JP2003533223A - α２δ２カルシウムチャネルサブユニットの発現細胞株 - Google Patents
α２δ２カルシウムチャネルサブユニットの発現細胞株Info
- Publication number
- JP2003533223A JP2003533223A JP2001585309A JP2001585309A JP2003533223A JP 2003533223 A JP2003533223 A JP 2003533223A JP 2001585309 A JP2001585309 A JP 2001585309A JP 2001585309 A JP2001585309 A JP 2001585309A JP 2003533223 A JP2003533223 A JP 2003533223A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gabapentin
- subunit
- compound
- calcium channel
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
- A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
- A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
- G01N33/9406—Neurotransmitters
- G01N33/9426—GABA, i.e. gamma-amino-butyrate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
- C12N2503/02—Drug screening
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
Abstract
(57)【要約】
カルシウムチャネルのα２δ２サブユニットと結合する化合物の結合能力を決定する方法が開示される。本方法は、カルシウムチャネルのα２δ２サブユニットを提供し、前記サブユニットを前記化合物と接触させ、さらに前記サブユニットと結合する前記化合物の結合能力を決定することを含む。
Description
【０００１】
本発明は、電圧依存カルシウムチャネルのα２δ２サブユニットを発現する細
胞株に関する。本発明では、前記細胞株はまた別のカルシウムチャネルサブユニ
ットを発現することができ、さらに前記細胞とガバペンチン、ガバペンチン類似
体、プレガバリンまたはプレガバリン類似体との結合を決定（determine）でき
る。
胞株に関する。本発明では、前記細胞株はまた別のカルシウムチャネルサブユニ
ットを発現することができ、さらに前記細胞とガバペンチン、ガバペンチン類似
体、プレガバリンまたはプレガバリン類似体との結合を決定（determine）でき
る。
【０００２】
電圧依存性カルシウムチャネルは、生理学的プロセス、例えば神経伝達物質の
放出、ホルモンの分泌、筋収縮、および遺伝子転写と関連付けられてきた。機能
的チャネルは少なくとも３つのサブユニット（α１、α２δおよびβサブユニッ
トを含む）を必要とする。前記チャネルはまたγサブユニットを含むことができ
る。電圧依存カルシウムチャネルには、電気生理学的性質および薬理学的特性を
基準に定義されたいくつかの公知のタイプが存在する。前記タイプは、Ｌ−、Ｎ
−、Ｐ／Ｑ−、Ｒ−およびＴ−タイプである。各々のタイプは、主としてそのチ
ャネル組成によって定義される。α１サブユニットタイプは、チャネルがＬ−、
Ｎ−、Ｐ／Ｑ−、Ｒ−またはＴ−タイプのいずれであろうと、そのチャネル決定
基に含まれている。α１サブユニットの活性は、α２δおよびβサブユニットに
よって調節される。チャネル活性はさらに第四のサブユニットγによって調節さ
れることがある。
放出、ホルモンの分泌、筋収縮、および遺伝子転写と関連付けられてきた。機能
的チャネルは少なくとも３つのサブユニット（α１、α２δおよびβサブユニッ
トを含む）を必要とする。前記チャネルはまたγサブユニットを含むことができ
る。電圧依存カルシウムチャネルには、電気生理学的性質および薬理学的特性を
基準に定義されたいくつかの公知のタイプが存在する。前記タイプは、Ｌ−、Ｎ
−、Ｐ／Ｑ−、Ｒ−およびＴ−タイプである。各々のタイプは、主としてそのチ
ャネル組成によって定義される。α１サブユニットタイプは、チャネルがＬ−、
Ｎ−、Ｐ／Ｑ−、Ｒ−またはＴ−タイプのいずれであろうと、そのチャネル決定
基に含まれている。α１サブユニットの活性は、α２δおよびβサブユニットに
よって調節される。チャネル活性はさらに第四のサブユニットγによって調節さ
れることがある。
【０００３】
分子生物学的技術によって、電圧依存カルシウムチャネルの作用メカニズムの
解明が可能になった。前記サブユニットの各々の遺伝子が単離されクローニング
された。これまでのところ、異なるα１サブユニットをコードする９つの遺伝子
が知られている。α１サブユニットはカルシウムイオンが通過するポアを形成す
る。α１サブユニットは電圧センサーを含み、これはまたチャネルタイプと密接
な関係を有するある種の薬剤または毒素との特異的結合の原因となるものである
。α１ポアを通過するチャネル電流は、β、γまたはα２δサブユニットの会合
によって調節される。弁別的にスプライスされる４つの細胞内βサブユニット遺
伝子が存在する。トランスメンブレンγサブユニットについては２つの遺伝子が
知られており、１つは骨格筋に、新規な遺伝子は脳で発現される。α２δは、最
初ただ１つのアイソフォームが特定されただけであった。しかしながら、最近、
２つの新規なα２δ遺伝子、α２δ２およびα２δ３が特定された。これら遺伝
子は、最初のα２δ１遺伝子に対して５５．６％および３０．３％の相同性を有
する（Klugbauer et al., J. Neuroscience 19(2):684-691(1999)）。α２およ
びδタンパク質は同じ遺伝子よって発現される。このタンパク生成物は翻訳後に
切断され、最終的なα２およびδタンパク質はジスルフィド結合によって連結さ
れる。トランスメンブレンδタンパク質はα２タンパク質を細胞膜に固定する。
解明が可能になった。前記サブユニットの各々の遺伝子が単離されクローニング
された。これまでのところ、異なるα１サブユニットをコードする９つの遺伝子
が知られている。α１サブユニットはカルシウムイオンが通過するポアを形成す
る。α１サブユニットは電圧センサーを含み、これはまたチャネルタイプと密接
な関係を有するある種の薬剤または毒素との特異的結合の原因となるものである
。α１ポアを通過するチャネル電流は、β、γまたはα２δサブユニットの会合
によって調節される。弁別的にスプライスされる４つの細胞内βサブユニット遺
伝子が存在する。トランスメンブレンγサブユニットについては２つの遺伝子が
知られており、１つは骨格筋に、新規な遺伝子は脳で発現される。α２δは、最
初ただ１つのアイソフォームが特定されただけであった。しかしながら、最近、
２つの新規なα２δ遺伝子、α２δ２およびα２δ３が特定された。これら遺伝
子は、最初のα２δ１遺伝子に対して５５．６％および３０．３％の相同性を有
する（Klugbauer et al., J. Neuroscience 19(2):684-691(1999)）。α２およ
びδタンパク質は同じ遺伝子よって発現される。このタンパク生成物は翻訳後に
切断され、最終的なα２およびδタンパク質はジスルフィド結合によって連結さ
れる。トランスメンブレンδタンパク質はα２タンパク質を細胞膜に固定する。
【０００４】
研究では、α２δ１サブユニットは、鎮痙薬、ガバペンチン［１−（アミノメ
チル）シクロヘキサン酢酸］に対する結合部位を含んでいることが示されている
（Gee et al., J. Biol. Chem. 271(10):5786-5776(1996)）。ガバペンチンは、
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）類似体である。ガバペンチンは、癲癇治療および発
作頻度の減少で動物モデルおよびヒトの患者の両方において有効である。ガバペ
ンチンの正確な作用メカニズムは不明のままである。最近の実験で、ガバペンチ
ンはまたα２δ２サブユニットにも結合することが示された。
チル）シクロヘキサン酢酸］に対する結合部位を含んでいることが示されている
（Gee et al., J. Biol. Chem. 271(10):5786-5776(1996)）。ガバペンチンは、
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）類似体である。ガバペンチンは、癲癇治療および発
作頻度の減少で動物モデルおよびヒトの患者の両方において有効である。ガバペ
ンチンの正確な作用メカニズムは不明のままである。最近の実験で、ガバペンチ
ンはまたα２δ２サブユニットにも結合することが示された。
【０００５】
機能的チャネルは、細胞内でカルシウムチャネルサブユニットを発現させるこ
とによって形成させることができる。この技術は、チャネルの作用に対する種々
の分子の影響を決定するために役立つ。米国特許5,712,158号および米国特許5,7
70,447号には、ガバペンチンのカルシウムチャネルサブユニットとの結合特性を
解明するために有用な安定な細胞株が記載されている。前記細胞株はβサブユニ
ットおよび最初のα２δ（今はα２δ１と称される）を高レベルで発現する。細
胞に任意のα１サブユニットをトランスフェクトすることによって、機能的なカ
ルシウムチャネルの形成がもたらされ、このカルシウムチャネルは、ガバペンチ
ンおよびガバペンチン関連化合物の結合の評価に用いることとができる。
とによって形成させることができる。この技術は、チャネルの作用に対する種々
の分子の影響を決定するために役立つ。米国特許5,712,158号および米国特許5,7
70,447号には、ガバペンチンのカルシウムチャネルサブユニットとの結合特性を
解明するために有用な安定な細胞株が記載されている。前記細胞株はβサブユニ
ットおよび最初のα２δ（今はα２δ１と称される）を高レベルで発現する。細
胞に任意のα１サブユニットをトランスフェクトすることによって、機能的なカ
ルシウムチャネルの形成がもたらされ、このカルシウムチャネルは、ガバペンチ
ンおよびガバペンチン関連化合物の結合の評価に用いることとができる。
【０００６】
本発明の目的は、カルシウムチャネルα２δ２サブユニットを安定に発現する
新規な細胞株を提供することである。本発明のさらに別の目的は、ガバペンチン
、ガバペンチン類似体、プレガバリン、プレガバリン類似体、およびＧＡＢＡの
３−アルキル誘導体とα２δ２サブタイプとの特異的結合を説明することである
。
新規な細胞株を提供することである。本発明のさらに別の目的は、ガバペンチン
、ガバペンチン類似体、プレガバリン、プレガバリン類似体、およびＧＡＢＡの
３−アルキル誘導体とα２δ２サブタイプとの特異的結合を説明することである
。
【０００７】
本発明は、カルシウムチャネルのα２δ２サブユニットへの化合物の結合能力
を決定する方法を提供するもので、カルシウムチャネルのα２δ２サブユニット
を用意し、前記α２δ２サブユニットを前記化合物と接触させ、そして前記化合
物の前記α２δ２サブユニットとの結合能力を決定することを含む。
を決定する方法を提供するもので、カルシウムチャネルのα２δ２サブユニット
を用意し、前記α２δ２サブユニットを前記化合物と接触させ、そして前記化合
物の前記α２δ２サブユニットとの結合能力を決定することを含む。
【０００８】図面の説明
図１は、ヒトα２δ２のｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターでの分子クローニング
の模式図である。 図２は、ヒトα２δの組織分布のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ヒトの種々の組織
に由来する１ｎｇの二本鎖ｃＤＮＡ（CLONTECH）をＰＣＲ（９４℃で１分、５５
℃で１分および７２℃で２分を３５サイクル）で増幅した。作製したＰＣＲ生成
物は、９５８から２１６５（ｈα２δ１）、２５３４から３６４３（ｈα２δ２
）および１９２０から３２７２ヌクレオチド（ｈα２δ３）のＤＮＡフラグメン
トである。
の模式図である。 図２は、ヒトα２δの組織分布のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ヒトの種々の組織
に由来する１ｎｇの二本鎖ｃＤＮＡ（CLONTECH）をＰＣＲ（９４℃で１分、５５
℃で１分および７２℃で２分を３５サイクル）で増幅した。作製したＰＣＲ生成
物は、９５８から２１６５（ｈα２δ１）、２５３４から３６４３（ｈα２δ２
）および１９２０から３２７２ヌクレオチド（ｈα２δ３）のＤＮＡフラグメン
トである。
【０００９】
図３は、ヒトα２δの組織分布のノザンブロット分析を示す。ノザンブロット
は材料と方法の項で述べたように実施した。ヒトマルチ組織ブロット（CLONTECH
）を、９５８から２１６５（ｈα２δ１）、２５３４から３６４３（ｈα２δ２
）および１９２０から３２７２ヌクレオチド（ｈα２δ３）から合成したジゴキ
シゲニン標識ｃＤＮＡでハイブリダイズさせた。マーカーＲＮＡの位置は左に表
示されている。
は材料と方法の項で述べたように実施した。ヒトマルチ組織ブロット（CLONTECH
）を、９５８から２１６５（ｈα２δ１）、２５３４から３６４３（ｈα２δ２
）および１９２０から３２７２ヌクレオチド（ｈα２δ３）から合成したジゴキ
シゲニン標識ｃＤＮＡでハイブリダイズさせた。マーカーＲＮＡの位置は左に表
示されている。
【００１０】
図４は、ヒトおよびマウスα２δの組織分布のウェスタンブロット分析を示す
。種々のヒト組織（Ａ，０．５μｇ）およびマウス組織（Ｂ，１００μｇ）の膜
タンパク質を４％から２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NOVEX）にロードし、ウェス
タンブロット分析に付した（材料と方法の項を参照されたい）。抗α２δモノク
ローナル抗体またはα２δ２およびα２δ３に対するポリクローナル抗体をプロ
ーブとして用いてブロットを分析した。
。種々のヒト組織（Ａ，０．５μｇ）およびマウス組織（Ｂ，１００μｇ）の膜
タンパク質を４％から２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NOVEX）にロードし、ウェス
タンブロット分析に付した（材料と方法の項を参照されたい）。抗α２δモノク
ローナル抗体またはα２δ２およびα２δ３に対するポリクローナル抗体をプロ
ーブとして用いてブロットを分析した。
【００１１】
図５は、α２δｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の膜と［3Ｈ
］ガバペンチンとの結合を示す。ｐｃＤＮＡ３．１（コントロール）、ｐｃＤＮ
Ａ３．１／ブタα２δ１構築物（ｐα２δ１）、およびｐｃＤＮＡ３．１／ヒト
α２δ２構築物（ｈα２δ２）の２０μｇをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクト
した。膜は、［3Ｈ］ガバペンチン結合アッセイ（材料と方法の項を参照された
い）用に調製した。データは、別個の３アッセイ（各測定についてそれぞれ３組
ずつ）の平均である。材料と方法の項で述べたように、同じ膜（１００μｇ）を
対応する抗体によるウェスタンブロット分析に付した。
］ガバペンチンとの結合を示す。ｐｃＤＮＡ３．１（コントロール）、ｐｃＤＮ
Ａ３．１／ブタα２δ１構築物（ｐα２δ１）、およびｐｃＤＮＡ３．１／ヒト
α２δ２構築物（ｈα２δ２）の２０μｇをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクト
した。膜は、［3Ｈ］ガバペンチン結合アッセイ（材料と方法の項を参照された
い）用に調製した。データは、別個の３アッセイ（各測定についてそれぞれ３組
ずつ）の平均である。材料と方法の項で述べたように、同じ膜（１００μｇ）を
対応する抗体によるウェスタンブロット分析に付した。
【００１２】
図６は、α２およびδサブユニット間のジスルフィド結合の破壊を示す。各サ
ンプル（ｐα２δ１は０．５μｇおよびｈα２δ２は５μｇ）の膜タンパク質の
等量を１００ｍＭのＤＴＴの存在下または非存在下で１０分間インキュベートし
、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させ、ＰＶＤＦメンブレンに移した。ブロット
は、抗α２δ１抗体（左）または抗α２δ２抗体（右）のいずれかをプローブと
して分析した。マーカータンパク質の位置は右に表示されている。
ンプル（ｐα２δ１は０．５μｇおよびｈα２δ２は５μｇ）の膜タンパク質の
等量を１００ｍＭのＤＴＴの存在下または非存在下で１０分間インキュベートし
、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させ、ＰＶＤＦメンブレンに移した。ブロット
は、抗α２δ１抗体（左）または抗α２δ２抗体（右）のいずれかをプローブと
して分析した。マーカータンパク質の位置は右に表示されている。
【００１３】
図７は、ブタα２δ１（Ａ）およびヒトα２δ２（Ｂ）を過剰産生しているＨ
ＥＫ２９３細胞の膜と［3Ｈ］ガバペンチン（ＧＢＰ）との結合のスキャチャー
ド分析を示す。細胞膜は、ＧＫＳ０２（ブタα２δ１のための安定な細胞株）お
よびＧＫＳ０７（ヒトα２δ２のための安定な細胞株）から調製した。特異的な
［3Ｈ］ガバペンチン結合は材料と方法の項で述べたように実施した。結合活性
は、タンパク質１ｍｇ当たりの結合ガバペンチンのピコモルとして表した。各結
合反応は、２０μｇのＧＫＳ０２膜タンパク質または１０μｇのＧＫＳ０７膜タ
ンパク質を含んでいた。データは３アッセイの平均である。
ＥＫ２９３細胞の膜と［3Ｈ］ガバペンチン（ＧＢＰ）との結合のスキャチャー
ド分析を示す。細胞膜は、ＧＫＳ０２（ブタα２δ１のための安定な細胞株）お
よびＧＫＳ０７（ヒトα２δ２のための安定な細胞株）から調製した。特異的な
［3Ｈ］ガバペンチン結合は材料と方法の項で述べたように実施した。結合活性
は、タンパク質１ｍｇ当たりの結合ガバペンチンのピコモルとして表した。各結
合反応は、２０μｇのＧＫＳ０２膜タンパク質または１０μｇのＧＫＳ０７膜タ
ンパク質を含んでいた。データは３アッセイの平均である。
【００１４】
図８は、［3Ｈ］ガバペンチン（ＧＢＰ）結合活性による細胞株のスクリーニ
ングを示す。ＨＥＫ２９３細胞にヒトα２δ２をトランスフェクトした。単一ク
ローンをＧ４１８耐性によって選別した。“２９２３”は親細胞ＨＥＫ２９３で
あり、“２Ｌ”は、ブタα２δ１を安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞であ
る。
ングを示す。ＨＥＫ２９３細胞にヒトα２δ２をトランスフェクトした。単一ク
ローンをＧ４１８耐性によって選別した。“２９２３”は親細胞ＨＥＫ２９３で
あり、“２Ｌ”は、ブタα２δ１を安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞であ
る。
【００１５】
本明細書で用いられるように、ガバペンチン類似体には、アルキル置換ガバペ
ンチン類似体、橋かけガバペンチン類似体および複素環式ガバペンチン類似体（
例えばBryans et al.（J. Med. Chem. 41:1838-1845(1998)が記載したようなも
の）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。 類似体とは、“同様な電子
構造をもつが異なる原子を有する化合物”と定義される（Grant et al., Chemic
al Dictionary, 5th ed., McGraw-Hill, 1987）。ガバペンチンは以下の構造を
有する：
ンチン類似体、橋かけガバペンチン類似体および複素環式ガバペンチン類似体（
例えばBryans et al.（J. Med. Chem. 41:1838-1845(1998)が記載したようなも
の）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。 類似体とは、“同様な電子
構造をもつが異なる原子を有する化合物”と定義される（Grant et al., Chemic
al Dictionary, 5th ed., McGraw-Hill, 1987）。ガバペンチンは以下の構造を
有する：
【化１】
【００１６】
ガバペンチン類似体の例は上掲書（Bryans wet al.）に記載されてあり、以下
が含まれる（ただしこれらに限定されない）： 下記の構造を有する分子：
が含まれる（ただしこれらに限定されない）： 下記の構造を有する分子：
【化２】
【００１７】
この類似体は、シクロヘキサン環の３位でアルキル化される。類似体は、１か
ら４つの炭素原子を有するアルキル基で炭素環の任意の位置でアルキル化されて
あってもよい。類似体はまた、下記の構造を有する分子であってもよい：
ら４つの炭素原子を有するアルキル基で炭素環の任意の位置でアルキル化されて
あってもよい。類似体はまた、下記の構造を有する分子であってもよい：
【化３】
【００１８】
この類似体はガバペンチン環の３位でアルキル置換される。
このタイプの分子には、プレガバリン
【化４】
その類似体、およびＧＡＢＡの３−アルキル誘導体が含まれる。
【００１９】材料と方法
ブタα２δ１（ｐα２δ１）ｃＤＮＡは、J. Brown（J.P. Brown, V.U.K. Di
ssanayke, A.R. Briggs, M.R. Milic, N. Gee, Anal. Biochem., 255:236-243(1
998)）から入手したものである。マウスα２δ３（ｍα２δ３）ｃＤＮＡは、F.
Hoffman（N. Klugbauer, L. Lacinova, E. Marais, M. Hobom, F. Hofmann, J.
Neurosci. 19:684-691(1999)）から分与された。α２δ１に対するモノクロー
ナル抗体は Afinity Bioreagents, Inc. から購入した。α２δ２およびα２δ
３に対するポリクローナル抗体は、Sanra Duffy（Pfizer）から入手したもので
ある。ヒトおよびマウスのマルチ組織ブロットおよびｃＤＮＡは CLONTECH から
購入した。マウスの組織は Pel-Freez Biologicals から購入した。ＰＣＲ試薬
はInvitrogenから入手した。ＥＣＬウェスタンブロットキットはAmershamから入
手した。リポフェクタミン、増殖培養液、制限酵素は、Life Technologiesから
入手した。ＨＥＫ２９３およびＣＯＳ−７細胞株はＡＴＣＣより入手した。他の
全ての化学薬品はSigmaから得た。
ssanayke, A.R. Briggs, M.R. Milic, N. Gee, Anal. Biochem., 255:236-243(1
998)）から入手したものである。マウスα２δ３（ｍα２δ３）ｃＤＮＡは、F.
Hoffman（N. Klugbauer, L. Lacinova, E. Marais, M. Hobom, F. Hofmann, J.
Neurosci. 19:684-691(1999)）から分与された。α２δ１に対するモノクロー
ナル抗体は Afinity Bioreagents, Inc. から購入した。α２δ２およびα２δ
３に対するポリクローナル抗体は、Sanra Duffy（Pfizer）から入手したもので
ある。ヒトおよびマウスのマルチ組織ブロットおよびｃＤＮＡは CLONTECH から
購入した。マウスの組織は Pel-Freez Biologicals から購入した。ＰＣＲ試薬
はInvitrogenから入手した。ＥＣＬウェスタンブロットキットはAmershamから入
手した。リポフェクタミン、増殖培養液、制限酵素は、Life Technologiesから
入手した。ＨＥＫ２９３およびＣＯＳ−７細胞株はＡＴＣＣより入手した。他の
全ての化学薬品はSigmaから得た。
【００２０】
ヒトα２δ２サブユニットのクローニング：ヒトα２δ２（ｈα２δ２）ｃＤ
ＮＡは、ヒトの脳のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって増幅させた。寄託
されたGenBankのｈα２δ２サブユニットのＤＮＡ配列（受託番号 AF042792）を
基に、４つのオーバーラップＤＮＡフラグメント（これはｈα２δ２ｃＤＮＡの
完全な開放読み枠のヌクレオチド１４−９９４（フラグメントＨ）、８４５−１
８１６（フラグメントＦ）、１５１７−２７９１（フラグメントＤ）、および２
６８１−３７９０(フラグメントＣ)をカバーする）をＰＣＲによって作製し、続
いて、ＴＡクローニングキットを用いて発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１でクロー
ニングした。プライマー対の配列は以下を用いた：
ＮＡは、ヒトの脳のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって増幅させた。寄託
されたGenBankのｈα２δ２サブユニットのＤＮＡ配列（受託番号 AF042792）を
基に、４つのオーバーラップＤＮＡフラグメント（これはｈα２δ２ｃＤＮＡの
完全な開放読み枠のヌクレオチド１４−９９４（フラグメントＨ）、８４５−１
８１６（フラグメントＦ）、１５１７−２７９１（フラグメントＤ）、および２
６８１−３７９０(フラグメントＣ)をカバーする）をＰＣＲによって作製し、続
いて、ＴＡクローニングキットを用いて発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１でクロー
ニングした。プライマー対の配列は以下を用いた：
【００２１】
５′−ＴＣＴＴＧＡＡＴＧＧＡＡＡＣＡＴＧＧＣＧＧＴＧＣ−３′（配列識別
番号１）および５′−ＴＡＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＣＴＴＣＧＧＡＣＡＴ−３
′(配列識別番号２)（フラグメントＨ）； ５′−ＡＴＧＴＧＴＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＣＧＣＡＧＡＣ−３′(配列識別
番号３)および５′−ＡＧＣＣＧＴＴＣＡＧＧＴＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＣＡ−３
′(配列識別番号４)（フラグメントＦ）； ５′−ＣＣＡＴＣＣＧＣＡＴＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＴ−３′（配列識別
番号５）および５′−ＧＴＡＡＧＴＣＣＴＣＡＴＴＧＴＴＡＡＣＣＴＣＧＣ−３
′(配列識別番号６)（フラグメントＤ）； ５′−ＣＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＡＧＣＣＡ−３′（配列識別
番号７）および５′−ＧＡＴＧＴＧＡＴＴＴＧＧＧＴＧＣＣＡＡＡＣＡＣＣ−３
′(配列識別番号８)(フラグメントＣ)。前記４つのフラグメントは、内部の固有
の制限酵素部位、ｎｔ７９１（PflMI）、１３９５（ＸbaＩ）、および２６２８
（ＨpaＩ）で切断し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Invitrogen, Carlsbod, CA）
中のＨind III／ＸhoＩ部位で組み立てた（図１参照）。
番号１）および５′−ＴＡＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＣＴＴＣＧＧＡＣＡＴ−３
′(配列識別番号２)（フラグメントＨ）； ５′−ＡＴＧＴＧＴＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＣＧＣＡＧＡＣ−３′(配列識別
番号３)および５′−ＡＧＣＣＧＴＴＣＡＧＧＴＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＣＡ−３
′(配列識別番号４)（フラグメントＦ）； ５′−ＣＣＡＴＣＣＧＣＡＴＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＴ−３′（配列識別
番号５）および５′−ＧＴＡＡＧＴＣＣＴＣＡＴＴＧＴＴＡＡＣＣＴＣＧＣ−３
′(配列識別番号６)（フラグメントＤ）； ５′−ＣＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＡＧＣＣＡ−３′（配列識別
番号７）および５′−ＧＡＴＧＴＧＡＴＴＴＧＧＧＴＧＣＣＡＡＡＣＡＣＣ−３
′(配列識別番号８)(フラグメントＣ)。前記４つのフラグメントは、内部の固有
の制限酵素部位、ｎｔ７９１（PflMI）、１３９５（ＸbaＩ）、および２６２８
（ＨpaＩ）で切断し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Invitrogen, Carlsbod, CA）
中のＨind III／ＸhoＩ部位で組み立てた（図１参照）。
【００２２】
ＲＴ−ＰＣＲ：種々の組織に由来する二本鎖ｃＤＮＡ調製物（CLONTECH）を用
いて、９４℃１分、５５℃１分、さらに７２℃２分の３５サイクルでＰＣＲ反応
を実施した。前記反応は、１ｎｇのｃＤＮＡ、１０ｐＭのプライマー、１ｍＭの
ｄＮＴＰおよび１×ＰＣＲ緩衝液を含む溶液（５０μＬ容積）中で実施した。前
記反応混合物の１０μＬを１％アガロースゲルに装荷した。ヒトα２δ１、α２
δ２およびα２δ３のためのプライマー対はそれぞれ以下のとおりであった：
いて、９４℃１分、５５℃１分、さらに７２℃２分の３５サイクルでＰＣＲ反応
を実施した。前記反応は、１ｎｇのｃＤＮＡ、１０ｐＭのプライマー、１ｍＭの
ｄＮＴＰおよび１×ＰＣＲ緩衝液を含む溶液（５０μＬ容積）中で実施した。前
記反応混合物の１０μＬを１％アガロースゲルに装荷した。ヒトα２δ１、α２
δ２およびα２δ３のためのプライマー対はそれぞれ以下のとおりであった：
【００２３】
５′−ＧＡＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＡＡＴＡＴＣＡＣＡＧＣＣ−３′(配列識別
番号９)および５′−ＡＣＡＡＡＴＣＧＴＧＣＴＴＴＣＡＣＴＣＣＣＴＴＧ−３
′（ｎｔ９５８から２１６５；受託番号 M76559）（配列識別番号１０）； ５′−ＣＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＡＧＣＣＡ−３′(配列識別
番号１１)および５′−ＧＡＴＧＴＧＡＴＴＴＧＧＧＴＧＣＣＡＡＡＣＡＣＣ−
３′（ｎｔ２５３４から３６４３；受託番号 AF042792）(配列識別番号１２)；
並びに ５′−ＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＧＧＴＣ−３′(配列識別
番号１３)および、５′−ＣＡＴＣＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＧ
−３′（ｎｔ１９２０から３２７２；受託番号 AJ272213）（配列識別番号１４
）。 ヒトα２δ１、α２δ２およびα２δ３の予想されるＰＣＲ生成物の長さは、１
２０８、１１１０および１３５２ｂｐであった。これらのプライマーは、対応す
るＰＣＲ生成物のシークェンシング分析によって決定したとおり、α２δの各サ
ブタイプに特異的であった。
番号９)および５′−ＡＣＡＡＡＴＣＧＴＧＣＴＴＴＣＡＣＴＣＣＣＴＴＧ−３
′（ｎｔ９５８から２１６５；受託番号 M76559）（配列識別番号１０）； ５′−ＣＴＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＧＣＴＡＧＣＣＡ−３′(配列識別
番号１１)および５′−ＧＡＴＧＴＧＡＴＴＴＧＧＧＴＧＣＣＡＡＡＣＡＣＣ−
３′（ｎｔ２５３４から３６４３；受託番号 AF042792）(配列識別番号１２)；
並びに ５′−ＣＧＴＧＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＧＧＴＣ−３′(配列識別
番号１３)および、５′−ＣＡＴＣＴＣＡＧＴＣＡＧＴＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＧ
−３′（ｎｔ１９２０から３２７２；受託番号 AJ272213）（配列識別番号１４
）。 ヒトα２δ１、α２δ２およびα２δ３の予想されるＰＣＲ生成物の長さは、１
２０８、１１１０および１３５２ｂｐであった。これらのプライマーは、対応す
るＰＣＲ生成物のシークェンシング分析によって決定したとおり、α２δの各サ
ブタイプに特異的であった。
【００２４】
ノザンブロット分析：マルチ組織ノザンブロット（CLONTECH）を製造元の推奨
にしたがってハイブリダイズさせ洗浄した。α２δのサブタイプに特異的なジゴ
キシゲニン標識プローブをＰＣＲで作製し、１０ｍＬのイージーハイブ（EasyHy
b, Boehringer Mannheim）で５０℃で一晩ハイブリダイズさせた。ＲＴ−ＰＣＲ
用に使用するプライマー対と同じプライマー対を用いてプローブを作製した。ブ
ロットを２回（最初は２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで室温で５分、続いて０
．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで６８℃で１５分）洗浄した。発現の検出は
製造元（Boehringer Mannheim）の指示にしたがった。
にしたがってハイブリダイズさせ洗浄した。α２δのサブタイプに特異的なジゴ
キシゲニン標識プローブをＰＣＲで作製し、１０ｍＬのイージーハイブ（EasyHy
b, Boehringer Mannheim）で５０℃で一晩ハイブリダイズさせた。ＲＴ−ＰＣＲ
用に使用するプライマー対と同じプライマー対を用いてプローブを作製した。ブ
ロットを２回（最初は２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで室温で５分、続いて０
．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで６８℃で１５分）洗浄した。発現の検出は
製造元（Boehringer Mannheim）の指示にしたがった。
【００２５】
細胞培養およびトラスフェクション：ＣＯＳ−７およびＨＥＫ２９３細胞をそ
れぞれＤＭＥＭおよびＲＰＭＩ１６４０培養液で培養した。前記培養液に９５％
空気および５％ＣＯ２を有する湿潤化したインキュベーター中で３７℃で５０単
位／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および１０％熱
不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した。ＣＯＳ−７細胞への一過性トランス
フェクションのために、２０μｇのプラスミドＤＮＡ（ベクターまたはα２δ挿
入物を含む同じベクター）を３０μＬのリポフェクチンとインキュベートした。
混合物を１．５ｍＬの血清非含有培養液中で前記細胞に重ね、５時間インキュベ
ートした。ＦＢＳを前記培養皿に添加して最終濃度を１０％にした。培養液を次
の朝、交換した。トランスフェクション後４８時間で、膜の調製のために細胞を
採集した。ブタα２δ１およびヒトα２δ２のＨＥＫ２９３細胞への安定なトラ
ンスフェクションの場合は、トランスフェクション後４８時間で８００μｇ／ｍ
ＬのＧ４１８（ゲンタシン）を細胞に添加したことを除き、一過性のトランスフ
ェクションのための方法と同じ方法を適用した。２つのクローン、ＧＫＳ０２お
よびＧＫＳ０７は、それぞれブタα２δ１およびヒトα２δ２の最高の発現を示
し、更なる結合実験のために選択した。前記細胞株はＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１８
２３を有する。さらに、α２δ２タンパク質結合アッセイの発現用ホストには真
核細胞発現系、例えば酵母、昆虫細胞および哺乳類細胞（ＣＨＯ、ＣＯＳ−７、
ＨＥＫ２９３など）もまた含まれる。
れぞれＤＭＥＭおよびＲＰＭＩ１６４０培養液で培養した。前記培養液に９５％
空気および５％ＣＯ２を有する湿潤化したインキュベーター中で３７℃で５０単
位／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および１０％熱
不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した。ＣＯＳ−７細胞への一過性トランス
フェクションのために、２０μｇのプラスミドＤＮＡ（ベクターまたはα２δ挿
入物を含む同じベクター）を３０μＬのリポフェクチンとインキュベートした。
混合物を１．５ｍＬの血清非含有培養液中で前記細胞に重ね、５時間インキュベ
ートした。ＦＢＳを前記培養皿に添加して最終濃度を１０％にした。培養液を次
の朝、交換した。トランスフェクション後４８時間で、膜の調製のために細胞を
採集した。ブタα２δ１およびヒトα２δ２のＨＥＫ２９３細胞への安定なトラ
ンスフェクションの場合は、トランスフェクション後４８時間で８００μｇ／ｍ
ＬのＧ４１８（ゲンタシン）を細胞に添加したことを除き、一過性のトランスフ
ェクションのための方法と同じ方法を適用した。２つのクローン、ＧＫＳ０２お
よびＧＫＳ０７は、それぞれブタα２δ１およびヒトα２δ２の最高の発現を示
し、更なる結合実験のために選択した。前記細胞株はＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１８
２３を有する。さらに、α２δ２タンパク質結合アッセイの発現用ホストには真
核細胞発現系、例えば酵母、昆虫細胞および哺乳類細胞（ＣＨＯ、ＣＯＳ−７、
ＨＥＫ２９３など）もまた含まれる。
【００２６】
膜の調製：膜は組織または培養細胞から調製した。細胞は２回冷ＰＢＳで洗浄
し、続いてトリス（５ｍＭ，ｐＨ７．４）、ＥＤＴＡ（５ｍＭ）、ＰＭＳＦ（０
．１ｍＭ）、ロイペプチン（０．０２ｍＭ）、およびペプスタチン（０．０２ｍ
Ｍ）を含む冷緩衝液で削り落とした。細胞を氷上で３０分インキュベートし、続
いて超音波処理を３０から４０秒実施した。組織から膜を調製する場合は、組織
を小さな細片にスライスし、１０秒間隔で４回超音波処理した。得られた組織ま
たは細胞のホモジネートを７５０から１０００×ｇで１０分間遠心し、続いて、
上清を５００００×ｇで３０分遠心した。生じたペレットを上記の緩衝液と同じ
ものに再度懸濁させた。
し、続いてトリス（５ｍＭ，ｐＨ７．４）、ＥＤＴＡ（５ｍＭ）、ＰＭＳＦ（０
．１ｍＭ）、ロイペプチン（０．０２ｍＭ）、およびペプスタチン（０．０２ｍ
Ｍ）を含む冷緩衝液で削り落とした。細胞を氷上で３０分インキュベートし、続
いて超音波処理を３０から４０秒実施した。組織から膜を調製する場合は、組織
を小さな細片にスライスし、１０秒間隔で４回超音波処理した。得られた組織ま
たは細胞のホモジネートを７５０から１０００×ｇで１０分間遠心し、続いて、
上清を５００００×ｇで３０分遠心した。生じたペレットを上記の緩衝液と同じ
ものに再度懸濁させた。
【００２７】
ウェスタンブロット分析：前記細胞膜（ＧＫＳ０７細胞については０．５μｇ
、ＧＫＳ０２細胞については５μｇ、一過性にトランスフェクトした細胞または
組織については１００μｇ）を４％から２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させ、半
乾燥トランスファーユニットを用いてニトロセルロースメンブレンに移した。前
記のメンブレンをウサギ抗α２δ１、α２δ２およびα２δ３抗体のいずれかと
１時間室温でインキュベートし、続いて１×ＰＢＳで洗浄した。前記のブロット
を抗ウサギＩｇＧと１時間インキュベートし、さらに製造元の推奨する方法にし
たがってＥＣＬ反応により展開させた。
、ＧＫＳ０２細胞については５μｇ、一過性にトランスフェクトした細胞または
組織については１００μｇ）を４％から２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離させ、半
乾燥トランスファーユニットを用いてニトロセルロースメンブレンに移した。前
記のメンブレンをウサギ抗α２δ１、α２δ２およびα２δ３抗体のいずれかと
１時間室温でインキュベートし、続いて１×ＰＢＳで洗浄した。前記のブロット
を抗ウサギＩｇＧと１時間インキュベートし、さらに製造元の推奨する方法にし
たがってＥＣＬ反応により展開させた。
【００２８】
結合アッセイ：放射能リガンド結合アッセイは、２０ｎＭの［3Ｈ］ガバペン
チンの存在下でインキュベートした膜タンパク質を用いて実施した。膜（一過性
にトランスフェクトした細胞のタンパク質については１００μｇ、ＧＫＳ０２細
胞については２０μｇ、ＧＫＳ０７細胞については１０μｇ）を１０ｍＭのＨＥ
ＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ´−［２−エタンスルホ
ン酸］）（ｐＨ７．４）中で４０から５０分室温でインキュベートし、続いて予
め湿らせたＧＦ／Ｃメンブレンでろ過し、３ｍＬの氷冷トリス緩衝液（５０ｍＭ
，ｐＨ７．４）で迅速に５回洗浄した。前記フィルターを乾燥させ、液体シンチ
レーションカウンターで計測した。非特異的結合を決定するために、前記結合ア
ッセイは１０μＭのプレガバリンの存在下で実施した（N.S. Gee, J.P. Brown,
V.U. Dissanayake, J. Offord, R. Thurlow, G.N. Woodruff, J. Biol. Chem. 2
71:5768-5776）。特異的結合は、全結合から非特異的結合を差し引いて得られた
。クローン＃７は最高のα２δ２サブユニット発現クローンと決定された。結合
アッセイはまた、α２δ２サブタイプ選択的阻害剤のスクリーニングのために、
ヒトおよび他の哺乳類種由来のリコンビナントおよび／または精製α２δ２タン
パク質を用いて実施することができる。
チンの存在下でインキュベートした膜タンパク質を用いて実施した。膜（一過性
にトランスフェクトした細胞のタンパク質については１００μｇ、ＧＫＳ０２細
胞については２０μｇ、ＧＫＳ０７細胞については１０μｇ）を１０ｍＭのＨＥ
ＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ´−［２−エタンスルホ
ン酸］）（ｐＨ７．４）中で４０から５０分室温でインキュベートし、続いて予
め湿らせたＧＦ／Ｃメンブレンでろ過し、３ｍＬの氷冷トリス緩衝液（５０ｍＭ
，ｐＨ７．４）で迅速に５回洗浄した。前記フィルターを乾燥させ、液体シンチ
レーションカウンターで計測した。非特異的結合を決定するために、前記結合ア
ッセイは１０μＭのプレガバリンの存在下で実施した（N.S. Gee, J.P. Brown,
V.U. Dissanayake, J. Offord, R. Thurlow, G.N. Woodruff, J. Biol. Chem. 2
71:5768-5776）。特異的結合は、全結合から非特異的結合を差し引いて得られた
。クローン＃７は最高のα２δ２サブユニット発現クローンと決定された。結合
アッセイはまた、α２δ２サブタイプ選択的阻害剤のスクリーニングのために、
ヒトおよび他の哺乳類種由来のリコンビナントおよび／または精製α２δ２タン
パク質を用いて実施することができる。
【００２９】結果
α２δ転写物の組織分布：ｈα２δ１、ｈα２δ２およびｈα２δ３ｍＲＮＡ
の組織分布を先ずＲＴ−ＰＣＲ分析によって調べた。これらのプローブは、α２
δの３つのサブタイプを特異的に増幅させるためにデザインした。図２で示した
ように、ｈα２δ１、ｈα２δ２およびｈα２δ３の予想サイズ（１２０８，１
１０および１３５２ｂｐ）とよく一致するただ１つのＰＣＲ生成物が、検査した
ほとんど全ての組織に出現した。より高レベルのｈα２δ２転写物が、脳を含む
他のいずれの組織よりも肺で認められた。ＰＣＲ生成物は対応するα２δと同一
の配列を示したので、広範囲の組織分布はｈα２δｍＲＮＡ発現の普遍的特色を
示している。しかしながら、ここで用いたＲＴ−ＰＣＲ条件では、種々の組織間
でのα２δｍＲＮＡレベルの定量的見積もりが得られなかったので、ノザン分析
が各サブタイプのｈα２δｍＲＮＡの相対量を見積もるために必要である。ノザ
ンブロットは、ｈα２δ１がはるかに多く骨格筋で発現されることを除いて、３
つのｈα２δ遺伝子全てが、脳、心臓、および筋肉でほぼ等しくよく発現される
ことを示した（図３）。これら３つの組織の他に、もっとも豊富なｈα２δ２転
写物が肺で認められた。肺でｈα２δ２ｍＲＮＡがもっとも高く発現されること
は、上記のＲＴ−ＰＣＲの結果と一致し、最近の報告（B. Gao, Y. Sekido, A.
Maximov, M. Saad, E. Forgacs, F. Latif et al., J. Biol. Chem. 275:12237-
12242(2000)）とも合致したが、初期の観察（N. Klugbauer, L. Lacinova, E. M
arais, M. Hobom, F. Hofmann, J. Neurosci. 19:684-691(1999)）とは異なって
いる。本研究では、我々はまた少量のｈα２δ１およびｈα２δ３ｍＲＮＡを肝
臓および腎臓でそれぞれ検出した。我々の研究室および他の研究室の結果（Klug
bauer, 上掲書(1999); Gao, 上掲書(2000); 我々の未発表データ）は、マウスの
α２δ３（ｍα２δ３）の発現は脳に限定されることを示した。ｈα２δ３の脳
以外の他の組織における発現もまたα２δ３発現の種における相違を示唆してい
る。
の組織分布を先ずＲＴ−ＰＣＲ分析によって調べた。これらのプローブは、α２
δの３つのサブタイプを特異的に増幅させるためにデザインした。図２で示した
ように、ｈα２δ１、ｈα２δ２およびｈα２δ３の予想サイズ（１２０８，１
１０および１３５２ｂｐ）とよく一致するただ１つのＰＣＲ生成物が、検査した
ほとんど全ての組織に出現した。より高レベルのｈα２δ２転写物が、脳を含む
他のいずれの組織よりも肺で認められた。ＰＣＲ生成物は対応するα２δと同一
の配列を示したので、広範囲の組織分布はｈα２δｍＲＮＡ発現の普遍的特色を
示している。しかしながら、ここで用いたＲＴ−ＰＣＲ条件では、種々の組織間
でのα２δｍＲＮＡレベルの定量的見積もりが得られなかったので、ノザン分析
が各サブタイプのｈα２δｍＲＮＡの相対量を見積もるために必要である。ノザ
ンブロットは、ｈα２δ１がはるかに多く骨格筋で発現されることを除いて、３
つのｈα２δ遺伝子全てが、脳、心臓、および筋肉でほぼ等しくよく発現される
ことを示した（図３）。これら３つの組織の他に、もっとも豊富なｈα２δ２転
写物が肺で認められた。肺でｈα２δ２ｍＲＮＡがもっとも高く発現されること
は、上記のＲＴ−ＰＣＲの結果と一致し、最近の報告（B. Gao, Y. Sekido, A.
Maximov, M. Saad, E. Forgacs, F. Latif et al., J. Biol. Chem. 275:12237-
12242(2000)）とも合致したが、初期の観察（N. Klugbauer, L. Lacinova, E. M
arais, M. Hobom, F. Hofmann, J. Neurosci. 19:684-691(1999)）とは異なって
いる。本研究では、我々はまた少量のｈα２δ１およびｈα２δ３ｍＲＮＡを肝
臓および腎臓でそれぞれ検出した。我々の研究室および他の研究室の結果（Klug
bauer, 上掲書(1999); Gao, 上掲書(2000); 我々の未発表データ）は、マウスの
α２δ３（ｍα２δ３）の発現は脳に限定されることを示した。ｈα２δ３の脳
以外の他の組織における発現もまたα２δ３発現の種における相違を示唆してい
る。
【００３０】
脳では、ｈα２δ１、ｈα２δ２、およびｈα２δ３が、検査した脳の全ての
部分（小脳、大脳皮質、髄質、後頭極、前頭葉、側頭葉および被殻を含む）で検
出された。大脳皮質よりも小脳でより高レベルのｈα２δ２転写物が認められ、
一方、ｈα２δ３については反対であった。ｈα２δ１については、そのｍＲＮ
Ａは前記２つの領域にほぼ均等に分布していた。これら２つの脳の領域における
前記３つのアイソフォームの発現パターンは、以前のin situハイブリダイゼー
ションの結果と一致していた（Klugbauer, 上掲書(1999); M. Hobom, S. Dai, E
. Marais, L. Lacinova, F. Hofmann, N. Klugbauer, Eur. J. Neurosci., 12:1
217-1226(2000)）。さらに、α２δｍＲＮＡの３つのサブタイプはいずれも脊髄
で見出されるが、脳で認められるレベルより低かった。
部分（小脳、大脳皮質、髄質、後頭極、前頭葉、側頭葉および被殻を含む）で検
出された。大脳皮質よりも小脳でより高レベルのｈα２δ２転写物が認められ、
一方、ｈα２δ３については反対であった。ｈα２δ１については、そのｍＲＮ
Ａは前記２つの領域にほぼ均等に分布していた。これら２つの脳の領域における
前記３つのアイソフォームの発現パターンは、以前のin situハイブリダイゼー
ションの結果と一致していた（Klugbauer, 上掲書(1999); M. Hobom, S. Dai, E
. Marais, L. Lacinova, F. Hofmann, N. Klugbauer, Eur. J. Neurosci., 12:1
217-1226(2000)）。さらに、α２δｍＲＮＡの３つのサブタイプはいずれも脊髄
で見出されるが、脳で認められるレベルより低かった。
【００３１】
α２δタンパク質の組織分布：タンパク質レベルはｍＲＮＡの定常状態レベル
の関数であるが、個々の遺伝子のｍＲＮＡとタンパク質の相対量はいつも比例す
るとは限らない。前記相対量は翻訳後調節を反映することがある（V.N. Jackson
, N.T. Price, L. Carpenter, A.P. Halestrap, Biochem. J., 324:447-453(199
7)）。組織間のヒトおよびマウスのα２δサブユニットの相対レベルを調べるた
めに、α２δの個々のサブタイプタンパク質に対して作製した抗体をウェスタン
ブロットに用いた。等量のタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲルに装荷し
た。ｈα２δ１の普遍的分布と一致して、ヒトおよびマウス組織のウェスタンブ
ロットは、ｈα２δ１およびｍα２δ１タンパク質は両方とも広範囲に分布する
ことを示したが、一方、ｈα２δ１は肺および空腸には検出されなかった。対照
的に、ｈα２δ３タンパク質は脳でのみ検出され、肺、精巣、大動脈、脾臓、空
腸、および腎臓では検出されなかった（図４Ａ）。同様に、ｍα２δ３タンパク
質は脳でのみ検出され、心臓、腎臓、肺臓、すい臓、胃、脾臓、胸腺、卵巣、下
垂体、甲状腺、および前立腺では検出されなかった。驚くべきことには、肺での
ｈα２δ２転写物の顕著な発現（図２および３）とは対照的に、ｈα２δ２タン
パク質は脳で顕著に認められ、ｈα２δ２タンパク質のレベルは肺では検出可能
ではなかった（図４Ａ）。脳の他に、低レベルのｈα２δ２タンパク質がまた大
動脈、精巣および心室筋に見出された。精巣には２つの免疫反応バンドが存在す
るようであり、１つは予想したｈα２δ２の分子量（１７５ｋＤａ）であり、他
方はわずかに小さい分子量を示した。この小さい分子量のタンパク質は心室筋で
検出された優勢なバンドと類似しているようであった。以前にｐα２δ１で観察
されたように、この小さいバンドは、α２δタンパク質から解離したα２サブユ
ニットまたはα２δ２のアイソフォームを示しているのかもしれない（J.P. Bro
wn, V.U.K. Dissanayke, A.R. Briggs, M.R. Milic, N. Gee, Anal. Biochem.,
255:236-243(1998); M. Wang, J. Offord, D.L. Oxender, T.Z. Su, Biochem. J
. 342:313-320(1999)）。さらに、２つの免疫反応バンドはまた抗α２δ２抗体
によってマウスの心臓で検出されたが、この場合は優勢なバンドは他の組織で見
出されたものより大きな分子量を有していた（図４Ｂ）。
の関数であるが、個々の遺伝子のｍＲＮＡとタンパク質の相対量はいつも比例す
るとは限らない。前記相対量は翻訳後調節を反映することがある（V.N. Jackson
, N.T. Price, L. Carpenter, A.P. Halestrap, Biochem. J., 324:447-453(199
7)）。組織間のヒトおよびマウスのα２δサブユニットの相対レベルを調べるた
めに、α２δの個々のサブタイプタンパク質に対して作製した抗体をウェスタン
ブロットに用いた。等量のタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲルに装荷し
た。ｈα２δ１の普遍的分布と一致して、ヒトおよびマウス組織のウェスタンブ
ロットは、ｈα２δ１およびｍα２δ１タンパク質は両方とも広範囲に分布する
ことを示したが、一方、ｈα２δ１は肺および空腸には検出されなかった。対照
的に、ｈα２δ３タンパク質は脳でのみ検出され、肺、精巣、大動脈、脾臓、空
腸、および腎臓では検出されなかった（図４Ａ）。同様に、ｍα２δ３タンパク
質は脳でのみ検出され、心臓、腎臓、肺臓、すい臓、胃、脾臓、胸腺、卵巣、下
垂体、甲状腺、および前立腺では検出されなかった。驚くべきことには、肺での
ｈα２δ２転写物の顕著な発現（図２および３）とは対照的に、ｈα２δ２タン
パク質は脳で顕著に認められ、ｈα２δ２タンパク質のレベルは肺では検出可能
ではなかった（図４Ａ）。脳の他に、低レベルのｈα２δ２タンパク質がまた大
動脈、精巣および心室筋に見出された。精巣には２つの免疫反応バンドが存在す
るようであり、１つは予想したｈα２δ２の分子量（１７５ｋＤａ）であり、他
方はわずかに小さい分子量を示した。この小さい分子量のタンパク質は心室筋で
検出された優勢なバンドと類似しているようであった。以前にｐα２δ１で観察
されたように、この小さいバンドは、α２δタンパク質から解離したα２サブユ
ニットまたはα２δ２のアイソフォームを示しているのかもしれない（J.P. Bro
wn, V.U.K. Dissanayke, A.R. Briggs, M.R. Milic, N. Gee, Anal. Biochem.,
255:236-243(1998); M. Wang, J. Offord, D.L. Oxender, T.Z. Su, Biochem. J
. 342:313-320(1999)）。さらに、２つの免疫反応バンドはまた抗α２δ２抗体
によってマウスの心臓で検出されたが、この場合は優勢なバンドは他の組織で見
出されたものより大きな分子量を有していた（図４Ｂ）。
【００３２】
α２およびδタンパク質のジスルフィド結合：α２δ１のα２およびδ１サブ
ユニットはジスルフィド結合によって連結されていることが示された（Wang, 上
掲書(1999)）。δ領域のアミノ酸配列は、α２δ１とα２δ２間でより保存され
ていないので、α２δ２タンパク質が翻訳後２つのサブユニットに切断されるか
否かを知ることは興味のあるところである。そのような可能性を調べるために、
ｐα２δ１（ＧＫＳ０２）およびｈα２δ２（ＧＫＳ０７）タンパク質を過剰発
現しているＨＥＫ２９３細胞株の細胞膜を、ゲル電気泳動の前に１００ｍＭＤＴ
Ｔで処理するかまたは未処理のままにした。ＤＴＴの存在下では、ｐα２δ１お
よびｈα２δ２タンパク質の両者はα２として予想した位置にシフトし、ｐα２
δ１の場合のように、ｈα２δ２もまたジスルフィド結合により連結された２つ
のサブユニットから成ることを示唆している（図６）。
ユニットはジスルフィド結合によって連結されていることが示された（Wang, 上
掲書(1999)）。δ領域のアミノ酸配列は、α２δ１とα２δ２間でより保存され
ていないので、α２δ２タンパク質が翻訳後２つのサブユニットに切断されるか
否かを知ることは興味のあるところである。そのような可能性を調べるために、
ｐα２δ１（ＧＫＳ０２）およびｈα２δ２（ＧＫＳ０７）タンパク質を過剰発
現しているＨＥＫ２９３細胞株の細胞膜を、ゲル電気泳動の前に１００ｍＭＤＴ
Ｔで処理するかまたは未処理のままにした。ＤＴＴの存在下では、ｐα２δ１お
よびｈα２δ２タンパク質の両者はα２として予想した位置にシフトし、ｐα２
δ１の場合のように、ｈα２δ２もまたジスルフィド結合により連結された２つ
のサブユニットから成ることを示唆している（図６）。
【００３３】
［3Ｈ］ガバペンチンの結合：クローン化ｈα２δ２のガバペンチン結合特性
を決定するために、ｐα２δ１、ｈα２δ２およびベクターｐｃＤＮＡ３．１を
一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞から膜を単離した。対応するα２
δタンパク質の発現はウェスタンブロットで調べた。図５に示したように、ｐα
２δ１による細胞のトランスフェクションは、ガバペンチン結合の顕著な増加を
もたらした。同様に、ｈα２δ２を発現する細胞は、約４倍のガバペンチン結合
活性の増加を示した。ｐｃＤＮＡ３．１ベクターのみをトランスフェクトした細
胞でわずかな結合活性の増加が観察されたが、統計学的分析では前記の小さな変
化は有意であるとは示されなかった。
を決定するために、ｐα２δ１、ｈα２δ２およびベクターｐｃＤＮＡ３．１を
一過性にトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞から膜を単離した。対応するα２
δタンパク質の発現はウェスタンブロットで調べた。図５に示したように、ｐα
２δ１による細胞のトランスフェクションは、ガバペンチン結合の顕著な増加を
もたらした。同様に、ｈα２δ２を発現する細胞は、約４倍のガバペンチン結合
活性の増加を示した。ｐｃＤＮＡ３．１ベクターのみをトランスフェクトした細
胞でわずかな結合活性の増加が観察されたが、統計学的分析では前記の小さな変
化は有意であるとは示されなかった。
【００３４】
ｐα２δ１およびｈα２δ２のガバペンチン結合ＫDおよび結合特性を細胞株
ＧＫＳ０２（ｐα２δ１）およびＧＫＳ０７（ｈα２δ２）で決定した。安定的
にｐα２δ１を発現しているＨＥＫ細胞では、［3Ｈ］ガバペンチンは、以前の
報告（Gee, 上掲書(1996)）で示したように、ＫD値７２±９ｎＭで単一部位集団
に結合した（図７Ａ）。同様に、単一結合部位集団はまたｈα２δ２を含む膜に
も観察されたが（図７Ｂ）、ＫD値はｐα２δ１（１５６±２５ｎＭ）よりも高
かった。ｈα２δ２の薬理学的特性を決定するために、いくつかの化合物を［3
Ｈ］ガバペンチン結合について競合させるために選択した。同様な（しかし同一
ではない）競合プロフィールがα２δタンパク質の２つのサブタイプで認められ
た（表１）。例えば、α２δの両サブタイプとの結合は、Ｌ−ロイシンはそのＤ
−鏡像体よりもはるかに強力であったので立体特異的である。ＢＣＨ（Ｌ系トラ
ンスポートのモデル基質）およびフェニルアラニンの親和性は両サブタイプタン
パク質に対して弱かった。他方、α２δ２とのガバペンチンの結合は、ｐα２δ
１（１４９ｎＭ）と比較して（Ｓ＋）−３−イソブチルＧＡＢＡ（プレガバリン
）に対してより感受性が高く、ＩＣ50値は９６ｎＭであった。
ＧＫＳ０２（ｐα２δ１）およびＧＫＳ０７（ｈα２δ２）で決定した。安定的
にｐα２δ１を発現しているＨＥＫ細胞では、［3Ｈ］ガバペンチンは、以前の
報告（Gee, 上掲書(1996)）で示したように、ＫD値７２±９ｎＭで単一部位集団
に結合した（図７Ａ）。同様に、単一結合部位集団はまたｈα２δ２を含む膜に
も観察されたが（図７Ｂ）、ＫD値はｐα２δ１（１５６±２５ｎＭ）よりも高
かった。ｈα２δ２の薬理学的特性を決定するために、いくつかの化合物を［3
Ｈ］ガバペンチン結合について競合させるために選択した。同様な（しかし同一
ではない）競合プロフィールがα２δタンパク質の２つのサブタイプで認められ
た（表１）。例えば、α２δの両サブタイプとの結合は、Ｌ−ロイシンはそのＤ
−鏡像体よりもはるかに強力であったので立体特異的である。ＢＣＨ（Ｌ系トラ
ンスポートのモデル基質）およびフェニルアラニンの親和性は両サブタイプタン
パク質に対して弱かった。他方、α２δ２とのガバペンチンの結合は、ｐα２δ
１（１４９ｎＭ）と比較して（Ｓ＋）−３−イソブチルＧＡＢＡ（プレガバリン
）に対してより感受性が高く、ＩＣ50値は９６ｎＭであった。
【００３５】
【表１】
【００３６】
図８はまた、ヒトα２δ２タンパク質を発現する安定な細胞株のスクリーニン
グを示す。 本明細書で開示した本発明の形態は目下の好ましい実施態様を構成しているが
、多くの他の形態も可能である。本明細書では、本発明の全ての可能な同等物ま
たは派生物を記載することを意図していない。本明細書で用いられる用語は限定
ではなく単なる記述であり、本発明の範囲を逸脱することなく多様な変更を為し
えることは理解されよう。
グを示す。 本明細書で開示した本発明の形態は目下の好ましい実施態様を構成しているが
、多くの他の形態も可能である。本明細書では、本発明の全ての可能な同等物ま
たは派生物を記載することを意図していない。本明細書で用いられる用語は限定
ではなく単なる記述であり、本発明の範囲を逸脱することなく多様な変更を為し
えることは理解されよう。
【図１】
ヒトα２δ２のｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターでの分子クローニングの模式図
である。
である。
【図２】
ヒトα２δの組織分布のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図３Ａ】
ヒトα２δ１の組織分布のノザンブロット分析を示す。
【図３Ｂ】
ヒトα２δ１の組織分布のノザンブロット分析を示す。
【図３Ｃ】
ヒトα２δ２の組織分布のノザンブロット分析を示す。
【図３Ｄ】
ヒトα２δ２の組織分布のノザンブロット分析を示す。
【図３Ｅ】
ヒトα２δ３の組織分布のノザンブロット分析を示す。
【図３Ｆ】
ヒトα２δ３の組織分布のノザンブロット分析を示す。
【図４Ａ】
ヒトα２δの組織分布のウェスタンブロット分析を示す。
【図４Ｂ】
マウスα２δの組織分布のウェスタンブロット分析を示す。
【図５】
α２δｃＤＮＡをトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞の膜と［3Ｈ］ガバペ
ンチンとの結合を示す。
ンチンとの結合を示す。
【図６】
α２およびδサブユニット間のジスルフィド結合の破壊を示す。
【図７】
ブタα２δ１（Ａ）およびヒトα２δ２（Ｂ）を過剰産生しているＨＥＫ２９
３細胞の膜と［3Ｈ］ガバペンチン（ＧＢＰ）との結合のスキャチャード分析を
示す。
３細胞の膜と［3Ｈ］ガバペンチン（ＧＢＰ）との結合のスキャチャード分析を
示す。
【図８】
［3Ｈ］ガバペンチン（ＧＢＰ）結合活性による細胞株のスクリーニングを示
す。
す。
【配列表】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ
，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，
ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ
Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ
，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，
ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ
Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ
，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，
ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
Ｆターム(参考） 2G045 AA40
4B024 AA11 BA80 CA04 CA20 DA02
DA03 EA04 GA13 HA11
4B063 QA05 QQ21 QQ41 QQ61 QQ89
QR77 QR80 QX07
4B065 AA90X AA90Y AA93X AA93Y
AB01 AC14 BA02 BA05 CA24
CA46
Claims (18)
- 【請求項１】 化合物とカルシウムチャネルα２δ２サブユニットを発現し
ている細胞株との結合能を決定する方法であって、 カルシウムチャネルα２δ２サブユニットを発現している細胞を用意し； この細胞を化合物と接触させ；さらに この化合物の細胞との結合能を決定する ことを含む上記方法。 - 【請求項２】 化合物がガバペンチンである請求項１の方法。
- 【請求項３】 化合物がガバペンチン類似体である請求項１の方法。
- 【請求項４】 ガバペンチン類似体が、１から４つの炭素原子を有するアル
キル基で炭素環の任意の位置でアルキル化されている請求項３の方法。 - 【請求項５】 ガバペンチン類似体が、ガバペンチンの３−アルキル置換体
である請求項３の方法。 - 【請求項６】 化合物がプレガバリンである請求項１の方法。
- 【請求項７】 化合物が、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の３−アルキル誘導
体である請求項１の方法。 - 【請求項８】 カルシウムチャネルのα２δ２サブユニットを発現している
安定な細胞株。 - 【請求項９】 ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−１８２３の請求項８の細胞株。
- 【請求項１０】 化合物とカルシウムチャネルα２δ２サブユニットとの結
合能を決定する方法であって、 カルシウムチャネルα２δ２サブユニットを用意し； このα２δ２サブユニットを化合物と接触させ；さらに この化合物のα２δ２サブユニットとの結合能力を決定する ことを含む上記方法。 - 【請求項１１】 化合物がガバペンチンである請求項１０の方法。
- 【請求項１２】 化合物がガバペンチン類似体である請求項１０の方法。
- 【請求項１３】 ガバペンチン類似体が、１から４つの炭素原子を有するア
ルキル基で炭素環の任意の位置でアルキル化されている請求項１２の方法。 - 【請求項１４】 ガバペンチン類似体が、ガバペンチンの３−アルキル置換
体である請求項１２の方法。 - 【請求項１５】 化合物がプレガバリンである請求項１０の方法。
- 【請求項１６】 化合物が、ＧＡＢＡの３−アルキル誘導体である請求項１
０の方法。 - 【請求項１７】 α２δ２サブユニットが精製タンパク質である請求項１０
の方法。 - 【請求項１８】 α２δ２サブユニットがリコンビナントタンパク質である
請求項１０の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US20446600P | 2000-05-16 | 2000-05-16 | |
| US60/204,466 | 2000-05-16 | ||
| PCT/US2001/014799 WO2001088101A2 (en) | 2000-05-16 | 2001-05-08 | CELL LINE FOR THE EXPRESSION OF AN α2δ2 CALCIUM CHANNEL SUBUNIT |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003533223A true JP2003533223A (ja) | 2003-11-11 |
Family
ID=22758003
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001585309A Pending JP2003533223A (ja) | 2000-05-16 | 2001-05-08 | α２δ２カルシウムチャネルサブユニットの発現細胞株 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7067262B2 (ja) |
| EP (1) | EP1294854A2 (ja) |
| JP (1) | JP2003533223A (ja) |
| AU (1) | AU2001259627A1 (ja) |
| CA (1) | CA2408246A1 (ja) |
| WO (1) | WO2001088101A2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SI0934061T1 (en) | 1996-07-24 | 2003-10-31 | Warner-Lambert Company Llc | Isobutylgaba and its derivatives for the treatment of pain |
| NI200300043A (es) * | 2002-03-28 | 2003-11-05 | Warner Lambert Co | AMINOACIDOS CON AFINIDAD POR LA PROTEINA a2DELTA. |
| BRPI0414819A (pt) | 2003-09-25 | 2006-11-14 | Warner Lambert Co | pró-fármacos de aminoácidos com afinidade para a proteìna alfa2delta |
| EP2116618A1 (en) | 2008-05-09 | 2009-11-11 | Agency for Science, Technology And Research | Diagnosis and treatment of Kawasaki disease |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5712158A (en) * | 1995-06-06 | 1998-01-27 | Warner-Lambert Company | Cell line for the rapid expression of functional calcium channels |
| WO1999008670A1 (en) | 1997-08-20 | 1999-02-25 | Guglietta, Antonio | Gaba analogs to prevent and treat gastrointestinal damage |
-
2001
- 2001-05-08 CA CA002408246A patent/CA2408246A1/en not_active Abandoned
- 2001-05-08 EP EP01933183A patent/EP1294854A2/en not_active Withdrawn
- 2001-05-08 US US10/258,936 patent/US7067262B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-05-08 JP JP2001585309A patent/JP2003533223A/ja active Pending
- 2001-05-08 WO PCT/US2001/014799 patent/WO2001088101A2/en not_active Application Discontinuation
- 2001-05-08 AU AU2001259627A patent/AU2001259627A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1294854A2 (en) | 2003-03-26 |
| CA2408246A1 (en) | 2001-11-22 |
| AU2001259627A1 (en) | 2001-11-26 |
| US7067262B2 (en) | 2006-06-27 |
| WO2001088101A2 (en) | 2001-11-22 |
| WO2001088101A3 (en) | 2002-08-08 |
| US20030212132A1 (en) | 2003-11-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gong et al. | Tissue-specific expression and gabapentin-binding properties of calcium channel α2δ subunit subtypes | |
| McDonald et al. | Cloning, expression, and tissue distribution of a human amiloride-sensitive Na+ channel | |
| Prasad et al. | Molecular cloning of the human placental folate transporter | |
| Tiku et al. | Cold-induced expression of Δ9-desaturase in carp by transcriptional and posttranslational mechanisms | |
| Galietta et al. | IL-4 is a potent modulator of ion transport in the human bronchial epithelium in vitro | |
| Wang et al. | Cloning and functional expression of ATA1, a subtype of amino acid transporter A, from human placenta | |
| Marg et al. | Neurotractin, a novel neurite outgrowth-promoting Ig-like protein that interacts with CEPU-1 and LAMP | |
| Chang et al. | Concomitant and hormonally regulated expression of trp genes in bovine aortic endothelial cells | |
| Derst et al. | Cellular localization of the potassium channel Kir7. 1 in guinea pig and human kidney | |
| US6277585B1 (en) | Netrin receptors | |
| EP1235934B1 (en) | Screening method for candidate drugs | |
| Hampe et al. | A head-activator binding protein is present in hydra in a soluble and a membrane-anchored form | |
| JP2003533223A (ja) | α２δ２カルシウムチャネルサブユニットの発現細胞株 | |
| EP0887081B1 (en) | Human serum glucocorticoid regulated kinase, a target for chronic renal disease and diabetic nephropathy | |
| JP2002505102A (ja) | ポリ不飽和脂肪酸によって活性化された新規な機械的感受性を有する哺乳類カリウムチャンネルファミリー、及びこれらを特に医薬スクリーニングに用いる方法 | |
| Uyeda et al. | MDP77: A novel neurite-outgrowth-promoting protein predominantly expressed in chick muscles | |
| JP2003518628A (ja) | 化合物 | |
| JP2003522522A (ja) | 新規ヒトカルシウム感受性カリウムチャンネルサブユニット | |
| JP3997912B2 (ja) | 新規カリウムチャネル | |
| US7108987B2 (en) | Factors participating in degranulation of mast cells, DNAs encoding the same, method of screening of these factors and the inhibitors | |
| US6673899B2 (en) | Sodium ion-driven chloride /bi-carbonate exchanger | |
| JP2002501382A (ja) | ＧＡＢＡ−Ａ受容体のヒトθサブユニット | |
| JP4287582B2 (ja) | Ｍｉｎ６細胞下位株 | |
| AU780470B2 (en) | Inhibitor of osteoclast precursor formation | |
| Gess et al. | Lack of control by immediate early response genes in the oxygen regulation of erythropoietin gene expression |