の由来する生物種と同一または近縁の細胞を用いる場合においては、宿主細胞に固有に発現している他のシグナル伝達系タンパク質による望ましくない影響、例えばリン酸化や脂肪酸付加などの影響が不可避であり、合成されたタンパク質を、いわゆるインタクトな状態で回収するには、信頼性が低いと言わざるを得ない状況であった。またこれは、生体組織から目的タンパク質を単離精製する場合にも同じことが言える。
【００１１】
また、目的の遺伝子をその由来する細胞において過剰発現させ、その表現型を観察することによって目的遺伝子の機能を解析するといった方法が一般に用いられている。ただ、この方法では、そのタンパク質の関与の効果がシグナル伝達経路の末端に影響が現れることが多いため、そのタンパク質自体が他のタンパク質と直接的にどのように相互作用するかを解析する目的には不向きであるといえる。その上、過剰発現することによって、生体内では本来起こり得ないような影響が現れることも多々あり、本来の機能を解析するのに支障をきたすこともある。
【００１２】
逆に、目的遺伝子を欠失させる遺伝子ノックアウト法と呼ばれる方法もあり、細胞レベルではなく、実際にその遺伝子型を持つ個体を生育させて表現形を観察するといった方法をとるが、過剰発現法と同じような問題点があった。
【００１３】
更に、Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステムも近年盛んに使用される相互作用の解析方法である。ただ、この方法にも様々な制限があり、相互作用が測定できない場合や、偽陽性が生じやすいなどの問題点が多くあった。
【００１４】
前述のような細胞の系を用いたタンパク質の合成法の欠点を克服する方法として、近年、無細胞タンパク質合成系によるタンパク質合成法が注目を浴びるようになってきた。現在、無細胞タンパク質合成系は、生体細胞からの抽出液を用いたものが主流であり、その中でも、大腸菌、コムギ胚芽、ウサギ網状赤血球に由来するものが特に広く用いられている。特に大腸菌に由来する系は、原料の供給が比較的容易であることもあり、他の二つの系と比較してもより一般的に用いられている。しかしながら、大腸菌は原核細胞であり、真核細胞由来のタンパク質、特にヒト由来のタンパク質を合成しようとした場合、合成システムがうまく適合せずに合成に失敗する例が数多く見られる。特に、シグナル伝達に関与するタンパク質の合成は、経験則的に大腸菌由来の無細胞系では合成が困難であるとされてきた。
【００１５】
一方、大腸菌由来の無細胞タンパク質合成系と比較して、コムギ由来のタンパク質合成系は、コムギが真核生物であることから、ヒトのタンパク質合成により適しているとされている。また、ウサギ網状赤血球と比較しても、材料が遥かに容易に供給されることもあり、無細胞タンパク合成系の中でも特に期待が持たれていた。しかしながらこれまで、内在性のタンパク質合成阻害物質の混入により、その合成効率は芳しいものではなかった。最近、”トリチン”と呼ばれるＲＮＡグリコシダーゼがタンパク質の合成を阻害していることが明らかになり、また、この”トリチン”はコムギ種子の胚乳成分に大量に局在していることが分かった。そこで、コムギ胚芽抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系における効率を上昇させる手段として、胚芽より胚乳成分を洗浄によってほぼ完全に除去することにより、タンパク質合成効率を飛躍的に向上させることが出来るようになることが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【００１６】
【非特許文献１】
Ｍａｄｉｎら、 （２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９７， ５５９−５６４
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
上に述べたような理由から、シグナル伝達に係わるタンパク質を中心として、簡便かつ再現性の良い、相互作用パートナーをスクリーニングする方法が求められていた。すなわち、本発明の目的は簡便かつ再現性のよいタンパク質と物質の相互作用解析法、スクリーニング法を提供することである。また、不純物が少なく、状態の変化、特に活性の変化に伴う構造変化や化学的修飾の測定を容易にかつ正確に行うことができるタンパク質と物質との相互作用検出用タンパク質を提供することである。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
前記の目的を達成するために、本発明者らは鋭意研究を重ね、相互作用の予想される一種以上の候補物質を加えた条件下で、無細胞タンパク質合成系でシグナル伝達系タンパク質を合成して相互に反応させることにより、該候補物質と無細胞タンパク質合成系で合成された該シグナル伝達系タンパク質の相互作用により該シグナル伝達系タンパク質を活性化または不活性化させ、活性化または不活性化された該シグナル伝達系タンパク質の活性を測定することにより、各物質間の相互作用の有無を判定する方法を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１９】
すなわち本発明は以下の項目よりなる。
（１）一種以上のレポータータンパク質を用いて他の物質との相互作用を検出することを特徴とするタンパク質相互作用の検出方法において、該レポータータンパク質と相互作用の予想される一種以上の候補物質の存在下で該レポータータンパク質を無細胞タンパク質合成により合成することにより、該レポータータンパク質と相互作用する物質をスクリーニングする方法。
【００２０】
（２）相互作用の予想される一種以上の候補物質がタンパク質（候補タンパク質）であることを特徴とする（１）記載の方法。
【００２１】
（３）候補タンパク質が無細胞タンパク合成により得られたタンパク質であることを特徴とする（２）に記載の方法
【００２２】
（４）レポータータンパク質が酵素またはレセプターであることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【００２３】
（５）レポータータンパク質がシグナル伝達に関与するタンパク質であることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
【００２４】
（６）無細胞タンパク質合成が、コムギ胚芽抽出液、大腸菌抽出液および、網状赤血球抽出液の少なくとも１つを用いることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
【００２５】
（７）タンパク質を該タンパク質と相互作用する物質の存在下で無細胞タンパク質合成方法にて合成することにより、不活性化もしくは活性化された該タンパク質を取得する方法。
【００２６】
（８）タンパク質と相互作用する物質がタンパク質であることを特徴とする（７）に記載のタンパク質を取得する方法。
【００２７】
（９）タンパク質と相互作用するタンパク質が変異導入により活性化されたタンパク質であることを特徴とする（８）に記載の方法。
【００２８】
（１０）活性型もしくは不活性型のタンパク質であって、該活性型もしくは不活性型のタンパク質は、該タンパク質と相互作用する物質の存在下で無細胞タンパク質合成方法にて合成されたものであることを特徴とする活性型もしくは不活性型のタンパク質。
【００２９】
（１１）該タンパク質と相互作用する物質がタンパク質であることを特徴とする（１０）に記載の活性型もしくは不活性型のタンパク質。
【００３０】
（１２）活性型もしくは不活性型のタンパク質および、該タンパク質の存在下で合成されたタンパク質がシグナル伝達系タンパク質であることを特徴とする（１１）に記載のタンパク質。
【００３１】
（１３）シグナル伝達系タンパク質が、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、レセプターおよび、転写因子であることを特徴とする（１２）に記載のタンパク質。
【００３２】
【発明の実施の形態】
まず本発明は、一種以上のタンパク質（レポータータンパク質）を用いて、該レポータータンパク質と他の物質（候補物質）、好ましくは他のタンパク質（候補タンパク質）とのタンパク質間相互作用を検出することを特徴とするタンパク質の相互作用の検出方法である。ここで、レポータータンパク質とは候補タンパク質によって相互作用を受けるタンパク質を意味し、また、候補物質もしくは候補タンパク質とはレポータータンパク質に対して相互作用を与えることを期待する物質もしくはタンパク質を意味する。
【００３３】
本発明におけるレポータータンパク質としては特に限定されないが、何らかの形で状態の変化が測定可能であるものが好ましい。
ここで言う状態の変化とは、会合し、結合による複合体形成、タンパク質の立体構造の変化等の物理学的変化、タンパク質分子の修飾、脱修飾等の化学的変化、活性の変化等の他の物質との相互作用の度合いの変化などが挙げられる。
これら状態の変化を測定することにより、レセプタータンパク質と他の物質との相互作用の有無を検出する。
【００３４】
本発明でいう相互作用とは、上記のようにレポータータンパク質が他の物質から何らかの形で状態の変化を受けることを言う。
相互作用の検出は、簡便性の面からタンパク質としての活性の変化により検出することが好ましい。
【００３５】
上記のことから、レポータータンパク質としては、測定の簡便さから、活性測定可能なタンパク質が好ましく、具体的には酵素もしくはレセプターが好ましい。酵素としては特に限定されないが、プロテインキナーゼやプロテインホスファターゼなどのシグナル伝達系酵素、プロテアーゼなどを挙げることが出来る。また、レセプターとしては、相互作用によって、酵素活性の増減がみられるものが好ましく用いられる。例えば、ＡＴＰａｓｅ活性を有するレセプターなどが好ましい。
【００３６】
また、本発明における無細胞タンパク質合成系とは、細胞を用いずに核酸類内に含まれる情報を元にタンパク質やポリペプチドを合成する技術を言い、具体的にはｍＲＮＡを添加してタンパク質やポリペプチド鎖を合成する無細胞翻訳系、あるいはＤＮＡからの情報を元にしてｍＲＮＡを合成し、さらにタンパク質やポリペプチド鎖を合成する無細胞転写翻訳共役系のいずれでもよい。
【００３７】
さらに、本発明における無細胞タンパク質合成系においては、コムギ胚芽抽出液、大腸菌細胞抽出液、網状赤血球抽出液が好適に使用される。
【００３８】
更に好ましくはコムギ胚芽抽出液が使用される。最近、タンパク質合成阻害物質を除去することによりタンパク質合成効率を飛躍的に向上させることが出来るようになることが報告されており（Ｍａｄｉｎ Ｋ ｅｔ ａｌ． （２０００） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９７， ５５９−５６４）、その原理を用いた製品が販売されていることから（ＰＲＯＴＥＩＯＳ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ：東洋紡製）、それを用いることが好ましいといえる。
【００３９】
無細胞タンパク質合成方法を用いてタンパク質を合成する方法としては公知の方法をそのまま用いることができ、市販キットを用いる場合にはその説明書に従って合成することができる。
【００４０】
本発明に用いる候補物質は、レポータータンパク質の活性化等に何らかの影響を与えると推測されるものであれば、低分子、高分子の有機化合物、糖類、タンパク質、無機イオン類、金属イオン類など特に限定されるものではないが、生態系のタンパク質の複雑な相互作用を解析する目的では、候補物質としてはタンパク質（候補タンパク質）であることが好ましい。
【００４１】
本発明にもちいる候補タンパク質は、天然物からの抽出物、合成物いずれでも良い。合成物の場合、いかなる方法を用いて合成してもよいが、好ましくは無細胞タンパク質合成方法が用いられる。また、無細胞タンパク質合成により得られたタンパク質は不純物が少ないため、レポータータンパク質の状態の変化、特に活性の変化の測定を容易にかつ正確に行うことができる。
【００４２】
また、本発明に用いるタンパク質間相互作用検出用タンパク質はシグナル伝達系タンパク質であることが好ましい。
ここでいうシグナル伝達系タンパク質とは、細胞内シグナル伝達経路に関与する一連のタンパク質の総称またはその一部を指す。具体的には、プロテインキナーゼ、プロテインフォスファターゼ、レセプター、転写因子などが好ましく、さらに具体的には、プロテインキナーゼとしては、ＭＡＰキナーゼ、ＭＡＰキナーゼキナーゼ、プロテインキナーゼＣ、非受容体型チロシンキナーゼなど、プロテインフォスファターゼとして、カルシニューリン、ＭＡＰキナーゼフォスファターゼなど、レセプターとして、ＥＧＦレセプター、ＰＤＧＦレセプターなど、転写因子として、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎなどを用いることができる。
【００４３】
また、本発明では、これらのレセプタータンパク質の活性変化を測定することにより、容易に候補タンパク質をスクリーニングすることができる。
【００４４】
一方で、本発明でいう候補タンパク質としては、特に限定されず、レポータータンパク質に相互作用すると思われるタンパク質全般を含む。スクリーニングの際には、候補タンパク質を単独であっても良いし、複数の候補タンパク質を同時に作用させても良く、さらには候補タンパク質が含まれるであろうライブラリーなどからさまざまなタンパク質を共発現させた混合物のようなものでも良い。
【００４５】
また、具体的にスクリーニングする方法としては、ライブラリーをいくつかのグループに分け、無細胞タンパク質合成系で個々のグループのタンパク質を発現させ、それぞれグループ毎に発現させたタンパク質のプールを加えた条件下でレポータータンパク質を無細胞合成し、レポータータンパク質の活性を測定し、まずどのグループに目的の候補タンパク質が含まれるかを推定し、更にグループを分割して解析して行く方法が挙げられる。
【００４６】
後述する実施例では、ＭＡＰキナーゼをレポータータンパク質として、候補タンパク質としてＭＡＰキナーゼキナーゼの構成的活性型変異体（Ｂｒｕｎｅｔ Ａ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９， ３３７９−３３８７）を用いて行ったが、ＭＡＰキナーゼキナーゼの構成的活性型変異体が候補タンパク質のグループのうち約１／１００存在するだけでも、レポータータンパク質（ＭＡＰキナーゼ）の活性化を測定することが可能であったことから、本発明はスクリーニングに非常に有効であることが示された。
【００４７】
また、本発明は、タンパク質を該タンパク質と相互作用の予想される候補物質質の存在下で無細胞タンパク質合成方法を用いて合成し、相互に反応させることにより、不活性化または活性化されたタンパク質を取得する方法を提供する。
【００４８】
ここで言う候補物質とは、活性型もしくは不活性型のタンパク質と相互作用するタンパク質とは、活性型もしくは不活性化のタンパク質と相互作用し、活性状態のタンパク質であれば不活性化させ、不活性状態のタンパク質であれば活性化させる物質である。
【００４９】
活性型もしくは不活性型のタンパク質と相互作用するタンパク質としては、野生型タンパク質を用いても良いが、そのタンパク質自身も活性化が必要な場合があり、必要に応じて変異を導入して、活性化して用いることができる。変異としては、点突然変異、欠失などを挙げることができる。実際本発明の有意性を示す実施例には、プロテインキナーゼの一種であるＭＥＫ１に、２箇所のアミノ酸置換と１箇所の欠失を導入することにより、ＭＥＫ１を他のタンパク質からの制御を受けない構成的活性型変異体を作成し、これを用いてプロテインキナーゼの一種であるＥＲＫ２の活性化を示した。 ＥＲＫ２は変異型のＭＥＫ１により活性化され、本発明の有意性が示された。
【００５０】
また、本発明は、上記方法に従って活性化または不活性化されたタンパク質である。タンパク質としてはシグナル伝達系タンパク質が好ましい。
この方法を用いることにより、従来法では非常に煩雑であった活性化もしくは不活性化タンパク質の調整を非常に短時間で終わらせることができ、また、不純物が少なく、解析に用いるのに適したタンパク質を容易に得ることができる。
従って、このタンパク質を用いることにより、タンパク質の活性、不活性状態での構造変化、修飾変化などの解析を行うことも容易となる。
【００５１】
以下、本発明におけるタンパク質相互作用のスクリーニング法について詳細に説明する。
本発明に使用される無細胞抽出液は、通常のいかなる組成のものを用いてもよい。しかし、タンパク合成効率や、取扱の簡便さを考慮すると、コムギ胚芽由来抽出液を用いるのが望ましい。無細胞タンパク質合成反応液には、無細胞抽出液のほか、目的のタンパク質をコードするＤＮＡあるいはＲＮＡ、ＤＮＡを用いる場合にはＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸、緩衝液、ＡＴＰまたはＧＴＰなどのエネルギー源、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ等のＡＴＰ再生系、安定化剤、ＲＮａｓｅ阻害剤等を適量加える。反応温度は、２３−２６℃が適している。
【００５２】
タンパク質合成の鋳型となるｍＲＮＡは、ＤＮＡからＲＮＡポリメラーゼによる転写反応により提供される。本発明に用いられるＲＮＡポリメラーゼは、通常のいかなる構造の物を用いてもよい。しかし、ｍＲＮＡ転写効率や、取扱の簡便さを考慮すると、市販のＴ７、ＳＰ６等のウィルス由来のＲＮＡポリメラーゼが望ましい。
【００５３】
本発明に用いられる鋳型ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼが結合するプロモータ配列と、その下流に目的遺伝子のオープンリーディングフレームが配置される構造を持つ。望ましくは、プロモータとオープンリーディングフレームとの間に翻訳増強配列が含まれるものが良い。また、適当なベクター上に配置されたプラスミドＤＮＡの形態であることが望ましい。本発明におけるＤＮＡの転写は、合成するタンパク質をコードするＤＮＡを全て混合した状態で一反応系で行ってもよいし、もちろん、各タンパク質をコードする遺伝子から別個にＲＮＡを合成し、合成後に任意の割合で各ＲＮＡを混合しても良い。
【００５４】
本発明に用いられる候補タンパク質の遺伝子は、レポータータンパク質に対して相互作用する可能性が示唆される既知タンパク質の遺伝子もしくは構造的に作用を及ぼす可能性が高い機能的に未知なタンパク質の遺伝子を任意に選択したものであってもよいし、ランダムもしくは網羅的にあらゆる遺伝子を包含したものであってもよい。
【００５５】
【実施例】
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【００５６】
実施例１
ヒト由来ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）遺伝子のクローニング
ＨｅＬａ細胞由来のｍＲＮＡを単離精製し、これを鋳型として逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。逆転写反応には、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（Ｒ）（東洋紡績製）を用いた。合成したｃＤＮＡを鋳型として、センスプライマーＭＡＰＫ１−Ｆ（配列番号１）とアンチセンスプライマーＭＡＰＫ１−Ｒ（配列番号２）を用い、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応には、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）を使用し、各プライマー５０ｐｍｏｌ、硫酸マグネシウム１ｍＭ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ各０．２ｍＭ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ− 専用バッファーを１ｘ濃度、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ− ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット、最終液量５０μｌの反応系で、９４℃２分、［９４℃１５秒、６０℃２０秒、６８℃１分］ｘ２５サイクルの温度で反応を行った。ＰＣＲ産物を精製し、無細胞タンパク質合成キット「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属の専用ベクターｐＥＵ３−ＮＩＩのＥｃｏＲＶサイトにサブクローニングを行い、プラスミドｐＥＵ−ＭＡＰＫ１を構築した。
【００５７】
実施例２
ヒト由来ＭＥＫ１遺伝子の構成的活性型変異体のクローニング
ＨｅＬａ細胞由来のｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡを鋳型として、５ステップのｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行うことにより、ＭＥＫ１遺伝子の増幅と構成的活性型変異の導入を同時に行った。
具体的には、ＨｅＬａ細胞由来のｍＲＮＡを単離精製し、これを鋳型として逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。逆転写反応には、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（Ｒ）（東洋紡績製）を用いた。合成したｃＤＮＡを鋳型として、センスプライマーＭＥＫ１−Ｆ（配列番号３）とアンチセンスプライマーＭＥＫ１−Ｒ（配列番号４）を用い、ＰＣＲ反応を行った（第一ステップ）。ＰＣＲ反応には、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ− ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）を使用し、各プライマー５０ｐｍｏｌ、硫酸マグネシウム１ｍＭ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ各０．２ｍＭ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ− 専用バッファーを１ｘ濃度、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ− ＤＮＡポリメラーゼ１ユニット、最終液量５０μｌの反応系で、９４℃２分、［９４℃１５秒、６０℃２０秒、６８℃１分］ｘ２０サイクルの温度で反応を行った。増幅したＰＣＲ産物を鋳型として、センスプライマーＭＥＫ１−ＦとアンチセンスプライマーＭＥＫ１−ＣＡＲ（配列番号５）およびセンスプライマーＭＥＫ１−ＣＡＦ（配列番号６）とアンチセンスプライマーＭＥＫ１−Ｒの二種の組み合わせのプライマーを用いて、前記と同じ反応条件でＰＣＲ反応を行った（第二ステップ）。ＭＥＫ１−ＣＡＦとＭＥＫ１−ＣＡＲには、アミノ酸置換（Ｓｅｒ２１８Ｇｌｕ、Ｓｅｒ２２２Ｇｌｕ）を導入する塩基配列を含んでいる。二種のＰＣＲ産物を鋳型として、センスプライマーＭＥＫ１−ＦとアンチセンスプライマーＭＥＫ１−Ｒを用いて、前記と同じ反応条件でＰＣＲ反応を行った（第三ステップ）。増幅したＰＣＲ産物を鋳型として、センスプライマーＭＥＫ１−ＦとアンチセンスプライマーＭＥＫ１−ＡａＲ（配列番号７）およびセンスプライマーＭＥＫ１−ＡａＦ（配列番号８）とアンチセンスプライマーＭＥＫ１−Ｒの二種の組み合わせのプライマーを用いて、前記と同じ反応条件でＰＣＲ反応を行った（第四ステップ）。ＭＥＫ１−ＡａＦとＭＥＫ１−ＡａＲには、５２５位のＡａｔ Ｉ切断部位を破壊するサイレント変異を導入する塩基配列を含んでいる。二種のＰＣＲ産物を鋳型として、センスプライマーＭＥＫ１−ＦとアンチセンスプライマーＭＥＫ１−Ｒを用いて、前記と同じ反応条件でＰＣＲ反応を行った（第五ステップ）。増幅したＰＣＲ産物を、前述のｐＥＵ３−ＮＩＩベクターのＥｃｏＲＶサイトにサブクローニングし、中間体プラスミドｐＥＵ−ＭＥＫ１−ＸＥを構築した。このプラスミドを２箇所のＡａｔ Ｉサイトで切断し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応で再び連結することによって、その間のＤＮＡ断片を欠失させ、ｐＥＵ−ＭＥＫ１−ＣＡを構築した。
【００５８】
実施例３
ＭＥＫ１構成的活性型変異体の無細胞タンパク質合成系による合成
上記のプラスミドｐＥＵ−ＭＥＫ１−ＣＡを鋳型として、Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）によりｍＲＮＡの合成をそれぞれ行った。合成したｍＲＮＡをＧ−２５マイクロスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて精製、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファーミックス溶液にバッファー置換し、重層法による無細胞タンパク質合成を行った。
重層法反応は、９６穴プレートにおいて、滅菌水１．８μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファー＃２ ２．０μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のクレアチンキナーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）１．７μｌ、ＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／μｌ、東洋紡績製）１．０μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のコムギ胚芽抽出液１０．０μｌ、バッファー置換したｐＥＵ−ＭＡＰＫ１由来の精製ｍＲＮＡ液（０．３〜０．４μｇ／μｌ）３３．５μｌからなるリアクションミックス溶液を、あらかじめ９６穴プレートに分注したバッファーミックス溶液２５０μｌの下に重層することにより行った。反応は、２６℃で１６時間行った。合成したＥＲＫ２タンパク質をＧ−２５マイクロスピンカラムを用いて精製、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファーミックス溶液にバッファー置換した。
【００５９】
実施例４
ＭＥＫ１構成的活性型変異体存在下でのＥＲＫ２の無細胞タンパク質合成系による合成
上記のプラスミドｐＥＵ−ＭＡＰＫ１を鋳型として、Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）によりｍＲＮＡの合成をそれぞれ行った。合成したｍＲＮＡをＧ−２５マイクロスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて精製、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファーミックス溶液にバッファー置換し、重層法による無細胞タンパク質合成を行った。
重層法反応は、９６穴プレートにおいて、滅菌水１．８μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファー＃２ ２．０μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のクレアチンキナーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）１．７μｌ、ＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／μｌ、東洋紡績製）１．０μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のコムギ胚芽抽出液１０．０μｌ、バッファー置換したｐＥＵ−ＥＲＫ２由来の精製ｍＲＮＡ溶液（０．３〜０．４μｇ／μｌ）１３．４μｌ、バッファー置換したＭＥＫ１構成的活性型変異体の精製タンパク質溶液２０．１μｌからなるリアクションミックス溶液を、あらかじめ９６穴プレートに分注したバッファーミックス溶液２５０μｌの下に重層することにより行った。反応は、２６℃で１６時間行った。
【００６０】
実施例５
ＥＲＫ２の酵素活性測定
無細胞タンパク質合成により合成したＥＲＫ２の活性測定を行った。
具体的には、無細胞タンパク質合成反応終了液を、Ｇ−２５マイクロスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて、ＭＡＰキナーゼバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ７．５、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）にバッファー置換を行った。このバッファー置換後のタンパク質溶液をサンプル液として活性測定を行った。活性測定には、ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いた。
その結果を図１に示す。ＭＥＫ１構成的活性型変異体を加えずに合成反応を行った際のＥＲＫ２に比べ、ＭＥＫ１構成的活性型変異体を加えて無細胞タンパク合成反応を行った際のＥＲＫ２は、１０００倍を超える活性の増強が確認された。この結果はＥＲＫ２がＭＥＫ１により活性化されたことを強く示唆しており、この２種類のタンパク質が相互作用する関係にあることが改めて証明されるに至った。この結果は、本発明が、相互の関係が不明確である２種類のタンパク質の相互作用の有無を証明するのに有効な手段であることを示す好例であると考えられ、他の種類のシグナル伝達系タンパク質への応用が可能になると期待される。
【００６１】
実施例６
ＭＥＫ１構成的活性型変異体と他のタンパク質との無細胞タンパク質合成系による同時合成
上記のプラスミドｐＥＵ−ＭＡＰＫ１と、同じくｐＥＵ３−ＮＩＩベクターにクローニングした無関係の遺伝子９９種類と上記のｐＥＵ−ＭＥＫ１−ＣＡをそれぞれ等量混合したプラスミド混合液（以下、ライブラリ）を、１：１の割合で混合したものを鋳型として、Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）によりｍＲＮＡの合成を行った。合成したｍＲＮＡをＧ−２５マイクロスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて精製、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファーミックス溶液にバッファー置換し、重層法による無細胞タンパク質合成を行った。
重層法反応は、９６穴プレートにおいて、滅菌水１．８μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファー＃２ ２．０μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のクレアチンキナーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）１．７μｌ、ＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／μｌ、東洋紡績製）１．０μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のコムギ胚芽抽出液１０．０μｌ、バッファー置換したライブラリ由来の精製ｍＲＮＡ等量混合液（０．３〜０．４μｇ／μｌ）３３．５μｌからなるリアクションミックス溶液を、あらかじめ９６穴プレートに分注したバッファーミックス溶液２５０μｌの下に重層することにより行った。反応は、２６℃で１６時間行った。
【００６２】
実施例７
ＭＥＫ１構成的活性型変異体および他のタンパク質存在下でのＥＲＫ２の無細胞タンパク質合成系による合成
上記のプラスミドｐＥＵ−ＭＡＰＫ１を鋳型として、Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（東洋紡績製）によりｍＲＮＡの合成をそれぞれ行った。合成したｍＲＮＡをＧ−２５マイクロスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて精製、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファーミックス溶液にバッファー置換し、重層法による無細胞タンパク質合成を行った。
重層法反応は、９６穴プレートにおいて、滅菌水１．８μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のバッファー＃２ ２．０μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のクレアチンキナーゼ（１０ｍｇ／ｍｌ）１．７μｌ、ＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／μｌ、東洋紡績製）１．０μｌ、「ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＭ）」付属のコムギ胚芽抽出液１０．０μｌ、バッファー置換したｐＥＵ−ＥＲＫ２由来の精製ｍＲＮＡ溶液（０．３〜０．４μｇ／μｌ）１３．４μｌ、バッファー置換したライブラリ由来の精製タンパク質溶液２０．１μｌからなるリアクションミックス溶液を、あらかじめ９６穴プレートに分注したバッファーミックス溶液２５０μｌの下に重層することにより行った。反応は、２６℃で１６時間行った。
【００６３】
実施例８
ＥＲＫ２の酵素活性測定
無細胞タンパク質合成系により合成したＥＲＫ２の活性測定を行った。
具体的には、無細胞タンパク質合成反応終了液を、Ｇ−２５マイクロスピンカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて、ＭＡＰキナーゼバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ７．５、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）にバッファー置換を行った。このバッファー置換後のタンパク質溶液をサンプル液として活性測定を行った。活性測定には、ｐ４２／ｐ４４ ＭＡＰ Ｋｉｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いた。
その結果を図２に示す。あらかじめ加えたタンパク質をＭＥＫ１構成的活性型変異体のみで構成された場合のＥＲＫ２の活性を１００とした場合、ライブラリ由来のタンパク質を加えた場合の活性は、１８となった。ＭＥＫ１の発現量はＥＲＫ２の１／１００前後と推察されるが、等量で発現させた場合には及ばないものの、明らかにＭＥＫ１がＥＲＫ２に作用していることが示された。この結果から、１プールあたり１００クローンからなる遺伝子発現ライブラリを用いて、ＥＲＫ２に相互作用を及ぼす未知または既知のタンパク質の遺伝子を同定することができることは容易に推察される。またこの結果を応用して、ある特定のシグナル伝達系タンパク質に影響を及ぼす未知または既知のタンパク質の遺伝子を同定することができることは容易に推察される。
【００６４】
【発明の効果】
本発明により、あるタンパク質の活性を制御する物質のハイスループットなスクリーニングが可能となった。さらに本発明の方法を用いることにより、活性化または不活性化されたタンパク質を効率的かつ簡便に調整できるようになった。従って本発明によれば、目的タンパク質を活性化または不活性化するうような物質を容易にスクリーニングすることができ、また、活性化または不活性化さらたタンパク質を簡便に調整できる。また、さまざまな物質がタンパクに与える影響を調べることができ、物質の毒性や生体に与える影響の解明、疾患の解明、医薬品の開発などに寄与することができる。
【００６５】
【配列表】
配列番号１
配列の長さ：２１
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
ＣＴＴＣＣＴＴＣＣＴ ＣＴＣＣＣＧＧＴＣＡ Ｇ
【００６６】
配列番号２
配列の長さ：２１
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
ＣＣＴＣＴＧＡＧＣＣ ＣＴＴＧＴＣＣＴＧＡ Ｃ
【００６７】
配列番号３
配列の長さ：２０
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
ＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡ ＡＧＡＡＧＣＣＧＡＣ
【００６８】
配列番号４
配列の長さ：２０
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
ＴＴＡＧＡＣＧＣＣＡ ＧＣＡＧＣＡＴＧＧＧ
【００６９】
配列番号５
配列の長さ：３０
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
ＧＡＡＣＴＣＧＴＴＧ ＧＣＣＡＴＣＴＣＧＴ ＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧ
【００７０】
配列番号６
配列の長さ：２９
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
ＧＡＣＧＡＧＡＴＧＧ ＣＣＡＡＣＧＡＧＴＴ ＣＧＴＧＧＧＣＡＣ
【００７１】
配列番号７
配列の長さ：２２
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
ＡＣＡＴＡＴＧＴＣＡ ＧＴＣＣＴＴＴＴＡＴ ＴＡ
【００７２】
配列番号８
配列の長さ：２２
配列の型：核酸（ＤＮＡ）
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成ＤＮＡ
配列
ＴＡＡＴＡＡＡＡＧＧ ＡＣＴＧＡＣＡＴＡＴ ＣＴ
【図面の簡単な説明】
【図１】ＥＲＫ２の存在下でＭＥＫ１構成的活性型変異体を発現させた場合と発現させなかった場合のＥＲＫ２タンパク質の酵素活性を示す図。
縦軸にＥＲＫ２の活性（基質ペプチドへの３２Ｐの付加活性）を、横軸にサンプルの希釈率を示す。（単独）： ｍＲＮＡを加えずに反応を行った場合、（発現）：ｐＥＵ−ＭＥＫ１−ＣＡ由来のｍＲＮＡを加えてＭＥＫ１−ＣＡを発現させた場合、（コントロール）：ＥＲＫ２を反応系に添加しなかった場合。
【図２】ＭＥＫ１構成的活性型変異体遺伝子を含むライブラリをＥＲＫ２タンパク質存在下で発現させた場合のＥＲＫ２タンパク質の酵素活性を示す図。
横軸にＥＲＫ２の相対活性を示す。ｐＥＵ−ＭＥＫ１−ＣＡ由来のもののみで構成されるｍＲＮＡを添加した場合のＥＲＫ２の活性値を１００とし、ライブラリ由来のｍＲＮＡを添加した場合 （ライブラリ）、ＥＲＫ２単独で発現させた場合（コントロール）の相対値を示す。
Claims (13)
- 一種以上のレポータータンパク質を用いて他の物質との相互作用を検出することを特徴とするタンパク質相互作用の検出方法において、該レポータータンパク質と相互作用の予想される一種以上の候補物質の存在下で該レポータータンパク質を無細胞タンパク質合成により合成することにより、該レポータータンパク質と相互作用する物質をスクリーニングする方法。
- 相互作用の予想される一種以上の候補物質がタンパク質（候補タンパク質）であることを特徴とする請求項１記載の方法。
- 候補タンパク質が無細胞タンパク合成により得られたタンパク質であることを特徴とする請求項２に記載の方法
- レポータータンパク質が酵素またはレセプターであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- レポータータンパク質がシグナル伝達に関与するタンパク質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 無細胞タンパク質合成が、コムギ胚芽抽出液、大腸菌抽出液および、網状赤血球抽出液の少なくとも１つを用いることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- タンパク質を該タンパク質と相互作用する物質の存在下で無細胞タンパク質合成方法にて合成することにより、不活性化もしくは活性化された該タンパク質を取得する方法。
- タンパク質と相互作用する物質がタンパク質であることを特徴とする請求項７に記載のタンパク質を取得する方法。
- タンパク質と相互作用するタンパク質が変異導入により活性化されたタンパク質であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
- 活性型もしくは不活性型のタンパク質であって、該活性型もしくは不活性型のタンパク質は、該タンパク質と相互作用する物質の存在下で無細胞タンパク質合成方法にて合成されたものであることを特徴とする活性型もしくは不活性型のタンパク質。
- 該タンパク質と相互作用する物質がタンパク質であることを特徴とする請求項１０に記載の活性型もしくは不活性型のタンパク質。
- 活性型もしくは不活性型のタンパク質および、該タンパク質の存在下で合成されたタンパク質がシグナル伝達系タンパク質であることを特徴とする請求項１１に記載のタンパク質。
- シグナル伝達系タンパク質が、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、レセプターおよび、転写因子であることを特徴とする請求項１２に記載のタンパク質。
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|---|---|---|---|---|
| WO2005024428A1 (ja) * | 2003-09-08 | 2005-03-17 | Cellfree Sciences Co., Ltd. | 生理活性タンパク質に対する薬剤の新規ハイスループットスクリーニング法 |
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