JP2004057198A - 多能性体細胞 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の動物の培養体細胞は、正常核型を有し、かつインビトロで誘導された時に胚様体に発達するか、SCIDマウスに導入された時に奇形腫に発達する。そのような細胞の生産方法も開示されている。
【選択図】なし
Description
【発明の属する技術分野】
(発明の属する技術分野)
本発明は、動物の培養体細胞とその生産方法に関する。
(関連出願)
本願は、2002年7月26日に出願された米国仮出願出願番号第60/398,883号の優先権を主張する。その出願の内容は引用により本願に組み込まれる。
【0002】
【従来の技術】
多分化能すなわち多能性の胚性幹(ES)細胞は、哺乳類の初期胚に由来する。ES細胞はインビボですべての細胞系統に分化することができ、インビトロで誘導された場合にはほとんどの細胞の種類に分化する。ES細胞は、その多能性のために、変性疾患や遺伝疾患の治療に大きな見込みがあると考えられている。倫理上の問題により、ヒトES細胞の研究や治療での使用が妨げられている。非胚由来の多能性細胞(例えば体細胞)はこの障害を回避するだろう。
【0003】
ある体細胞が、それとは無関係な種類の組織の細胞に発達できることが報告されている。しかしながら、その発達可能性は制限されている。無制限の発達可能性を有する体細胞が必要とされている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、変性疾患および遺伝疾患の治療や胚の発達/分化のメカニズムの研究に使用でき、かつヒト胚操作の倫理上の問題を回避することができる多能性細胞を提供することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】
1態様では、本発明は、正常核型を有し、インビトロで誘導された場合に胚様体に発達する、動物の培養体細胞、すなわち器官の特徴を有する構造体にさらに発達可能な細胞体をその特徴とする。そのような構造体の例には、規則的な収縮と緩和を示す原腸が含まれる。培養細胞は、非胚由来か非生殖細胞系列由来であるため、体細胞性である。
【0006】
別の態様では、本発明は、正常核型を有し、重症複合免疫不全(SCID)マウスに導入された場合に奇形種に発達する、動物の培養体細胞をその特徴とする。奇形腫は、3つすべての胚葉層(すなわち外胚葉、中胚葉、内胚葉)に由来する組織を含む腫瘍である。組織の例には、角膜レンズおよび発達中の表皮(外胚葉)、軟骨および横紋筋(中胚葉)、ならびに肝臓および胃腸管(内胚葉)が含まれる。1実施態様では、動物の培養体細胞は、インビトロで誘導された場合に、胚様体に発達することができる。別の実施態様では、培養細胞は時期特異的な胚抗原−1(SSEA−1)を発現しない。すなわち、SSEA−1陰性である。
【0007】
さらに別の態様では、本発明は、上述したような多能性動物細胞を生産する方法をその特徴とする。方法は、(1)動物の組織から体細胞を分離する工程と、(2)分離細胞を飢餓条件下で培養する工程と、(3)培養細胞中の多能性細胞を同定し、濃縮する工程とから成る。濃縮された多能性細胞は、SCIDマウスに導入された場合に奇形種へと発達する。ヒトを始めとする哺乳動物から体細胞を分離することができる。この方法で使用する体細胞を分離するためには、いかなる適切な組織も使用することができる。そのような組織の例には、臍帯血、骨髄、羊水、脂肪細胞、胎盤および末梢血が含まれる。
【0008】
多能性細胞を生産するために、分離された細胞は、細胞が成長するのに不利な飢餓条件下で、例えば0.5%〜2%の血清を含む飢餓培地中で5〜10日間または培地を変更せずに10%〜20%の血清を含む標準培地中で7〜21日間培養される。標準培地は、細胞増殖を促進する栄養素および因子を含んでいる。飢餓培地は、細胞増殖のための栄養素および因子の量が少ない。栄養素には、血清や血清代用物が含まれる。因子には、インスリン、表皮成長因子(EGE)、酸性繊維芽細胞成長因子(aFGF)および塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)が含まれる。飢餓条件で培養された細胞のうち、多能性細胞は、例えばその形態や細胞表面マーカー(例えばSSEA−1陰性)に基づいて同定および濃縮される。
【0009】
請求項1に記載の発明は、正常核型を有し、インビトロで誘導された場合に胚様体に発達する動物の培養体細胞を要旨とする。
請求項2に記載の発明は、正常核型を有し、SCIDマウスに導入された場合に奇形腫に発達する動物の培養体細胞を要旨とする。
【0010】
請求項3に記載の発明は、請求項2に記載の細胞において、インビトロで誘導された場合に胚様体に発達することを要旨とする。
請求項4に記載の発明は、請求項3に記載の細胞において、哺乳動物細胞であることを要旨とする。
【0011】
請求項5に記載の発明は、請求項4に記載の細胞において、ヒト細胞であることを要旨とする。
請求項6に記載の発明は、請求項5に記載の細胞において、時期特異的胚抗原−1陰性であることを要旨とする。
【0012】
請求項7に記載の発明は、請求項4に記載の細胞において、時期特異的胚抗原−1陰性であることを要旨とする。
請求項8に記載の発明は、請求項3に記載の細胞において、時期特異的胚抗原−1陰性であることを要旨とする。
【0013】
請求項9に記載の発明は、多能性動物細胞を生産する方法であって、動物の組織から体細胞を分離する工程と、前記分離細胞を飢餓条件下で培養する工程と、培養細胞中の多能性細胞を同定し、濃縮する工程とから成り、前記多能性細胞は、SCIDマウスに導入された場合に奇形種に発達することを要旨とする。
【0014】
請求項10に記載の発明は、請求項9に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性であることを要旨とする。
請求項11に記載の発明は、請求項9に記載の方法において、前記動物は哺乳動物であることを要旨とする。
【0015】
請求項12に記載の発明は、請求項11に記載の方法において、前記哺乳動物はヒトであることを要旨とする。
請求項13に記載の発明は、請求項12に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性であることを要旨とする。
【0016】
請求項14に記載の発明は、請求項12に記載の方法において、前記組織は臍帯血、骨髄、羊水、脂肪細胞、胎盤または末梢血であることを要旨とする。
請求項15に記載の発明は、請求項14に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性であることを要旨とする。
【0017】
請求項16に記載の発明は、請求項14に記載の方法において、前記組織は臍帯血、骨髄、または羊水であることを要旨とする。
請求項17に記載の発明は、請求項16に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性であることを要旨とする。
【0018】
請求項18に記載の発明は、請求項16に記載の方法において、前記培養工程は、細胞を0.5%〜2%の血清を含む培地に5〜10日間置くか、培地を変更せずに10%〜20%の血清を含む培地に7〜21日間置くことにより行なわれることを要旨とする。
【0019】
請求項19に記載の発明は、請求項18に記載の方法において、前記培養工程は、細胞を0.5%の血清を含む培地に5〜7日間置くか、培地を変更せずに20%の血清を含む培地に2週間置くことにより行われることを要旨とする。
【0020】
請求項20に記載の発明は、請求項19に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性であることを要旨とする。
請求項21に記載の発明は、請求項14に記載の方法において、前記培養工程は、細胞を0.5%〜2%の血清を含む培地に5〜10日間置くか、培地を変更せずに10%〜20%の血清を含む培地に7〜21日間置くことにより行なわれることを要旨とする。
【0021】
請求項22に記載の発明は、請求項21に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性であることを要旨とする。
請求項23に記載の発明は、請求項21に記載の方法において、前記培養工程は、細胞を0.5%の血清を含む培地に5〜7日間置くか、培地を変更せずに20%の血清を含む培地に2週間置くことにより行われることを要旨とする。
【0022】
請求項24に記載の発明は、請求項23に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性であることを要旨とする。
請求項25に記載の発明は、請求項12に記載の方法において、前記培養工程は、細胞を0.5%〜2%の血清を含む培地に5〜10日間置くか、培地を変更せずに10%〜20%の血清を含む培地に7〜21日間置くことにより行なわれることを要旨とする。
【0023】
請求項26に記載の発明は、請求項25に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性であることを要旨とする。
請求項27に記載の発明は、請求項11に記載の方法において、前記組織は臍帯血、骨髄、羊水、脂肪細胞、胎盤または末梢血であることを要旨とする。
【0024】
請求項28に記載の発明は、請求項11に記載の方法において、前記培養工程は、細胞を0.5%〜2%の血清を含む培地に5〜10日間置くか、培地を変更せずに10%〜20%の血清を含む培地に7〜21日間置くことにより行なわれることを要旨とする。
【0025】
請求項29に記載の発明は、請求項9に記載の方法において、前記組織は臍帯血、骨髄、羊水、脂肪細胞、胎盤または末梢血であることを要旨とする。
請求項30に記載の発明は、請求項29に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性であることを要旨とする。
【0026】
請求項31に記載の発明は、請求項29に記載の方法において、前記組織は臍帯血、骨髄、または羊水であることを要旨とする。
請求項32に記載の発明は、請求項31に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性であることを要旨とする。
【0027】
請求項33に記載の発明は、請求項31に記載の方法において、前記培養工程は、細胞を0.5%〜2%の血清を含む培地に5〜10日間置くか、培地を変更せずに10%〜20%の血清を含む培地に7〜21日間置くことにより行なわれることを要旨とする。
【0028】
請求項34に記載の発明は、請求項29に記載の方法において、前記培養工程は、細胞を0.5%〜2%の血清を含む培地に5〜10日間置くか、培地を変更せずに10%〜20%の血清を含む培地に7〜21日間置くことにより行なわれることを要旨とする。
【0029】
請求項35に記載の発明は、請求項9に記載の方法において、前記培養工程は、細胞を0.5%〜2%の血清を含む培地に5〜10日間置くか、培地を変更せずに10%〜20%の血清を含む培地に7〜21日間置くことにより行なわれることを要旨とする。
【0030】
請求項36に記載の発明は、請求項35に記載の方法において、多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性であることを要旨とする。
本発明の多能性体細胞を飢餓条件下で生産できることは予想していなかった。本発明の他の特徴または利点は、以下の詳細な説明と、さらには特許請求の範囲とから明らかとなろう。
【0031】
【発明の実施の形態】
本発明は動物の培養体細胞に関する。この細胞は、インビトロで誘導された場合に胚様体に発達するか、SCIDマウスに導入された場合に奇形腫に発達するため、多能性である。該細胞は、正常細胞の染色体の特徴であるすべての染色体を有しており、顕著な変化を有しない。言いかえれば、該細胞は正常核型を有している。
【0032】
該細胞は未分化のES細胞に特徴的な表現型を有する。1例において、該細胞は、培養物中で自然に平らな球状コロニーを形成する。同様のコロニーが未分化のES細胞の培養物中に見出されている。例えばThomson J.ら、Science、282:1145−1147,1998を参照されたい。該細胞はさらに、例えば時期特異的胚抗原(SSEA)−1を発現しないがSSEA−3、SSEA−4、TRA−l−60、TRA−1−81およびOct−4を発現するというような、未分化のES細胞に特徴的な抗原特性も示す。Octは多能性細胞の発達に重要な転写因子のファミリーである。哺乳類生殖細胞系列細胞や幹細胞で特異的に発現されるOct−4は、細胞の多能性を維持するのに不可欠である(例えば、Nicholsら、Cell、95:379−391,1998を参照)。
【0033】
さらに該細胞は高レベルのテロメラーゼ活性を有し得る。テロメラーゼは、細胞の複製中に染色体の末端にテロメア反復部を付加するリボ核タンパク質であり、そのためテロメアと染色体の長さが維持される。高レベルのテロメラーゼの発現は、生殖細胞系列の細胞、ES細胞および胚組織で見出されるが、体細胞では見出されない。その結果、テロメア(および染色体)は細胞***後ごとに体細胞ではより短くなる。最後に、有限の寿命の後に、体細胞は染色体DNAの損失により老化期に入る。体細胞でのテロメラーゼ発現の回復は細胞の寿命を延ばすため、本発明の細胞での高レベルのテロメラーゼ活性は、本発明の細胞の寿命がES細胞の寿命と等しいことを示唆している。
【0034】
本発明の多能性細胞は、動物の組織から体細胞を分離し、分離した細胞を飢餓条件下で培養し、培養細胞を同定および濃縮することにより、生産することができる。多能性細胞は、例えば以下に実施例2で説明する方法や当該技術分野においてよく知られている類似の方法を用いて、例えば臍帯血、骨髄、羊水、脂肪細胞、胎盤または末梢血細胞から分離された間充織幹細胞より生産することができる。例えばErices A.ら、British J.Haemaxol、109:235−242,2000、Pittenger M.、Science、284:143−147,1999、Safford K.ら、Biochem.Biophy.Research Comm.294:371−379,2002、Erickson G.ら、Biochem.Biophy.Research Comm.290:763−769、2002を参照。間充織幹細胞は、10〜20%ES細胞選別ウシ胎児血清(FBS)およびbFGFを含むα改変MEMで維持することもできるし、上述の飢餓条件下で培養してもよい。間充織幹細胞を飢餓条件下で多能性細胞に変換する際には、細胞融合も核移植も要しない。飢餓プロセス後、多能性体細胞は、その形態(例えば細胞の大きさと形状)、酵素活性(例えばアルカリ性フォスファターゼとテロメラーゼ)および表面マーカー(例えばSSEA−l陰性、SSEA−3陽性およびSSEA−4陽性)によって同定することができる。同定された細胞は、当該技術分野で周知のどのような適切な細胞分離技術を使用して濃縮してもよい。例えば、細胞はコロニーを形成する傾向があるので、顕微鏡下でマイクロピペットを使用して直接コロニーを拾い上げることができる。大量の細胞をより急速に濃縮するためには、蛍光標示式細胞分取(FACS)法を使用することができる。例えば、種々の蛍光標識と結合された抗SSEA−3モノクローナル抗体、抗SSEA−4モノクローナル抗体、および抗SSEA−lモノクローナル抗体を使用して、SSEA−3陽性、SSEA−4陽性、かつSSEA−l陰性である細胞を濃縮することができる。それらの細胞はその多能性についてさらに精査することができる。
【0035】
任意の適切な方法を使用して細胞の多能性を試験することができる。例えば、以下に実施例5で説明するようなインビボ奇形腫形成アッセイを使用する。奇形腫は3つのすべての胚葉層の誘導物を含むため、細胞が奇形腫を形成する能力は、細胞が多能性であることを示す。代わりに、以下に実施例6に説明するようなインビトロ胚様体形成アッセイを使用することもできる。胚様体の形成は、細胞が多能性であることを示す。
【0036】
本発明の細胞は様々な方法で使用することができる。本発明の細胞を変性疾患や遺伝疾患の治療に使用して、ヒト胚操作の倫理上の問題を回避することができる。これを行うために、例えば組織または器官の適切な発達に不可欠な機能的遺伝子を欠いた間充織幹細胞を患者から分離し得る。多能性細胞を生産した後に、該分離細胞に遺伝子の機能的形式をコードする発現核酸ベクターを導入することができる。リン酸カルシウム共沈、DEAEデキストラン媒介形質移入、リポフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、またはウイルスを介した技術を含めた様々な技術により、細胞にベクターを導入することができる。細胞の多能性に影響を及ぼさない方法が好まれる。そのような技術の説明は、例えば米国特許第5,591,625号および米国特許出願第20020127715号に見出すことができる。細胞に機能的遺伝子を導入した後に、当該技術分野で周知の方法を用いて患者に細胞を戻して移植することができる。該細胞は該患者から作られているので、この治療は免疫拒絶を引き起こさない。移植された細胞は適切な条件下で機能的な組織または器官に発達することができる。この発達を促進するために、細胞の発達を誘導する因子を患者を投与してもよい。そのような因子は小分子化合物、ペプチドおよび核酸であり得る。実施例はトランスフォーミング成長因子β、骨形成タンパク質、および神経成長因子を含むが、それらに限定されない。
【0037】
本発明の細胞は、胚の発達/分化のメカニズムを研究するのにも有用である。多能性細胞をモデル系として使用して、多能性細胞の特定の組織または器官への発達を誘導するための条件を同定することができる。さらには、例えばShenM.ら、Development、124:429−42,1997に記述されているようなディファレンシャルcDNAスクリーニングを使用して、胚の発達中に重要な役割を果たす遺伝子を分離することができる。例えば上述の胚様体に発達するように誘導された多能性細胞からcDNAライブラリを作製することができる。ライブラリは2セットのレプリカフィルタ上に蒔かれる。一方のセットのフィルタ(セットA)は非誘導細胞から作製したcDNAでスクリーニングする。他方のセットのフィルタ(セットB)は誘導細胞から作製した同量のcDNAでスクリーニングする。ライブラリのスクリーニングに使用するcDNAには標識して、当該技術分野において周知の方法を用いて視覚化することができる。その後、ライブラリから、セットAでよりもセットBでより強いハイブリダイゼーションシグナルを示すcDNAクローンを選択することができる。それらのcDNAは、誘導細胞で過剰発現している遺伝子をコードする。逆に、非誘導多能性細胞で過剰発現している遺伝子を分離することもできる。同じ理由で、上述の飢餓プロセスの前後に細胞で過剰発現している遺伝子も分離することができる。分離された遺伝子はすべて、それぞれのプロセスにおけるその役割を定義するためにさらに詳しく調べることができる。
【0038】
非ヒト動物から生産された多能性細胞を使用し、例えばCampbell K.ら、Nature、380:64−66、1996に記述されているような方法を使用して、動物の器官またはクローンに発達させることができる。従って、それらの細胞はペット業界や畜産業で価値があり、絶滅の危機に瀕した動物を保存するために使用することができる。
【0039】
本発明の多くの実施態様について説明した。しかしながら、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、様々な改変を行い得ることがと理解される。従って、特許請求の範囲には他の実施態様が包含される。
【0040】
以下の特定の実施例は単なる例であって、本開示の残りの部分を如何様にも限定するものではないと解釈されるべきである。これ以上詳述しなくとも、本明細書の説明に基づいて、当業者は本発明を最大限に利用できるものと考えられる。本明細書に引用したすべての刊行物はその全体を引用により組み込むものとする。
【0041】
(実施例1)
細胞マーカーを検査するために免疫細胞化学染色を行なった。
細胞表面マーカーを染色するために、細胞を4%パラホルムアルデヒドで20℃で10分間固定した。細胞骨格タンパク質を染色するために、細胞をメタノールで−20℃で2分間固定し、0.1%Triton X−100で10分間透過処理した。他の細胞内分子を染色するために、細胞を4%パラホルムアルデヒドで20℃で10分間固定し、0.1%Triton X−100で10分間透過化処理した。
【0042】
固定した細胞を、リン酸緩衝食塩水(PBS)、1%ウシ血清アルブミン(BSA)および1次抗体を作製した種と同じ種からの1%血清(Sigma社、ミズーリ州セントルイス所在)を含むブロック溶液で30分間インキュベートした。その後、細胞を、ブロック溶液で適切に希釈した1次抗体、ビオチン化抗マウス2次抗体、およびストレプトアビジン共役西洋ワサビペルオキシダーゼと共に各々60分間、連続的にインキュベートした。各ステップ間で、細胞を0.3%BSAを含むPBSで10分間洗浄した。ジアミノベンジジンクロマゲン(Vector Laboratories社、カリフォルニア州)と共にインキュベートすることにより、西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を視覚化した。視覚化後、細胞を顕微鏡で調べ、写真を撮影した。
【0043】
(実施例2)
骨髄および臍帯血から間充織細胞を分離した。
Bio Whittaker社(メリーランド州ウォーカーズビル所在)からヒト骨髄を購入した。臍帯血をインフォームドコンセントした被験者から得た。間充織幹細胞を分離するために、例えばErices A.ら、BritishJ.Haematol.、109:235−242,2000またはPittengerM.ら、Science、284:143−147,1999に記述されているようなFicol−paque(d=1.077g/ml、Amersham Biosciences、ニュージャージー州ピスカタウェイ所在)密度勾配法を使用して、ヒト骨髄または臍帯血から単核細胞を調製した。
【0044】
分離した単核細胞を、標準培地、すなわち20%ES細胞選別FBS(Hyclone社、ユタ州ローガン所在)、4ng/ml b−FGF、100U/mlペニシリン、およびl00μg/mlストレプトマイシン(Invitrogen社、カリフォルニア州カールズバッド所在)を含むα改変最小必須培地(MEM)を含む組織培養皿に1×106細胞/cm2の濃度で接種した。2週間の培養後、多くの細胞が培養皿に付着した。これらの形態学的に同種の細胞は32〜36時間の倍加時間で自己複製した。
【0045】
付着細胞を、上述と同じ免疫細胞化学を用いてさらに特徴づけた。CD34またはCD45(造血系統の細胞表面抗原)に対する抗体を、Bacton Dickinson(カリフォルニア州マウンテンビュー所在)より購入した。染色結果によると、細胞はCD34およびCD45陰性であり、細胞が造血系統に属しないことが示唆された。さらに、細胞は、例えばPittenger M.ら、Science、284:143−147,1999に記述されている方法に従って適切な培地を用いて、骨細胞、軟骨細胞および脂肪細胞に分化するように誘導させることができた。分化した骨細胞はvon Kossa染色法を使用して分析した。分化した軟骨細胞はサフラニンOで染色した。脂肪細胞はオイルレッドOで染色した。以上の方法は、例えばColter D.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.98;7841−7845、2001に見出すことができる。その結果は、分離細胞が間充織幹細胞であることを示していた(Prockop D.ら、Nature、276:71−74,1997)が、それらの細胞はSCIDマウスに誘導された時には奇形種に発達せず、また、誘導された時に胚様体に発達しなかったので、それらの細胞の発達可能性は限定されている。実施例5,6を参照されたい。
【0046】
(実施例3)
上述の分離間充織幹細胞を、多能性細胞を生成するために飢餓条件下で培養した。
間充織幹細胞を、実施例2に記述した標準培地で3〜5代、継代培養した。その後、細胞を、b−FGFを欠いた0.5%FBSを含むα改変MEM(飢餓培地)に5〜7日間置いた。別法として、細胞を培地を2週間変えずに標準培地中に維持した。上記の飢餓プロセスの間、顕微鏡下で細胞を毎日モニタした。細胞の融合は見出されなかった。飢餓プロセスの終わりに、丸くて平らなコロニーが培養物中に現われた。コロニーの各々をマイクロピペットを使用して採取し、20%ES選別FBS、4ng/ml bFGFおよび0.1mM 2−メルカプトエタノールを含むIscoveの改変Dulbecco培地中でマウス支持細胞(例えばマイトマイシン処理マウスSTO細胞(ATCC CRL−1503)またはマウス胚繊維芽細胞)上で未分化の状態で維持した。各コロニーからの細胞は未分化の状態で維持することができ、4か月を超えて(または15継代を超えて)増殖し続けることができた。
【0047】
(実施例4)
コロニーからの細胞の形態、細胞マーカー発現、酵素活性、および核型を調べた。
細胞を光学顕微鏡または走査電子顕微鏡の下で検査した。走査電子顕微鏡試験のため、細胞をMelinexフィルム(DuPont社、バージニア州ホープウェル所在)上で培養し、2%四酸化オスミウム(w/v)、0.lM リン酸緩衝液pH7.4で16時間4℃で固定し、一連の勾配エタノールで脱水した。液体二酸化炭素を使用して臨界点乾燥し、クロミウムでスパッタコーティングした後、2kVで稼働させた走査電子顕微鏡(SEM)Leo 982(LEO Elektronenmikroskopie社、ドイツ)の電場放射下で細胞を検査した。例えばBozzola J.ら、1992、Specimen preparation for scanning electron microscopy In:Electron Microscopy:Principles and Techniques for Biologists 40〜62ページ Jones and Bartlett Publishers、Bostonを参照されたい。顕微鏡写真が示すように、細胞の形態は、Thomson J.ら、Science、282:1145−1147、1998に説明されているような、未分化ES細胞の形態に類似していた。
【0048】
細胞をさらに上述の免疫細胞化学染色を用いて特徴づけた。SSEA−1(MC−480、1:50)、SSEA−3(MC−631、1:50)およびSSEA−4(MC−813−70、1:50)に対する抗体を、アイオワ州立大学Developmental Studies Hybridoma Bank(アイオワ州アイオワシティ)から得た。抗TRA−1−60抗体および抗TRA−l−81抗体をSanta Cruz Biotechnology社(カリフォルニア州サンタクルス)から得た。結果は、細胞がSSEA−1陰性で、SSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60およびTRA−l−81陽性であることを示した。さらに転写因子Oct−4の発現を、Reubinoff B.ら、Nature Biotechnol.18:399−404,2000に記述されるような逆転写PCRにより検出した。
【0049】
細胞のアルカリ性フォスファターゼ活性を生産の使用説明書(Sigma社、ミズーリ州セントルイス所在)に従ってSigma 86−Rキットを使用して検出した。細胞は高レベルのアルカリ性フォスファターゼ活性を示した。KimN.ら、Science、266:2011−2015,1994に記述されるようなTRAPeze ELSIAテロメラーゼ検出法を用いて、細胞のテロメラーゼ活性を調べた。その結果、細胞のテロメラーゼ活性が高レベルであることが明らかになった。
【0050】
細胞の核型を、例えばISCN 1995:ヒト細胞遺伝学的命名法のための国際制度(An International System for Human Cytogenetic Nomenclature)、F.Mitelman編、Karger、Basel(1995)に記述された方法を用いて、決定した。要約すると、細胞を回収前の12時間、1:4希釈で継代培養した。細胞をトリプシンEDTAで収集し、1.5時間コルセミドとインキュベートした後、低張性KClで溶解し、酸/アルコールで固定した。例えばFreshney,R、「動物細胞の培養−基本技術の手引き(Culture of animal cells−A manual of basic technique)」第3版」A John Wiley&Sons社 New York(1994)、pp205−209に記述されているような方法を用いて、***中期を分析した。その結果、細胞はヒトの46本の染色体をすべて有していることが明らかとなった。その染色体に、正常なヒトの染色体と比較して顕著な変化はなかった。
【0051】
(実施例5)
実施例3に記述したように調製した細胞の多能性を試験するために、奇形種形成アッセイを行った。
約1×105個の細胞をSCIDマウスの後脚の筋系に移植した。注入6〜8週間後に奇形種が観察された。奇形種を回収し、Thomson J.ら、Science 282:1145−1147,1998に記述されている方法を使用して、組織の検査に供した。調べた腫瘍はすべて、3つの胚葉層すべて、すなわち発達中の胃腸管(内胚葉);軟骨、骨および横紋筋(中胚葉);ならびに角膜レンズ、破砕ケラチンおよび発達中の表皮(外胚葉)に由来した。対照として、実施例2に記述した間充織幹細胞は、SCIDマウス中で奇形種へは発達しなかった。
【0052】
(実施例6)
実施例3で調製した細胞の多能性を試験するために、胚様体形成アッセイを行なった。
細胞は被覆を施していない細菌用ペトリ皿で4〜6日間培養した。細胞は増殖し、懸濁液中で球体(胚様体)を形成した。胚様体を0.1%ゼラチンで被覆されたチャンバースライド上に移して接種した。一週間後、培養物中に、球体の成長物から多数のクラスターが現れた。クラスターの各々は12時間を越える時間の間、1サイクル当たり5〜7秒で規則的な収縮と弛緩を示した。この機械的活動は、Yamada T.ら、Stem Cells 20:41−49,2002に記述されるようなES細胞から発達した腸様の器官(原腸)の機械的活動に類似していた。これとは対照的に、同じ条件下で誘導しても、間充織幹細胞は胚様体へ発達することができなかった。
【0053】
(他の実施態様)
本明細書に開示した特徴のすべてをいかなる組合せで組み合わせてもよい。本明細書で開示した各特徴は、同じか、等価か、または同様な目的を果たす代替特徴と置き換えてもよい。したがって、別段明記しない限り、開示した各特徴は、一連の包括的な等価または同様な特徴の一例にすぎない。
【0054】
上記の説明から、当業者は容易に本発明の本質的特徴を確認することができ、本発明の範囲の精神および範囲から逸脱せずに、本発明を様々な使用方法や様々な条件に適合させる本発明の種々の変更および改変を行うことができる。したがって、他の実施態様も特許請求の範囲に包含される。
【0055】
【発明の効果】
本発明によれば、多能性細胞を変性疾患および遺伝疾患の治療や胚の発達/分化のメカニズムの研究に使用でき、かつヒト胚操作の倫理上の問題を回避することができる。
Claims (36)
- 正常核型を有し、インビトロで誘導された場合に胚様体に発達する、動物の培養体細胞。
- 正常核型を有し、SCIDマウスに導入された場合に奇形腫に発達する、動物の培養体細胞。
- インビトロで誘導された場合に胚様体に発達する、請求項2に記載の細胞。
- 哺乳動物細胞である、請求項3に記載の細胞。
- ヒト細胞である、請求項4に記載の細胞。
- 時期特異的胚抗原−1陰性である、請求項5に記載の細胞。
- 時期特異的胚抗原−1陰性である、請求項4に記載の細胞。
- 時期特異的胚抗原−1陰性である、請求項3に記載の細胞。
- 多能性動物細胞を生産する方法であって、
動物の組織から体細胞を分離する工程と、
前記分離細胞を飢餓条件下で培養する工程と、
培養細胞中の多能性細胞を同定し、濃縮する工程とから成り、
前記多能性細胞は、SCIDマウスに導入された場合に奇形種に発達する、方法。 - 多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性である、請求項9に記載の方法。
- 前記動物は哺乳動物である、請求項9に記載の方法。
- 前記哺乳動物はヒトである、請求項11に記載の方法。
- 多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性である、請求項12に記載の方法。
- 前記組織は臍帯血、骨髄、羊水、脂肪細胞、胎盤または末梢血である、請求項12に記載の方法。
- 多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性である、請求項14に記載の方法。
- 前記組織は臍帯血、骨髄、または羊水である、請求項14に記載の方法。
- 多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性である、請求項16に記載の方法。
- 前記培養工程は、細胞を0.5%〜2%の血清を含む培地に5〜10日間置くか、培地を変更せずに10%〜20%の血清を含む培地に7〜21日間置くことにより行なわれる、請求項16に記載の方法。
- 前記培養工程は、細胞を0.5%の血清を含む培地に5〜7日間置くか、培地を変更せずに20%の血清を含む培地に2週間置くことにより行われる、請求項18に記載の方法。
- 多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性である、請求項19に記載の方法。
- 前記培養工程は、細胞を0.5%〜2%の血清を含む培地に5〜10日間置くか、培地を変更せずに10%〜20%の血清を含む培地に7〜21日間置くことにより行なわれる、請求項14に記載の方法。
- 多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性である、請求項21に記載の方法。
- 前記培養工程は、細胞を0.5%の血清を含む培地に5〜7日間置くか、培地を変更せずに20%の血清を含む培地に2週間置くことにより行われる、請求項21に記載の方法。
- 多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性である、請求項23に記載の方法。
- 前記培養工程は、細胞を0.5%〜2%の血清を含む培地に5〜10日間置くか、培地を変更せずに10%〜20%の血清を含む培地に7〜21日間置くことにより行なわれる、請求項12に記載の方法。
- 多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性である、請求項25に記載の方法。
- 前記組織は臍帯血、骨髄、羊水、脂肪細胞、胎盤または末梢血である、請求項11に記載の方法。
- 前記培養工程は、細胞を0.5%〜2%の血清を含む培地に5〜10日間置くか、培地を変更せずに10%〜20%の血清を含む培地に7〜21日間置くことにより行なわれる、請求項11に記載の方法。
- 前記組織は臍帯血、骨髄、羊水、脂肪細胞、胎盤または末梢血である、請求項9に記載の方法。
- 多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性である、請求項29に記載の方法。
- 前記組織は臍帯血、骨髄、または羊水である、請求項29に記載の方法。
- 多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性である、請求項31に記載の方法。
- 前記培養工程は、細胞を0.5%〜2%の血清を含む培地に5〜10日間置くか、培地を変更せずに10%〜20%の血清を含む培地に7〜21日間置くことにより行なわれる、請求項31に記載の方法。
- 前記培養工程は、細胞を0.5%〜2%の血清を含む培地に5〜10日間置くか、培地を変更せずに10%〜20%の血清を含む培地に7〜21日間置くことにより行なわれる、請求項29に記載の方法。
- 前記培養工程は、細胞を0.5%〜2%の血清を含む培地に5〜10日間置くか、培地を変更せずに10%〜20%の血清を含む培地に7〜21日間置くことにより行なわれる、請求項9に記載の方法。
- 多能性細胞は時期特異的胚抗原−1陰性である、請求項35に記載の方法。
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